BR112015024012B1 - Processo para obter pelo menos um piripiropeno, processo para produzir pelo menos um composto de fórmula iii, fórmula iv ou fórmula v, processo para obter pelo menos um composto de fórmula i ou fórmula ii e usos de biomassa seca - Google Patents

Abstract

processo para se obter pelo menos um piripiropeno, processos para a produção e para obtenção de pelo menos um composto, biomassa seca e seu uso. a presente invenção refere-se a processos para produzir biomassa seca de organismos produtores de piripiropeno, processos para obter piripiropenos a partir de tal biomassa seca, assim como a processos para produzir compostos da fórmula (iii) e / ou fórmula (iv) e / ou fórmula (v) a partir dos piripiropenos obtidos da biomassa seca. a invenção refere-se ainda à própria biomassa seca, assim como a processos que usam a referida biomassa seca para obter piripiropenos para a produção de compostos da fórmula (iii) e / ou fórmula (iv) e / ou fórmula (v), incluindo processos que usam a referida biomassa seca para obter piripiropenos ou compostos da fórmula (iii) e / ou fórmula (iv) e / ou fórmula (v) a fim de produzir composições para controle de pragas, em particular inseticidas, compreendendo tais compostos.

Description

[001] Este pedido reivindica prioridade a EP 13161548.6 depositado em 28 de março de 2013, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A invenção refere-se a processos para a produção de biomassa seca de organismos produtores de piripiropenos, processos para obtenção de tais piripiropenos a partir dessa biomassa seca, bem como a processos para produzir compostos da fórmula III e / ou Fórmula IV e / ou Fórmula V a partir dos piripiropenos obtidos a partir da biomassa seca. A invenção refere-se ainda à própria biomassa seca, assim como a processos que utilizam a referida biomassa seca para obter piripiropenos para a produção de compostos da fórmula III e / ou Fórmula IV e / ou Fórmula V, incluindo processos que utilizam a referida biomassa seca para obter piripiropenos ou compostos da fórmula III e / ou Fórmula IV e / ou Fórmula V a fim de produzir composições para o controle de pragas, em particular inseticidas, compreendendo tais compostos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Piripiropenos são um grupo de compostos de ocorrência natural, que são produzidos como metabólitos secundários por microrganismos e, em particular, por vários fungos filamentosos. Este grupo de compostos têm atraído a atenção porque eles mostram inibição muito potente da colesterol aciltransferase Acil-CoA: (ACAT) em microssomas de fígado de rato (Journal of Antibiotics (1996), 49 (3), 292-298) e têm atividade inseticida contra vários insetos, por exemplo, contra Helicoverpa armigera larva (Applied and Environmental Microbiology (1995), 61 (12), 4429-4435), Diamondback moth larva (WO 2004/060065), Tenebrio molitor (WO 2004/060065) e afídeos (WO 2006/129714).

[004] Até agora, a síntese química de piripiropenos permanece bastante difícil, de modo que uma grande proporção de piripiropenos ainda é produzida através da fermentação de microorganismos. Microorganismos com a capacidade de produzir piripiropenos são, por exemplo, Penicillium coprobium estirpe PF-1169 (Journal of Technical Disclosuren° 500997 / 2008), Aspergillus fumigatus estirpe IF0-1289 (Publicação de Patente Japonesa n° 360895/1992), Eupenicillium reticulosporum estirpe NRRL-3446 (Applied and Environmental Microbiology (1995), 61 (12), 4429-4435), Penicillium griseofulvum estirpe F1959 (WO 2004/060065), bem como Aspergillus fumigatus FO1289 e seu mutante Aspergillus fumigatus FO1289-2501. Muitas vezes estes microorganismos, por exemplo, Aspergillus fumigatus FO1289 e seu mutante Aspergillus fumigatus FO1289-2501 produzem não apenas um, mas vários piripiropenos diferentes que diferem em estruturas de suas cadeias laterais (Journal of Antibiotics (1996), 49 (3), 292-298).

[005] Pesquisas na área de piripiropenos permitiram não só a identificação de microorganismos produtores de piripiropeno e a identificação de diferentes tipos de piripiropenos de ocorrência natural, mas também proporcionaram uma infinidade de derivados de piripiropenos produzidos através de modificação química daqueles de ocorrência natural. Exemplos destes derivados, bem como os seus processos de produção são descritos nos documentos EP1889540, EP2119361, EP2186815 e EP2426124.

[006] Coletar todo o potencial deste grupo de interesse de compostos naturais e seus derivados exigirá a utilização de métodos eficazes de produção em larga escala de piripiropenos. No entanto, a produção de piripiropenos por fermentação de microorganismos e sua coleta por meio de extração da biomassa produzida ainda sofre problemas técnicos e de custos elevados causados durante a manipulação e o armazenamento da biomassa produzida e / ou ligada à manipulação de grandes volumes durante e após a extração de piripiropenos a partir da biomassa. Os problemas técnicos de particular importância são, por exemplo, a falta de meios para armazenamento a longo prazo da biomassa produzida e a ocorrência de elevadas resistências a filtros durante a extração de piripiropenos a partir de grandes volumes de biomassa.

[007] A presente invenção resulta em parte da descoberta de que é possível isolar piripiropenos da biomassa seca sem sofrer uma influência negativa sobre o rendimento do piripiropenos extraídos em comparação com extrações a partir de material não seco. Embora a produção de biomassa seca e sua utilização para a extração de piripiropenos tenham elevado grandemente a estabilidade durante o armazenamento da biomassa, elas resultam em baixa resistência a filtro durante a extração de piripiropenos e levam a maiores concentrações de piripiropenos após extração.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A invenção inclui um processo para se obter pelo menos um piripiropeno compreendendo as etapas de: a) cultura de um organismo produtor de piripiropeno em um caldo de cultura sob condições de cultura, em que pelo menos um piripiropeno é produzido, b) produção de biomassa seca a partir de pelo menos uma parte da biomassa obtida na etapa a), c) obtenção de pelo menos um piripiropeno a partir da biomassa seca produzida na etapa b).

[009] Este processo pode compreender uma etapa, em que a biomassa seca produzida na etapa b) é produzida diretamente por meio de secagem por pulverização do meio de cultura compreendendo a biomassa, ou é produzida através de secagem da biomassa úmida obtida a partir do caldo de cultura.

[010] A biomassa úmida pode ser obtida a partir do caldo de cultura através de: a) filtração e / ou centrifugação, ou b) filtração e aplicação de pressão mecânica, ou c) filtração e / ou centrifugação e aplicação de pressão mecânica.

[011] A biomassa úmida pode ainda ser: a) ressuspensa em um meio de ressuspensão, b) homogeneizada, pode ter c) um teor de glicose de menos de 5 g / l, pode ter d) um teor de água entre mais do que 15% e menos do que 90%, ou pode ter; e) uma combinação de pelo menos duas dessas características a) a d).

[012] O processo como acima descrito pode ainda compreender uma etapa, em que a biomassa seca é produzida por secagem em secador por pulverização, um secador moinho de pasta, um secador flash, um secador de leito fluido, ou um secador rotativo. De preferência, a biomassa seca é produzida por secagem em secador por pulverização ou um secador moinho de pasta. A biomassa seca produzida e utilizada nos processos descritos acima pode ser armazenada de cerca de 5 horas, ou até vários anos, antes do piripiropeno ser obtido. Além disso, a biomassa seca acima mencionada tem de preferência um teor de água residual inferior a 10%. Em uma forma de realização da invenção, a biomassa seca consiste em mais de 80% de partículas com um tamanho entre 0,01 mm a 5 mm.

[013] De preferência, a matéria seca produzida e utilizada nos processos descritos acima compreende pelo menos 95% do piripiropeno produzido durante a cultura do organismo produtor piripiropeno, ou seja, a quantidade de piripiropeno compreendida na biomassa úmida colhida do caldo de cultura depois da fermentação do organismo produtor de piripiropeno. De preferência, o organismo produtor de piripiropeno pertence ao gênero Penicillium, Eupenicillium, ou Aspergillus, ainda mais preferivelmente o organismo produtor de piripiropeno é selecionado a partir do grupo que consiste em Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum e Aspergillus fumigatus. Mais preferivelmente, o organismo produtor de piripiropeno é Pennicillium coprobium.

[014] Os processos descritos acima geralmente compreendem uma etapa, na qual o piripiropeno é obtido a partir da biomassa seca através de extração, de preferência por meio de extração com um solvente selecionado a partir do grupo de metanol, tolueno e etil benzeno, ou é uma mistura de pelo menos dois deles. Em uma forma de realização da invenção, os processos descritos acima compreendem uma etapa de extração de pelo menos um piripiropeno a partir da biomassa seca e separação do solvente utilizado para extração da biomassa extraída por filtração, em que a resistência do filtro é de preferência abaixo de 5 * 1013mPas / m2.

[015] Os processos tal como descrito acima podem também compreender uma etapa para produzir pelo menos um composto da Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V, em que pelo menos um piripiropeno é obtido através de um processo como descrito acima, e é utilizado para produzir pelo menos um composto da Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V. Estes processos podem compreender adicionalmente a etapa de obter ou purificar o composto da Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V, que pode ainda ser usado para produzir uma composição de controle de pragas, que é de preferência um inseticida.

[016] Outra forma de realização da invenção é biomassa seca de um organismo produtor de piripiropeno compreendendo pelo menos um piripiropeno e tendo um teor de água de menos de 10%, ou possuindo um tamanho de partícula entre 0,01 mm e 5 mm, ou tendo um teor de água inferior a 10% e um tamanho de partícula entre 0,01 mm a 5 mm. A biomassa seca é de preferência de um organismo produtor de piripiropeno selecionado a partir do grupo de Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum e Aspergillus fumigatus, ainda mais preferivelmente, a biomassa seca é de Penicillium coprobium.

[017] Outra forma de realização da invenção é um processo para se obter pelo menos um composto da Fórmula I, ou para a produção de pelo menos um composto da Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V, a partir da biomassa seca de um organismo produtor de piripiropeno que compreende pelo menos um piripiropeno e com um teor de água inferior a 10%, ou com um tamanho de partícula entre 0,01 mm a 5 mm, ou com um teor de água de menos de 10% e um tamanho de partícula entre 0,01 mm e 5 mm. A biomassa seca é de preferência de um organismo produtor de piripiropeno selecionado a partir do grupo de Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum e Aspergillus fumigatus, ainda mais preferivelmente, a biomassa seca é de Penicillium coprobium. De preferência, este processo é um processo em que um composto da Fórmula II é obtido. Em outra forma de realização, o composto obtido da fórmula II é usado para produzir pelo menos um composto da Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V, de um modo preferido utilizado para produzir um composto da Fórmula V. O processo pode ainda incluir uma etapa adicional, em que pelo menos um composto da Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V, de um modo preferido um composto da Fórmula V sendo produzido durante o processo, é adicionalmente utilizado para produzir uma composição de controle de pragas compreendendo pelo menos um composto da Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V. De preferência, a composição de controle de pragas é um inseticida.

[018] A invenção não inclui ainda a utilização de biomassa seca de um organismo produtor de piripiropeno compreendendo pelo menos um piripiropeno e com um teor de água de menos de 10%, ou com um tamanho de partícula entre 0,01 mm a 5 mm, ou com um teor de água inferior a 10% e um tamanho de partícula entre 0,01 mm a 5 mm, para se obter pelo menos um composto da Fórmula I. A biomassa seca é de preferência de um organismo produtor de piripiropeno selecionado a partir do grupo de Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum e Aspergillus fumigatus, ainda mais preferivelmente, a biomassa seca é de Penicillium coprobium. De preferência, a biomassa seca é utilizada para se obter um composto da Fórmula II.

[019] Também compreendido pela invenção é o uso de biomassa seca de um organismo produtor de piripiropeno compreendendo pelo menos um piripiropeno e tendo um teor de água de menos de 10%, ou com um tamanho de partícula entre 0,01 mm a 5 mm, ou tendo um teor de água inferior a 10% e um tamanho de partícula entre 0,01 mm a 5 mm, em um processo para produzir pelo menos um composto da Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V. A biomassa seca é de preferência de um organismo produtor de piripiropeno selecionado a partir do grupo de Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum e Aspergillus fumigatus, ainda mais preferivelmente, a biomassa seca é de Penicillium coprobium.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[020] A Figura 1 representa um desenho esquemático de um secador moinho de pasta (paste mill dryer) utilizado nos Exemplos I e II.

[021] O processo inicia-se com um fornecimento de biomassa úmida (Alimentação Úmida) para dentro um recipiente no lado esquerdo da Figura 1. O recipiente é fornecido com um rotor acionado por um motor (M) na parte inferior do recipiente, para homogeneização da biomassa úmida antes de ser alimentada ao secador moinho de pasta por um parafuso alimentado pelo motor (M). O secador moinho de pasta representado no lado esquerdo do centro da Figura 1 é novamente provido de um número de facas rotoras no terço inferior do secador moinho de pasta. As facas rotoras são alimentadas por um motor (M) na parte inferior do secador moinho de pasta. O secador moinho de pasta também é fornecido com um fornecimento de ar quente no terço inferior de seu volume. O fluxo de ar é representado no centro direito inferior da Figura 1 e é caracterizado por um controle de fluxo (FC), um dispositivo para aquecimento do ar, e um controle de temperatura (TC) que regula a potência do dispositivo de aquecimento, a fim de fornecer o ar com uma temperatura de entrada predeterminada. O ar quente fornecido ao terço inferior do secador moinho de pasta mistura com a biomassa úmida fornecida pelo parafuso e homogeneizada pelas facas rotoras que giram perto da alimentação da biomassa úmida. O resultado desta combinação é que a biomassa úmida é tomada por um vórtice de ar quente no terço médio do volume do secador moinho de pasta, onde é seca. A biomassa seca produzida pelo presente processo é levada ainda para cima pelo ar quente para o espaço central (terço superior do volume) do secador moinho de pasta, onde ele flui através de um tubo para um recipiente adicional que compreende um filtro interno e sendo representado no lado direito da Figura 1. A biomassa seca é recolhida através do filtro na parte inferior do recipiente e pode ser esvaziada dentro de outro recipiente para o armazenamento ou transporte adicional da biomassa seca (produto seco). O tubo de ligação do secador moinho de pasta e o recipiente que compreende o funil compreende outro sensor para controle de temperatura (TC) que mede a temperatura da corrente de ar de saída (temperatura de saída) e regula a velocidade do motor (M) que aciona o parafuso da alimentação de biomassa úmida para o secador moinho de pasta. O próprio moinho secador de pasta é ainda proporcionado com um controle de pressão (PC) que controla um motor (M) localizado na saída do recipiente que compreende o funil e controla a quantidade de ar (gás de saída) que pode escapar do recipiente compreendendo o funil.

[022] A Figura 2 representa um desenho esquemático do secador por pulverização usado no Exemplo III.

[023] O secador por pulverização consiste basicamente em uma estrutura semelhante a funil na parte inferior do secador por pulverização que tem uma altura descrita por H3, um diâmetro total na parte superior descrito por D1 e um diâmetro na parte inferior ou abertura, respectivamente, descrito por D2. No topo desta estrutura semelhante a funil está uma seção média formada como um tambor e com uma altura descrita por H2, e um diâmetro superior e inferior idêntico ao diâmetro superior da estrutura semelhante a funil descrita por D1. A parte superior fechada do secador por pulverização compreende um espaço principal que tem uma altura descrita por H1. Este espaço principal compreende também um tubo e um bocal através do qual a biomassa úmida é alimentada e pulverizada para dentro da seção média do secador por pulverização. Todo o secador por pulverização é fornecido com um fluxo de ar quente, que leva para cima a biomassa úmida finamente distribuída para secagem do fluxo de co-corrente abaixo do secador. Um fluxo misto de biomassa seca e gás de secagem sai do secador na parte inferior do corpo secador em direção a um separador de gás sólido.

DEFINIÇÕES GERAIS

[024] Os termos “piripiropenos” e “piripiropenos” significa composto(s) da Fórmula I:

- em que R1, R2, R3 e R4 possuem as combinações como representado na Tabela 1 TABELA 1: COMBINAÇÕES DE R1, R2, R3 E R4 DE COMPOSTOS DA FÓRMULA I E NOMES DE COMPOSTOS COM TAIS COMBINAÇÕES

[025] Por razões de ilustração, o termo “piripiropeno A” tal como descrito pela Fórmula I e na Tabela I significa um composto da Fórmula II, que é também conhecido como 1,7,11-tri-O-acetilpiripiropeno A:

[026] Piripiropenos preferidos incluem piripiropeno A a piripiropeno O como descrito na Tabela 1, e são de preferência piripiropeno A, E e O com piripiropeno A sendo o mais preferido.

[027] São também preferidos os compostos como descritos pela Fórmula II, Fórmula III, Fórmula IV e Fórmula V.

[028] O termo “1,7,11-tri-deacetilpiripiropeno A” significa um composto da Fórmula III:

[029] O termo “composto da fórmula IV” significa um composto da Fórmula I, em que: - R1 e R3 representam ciclopropilcarbonilóxi, e - R2 representa hidroxila, ciclopropilcarbonilóxi ou 2- cianobenzoilóxi; - R4 representa hidroxila.

[030] De preferência, o composto da fórmula IV compreende uma combinação, em que: - R1 representa hidroxila, - R2 e R3 representam ciclopropilcarbonilóxi, e - R4 representa hidroxila ou ciclopropilcarbonilóxi.

[031] O termo “1,11-di-O-ciclopropanocarbonil-1,7,11- trideacetilpiripiropeno A” significa um composto da Fórmula V:

[032] Piripiropenos descritos pela Fórmula I, Fórmula II, Fórmula 111, Fórmula IV e Fórmula V incluem também os sais destes compostos. De preferência, os sais desses compostos da Fórmula I, Fórmula IV e Fórmula V. Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido agricolamente ou horticolamente aceitáveis, tais como sais de cloridrato, sais de nitrato, sais de sulfato, sais de ácido fosfórico ou sais de acetato.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

[033] A invenção refere-se a processos para a produção de biomassa seca de organismo produtor de piripiropeno, processos para obtenção de piripiropenos a partir de tal biomassa seca, bem como a processos para produzir compostos da fórmula III e / ou Fórmula IV e / ou Fórmula V a partir dos piripiropenos obtidos a partir da biomassa seca.

[034] A invenção diz respeito ainda à própria biomassa seca, bem como à utilização da biomassa seca para obter piripiropenos ou compostos da fórmula III e / ou Fórmula IV e / ou Fórmula V e à utilização da biomassa seca ou como inseticida para produzir um inseticida.

[035] Por conseguinte, a invenção compreende um processo para se obter pelo menos um piripiropeno compreendendo as etapas de: a) cultura de um organismo produtor de piripiropeno em um caldo de cultura sob condições de cultura, em que pelo menos um piripiropeno é produzido, b) produção de biomassa seca a partir de pelo menos parte da biomassa obtida na etapa a), c) obtenção de pelo menos um piripiropeno a partir da biomassa seca produzida na etapa b).

[036] O piropiropeno obtido pode ser usado para produzir derivados de piripiropeno. Derivados preferidos de piripiropeno são os compostos da Fórmula III, compostos da Fórmula IV e compostos da Fórmula V.

[037] Assim, outra forma de realização da invenção é um processo para produzir um derivado de piripiropeno, de preferência um processo para produzir pelo menos um composto da Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V, compreendendo: a) obtenção de piripiropeno a partir de biomassa seca compreendendo pelo menos um piripiropeno, b) produção de pelo menos um derivado de pelo menos um piripiropeno do piripiropeno obtido na etapa a), de preferência a produção de pelo menos um derivado de piripiropeno selecionado a partir do grupo de compostos que consiste no composto da Fórmula III, o composto da Fórmula IV e o composto da Fórmula V a partir do piripiropeno obtido na etapa a).

[038] Outra forma de realização da invenção é um processo para produzir um derivado de piripiropeno, de preferência um processo para produzir pelo menos um composto da Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V, de modo preferido um composto da Fórmula V, que compreende: a) cultura de um organismo produtor de piripiropeno em um caldo de cultura sob condições de cultura, em que pelo menos um piripiropeno é produzido, b) produção de biomassa seca a partir de pelo menos parte da biomassa obtida na etapa a), c) obtenção de pelo menos um piripiropeno a partir da biomassa seca produzida na etapa b), d) produção de pelo menos um derivado de pelo menos um piripiropeno do piripiropeno obtido na etapa c), de preferência a produção de pelo menos um derivado de piripiropeno selecionado a partir do grupo de compostos que consiste no composto da Fórmula III, o composto da Fórmula IV e o composto da Fórmula V a partir do piripiropeno obtido na etapa c).

[039] O piripiropeno obtido nos processos acima descritos é preferencialmente obtido a partir da biomassa seca através de extração de acordo com os métodos disponíveis na arte, por exemplo, pelos métodos descritos mais abaixo.

[040] O piripiropeno obtido pode ser purificado por métodos disponíveis na arte, por exemplo, para produzir o respectivo piripiropeno como um composto 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou quase 100% puro, ou pode ser utilizado, enquanto ainda compreendido no solvente ou solventes, para a extração de um processo para produzir um derivado de piripiropeno.

CULTURA DE UM ORGANISMO PRODUTOR DE PIRIPIROPENO

[041] Biomassa compreendendo pelo menos um piripiropeno pode ser produzida por fermentação de organismos produtores de piripiropeno. Organismos produtores de piripiropeno são qualquer tipo de células microbianas com a capacidade de produzir piripiropenos, ou por seu conjunto natural de genes ou porque são recombinantes para genes que fornecem uma, várias ou todas as etapas da biossíntese de pelo menos um piripiropeno.

[042] Exemplos de organismos produtores de piripiropeno adequados, bem como as suas respectivas condições de cultura foram descritos em Puré Appl. Chem.,Vol. 71, n° 6, pp 1059-1064, 1999; em Bioorganic Medicinal Chemistry Letter vol. 5, n° 22, p. 2683, e no Pedido de Patente Japonesa n° 239385/1996, Pedido de Patente Japonesa publicado n° 184158/1994, WO 2004/060065, Pedido de Patente Japonesa publicado n° 259569/1996.

[043] Organismos produtores de piripiropeno preferidos são microrganismos pertencentes ao gênero Penicillium, o gênero Eupenicillium, ou o gênero Aspergillus, espécies preferidas de organismos produtores de piripiropeno são: Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupen- icillium reticulosporum ou Aspergillus fumigatus e, em particular, Penicillium coprobium. As estirpes preferidas desses organismos produtores de piripiropeno são estirpe de Penicillium coprobium PF-1169 (Jornal de Divulgação Técnica n° 500997/2008), estirpe de Penicillium griseofulvum F1959 (WO2004/060065), estirpe de Eupenicillium reticulosporum NRRL-3446 (WO2004/060065) e Aspergillus fumigatus FO1289, incluindo sua variante Aspergillus fumigatus FO1289-2501 (WO94/09147), entre eles Penicillium coprobium PF1169 sendo o mais preferido.

[044] Organismos produtores de piripiropeno geralmente produzem mais do que um composto da Fórmula I, por exemplo, o documento WO94/109147 descreve que Aspergillus fumigatus FO1289 é capaz de produzir piripiropeno A, piripiropeno B, piripiropeno C e piripiropeno D.

[045] Deste modo, é possível obter um ou vários piripiropenos a partir da biomassa seca produzida e utilizada na invenção.

[046] Um organismo produtor de piripiropeno também pode ser uma célula microbiana, por exemplo, Aspergillus oryzae, a qual compreende apenas partes dos genes para a via de biossíntese para a produção de piri- piropenos, mas a qual é provida de precursores de piripiropeno durante as condições de fermentação. Tais microorganismos foram, por exemplo, descritos nos documentos CA2787829 e CA2788058.

[047] Os organismos produtores de piripiropeno são preferencialmente fermentados em grandes quantidades no estado líquido, tal como em culturas em suspensão. Métodos preferidos são a cultura sob agitação em condições aeróbicas, a cultura com borbulhamento sob agitação ou cultura aeróbica de parte profunda, em particular, a cultura com borbulhamento sob agitação é na maioria dos casos vantajosa.

[048] O processo de fermentação é usualmente realizado em biorreatores. Biorreatores tipicamente permitem o controle das condições de cultura, tais como temperatura, pH, tensão de oxigênio e níveis de dióxido de carbono. Por exemplo, biorreatores são tipicamente configuráveis, por exemplo, usando portas fixas a tubos, para permitir que componentes gasosos como oxigênio ou nitrogênio sejam borbulhados através de uma cultura líquida. O biorreator pode ser pressurizado. Ele pode ser também adaptado para permitir o fornecimento contínuo ou continuado de fontes assimiláveis de nitrogênio e / ou carbono.

[049] Biorreatores podem compreender pequenos volumes, por exemplo, para aplicações em escala de laboratório, de 5 litros, 10 litros ou 20 litros, mas também podem acomodar grandes volumes, tais como 5000 litros; 10,000 litros; 40,000 litros; 50,000 litros; 100,000 litros; 150,000 litros; 200,000 litros, ou valores ainda mais elevados.

[050] A fermentação pode ser um processo contínuo, com a colheita regular ou remoção da biomassa produzida ou pode ser um processo em batelada, tal como um processo em batelada de alimentação repetida, incluindo uma ou mais adições de fontes de carbono e / ou nitrogênio depois que a fermentação se iniciou. Assim, o processo de fermentação pode ser parado ou interrompido, e a biomassa produzida removida do recipiente de cultura, antes de outro processo ou nova fermentação ser iniciada.

[051] As fontes de carbono e nitrogênio podem ser fornecidas em composições separadas. Isto porque as diferentes fontes podem ser sujeitas a diferentes condições de esterilização e, além disso, permitem uma variação nas quantidades relativas de carbono e nitrogênio ou outros nutrientes durante a fermentação. As diferentes fontes de nutrientes podem ser fornecidas separadamente ou fornecidas simultaneamente ou fornecidas como uma preparação combinada e são de preferência fornecidas em um líquido.

[052] As fontes de nutrientes podem ser fontes complexas, meios definidos ou compostos individuais ou isolados. Fontes não complexas são preferidas e, portanto, os compostos podem ser adicionados em um grau de pureza elevado, e podem ser produtos químicos comuns (ou comercialmente disponíveis).

[053] Fontes de nitrogênio apropriadas incluem íons de amônia ou de amônio. A vantagem aqui é que a amônia pode atuar como um regulador do pH. Isto pode ser fornecido na forma de um sal de amônio, tal como nitrato, sulfato ou fosfato ou sob a forma dos próprios íons de amônio, por exemplo, uma solução aquosa de hidróxido de amônio. Outras fontes de nitrogênio inorgânico também podem ser utilizadas, tais como nitrato de sódio, ureia ou um aminoácido tal como asparagina ou glutamina. Se o fungo é do gênero Rhizopus, então nitrato de preferência não é utilizado como uma fonte de nitrogênio. Fontes nitrogenadas complexas incluem hidrolisados de levedura, levedura primária, farelo de soja, hidrolisados de caseína, levedura, extrato de levedura ou farelo de arroz.

[054] A fonte de carbono pode compreender fontes complexas, tais como maltodextrina, farinha de aveia, repasto de aveia, melaço, óleo vegetal (por exemplo, feijão de soja), extrato de malte ou amido. Fontes de carbono preferidas são fontes de carbono não complexas tais como açúcares, tais como frutose, maltose, sacarose, xilose, manitol, glicose, Iactose, citrato, acetato, glicerol ou etanol.

[055] O líquido aquoso pode adicionalmente conter outras substâncias para auxiliar na fermentação, por exemplo, um agente quelante (por exemplo, ácido cítrico), um agente antiespuma (por exemplo, óleo de feijão de soja), uma vitamina (por exemplo, tiamina e / ou riboflavina), quaisquer metais catalíticos necessários (por exemplo, metais alcalino-terrosos tais como magnésio ou cálcio, ou zinco ou ferro e / ou outros metais tais como cobalto e cobre), fósforo (por exemplo, fosfato) e / ou enxofre (por exemplo, sulfato). Preferivelmente, o líquido aquoso terá um baixo teor de enxofre, por exemplo, inferior a 3,0 g / l, de preferência inferior a 2,0 g / l; ou 1,0 g / l de enxofre.

[056] De preferência, são controlados o pH, temperatura e / ou teor de oxigênio (do líquido aquoso) durante a fermentação. Isto pode ser para manter constante o pH, temperatura e / ou teor de oxigênio ou dentro de um intervalo desejado. O pH do líquido aquoso durante a fermentação pode ser de pH 2 a pH 8, tal como de pH 3 a pH 7, idealmente de pH 4 a pH 6, mas também pode ser, por exemplo, de pH 6 a pH 8.

[057] A temperatura do líquido aquoso durante a fermentação pode ser de 15 °C a 40 °C, ou de 18 °C a 40 °C, tal como de 20 °C a 35 °C, idealmente de 25 °C a 33 °C. Em muitos casos, o crescimento tem lugar em torno de 26 °C a 37 °C.

[058] É importante que durante a fermentação ocorra a mistura. Isto pode ser conseguido por aeração, por exemplo, borbulhando ar no líquido aquoso. Isso pode servir o objetivo adicional de fornecer oxigênio às células em crescimento. Outros meios de agitação ou de mistura incluem agitação, por exemplo, utilizando um impulsor. A entrada de energia através agitação deverá geralmente ser ajustada a um valor entre 1 a 20 W / L e de preferência a um valor de 2 a 5 W / L.

[059] A agitação pode resultar em um fluxo axial hydrofeil ou pode ser concebida de forma que o meio aquoso é forçado radialmente para fora a partir do impulsor, por exemplo, semelhante a um fluxo em uma turbina. Uma das vantagens da aeração e / ou agitação é que o teor de oxigênio do líquido aquoso pode ser mantido relativamente alto. Isto pode ser pelo menos 10%, tal como pelo menos 15%, idealmente pelo menos 20% (em termos de saturação do ar).

[060] A produção de piripiropenos varia dependendo do meio e condições de cultura, ou o organismo utilizado. Por conseguinte, a fermentação pode levar de 1 a 40 dias, tal como de 5 a 20, ou 10 a 18 dias, mas pode também opcionalmente ser mais curta, por exemplo, de 2 a 4 dias. Geralmente as condições de fermentações são selecionadas a fim serem semelhantes ou idênticas às condições de fermentação preferidas pelo organismo de cultura durante a produção de piripiropeno. O acúmulo de piripiropenos geralmente atinge o seu pico em 2 dias a 25 dias. Uma fermentação mais curta presta-se no sentido de uma batelada, em vez de um processo de fermentação contínua.

[061] Em uma forma de realização preferida, o teor de açúcar que pode ser utilizado é ajustado até um máximo de 5 g / l, de preferência até um máximo de 1 g / l até o final da fermentação, ou seja, nenhum açúcar é adicionado e a fermentação é interrompida apenas quando o teor de açúcar é igual ou inferior a este valor.

[062] Em uma forma de realização da invenção, a biomassa produzida durante a fermentação é diretamente transformada em biomassa seca através de secagem por pulverização do meio de cultura compreendendo a biomassa. De preferência, as células da biomassa são mortas, por exemplo, por um método descrito a seguir, antes da etapa de secagem ser realizada.

[063] Em outras formas de realização da invenção, a biomassa produzida durante a fermentação é separada do caldo de cultura, de modo a produzir a biomassa úmida que é então usada para produzir biomassa seca.

MORTE DAS CÉLULAS

[064] A biomassa produzida durante a fermentação é de preferência morta antes de sua separação do caldo de cultura, mas também pode ser morta em um estágio posterior dos processos da invenção. As células da biomassa podem ser mortas por processos conhecidos na arte. De preferência, as células são mortas por meio de um tratamento térmico imediatamente após a fermentação. O tratamento térmico pode ser realizado no vaso de cultura ou em um aparelho dedicado. Em algumas formas de realização da invenção, a morte também pode ser realizada em um aparelho de execução contínua com um tempo de residência. Se o tratamento térmico é utilizado, então o congelamento é uma possibilidade, embora o aquecimento seja geralmente preferido (por exemplo, pasteurização). A morte das células por meio de aquecimento é geralmente realizada a uma temperatura entre 60 °C a 120 °C, de preferência entre 70 °C a 90 °C durante um período de tempo compreendido de 5 a 180 minutos, de preferência durante um período de tempo entre 30 a 90 minutos.

[065] A entrada de calor no caldo de fermentação pode ser alcançada por aparelhos trocadores de calor como trocadores de calor de placa ou trocadores de calor de tubos ou serpentinas de aquecimento, mas também por mistura de substâncias tais como a água a temperaturas elevadas. Um exemplo para essa mistura de substâncias é a injeção de vapor de água.

[066] As temperaturas para matar biomassa contendo piripiropeno podem variar de 40 °C a 200 °C, mas preferivelmente de 50 a 120 °C e ainda mais preferivelmente de 60 a 80 °C. O tempo de residência correspondente em temperatura elevada no aparelho para matar biomassa terá de ser adaptado por experimentação de rotina das condições de cada caso individual, por exemplo, volume e concepção do recipiente de cultura ou o aparelho dedicado à morte de células, bem como o organismo que fornece a biomassa. Tipicamente, o tempo de residência é selecionado de 1 a 500 minutos ou de 10 a 120 minutos ou de 5 a 80 minutos. Alternativamente, as células da biomassa podem ser mortas por tratamentos químicos. Tais tratamentos químicos estão prontamente disponíveis na arte. Por exemplo, o ácido benzoico ou ácido sódico normalmente mata as células se adicionado ao caldo de fermentação em quantidades de 0,1% a 10% (volume / volume).

[067] Alternativamente, ou em adição, os microrganismos podem ser mortos após a separação da biomassa do caldo de cultura, ou ao serem ressuspensos em um meio de ressuspensão orgânico, ou após a separação da biomassa de um meio de ressuspensão orgânico, ou durante a homogeneização da biomassa, ou durante a secagem da biomassa, ou por uma combinação dessas possibilidades.

SEPARAÇÃO DE BIOMASSA

[068] A biomassa produzida durante o processo de fermentação pode ser separada do caldo de cultura por processos conhecidos na arte. A biomassa pode ser separada do volume total do caldo de cultura, ou pode ser separada de apenas uma parte do volume total, para permitir a fermentação contínua. A separação da biomassa pode ser realizada através de métodos estabelecidos, de preferência por filtração ou centrifugação, por exemplo, por ultrafiltração, microfiltração, decantação, ou uma combinação de filtração e centrifugação.

[069] A filtração pode ser realizada mediante a utilização das tecnologias de filtro usuais utilizadas na técnica, tal como um separador vibratório, um filtro de tela vibratória, um separador vibratório circular, um filtro de tambor rotativo, um agitador de movimento linear / inclinado, um filtro de pressão, por filtração de fluxo tangencial, através de filtros de correia, filtros rotativos, filtros de prensa, ou técnicas semelhantes, em que uma barreira que consiste no filtro separa a biomassa e permite a passagem da fase líquida sem biomassa.

[070] Dependendo da técnica de filtro usada, o processo de filtração é geralmente realizado a uma pressão de cerca de 0,5 a 15 bar, por exemplo, no caso de um filtro-prensa ser usado, ou é realizado a uma pressão abaixo do normal, como 0,01 a 0,9 bar, por exemplo, no caso de um filtro de tambor rotativo ser usado. A temperatura utilizada durante a separação eventual da biomassa é geralmente entre 5 °C a 80 °C, mas também pode ser maior, em particular se as células da biomassa são mortas através da aplicação de calor e a biomassa é separada do caldo de cultura antes da biomassa e o caldo de cultura terem tido tempo para esfriar.

[071] O separador vibratório pode incluir pelo menos um filtro de tela vibratória. A biomassa também não deve aderir de forma significativa ao material de filtro. Material de filtro preferido é: cerâmicas porosas ou polipropileno, o uso de outros materiais também é possível. Um exemplo de filtração que é em particular adequado para a presente invenção é a filtração de fluxo tangencial, também conhecida como filtração de fluxo cruzado. A filtração de fluxo tangencial (TFF) é uma técnica de separação que utiliza sistemas de membrana e força de fluxo para purificar sólidos a partir de líquidos. Tamanhos de poro preferidos usados em TFF permitem que solutos e detritos do caldo de fermentação fluam, mas retêm a biomassa.

[072] Tamanhos de malha apropriados para o procedimento de filtração incluem menor do que 1000 micrômetros, ou menor do que 800 micrômetros, ou menor do que 600 micrômetros, ou menor do que 500 mi- crômetros, ou menor do que 400 micrômetros, ou menor do que 300 micrômetros, ou menor do que 200 micrômetros, ou menor do que 180 micrômetros, ou menor do que 150 micrômetros, ou menor do que 120 micrômetros, ou menor do que 100 micrômetros, ou menor do que 90 micrômetros, ou menor do que 80 micrômetros, ou menor do que 70 micrômetros, ou menor do que 60 micrômetros, ou menor do que 50 micrômetros, ou menor do que 40 micrômetros, ou menor do que 30 micrômetros, ou menor do que 20 micrômetros. Em algumas formas de realização, um filtro de tela vibratória de 106 micrômetros é usado. Um filtro com um tamanho de malha diferente de 106 micrômetros, ou filtros de um tipo diferente do vibratório também podem ser utilizados.

[073] Em certas formas de realização, a filtração é realizada à temperatura ambiente e à pressão atmosférica. Em outras formas de realização, a filtração é realizada a temperaturas e / ou pressões elevadas ou abaixadas.

[074] A centrifugação é um processo que envolve a utilização de força centrífuga para a separação de misturas. Os componentes mais densos da mistura migram para fora do eixo da centrífuga, enquanto os componentes menos densos da mistura migram na direção do eixo. Ao aumentar a força gravitacional eficaz (isto é, através do aumento da velocidade de centrifugação), o material mais denso, normalmente sólido, separa-se do material menos denso, normalmente líquidos, de acordo com a densidade. Máquinas preferidas para centrifugação são centrífugas decanter e centrífugas de pilha de discos de alta velocidade.

[075] Uma centrífuga decanter pode operar por bombeamento do caldo de cultura, incluindo a biomassa para um cilindro giratório. À medida que a força centrífuga empurra a biomassa contra a parede externa, um rolo rotativo interno pode mover a biomassa contra a parede para a descarga em uma extremidade. A extremidade de descarga da centrífuga decanter pode ter um raio decrescente juntamente com o rolo para corresponder ao tamanho decrescente. À medida que a biomassa se move para cima da rampa criada pelo raio decrescente, a biomassa pode ser continuamente removida.

[076] Uma centrífuga de pilha de discos de alta velocidade pode empurrar o caldo de cultura para fora ao longo de um caminho de discos inclinados. A biomassa constituída pelo caldo de cultura será empurrada na inclinação descendente dos discos e será separada do caldo de cultura. A biomassa pode ser descarregada de forma contínua ou intermitente no lado descendente da centrífuga de pilha de discos de alta velocidade, enquanto o caldo de cultura é empurrado para cima ao longo dos discos para a saída.

[077] A biomassa tendo sido separada do caldo de cultura (biomassa úmida) normalmente contém mais do que 95% (peso / peso) dos piripiropenos produzidos em fermentação, de preferência mais do que 97% e mais preferencialmente mais do que 99%. O teor de piripiropenos no caldo de cultura separado é, por conseguinte, geralmente inferior a 5% (peso / peso), preferivelmente menos do que 3% e mais preferivelmente menos do que 1%.

[078] A biomassa seca utilizada para o isolamento de piripiropenos pode ser produzida diretamente por secagem da biomassa úmida obtida através das técnicas descritas acima. Estas técnicas geralmente produzem uma biomassa úmida com um teor de água residual (peso / peso) entre mais do que 15% e menos de 90%. De um modo preferido entre mais do que 30% e menos de 90%, ainda mais preferido entre mais do que 40% e menos de 90% ou mais de 50% a menos de 90%.

[079] No entanto, não é necessário, mas geralmente vantajoso reduzir o teor de água da biomassa úmida ainda mais antes da biomassa úmida ser usada para a produção de biomassa seca. Assim, a biomassa úmida pode ser submetida, a uma (nova) etapa de remoção de líquido envolvendo o uso de pressão mecânica aplicada diretamente à biomassa úmida. A quantidade de pressão mecânica aplicada não deve causar uma percentagem significativa de ruptura das células microbianas da biomassa, se isso resultar em perda de piripiropenos para a fase líquida, mas deve em vez disso ser simplesmente suficiente para desidratar a biomassa ao nível desejado para subsequente secagem. Por conseguinte, a biomassa úmida normalmente contém ainda mais do que 95% (peso / peso) dos piripiropenos produzidos em fermentação, de preferência mais do que 97% e mais preferencialmente mais do que 99%. O teor de piripiropenos em fase líquida separada é, portanto, geralmente inferior a 5% (peso / peso), preferivelmente menos do que 3% e mais preferencialmente menos do que 1% dos piripiropenos produzidos durante a fermentação.

[080] Pressão mecânica pode ser utilizada para a biomassa úmida, usando métodos conhecidos na arte, por exemplo, utilizando um filtro- prensa de correia, uma prensa de parafuso, uma prensa finalizadora, um filtro- prensa, um filtro de pressão ou qualquer outro meio adequado para o efeito. De preferência, um filtro-prensa de correia é usado para o efeito.

[081] Um filtro-prensa de correia é um dispositivo de drenagem que aplica pressão mecânica a uma suspensão ou pasta (por exemplo, a biomassa úmida) que é passada entre duas correias tensionadas geralmente com aberturas de tamanho mícron pequeno. As correias tensionadas executadas através de uma serpentina de rolos de diâmetro decrescente. A maioria dos filtros-prensa de correia tem três zonas diferentes: uma zona de gravidade, onde líquido livre é drenado por gravidade através de uma correia porosa; uma zona de cunha, em que os sólidos são preparados por aplicação de pressão; e uma zona de pressão, onde pressão ajustável é aplicada a sólidos drenados por gravidade. As correias podem então passar através de uma série de rolos que comprimem o suco para fora através das aberturas na correia. Os sólidos em bolo podem então ser ejetados em que as duas correias se separam no final da operação de unidade. O sumo pode escorrer para dentro de panelas na parte inferior da unidade onde se usa força gravitacional, ele pode ser ejetado através de uma abertura comum e enviado a jusante para processamento adicional.

[082] Uma prensa de parafuso pode operar através da introdução de material (por exemplo, a biomassa úmida) em um dispositivo que se assemelha a um trado de rosca. O eixo de rotação na prensa de rosca pode transportar o material para dentro do equipamento, onde na medida em que o material avança, a trajetória, ou a distância entre as roscas do parafuso, se torna menor ou o eixo cada vez mais amplo. À medida que a trajetória diminui, o volume total entre as roscas diminui, criando um efeito de compressão. A biomassa úmida pode ser comprimida entre esses percursos e líquido pode ser expelido. O eixo de rotação pode ser envolto por uma tela de malha de pequena dimensão mícron que pode conter a biomassa úmida no parafuso, mas permitem que o líquido seja expelido.

[083] Uma prensa finalizadora pode operar de forma semelhante à prensa de parafuso, mas em vez de um parafuso com rosca, existe um eixo rotativo com pás que podem empurrar o material ao longo de um tamanho de tela. A fase sólida restante da biomassa úmida pode então ser ejetada para fora da prensa finalizadora.

[084] Um filtro-prensa, incluindo filtros-prensa concebidos como um filtro-prensa de câmara ou um filtro-prensa de membrana, pode ser operado utilizando uma bomba de deslocamento positivo e bombeando a biomassa úmida para uma série de câmaras de filtro. As câmaras de filtro podem ter aberturas de tamanho mícron pequeno que podem impelir o líquido para fora utilizando a pressão da bomba de deslocamento positivo. Uma vez que sólidos suficientes tenham acumulado no interior do filtro e o líquido não pode ser extraído adicionalmente, um “aperto” pode ser introduzido por injeção de água ou ar para dentro da bexiga entre as câmaras de filtro, criando uma pressão adicional sobre o bolo de filtração quando se utiliza um filtro-prensa de membrana. Na medida em que as bexigas empurram para fora, pressão adicional pode ser exercida sobre as câmaras de filtro na medida em que as paredes empurram para dentro. Líquido adicional pode ser liberado. Uma vez que o líquido é suficientemente removido, as câmaras de filtro-prensa podem ser abertas e a biomassa úmida pode ser ejetada.

[085] Uma ou mais das técnicas anteriores para aplicar pressão mecânica pode ser usada sozinha ou em combinação para remover líquido da biomassa úmida para utilização na presente invenção.

[086] Assim, os processos para a obtenção de pelo menos um piripiropeno e os processos para a produção de um derivativo de piripiropeno podem compreender uma etapa de separação de biomassa do caldo de cultura para se obter biomassa úmida, que é então usada para produzir biomassa seca.

[087] A etapa para a obtenção de biomassa úmida pode ser realizada por meio de filtração, por meio de centrifugação de preferência utilizando uma tecnologia tal como descrito acima, ou pode ser realizada por meio de uma combinação de filtração e centrifugação e pode ou não compreender uma etapa de aplicação de pressão mecânica, de preferência novamente uma etapa de aplicação de pressão mecânica como descrito acima.

[088] Por conseguinte, os processos para se obter pelo menos um piripiropeno e os processos para a produção de um derivado de piripiropeno podem compreender uma etapa de separação da biomassa do caldo de cultura por meio do uso de um separador vibratório, um filtro de crivo vibratório, um separador vibratório circular, um filtro de tambor rotativo, um agitador de movimento linear / inclinado, um filtro de pressão, filtração de fluxo tangencial, através de filtros de correia, filtros rotativos, filtros-prensa, dos quais são preferidos um separador vibratório e filtração de fluxo tangencial. Máquinas preferidas para centrifugação são centrífugas decanter e centrífugas de pilha de discos de alta velocidade

[089] Em algumas formas de realização, a biomassa úmida produzida como descrito acima é tratada para reduzir o teor de água, utilizando uma etapa de aplicação de pressão mecânica, por meio de um filtro prensa de correia, prensa de parafuso, uma prensa finalizadora, um filtro-prensa ou um filtro de pressão. De preferência, um filtro prensa de correia é usado para o efeito.

REDUÇÃO DE COMPONENTES INDESEJÁVEIS E / OU ARMAZENAMENTO DE CURTA DURAÇÃO

[090] Na maioria das formas de realização da invenção, a biomassa úmida produzida por separação do caldo de cultura ou após a aplicação de pressão mecânica é diretamente utilizada para a produção de biomassa seca, a qual é então utilizada ou para armazenamento ou para purificação de piripiropenos.

[091] No entanto, em várias formas de realização da invenção, a biomassa úmida é adicionalmente purificada durante o manuseamento da biomassa úmida, a fim de reduzir o conteúdo do caldo de cultura, que poderia causar problemas de purificação de piripiropenos ou o manuseamento da biomassa úmida em fases posteriores / ou é submetida a armazenamento de curta duração em um tanque de armazenamento.

[092] Conteúdos do caldo de cultura que podem ser reduzidos por purificação adicional da biomassa úmida são, por exemplo, sais, açúcares residuais, ou outros componentes que tenham sido produzidos durante a fermentação, por exemplo, componentes lipofílicos, como ácidos e óleos graxos.

[093] Por conseguinte, o processamento adicional da biomassa úmida pode ou não envolver uma ou mais etapas de lavagem para purificação adicional, na qual a biomassa úmida é ressuspensa em um meio no qual a solubilidade de piripiropenos é muito baixa (meio de ressuspensão). Por conseguinte, o meio utilizado para uma etapa de lavagem é, de preferência, hidrofílico, ou pode consistir em uma mistura de componentes hidrofílicos e hidrofóbicos. Em uma forma de realização, o meio de ressuspensão é água. Em outra forma de realização, o meio de ressuspensão é uma solução aquosa de um tampão de pH, por exemplo, sal de fosfato ou TRIS ou sal de amônia, ou uma solução aquosa de um agente conservante como ácido benzoico, sais de ácido benzoico, ácido sórbico, sais de ácido sórbico ou outros conservantes conhecidos na técnica como tendo o mesmo efeito.

[094] De preferência, a biomassa úmida é ressuspensa diretamente após separação do caldo de cultura e não após a aplicação de pressão mecânica.

[095] A temperatura do meio de ressuspensão pode variar entre o ponto de congelamento e de ebulição do meio de ressuspensão, de preferência a temperatura situa-se entre 5 °C e 50 °C, mais preferivelmente a temperatura está entre 10 °C e 30 °C. O meio de ressuspensão pode ser separado da biomassa por meio de tecnologias idênticos ou semelhantes, como pode ser utilizado para separar a biomassa do caldo de cultura. A biomassa pode ser ressuspensa várias vezes nos mesmos ou diferentes meios de ressuspensão. Normalmente, o volume de um meio de ressuspensão é inferior a 70%, 60%, 50%, 30%, 25%, 10% ou menos de 5% do volume do caldo de cultura utilizado para produzir a respectiva quantidade de biomassa úmida, mas pode mesmo ser maior, como 1 vez, 2 vezes, 3 vezes ou mais do volume da biomassa úmida.

[096] A biomassa úmida produzida após a separação do caldo de cultura, após uma ou mais etapas de ressuspensão ou produzida após a aplicação de pressão mecânica pode ser armazenada em um tanque de armazenamento, de preferência um tanque de armazenamento refrigerado. Em formas de realização particulares, o tanque de armazenamento refrigerado é mantido a uma temperatura abaixo de 50 °C, ou abaixo de 40 °C, ou abaixo de 30 °C, ou abaixo de 25 °C, ou abaixo de 20 °C, ou abaixo de 15 °C, ou abaixo de 10 °C, ou abaixo de 5 °C, ou abaixo de 2 °C, mas acima da temperatura de congelamento da biomassa úmida. O tanque de armazenamento refrigerado é mantido a uma temperatura abaixo da temperatura ambiente, de preferência abaixo de 15 °C, ou abaixo de 10 °C, ou abaixo de 5 °C, ou abaixo de 2 °C, mas acima da temperatura de congelamento da biomassa úmida.

[097] A biomassa úmida pode ser armazenada sob tais condições durante várias horas e até vários meses, por exemplo, durante o transporte. Durações preferenciais para o armazenamento de curto prazo são mais de 5 horas a 5 meses, mas de preferência não deve exceder um ou dois meses, no caso da biomassa úmida compreender células vivas da própria biomassa úmida ou de outros microrganismos introduzidos durante o manuseamento da biomassa úmida. Outra maneira de estabilizar a biomassa úmida para o armazenamento é baixar o pH da biomassa úmida para, ou durante o armazenamento a um valor de pH de 1 a 5. A biomassa estabilizada deste modo pode geralmente ser armazenada por um período entre alguns dias a várias semanas. Também é possível combinar ambos os métodos, isto é, armazenamento a um pH reduzido e em um tanque de armazenamento refrigerada, de modo a prolongar o tempo de armazenamento.

HOMOGENEIZAÇÃO

[098] A biomassa úmida é utilizada diretamente para posterior secagem, ou pode ser homogeneizada antes de uma etapa adicional ser realizada para ou secar a biomassa úmida ou aumentar o conteúdo de matéria seca da biomassa, por exemplo, por aplicação de pressão mecânica. Em particular no caso da biomassa úmida ter um teor relativamente baixo de material seco (peso / volume) de menos do que 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, ou 5% e / ou ter sido armazenada durante algum tempo, é aconselhável homogeneizar a biomassa antes da secagem, ou antes de uma nova pressão mecânica ser aplicada. A homogeneização pode simplesmente ter o objetivo de produzir uma distribuição homogênea dos componentes líquidos e sólidos da biomassa úmida, a fim de facilitar o processamento posterior, por exemplo, para proporcionar um fornecimento homogêneo de biomassa úmida para um filtro-prensa de correia, uma prensa de parafuso, uma prensa finalizadora, um filtro-prensa, ou quaisquer outros meios adequados para aumentar o teor de matéria seca, ou pode ter o objetivo de proporcionar um fornecimento homogêneo de biomassa úmida para posterior secagem, por exemplo, como alimentar a um secador moinho de pasta, um secador de pulverização, um secador flash, um secador de leito fluidizado, ou um secador rotativo.

[099] Uma distribuição homogênea de componentes sólidos e líquidos, bem como uma ruptura de paredes celulares da biomassa úmida pode ser conseguida usando uma máquina de dispersão estator rotor ou outro aparelho de homogeneização. Uma máquina de dispersão estator rotor é um meio preferido para homogeneizar a biomassa úmida que tem um teor relativamente baixo de matéria seca, tal como um teor de matéria seca inferior a 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ou 5%.

[0100] Um expansor ou extrusora pode ser usada para dar forma e / ou homogeneizar a biomassa úmida. Uma extrusora é preferível porque as condições de extrusão podem ser ajustadas para minimizar a ruptura das paredes celulares. A extrusão pode ser usada para formar estruturas semelhantes a cilindro alongado (estas podem ter uma seção transversal ci-líndrica e / ou circular) se passadas através de uma placa-matriz adequada (por exemplo, com orifícios circulares ou quadrados). Estas estruturas alongadas podem ainda ser formadas em grânulos, através de um cortador, tal como uma lâmina de rotação, para cortar os longos fios de estruturas semelhantes a cilindro. Após extrusão, o “espaguete” e grânulos têm de preferência um teor de água inferior a 15%, tal como inferior a 10%, e idealmente de 3 a 7%. Os grânulos podem ter um diâmetro de 0,3 a 10 mm, tal como de 0,7 a 5 mm, idealmente de 1 a 3 mm.

[0101] A extrusão pode também ser usada para formar folhas ou camadas da biomassa úmida. Isto pode ser alcançado por passagem através de uma ou mais fendas. Estas formas também podem ser preparadas pelo uso de uma ou mais superfícies em movimento, tais como rolo(s) e / ou cilindro(s). Estes podem se mover na mesma direção ou em contrarrotação e pode haver uma, duas ou até cinco dessas superfícies. As folhas ou camadas podem ter uma espessura de 0,3 a 10 mm, tal como de 0,7 a 5 mm, idealmente de 1 a 3 mm.

[0102] Biomassa úmida tratada por extrusão é preferivelmente seca em um secador de leito fluidizado para produzir biomassa seca.

[0103] Em algumas formas de realização da invenção, pode ser vantajoso utilizar a etapa de homogeneização para romper as paredes celulares da biomassa úmida. Tal como aqui utilizado, o rompimento das paredes celulares engloba processos mecânicos ou químicos que perturbam a organização do organismo no nível de células individuais ou estruturas multicelulares. A ruptura das paredes celulares pode incluir, por exemplo, moagem, corte, trituração, esmagamento, pressão, rasgamento, lise por pressão osmótica, ou tratamentos químicos que degradam estruturas biológicas. Meramente a título de exemplo, a ruptura das paredes celulares pode ser conseguida utilizando uma fase de trituração, por exemplo, por aplicação de um moinho de facas, moinho de esferas, e semelhantes, ou uma combinação deles.

[0104] Os processos para se obter pelo menos um piripiropeno e os processos para a produção de um derivado de piripiropeno podem compreender mais uma etapa em que a biomassa úmida é tratada para reduzir componentes indesejados, por exemplo, por ressuspensão em um meio de ressuspensão, e ou uma etapa de armazenamento a curto prazo e / ou uma etapa de homogeneização, antes da biomassa úmida ser usada para a produção de biomassa seca.

[0105] Deste modo, os processos, tal como descrito acima, podem compreender uma etapa em que a biomassa úmida foi ressuspensa em um meio de ressuspensão e / ou foi homogeneizada e / ou tem um teor de glicose de menos de 5 g / l, e / ou tem um teor de água entre mais do que 15% e menos de 90%.

PRODUÇÃO DE BIOMASSA SECA

[0106] A biomassa seca utilizada para isolar piripiropenos tem, na ordem de preferência, teor de água residual inferior a 15%. Mais preferivelmente, a biomassa seca tem, na ordem de preferência, um teor de água residual inferior a 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% ou 3%.

[0107] O teor de água residual é medido de acordo com o método de, mais uma vez na ordem de preferência, o método de Aufhauser, o método de escalas de halogênio (IR) e / ou o método de Karl-Fischer, tal como descrito nos Exemplos.

[0108] A produção de biomassa seca pode ser realizada utilizando um secador por pulverização, um secador moinho de pasta, um secador flash, um secador de leito fluidizado, ou um secador rotativo, ou por qualquer outro meio apropriado para secar a biomassa úmida ao teor de água residual descrito acima, tal como liofilização ou pelo uso de secadores de bandeja simples. Os métodos preferidos para a produção de biomassa seca são por secagem em um secador por pulverização ou um secador moinho de pasta.

[0109] Biomassa seca pode ser produzida a partir de biomassa úmida produzida por qualquer tipo de processo para a separação de biomassa do caldo de cultura descrito acima, incluindo as etapas adicionais para reduzir o teor de água da biomassa úmida, como a aplicação de pressão mecânica. No entanto, a biomassa seca também pode ser produzida por secagem da biomassa que não foi separada do caldo de cultura usado na fermentação, por exemplo, usando um secador por pulverização.

[0110] A secagem por pulverização é um método comumente usado para a secagem de uma alimentação líquida utilizando um gás quente. Um secador por pulverização leva uma corrente de líquido, por exemplo, a biomassa úmida e separa o soluto como um sólido e o líquido em um vapor. A corrente de entrada é pulverizada através de um bocal em uma corrente de vapor quente e vaporizada. O bico do secador por pulverização é normalmente ajustável, e tipicamente é ajustado para tornar as gotas tão pequenas quanto possível para maximizar a transferência de calor e a taxa de vaporização de água. No entanto, o bocal tem que ser ajustado a fim de evitar o bloqueio por partes da biomassa composta pela corrente de entrada. De preferência, a biomassa da corrente de entrada é homogeneizada a fim de produzir partículas menores e romper as paredes celulares antes de ser utilizada como corrente de entrada para secagem por pulverização. Os sólidos secos resultantes podem ter uma consistência fina, pulverulenta, dependendo do tamanho do bocal usado.

[0111] Não é possível fornecer aqui valores precisos para cada parâmetro envolvido no ajuste das condições para secagem por pulverização, uma vez que estes parâmetros e os seus valores associados dependem do tipo de dispositivo de secagem por pulverização usado. Como um guia, o processo de secagem por pulverização é melhor utilizado com a biomassa úmida que tem um teor de água residual de 80% a 99,5%, de preferência 88% a 92% (peso / peso), mas também pode ser usado para produzir biomassa seca diretamente a partir de biomassa ainda compreendida no caldo de cultura de fermentação.

[0112] O bocal deve ter uma abertura de 0,5 a 10 mm. A pressão aplicada no final dos bocais para pulverização da biomassa úmida pode ser entre cerca de 2 a 250 bar, e a pressão do ar quente na entrada do dispositivo pode estar entre cerca de 100 e 2000 mbar acima da pressão.

[0113] A temperatura do ar de entrada é de preferência entre 80 °C a 350 °C, de preferência 120 °C a 180 °C. A temperatura de saída é de preferência entre 20 °C a 200 °C, de preferência entre 60 °C a 100 °C.

[0114] Secadores Flash são normalmente utilizados para secagem de sólidos que foram desidratados ou inerentemente possuem baixos teores de umidade. Secadores flash, também conhecidos como “secadores pneumáticos”, são geralmente utilizados para secar biomassa úmida com um teor de água residual de 20% a 90% (peso / peso). Estes secadores tipicamente dispersam material úmido em uma corrente de ar aquecido que o transmite por meio de um duto de secagem. O calor da corrente de ar seca o material na medida em que é transportado através do duto de secagem. Descrições mais detalhadas de secadores flash e secadores pneumáticos podem ser encontradas na Patente US n° 4.214.375, que descreve um secador flash, e a Patentes US n° 3.789.513 e 4.101.264, que descrevem secadores pneumáticos.

[0115] Um secador flash pode soltar a biomassa úmida em um sistema de circuito fechado com ar quente injetado tangencialmente para fora do circuito. O ar aquecido pode transportar a biomassa úmida ao longo da borda externa do circuito, secando assim continuamente.

[0116] Por ter o rolo de material ao longo da parede acionado pelo fluxo de ar, um efeito de redução do tamanho de partícula pode ser criado, uma vez que o tamanho das partículas é suficientemente pequeno para que possam fluir livremente fora do ar. Uma vez que o tamanho de partícula e o teor de água são reduzidos aos níveis desejáveis, as partículas podem ser transportadas ao longo de um tubo de escape localizado na parte interna do circuito para um aparelho de coleta.

[0117] Secadores moinho de pasta são utilizados para a secagem do bolo úmido, suspensão, ou pasta, que é normalmente difícil de secar em outros secadores. De preferência, eles são usados para secar a biomassa úmida com um teor de água residual de 5% a 80% (peso / peso). Um secador moinho de pasta pode secar a biomassa úmida em uma cuba agitada que faz com que o material seja suspenso devido à pressão do ar que cria um efeito de suspensão. O material é alimentado por um alimentador de parafuso por meio de uma velocidade variável para dentro da câmara de secagem vertical, onde é aquecido pelo ar e, ao mesmo tempo, desintegrado por um desintegrador especialmente concebido, que é geralmente uma estrutura semelhante a um ventilador que gira na câmara de secagem, cumprindo assim uma função como um misturador rotativo. O aquecimento do ar pode ser direto ou indireto, dependendo da aplicação. A biomassa seca que ocorre em partículas de tamanho reduzido pode então ser transportada por meio de um classificador no topo da câmara de secagem transportada pelo fluxo de ar para um aparelho de coleta, tal como um ciclone, coletor de poeira, ou similar, onde o material é então coletado.

[0118] Secadores rotativos operam por alimentação contínua de material úmido, por exemplo, a biomassa úmida, que é seca por contato com ar quente, enquanto sendo transportada ao longo do interior de um cilindro rotativo, com o escudo rotativo atuando como o dispositivo de transporte e agitador. De preferência, eles são usados para secar a biomassa úmida que tem um teor de água residual de 5 a 80% (peso / peso).

[0119] Secadores de leito fluidizado são geralmente utilizados para secagem simultânea e desintegração de um material sob a forma de uma pasta. Os secadores de leito fluidizado podem compreender uma câmara de secagem cilíndrica, que é fornecida com um fundo cônica no sentido ascendente. A biomassa úmida é fornecida à câmara através de uma fenda que se estende substancialmente de forma circular entre o fundo cônico e a parede da câmara de secagem a partir de um distribuidor anular para o meio de fluidização e de secagem. Um agitador é colocado coaxialmente na câmara, as lâminas do referido agitador sendo paralelas ao fundo cônico. De preferência, as lâminas do agitador são posicionadas a uma pequena distância do fundo cônico. Um exemplo para um secador de leito fluidizado é descrito em US 4581830. Um design diferente de um secador de leito fluidizado pode funcionar e secar material (por exemplo, biomassa úmida) introduzindo-o em um leito de vibração com o ar aquecido passando direta ou indiretamente para o material. A vibração e o ar podem criar uma suspensão fluidizada do material que pode aumentar a área de superfície a ser seca. De preferência, eles são usados para secar a biomassa úmida com um teor de água residual de 5% a 80% (peso / peso).

[0120] O procedimento de secagem, em especial os procedimentos de secagem que utilizam um secador flash, um secador moinho de pasta, um secador rotativo, um secador de leito fluidizado ou um secador de bandeja ou semelhante, ou uma combinação deles, utilizam uma corrente de ar para secagem com uma temperatura de entrada (a temperatura na entrada para o secador) de acima de 25 °C, ou acima de 50 °C, ou acima de 75 °C, ou acima de 100 °C, ou acima de 125 °C, ou acima de 150 °C, ou acima de 175 °C, ou acima de 200 °C, ou acima de 225 °C, ou acima de 250 °C, ou acima de 275 °C, ou acima de 300 °C, ou acima de 325 °C, ou acima de 350 °C, ou acima de 375 °C, ou superior a 400 °C, ou acima de 425 °C, ou acima de 450 °C, ou acima de 475 °C, ou acima de 500 °C.

[0121] De preferência, a temperatura de entrada é de 25 °C a 50 °C, ou de 50 °C a 75 °C, ou de 75 °C a 100 °C, ou de 100 °C a 125 °C, ou de 125 °C a 150 °C, ou de 150 °C a 175 °C, ou de 175 °C a 200 °C, ou de 200 °C a 225 °C, ou de 225 °C a 250 °C, ou de 250 °C a 275 °C, ou de 275 °C a 300 °C, ou de 300 °C a 325 °C, ou de 325 °C a 350 °C, ou de 350 °C a 375 °C, ou de 375 °C a 400 °C, ou de 400 °C a 425 °C, ou de 425 °C a 450 °C, ou de 450 °C a 475 °C, ou de 475 °C a 500 °C, ou acima de 500 °C .

[0122] Em algumas formas de realização, a temperatura de entrada é de 50 °C a 100 °C, ou de 100 °C a 150 °C, ou de 150 °C a 200 °C, ou de 200 °C a 250 °C, ou de 250 °C a 300 °C, ou de 300 °C a 350 °C, ou de 350 °C a 400 °C, ou de 400 °C a 450 °C, ou de 450 °C a 500 °C, ou acima de 500 °C.

[0123] Em algumas formas de realização, a temperatura de saída (a temperatura na saída do secador) é abaixo de 300 °C, ou abaixo de 275 °C, ou abaixo de 250 °C, ou abaixo de 225 °C, ou abaixo de 200 °C, ou abaixo de 175 °C, ou abaixo de 150 °C, ou abaixo de 125 °C, ou abaixo de 100 °C, ou abaixo de 75 °C, ou abaixo de 50 °C, ou abaixo de 25 °C.

[0124] Em algumas formas de realização, a temperatura de saída é de 300 °C a 275 °C, ou de 275 °C a 250 °C, ou de 250 °C a 225 °C, ou de 225 °C a 200 °C, ou de 200 °C a 175 °C, ou de 175 °C a 150 °C, ou de 150 °C a 125 °C, ou de 125 °C a 100 °C, de 100 °C a 75 °C, ou de 75 °C a 50 °C, ou de 50 °C a 25 °C, ou abaixo de 25 °C.

[0125] Em algumas formas de realização, a temperatura de saída é de 300 °C a 250 °C ou de 250 °C a 200 °C, ou de 200 °C a 150 °C, ou de 150 °C a 100 °C, ou de 100 °C a 50 °C, ou de 50 °C a 25 °C, ou abaixo de 25 °C.

[0126] Em algumas formas de realização, o ar usado para secagem é substituído por um gás não inflamável, por exemplo, nitrogênio (N2). Isto é de particular importância se a biomassa seca produzida através do processo de secagem tem uma elevada proporção de tamanhos de partículas pequenas.

[0127] Secadores de bandeja são normalmente utilizados para o trabalho de laboratório e pequenas operações de secagem em escala piloto. Secadores de bandeja trabalham na base de aquecimento de convecção e evaporação. Biomassa úmida pode ser seca de forma eficaz usando o calor e uma entrada de ar para remover a água evaporada. O ar quente é circulado para secar. Secadores de bandeja pode também empregar pressão reduzida ou vácuo para secar à temperatura ambiente, quando os produtos são sensíveis à temperatura e são semelhantes a um liofilizador, porém menos dispendiosos de utilizar e podem ser facilmente ampliados.

[0128] Como alternativa às técnicas de secagem acima descritas, a biomassa seca também pode ser produzida por liofilização, também conhecida como secagem por congelamento ou criodessecação. O processo de liofilização envolve o congelamento do material e, em seguida, a redução da pressão ao redor e a adição de calor suficiente para permitir que água congelada no material sublime a partir da fase sólida para gás. Semelhante ao uso de secadores de bandeja, a liofilização é na maioria das vezes utilizada para pequenas operações em escala piloto, que são formas de realização menos preferidas da invenção.

[0129] Vários agentes de fluxo (incluindo produtos derivados de sílica, tal como a sílica precipitada, sílica fumada, silicato de cálcio, silicatos de alumínio e sódio) podem ser adicionados à biomassa antes ou após a secagem. A aplicação destes materiais a pós com elevado teor de gordura, higroscópicos ou pegajosos evita a aglomeração ou agregação durante e após a secagem, e promove o fluxo livre de pós secos. Isto não apenas reduz a pegajosidade, mas também reduz o acúmulo e oxidação de materiais em superfícies secas.

BIOMASSA SECA

[0130] Como mencionado acima, a biomassa seca utilizada para isolar piripiropenos tem, de preferência, o teor de água residual (peso / peso) de menos do que 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% ou 3%.

[0131] De um modo preferido, o tamanho de partícula de mais do que 80%, 85%, 90%, 95% ou mais de 98% da biomassa seca é entre 0,01 mm e 5 mm, ou menos de 3 mm, de preferência inferior a 1 mm e mais preferivelmente inferior a 0,5 mm.

[0132] O tamanho médio de partículas medidas imediatamente após a homogeneização ou logo em seguida é prático, portanto, é de preferência não mais do que 10 μm, não mais do que 25 μm, ou não mais do que 100 μm. Em algumas formas de realização, o tamanho médio de partícula é de 1 μm a 10 μm, de 1 μm a 15 μm, 10 μm a 100 μm ou de 1 μm a 40 μm. Em algumas formas de realização, o tamanho médio das partículas é maior que 10 μm e até 100 μm. Em algumas formas de realização, o tamanho médio de partícula é entre 10 μm a 100 μm.

[0133] A moagem pode ser realizada na biomassa seca a fim de produzir um tamanho de partícula específico, por meio de sistemas mecânicos com peças fixas ou giratórias. Tais peças podem ser martelos, telas ou cilindros rotativos que pressionam uns aos outros.

[0134] Exemplos de técnicas para separação de biomassa úmida do caldo de cultura, por aplicação de pressão mecânica, para a secagem da biomassa úmida ou por moagem são descritos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o âmbito da aplicação. Uma pessoa com conhecimentos comuns na arte, lendo a descrição, deve entender que outras técnicas podem ser utilizadas para alcançar os mesmos resultados.

ARMAZENAMENTO DE BIOMASSA SECA

[0135] A biomassa seca produzida por meio de qualquer das técnicas descritas acima, ou produzida por técnicas semelhantes pode ser armazenada em um tanque de armazenamento. O tanque de armazenamento é usualmente mantido a uma temperatura abaixo de 50 °C, ou abaixo de 40 °C, ou abaixo de 30 °C, ou abaixo de 25 °C, ou abaixo de 20 °C, ou abaixo de 15 °C, ou abaixo de 10 °C, ou abaixo de 5 °C, ou abaixo de 2 °C, mas preferivelmente acima da temperatura de congelamento.

[0136] A biomassa seca pode ser armazenada sob tais condições durante várias horas, ou pode ser armazenada para o armazenamento a longo prazo. A biomassa seca armazenada tem de preferência um teor de água residual (peso / peso) de menos do que 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% ou 3%.

[0137] Durações preferidas para armazenamento são de cerca de 5 horas ou até vários anos. Durações ainda mais preferidas para o armazenamento são durante mais do que cerca de 5 horas a menos do que cerca de um ano, mas também é possível escolher outras durações, por exemplo, de cerca de 1 semana a cerca de 12 meses, de cerca de 2 semanas a cerca de 24 meses, por exemplo, de cerca de 1 mês a cerca de 18 meses, de cerca de 4 horas até cerca de 6 meses.

[0138] Assim, os processos para se obter pelo menos um piripiropeno e os processos para a produção de um derivado de piripiropeno utilizam biomassa seca tendo um teor de água residual (peso / peso) de menos do que 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, ou 3%, e pode ter sido armazenada de cerca de 5 horas ou até vários anos, antes do piripiropeno compreendido ser obtido.

[0139] Embora cada manuseamento da biomassa úmida antes da extração dos piripiropenos produzidos, incluindo as etapas para a produção de biomassa seca, inclua o risco de perder quantidades valiosas de biomassa, é possível obter um rendimento de pelo menos 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou ainda mais dos piripiropenos produzidos em fermentação através de extração, com base na quantidade de biomassa seca recuperada.

[0140] Outra forma de realização da invenção é biomassa seca de um organismo produtor de piripiropeno compreendendo pelo menos um piripiropeno e com um: a) teor em água inferior a 10%, ou b) um tamanho de partícula entre 0,01 mm a 5 mm, ou c) tem um teor em água inferior a 10% e um tamanho de partícula entre 0,01 mm e 5 mm.

[0141] De preferência, a biomassa seca com essas características é de um organismo produtor de piripiropeno pertencente ao gênero Penicillium, Eupenicillium ou Aspergillus, ainda mais preferivelmente sendo de Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum ou Aspergillus fumigatus, em particular de uma das cepas mencionadas acima. Em uma forma de realização, a biomassa seca é de Penicillium coprobium, por exemplo, de Penicillium coprobium PF1169.

[0142] A biomassa seca de um modo preferido compreende pelo menos piripiropeno A, mas também pode compreender uma combinação de um ou mais piripiropenos, por exemplo, a biomassa seca pode compreender piripiropeno A, piripiropeno B, piripiropeno C e piripiropeno D.

EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PIRIPIROPENOS

[0143] A extração de piripiropenos a partir da biomassa seca pode ser realizada de acordo com métodos conhecidos na arte, por exemplo, como descrito nos documentos WO2004/060065, WO94/09147 ou WO2011/108155.

[0144] Solventes adequados para a extração incluem: - álcoois possuindo 1 a 6 átomos de carbono, tais como metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, iso-butanol, terc-butanol, n-hexanol, e os álcoois tais como 2-etil-hexanol, hexafluorisopropanol, etileno glicol; - hidrocarbonetos aromáticos, tais como benzeno, tolueno, etilbenzeno, clorobenzeno, cimeno, xilenos, mesitileno, benzotrifluoreto; - ésteres, tais como acetato de metila, acetato de etila, acetato de n-butila, acetato de isobutila; - éteres, tais como dietil éter, diisopropil éter, di-n-butil éter, terc- butil metil éter (TBME), tetrahidrofurano (THF), 2-metil tetrahidrofurano, 1,4- dioxano, 1,2-dimetoxietano; - solventes apróticos dipolares, tais como N,N-dimetilformamida (DMF); N,N-dibutilformamida, N, N-dimetilacetamida (DMAC), 1-metil-2- pirrolidinona (NMP), 1,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMI), N,N’-dimetilpropileno ureia (DMPU), dimetil sulfóxido (DMSO), sulfolano; acetonitrila; - solventes orgânicos polares, tais como piridina, solventes de hidrocarbonetos halogenados tais como diclorometano e clorofórmio; - cetonas, tais como acetona, metil etil cetona, dietil cetona, ciclohexanona; - nitrilas, tais como acetonitrila e isobutironitrila.

[0145] O termo solvente, tal como aqui utilizado inclui também misturas de dois ou mais dos solventes acima. Os solventes são geralmente aplicados a uma temperatura no intervalo de 0 °C até o ponto de ebulição do solvente, de preferência os solventes são aplicados a uma temperatura no intervalo de 20 °C a 60 °C.

[0146] Em uma forma de realização da invenção, os solventes utilizados na extração são solventes orgânicos selecionados a partir do grupo que consiste em metanol, acetato de metila, acetato de etila, acetato de butila, tolueno, etilbenzeno, clorobenzeno, clorofórmio, diclorometano, dietil éter, diisopropil éter, tetrahidrofurano e dioxano ou uma mistura de pelo menos dois destes solventes. Em outra forma de realização, os solventes incluem metanol, tolueno e etil benzeno ou são uma mistura de pelo menos dois deles, em particular misturas de metanol / tolueno ou misturas de metanol / etilbenzeno.

[0147] Normalmente, a extração é realizada várias vezes na biomassa seca, a fim de extrair os piripiropenos tão completamente quanto possível. O solvente compreendendo piripiropenos extraídos é separado da biomassa por meio de filtração.

[0148] A resistência do filtro depende do solvente particular utilizado e do teor de água residual da biomassa seca utilizada.

[0149] Em algumas formas de realização da invenção, a resistência do filtro é, em grau crescente de preferência: abaixo de 5*1013 mPas / m2, abaixo de 4*1013mPas / m2, abaixo de 3*1013mPas / m2, abaixo de 2*1013mPas / m2.

[0150] Métodos para purificar os piripiropenos compreendidos no solvente utilizado para extração estão prontamente disponíveis na arte. Alguns métodos exemplares foram descritos nos documentos WO94/09147, WO2004/060065 e WO2011/108155.

[0151] Os piripiropenos obtidos através dos processos descritos acima podem ser usados para criar outros derivados de piripiropenos, por exemplo, derivados conforme descritos nos documentos EP1889540, EP2119361, EP2196815, EP2426124, particularmente preferidos são os compostos da Fórmula III, Fórmula IV e Fórmula V.

[0152] Um método para a produção do composto da Fórmula III é descrito na Publicação de Patente Japonesa n° 259569/1996.

[0153] Os métodos para a produção de compostos da fórmula IV e fórmula V são descritos no documento WO2006/129714.

[0154] Métodos particularmente preferidos para a produção de um composto da Fórmula V são descritos nos documentos EP13151492.9 e US61/753023, que são ambos incluídos por referência em sua totalidade.

[0155] A invenção também abrange processos para se obter pelo menos um composto da Fórmula I ou para produzir pelo menos um composto da Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V, a partir da biomassa seca com um: a) teor de água inferior a 10%, ou b) um tamanho de partícula entre 0,01 mm e 5 mm, ou c) tem um teor de água inferior a 10% e um tamanho de partícula entre 0,01 mm a 5 mm.

[0156] De preferência, a biomassa seca com essas características é de um organismo produtor de piripiropeno pertencente ao gênero Penicillium, Eupenicillium ou Aspergillus, ainda mais preferivelmente sendo de Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum ou Aspergillus fumigatus, em particular de uma das suas estirpes mencionadas acima. Em uma forma de realização, a biomassa seca é de Penicillium coprobium, por exemplo, de Penicillium coprobium PF1169.

[0157] A biomassa seca de um modo preferido compreende pelo menos piripiropeno A, mas também pode compreender uma combinação de um ou mais piripiropenos, por exemplo, a biomassa seca pode compreender piripiropeno A, piripiropeno B, piripiropeno C e piripiropeno D.

[0158] De preferência, os processos envolvem a obtenção de um composto da Fórmula II, que pode ou não ser usado para produzir pelo menos um composto da fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V, preferivelmente utilizado para produzir pelo menos um composto da Fórmula IV ou Fórmula V e ainda mais preferivelmente um para produzir um composto da Fórmula V. Os processos podem também compreender a etapa de utilização de pelo menos um composto da Fórmula II, Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V, de um modo preferido um composto da fórmula geral V para produzir uma composição para controle de pragas, que compreende pelo menos um composto da Fórmula II, Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V. A composição para controle de pragas é preferencialmente um inseticida.

[0159] Processos para se obter compostos da Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V a partir de compostos da Fórmula I ou Fórmula II, bem como processos para a produção de composições para o controle de pragas, incluindo inseticidas que utilizam estes compostos como ingredientes ativos são, por exemplo, divulgados nos documentos EP2223599, EP2119361 e EP1889540, que são aqui incluídos em sua totalidade.

EXEMPLOS EXEMPLO I: PRODUÇÃO DE BIOMASSA SECA COM 7% DE TEOR DE ÁGUA RESIDUAL POR MEIO DE SECAGEM EM UM SECADOR MOINHO DE PASTA E EXTRAÇÃO DE PIRIPIROPENO A COM ETIL BENZENO

[0160] Para a secagem em um secador moinho de pasta e ainda extração de piripiropeno A, foi aplicada biomassa suspensa de Penicillium coprobium de fermentação em batelada alimentada. O microrganismo P. coprobium foi cultivado em um fermentador de 16,5 m3com volume de trabalho de 10 m3.

[0161] O caldo de cultura colhido compreendia um volume de 10 m3e continha 6 a 8% (peso / volume) de biomassa que compreendia 1,8% a 2% (peso / volume) de piripiropenos, localizada no interior da biomassa. (Para análise de HPLC de piripiropeno A e determinação do teor de Biomassa, veja abaixo).

[0162] O caldo de cultura recolhido foi tratado com um processo de inativação térmica e desidratado por filtração em um dispositivo de filtro- prensa contendo 26 placas com um tamanho de 760x760 mm para produzir biomassa úmida. Todas as placas foram cobertas com material de tecido de filtro do fabricante Nakao filter corp., tipo TR 2600. O bolo do filtro obtido (biomassa úmida) tinha um teor de água de ~75% a 78% (para determinação do teor de água, veja abaixo). Glicose residual não foi detectado no bolo do filtro.

[0163] Este bolo do filtro desidratado foi, em seguida, submetido à secagem em secador moinho de pasta semelhante em construção ao desenho esquemático de um secador moinho de pasta mostrado na Figura 1.

[0164] O secador moinho de pasta usado no Exemplo I tinha as seguintes especificações:

- Diâmetro: 140 milímetros - Altura: 1,300 milímetros - Número de facas rotoras: 5 - Número de voltas máx.: 2.800 RPM - Rendimento de gás máx.: 300 kg / h

[0165] 7,5 a 7,9 kg / h do bolo do filtro descrito foram alimentados ao secador moinho de pasta através de um parafuso de alimentação. A quantidade do nitrogênio utilizado como gás de secagem foi fixada a 119 a 121 m3/ h ou velocidade hidráulica do gás de 3 m / s, respectivamente. O rotor composto na câmara de secagem do secador moinho de pasta foi ajustado para um número de voltas de 900 rpm para alcançar um tempo de residência suficiente no aparelho correspondente ao nível de secagem suficiente do produto. A temperatura de entrada do gás de secagem foi fixada a 221 a 224 °C.

[0166] O teor de água obtido da biomassa seca foi determinado ser de 7% e o teor de piripiropeno A foi de 28,9% em peso.

[0167] A biomassa seca produzida mostrou estabilidade em armazenamento a longo prazo à temperatura ambiente: após 213 dias, foi observada uma perda de piripiropeno A de 4%; e após 242 dias, 6% no total de piripiropeno A foram decompostos. A 60 °C, foi observada uma degradação contínua de piripiropeno A de, no total, 54% de piripiropeno A após 242 dias.

MOAGEM E EXTRAÇÃO COM ETIL BENZENO

[0168]A biomassa obtida por secagem em moinho de pasta tal como descrito acima e contendo 7% de água residual foi submetida à moagem utilizando um aparelho Microthron MB550, ajustado na etapa 7 durante 45 segundos. 100 g de biomassa seca moída foram submetidos a um reator de 0,75 L agitado com um impulsor de lâmina. 200 mL de etil benzeno foram adicionados e a suspensão foi agitada durante 18 h a 60 °C com 250 rpm. Depois disso, a suspensão foi filtrada utilizando um filtro de vidro de 0,5 L (tamanho de poros 3; 9,5 cm de diâmetro) utilizando vácuo de 200 mbar. O bolo do filtro foi lavado duas vezes com 200 mL de etil benzeno, cada uma tendo uma temperatura de 60 °C (lavagens de deslocamento). Em seguida, o bolo do filtro foi lavado duas vezes com 150 mL de etil benzeno, cada uma tendo uma temperatura de 60 °C (lavagens de deslocamento).

[0169] O piripiropeno foi obtido a um rendimento de 93,9% (peso / peso) em relação à quantidade presente na biomassa seca antes da extração.

EXEMPLO PARA O PROCEDIMENTO DA DETERMINAÇÃO DA RESISTÊNCIA DO FILTRO DE BIOMASSA SECA USANDO DIFERENTES SOLVENTES DE EXTRAÇÃO

[0170] 50 g de biomassa seca em moinho de pasta com um teor de água residual de 7% (veja Exemplo I, supra) e 100 ml de solvente foram agitados a uma determinada temperatura durante 18 horas. Os solventes utilizados foram: a) metanol com temperatura ambiente; b) tolueno com temperatura ambiente, c) etil benzeno com temperatura ambiente e d) etil benzeno com 60 °C. A suspensão obtida foi filtrada utilizando um filtro de pressão e um tecido de filtro PP25130F (PP = polipropileno, empresa: Verseidag) a 1 bar. Os parâmetros seguintes foram medidos para determinar a resistência do filtro: a) área de filtração; b) tempo de filtração; c) pressão de filtração; d) volume do filtrado obtido; e) altura do bolo do filtro. Resistências do filtro e concentrações de piripiropeno A na solução após extração determinadas para biomassas com diferentes teores de água residual são listadas na Tabela 2). TABELA 2: RESUMO DE EXTRAÇÕES DE PIRIPIROPENO (PPA) A PARTIR DE BIOMASSA ÚMIDA E SECA

EXEMPLO II: PRODUÇÃO DE BIOMASSA SECA COM 5% DE TEOR DE ÁGUA RESIDUAL POR MEIO DE SECAGEM EM UM SECADOR MOINHO DE PASTA E EXTRAÇÃO DE PIRIPIROPENO A COM TOLUENO E ETIL BENZENO

[0171] Os mesmos material e aparelho descritos no Exemplo 1 foram usados para a secagem em um secador moinho de pasta. A taxa de alimentação foi ajustada desta vez para 4 a 5,8 kg / h e a velocidade do rotor foi ajustada a 1000 rpm. 113 a 117 m3/ h de gás de secagem (nitrogênio) foram aplicados a 219 até 224 ° C para secar a biomassa úmida.

[0172] A biomassa seca gerada no processo de secagem descrito tinha um teor de água residual de 5%, um teor de piripiropeno A de 28% e mostrou estabilidade de armazenamento a longo prazo à temperatura ambiente. Uma perda de piripiropeno A de 4% foi observada após 183 dias; após 242 dias, um total de 11% piripiropeno A foi decomposto. Armazenamento do mesmo material a 60 °C durante o mesmo período de tempo (242 dias) produziu uma perda de 11% de piripiropeno A.

MOAGEME EXTRAÇÃO COM TOLUENO

[0173] Biomassa seca obtida por secagem em moinho de pasta, tal como acima descrito, contendo 5% de água residual foi submetida à moagem utilizando um aparelho Microthron MB550, ajustado à etapa 7 durante 45 segundos. 100 g da biomassa seca moída foram submetidos a um reator de 0,75 litro agitada com um impulsor de lâmina. 200 ml de tolueno foram adicionados e a suspensão foi agitada durante 18 h a 60 °C com 250 rpm. Depois disso, a suspensão foi filtrada utilizando um filtro de vidro de 0,5 litro (tamanho de poros 3; 9,5 cm de diâmetro) usando vácuo a 200 mbar.

[0174] O bolo do filtro foi lavado com 200 ml de tolueno (lavagem de deslocamento). Em seguida, o bolo do filtro foi transferido para o reator de 0,75 litro e agitado durante mais 60 min com 200 ml de tolueno. A suspensão foi filtrada de novo utilizando as mesmas condições tal como descrito acima.

[0175] Em seguida, o bolo do filtro foi lavado com 150 mL de tolueno (lavagem de deslocamento). Em seguida, o bolo do filtro foi transferido para o reator de 0,75 litro e agitado durante mais 60 min com 150 ml de tolueno. A suspensão foi filtrada de novo utilizando as mesmas condições tal como descrito acima.

[0176] Em seguida, o bolo do filtro foi lavado com 150 ml de tolueno (lavagem de deslocamento). Em seguida, o bolo do filtro foi transferido para o reator de 0,75 litro e agitado durante mais 60 min com 150 ml de tolueno. A suspensão foi filtrada de novo utilizando as mesmas condições tal como descrito acima. Piripiropeno foi obtido com um rendimento de 96,4% (peso / peso) em relação à quantidade presente na biomassa seca antes da extração.

MOAGEM E EXTRAÇÃO COM ETIL BENZENO EXEMPLO 1

[0177] Biomassa seca obtida por secagem em moinho de pasta, tal como acima descrito, contendo 5% de água residual foi submetida à moagem, utilizando um aparelho Microthron MB550, ajustado à etapa 7 durante 45 segundos. 100 g de biomassa seca moída foram submetidos a um reator de 0,75 litro, agitados com um impulsor de lâmina. 200 ml de etil benzeno foram adicionados e a suspensão foi agitada durante 18 h a 60 °C com 250 rpm. Depois disso, a suspensão foi filtrada utilizando um filtro de vidro de 0,5 litro (tamanho de poros 3; 9,5 centímetros de diâmetro) usando vácuo a 200 mbar.

[0178] O bolo do filtro foi lavado de novo com 200 ml de etil benzeno (lavagem de deslocamento). Em seguida, o bolo do filtro foi transferido para o reator de 0,75 litro e agitado durante mais 60 min com 200 ml de etil benzeno. A suspensão foi filtrada de novo utilizando as mesmas condições tal como descrito acima.

[0179] Em seguida, o bolo do filtro foi lavado com 150 ml de etil benzeno (lavagem de deslocamento). Em seguida, o bolo do filtro foi transferido para o reator de 0,75 litro e agitado durante mais 60 min com 150 ml de etil benzeno. A suspensão foi filtrada de novo utilizando as mesmas condições tal como descrito acima.

[0180] Em seguida, o bolo do filtro foi lavado com 150 ml de etil benzeno (lavagem de deslocamento). Em seguida, o bolo do filtro foi transferido para o reator de 0,75 litro e agitado durante mais 60 min com 150 ml de etil benzeno. A suspensão foi filtrada de novo utilizando as mesmas condições tal como descrito acima. Piripiropeno foi obtido com um rendimento de 95,3% (peso / peso) em relação à quantidade presente na biomassa seca antes da extração.

MOAGEM E EXTRAÇÃO COM ETIL BENZENO

[0181] Biomassa seca obtida por secagem em moinho de pasta, tal como acima descrito, contendo 5% de água residual foi submetida à moagem, utilizando um aparelho Microthron MB550 ajustado à etapa 7 durante 45 segundos. 200 g de biomassa seca moída foram submetidos a um reator de 0,75 litro equipado com um impulsor de lâmina. 400 ml de etil benzeno foram adicionados e a suspensão foi agitada durante 18 h à temperatura ambiente com 350 rpm. Depois disso, a suspensão foi filtrada utilizando um filtro de vidro de 0,5 litro (tamanho de poros 3; 9,5 centímetros de diâmetro) usando vácuo a 200 mbar.

[0182] O bolo do filtro foi lavado de novo com 400 ml de etil benzeno (lavagem de deslocamento). Em seguida, o bolo do filtro foi transferido para o reator de 0,75 litro e agitado durante mais 60 min com 400 ml de etil benzeno. A suspensão foi filtrada de novo utilizando as mesmas condições tal como descrito acima.

[0183] Em seguida, o bolo do filtro foi lavado com 300 ml de etil benzeno (lavagem de deslocamento). Em seguida, o bolo do filtro foi transferido para o reator de 0,75 litro e agitado durante mais 60 min com 300 ml de tolueno. A suspensão foi filtrada de novo utilizando as mesmas condições tal como descrito acima. Piripiropeno foi obtido com um rendimento de 91,5% (peso / peso) em relação à quantidade presente na biomassa seca antes da extração.

EXTRAÇÃO COM METANOL

[0184] 100 g de biomassa seca obtida por secagem em moinho de pasta, tal como acima descrito, contendo 5% de água residual foram submetidos a um reator de 0,75 litro, equipado com um impulsor de lâmina. 200 ml de metanol foram adicionados e a suspensão foi agitada durante 18 h à temperatura ambiente com 250 rpm. Depois disso, a suspensão foi filtrada utilizando um filtro de vidro de 0,5 litro (tamanho de poro 3; 9,5 centímetros de diâmetro) usando vácuo a 200 mbar.

[0185] O bolo do filtro foi lavado duas vezes com 200 ml de metanol cada (lavagens de deslocamento). Em seguida, o bolo do filtro foi lavado duas vezes com 150 ml de metanol cada (lavagens de deslocamento). Piripiropeno foi obtido com um rendimento de 96,9% (peso / peso) em relação à quantidade presente na biomassa seca antes da extração.

MOAGEME EXTRAÇÃO COM METANOL

[0186] A biomassa obtida por secagem em moinho de pasta, tal como acima descrito, contendo 5% de água residual foi submetida à moagem utilizando um aparelho Microthron MB550 ajustado à etapa 7 durante 45 segundos.

[0187] 100 g da biomassa seca moída foram submetidos a um reator de 0,75 litro equipado com um impulsor de lâmina. 200 ml de metanol foram adicionados e a suspensão foi agitada durante 18 h à temperatura ambiente com 250 rpm. Depois disso, a suspensão foi filtrada utilizando um filtro de vidro de 0,5 litros (tamanho de poros 3; 9,5 centímetros de diâmetro) usando vácuo a 200 mbar.

[0188] O bolo do filtro foi lavado duas vezes com 200 ml de metanol cada (lavagens de deslocamento). Em seguida, o bolo do filtro foi lavado duas vezes com 150 ml de metanol cada (lavagens de deslocamento). Piripiropeno foi obtido com um rendimento de 98,7% (peso / peso) em relação à quantidade presente na biomassa seca antes da extração.

EXEMPLO III: PRODUÇÃO DE BIOMASSA SECA COM 3% DE TEOR DE ÁGUA RESIDUAL ATRAVÉS DE SECAGEM POR PULVERIZAÇÃO E EXTRAÇÃO DE PIRIPIROPENO A COM ETIL BENZENO E METANOL

[0189] Biomassa de P. coprobium produzida em fermentação de batelada de alimentação e suspensa em caldo de cultura foi usada para secagem por pulverização. O microrganismo P. coprobium foi cultivado em um fermentador de 0,3 m3com um volume de trabalho de 0,2 m3. Caldo de fermentação (caldo de cultura) contendo de 6 a 8% de biomassa e 2 a 2,1% de piripiropeno A na biomassa e menos do que 0,1 g / L de glicose. Este caldo foi submetido à inativação térmica durante 60 minutos a 70 °C antes da colheita a partir do vaso de fermentação. Depois, o caldo de cultura foi homogeneizado usando um aparelho Cavitron ajustado a uma temperatura de 70 °C. Em seguida, o caldo de fermentação foi mantido a 70 °C durante mais 30 minutos em um tanque de tampão antes de ser seco por pulverização.

[0190] Para a secagem, uma torre de secagem por pulverização semelhante em construção como descrito pelo desenho esquemático na Figura 2 foi utilizada, com as mesmas características técnicas descritas abaixo:

[0191] O caldo de cultura compreendendo a biomassa produzida foi alimentado ao secador de pulverização a uma velocidade de alimentação de 7,5 a 8,5 kg / h. Utilizou-se nitrogênio como gás de secagem e aplicado com 250 m3/ h e uma temperatura de entrada de 160 °C. A temperatura de saída de gás correspondente foi de 77 a 80 °C no ciclone.

[0192] A biomassa seca tinha um teor de água residual de 3% e um teor de piripiropeno A de 24%.

[0193] Esta biomassa seca produzida desta maneira mostrou estabilidade de armazenamento a longo prazo, porque apenas uma ligeira diminuição de 4% de piripiropeno A foi observada após armazenamento durante 213 dias à temperatura ambiente, bem como após armazenamento durante 242 dias a 60 °C.

EXTRAÇÃO COM ETIL BENZENO

[0194] 100 g de biomassa seca por pulverização contendo 3% de água residual foram submetidos a um balão de 0,5 litro e 4 tubuladuras agitado com um impulsor de lâmina. 200 ml de etil benzeno foram adicionados e a suspensão foi agitada durante 18 h à temperatura ambiente com 530 rpm. Depois disso, a suspensão foi filtrada utilizando um filtro de vidro de 0,5 litro (tamanho de poro 3; 9 cm de diâmetro).

[0195] O bolo do filtro foi lavado quatro vezes com 150 ml de etil benzeno cada (lavagens de deslocamento). Piripiropeno foi obtido com um rendimento de 95,6% (peso / peso) em relação à quantidade presente na biomassa seca antes da extração.

EXTRAÇÃO COM METANOL

[0196] 100 g de biomassa seca por pulverização contendo 3% de água residual foram submetidos a um balão de 0,5 litro e 4 tubuladuras agitado com um impulsor de lâmina. 200 ml de metanol foram adicionados e a suspensão foi agitada durante 18 h à temperatura ambiente com 530 rpm. Depois disso, a suspensão foi filtrada utilizando um filtro de vidro de 0,5 litro (tamanho de poro 3; 9 cm de diâmetro).

[0197] O bolo do filtro foi lavado quatro vezes com 150 ml de metanol cada (lavagens de deslocamento). Piripiropeno foi obtido com um rendimento de 98% (peso / peso) em relação à quantidade presente na biomassa seca antes da extração.

IV: ANÁLISE E MÉTODOS

[0198] Na medida em que não indicado de outra forma, os seguintes métodos foram utilizados para determinar os valores apresentados nos exemplos: - Análise por HPLC PIRIPIROPENO - Instrumento: AGILENT - Coluna: Zorbax Eclipse XDB-C18; 1,8 μm; 50 x 4,6 mm - (N ° 922.975,902) - Pressão: cerca de 230 bar - Compr. de onda do detector de UV: 230 nm ou 320 nm - Temperatura: 40 °C PREPARAÇÃO DE SOLUÇÕES - Solução A: Água (Sigma-Aldrich) com 0,1 vol% de ácido fosfórico - Solvente Orgânico B: Acetonitrila (Sigma-Aldrich Grau Gradiente)

- A fase móvel é automaticamente desgaseificada no aparelho de HPLC. 3 min padrão externo para piripiropeno A Área pico em % para qualquer 1 μl (piripiropeno) - Solvente de diluição Acetonitrila para piripiropeno

PREPARAÇÃO DE AMOSTRA PARA PIRIPIROPENO A

[0199]Pesar com precisão cerca de 100 mg de amostra em um balão volumétrico de 100,0 ml; dissolver em 40,0 ml de acetonitrila (ultrassonicar durante 1 minuto). Se a amostra não for resolvida em acetonitrila pura, adicionar água e repitir sonificação. Completar o volume com acetonitrila.

PREPARAÇÃO PADRÃO

[0200] Uma calibração típica contém cinco soluções padrão:

[0201]Dissolver cada solução padrão em acetonitrila (piripiropeno A) (ver preparação de amostra para mais detalhes). O tipo de curva de calibração é linear.

[0202]As concentrações dependem da sensibilidade do detector, ajustes podem ser necessários.

FORMATO DE INJEÇÃO

[0203]4 x em branco / 1 x padrão 1 a 5 / preparação de amostra.

TEMPOS DE RETENÇÃO

[0204] O tempo de retenção de piripiropeno A é: 7,7 min

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE BIOMASSA

[0205] Filtração de ~ 15 g de caldo de fermentação; 2 x lavagem do bolo do filtro com água destilada; secagem do bolo do filtro: halogênio (IR-) - escalas de secagem (Mettler Toledo) temperatura de secagem 180 °C até peso constante. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÁGUA 1) O teor de água residual do bolo de filtro (biomassa úmida) foi determinado por cálculo do teor de biomassa do caldo de fermentação (ver acima) e o peso real do bolo do filtro. 2) Para teores de água residuais abaixo de ~ 30%: perda no método de secagem. Aprox. 5 - 10 g de biomassa são secos em um secador a vácuo a 80 °C e 50 mbar (corrente de nitrogênio 20 L / h) durante 18 h (massa constante). 3) Para teores de água residual abaixo de ~ 10%: a) Escalas de halogênio (IR) (Mettler Toledo) a 102 °C, 4 h (peso constante). b) Karl Fischer: para 0,1 g - 0,5 g de biomassa seca é adicionado ~ 45 mL de metanol. Esta suspensão é agitada durante um curto período de tempo (~ 10 seg).

[0206] Em seguida, titulação de Karl Fischer é realizada. Este método é adequado para a biomassa de tamanho de partícula relativamente pequeno, devido à possibilidade de alcançar toda água que está ligado no interior das células. Oberschalenwaage, Magnetrührer mit Heizpilz, Glasapparatur nach c) Método Aufhauser: uma amostra de 50 g de biomassa é pesada em um balão de 500 ml que é depois cheio até aproximadamente metade do volume com tolueno.

[0207] A água é removida por destilação azeotrópica e recolhida em uma armadilha Dean-Stark até que nenhuma água seja removida da amostra.

[0208] A densidade é assumida como sendo de 1 g / ml:

DETERMINAÇÃO DA GLICOSE COM CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

Claims (28)

1. PROCESSO PARA OBTER PELO MENOS UM PIRIPIROPENO, caracterizado por compreender as etapas de: a) cultura de um organismo produtor de piripiropeno em um caldo de cultura sob condições de cultura, em que pelo menos um piripiropeno é produzido, b) produção de biomassa seca tendo um conteúdo de água residual (peso/peso) inferior a 10% a partir de pelo menos uma parte da biomassa obtida na etapa a), c) obtenção de pelo menos um piripiropeno a partir da biomassa seca produzida na etapa b).

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela biomassa seca produzida na etapa b) ser produzida diretamente por meio de secagem por pulverização do caldo de cultura que compreende a biomassa, ou ser produzida através de secagem da biomassa úmida obtida a partir do caldo de cultura.

3. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela biomassa úmida ser obtida a partir do caldo de cultura através de: a) filtração e/ou centrifugação, ou b) filtração e aplicação de pressão mecânica, ou c) filtração e/ou centrifugação e aplicação de pressão mecânica.

4. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 3, caracterizado pela biomassa úmida: a) ter sido ressuspensa em um meio de ressuspensão, ou b) ter sido homogeneizada, ou c) ter um teor de glicose de menos que 5 g/l, ou d) ter um teor de água entre mais que 15% e menos que 90%, ou e) ter uma combinação de pelo menos dois de a) a d).

5. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela biomassa seca produzida na etapa b), ser produzida por secagem em um secador por pulverização, um secador moinho de pasta (paste mill dryer), um secador flash, um secador de leito fluidizado ou um secador rotativo.

6. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela biomassa seca produzida na etapa b), ser produzida por secagem em um secador por pulverização ou um secador moinho de pasta.

7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela biomassa seca produzida na etapa b), ser armazenada por cerca de 5 horas até vários anos, antes do piripiropeno ser obtido na etapa c).

8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela biomassa seca produzida na etapa b), possuir um teor de água residual inferior a 5%.

9. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por mais de 80% da biomassa seca produzida na etapa b) possuir um tamanho de partícula entre 0,01 mm a 5 mm.

10. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pela biomassa seca produzida na etapa b) e utilizada para obter piripiropeno na etapa c) compreender pelo menos 95% do piripiropeno produzido durante a cultura da etapa a).

11. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo organismo produtor de piripiropeno pertencer ao gênero Penicillium, Eupenicillium ou Aspergillus.

12. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo organismo produtor de piripiropeno ser selecionado a partir do grupo que consiste em Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum e Aspergillus fumigatus.

13. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo organismo produtor de piripiropeno ser Pennicillium coprobium.

14. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo piripiropeno ser obtido a partir da biomassa seca por meio de extração com um solvente selecionado a partir do grupo de metanol, tolueno e etil benzeno, ou ser uma mistura de pelo menos dois deles.

15. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo piripiropeno ser obtido a partir da biomassa seca por meio de extração com um solvente e o solvente ser separado da biomassa por meio da etapa de filtração, possuindo uma resistência de filtro abaixo de 5*1013 mPas/m2.

16. PROCESSO PARA PRODUZIR PELO MENOS UM COMPOSTO DE FÓRMULA III, FÓRMULA IV OU FÓRMULA V

em que: R1 e R3 representam ciclopropilcarbonilóxi, e R2 representa hidroxila, ciclopropilcarbonilóxi ou 2-cianobenzoilóxi, R4 representa hidroxila

caracterizado por compreender: a) obtenção de piripiropeno através de um processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, b) produção do composto de Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V a partir do piripiropeno obtido na etapa a).

17. PROCESSO PARA OBTER PELO MENOS UM COMPOSTO DE FÓRMULA I OU FÓRMULA II, ou para produção de pelo menos um composto de Fórmula III ou Fórmula IV

em que R1, R2, R3 e R4 têm as combinações

em que R1 e R3 representam ciclopropilcarbonilóxi, e R2 representa hidroxila, ciclopropilcarbonilóxi ou 2-cianobenzoilóxi, R4 representa hidroxila caracterizado por ser a partir de biomassa seca de um organismo produtor de piripiropeno compreendendo pelo menos um piripiropeno e tendo um conteúdo de água residual (peso/peso) inferior a 10%.

18. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo organismo produtor de piripiropeno ser selecionado a partir do grupo que consiste em Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum e Aspergillus fumigatus.

19. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo organismo produtor de piripiropeno ser Penicillium coprobium.

20. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado por pelo menos um composto de Fórmula I ou Fórmula II ser obtido através da extração de biomassa seca.

21. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado por pelo menos um composto de Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V ser produzido a partir de pelo menos um composto de Fórmula I ou Fórmula II obtido através de extração da biomassa seca.

22. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizado pelo composto de Fórmula II ser obtido através da extração da biomassa seca.

23. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo composto da Fórmula II ser obtido e utilizado para produzir pelo menos um composto de Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V.

24. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 23, caracterizado por pelo menos um composto de Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V ser usado para produzir uma composição para controle de pragas.

25. USO DE BIOMASSA SECA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado por ser para se obter pelo menos um composto da Fórmula I.

26. USO DE BIOMASSA SECA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado por ser para se obter um composto da Fórmula II.

27. USO DE BIOMASSA SECA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado por ser em um processo para produzir pelo menos um composto da Fórmula III, Fórmula IV ou Fórmula V.

28. USO DE BIOMASSA SECA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado por ser em um processo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 24.

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