CN109628530A - 一种多杀菌素的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多杀菌素的生产方法，属于发酵工程技术领域，该方法通过优化多杀菌素的发酵及分离纯化过程，包括在发酵培养液中加入卵磷脂、优化培养基组分及培养条件、在发酵过程中进行物料的补加以及分离纯化过程中的提取工艺的改进，增加了刺糖多孢菌的活性，同时提高了其产率与纯度，具有环境污染小、成本低、效率高、工艺简单等优点。

Description

一种多杀菌素的生产方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种多杀菌素的生产方法。
背景技术
多杀菌素是在多刺甘蔗多孢菌发酵液中提取的一种大环内酯类无公害高效生物杀虫剂。多杀菌素作为一种广谱的生物农药，具有高效、低毒、低残留、易降解以及对非靶标动物无害等优点，同时对哺乳动物也并无致癌、致畸或致突变等作用。
目前，发酵工艺复杂、效能低、成本高是制约多杀菌素大规模生产的主要问题，而培养基优化以及菌株改造是提高发酵产率，是降低发酵成本的主要方法。通常，菌株改造的技术要求较高、不易实施，培养基的优化由于可选择性较广，而被普遍采用。论文利用混料设计优化多杀菌素发酵培养基[J],阎宝清,夏立秋,龙如花,et al,食品与机械,2014(4):200-203.利用Plackett-Burman试验设计从8种营养成分中筛选出葡萄糖、棉籽粉、玉米浆及豆饼粉，通过D-最优混料设计，确定了四种成分的最佳比例，即葡萄糖59g/L、棉籽粉28g/L、玉米浆6.5g/L和豆饼粉6.5g/L，多杀菌素最高理论产量为256.75mg/L，实际产量为249.9mg/L。但该论文仅针对培养基组分配比进行了研究，却并未研究pH、发酵温度及发酵周期等因素的协同作用同样也会影响多杀菌产率。
而有关多杀菌素的分离纯化方法，目前为止主要有两种，溶媒萃取法和树脂吸附提取法，前者将发酵液中的多杀菌素吸附后利用有机溶剂将其从吸附剂中洗脱，再经浓缩得到多杀菌素，该方法处理量大、耗时短且成本低廉，但大都在实验室阶段，无法投入在工业化生产中；而后者则利用多杀菌素与杂质在溶媒中不同的溶解度，将多杀菌素从一种溶剂转移到另一种溶剂，进而浓缩去杂质，该方法处理效果较好且纯度较高，但该方法对设备要求较高，且在大规模生产中处理量较小，且面临着成本高、耗时长等问题。
申请号为201310756417.6的专利公开了一种多杀菌素的补料发酵及分离纯化方法，该方法包括将能提高多杀菌素产率的基因工程菌经斜面培养及种子培养后将种子液接种到发酵培养基中，进行一次补加玉米浆和油脂，二次补加玉米浆，分离提纯时，向发酵液加入丙酮进行离心，并用大孔树脂吸附，再用丙酮洗脱，经历超滤、纳滤、乙酸乙酯萃取、蒸发后得到多杀菌素。该发明通过补加混合油脂能够提高多杀菌素的产率并降低成本，但该方法的分离纯化过程中如超滤、纳滤等步骤对设备要求较高且处理量较小，同时，过程中使用的丙酮等物质，有毒有害、威胁健康并造成环境污染。
申请号为201410298686.7的专利公开了一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的方法，该方法包括对刺糖多孢菌液预处理、吸附剂吸附离心后水相中的有机物、合并离心分离后的固体、提取多杀菌素以及重结晶得到多杀菌素。该发明减少了有机溶剂的使用量，减少环境污染的同时降低了成本。但该发明在提取过程中，索氏提取通常提取时间较长且产率低，而重结晶过程将消耗部分正戊烷、正己烷、环己烷或石油醚等，溶剂消耗量大，会对环境造成影响。
目前为止，多杀菌素的生产存在工艺复杂、成本高、环境污染等各类问题，制备出的多杀菌通常产率及纯度也较低，因此，需要对多杀菌素的生产过程进行进一步优化，进而提高多杀菌素产率、纯度，同时简化工艺、降低成本及溶剂消耗，避免环境污染问题的发生。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种多杀菌素的生产方法，该方法通过优化多杀菌素的发酵及分离纯化过程，增加了刺糖多孢菌的活性，同时提高了其产率与纯度，具有环境污染小、成本低、效率高、工艺简单等优点。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种多杀菌素的生产方法，该方法包括：
(1)发酵：
S1：斜面培养：将刺糖多孢菌在斜面培养基上培养制成孢子悬液；
S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液接种于种子活化培养基中，得到种子液；
S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液转入发酵培养基中，依次进行三次物料补加，第一次补加植物油和卵磷脂，第二次补加葡萄糖和玉米浆，第三次补加玉米浆，得到发酵液；
(2)分离、纯化：
S4：发酵液预处理：向发酵液中加入碱液，调节pH并搅拌，离心得到固体A和清液；
S5：吸附剂吸附：向步骤S4得到的清液中加入大孔网状吸附剂，加热搅拌后离心，得到固体B；
S6：混合干燥：将步骤S4得到的固体A与步骤S5得到的固体B混合，然后真空干燥，得到干燥后的混合物；
S7：索氏提取：将步骤S6得到的干燥后的混合物加入提取剂浸渍，同时超声，进行第一阶段回流提取后再次浸渍，而后进行第二阶段回流提取，旋转蒸发得到浓缩液；
S8：析晶、分离及干燥：调节步骤S7中浓缩液的pH得到结晶液，而后离心得到湿晶，将湿晶干燥后得到多杀菌素。
在一些具体的实施方案中，步骤S1所述的斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物3g/L、无机盐0.2g/L和琼脂粉16g/L；优选地，所述的无机盐为MgSO4·7H2O。
进一步地，步骤S1所述的斜面培养，培养温度为28℃，转速为150r/min，培养周期为10d，pH为6.5。
在一些具体的实施方案中，步骤S2所述的种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物4g/L、酪蛋白胨25g/L和无机盐1.5g/L；优选地，所述的无机盐为MgSO4·7H2O与K2HPO4，其中，MgSO4·7H2O为0.2g/L，K2HPO4为1.3g/L。
进一步地，步骤S2所述的孢子悬液以体积比为1％的接种量转入种子活化培养基中；所述的种子活化培养基共50mL，装于250mL的摇瓶中。
进一步地，步骤S2所述的种子培养，培养温度为30℃，转速为250r/min，培养周期为2d，pH为6。
进一步地，步骤S3所述的种子液以体积比为10％的接种量转入发酵培养基中；所述的发酵培养基共20mL，装于250mL的摇瓶中。
进一步地，步骤S3所述的第一次补加卵磷脂和植物油，各组分按质量浓度计，分别为：卵磷脂2g/L和植物油1g/L；所述的第二次补加葡萄糖与玉米浆，各组分按质量浓度计，分别为：葡萄糖3g/L和玉米浆1g/L，所述的第三次补加玉米浆的质量浓度为0.5g/L；所述的第一次补加在发酵2-3d时，所述的第二次补加在发酵4-7d时，所述的第三次补加在发酵8-9d时。
进一步地，步骤S3所述的植物油为玉米油、花生油、大豆油、橄榄油、菜籽油和葵花籽油中的一种或多种；
优选地，步骤S3所述的植物油为大豆油与橄榄油按质量比2:1的比例混合而成；
进一步地，所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖30-40g/L、可溶性淀粉15-20g/L、玉米浆8-12g/L、棉籽粉3-8g/L、豆饼粉3-8g/L、植物油15-20g/L、无机盐1-2g/L和卵磷脂0.5-1g/L；
优选地，步骤S3所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖36g/L、可溶性淀粉18g/L、玉米浆10g/L、棉籽粉5g/L、豆饼粉5g/L、植物油18g/L、无机盐1.5g/L和卵磷脂0.8g/L。
进一步地，步骤S3所述的发酵培养条件，发酵温度为25-35℃、溶解氧为40％-60％、pH为7-8、培养周期为7-9d、转速为120-250r/min；
优选地，步骤S3所述的发酵培养条件，发酵温度为30℃、溶解氧为50％、pH为7.5、培养周期为8d、转速为200r/min。
进一步地，步骤S3所述的无机盐为K2HPO4。
进一步地，步骤S4所述的碱液为质量分数为30％的NaOH溶液，调节pH至8-10；所述的搅拌，搅拌时间为30min。
在一些具体的实施方式中，步骤S5中所述的大孔网状吸附剂的加入量为步骤S4中清液体积的0.5-10％，所述的加热搅拌，指在加热搅拌器中加热至温度为30-50℃，搅拌时间为15-60min。
进一步地，步骤S6所述的真空干燥，干燥温度30-80℃，干燥时间1-8h。
进一步地，步骤S7中所述的提取剂是体积比为3:1的乙酸乙酯与乙醇混合液，加入量为步骤S6得到的干燥后的混合物质量的1-5倍；所述的浸渍，指将步骤S6得到的干燥后的混合物置于索氏提取装置的接收瓶中，加入提取剂浸渍1h，所述的再次浸渍，浸渍时间为24h；所述的超声，超声频率为45kHz；所述的第一阶段回流提取，回流次数为1-2次，水浴温度为80℃；所述的第二阶段回流提取，提取时间为0.5-2h，水浴温度为80℃。
进一步地，步骤S8中所述的调节步骤S7中浓缩液的pH，指使用质量分数为30％的NaOH溶液将pH调节至9-11。
本发明所取得的有益效果是：
(1)葡萄糖和可溶性淀粉作为碳源，玉米浆、棉籽粉和豆饼粉作为氮源，同时卵磷脂以及植物油的加入，可以减少发酵时间，提高发酵效率，将以上物质进行复配，为刺糖多孢菌补充营养成分的同时，能够提高刺糖多孢菌的细胞膜的通透性，使多杀菌素渗透到细胞外，同时提高多杀菌素的产率。
(2)大孔网状吸附剂对有机物选择性良好、物理化学稳定性高、易再生、使用方便同时脱色力高，发酵结束后加入可使多杀菌素积累显著增加。
(3)发酵培养基中第一次补加植物油及卵磷脂能够促进植物油在发酵液中的分散，进而发挥植物油的作用使发酵液pH保持稳定、促进菌浓度的增加，第二次、第三次补加葡萄糖或玉米浆，能够充分利用碳源、氮源，补充营养、提高刺糖多孢菌的细胞活性，增加各物质的利用率，同时防止发酵液由于残留多糖等物质造成粘稠等问题的同时，促进了多杀菌的合成。
(4)发酵及分离纯化过程没有甲醇或丙酮等有机溶剂的参与，降低了成本的同时避免了健康的威胁及环境的污染。
(5)提取步骤将索氏提取与超声相结合，分阶段进行回流提取，能够增加提取的产率，经由析晶等步骤后，进一步提高了多杀菌素的纯度。
(6)本发明的发酵及分离纯化方法简单易行、节约成本、降低污染，同时，得到的多杀菌素具有产率高、纯度高的优点。
具体实施方式
如无特殊说明，本发明所采用的原料均为目前的普通市售产品，本发明对此不作限定。其中，卵磷脂中磷脂酰胆碱的含量高于24％。
实施例1
一种多杀菌素的生产方法，包括以下步骤：
(1)发酵：
S1：斜面培养：将刺糖多孢菌在斜面培养基上培养制成孢子悬液；
斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物3g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L和琼脂粉16g/L；
斜面培养条件：培养温度为28℃，转速为150r/min，培养周期为10d，pH为6.5；
S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液以体积比为1％的接种量转入种子活化培养基中，得到种子液；
种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物4g/L、酪蛋白胨25g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L和K2HPO41.3g/L；
种子培养条件：培养温度为30℃，转速为250r/min，培养周期为2d，pH为6；
S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液以体积比为10％的接种量转入发酵培养基中，发酵培养基共20mL，装于250mL的摇瓶中；依次进行三次物料补加，第一次补加在发酵2d时，补加卵磷脂2g/L和菜籽油1g/L，第二次补加在发酵4d时，补加葡萄糖3g/L和玉米浆1g/L，第三次补加在发酵8d时，补加玉米浆0.5g/L，得到发酵液；
发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖30g/L、可溶性淀粉15g/L、玉米浆8g/L、棉籽粉3g/L、豆饼粉3g/L、菜籽油15g/L、K2HPO41g/L和卵磷脂0.5g/L；
发酵培养条件：发酵温度为25℃、溶解氧为40％、pH为7、培养周期为7d、转速为120r/min；
(2)分离、纯化：
S4：发酵液预处理：向发酵液中加入质量分数为30％的NaOH溶液，调节pH至8并搅拌30min，离心得到固体A和清液；
S5：吸附剂吸附：向步骤S4得到的清液中加入大孔网状吸附剂，大孔网状吸附剂的加入量为步骤S4中清液体积的0.5％，加热至温度为30℃后搅拌15min并离心，得到固体B；
S6：混合干燥：将步骤S4得到的固体A与步骤S5得到的固体B混合，然后真空干燥，干燥温度为30℃，干燥时间为1h，得到干燥后的混合物；
S7：索氏提取：将步骤S6得到的干燥后的混合物置于索氏提取装置的接收瓶中，加入体积比为3:1的乙酸乙酯与乙醇混合液浸渍1h，加入量为步骤S6得到的干燥后的混合物质量的1倍，同时超声，超声频率为45kHz，进行第一阶段回流提取，回流次数为1次，水浴温度为80℃，然后再次浸渍24h，而后进行第二阶段回流提取，提取时间为0.5h，水浴温度为80℃，旋转蒸发得到浓缩液；
S8：析晶、分离及干燥：使用质量分数为30％的NaOH溶液调节步骤S7中浓缩液的pH至9，得到结晶液，而后离心得到湿晶，将湿晶干燥后得到多杀菌素。
实施例2
一种多杀菌素的生产方法，包括以下步骤：
(1)发酵：
S1：斜面培养：将刺糖多孢菌在斜面培养基上培养制成孢子悬液；
斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物3g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L和琼脂粉16g/L；
斜面培养条件：培养温度为28℃，转速为150r/min，培养周期为10d，pH为6.5；
S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液以体积比为1％的接种量转入种子活化培养基中，得到种子液；
种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物4g/L、酪蛋白胨25g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L和K2HPO41.3g/L；
种子培养条件：培养温度为30℃，转速为250r/min，培养周期为2d，pH为6；
S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液以体积比为10％的接种量转入发酵培养基中，发酵培养基共20mL，装于250mL的摇瓶中；依次进行三次物料补加，第一次补加在发酵3d时，补加卵磷脂2g/L和菜籽油1g/L，第二次补加在发酵7d时，补加葡萄糖3g/L和玉米浆1g/L，第三次补加在发酵9d时，补加玉米浆0.5g/L，得到发酵液；
发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖40g/L、可溶性淀粉20g/L、玉米浆12g/L、棉籽粉8g/L、豆饼粉8g/L、菜籽油20g/L、K2HPO42g/L和卵磷脂1g/L；
发酵培养条件：发酵温度为35℃、溶解氧为60％、pH为8、培养周期为9d、转速为250r/min；
(2)分离、纯化：
S4：发酵液预处理：向发酵液中加入质量分数为30％的NaOH溶液，调节pH至10并搅拌30min，离心得到固体A和清液；
S5：吸附剂吸附：向步骤S4得到的清液中加入大孔网状吸附剂，大孔网状吸附剂的加入量为步骤S4中清液体积的10％，加热至温度为50℃后搅拌60min并离心，得到固体B；
S6：混合干燥：将步骤S4得到的固体A与步骤S5得到的固体B混合，然后真空干燥，干燥温度为80℃，干燥时间为8h，得到干燥后的混合物；
S7：索氏提取：将步骤S6得到的干燥后的混合物置于索氏提取装置的接收瓶中，加入体积比为3:1的乙酸乙酯与乙醇混合液浸渍1h，加入量为步骤S6得到的干燥后的混合物质量的5倍，同时超声，超声频率为45kHz，进行第一阶段回流提取，回流次数为2次，水浴温度为80℃，然后再次浸渍24h，而后进行第二阶段回流提取，提取时间为2h，水浴温度为80℃，旋转蒸发得到浓缩液；
S8：析晶、分离及干燥：使用质量分数为30％的NaOH溶液调节步骤S7中浓缩液的pH至9，得到结晶液，而后离心得到湿晶，将湿晶干燥后得到多杀菌素。
实施例3
一种多杀菌素的生产方法，包括以下步骤：
(1)发酵：
S1：斜面培养：将刺糖多孢菌在斜面培养基上培养制成孢子悬液；
斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物3g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L和琼脂粉16g/L；
斜面培养条件：培养温度为28℃，转速为150r/min，培养周期为10d，pH为6.5；
S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液以体积比为1％的接种量转入种子活化培养基中，得到种子液；
种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物4g/L、酪蛋白胨25g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L和K2HPO41.3g/L；
种子培养条件：培养温度为30℃，转速为250r/min，培养周期为2d，pH为6；
S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液以体积比为10％的接种量转入发酵培养基中，发酵培养基共20mL，装于250mL的摇瓶中；依次进行三次物料补加，第一次补加在发酵2.5d时，补加卵磷脂2g/L和植物油1g/L，第二次补加在发酵5d时，补加葡萄糖3g/L和玉米浆1g/L，第三次补加在发酵8.5d时，补加玉米浆0.5g/L，得到发酵液；
发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖36g/L、可溶性淀粉18g/L、玉米浆10g/L、棉籽粉5g/L、豆饼粉5g/L、植物油18g/L、K2HPO41.5g/L和卵磷脂0.8g/L；
发酵培养条件：发酵温度为30℃、溶解氧为50％、pH为7.5、培养周期为8d、转速为200r/min；
所述的植物油为菜籽油与橄榄油按质量比2:1的比例混合而成；
(2)分离、纯化：
S4：发酵液预处理：向发酵液中加入质量分数为30％的NaOH溶液，调节pH至9并搅拌30min，离心得到固体A和清液；
S5：吸附剂吸附：向步骤S4得到的清液中加入大孔网状吸附剂，大孔网状吸附剂的加入量为步骤S4中清液体积的5％，加热至温度为30℃后搅拌15min并离心，得到固体B；
S6：混合干燥：将步骤S4得到的固体A与步骤S5得到的固体B混合，然后真空干燥，干燥温度为30℃，干燥时间为1h，得到干燥后的混合物；
S7：索氏提取：将步骤S6得到的干燥后的混合物置于索氏提取装置的接收瓶中，加入体积比为3:1的乙酸乙酯与乙醇混合液浸渍1h，加入量为步骤S6得到的干燥后的混合物质量的1倍，同时超声，超声频率为45kHz，进行第一阶段回流提取，回流次数为2次，水浴温度为80℃，然后再次浸渍24h，而后进行第二阶段回流提取，提取时间为2h，水浴温度为80℃，旋转蒸发得到浓缩液；
S8：析晶、分离及干燥：使用质量分数为30％的NaOH溶液调节步骤S7中浓缩液的pH至9，得到结晶液，而后离心得到湿晶，将湿晶干燥后得到多杀菌素。
实施例4
一种多杀菌素的生产方法，包括以下步骤：
(1)发酵：
S1：斜面培养：将刺糖多孢菌在斜面培养基上培养制成孢子悬液；
斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物3g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L和琼脂粉16g/L；
斜面培养条件：培养温度为28℃，转速为150r/min，培养周期为10d，pH为6.5；
S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液以体积比为1％的接种量转入种子活化培养基中，得到种子液；
种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物4g/L、酪蛋白胨25g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L和K2HPO41.3g/L；
种子培养条件：培养温度为30℃，转速为250r/min，培养周期为2d，pH为6；
S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液以体积比为10％的接种量转入发酵培养基中，发酵培养基共20mL，装于250mL的摇瓶中；依次进行三次物料补加，第一次补加在发酵2.5d时，补加卵磷脂2g/L和玉米油1g/L，第二次补加在发酵5d时，补加葡萄糖3g/L和玉米浆1g/L，第三次补加在发酵8.5d时，补加玉米浆0.5g/L，得到发酵液；
发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖32g/L、可溶性淀粉16g/L、玉米浆9g/L、棉籽粉4g/L、豆饼粉4g/L、玉米油16g/L、K2HPO41.2g/L和卵磷脂0.6g/L；
发酵培养条件：发酵温度为28℃、溶解氧为45％、pH为7、培养周期为7.5d、转速为150r/min；
(2)分离、纯化：
S4：发酵液预处理：向发酵液中加入质量分数为30％的NaOH溶液，调节pH至8并搅拌30min，离心得到固体A和清液；
S5：吸附剂吸附：向步骤S4得到的清液中加入大孔网状吸附剂，大孔网状吸附剂的加入量为步骤S4中清液体积的0.5％，加热至温度为30℃后搅拌15min并离心，得到固体B；
S6：混合干燥：将步骤S4得到的固体A与步骤S5得到的固体B混合，然后真空干燥，干燥温度为50℃，干燥时间为3h，得到干燥后的混合物；
S7：索氏提取：将步骤S6得到的干燥后的混合物置于索氏提取装置的接收瓶中，加入体积比为3:1的乙酸乙酯与乙醇混合液浸渍1h，加入量为步骤S6得到的干燥后的混合物质量的2倍，同时超声，超声频率为45kHz，进行第一阶段回流提取，回流次数为1次，水浴温度为80℃，然后再次浸渍24h，而后进行第二阶段回流提取，提取时间为1h，水浴温度为80℃，旋转蒸发得到浓缩液；
S8：析晶、分离及干燥：使用质量分数为30％的NaOH溶液调节步骤S7中浓缩液的pH至10，得到结晶液，而后离心得到湿晶，将湿晶干燥后得到多杀菌素。
实施例5
一种多杀菌素的生产方法，包括以下步骤：
(1)发酵：
S1：斜面培养：将刺糖多孢菌在斜面培养基上培养制成孢子悬液；
斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物3g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L和琼脂粉16g/L；
斜面培养条件：培养温度为28℃，转速为150r/min，培养周期为10d，pH为6.5；
S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液以体积比为1％的接种量转入种子活化培养基中，得到种子液；
种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物4g/L、酪蛋白胨25g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L和K2HPO41.3g/L；
种子培养条件：培养温度为30℃，转速为250r/min，培养周期为2d，pH为6；
S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液以体积比为10％的接种量转入发酵培养基中，发酵培养基共20mL，装于250mL的摇瓶中；依次进行三次物料补加，第一次补加在发酵2.5d时，补加卵磷脂2g/L和花生油1g/L，第二次补加在发酵5d时，补加葡萄糖3g/L和玉米浆1g/L，第三次补加在发酵8.5d时，补加玉米浆0.5g/L，得到发酵液；
发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖38g/L、可溶性淀粉19g/L、玉米浆11g/L、棉籽粉7g/L、豆饼粉6g/L、花生油19g/L、K2HPO41.8g/L和卵磷脂0.9g/L；
发酵培养条件：发酵温度为32℃、溶解氧为55％、pH为8、培养周期为8d、转速为220r/min；
(2)分离、纯化：
S4：发酵液预处理：向发酵液中加入质量分数为30％的NaOH溶液，调节pH至8并搅拌30min，离心得到固体A和清液；
S5：吸附剂吸附：向步骤S4得到的清液中加入大孔网状吸附剂，大孔网状吸附剂的加入量为步骤S4中清液体积的0.5％，加热至温度为30℃后搅拌15min并离心，得到固体B；
S6：混合干燥：将步骤S4得到的固体A与步骤S5得到的固体B混合，然后真空干燥，干燥温度为50℃，干燥时间为3h，得到干燥后的混合物；
S7：索氏提取：将步骤S6得到的干燥后的混合物置于索氏提取装置的接收瓶中，加入体积比为3:1的乙酸乙酯与乙醇混合液浸渍1h，加入量为步骤S6得到的干燥后的混合物质量的2倍，同时超声，超声频率为45kHz，进行第一阶段回流提取，回流次数为2次，水浴温度为80℃，然后再次浸渍24h，而后进行第二阶段回流提取，提取时间为2h，水浴温度为80℃，旋转蒸发得到浓缩液；
S8：析晶、分离及干燥：使用质量分数为30％的NaOH溶液调节步骤S7中浓缩液的pH至10，得到结晶液，而后离心得到湿晶，将湿晶干燥后得到多杀菌素。
对比例1
与实施例1的区别在于，步骤S3的发酵培养基主要成分及补加时均不加入卵磷脂。
对比例2
与实施例1的区别在于，步骤S3仅进行两次补加，第一次补加在发酵2d时，补加1g/L菜籽油和2g/L卵磷脂、3g/L葡萄糖和1g/L玉米浆，第二次补加在发酵8d时，补加0.5g/L玉米浆。
对比例3
与实施例1的区别在于，不进行物料补加，将需要补加的物料直接并入发酵培养基，即发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖39g/L、可溶性淀粉18g/L、玉米浆11.5g/L、棉籽粉5g/L、豆饼粉5g/L、菜籽油19g/L、K2HPO41.5g/L和卵磷脂2.8g/L。
对比例4
与实施例1的区别在于，步骤S3所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖30g/L、可溶性淀粉10g/L、玉米浆10g/L、棉籽粉5g/L、豆饼粉5g/L、菜籽油15g/L、K2HPO41g/L和卵磷脂0.5g/L。
对比例5
与实施例1的区别在于，步骤S3所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖45g/L、可溶性淀粉25g/L、玉米浆15g/L、棉籽粉10g/L、豆饼粉10g/L、菜籽油25g/L、K2HPO45g/L和卵磷脂2g/L。
对比例6
与实施例1的区别在于，发酵温度为20℃、溶解氧为30％、pH为6、培养周期为5d、转速为100r/min。
对比例7
与实施例1的区别在于，发酵温度为40℃、溶解氧为65％、pH为9、培养周期为10d、转速为280r/min。
对比例8
与实施例1的区别在于，步骤S7所述的索氏提取，不进行超声处理，回流提取2次后直接再提取1h。
测定采用实施例1-5及对比例1-8生产方法最终得到的多杀菌素的产率及纯度，如表1所示。
表1多杀菌素的产率及纯度
实例 产率(％) 纯度(％)
实施例1 89.32 95.98
实施例2 90.09 96.46
实施例3 90.32 96.65
实施例4 89.23 96.16
实施例5 89.02 95.32
对比例1 78.95 94.51
对比例2 80.22 94.65
对比例3 45.68 94.06
对比例4 75.54 95.01
对比例5 75.63 94.95
对比例6 78.21 95.09
对比例7 77.32 95.02
对比例8 85.28 88.21
由表1可知，实施例1-5中多杀菌素的产率及纯度均优于对比例1-8，其中实施例1-5的产率均高于89％，纯度均高于95％。由实施例1及对比例1可知，卵磷脂的加入有助于多杀菌素产率的提高；由实施例1及对比例2可知，三次补加的方式相比于二次补加，有助于促进多杀菌素产率的提高；由实施例1及对比例3可知，发酵过程进行物料补加，对多杀菌素产率的影响较大，进行补加后，产率可提高近一倍；由实施例1及对比例4-5比较可知，多杀菌素的产率受到发酵培养基中各组分质量浓度影响；通过实施例1及对比例6-7比较可知，多杀菌素的产率受到发酵温度、溶解氧、pH、培养周期及转速的影响；由实施例1及对比例8可知，分阶段索氏提取与超声结合，能够提高多杀菌素的产率及纯度。
综上可知，培养基的组分及培养条件、发酵过程物料的补加以及分离纯化过程均能影响多杀菌素的产率或纯度，本发明的一种多杀菌素的生产方法能够增加刺糖多孢菌的活性，提高其产率及纯度，同时具有环境污染小、成本低、效率高及工艺简单等优点。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种多杀菌素的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)发酵：
S1：斜面培养：将刺糖多孢菌在斜面培养基上培养制成孢子悬液；
S2：种子培养：将步骤S1得到的孢子悬液接种于种子活化培养基中，得到种子液；
S3：发酵培养：将步骤S2得到的种子液转入发酵培养基中，依次进行三次物料补加，第一次补加植物油和卵磷脂，第二次补加葡萄糖和玉米浆，第三次补加玉米浆，得到发酵液；
(2)分离、纯化：
S4：发酵液预处理：向发酵液中加入碱液，调节pH并搅拌，离心得到固体A和清液；
S5：吸附剂吸附：向步骤S4得到的清液中加入大孔网状吸附剂，加热搅拌后离心，得到固体B；
S6：混合干燥：将步骤S4得到的固体A与步骤S5得到的固体B混合，然后真空干燥，得到干燥后的混合物；
S7：索氏提取：将步骤S6得到的干燥后的混合物加入提取剂浸渍，同时超声，进行第一阶段回流提取后再次浸渍，而后进行第二阶段回流提取，旋转蒸发得到浓缩液；
S8：析晶、分离及干燥：调节步骤S7中浓缩液的pH得到结晶液，而后离心得到湿晶，将湿晶干燥后得到多杀菌素。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S3所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖30-40g/L、可溶性淀粉15-20g/L、玉米浆8-12g/L、棉籽粉3-8g/L、豆饼粉3-8g/L、植物油15-20g/L、无机盐1-2g/L和卵磷脂0.5-1g/L。
3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于：所述的发酵培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖36g/L、可溶性淀粉18g/L、玉米浆10g/L、棉籽粉5g/L、豆饼粉5g/L、植物油18g/L、无机盐1.5g/L和卵磷脂0.8g/L。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S3所述的发酵培养条件，发酵温度为25-35℃、溶解氧为40％-60％、pH为7-8、培养周期为7-9d、转速为120-250r/min。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S3所述的第一次补加卵磷脂和植物油，各组分按质量浓度计，分别为：卵磷脂2g/L和植物油1g/L；所述的第二次补加葡萄糖与玉米浆，各组分按质量浓度计，分别为：葡萄糖3g/L和玉米浆1g/L，所述的第三次补加玉米浆的质量浓度为0.5g/L。
6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S3所述的第一次补加在发酵2-3d时，所述的第二次补加在发酵4-7d时，所述的第三次补加在发酵8-9d时。
7.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S3所述的植物油为玉米油、花生油、大豆油、橄榄油、菜籽油和葵花籽油中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S3所述的无机盐为K2HPO4。
9.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S1所述的斜面培养，斜面培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物3g/L、无机盐0.2g/L和琼脂粉16g/L；培养温度为28℃，转速为150r/min，培养周期为10d，pH为6.5；步骤S2所述的种子培养，种子活化培养基组分按质量浓度计，包括：葡萄糖10g/L、可溶性淀粉5g/L、酵母提取物4g/L、酪蛋白胨25g/L和无机盐1.5g/L；培养温度为30℃，转速为250r/min，培养周期为2d，pH为6。
10.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：步骤S7中所述的提取剂是体积比为3:1的乙酸乙酯与乙醇混合液，所述提取剂的加入量为步骤S6得到的干燥后的混合物质量的1-5倍。
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