CN104372060A - 一种固态发酵饼粕制备低聚肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种固态发酵饼粕制备低聚肽的方法，涉及生物工程领域。一种或多种饼粕为原料，进行粉碎预处理，接种经扫频超声辅助培养的微生物发酵种子液，调节饼粕含水量至50%~60%（w/w），在多层输送带式发酵床30~35℃温度下进行60~80小时的磁场辅助发酵，发酵完成后加水提取低聚肽，提取液经离心去渣、脱色、干燥等步骤得到饼粕低聚肽产品。该方法可以显著降低固态发酵饼粕制备低聚肽的成本、提高生产效率。利用本方法所得到的低聚肽可用于人类保健和营养品、动物日粮等。

Description

一种固态发酵饼粕制备低聚肽的方法

 

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，具体涉及多肽生产和生物发酵技术，特指以油脂饼粕为主要原料、采用扫频超声波辅助制种、在多层输送带式发酵床上经磁场辅助固态发酵制备低聚肽的方法。

背景技术：

我国油脂饼粕资源极其丰富，绝大部分饼粕作为饲用目前一般直接添加到饲料中，加工方法比较粗放，造成生产效益较低，而且有些饼粕蛋白在油脂加工中热变性严重，造成动物的吸收利用率不高；有些饼粕含有植物凝集素、胰蛋白酶抑制因子（豆粕）或硫甙、芥酸（菜籽粕）等抗营养因子，还会对动物的生长产生抑制甚至导致伤害。使用微生物固态发酵油脂饼粕不仅可降解变性蛋白质从而提高其生物利用度、并可得到活性多肽产品，而且经过微生物的发酵作用还可同时将饼粕中的抗营养因子分解为无害成分。中国专利CN200810243460.1公开了一种采用混菌固态发酵制备菜籽活性肽的方法，CN200610097552.4专利中则公开了一种固态发酵生产富含益生菌多肽制品的方法，这两则专利均证明通过固态发酵可以有效制备获得活性低聚肽。

然而，现有固态发酵制备低聚肽的方法普遍存在发酵周期长、生产效率低、菌种成本较高等不足，制约固态发酵技术的推广应用。例如，固态发酵初始阶段需要接种大量微生物种子培养液，种子液接种量是决定固态发酵工艺成本的主要方面之一；另外，固态发酵过程中由于传质和传热的效率不高，影响了微生物的生长及分泌酶的效率，这是目前微生物固态发酵效率普遍较低、周期长的主要原因。因此，在传统固态发酵饼粕制备低聚肽工艺基础上，采用新方法降低固态发酵菌种培养成本，并提高发酵效率，是目前固态发酵制备低聚肽生产中迫切要解决的问题。

近年来，人们发现微生物在外界超声场加载于微生物培养液时有可刺激微生物菌种生长，因此通过筛选超声作用条件可提高菌种生长数量，从而可节约接种成本。由于同一种微生物在生长繁殖过程中其结构也会存在微小的差异，因此使用固定频率超声波难以对所有微生物细胞进行有效刺激。扫频模式超声波辐射时可围绕中心频率在一定频率范围内进行周期性扫频变化，可对细胞具有微小差异进行共振，从而获得更好的处理效果。磁场对生物生长的促进作用也引起人们极大的关注，在磁场作用下微生物活力、产酶量及胞内外物质传递效率等因素可发生显著变化，因此在固态发酵制备低聚肽过程中可利用磁场作用提高发酵效率。另外与超声场不同，磁场不需要液态介质即可发挥作用，尤其适用于固态发酵。

固态发酵一般规模较大，因此设计简便、实用的发酵工艺极为重要，发酵基质需要定期均匀翻料，但又不需要频繁翻料，因此可利用多层输送带发酵装置，使发酵基质在带上发酵，并通过上层带向下层洒落而得以均匀翻料。

总之，通过采用超声辅助菌种培养、磁场作用下带式多层固态发酵等新技术，可显著降低固态发酵制备低聚肽的成本、提高生产效率，无疑将具有巨大的经济效益和社会效益。

 

发明内容：

本发明的目的是提供一种固态饼粕发酵制备低聚肽的新方法，该方法中将扫频超声波应用于发酵种子液制备、提高菌种数量，通过多层输送带式发酵床进行固态发酵饼粕原料，并在发酵过程采用磁场辐射以提高发酵效率。

本发明的技术方案：以一种或多种饼粕为原料，进行粉碎预处理，接种经扫频超声辅助培养的微生物发酵种子液，调节含水量至50%-60%（w/w），在多层输送带式发酵床30~35℃经磁场辅助发酵60~80小时，加水提取低聚肽，提取液经离心去渣、脱色、干燥等步骤得到饼粕低聚肽产品。

一种固态发酵饼粕制备低聚肽的方法，按照下述步骤进行：

（1）原料进行粉碎预处理，过60~80目筛。

（2）接种微生物发酵剂：采用扫频超声辅助培养罐培养接种微生物菌种培养发酵剂，接种占原料饼粕质量5%~10%的发酵剂，混匀。

（3）固态发酵：调节发酵基质水分含量至50%~60%（w/w），在多层输送带式磁场辅助固态发酵床进行发酵。

（4）低聚肽提取：按照固液质量比1:3~1:5比例加水提取低聚肽，提取2~3次，合并提取液，卧螺式离心、再经板框式压滤机过滤得到低聚肽粗提液。

（5）低聚肽成品制备：用活性炭脱色，经真空浓缩后喷雾干燥得到低聚肽成品。

步骤（2）所述扫频超声辅助培养罐由发酵罐体、扫频超声振子、超声发生器、搅拌器、控制器等组成。

步骤（2）所述微生物发酵剂的发酵菌种为一种细菌类菌种——枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）与毕赤酵母（Pichia Pastoris）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或黑曲霉（Aspergillus niger）等真菌类菌种中的一种配合使用；使用时分别培养制备种子液，按体积比1:1混合后接种发酵饼粕。

步骤（2）所述微生物发酵剂按如下步骤制备：

1）配制种子液体培养基，其成分为蛋白胨1.0%（w/v）、氯化钠0.5%（w/v）、牛肉浸膏0.3%（w/v），混合均匀、灭菌后注入已灭菌的扫频超声辅助培养罐； 

2）发酵种子液制备 将经活化后的各微生物分别接种在装有发酵种子培养基的扫频超声辅助培养罐中进行扩大培养，设定培养罐转速为180r/min，超声频率为20~68kHz、扫频范围±0.5~±2kHz，于30~35℃培养24~48h。

步骤（3）所述多层输送带式磁场辅助发酵床上由发酵箱体、3~5层输送带、温湿度调节系统、进出料系统级控制系统等组成，每层输送带两侧分布永磁体，在发酵区域形成磁场强度为0.05~0.1特斯拉的磁场。

步骤（3）所述固态发酵步骤为将接种后的饼粕均匀摊布在发酵床输送带上，摊布厚度为20~40厘米，30~35℃发酵60~80小时，发酵期间通过每20~24小时开动输送带，使上层发酵基质散落至下层实现翻料。

本发明所用饼粕原料为大豆饼粕、菜籽饼粕、花生饼粕、葵花籽饼粕、芝麻饼粕及亚麻籽饼粕等中的一种或几种。

通过对比试验（种子液培养不施加扫频超声、采用槽式发酵池并定期人工翻料、且发酵过程不使用磁场促进，其他条件相同），经检测，本发明采用扫频超声辅助培养枯草芽孢杆菌、酵母菌及黑曲霉，在同等条件下与无超声培养相比，种子液中菌数分别提高116~290%、63%~152%以及160~264%，本发明技术生产的低聚肽产品得率比对照试验提高13.5%~46.4%，产品中蛋白质含量提高8.97%~15.2%，肽含量提高14.3%~36.7%。

利用本发明所得到的低聚肽可用于人类保健和营养品、动物日粮等。

与传统固态发酵工艺相比，本发明如下特点和有益效果：

1、本发明采用一体化的输送带式发酵床固态发酵，具有生产工艺简单、翻料均匀便捷、节能、易于工业化生产等优势。

2、本发明采用扫频超声辅助培养发酵种子液，可大幅提高菌数量、减少接种量从而显著降低成本。

3、本发明采用磁场辅助固态发酵，明显提高发酵效率、增加低聚肽产率，有着巨大的经济效益和社会效益，具有良好的应用前景。

4、微生物发酵饼粕不仅可获得经济价值巨大的低聚肽，微生物发酵对饼粕中一些抗营养因子可同时分解，产品达到人和动物的食用标准并含有其他多种人体有益功能因子。

 

附图说明

图1是本发明使用的扫频超声辅助微生物培养罐示意图。图1 a：培养罐正视图； 图1 b：培养罐俯视图。其中1— 培养罐体（夹套控温）；2— 超声振子；3— 超声发生器；4— 搅拌器；5— 投料口；6— 导线；7— 出料口。

图2是本发明所使用多层输送带式磁场辅助固态发酵床示意图。其中1— 发酵箱体；2— 输送带；3— 永磁体（输送带两侧相对均匀排布）；4— 加料器；5— 卸料口；发酵床中永磁体形成的磁场强度范围经测定为0.05~0.1特斯拉。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1

取豆粕100千克、菜籽粕100千克，进行粉碎过60目筛，混匀备用。配制种子液体培养基，其成分为蛋白胨1.0%（w/v）、氯化钠0.5%（w/v）、牛肉浸膏0.3%（w/v），混合均匀、灭菌后从附图1中投料口5加入已灭菌的扫频超声辅助培养罐1由投料口5接种活化的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis到培养罐，控制培养温度35℃，通过调节附图1中超声发生器3的超声波工作模式通过导线6控制超声振子2，使用扫频超声辅助培养24小时，超声频率28kHz、扫频范围±2kHz，搅拌器4用于搅拌，充分发酵，培养结束从出料口7放出种子培养液备用。按照相同的步骤和培养基配方，用另一只扫频超声辅助培养罐Pichia Pastoris对毕赤酵母35℃进行扫频超声辅助培养24小时，超声频率40kHz、扫频范围±1kHz，其他条件及操作步骤同枯草芽孢杆菌的培养。按体积比1:1混合后接种发酵。按照培养液与饼粕质量比1:20将两种种子培养液分别接种到豆粕、菜籽粕混合物中，调节饼粕含水量50%，用拌料器拌匀，通过加料器4均匀加到输送带式发酵床的2输送带上，厚度为20厘米，控制发酵箱体1内空气温度35℃，在永磁体3形成的磁场中发酵72小时。发酵期间每20小时翻料一次（通过输送带移动使上层发酵基质散落至下层）。发酵结束通过卸料口5出料。

按照发酵饼粕和水质量比1:5比例加水提取低聚肽，提取2次，合并提取液，卧螺式离心、再经板框式压滤机过滤得到低聚肽粗提液，用活性炭脱色，用截留分子量10,000Dalton超滤膜系统过滤，再经真空浓缩、喷雾干燥得到低聚肽成品35千克。

经检测，成品低聚肽蛋白质含量91%，肽含量为78%，硫苷含量6.8μmol/g。通过对比试验（种子液培养不施加扫频超声、采用槽式发酵池并定期人工翻料、且发酵过程不使用磁场促进，其他条件相同），结果发现本发明采用扫频超声辅助培养枯草芽孢杆菌、毕赤酵母，与无超声培养相比，种子液中菌数分别提高180%、63%。对照试验低聚肽产品得到24千克，其中蛋白质含量79%，肽含量为56%，硫苷含量19.3μmol/g。本发明技术使低聚肽产品得率提高37.5%，产品中蛋白质含量提高15.2%，肽含量提高27.9%，硫苷含量降低39.8%。

实施例2

取花生粕100千克、葵花籽粕100千克，进行粉碎过80目筛，混匀备用。

配制种子液体培养基，其成分同实施例1，混合均匀、灭菌后注入已灭菌的扫频超声辅助培养罐，接种活化的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis到培养罐，35℃扫频超声辅助培养36小时，超声频率40kHz、扫频范围±0.5kHz。按照相同的步骤和培养基配方，用另一只扫频超声辅助培养罐对黑曲霉Aspergillus niger进行超声辅助培养24小时，超声频率20kHz、扫频范围±1.5kHz。按体积比1:1混合后接种发酵。按照培养液与饼粕质量比1:20将两种种子培养液分别接种到豆粕、菜籽粕混合物中，调节饼粕含水量50%，用拌料器拌匀，通过加料器均匀加到输送带式发酵床的带上，厚度为30厘米，在35℃磁场辅助发酵72小时。发酵期间每24小时翻料一次（通过输送带移动使上层发酵基质散落至下层）。

按照发酵饼粕和水质量比1:3比例加水提取低聚肽，提取3次，合并提取液，卧螺式离心、再经板框式压滤机过滤得到低聚肽粗提液，用活性炭脱色，用截留分子量10,000 Dalton超滤膜系统过滤，再经真空浓缩、喷雾干燥得到低聚肽成品41千克。

经检测，成品低聚肽蛋白质含量93%，肽含量为82%。通过对比试验（种子液培养不施加扫频超声、采用槽式发酵池并定期人工翻料、且发酵过程不使用磁场促进，其他条件相同），结果发现本发明采用扫频超声辅助培养枯草芽孢杆菌、黑曲霉，与无超声培养相比，种子液中菌数分别提高290%、264%。对照试验低聚肽产品得到28千克，其中蛋白质含量81%，肽含量为60%。本发明技术使低聚肽产品得率提高46.4%，产品中蛋白质含量提高14.8%，肽含量提高36.7%。

 

实施例3

取芝麻粕100千克、亚麻籽粕100千克，进行粉碎过70目筛，混匀备用。

配制种子液体培养基，其成分同实施例1，混合均匀、灭菌后注入已灭菌的扫频超声辅助培养罐，接种活化的枯草芽孢杆菌到培养罐，35℃扫频超声辅助培养24小时，超声频率68kHz、扫频范围±2kHz。按照相同的步骤和培养基配方，用另一只扫频超声辅助培养罐对酿酒酵母进行超声辅助培养36小时，超声频率40kHz、扫频范围±1kHz。。

按照培养液与饼粕质量比1:40将两种种子培养液分别接种到豆粕、菜籽粕混合物中，调节饼粕含水量50%，用拌料器拌匀，通过加料器均匀加到输送带式发酵床的带上，厚度为40厘米，在30℃磁场辅助发酵60小时。发酵期间每20小时翻料一次（通过输送带移动使上层发酵基质散落至下层）。

按照发酵饼粕和水质量比1:4比例加水提取低聚肽，提取3次，合并提取液，卧螺式离心、再经板框式压滤机过滤得到低聚肽粗提液，用活性炭脱色，用截留分子量10,000 Dalton超滤膜系统过滤，再经真空浓缩、喷雾干燥得到低聚肽成品33千克。

经检测，成品低聚肽蛋白质含量85%，肽含量为72%。通过对比试验（种子液培养不施加扫频超声、采用槽式发酵池并定期人工翻料、且发酵过程不使用磁场促进，其他条件相同），结果发现本发明采用扫频超声辅助培养枯草芽孢杆菌、酿酒酵母，与无超声培养相比，种子液中菌数分别提高116%、152%。对照试验低聚肽产品得到27千克，其中蛋白质含量78%，肽含量为63%。本发明技术使低聚肽产品得率提高18.2%，产品中蛋白质含量提高8.97%，肽含量提高14.3%。

 

实施例4

取豆粕200千克，进行粉碎过60目筛，混匀备用。

配制种子液体培养基，其成分同实施例1，混合均匀、灭菌后注入已灭菌的扫频超声辅助培养罐，接种活化的枯草芽孢杆菌到培养罐，35℃扫频超声辅助培养24小时，超声频率35kHz、扫频范围±1kHz。按照相同的步骤和培养基配方，用另一只扫频超声辅助培养罐对黑曲霉进行超声辅助培养36小时，超声频率20kHz、扫频范围±2kHz。。

按照培养液与饼粕质量比1:20将两种种子培养液分别接种到豆粕、菜籽粕混合物中，调节饼粕含水量50%，用拌料器拌匀，通过加料器均匀加到输送带式发酵床的带上，厚度为30厘米，在35℃磁场辅助发酵80小时。发酵期间每20小时翻料一次（通过输送带移动使上层发酵基质散落至下层）。

按照发酵饼粕和水质量比1:5比例加水提取低聚肽，提取3次，合并提取液，卧螺式离心、再经板框式压滤机过滤得到低聚肽粗提液，用活性炭脱色，用截留分子量10,000 Dalton超滤膜系统过滤，再经真空浓缩、喷雾干燥得到低聚肽成品37千克。

经检测，成品低聚肽蛋白质含量89%，肽含量为78%。通过对比试验（种子液培养不施加扫频超声、采用槽式发酵池并定期人工翻料、且发酵过程不使用磁场促进，其他条件相同），结果发现本发明采用扫频超声辅助培养枯草芽孢杆菌、黑曲霉，与无超声培养相比，种子液中菌数分别提高231%、160%。对照试验低聚肽产品得到32千克，其中蛋白质含量80%，肽含量为66%。本发明技术使低聚肽产品得率提高13.5%，产品中蛋白质含量提高11.2%，肽含量提高18.2%。

Claims (7)

1.一种固态发酵饼粕制备低聚肽的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）原料进行粉碎预处理，过60~80目筛；

（2）接种微生物发酵剂：采用扫频超声辅助培养罐培养接种微生物菌种培养发酵剂，接种占原料饼粕质量5%~10%的发酵剂，混匀；

（3）固态发酵：调节发酵基质水分含量至50%~60%（w/w），在多层输送带式磁场辅助固态发酵床进行发酵；

（4）低聚肽提取：按照固液质量比1:3~1:5比例加水提取低聚肽，提取2~3次，合并提取液，卧螺式离心、再经板框式压滤机过滤得到低聚肽粗提液；

（5）低聚肽成品制备：用活性炭脱色，经真空浓缩后喷雾干燥得到低聚肽成品。

2.根据权利要求1所述的一种固态发酵饼粕制备低聚肽的方法，其特征在于步骤（2）所述扫频超声辅助培养罐由发酵罐体、扫频超声振子、超声发生器、搅拌器、控制器等组成。

3.根据权利要求1所述的一种固态发酵饼粕制备低聚肽的方法，其特征在于步骤（2）所述微生物发酵剂的发酵菌种为一种细菌类菌种——枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）与毕赤酵母（Pichia Pastoris）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或黑曲霉（Aspergillus niger）等真菌类菌种中的一种配合使用；使用时分别培养制备种子液，按体积比1:1混合后接种发酵饼粕。

4.根据权利要求1所述的一种固态发酵饼粕制备低聚肽的方法，其特征在于步骤（2）所述微生物发酵剂按如下步骤制备：

1）配制种子液体培养基，其成分为蛋白胨1.0%（w/v）、氯化钠0.5%（w/v）、牛肉浸膏0.3%（w/v），混合均匀、灭菌后注入已灭菌的扫频超声辅助培养罐； 

2）发酵种子液制备 将经活化后的各微生物分别接种在装有发酵种子培养基的扫频超声辅助培养罐中进行扩大培养，设定培养罐转速为180r/min，超声频率为20~68kHz、扫频范围±0.5~±2kHz，于30~35℃培养24~48h。

5.根据权利要求1所述的一种固态发酵饼粕制备低聚肽的方法，其特征在于步骤（3）所述多层输送带式磁场辅助发酵床上由发酵箱体、3~5层输送带、温湿度调节系统、进出料系统级控制系统等组成，每层输送带两侧分布永磁体，在发酵区域形成磁场强度为0.05~0.1特斯拉的磁场。

6.根据权利要求1所述的一种固态发酵饼粕制备低聚肽的方法，其特征在于步骤（3）所述固态发酵步骤为将接种后的饼粕均匀摊布在发酵床输送带上，摊布厚度为20~40厘米，30~35℃发酵60~80小时，发酵期间通过每20~24小时开动输送带，使上层发酵基质散落至下层实现翻料。

7.根据权利要求1所述的一种固态发酵饼粕制备低聚肽的方法，其特征在于所用饼粕原料为大豆饼粕、菜籽饼粕、花生饼粕、葵花籽饼粕、芝麻饼粕及亚麻籽饼粕等中的一种或几种。