TWI663170B - 自乾生質製造吡里哌若平（ｐｙｒｉｐｙｒｏｐｅｎｅｓ） - Google Patents

Abstract

本發明係關於製造吡里哌若平(pyripyropene)產生者生物體之乾生質的方法、自該乾生質獲得吡里哌若平的方法，及關於自該乾生質所得之吡里哌若平製造式III及/或式IV及/或式V之化合物的方法。本發明實際上進一步關於乾生質本身、及使用該乾生質以獲得用於製造式III及/或式IV及/或式V之化合物之吡里哌若平的方法，包括使用該乾生質以獲得吡里哌若平或式III及/或式IV及/或式V之化合物來製造包含該等化合物之害蟲控制組合物(特別是殺昆蟲劑)的方法。

Description

自乾生質製造吡里哌若平(PYRIPYROPENES)

本發明係關於製造吡里哌若平(pyripyropene)生產者生物體之乾生質的方法、自該乾生質獲得吡里哌若平的方法，及關於自乾生質所得之吡里哌若平製造式III及/或式IV及/或式V化合物的方法。本發明實際上進一步關於乾生質本身、及使用該乾生質以獲得用於製造式III及/或式IV及/或式V化合物之吡里哌若平的方法，包括使用該乾生質以獲得吡里哌若平或式III及/或式IV及/或式V化合物來製造包含該等化合物之害蟲控制組合物(特別是殺昆蟲劑)的方法。

吡里哌若平是一群自然生成之化合物，該等化合物係由微生物及尤其係由若干種絲狀真菌以二次代謝產物形式所產生。該化合物群組已受到注意，此乃因為其等顯示針對大鼠肝臟微粒體中Acyl-CoA膽固醇醯基轉移酶(ACAT)具有極強效的抑制作用(Journal of Antibiotics(1996)，49(3)，292-298)並針對於若干種昆蟲(例如，針對於棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)幼蟲(Applied and Environmental Microbiology(1995)，61(12)，4429-4435)、小菜蛾(Diamondback moth)幼蟲(W02004/060065)、黃粉蟲(Tenebrio molitor)(W02004/060065)及蚜蟲(aphids)(W02006/129714))具有殺昆蟲 活性。

迄今為止，吡里哌若平之化學合成仍非常困難，因此大比例之吡里哌若平仍舊係藉由微生物發酵作用加以製造。具有可製造吡里哌若平之能力的微生物為(例如)糞生青黴(Penicillium coprobium)PF-1169菌株(Journal of Technical Disclosure第500997/2008號)、熏煙麯黴(Aspergillus fumigatus)IF0-1289菌株(日本專利公開公開案第360895/1992號)、網狀孢正青黴(Eupenicillium reticulosporum)NRRL-3446菌株(Applied and Environmental Microbiology(1995)，61(12)，4429-4435)、灰黃青黴(Penicillium griseofulvum)F1959菌株(W02004/060065)、及熏煙麯黴(Aspergillus fumigatus)FO1289及其突變體熏煙麯黴FO1289-2501。極普遍地，在該等微生物中(例如熏煙麯黴FO1289及其突變體熏煙麯黴FO1289-2501)不僅會產生一種而是會產生在其側鏈結構具有差異性的若干種不同之吡里哌若平(Journal of Antibiotics(1996)，49(3)，292-298)。

在吡里哌若平領域之研究不僅可識別出產生吡里哌若平之微生物及不同種類之自然生成之吡里哌若平，而且可提供數目龐大之藉由化學修飾自然生成之吡里哌若平製得之吡里哌若平衍生物。該等衍生物及其製造方法之實例揭示於EP1889540、EP2119361、EP2186815及EP2426124中。

獲得全部可能之該受關注天然化合物群組及其衍生物需要利用有效大規模之製造吡里哌若平的方法。然而，經由微生物之發酵作用產生吡里哌若平及其經由從所製得的生質萃取之收集物仍舊存在技術性問題，且在處理及所製得生質之儲藏會引起及/或與在從生質萃取吡里哌若平期間及之後之大體積之處理相關的高成本問題。尤為重要的技術性問題為(例如)欠缺長期儲藏所製得生質之方法及從大體積生質中萃取出吡里哌若平期間所出現的高過濾阻力。

本發明部分上係基於與自未經乾燥的物質之萃取相比，可自乾生質分離吡里哌若平而不會對萃取的吡里哌若平之產率造成負面影響之發現。同時地，乾生質之產生及其於萃取吡里哌若平之使用在儲藏生質期間顯著地增強穩定性，減小經處理之體積，在萃取吡里哌若平中獲致低過濾阻力及在萃取之後獲得較高濃度之吡里哌若平。

本發明包括一種獲得至少一種吡里哌若平之方法，該方法包括以下步驟：a)將吡里哌若平生產者生物體於培養條件下培養在液體培養基中，其中可製得至少一種吡里哌若平，b)自步驟a)中所獲得生質之至少一部分製造乾生質，c)自步驟b)中所製得之該乾生質獲得至少一種吡里哌若平。

該方法包括其中步驟b)中所製得之該乾生質係直接藉由噴霧乾燥包含生質之液體培養基製得，或係藉由乾燥自液體培養基獲得之濕生質製得之步驟。

該濕生質可自液體培養基藉由以下獲得：a)過濾及/或離心，或b)過濾及施加機械壓力，或c)過濾及/或離心及施加機械壓力。

該濕生質可進一步進行以下操作：a)再懸浮於再懸浮培養基中，b)均質化，其可具有以下：c)小於5g/l之葡萄糖含量，可具有以下：d)介於大於15%至小於90%之間之水含量，或可具有以下：e)該等特徵a)至d)中之至少兩個特徵之組合。

上述方法可進一步包括其中乾生質係藉由在噴霧乾燥器、磨漿 式乾燥器、快速乾燥器、流化床乾燥器、或旋轉乾燥器中乾燥製得之步驟。較佳地，乾生質係藉由在噴霧乾燥器或磨漿式乾燥器中乾燥製得。製得並用於上述方法中之乾生質可在獲得吡里哌若平之前儲藏約5小時、或長達數年。此外，上文提及之乾生質較佳具有小於10%之殘餘水含量。於本發明之一個實施例中，乾生質佔具有介於0.01mm至5mm之間之粒徑的顆粒80%以上。

較佳地，製得並用於上述方法中之乾燥物質包含培養吡里哌若平生產者生物體期間所製得吡里哌若平之至少95%(即，包含於在吡里哌若平生產者生物體發酵後自液體培養基所收穫濕生質中之吡里哌若平的量)。較佳地，吡里哌若平生產者生物體屬於青黴屬、正青黴屬、或麯黴屬，甚至更佳地，吡里哌若平生產者生物體係選自由糞生青黴、灰黃青黴、網狀孢正青黴及熏煙曲黴組成之群。最佳地，吡里哌若平生產者生物體為糞生青黴。

上述方法通常包括其中吡里哌若平係自乾生質藉由萃取、較佳藉以選自甲醇、甲苯及乙苯之群之溶劑(或為其中至少兩者之混合物)萃取獲得之步驟。於本發明之一個實施例中，上述方法包括自乾生質萃取至少一種吡里哌若平及藉由其中過濾阻力較佳低於5*10¹³mPas/m²之過濾將用於萃取之溶劑與萃取的生質分離之步驟。

上述方法亦可包括製造至少一種式III、式IV或式V化合物之步驟，其中至少一種吡里哌若平係藉由上述方法獲得，及係用於製造至少一種式III、式IV或式V化合物。該等方法可進一步包括獲得或純化式III、式IV或式V化合物之步驟，該化合物可進一步用於製造害蟲控制組合物(較佳係殺昆蟲劑)。

本發明之另一個實施例為吡里哌若平生產者生物體之乾生質，其包含至少一種吡里哌若平且具有小於10%之水含量，或具有介於0.01mm至5mm之間之粒徑，或具有小於10%之水含量及介於0.01 mm至5mm之間之粒徑。乾生質較佳係衍生自選自糞生青黴、灰黃青黴、網狀孢正青黴及熏煙麯黴之群之吡里哌若平生產者生物體，甚至更佳地，乾生質係衍生自糞生青黴。

本發明之另一個實施例為一種獲得至少一種式I化合物、或自吡里哌若平生產者生物體之乾生質製造至少一種式III、式IV或式V化合物之方法，該乾生質包含至少一種吡里哌若平且具有小於10%之水含量，或具有介於0.01mm至5mm之間之粒徑，或具有小於10%之水含量及介於0.01mm至5mm之間之粒徑。乾生質較佳係衍生自選自糞生青黴、灰黃青黴、網狀孢正青黴及熏煙麯黴之群之吡里哌若平生產者生物體，甚至更佳地，乾生質係衍生自糞生青黴。較佳地，該方法為其中獲得式II化合物之方法。於另一個實施例中，獲得之式II化合物係用於製造至少一種式III、式IV或式V化合物，較佳係用於製造式V之化合物。該方法可甚至包括另一個其中於該方法中製得之至少一種式III、式IV或式V化合物(較佳係式V之化合物)進一步用於製造包含至少一種式III、式IV或式V化合物之害蟲控制組合物之步驟。較佳地，該害蟲控制組合物為殺昆蟲劑。

本發明實際上進一步包括一種以包含至少一種吡里哌若平且具有小於10%之水含量、或具有介於0.01mm至5mm之前之粒徑、或具有小於10%之水含量及介於0.01mm至5mm之間之粒徑之吡里哌若平生產者生物體乾生質於獲得至少一種式I化合物之用途。乾生質較佳係衍生自選自糞生青黴、灰黃青黴、網狀孢正青黴及熏煙麯黴之群之吡里哌若平生產者生物體，甚至更佳地，乾生質係衍生自糞生青黴。較佳地，乾生質係用於獲得式II之化合物。

本發明亦包括一種以包含至少一種吡里哌若平且具有小於10%之水含量、或具有介於0.01mm至5mm之間之粒徑、或具有小於10%之水含量及介於0.01mm至5mm之間之粒徑之吡里哌若平生產者生物體 乾生質於製造至少一種式III、式IV或式V化合物之方法中之用途。乾生質較佳係衍生自選自糞生青黴、灰黃青黴、網狀孢正青黴及熏煙麯黴之群之吡里哌若平生產者生物體，甚至更佳地，乾生質係衍生自糞生青黴。

一般定義

術語「吡里哌若平」意指式I之化合物

其中R1、R2、R3及R4具有如表1中所示之組合。

表1：式I化合物之R1、R2、R3及R4之組合及具有該等組合之化合物之名稱

基於說明之原因，由式I及表I所述之術語「吡里哌若平A」意指式II之化合物，其亦稱為1,7,11-三-O-乙醯基吡里哌若平A

較佳之吡里哌若平包括如表1中所述之吡里哌若平A至吡里哌若平O，及較佳係吡里哌若平A、E及O，其中吡里哌若平A為最佳。

另較佳者為式II、式III、式IV及式V所述之化合物。

術語「1,7,11-三-去乙醯基吡里哌若平A」意指式III之化合物

術語「式IV之化合物」意指式I之化合物，其中：R1與R3表示環丙基羰氧基，及R2表示羥基、環丙基羰氧基、或2-氰基苯甲醯氧基R4表示羥基，較佳地，式IV之化合物包含一種組合，其中：R1表示羥基，R2與R3表示環丙基羰氧基，及R4表示羥基、或環丙基羰氧基。

術語「1,11-二-O-環丙烷羰基-1,7,11-三去乙醯基吡里哌若平A」意指式V化合物：

由式I、式II、式III、式IV及式V所述之吡里哌若平亦包括該等化合物之鹽。較佳係式I、式IV及式V化合物之鹽。該等鹽之實例包括農 業或園藝可接受酸加成鹽，諸如鹽酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、或乙酸鹽。

圖1繪示用於實例I及II中之磨漿式乾燥器之示意圖。

該製程係以供給濕生質(濕進料)至圖1左側上之容器中開始。該容器提供有藉由位於容器底部處之馬達(M)驅動之轉子，以在藉由馬達(M)電動螺桿饋送濕生質至磨漿式乾燥器之前將其均質化。描繪於圖1左中側之磨漿式乾燥器亦在磨漿式乾燥器之底部三分之一之處提供有許多轉子刀。該等轉子刀藉由在磨漿式乾燥器之底部之處之馬達(M)供電。磨漿式乾燥器亦在其體積之底部三分之一之處提供有熱空氣供應源。空氣流描繪於圖1右下中側及其特徵係為用於加熱空氣之裝置之流動控制(FC)、及調節加熱裝置之功率以提供具有預定入口溫度之空氣之溫度控制(TC)。提供至磨漿式乾燥器之底部三分之一之處之熱空氣與藉由螺旋所提供之濕生質混合及藉由接近濕生質之進料之處旋轉之轉子刀均質化。此組合之結果係：濕生質藉由熱空氣之旋渦捲帶至將其乾燥之磨漿式乾燥器之體積之中間三分之一中。藉由此製程所製得之乾生質進一步藉由熱空氣捲帶至磨漿式乾燥器之頭部空間(其體積之較高三分之一)中，於該處乾生質經管流至另一個在內側包括過濾器且描繪於圖1右側之容器。乾生質係藉由位於容器底部之處之過濾器收集及可基於儲藏或乾生質(乾燥產物)之進一步輸送而排空至另一個容器中。將磨漿式乾燥器及包括漏斗之容器連接之管包括另一個用於測量外傳空氣流之溫度(流出口溫度)及調節驅動饋送濕生質至磨漿式乾燥器之螺旋的馬達(M)速度的溫度控制(TC)之感測器。磨漿式乾燥器自身進一步提供有可控制位於包括漏斗及控制可自包括漏斗 之容器逃逸之空氣(廢氣)的量之容器出口處之馬達(M)之壓力控制(PC)。

圖2繪示用於實例III中之噴霧乾燥器之示意圖。

噴霧乾燥器基本上係由在噴霧乾燥器底部之處具有以H3表示的高度、在較高部分之處具有以D1表示的總直徑及在較低部分或開孔之處具有分別以D2表示的直徑之似漏斗結構組成。在此似漏斗結構頂部為形成為料筒及具有以H2表示的高度、及與以D1表示之似漏斗結構之較高直徑相同的較高及較低直徑之中間部分。噴霧乾燥器之較高封閉部分包括具有以H1表示的高度之頭部空間。該頭部空間亦包括管及濕生質饋送通過並噴射至噴霧乾燥器之中間部分中之噴嘴。整體噴霧乾燥器提供熱空氣流，該熱空氣流捲帶均勻分佈的濕生質以並流下行於乾燥器方式乾燥。經乾燥之生質及乾燥用氣體之混合流在乾燥器本體之底部之處朝向氣體固體分離器離開乾燥器。

本發明係關於製造吡里哌若平生產者生物體之乾生質的方法、自該乾生質獲得吡里哌若平的方法，及關於自乾生質所得之吡里哌若平製造式III及/或式IV及/或式V化合物之方法。

本發明實際上進一步關於乾生質本身，及關於一種以乾生質於獲得吡里哌若平或式III及/或式IV及/或式V化合物之用途及一種以乾生質作為殺昆蟲劑或於製造殺昆蟲劑之用途。

因此，本發明包括一種獲得至少一種吡里哌若平之方法，該方法包括以下步驟：a)將吡里哌若平生產者生物體於培養條件下培養在液體培養基中，其中可製得至少一種吡里哌若平，b)自步驟a)中獲得之生質之至少一部分製造乾生質，c)自步驟b)中所製得之該乾生質獲得至少一種吡里哌若平。

該獲得之吡里哌若平可用於製造吡里哌若平之衍生物。較佳之吡里哌若平衍生物為式III化合物、式IV化合物及式V化合物。

因此，本發明另一個實施例為一種製造吡里哌若平之衍生物的方法，較佳係製造至少一種式III、式IV或式V化合物的方法，該方法包括：a)自包含至少一種吡里哌若平之乾生質獲得吡里哌若平，b)自步驟a)中所獲得之該吡里哌若平製造至少一種吡里哌若平之至少一種衍生物，較佳係自步驟a)中所獲得之該吡里哌若平製造至少一種選自由式III化合物、式IV化合物及式V化合物組成之化合物群組之吡里哌若平衍生物。

本發明之另一個實施例為一種製造吡里哌若平之衍生物的方 法，較佳係製造至少一種式III、式IV或式V化合物(較佳係式V之化合物)的方法，該方法包括：a)將吡里哌若平生產者生物體於培養條件下培養在液體培養基中，其中可製得至少一種吡里哌若平，b)自步驟a)中所獲得之生質之至少一部分製造乾生質，c)自步驟b)中所製得之該乾生質獲得至少一種吡里哌若平，d)自步驟c)中所獲得之吡里哌若平製造至少一種吡里哌若平之至少一種衍生物，較佳係自步驟c)中所獲得之吡里哌若平製造至少一種選自由式III化合物、式IV化合物及式V化合物組成之化合物群組之吡里哌若平衍生物。

於上述方法中所獲得之吡里哌若平較佳係自乾生質藉由萃取依照可於相關技藝中取得之方法，例如，依進一步述於下文之方法獲得。

該獲得之吡里哌若平可藉由相關技藝中可用之方法純化(例如)以製造呈90%、95%、96%、97%、98%、99%、或接近100%純化合物之各別吡里哌若平，或雖然仍舊包含於一或多種溶劑中，但仍可用於製造吡里哌若平衍生物的方法之萃取。

培養吡里哌若平生產者生物體：

包含至少一種吡里哌若平之生質可藉由吡里哌若平生產者生物體之發酵作用製得。吡里哌若平生產者生物體為具有可藉由其天然基因組或因其為提供用於生物合成至少一種吡里哌若平之一個、數個、或所有步驟之基因重組體而製造吡里哌若平之能力之任何類型微生物細胞。

適宜吡里哌若平生產者生物體之實例以及其各別培養條件已述於Pure Appl.Chem.，第71卷，第6號，第1059至1064頁，1999；Bioorganic Medicinal Chemistry Letter第5卷，第22號，第2683頁；及日本專利申請案公開第239385/1996號、日本專利申請案公開第184158/1994號、WO 2004/060065、日本專利申請案公開第 259569/1996號中。

較佳之吡里哌若平生產者生物體為屬於青黴屬、正青黴屬、或麯黴屬之微生物，吡里哌若平生產者生物體之較佳物種為：糞生青黴、灰黃青黴、網狀孢正青黴或熏煙麯黴，特別是糞生青黴。

該等吡里哌若平生產者生物體之較佳菌株為糞生青黴PF-1169菌株(Journal of Technical Disclosure第500997/2008號)、灰黃青黴F1959菌株(WO2004/060065)、網狀孢正青黴NRRL-3446菌株(WO2004/060065)及熏煙麯黴FO1289，包括其突變體熏煙麯黴FO1289-2501(WO94/09147)，其中糞生青黴PF1169為最佳。

吡里哌若平生產者生物體通常可製造一種以上的式I化合物，例如，WO94/109147描述熏煙麯黴FO1289可製造吡里哌若平A、吡里哌若平B、吡里哌若平C及吡里哌若平D。

據此，可自製得之乾生質獲得一或數種吡里哌若平並用於本發明。

吡里哌若平生產者生物體亦可為微生物細胞，例如，米麯黴(Aspergillus oryzae)，其僅含用於製造吡里哌若平之生物合成途徑的基因之部分，但其在發酵條件中可供給吡里哌若平之前驅物。該等微生物已(例如)述於CA2787829及CA2788058中。

生產吡里哌若平之生物體較佳是在液體(諸如，在懸浮液培養基)中以大量形式進行發酵。較佳之方法是在有氧條件下振盪培養、於攪拌下具以鼓泡方式培養或深部有氧培養，特定言之，於攪拌下以鼓泡方式培養在大多數情況中係為有利的。

發酵過程通常係在生物反應器中進行。生物反應器通常容許控制諸如溫度、pH、氧張力、及二氧化碳濃度之培養條件。例如，生物反應器通常可例如使用連接至管件之埠建構成容許例如氧氣或氮氣之氣體組分鼓泡通過液體培養基。生物反應器可進行加壓。其亦可能 適於達成可同化的氮及/或碳來源之連續或連續供給。生物反應器可包含5公升、10公升或20公升之(例如)用於實驗室規模應用之小體積，但亦可容納諸如5000公升、10.000公升、40.000公升、50.000公升、100.000公升、150.000公升、200.000公升、或甚至更大體積之大體積。發酵可為定期收穫或移除所得生質之連續製程或可為分批製程，諸如，包括在已開始發酵後一或多次地添加碳及/或氮來源之重複饋料分批製程。因此，發酵過程可加以停止或阻止，且所製得之生質可在開始另一個製程或新的發酵之前從培養容器移除。碳及氮來源可以個別組分提供。此乃因不同的來源可經受不同的滅菌條件，及另外其容許發酵期間碳及氮或其他營養素的相對量改變。該等不同的營養素來源可分開地提供，或同時地提供，或呈組合製劑提供，而較佳係呈液體提供。

該等營養素來源可為複雜來源、所定義之培養基或個別或分離的化合物。非複合性來源是較佳的，且因此該等化合物可以高純度添加，且可為常見(或市售)化學品。

適宜之氮來源包括氨或銨離子。其中優點在於氨可充作pH調整劑。其可呈諸如硝酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽之銨鹽之形式、或呈銨離子本身(例如氫氧化銨水溶液)之形式提供。亦可使用其他無機氮來源，諸如硝酸鈉、脲或諸如天冬醯胺酸或麩醯胺酸之胺基酸。若真菌為根黴菌屬，則較佳不使用硝酸鹽作為氮來源。複合性氮來源包括酵母水解產物、初生酵母、大豆粉、酪蛋白之水解產物、酵母、酵母萃取物或米麩。

碳來源可包括複合性來源，諸如麥芽糊精、燕麥粉(oat flour)、燕麥片(oat meal)、糖蜜、植物(例如大豆)油、麥芽萃取物或澱粉。較佳之碳來源為非複雜碳來源，諸如，糖(諸如果糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖)、檸檬酸鹽、乙酸鹽、甘油或乙醇。

水性液體可另外包含其他可促進發酵之物質，例如，螯合劑(例如檸檬酸)、消泡劑(例如大豆油)、維他命(例如硫胺素及/或核黃素)、任何必需的催化金屬(例如，鹼土金屬(諸如鎂或鈣、或鋅或鐵)及/或其他金屬(諸如鈷及銅))、磷(例如磷酸鹽)及/或硫(例如硫酸鹽)。較佳地，水性液體具有低硫含量，例如小於3.0g/l、較佳小於2.0g/l、或1.0g/l之硫。

較佳地，發酵期間(水性液體之)pH、溫度及/或氧含量係經控制。此係將pH、溫度及/或氧含量維持不變或維持在所欲範圍。發酵期間水性液體之pH可為pH 2至pH 8，諸如，pH 3至pH 7，最佳為pH 4至pH 6，但亦可為(例如)pH 6至pH 8。

發酵期間水性液體之溫度可為15℃至40℃、或18℃至40℃，諸如，20℃至35℃，最佳為25℃至33℃。於諸多情況中，生長係發生在約26℃至37℃之時。

在發酵期間進行混合具有重要性。此可藉由曝氣，例如，藉由鼓泡空氣於水性液體中達成。此另一目的是將氧氣提供給給生長細胞。攪動或混合之其他方法包括(例如)使用葉輪之攪拌。藉由攪拌之能量輸入通常應調整至介於1至20W/L之間之值及較佳係調整至2至5W/L之值。

攪拌可能會導致水翼軸向流動或可設計成使得水性介質強行自葉輪徑向向外，例如，類似在渦輪機中之流動。曝氣及/或攪動之優點之一是水性液體中之氧含量可維持相對地高。該含氧量可為至少10%，諸如，至少15%，最佳係至少20%(就空氣飽和而言)。

可根據培養基及培養條件、或所使用的生物體改變吡里哌若平之製法。因此，發酵可進行1至40天，諸如，5至20、或10至18天，但亦可視需要縮短，例如，縮短為2至4天。通常，發酵條件適宜地選擇成類似或等同於製造吡里哌若平中培養生物體之較佳發酵條件。吡里 哌若平之累積通常會在2天至25天中達到其峰值。較短時間之發酵適用於分批發酵製程而非連續發酵製程。

於一個較佳之實施例中，隨著發酵之結束，將可利用糖含量調整至5g/l之最大值，較佳係調整至1g/l之最大值，亦即，不添加糖及只有當糖含量等於或低於該值時才停止發酵。

於本發明之一個實施例中，發酵期間所製得之生質係藉由噴霧乾燥包含生質之液體培養基而直接轉化成乾生質。較佳地，在進行乾燥步驟之前例如藉由述於下文之方法殺死生質之細胞。

於本發明之其他實施例中，自液體培養基分離出於發酵期間所製得之生質，以製得濕生質，接著將該濕生質用於製造乾生質。

殺死細胞

發酵期間所製得之生質較佳係在其自液體培養基分離出之前被殺死，但亦可在本發明方法之隨後階段被殺死。可藉由相關技藝中已知的方法殺死生質之該等細胞。較佳地，藉由直接在發酵之後熱處理殺死該等細胞。可在培養容器中或在專用設備中進行熱處理。於本發明之一些實施例中，亦可在具有特定滯留時間之持續運行設備中進行殺死。若利用熱處理，雖然加熱一般是較佳的方式(例如巴士德滅菌法)，但冷凍是一種可能的方式。藉由加熱殺死細胞通常係在介於60℃至120℃之間、較佳介於70℃至90℃之間之溫度下進行，持續一段介於5至180分鐘之間之時間，較佳持續一段介於30至90分鐘之間之時間。

將熱輸入至發酵液不但可藉由例如板式熱交換器或管式熱交換器或加熱旋管之熱交換設備完成，亦可藉由混合在高溫下的物質(諸如水)達成。此物質之混合的一個實例是水蒸氣之注入。

達成殺死含吡里哌若平生質之溫度可自40℃至200℃、然較佳自50至120℃及甚至更佳自60至80℃變化。在用於殺死生質之設備中於 高溫下之對應滯留時間將必須依例行試驗調適至各個別情況之條件(例如，專用於殺死細胞以及提供生質之生物體之培養容器或設備之體積及設計)。通常，滯留時間係選擇為自1至500分鐘或自10至120分鐘或自5至80分鐘。或者，可藉由化學處理殺死生質之細胞。該等化學處理為相關技藝中所可輕易明瞭。例如，苯甲酸或苯甲酸鈉若添加自0.1%至10%(體積/體積)之量至發酵液中通常即可殺死細胞。

或者，或除此之外，可在自液體培養基分離出生質之後、或在再懸浮於有機再懸浮介質之時、或在自有機再懸浮介質分離出生質之前、或在均質化生質期間、或在乾生質期間、或藉由組合該等可能性殺死微生物。

生質之分離：

發酵製程期間所製得之生質可藉由相關技藝中已知的製程自液體培養基分離出。生質可自總體積之液體培養基分離出，或可僅自總體積之部分分離出，以便可以進行連續發酵。生質之分離可藉由已確認的方法，較佳藉由過濾或離心，例如，藉由超過濾、微過濾、傾倒、或過濾及離心之組合達成。

過濾可藉由利用相關技藝中所使用的常用過濾技術，諸如振動分離器、振動篩過濾器、圓振動分離器、旋轉鼓過濾器、線性/傾斜運動搖晃器、壓力過濾器，藉由切向流過濾，經由帶式過濾器、旋轉過濾器、過濾壓力機、或其中由過濾器組成之障壁分離出生質及容許不含生質之液相通過之類似技術進行。

取決於所使用的過濾技術，(例如)若使用過濾壓力機，則過濾製程通常係在約0,5至15bar之壓力下進行，或(例如)若使用旋轉鼓過濾器，則在低於標準之壓力，例如0,01至0,9bar下進行。

生質之分離中所採用之溫度通常在5℃至80℃之間，但尤其假若藉由施加熱殺死生質之細胞及在生質及液體培養基已經冷卻降低之前 自液體培養基分離出生質則亦可更高。

振動分離器可包括至少一個振動篩過濾器。生質亦不應明顯地黏著至過濾材料。較佳之過濾材料為：多孔陶瓷或聚丙烯，亦可使用其他材料。

尤其適用於本發明過濾之一個實例為切向流過濾，亦稱為橫流式過濾。切向流過濾(tangential flow fitration；TFF)為使用膜系統及流動力以藉由液體純化固體之分離技術。用於TFF中較佳孔徑大小可使得發酵液中之溶質及碎屑過濾通過，但會滯留住生質。

用於過濾步驟之適宜網目尺寸包括小於1000微米、或小於800微米、或小於600微米、或小於500微米、或小於400微米、或小於300微米、或小於200微米、或小於180微米、或小於150微米、或小於120微米、或小於100微米、或小於90微米、或小於80微米、或小於70微米、或小於60微米、或小於50微米、或小於40微米、或小於30微米、或小於20微米。於一些實施例中，係使用106-微米振動篩過濾器。亦可使用具有除了106微米以外之網目尺寸之過濾器、或除了振動類型以外之過濾器。

於某些實施例中，該過濾係在室溫及大氣壓下進行。於其他實施例中，該過濾係在提高或減低之溫度及/或壓力下進行。

離心作用是一種涉及使用離心力以將混合物分離之方法。混合物中較緻密的組分會從離心軸遷移離開，而混合物較不緻密的組分則會向離心軸遷移。藉由增加有效重力(亦即，藉由增加離心速度)，較緻密物質(通常係固體)依照密度與較不緻密物質(通常係液體)分開。用於離心之較佳機器是傾析離心機及高速碟片式離心機。

傾析離心機係藉由泵送包含生質之液體培養基至旋轉圓筒中加以操作。在離心力將生質推向外壁時，內部旋轉渦形件可相對壁將生質移向位於一端處而排出。傾析離心機之排出端可具有連同渦形件一 起逐漸減小之半徑以與逐漸減小之尺寸匹配。因生質向上沿著由逐漸減小之半徑所建立之斜坡移動，故可持續移去生質。

高速碟片式離心機可順著傾斜盤路徑將液體培養基向外推送。由液體培養基組成之生質將被推送於盤之向下斜率及自液體培養基分離出。生質可持續或間歇地排放於高速碟片式離心機之向下側上，而液體培養基則沿著盤向上推至流出口。

已自液體培養基分離出之生質(濕生質)通常包含大於95%(重量/重量)之發酵中所製得之吡里哌若平，較佳係大於97%且更佳係大於99%。經分離之液體培養基中吡里哌若平之含量因此通常為小於5%(重量/重量)，較佳係小於3%且更佳係小於1%。

用於分離吡里哌若平所用的乾生質可直接藉由乾燥由上述技術獲得的濕生質製得。該等技術通常可製得具有介於大於15%至小於90%之間之殘餘水含量(重量/重量)之濕生質。較佳係介於小於30%至小於90%之間，甚至更佳係介於大於40%至小於90%之間或介於大於50%至小於90%之間。

然而，並非必需但通常有利地，可甚至進一步在將濕生質用於製造乾生質之前減低濕生質之水含量。

因此，濕生質可經過一個(另一個)關於利用直接施加於濕生質之機械壓力而將液體移去的步驟。所施加機械壓力的量不應導致顯著百分率之生質微生物細胞破裂，若那樣的話則將導致吡里哌若平損失至液相，但反而應純粹足可將生質脫水達成後續之乾燥時所需含量。因此，濕生質通常仍舊包含大於95%(重量/重量)之在發酵中所製得之吡里哌若平，較佳係大於97%且更佳係大於99%。經分離之液相中吡里哌若平之含量因此通常小於5%(重量/重量)，較佳係小於3%且更佳係小於1%在發酵中所製得之吡里哌若平。

可藉由利用相關技藝中已知的方法，例如，藉由使用帶式過濾 壓力機、螺旋壓力機、精製壓力機、過濾壓力機、壓力過濾器或任何適於達成目的之其他方法將機械壓力用於濕生質。較佳地，使用帶式過濾壓力機以達成目的。

帶式過濾壓力機為施加機械壓力於在兩個通常具有小微米尺寸開孔之拉力帶之間通過的漿液或糊劑(例如濕生質)之脫水裝置。該等拉力帶行進通過蛇形漸減直徑輥。大多數帶式過濾壓力機具有三個不同區段：重力區段，在此自由液體藉由重力通過多孔帶濾水；楔形區段，在此基於施加壓力而製備固體；及壓力區段，在此施加可調整壓力於經重力濾水之固體。該等帶可接著通過可擠壓汁液通過帶中的開孔出來之一系列輥。濾餅固體可接著在兩個帶在單元操作結束時分開之處排出。汁液可滴落至位於裝置底部之處之盤中，於該處利用重力，汁液可通過共同開孔排出且送至下游以進一步處理。

螺旋壓力機可藉由引入物質(例如濕生質)至類似螺旋鑽之裝置中操作。於螺旋壓力機上之旋轉軸件可將物質傳送至設備中，於該處在物質行進時，螺紋(或螺旋螺紋之間的距離)變小或軸件變寬。因螺紋距離之減小，故在螺紋之間之總體積減小，從而建立壓縮效應。濕生質可在該等螺紋之間進行壓縮並將液體排出。藉由可保持濕生質於螺旋中但容許液體排出之小微米尺寸網篩包覆旋轉軸件。

精整壓力機可類似於螺旋壓力機但改有可順著篩網尺寸推送物質之槳葉之旋轉軸件替代具有螺紋之螺旋操作。濕生質之殘留固相可接著從精整壓力機中排出。

過濾壓力機，包括設計為腔室過濾壓力機或膜過濾壓力機之過濾壓力機，可藉由使用正位移泵及泵送濕生質至一系列過濾腔室中操作。過濾腔室具有可利用正位移泵之壓力推送液體出去之小微米尺寸開孔。在足量固體已累積於過濾器內部及液體不進一步萃取時，即可藉由注入水或空氣至在過濾腔室之間之囊袋中引起「擠壓」，當使用 膜過濾壓力機時於濾餅上產生額外壓力。在囊袋向外推送時，可隨著壁向內推送而施加額外壓力於過濾腔室上。可釋出其他液體。在充分移去液體時，可打開過濾壓力機腔室及可排出濕生質。

施加機械壓力之一或多種上述技術可單獨地或以組合方式用於將本發明之濕生質移去液體。

因此，獲得至少一種吡里哌若平之方法及製造吡里哌若平衍生物之方法包括自液體培養基分離出生質以獲得濕生質，接著將該濕生質用於製造乾生質之步驟。

獲得濕生質之該步驟可藉由過濾、藉由較佳使用如上所述技術之離心進行，或可藉由過濾、及離心之組合進行及可或可不包括施加機械壓力之步驟，亦較佳係如上所述施加機械壓力之步驟。

因此，獲得至少一種吡里哌若平之方法及製造吡里哌若平衍生物之方法包括自液體培養基藉由使用振動分離器、振動篩過濾器、圓振動分離器、旋轉鼓過濾器、線性/傾斜運動搖晃器、壓力過濾器、切向流過濾(藉由帶式過濾器、旋轉過濾器、過濾壓力機)分離出生質之步驟，其中振動分離器及切向流過濾為較佳。用於離心之較佳機器為傾析離心機及高速碟片式離心機。

於一些實施例中，係藉由採用施加機械壓力之步驟，藉由使用帶式過濾壓力機、螺旋壓力機、精整壓力機、過濾壓力機、或壓力過濾器，進一步處理如上述所製得之濕生質以減低水含量。較佳地，使用帶式過濾壓力機以達成目的。

不必要組分之減少及/或短時間儲藏：

於本發明之大多數實施例中，經由自液體培養基分離或在施加機械壓力之後所製得之濕生質係直接用於製造乾生質，接著該乾生質可用於儲藏或用於純化吡里哌若平。

然而，於本發明之各種實施例中，在處理濕生質期間，進一步 將濕生質純化以減少液體培養基中的內容物，該內容物會在隨後階段中造成純化吡里哌若平或處理濕生質之難題及/或經受儲存槽中短時間儲藏。

藉由進一步純化濕生質可減少液體培養基中之內容物為(例如)鹽、殘餘糖、或其他已於發酵期間製得之組分(例如，親油組分，例如脂肪酸或油)。

因此，濕生質之進一步處理可與或未與一或多個用於進一步純化之洗滌步驟有關，其中係將濕生質再懸浮於其中吡里哌若平之溶解度極低之介質(再懸浮介質)中。因此，用於洗滌步驟之介質較佳係親水性，或可由疏水組分的親水部分之混合物所組成。於一個實施例中，再懸浮介質為水。於另一個實施例中，再懸浮介質為例如磷酸鹽或TRIS或氨鹽之pH緩衝液之水溶液、或例如苯甲酸、苯甲酸鹽、山梨酸、山梨酸鹽之防腐劑之水溶液或其他在相關技藝中已知具有相同效應之防腐劑。

較佳地，該濕生質係在從液體培養基分離出之後直接進行再懸浮，而非在施加機械壓力之後直接再懸浮。

再懸浮介質之溫度可於再懸浮介質之凍結點及沸點之間變化，較佳地，該溫度係介於5℃及50℃之間，更佳地，該溫度係介於10℃及30℃之間。再懸浮介質可藉由使用與可用於自液體培養基分離出生質者相同或相似的技術與生質分離。生質可若干次地再懸浮於相同或不同再懸浮介質中。通常，以用於製造各別量的濕生質之液體培養基之體積計，再懸浮介質之體積小於70%、60%、50%、30%、25%、10%或小於5%，但可甚至更大，例如，係濕生質之體積的1倍、2倍、3倍或更多倍。

在從液體培養基分離出之後、於一或多個再懸浮步驟後所製得或在施加機械壓力之後所製得之濕生質可儲藏於儲存槽(較佳係激冷 儲存槽)之處。於特定實施例中，激冷儲存槽維持在低於50℃、或低於40℃、或低於30℃、或低於25℃、或低於20℃、或低於15℃、或低於10℃、或低於5℃、或低於2℃、但高於濕生質之凍結溫度之溫度。激冷儲存槽維持在低於室溫、較佳低於15℃、或低於10℃、或低於5℃、或低於2℃、但高於濕生質之凍結溫度之溫度。

濕生質可儲藏於該等條件下達數小時至長達數月(例如，在運送期間)。短時間儲藏之較佳持續時間為大於5小時至5個月，但若濕生質包含濕生質本身或在處理濕生質期間引入之其他微生物之活細胞，則較佳不應超過一或兩個月。基於儲藏而穩定濕生質之另一種方法係基於儲藏、或在儲藏期間使濕生質之pH減低至自1至5之pH。依此方式穩定之生質通常可儲藏一段介於數日至數週之間之時段。亦可將這兩種方法組合，亦即，於減低之pH下及在激冷儲存槽中儲藏，以延長儲藏時間。

均質化：

濕生質可直接用於進一步乾燥，或可在採行另一個步驟之前加以均質化，例如藉由施加機械壓力乾燥濕生質或提高生質之乾燥物質含量。尤其假若濕生質具有小於30%、25%、20%、15%、10%、或5%之相對低的乾燥物質含量(重量/體積)及/或已儲藏一段時間，則應在乾燥之前、或在施加進一步機械壓力之前將生質均質化。均質化可簡單地旨在製造濕生質之固體及液體組分之均質分佈以利於進一步處理(例如)來提供濕生質之均質供應源至帶式過濾壓力機、螺旋壓力機、精整壓力機、過濾壓力機、或任何適於提高乾燥物質含量之其他方法，或可旨在提供用於進一步乾燥之濕生質之均質供應源，例如，呈進料提供至磨漿式乾燥器、噴霧乾燥器、快速乾燥器、流化床乾燥器、或旋轉乾燥器。

濕生質之固體及液體組分的均質分佈以及細胞壁之破壞可藉由 使用轉子定子分散機器或其他均質化設備達成。轉子定子分散機器較佳是為可均質化具有諸如小於30%、25%、20%、15%、10%、或5%之乾燥物質含量之相對低的乾燥物質含量之濕生質之裝置。

膨脹器或擠出機可用於將濕生質成形及/或均質化。擠出機係較佳的，此乃因擠出條件可將細胞壁之破壞調整至最小。假若通過適宜模板(例如具有圓形或正方形洞)，擠出就可用於形成似細長形圓柱結構(其等可具有圓柱形及/或圓形截面)。該等細長形結構可進一步藉由使用諸如旋轉葉片之切割器切割似圓柱結構之長條而形成為顆粒。於擠出之後，「意大利麯狀物(spaghetti)」及顆粒較佳具有小於15%、諸如小於10%、及最佳自3至7%之水含量。顆粒可具有自0.3至10mm、諸如自0.7至5mm、最佳自1至3mm之粒徑。

擠出亦可用於形成濕生質之片或層。此可藉由通過一或多個槽(slot)達成。該等形式亦可藉由使用諸如輥及/或圓筒之一或多個移動表面製得。該等移動表面可沿相同方向移動或反方向旋轉及可存在一個、兩個或多達五個該等表面。該等片或層可具有自0.3至10mm、諸如自0.7至5mm、最佳自1至3mm之厚度。

較佳係在流化床乾燥器中乾燥藉由擠出處理之濕生質以製得乾生質。

於本發明之一些實施例中，可有利地使用均質化步驟以破壞濕生質之細胞壁。如本文所用，細胞壁之破壞包括在個別細胞或多細胞結構層級干擾生物體組織之機械或化學程序。細胞壁之破壞可包括：例如，研磨、切碎、撕碎、打碎、施壓、撕裂、藉由滲透壓力之溶解、或可降解生物結構之化學處理。僅舉例言之，可利用研磨階段，例如藉由應用刀式研磨機、球磨機、及類似、或其組合達成細胞壁之破壞。

獲得至少一種吡里哌若平之方法及製造吡里哌若平衍生物之方 法可包括另一個其中濕生質係例如藉由再懸浮於再懸浮介質中處理以減少不必要組分之步驟、及/或短時間儲藏之步驟及/或在將濕生質用於製造乾生質之前均質化之步驟。

因此，如上所述之該等方法可包括其中濕生質已再懸浮於再懸浮介質中且/或已進行均質化且/或具有小於5g/l之葡萄糖含量、且/或具有介於大於15%至小於90%之間之水含量之步驟。

乾生質之製造：

用於分離吡里哌若平所用的乾生質較佳具有小於15%之殘餘水含量。更佳地，乾生質較佳具有小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%或3%之殘餘水含量。

如實例中所述依照亦較佳Aufhäuser方法、鹵素(IR)測量方法及/或卡爾-費歇爾方法(Karl-Fischer method)之方法來測定殘餘水含量。

乾生質之製造可藉由使用噴霧乾燥器、磨漿式乾燥器、快速乾燥器、流化床乾燥器、或旋轉乾燥器、或藉由任何適於乾燥濕生質至上述殘餘水含量之其他方法(諸如冷凍乾燥)、或藉由使用簡單的盤式乾燥器進行。製造乾生質之較佳方法係藉由在噴霧乾燥器或磨漿式乾燥器中進行乾燥。

乾生質可自藉由任何類型的用於自上述液體培養基分離出生質之方法所製得之濕生質製得，包括進一步之減低濕生質之水含量之步驟，例如，施加機械壓力。然而，乾生質亦可藉由例如藉由使用噴霧乾燥器乾燥尚未自用於發酵中之液體培養基分離出之生質製得。

噴霧乾燥乃一種使用熱氣體來乾燥進料液體之常用方法。噴霧乾燥器可攝入例如濕生質之液體流並分離出呈固體之溶質及為蒸氣之液體。輸入流噴射通過噴嘴會形成熱蒸氣流並汽化。噴霧乾燥器之噴嘴通常係可調整的，且通常係經調整以使得液滴儘量小到可將熱轉移及水汽化速率最大化。然而，必須調整噴嘴以避免因輸入流組成之生 質之部分堵塞。較佳地，輸入流之生質係經均質化以製造較小顆粒及在將其用作用於噴霧乾燥之輸入流之前破壞細胞壁。所得乾燥固體係具有良好的粉末一致性，取決於所使用噴嘴的尺寸。

無法在本文中提供於調整用於噴霧乾燥之條件中所涉及之各參數的精確值，此乃因該等參數及其相關值係取決於所使用噴霧乾燥裝置之類型。作為指導之用，噴霧乾燥製程最佳係用於具有80%至99.5%、較佳88%至92%(重量/重量)之殘餘水含量之濕生質，但亦可用於直接自仍包含於發酵之液體培養基中之生質製造乾生質。

噴嘴應具有0.5至10mm之開孔。施加在用於噴射濕生質之噴嘴末端之處之壓力可介於約2至250bar之間，及在裝置之入口之處之熱空氣壓力可介於約100及2000mbar超壓之間。

入口空氣溫度較佳係介於80℃至350℃、較佳120℃至180℃之間。

出口溫度較佳係介於20℃至200℃之間，較佳地，介於60℃至100℃之間。

快速乾燥器通常係用於乾燥已經過脫水或固有地具有低水分含量之乾燥固體。快速乾燥器(亦稱為「氣流乾燥器」)通常係用於乾燥具有20%至90%(重量/重量)殘餘水含量之濕生質。

該等乾燥器通常係將濕物質分散至受熱空氣流中，該受熱空氣流傳送該濕物質通過乾燥管道。來自空氣流之熱量於物質傳送通過乾燥管道時將該物質乾燥。快速乾燥器及氣流乾燥器之更詳細的陳述可參見描述快速乾燥器之美國專利案第4,214,375號、及描述氣流乾燥器之美國專利案號3,789,513及4,101,264。

快速乾燥器可使濕生質進入具有熱空氣切向注入至環路外側之封閉環路系統中。受熱空氣可順著環路之外邊緣傳送濕生質，藉此持續地乾燥。

藉由讓物質順著藉由空氣流動驅動之壁滾動，在顆粒之尺寸小到足以使得該等顆粒可自由流動離開空氣時，即可建立粒徑漸減效應。一旦粒徑及水含量減低至期望之水平，顆粒可順著位於環路內側部分之排放管被帶至收集設備。

磨漿式乾燥器係用於乾燥通常難以在其他乾燥器中乾燥之濕濾餅、漿液、或糊劑。較佳地，將其等用於乾燥具有5%至80%(重量/重量)殘餘水含量之濕生質。

磨漿式乾燥器可乾燥濕生質使其進入歸因於建立懸浮效應之空氣壓力而導致物質懸浮之攪拌桶中。物質係由螺旋饋送器藉由可變速度驅動饋送至立式乾燥腔室中，於該處物質經由空氣加熱及於相同時間藉由特殊設計的破碎機碎裂，該特殊設計的破碎機通常為旋轉於乾燥腔室中之似扇結構，因而達成類似旋轉混合器之功能。空氣之加熱係直接或間接取決於應用。產生於尺寸減小的顆粒中之乾生質可接著藉由分級機帶至乾燥腔室頂部，藉由空氣流動帶至接著收集物質之諸如旋風分離器、袋濾室、或類似之收集設備中。

旋轉乾燥器係以持續饋送例如濕生質之濕物質方式操作，該濕物質經與受熱空氣接觸乾燥，同時順著旋轉圓筒內部傳送，其中旋轉殼充作傳送裝置及攪拌器。較佳地，將其等用於乾燥具有5至80%(重量/重量)殘餘水含量之濕生質。

流化床乾燥器通常係用於同時乾燥及碎裂呈糊劑形式之物質。流化床乾燥器可包括提供有向上錐形底部之圓柱形乾燥腔室。濕生質藉由針對於流化且乾燥用之介質之環形分配器通過在乾燥腔室之錐形底部與壁之間之實質上圓形延伸狹縫供應至該腔室。攪拌器係同軸地置於該腔室中，該攪拌器之葉片與錐形底部平行。較佳地，攪拌器之葉片係定位成距錐形底部一段小的距離。流化床乾燥器之一個實例揭示於US 4581830中。流化床乾燥器之一種不同設計可操作及藉由引入 物質至具有受熱空氣直接或間接越過物質之振動床上乾燥物質(例如，濕生質)。振動及空氣可建立物質之流體化懸浮從而可增加欲乾燥之表面積。較佳地，將其等用於乾燥具有5%至80%(重量/重量)殘餘水含量之濕生質。

乾燥程序，特別是使用快速乾燥器、磨漿式乾燥器、旋轉乾燥器、流化床乾燥器或盤式乾燥器或類似、或其組合之乾燥程序，係使用具有高於25℃、或高於50℃、或高於75℃、或高於100℃、或高於125℃、或高於150℃、或高於175℃、或高於200℃、或高於225℃、或高於250℃、或高於275℃、或高於300℃、或高於325℃、或高於350℃、或高於375℃、或高於400℃、或高於425℃、或高於450℃、或高於475℃、或高於500℃之入口溫度(於乾燥器入口之處之溫度)之乾燥用空氣流。

較佳地，入口溫度為自25℃至50℃、或自50℃至75℃、或自75℃至100℃、或自100℃至125℃、或自125℃至150℃、或自150℃至175℃、或自175℃至200℃、或自200℃至225℃、或自225℃至250℃、或自250℃至275℃、或自275℃至300℃、或自300℃至325℃、或自325℃至350℃、或自350℃至375℃、或自375℃至400℃、或自400℃至425℃、或自425℃至450℃、或自450℃至475℃、或自475℃至500℃、或高於500℃。

於一些實施例中，入口溫度為自50℃至100℃、或自100℃至150℃、或自150℃至200℃、或自200℃至250℃、或自250℃至300℃、或自300℃至350℃、或自350℃至400℃、或自400℃至450℃、或自450℃至500℃、或高於500℃。

於一些實施例中，流出口溫度(自乾燥器離開時之溫度)為低於300℃、或低於275℃、或低於250℃、或低於225℃、或低於200℃、或低於175℃、或低於150℃、或低於125℃、或低於100℃、或低於75 ℃、或低於50℃、或低於25℃。

於一些實施例中，流出口溫度為自300℃至275℃、或自275℃至250℃、或自250℃至225℃、或自225℃至200℃、或自200℃至175℃、或自175℃至150℃、或自150℃至125℃、或自125℃至100℃、自100℃至75℃、或自75℃至50℃、或自50℃至25℃、或低於25℃。

於一些實施例中，流出口溫度為自300℃至250℃或自250℃至200℃、或自200℃至150℃、或自150℃至100℃、自100℃至50℃、或自50℃至25℃、或低於25℃。

於一些實施例中，用於乾燥之空氣可改用例如氮氣(N₂)之非燃性氣體替代。假若藉由該乾燥製程所製得之乾生質具有高比例之小粒徑，則此舉具特殊之重要意義。

盤式乾燥器通常係用於實驗室操作及小試驗規模乾燥操作。盤式乾燥器係以對流加熱及蒸發作用為基礎加以操作。可有效使用熱量及空氣通孔移除經蒸發的水來乾燥濕生質。使熱空氣循環達成乾燥。盤式乾燥器亦可在產物對溫度敏感時利用減壓或真空來進行室溫下之乾燥，且係類似於冷凍乾燥器但使用成本低且可輕易地擴大規模。

替代上述乾燥技術地，亦可藉由亦稱為冷凍乾燥(freeze drying或cryodessication)之凍乾法製造乾生質。凍乾法係關於冷凍物質且接著減低周圍壓力並施加足以使物質中之冷凍水由固相昇華為氣體之熱量。類似於盤式乾燥器之使用，凍乾法大多係用於非本發明較佳實施例之小試驗規模操作。

可於乾燥之前或之後添加各種流動劑(包括衍生自二氧化矽之產物，諸如沉澱二氧化矽、發煙二氧化矽、矽酸鈣、及矽酸鋁鈉)至生質。將該等物質施加至高脂吸濕性或黏性粉末，可防止乾燥期間及之後之結塊或形成團塊，及促進乾燥粉末之自由流動。此不僅可減低黏稠，而且可減低乾燥器表面上物質之積聚及氧化。

乾生質：

如上所述，用於分離吡里哌若平之乾生質較佳具有小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、或3%之殘餘水含量(重量/重量)。

較佳地，多於80%、85%、90%、95%、或多於98%乾生質之粒徑係介於0.01mm至5mm之間、或小於3mm、較佳小於1mm及更佳小於0.5mm。

於均質化後立即或不久所測得之平均顆粒尺寸因此實際上較佳不大於10μm、不大於25μm、或不大於100μm。於一些實施例中，該平均粒徑為1μm至10μm、1μm至15μm、10μm至100μm或1μm至40μm。於一些實施例中，該平均粒徑為大於10μm且至高達100μm。於一些實施例中，該平均粒徑係介於10μm至100μm之間。

研磨可於乾生質上進行，藉由具有旋轉或固定部件之機械系統，可獲得特定粒徑。該等部件可為一者壓在另一者上之錘、篩網、或旋轉圓筒。

自液體培養基分離出濕生質、施加機械壓力、乾燥濕生質或研磨之例示性技術僅基於說明目的進行描述，而非意圖限制本申請案之範疇。熟習此項技藝者閱讀發明說明將明瞭可使用其他技術達成相同結果。

乾生質之儲藏：

藉由任何上述技術製得或藉由類似技術製得之乾生質可儲藏於儲存槽中。儲存槽通常維持在低於50℃、或低於40℃、或低於30℃、或低於25℃、或低於20℃、或低於15℃、或低於10℃、或低於5℃、或低於2℃、但較佳高於凍結溫度之溫度。

乾生質可粗藏於該等條件下若干個小時或可基於長時間儲藏而儲藏。儲藏之乾生質較佳具有小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、或3%之殘餘水含量(重量/重量)。

儲藏之較佳持續時間為自約5小時至長達數年。儲藏之甚至更佳的持續時間為長達大於約5小時至小於約1年，但亦可選擇其他持續時間，例如，自約1週至約12個月、自約2週至約24個月，例如，自約1個月至約18個月、自約4小時至約6個月。

因此，獲得至少一種吡里哌若平之方法及製造吡里哌若平衍生物之方法係使用具有小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、或3%之殘餘水含量(重量/重量)、且在獲得包含之吡里哌若平之前可能已儲藏約5小時或長達數年之乾生質。

雖然在萃取所製得吡里哌若平之前的每次處理濕生質(包括製造乾生質之步驟)包括會損失有價值量的生質之風險，但仍可獲得基於所回收乾生質的量計，至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至更大產率之於發酵中藉由萃取製得之吡里哌若平。

本發明之另一個實施例為吡里哌若平生產者生物體之乾生質，其包含至少一種吡里哌若平且具有：a)小於10%之水含量，或b)介於0,01mm至5mm之間之粒徑，或c)具有小於10%之水含量及介於0,01mm至5mm之間之粒徑。

較佳地，具有其等特徵之乾生質係衍生自屬於青黴屬、正青黴屬或麯黴屬之吡里哌若平生產者生物體，甚至更佳地，係衍生自尤其屬於其上述菌株之一之糞生青黴、灰黃青黴、網狀孢正青黴或熏煙麯黴。於一個實施例中，乾生質係衍生自糞生青黴，例如，係衍生自糞生青黴PF1169。

乾生質較佳包含至少吡里哌若平A，但亦可包含一或多種吡里哌若平之組合，例如，乾生質可包含吡里哌若平A、吡里哌若平B、吡里哌若平C及吡里哌若平D。

吡里哌若平之萃取及純化：

可依照相關技藝中已知的方法，例如如WO2004/060065、WO94/09147或WO2011/108155中所述，來進行自乾生質萃取吡里哌若平。

用於萃取之適宜溶劑包括：- 具有1至6個碳原子之醇(諸如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、第三丁醇、正己醇)、及諸如2-乙基-己醇、六氟異丙醇、乙二醇之醇；- 芳香烴，諸如苯、甲苯、乙苯、氯苯、對蒔蘿烴(cymene)、二甲苯、三甲苯、三氟甲苯；- 酯，諸如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、乙酸異丁酯；- 醚，諸如二乙醚、二異丙醚、二正丁醚、第三丁基甲醚(TBME)、四氫呋喃(THF)、2-甲基四氫呋喃、1,4-二噁烷、1,2-二甲氧基乙烷；- 雙極非質子溶劑，諸如N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N-二丁基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺(DMAC)、1-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮(DMI)、N,N'-二甲基丙烯脲(DMPU)、二甲亞碸(DMSO)、環丁碸；乙腈；- 極性有機溶劑(諸如吡啶)、鹵化烴溶劑(諸如二氯甲烷及氯仿)- 酮，諸如丙酮、甲基乙基酮、二乙酮、環己酮- 腈，諸如乙腈及異丁腈

術語溶劑如本文所用亦包括兩種或更多種上述溶劑之混合物。該等溶劑通常係於在自0℃至溶劑沸點範圍之溫度下施用，較佳地，該等溶劑係於在自20℃至60℃範圍之溫度下施用。

於本發明之一個實施例中，用於萃取之溶劑係選自由以下組成之群之有機溶劑：甲醇、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、乙 苯、氯苯、氯仿、二氯甲烷、二乙醚、二異丙醚、四氫呋喃、及二噁烷或至少兩種該等溶劑之混合物。於另一個實施例中，該等溶劑包括甲醇、甲苯及乙苯或為其中至少兩種之混合物，特別是甲醇/甲苯混合物或甲醇/乙苯混合物。

通常，基於乾生質而進行萃取若干次，以儘量完全地萃取吡里哌若平。自生質藉由過濾分離出包含萃取吡里哌若平之溶劑。

過濾阻力係取決於所使用的特定溶劑及所使用乾生質之殘餘水含量。

於本發明之一些實施例中，過濾阻力係處於較佳：低於5*10¹³mPas/m²、低於4*10¹³mPas/m²、低於3*10¹³mPas/m²、低於2*10¹³mPas/m²之增加程度。

可在相關技藝中輕易地取得純化包含於萃取用溶劑中之吡里哌若平的方法。一些例示性方法已述於WO94/09147、WO2004/060065及WO2011/108155中。

藉由上述方法獲得之吡里哌若平可用於產生吡里哌若平之其他衍生物，例如，如EP1889540、EP2119361、EP2196815、EP2426124中所述之衍生物，尤佳係式III、式IV及式V之化合物。

日本專利公開公關案第259569/1996號中描述一種製造式III之化合物的方法。

用於製造式IV及式V之化合物的方法述於WO2006/129714中。

用於製造式V之化合物的尤佳方法述於EP13151492.9及US61/753023中，其等均係以其全文引用的方式併入。

本發明亦包括自具有以下之乾生質獲得至少一種式I化合物或製造至少一種式III、式IV或式V化合物的方法：a)小於10%之水含量，或b)介於0,01mm至5mm之間之粒徑，或 c)具有小於10%之水含量及介於0,01mm至5mm之間之粒徑。

較佳地，具有其等特徵之乾生質係衍生自屬於青黴屬、正青黴屬或麯黴屬之吡里哌若平生產者生物體，甚至更佳地，係衍生自尤其其上述菌株中一種之糞生青黴、灰黃青黴、網狀孢正青黴或熏煙麯黴。於一個實施例中，乾生質係衍生自糞生青黴，例如，係衍生自糞生青黴PF1169。

乾生質較佳包含至少吡里哌若平A，但亦可包含一或多種吡里哌若平之組合，例如，乾生質可包含吡里哌若平A、吡里哌若平B、吡里哌若平C及吡里哌若平D。

較佳地，該等方法係關於獲得式II之化合物，該式II化合物可或可不用於製造至少一種式III、式IV或V化合物，較佳係用於製造至少一種式IV或式V之化合物及甚至更佳係用於製造式V之化合物。該等方法亦可包括使用至少一種式II、式III、式IV或式V化合物、較佳式V化合物以製造包含至少一種式II、式III、式IV或式V化合物之害蟲控制組合物之步驟。該害蟲控制組合物較佳係殺昆蟲劑。

自式I或式II化合物獲得結構式III、式IV或式V化合物之方法以及使用該等化合物作為活性組分來製造害蟲控制組合物(包括殺昆蟲劑)之方法例如揭示於以其全文併入本文之EP2223599、EP2119361及EP1889540中。

實例：

實例I：經由在磨漿式乾燥器中乾燥製造具有7%殘餘水含量之乾生質及利用乙苯萃取吡里哌若平A

應用在磨漿式乾燥器中乾燥及藉由饋料批次發酵進一步萃取糞生青黴之吡里哌若平A懸浮生質。將微生物糞生青黴以10m³工作體積培養於16,5m³發酵槽中。

獲得的液體培養基包含10m³之體積及包含6至8%(重量/體積)之 生質，該生質在生質內部包含1.8%至2%(重量/體積)之吡里哌若平。(關於吡里哌若平A及生質含量測定之HPLC分析，請參見下文)

該獲得的液體培養基以熱失減活程序加以處理並藉由裝納26個具有760×760mm尺寸之板之過濾壓力裝置中進行過濾脫水以製造濕生質。所有板係覆蓋製造商Nakao filter corp.型號TR 2600之濾布材料。所獲得的濾餅(濕生質)具有~75%至78%之水含量(關於水含量之測定，請參見下文)。該濾餅中沒有偵測到殘餘葡萄糖。

該脫水濾餅接著在結構類似於圖1所顯示磨漿式乾燥器之示意圖之磨漿式乾燥器中進行乾燥。

用於實例I中之磨漿式乾燥器具有以下規格：直徑：140mm

高度：1300mm

轉子刀型號：5

最大匝數：2800RPM

最大氣體通量：300kg/h

藉由饋送螺旋，將7.5至7.9kg/h之所述濾餅饋送至磨漿式乾燥器中。用為乾燥用氣體之氮氣的量設為119至121m³/h或液壓氣體速度分別為3m/s。包含於磨漿式乾燥器之乾燥腔室中之轉子設為900RPM之匝數以達成設備中之足夠滯留時間與足夠乾燥程度之產物對應。乾燥用氣體之入口溫度設為221至224℃。

測得乾生質之所得水含量為7%及吡里哌若平A含量為28.9重量%。

製得之乾生質於室溫下顯示具有長時間儲藏穩定性：於213天後，觀測到4%吡里哌若平A之損失，而於242天後，總計6%吡里哌若平A係經分解。60℃下，242天後，總計54%吡里哌若平發現連續吡里 哌若平A降解。

研磨及藉由乙苯萃取：

提供藉由上述磨漿式乾燥獲得及包含7%殘餘水之生質以使用設於步驟7歷時45秒之Microthron MB550設備研磨。取100g經研磨之乾生質提供至以葉片式葉輪攪拌之0.75L-反應器中。添加200mL乙苯及於60℃下以250rpm攪拌該懸浮液18小時。然後，使用0.5L玻璃過濾器(孔徑3，直徑9,5cm)利用200mbar之真空過濾該懸浮液。利用200mL乙苯洗滌濾餅兩次(每次具有60℃之溫度)(置換洗滌)。然後，每次以具有60℃溫度之150mL乙苯洗滌濾餅兩次(置換洗滌)。相較萃取前存在於乾生質中的量計，可獲得93.9%(重量/重量)產率之吡里哌若平。

使用不同萃取溶劑之乾生質過濾阻力測定程序之實例：

於特定溫度下攪拌50g具有7%殘餘水含量之經磨漿乾燥之生質(參見上述實例I)及100ml溶劑18小時。所使用的溶劑為a)具有室溫之甲醇；b)具有室溫之甲苯、c)具有室溫之乙苯及d)具有60℃之乙苯。使用壓力過濾器及濾布PP25130F(PP=聚丙烯，公司：Verseidag)於1bar下過濾所得懸浮液。測量以下參數以確定過濾阻力：a)過濾面積，b)過濾時間，c)過濾壓力，d)所得濾液之體積，e)濾餅之高度。過濾阻力及在萃取後針對具有不同殘餘水含量之生質測得之溶液中吡里哌若平A之濃度係列於表2)中。

實例II：經由在磨漿式乾燥器中乾燥製造具有5%殘餘水含量之乾生質及利用甲苯及乙苯萃取吡里哌若平A

使用與實例1中所述相同的材料及設備進行磨漿式乾燥器中之乾燥。此時進料速率設為4至5.8kg/h及轉子速度設為1000RPM。於219至224℃下施用113至117m³/h乾燥用氣體(氮氣)以乾燥濕生質。

於所述乾燥製程中形成之乾生質具有5%之殘餘水含量、28%之吡里哌若平A含量，及於室溫下顯示具有長時間儲藏穩定性。於183天後觀測到4%吡里哌若平A之損失，於242天後，總計11%吡里哌若平係經分解。相同物質於60℃下儲藏相同的時間(242天)，會造成11% 吡里哌若平A之損失。

研磨及利用甲苯萃取：

提供如上所述藉由磨漿式乾燥獲得之包含5%殘餘水之乾生質以使用設為步驟7歷時45秒之Microthron MB550設備研磨。取100g經研磨乾燥之生質提供至以葉片式葉輪攪拌之0.75公升-反應器中。添加200ml甲苯及於60℃下以250rpm攪拌該懸浮液18小時。然後，使用0.5公升玻璃過濾器(孔徑3，直徑9.5cm)利用200mbar之真空過濾該懸浮液。

利用200ml甲苯洗滌濾餅(置換洗滌)。然後，將濾餅轉移至0.75公升反應器及再藉由200ml甲苯攪拌60分鐘。再次利用與上述相同的條件過濾該懸浮液。

接著，利用150mL甲苯洗滌濾餅(置換洗滌)。然後，將濾餅轉移至0.75公升反應器及再藉由150ml甲苯攪拌60分鐘。再次利用與上述相同的條件過濾該懸浮液。

接著，利用150ml甲苯(置換洗滌)洗滌濾餅。然後，將濾餅轉移至0.75公升反應器及再藉由150ml甲苯攪拌60分鐘。再次利用與上述相同的條件過濾該懸浮液。相較萃取前存在於乾生質中的量計，可獲得96.4%(重量/重量)產率之吡里哌若平。

研磨及利用乙苯萃取：實例1

提供如上所述藉由磨漿式乾燥獲得之包含5%殘餘水之乾生質以使用設為步驟7歷時45秒之Microthron MB550設備研磨。取100g經研磨之乾生質提供至以葉片式葉輪攪拌之0.75公升-反應器中。添加200ml乙苯及於60℃下以250rpm攪拌該懸浮液18小時。然後，使用0.5公升玻璃過濾器(孔徑3，直徑9.5cm)利用200mbar之真空過濾該懸浮液。

再次利用200mL乙苯洗滌濾餅(置換洗滌)。然後，將濾餅轉移至 0.75公升反應器及再藉由200ml乙苯攪拌60分鐘。再次利用與上述相同的條件過濾該懸浮液。

接著，利用150ml乙苯洗滌濾餅(置換洗滌)。然後，將濾餅轉移至0.75公升反應器及再藉由150ml乙苯攪拌60分鐘。再次利用與上述相同的條件過濾該懸浮液。

接著，利用150ml乙苯洗滌濾餅(置換洗滌)。然後，將濾餅轉移至0.75公升反應器及再藉由150ml乙苯攪拌60分鐘。再次利用與上述相同的條件過濾該懸浮液。相較萃取前存在於乾生質中的量計，可獲得95.3%(重量/重量)產率之吡里哌若平。

研磨及利用乙苯萃取：

提供如上所述藉由磨漿式乾燥獲得之包含5%殘餘水之乾生質以使用設為步驟7歷時45秒之Microthron MB550設備研磨。取200g經研磨之乾生質提供至配備葉片式葉輪之0.75公升-反應器中。添加400ml乙苯及於室溫下以350rpm攪拌該懸浮液18小時。然後，使用0.5公升玻璃過濾器(孔徑3，直徑9.5cm)利用200mbar之真空過濾該懸浮液。

再次利用400ml乙苯洗滌濾餅(置換洗滌)。然後，將濾餅轉移至0.75公升反應器及再藉由400ml乙苯攪拌60分鐘。再次利用與上述相同的條件過濾該懸浮液。

接著，利用300ml乙苯洗滌濾餅(置換洗滌)。然後，將濾餅轉移至0.75 l反應器及再藉由300ml甲苯攪拌60分鐘。再次利用與上述相同的條件過濾該懸浮液。相較萃取前存在於乾生質中的量計，可獲得91.5%(重量/重量)產率之吡里哌若平。

利用甲醇萃取：

將如上所述藉由磨漿式乾燥獲得之包含5%殘餘水之100g乾生質提供至配備葉片式葉輪之0.75公升反應器。添加200mL甲醇及於室溫下以250rpm攪拌該懸浮液18小時。然後，使用0.5公升玻璃過濾器(孔 徑3，直徑9.5cm)利用200mbar之真空過濾該懸浮液。

每次以200ml甲醇洗滌濾餅兩次(置換洗滌)。然後，每次以150ml甲醇洗滌濾餅兩次(置換洗滌)。相較萃取前存在於乾生質中的量計，可獲得96.9%(重量/重量)產率之吡里哌若平。

研磨及利用甲醇萃取：

提供如上所述藉由磨漿式乾燥獲得之包含5%殘餘水之生質以使用設為步驟7歷時45秒之Microthron MB550設備研磨。

取100g經研磨之乾生質提供至配備葉片式葉輪之0.75公升-反應器。添加200ml甲醇及於室溫下以250rpm攪拌該懸浮液18小時。然後，使用0.5公升玻璃過濾器(孔徑3，直徑9.5cm)利用200mbar之真空過濾該懸浮液。

每次以200ml甲醇洗滌濾餅兩次(置換洗滌)。然後，每次以150ml甲醇洗滌濾餅兩次(置換洗滌)。相較對萃取前存在於乾生質中的量計，可獲得98.7%(重量/重量)產率之吡里哌若平。

實例III：經由噴霧乾燥製造具有3%殘餘水含量之乾生質及利用乙苯及甲醇萃取吡里哌若平A

將以饋料批次發酵中製得且懸浮於液體培養基中的糞生青黴之生質用於噴霧乾燥。將微生物糞生青黴以0.2m³工作體積培養於0.3m³發酵槽中。發酵液(液體培養基)會包含6至8%生質及在生質中包含2至2.1%吡里哌若平A、及小於0.1g/L葡萄糖。該液體培養基從發酵容器收集之前先在於70℃下進行熱失活作用60分鐘。然後，使用設於70℃之溫度之cavitron設備均質化該液體培養基。接著，該發酵液在噴霧乾燥之前於緩衝槽中再次維持在70℃長達30分鐘。

以乾燥而言，係使用結構類似於圖2示意圖所述之噴霧乾燥塔，其具有下方所述技術特徵：最大氣體流量 250m³/h

孔徑板之洞直徑 2mm

孔徑洞個數 1.255

D 1 1,25m

H 1 0,31m

H 2 1,22m

H 3 1,36m

D 2 66mm

噴嘴型號：Nubilosa 2複合材料，2mm

噴嘴於孔徑板之下的深度 200mm

加熱功率 20KW

初級分離 旋風分離器(直徑=0,203m，高度=0,5m)

過濾器(Filtertower) 聚酯PTFE塗層

過濾面積 3,40m²

管數 6

管長度 1,10m

管徑 0,16m

以7.5至8.5kg/h之進料速率將包含所製得之生質的液體培養基饋送至噴霧乾燥器中。使用氮氣作為乾燥用氣體並以250m³/h及160℃之入口溫度施用。旋風分離器中對應之氣體出口溫度為77至80℃。

該經乾燥生質具有3%之殘餘水含量及24%之吡里哌若平A含量。

以此方式製得之乾生質顯示具有長時間儲藏穩定性，此乃因於室溫下儲藏213天後、及於60℃下儲藏242天後觀測到僅4%吡里哌若平A之輕微減少。

利用乙苯萃取：

將包含3%殘餘水之100g經噴霧乾燥之生質提供至利用葉片式葉 輪攪拌之0.5公升4頸燒瓶。添加200ml乙苯及於室溫下以530rpm攪拌該懸浮液18小時。然後，使用0.5公升玻璃過濾器(孔徑3，直徑9cm)過濾該懸浮液。

每次以150ml乙苯洗滌濾餅四次(置換洗滌)。相較於萃取前存在於乾生質中的量計，可獲得95.6%(重量/重量)產率之吡里哌若平。

利用甲醇萃取：

將包含3%殘餘水之100g經噴霧乾燥之生質提供至利用葉片式葉輪攪拌之0.5公升4頸燒瓶。添加200ml甲醇及於室溫下以530rpm攪拌該懸浮液18小時。然後，使用0.5公升玻璃過濾器(孔徑3，直徑9cm)過濾該懸浮液。

每次以150ml甲醇洗滌濾餅四次(置換洗滌)。相較萃取前存在於乾生質中的量計，可獲得98%(重量/重量)產率之吡里哌若平。

IV：分析物及方法

只要未作另外規定，則使用以下方法以測定實例中所提出的值：

HPLC-分析物吡里哌若平

用於吡里哌若平A之樣本製備：

精稱約100mg樣本於100.0ml定量燒瓶中，溶解於40.0ml乙腈(超音波處理1分鐘)中。若樣本不溶於純乙腈，則添加水並重複超音波處理。利用乙腈達成體積。

標準製法：

典型校準包含5種標準溶液：

吡里哌若平：1. 100ml中具有30mg標準品

2. 100ml中具有60mg標準品

3. 100ml中具有90mg標準品

4. 100ml中具有120mg標準品

5. 100ml中具有150mg標準品

使每種標準溶液溶解於乙腈中(吡里哌若平A)(關於進一步詳細內容，請參見樣本製法)。校準曲線類型為線性。濃度係取決於偵測器 之靈敏度，可視需要進行調整。

注入形式

4×空白/1×標準品1至5/樣本製劑。

滯留時間

吡里哌若平A之滯留時間為：7,7min

生質含量測定

過濾約15g發酵液；用蒸餾水洗滌濾餅2x；將濾餅進行乾燥：鹵素(IR-)-乾燥測量(Mettler Toledo)乾燥溫度180℃，直到恆重。

水含量測定

1)濾餅(濕生質)之殘餘水含量係藉由自發酵液的生質含量(參見上述)及濾餅的實際重量計算測得。

2)對於低於~30%之殘餘水含量：於乾燥方法上損失。約5至10g生質在真空乾燥器中於80℃及50mbar(20L/h氮氣流)下乾燥18小時(恆重)。

3)對於低於~10%之殘餘水含量：

a)鹵素(IR)測量(Mettler Toledo)，於102℃下，4小時(恆重)。

b)卡爾費歇爾：將~45mL甲醇添加於0.1g至0.5g經乾燥生質中。攪拌該懸浮液一段短的時間(~10秒)。然後，進行卡爾費歇爾滴定。該方法有利於相對小粒徑之生質，此歸因於可觸及結合於細胞內部之所有水的可能性。Oberschalenwaage，Magnetrührer mit Heizpilz，Glasapparatur nach

c)Aufhäuser方法：稱取50g生質之樣本至於後來用甲苯填充至約一半體積之500ml燒瓶中。水分係藉由共沸蒸餾加以移除並收集於有刻度的迪恩-斯達克(dean-stark)盤中，直到無多餘水可從樣本移除。

假設密度為1g/ml：

藉由高效液相色譜測定葡萄糖：

管柱：Aminex HPX-87 H，300*7,8mm(Biorad)

預管柱：Cation H

溫度：30℃

流速：0.50ml/min

注入體積：5,0μl

偵測：RI-偵測器

持續時間：30.0分鐘

最大壓力：140bar

洗脫劑：5mM H₂SO₄

基質：發酵液，製備：樣本必須於0.22μm限定值過濾膜下進行過濾。

校準：葡萄糖50g/L含於水中

滯留時間：10.93min(葡萄糖)

Claims (29)

1. 一種獲得至少一種吡里哌若平(pyripyropene)之方法，該方法包括以下步驟：a)將吡里哌若平產生者生物體於培養條件下培養在液體培養基中，其中可製得至少一種吡里哌若平，b)自步驟a)中所獲得之生質之至少一部分製造乾生質，及c)自步驟b)中所製得之該乾生質獲得至少一種吡里哌若平，其中步驟b)中所製得之該乾生質具有小於10%之殘餘水含量。
2. 如請求項1之方法，其中步驟b)中所製得之該乾生質係直接藉由噴霧乾燥包含生質之液體培養基製得，或係藉由乾燥自液體培養基獲得之濕生質製得。
3. 如請求項2之方法，其中該濕生質係自液體培養基藉由以下獲得：a)過濾及/或離心，或b)過濾及施加機械壓力，或c)過濾及/或離心及施加機械壓力。
4. 如請求項2或3之方法，其中該濕生質a)已再懸浮於再懸浮培養基中，b)已進行均質化，c)具有小於5g/l之葡萄糖含量，d)具有介於大於15%至小於90%之間之水含量，e)具有a)至d)中至少兩者之組合。
5. 如請求項1之方法，其中步驟b)中所製得之該乾生質係藉由在噴霧乾燥器、磨漿式乾燥器、快速乾燥器、流化床乾燥器、或旋轉乾燥器中乾燥製得。
6. 如請求項1之方法，其中步驟b)中所製得之該乾生質係藉由在噴霧乾燥器或磨漿式乾燥器中乾燥製得。
7. 如請求項1至3、5及6中任一項之方法，其中步驟b)中所製得之該乾生質在步驟c)中獲得吡里哌若平之前可儲藏約5小時至長達數年。
8. 如請求項1至3、5及6中任一項之方法，其中步驟b)中所製得之乾生質之80%以上具有介於0.01mm至5mm之間之粒徑。
9. 如請求項1至3、5及6中任一項之方法，其中於步驟b)中製得及在步驟c)中用於獲得吡里哌若平之該乾生質包含至少在步驟a)之培養期間所產生之吡里哌若平之95%。
10. 如請求項1至3、5及6中任一項之方法，其中該吡里哌若平生產者生物體屬於青黴屬、正青黴屬或麴黴屬。
11. 如請求項1至3、5及6中任一項之方法，其中該吡里哌若平生產者生物體係選自由糞生青黴(Penicillium coprobium)、灰黃青黴(Penicillium griseofulvum)、網狀孢正青黴(Eupenicillium reticulosporum)及熏煙麯黴(Aspergillus fumigatus)組成之群。
12. 如請求項1至3、5及6中任一項之方法，其中該吡里哌若平生產者生物體為糞生青黴。
13. 如請求項1至3、5及6中任一項之方法，其中該吡里哌若平係自乾生質經由選自甲醇、甲苯及乙苯，或為其中至少兩者之混合物之群之溶劑萃取獲得。
14. 如請求項1至3、5及6中任一項之方法，其中該吡里哌若平係自乾生質經由溶劑萃取獲得及該溶劑係藉由具有低於5*10¹³mPas/m²之過濾阻力之過濾步驟與生質分離。
15. 一種製造至少一種式III、式IV或式V之化合物之方法， 式IV為式I化合物，其中：R1與R3表示環丙基羰氧基，R2表示羥基、環丙基羰氧基、或2-氰基苯甲醯氧基，且R4表示羥基，該方法包括：a)藉由如請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中任一項之方法獲得吡里哌若平，b)自步驟a)中獲得之該吡里哌若平製造式III、式IV或式V之化合物。
16. 一種包含至少一種吡里哌若平且具有以下之吡里哌若平生產者生物體之乾生質：a)小於10%之水含量，或b)小於10%之水含量及介於0.01mm至5mm之間之粒徑。
17. 如請求項16之乾生質，其中該吡里哌若平生產者生物體係選自由糞生青黴、灰黃青黴、網狀孢正青黴及熏煙麯黴組成之群。
18. 如請求項16或17之乾生質，其中該吡里哌若平生產者生物體為糞生青黴。
19. 一種自如請求項16、17或18中任一項之乾生質獲得至少一種式I或式II化合物或製造至少一種式III、式IV或式V化合物之方法，其中R1、R2、R3及R4為如下之組合： 式IV為式I化合物，其中：R1與R3表示環丙基羰氧基，R2表示羥基、環丙基羰氧基、或2-氰基苯甲醯氧基，且R4表示羥基，
20. 如請求項19之方法，其中該至少一種式I或式II化合物係藉由萃取如請求項16、17或18中任一項之乾生質獲得。
21. 如請求項15或19之方法，其中該至少一種式III、式IV或式V化合物係自藉由萃取如請求項16、17或18中任一項之乾生質獲得之至少一種式I或式II化合物製得。
22. 如請求項15、19及20中任一項之方法，其中式II之化合物係藉由萃取如請求項16、17或18中任一項之乾生質獲得。
23. 如請求項22之方法，其中獲得式II之化合物及將其用於製造至少一種式III、式IV或式V化合物。
24. 如請求項15、19及20中任一項之方法，其中獲得至少一種式III、式IV或式V化合物或在自式II化合物製得其之後進行分離。
25. 如請求項15、19及20中任一項之方法，其中該至少一種式III、式IV或式V化合物係用於製造害蟲控制組合物。
26. 一種以如請求項16、17或18中任一項之乾生質於獲得至少一種式I化合物之用途。
27. 一種以如請求項16、17或18中任一項之乾生質於獲得式II化合物之用途。
28. 一種以如請求項16、17或18中任一項之乾生質於製造至少一種式III、式IV或式V化合物之方法中之用途。
29. 一種以如請求項16、17或18中任一項之乾生質於如請求項15、19、20、21、22、23、24或25中任一項之方法中之用途。