CN1159444C - 突变的青霉素g酰基转移酶基因 - Google Patents

突变的青霉素g酰基转移酶基因 Download PDF

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Abstract

本发明提供了显示出改变的底物特异性的新的突变β-内酰胺青霉素G酰基转移酶。这些青霉素G酰基转移酶是由表达编码所说的青霉素G酰基转移酶的基因获得的，它们具有其中至少有一个氨基酸不同于野生型青霉素G酰基转移酶的氨基酸序列。

Description

突变的青霉素G酰基转移酶基因
发明所属技术领域
本发明涉及原核生物青霉素G酰基转移酶或其酶原(preenzyme)或前酶原(preproenzyme)的突变。这种突变导致突变的青霉素G酰基转移酶特性的改变。
发明背景
β-内酰胺类抗生素主要由发酵获得。青霉属与头孢属(顶孢霉属)的真菌用来产生一些β-内酰胺抗生素的(如青霉素G、青霉素V和头孢菌素C，这些发酵产物也分别称作PenG，PenV和CefC)的原材料。几乎所有的这些起始材料都以青霉素和头孢菌素投放市场。一般来说在青霉素核的6-氨基或者头孢菌素核的7-氨基位置上的酰基基团被称为“侧链”，相应的酸被称为“侧链酸”。PenG，PenV和CefC的侧链分别为苯乙酰、苯氧乙酰和氨基己二酰。通过切断酰胺键(脱酰基作用)可使侧链从环上脱离，如果是青霉素分子，就产生6-氨基青霉酸(6-APA)，而对头孢菌素而言产生7-氨基头孢菌酸(7-ACA)。在这一点上，苯乙酰基-7-氨基去乙酸基(deacylation)头孢菌酸(CefG)也应被认为是7-ADCA的前体，虽然其并非发酵产物。CefG通常是以化学方法用青霉素G为前体产生的。
为了获得活性范围改变的β-内酰胺化合物，增加对β-内酰胺酶的抗性或改进β-内酰胺化合物的临床特性，6-APA，7-ACA以及7-ADCA被作为合成操作的起点用生产各种选择的青霉素和头孢菌素。至今这些半合成青霉素与头孢菌素在β-内酰胺抗生素中仍占有很重要的市场。
这些半合成β-内酰胺产物必须由发酵得到的青霉素与头孢菌素的脱酰化获得。虽然一些相当有效的化学方法可用来脱酰基化(J.Verweii & Vroom，Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 112：(1993)66-81)，但现在这些酶促方法的高耗能以及化学方法导致的环境问题更加受到重视(Dunnill，P.，固定化细胞和酶技术，Philos，Philos，Trans.R.Soc.London B290(1980)409-420)。可以完成催化β-内酰胺化合物脱酰化的酶根据它们催化的化学反应被归为水解酶类。当然，那些在β-内酰胺化合物脱酰化中特别有用的水解酶在本领域通常被称作“酰基转移酶”或“酰胺酶”。这些名称在这种特定的情况下具有相同的含义。与β-内酰胺类抗生素相关联，这些酰基转移酶通常被特称为“β-内酰胺酰基转移酶”，因为并非所有的酰胺酶都可以以β-内酰胺核作为酰基基团的受体/供体。根据文献记载，依据它们的底物特异性和分子结构，β-内酰胺酰基转移酶可分为几类(B.S.Deshpande等，微生物学和生物技术世界杂志，10(1994)129-138)。
酰基转移酶，命名及分类
根据特异性分类
酰基转移酶的底物特异性取决于酶上的侧链结合位点。所述位点也就是酶识别β-内酰胺分子的侧链部分的识别位点。一般来说，酰基转移酶对与氮原子相邻的酰胺基团并没有很强的特异性(该基团可能是cephem基团、penem基团、氨基酸、糖等)(J.G.Shewale等，国际生物化学方法，1990年6月，97-103)。对于青霉素G酰基转移酶(苯甲基青霉素酰胺水解酶，也称青霉素酰胺酶，EC 3.5.1.11)而言，酰基部分是非常疏水的，并且优选的是苯乙酰基或(短的)烷基。青霉素G酰基转移酶在工业上用来水解PenG或CefG，从而产生苯乙酸和6-APA或7-ADCA，这些化合物是工业上生产半合成青霉素和头孢菌素非常重要的中间体。除了以上所述的主要用途外，据报道这些酶也应用在其它一些反应过程中。如有机合成和肽化学中用于保护/脱保护敏感基团，立体特异性转化，苯酰甘氨酸的光学转变，carbinols的脱酯化，mono-bactams的酰化等。在这些应用中，这些酶或者以自然状态使用，或者以固定化制品的方式使用。具有酶活性的微生物全细胞也可以以细胞悬液的方式或固定化细胞制品的方式使用。
不能被青霉素G酰基转移酶水解的底物的例子是具有荷电的酰基部分的那些，例如，二羧酸：琥珀酰，戊二酰，己二酰以及氨基己二酰，CefC的侧链。
青霉素V酰基转移酶对苯氧乙酰基有高度的特异性，而氨苄青霉素酰基转移酶优先选择D-苯基甘氨酸作为侧链。戊基(glutaryl)-酰基转移酶使戊基7-ACA脱酰基，后者是在用D-氨基氧化酶使侧链酶促脱酰氨基后接着用过氧化物(其在第一步中产生)化学脱羧形成酮基己二酰衍生物从CefC制备的。而且，已报道这些酰基转移酶中的一些能够水解以琥珀酰，戊二酰和己二酰为酰基部分的头孢菌酸(包括去乙酸基衍生物)，甚至在CefC很有限的情况下(综述参见EP-A-322032，Merck)。迄今为止，这些酰基转移酶仅在假单胞菌属的一些种，巨大芽孢杆菌和粘节杆菌的一些菌株中发现。
根据酶的结构特性分类
除了特异性外，也可以根据分子特点对酰基转移酶进行分类(V.K.Sudhakaran等，方法-生物化学27(1992)：131-143)：
-I型酰基转移酶对青霉素V是特异性的。这些酶由四个分子量为35kDa的相同的亚单位组成。
-II型酰基转移酶具有以下共同的分子结构：这些酶都是由一个小的亚单位(α：16-26kDa)和一大的亚单位(β：54-66kDa)组成的异源双体。
根据结构特异性，II型乙酰转移酶还可以进一步分为两组：
-IIA型酰基转移酶包括青霉素G酰基转移酶；
-IIB型酰基转移酶包括戊二酰酰基转移酶。
-III型酰基转移酶是氨苄青霉素酰基转移酶，已报道它们是由分子量为72kDa的两个相同的亚单位组成的二聚体。
蛋白质工程在筛选/化学修饰方面的优点
已开发或发现了几种改进酶特性的方法，如，经典的筛选方法，对已存在的蛋白质进行化学修饰或者现代基因工程和蛋白质工程技术。
可以筛选具有所需酶促活性的有机体或微生物，例如，从某种微生物或一些微生物的培养液中分离和纯化酶，然后确定该酶的化学特性和这些化学特性是否符合应用的需要。现收集到的酰基转移酶都是一些灵敏的筛选方法的结果。β-内酰胺酶已在许多生物。如真菌，酵母，放线菌，以及细菌中发现。
如果已鉴别的酶不能从它的天然产生有机体获得，则就可以用重组DNA技术分离编码酶的基因，然后在其它生物体中表达该基因，并且分离纯化所表达的酶和检测该酶是否适合应用意图。
可以特别用化学修饰方法实现对现有的酶的修饰。通常，这些方法特异性太低，以致会修饰具有共同侧链的酶的所有可接近的残基，或者这些方法依赖于存在合适修饰的氨基酸。而且，化学修饰法不能对一些不易接触到的氨基酸进行修饰，除非酶分子不发生折叠。此外，化学修饰法还需要一些制备酶的额外的步骤和化学药品。通过用编码基因进行诱变的方法进行酶修饰不会遇到这些问题。因此，这种方法更为优越。
除了选择一种酰基转移酶之外，随后的高产青霉素酰基转移酶产生菌的构建和筛选以及纯化和固定的工业方法的开发是一个艰巨的过程。就突变体产生以及随后的形成而言，通常可以遵循野生型方案。因此，一旦某种酰基转移酶的这种开发成功，扩大这种选择的酰基转移酶的应用就比继续从其它来源筛选酶更具吸引力。因而，通过对具有编码功能的野生型基因进行诱变而进行酶修饰的办法被认为是优越的，尤其在需要酶特性的小的改造时。所需特性可以包括改变的特异性，对某种底物的改变的特殊活性，改变的pH依赖性或改变的稳定性。诱变可以通过随机诱变和定向诱变来实现。
随机诱变方法通过化学诱变剂或诱变照射对微生物全细胞进行处理，当然可以导致酶的修饰，但在诱变后必须经过大量的筛选步骤才能找到具有所需特性的突变体。通过克隆编码的酶，在体外或体内对其进行诱变，然后再将该突变基因亚克隆到合适的宿主细胞中来表达该基因所编码的酶的方法可以大大提高随机诱变后纯化所需突变酶的可能性。在这种情况下，用来筛选筛选突变酶的合适的生物筛选方法必须是有效的。
定点诱变是获得修饰的最特异的方法。这种方法可以用任何其它的所需氨基酸来特异性地取代一个或多个氨基酸。
可以通过化学法和酶法将β-内酰胺中间体转化为所需的半合成抗生素。假如一种合适的酶是可用的，则酶学途径是比较好的。这是因为：
-可以立体有择性地进行反应。
-反应物不需要象硅烷化之类的侧链保护。
-对有机溶剂的需要更少，比如可以省去引起环境问题的二氯甲烷之类的有机溶剂。
-与化学方法相比，所需步骤通常要少一些。
-不需高温高压。
-通常，副产物含量较低。
各种选择的青霉素和头孢菌素的的合成操作基本上都分别从6-APA，7-ACA以及7-ADCA开始。
酶促转化利用了在合适的条件下所有的酶反应都是可逆的这一点。这在应用上的重要性已在以前的综述中被阐明。文献列举一些青霉素酰基转移酶在生物合成路线中应用的例子(J.G.Shewale等，国际方法生物化学，1990年6月，91-103)。6-APA，7-ADCA，7-ACA，3-氨基-4-α-甲基monobactamic酸和肽的酰基衍生物已经通过各种结构的侧链部分制备。除了6-APA和7-ADCA外，青霉素酰基转移酶也用于生产一些抗生素中间体，如6-氨基-2，2-二甲基-3-(四唑-5基)penam，甲基-6-氨基青霉酸，3-甲基-7-氨基-2-cephem-4-羧酸和3-氨基诺卡氏菌酸。水解反应在碱性pH(4.0-7.0)条件下被催化而酸性条件则促进酰基化反应。
在生物转化过程中，许多因素都会影响酰基转移酶的特性：
-反应介质：pH，离子强度，温度，有机溶剂等；
-对处理条件而言的稳定性；
-反应物的稳定性；
-酶的催化活性。
除了非酶性质的稳定性外，其它因素都可以是通过蛋白质工程进行的酶修饰的目标。
为了使生物合成过程经济可行，已探讨了这些因素的各种。甲基酯(与侧链酸的游离酸相比其是高级酰基供体)以用于反应。为了有利于酰化，经用某些溶剂改变酶分子周围的水活性已移动了反应平衡，例如聚乙二醇，甲醇，乙醇，丙醇，丁醇和丙酮被用于提高青霉酸G，青霉酸V和氨苄青霉素的产量。
酰化反应(尤其是用6-APA，7-ADCA和7-ACA的)产生重要的临床抗生素。然而，反应需要在严格的动力学参数控制下监测。尽管在某些文献中推测蛋白质工程工具可以开发来获得定制的酶分子，以可以与现存的化学方法相竞争的量给出半合成青霉酸和头孢菌素，但不存在任何这样的技术，既不知道如何进行或制作哪一种工程酶，也不知道哪一个氨基酸残基应被取代或取代种类和所需底物之间有何关系。给定的青霉素酰基转移酶的合成潜力是有限的，这是因为酶的特异性。因此，人们对开发在脱酰/酰化反应中高效产生所需化学物质的酶具有极大的兴趣。特别的兴趣是β-内酰胺(尤其是PenG，PenV，CefC和它们的衍生物)脱酰化产生6-APA和7-ACA和衍生物，后者酰化产生目标青霉酸和头孢菌素。
此外，增加更具极性的侧链或荷电侧链(如丁二酰，戊二酰或者己二酰)的活性是所需的。具体地说，用能够催化CefC(和衍生物)转化成为7-ACA(和衍生物)的有效酶处理是非常重要的。
合成中酶应用的理论方面
青霉素G酰基转移酶是水解酶，其催化各种β-内酰胺化合物的脱酰化。此外，由于酶以两个方向催化反应，所以这些酰基转移酶也用作为转移酶来催化产物(诸如β-内酰胺抗生素，多肽，低聚糖或甘油酯)的缩合合成。酶催化的合成可以以平衡控制或动力学控制的反应进行。
在平衡控制过程中，酶仅加速建立热力学平衡的速率。酶的动力性质不影响平衡浓度。然而，热力学平衡依赖反应条件如pH值，温度，离子强度，或溶剂组合。有利于以获得所需产物最佳产量的方式移动热力学平衡的反应条件通常对酶功能不是最佳的。在这种情况下，用酶工程改造酶使其适应接近热力学最佳反应的条件可能是所需的。在这一方面，稳定性，最适温度以及pH值可以是有用的目标。
在动力学控制反应中，以使所需产物在非平衡条件下的反应期间产生大量积累的方式选择反应条件。在这种情况下，除已经论及的参数之外，酶的动力性质在获得可以与现存的化学方法有利地竞争的产物中也是重要的因素。青霉素C酰基转移酶的动力学与经酰基-酶媒介的催化过程一致。如图1所示，这一媒介在酶机制中起关键作用。在这一方案中，酰基转移酶充当水解酶(此时酰基基团转移到水中)和转移酶(此时酰基从激活的底物转移到亲核试剂被催化)。由酰基转移酶的特异性确定化合物X-CO-NH-Y(其是特定酰基转移酶的底物)中化学基团X和Y的性质。X代表侧链，而Y代表酰基受体基团。例如，对于PenG的脱酰作用，X-CO-代表苯基-乙酰基侧链，-NH-Y代表6-氨基青霉酸。对给定的某些酶促机制而言，由X和Y结合位点的体系结构和氨基酸组成确定特异性。
在所述机制的第一个步骤中，底物结合到酶上形式-非共价Michaelis-Menten复合物。在尔后的步骤中，共价的媒介在底物的酶和酰基部分之间形成(E-CO-X)。可以通过酰胺键(X-CO-NH-Y的酰胺水解)或酯键(X-CO-O-R的之水解)的裂解可以发生酰基-酶的形成，在低的pH值下，其也可以直接从X-COOH形成。在脱酰作用之前亲核试剂YNH结合到酰基-酶上。在有利于脱酰化的条件下(酶充当脱酰酶或酰胺酶)，水分子水解酰基-酶，进而释放出第二种产物X-COOH，并且使酶再生用于新的催化循环。在有利于形成化合物X-CO-NH-Y的条件下，亲核试剂Y-NH与酶而不是与水(氨解)反应。对PenG，所述机制由观察到苯乙酸作为竞争性抑制物起作用，同时6-APA作为非竞争抑制剂起作用得到证实。然而，当使用适当的侧链酯衍生物(X-CO-O-R)或仅仅酰胺(X-CO-NH2)时，与水解(V3)相比，酰基-酶(V2)形成相对较快。结果是酰基酶媒介物积累。在具有游离伯氨基(一般由Y-NH2表示)的合适的化合物(例如，被酰基转移酶结合的6-APA，7-ACA，7-ADCA)存在时，可以形成酰胺，给出X-CO-N-Y(V-1氨解)。
就化学基团X和Y的优先选择而言，在X和Y结合位点的残基取代改变这一优先选择。在底物特异性方面变化包括所有Vmax和Km的增加和减少的组合，在某些情况下，需要更特异性酶，例如，在旋光对映体混合物的情况下，但酶对旋光选择性地针对对映体中的一个时，其会是有用的。在其它情况之下，例如转化相当纯的化合物时，在选择的成本下的高转化率是优选的。在高底物浓度时，较高的Vmax是优选的，而Km并不重要。
用于底物激活和动力学控制的酰基转移酶可以改变，其方式是就酰基转移至非水受体亲核试剂(V-1)：比率V-1/V3相对于野生型增加而言，使其水解化合物(V3＝转移酰基至水中)的催化能力受到抑制。
转移酶对水解酶活性的比率是在缩合产物的动力学控制合成中影响产率的酶性质。可以从由酰基-酶形成X-CO-NH-Y和X-COOH的起始速率可以确定酰基转移至YNH或H2OD表观二级速率常数的比率。
可以通过改善亲核试剂对酰基-酶复合物与水的亲和性改善转移酶的活性。因为酰基的转移与结合到酰基-酶上的亲核试剂的量是相称的，所以增加酶-酰基复合物的亲和性将改善水解缩合产物的产量。
此外，可以通过降低获得的所需产物(V1V3)的水解来获得酶催化的生物合成中的较高产率。酰胺键相对于酯键的水解已降低的变体仍然可以从酯底物(V2)形成酰基酶，但具有对产物酰胺键的相对较弱的水解能力(相对于野生型的增加的比率V1/V3)。
相关文献
几种编码IIA型青霉素G酰基转移酶的基因已被测序，即，来源于大肠杆菌(G.Schumacher等，核酸研究14(1986)5713-5727)，嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌(J.L.Barbero等，基因49(1986)69-80)，粪产碱菌(美国专利5,168,048 Gist-brocades)，雷氏普罗威登斯菌(G.Ljubijankic等，DNA测序和作图杂志3(1992)195-201)和粘节杆菌(Arthrobacter viscosis)(M.Konstantinovic等(1993)EMBL数据库条目L04471)的基因。
重组DNA方法的使用已使得可以增加商业上使用的青霉素酰基转移酶的产生水平(Mayer等，生物技术进展，1(1982)83-86)，并且扩大了处理这些酶的视野(Schumacher等，核酸研究14(1986)5713-5723)。发现大肠杆菌的酰基转移酶作为大前体蛋白质产生，其进一步被加工成由小(α)和大的(β)亚单位组成的周质成熟蛋白质。嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌酰基转移酶基因的克隆和测序显示从与大肠杆菌酰基转移酶基因密切同源的酰基转移酶基因(J.L.Barbero等，基因49(1986)69-80)。也描述了雷氏变形菌(G.O.Daumy等，细菌学杂志163(1985)1279-1281)和粪产碱菌(美国专利5,168,048和EP-A-453048，Gist-brocades)的青霉酸G酰基转移酶的小和大亚单位。
这些出版物既未教导也未建议本发明的内容。
已描述了借助于蛋白质-工程技术重新设计酶的比活(specificactivity)。
专利申请EP-130756和EP-251445描述了为了改变酶的动力学性质，在某些组的丝氨酸蛋白酶中残基的选择和这些残基中某些的诱变。
由于这些专利申请具体地涉及丝氨酸蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶型)，因此这些出版物并未指出哪一个残基调节IIa型青霉素G酰基转移酶的催化性质。
Wells等(Proc.Natl.Acad.Sci.美国84(1987)5167)显示了枯草杆菌蛋白酶的例子。地衣芽孢杆菌和液解化淀粉杆菌丝氨酸蛋白酶不同之处在于蛋白质序列中31％(86个残基)的序列和在某些底物上的催化效率中的60因子。通过用相应的地衣芽孢杆菌序列的残基取代液解化淀粉杆菌序列的86个不同氨基酸中的3个，突变酶的催化活性改善接近69倍。
Wilks等(科学242(1988)1541)描述了如何通过将102位谷氨酰胺突变成精氨酸来将乳酸脱氢酶改变成为苹果酸脱氢酶。在丝氨酸蛋白酶以及乳酸脱氢酶两种情况下，修正建议的灵感来源于与天然发生的酶(其已经显示所需的特异性)比较。用相同的方法，通过以Phe209代替Leu209，细胞色素p45015α的特异性被改变成为细胞色素p450coh的特异性(Lindberg和Negishi，自然339(1989)632)。
专利申请WO93/15208描述了用于修饰脱氢酶特异性和或的效率而保持其催化活性的方法，该方法的特征在于它包括：选择酶，其三级结构是实质上已知的或可推测的；鉴别至少一个特异性和/或效率相关区；鉴别或者构建结合在DNA编码序列中鉴别的区的单一限制位点；除了随机化至少一个密码子上的核苷酸，或选择鉴别的区的至少一部分的取代基(其自身同样地可以随机化)而外产生相应于鉴别的区的至少一个部分的DNA序列；用产生的或取代的DNA序列替代原有序列；表达包括产生或取代的DNA序列的DNA；和选择一种所需的修饰以便DNA编码序列可被分离。脱氢酶与青霉素C酰基转移酶毫不相关，这一专利申请没有揭示出在酰基转移酶中应被取代与改变其动力性质的残基。
Forney等(应用和环境微生物学55(1989)2550-2556；应用和环境微生物学55(1989)2256-2260)以用克隆和化学/UV随机诱变技术分离到能够在戊二酰-L-亮氨酸或D(-)-α-氨基-苯基-乙酰基-(L)-亮氨酸上生长的的日益增长的大肠杆菌菌株。突变体产生的青霉素酰基转移酶在pH值5和6之间水解戊二酰-L-亮氨酸，在pH值6.5时水解D(-)-α-氨基-苯基-乙酰基-(L)-亮氨酸。虽然推测青霉素G酰基转移酶的特异性变化之由于酰基转移酶中的一个或多个突变，但没有鉴别出涉及的残基和突变的类别。
J.A.Williams T.J.Zuzel(细胞生物化学(1985)补充9B，99)在摘要中报道了经体外蛋氨酸诱变的青霉素G酰基转移酶的底物特异性修饰。尽管摘要中并没有报道这一蛋氨酸的位置，但从其叙述中似乎可以得出结论，其涉及大肠杆菌酰基转移酶Met168位置。然而，这一文献没有揭示与所观察的特异性有关的甲硫氨酸有关的如何取代的任何细节。Prieto等(I.Prieto等，应用微生物生物技术，31(1990)553-559)用丙氨酸，缬氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，酪氨酸取代嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌中蛋氨酸168(其影响PenG和PenV脱酰化的动力参数)。此外，制备了几乎不显示出任何作用的突变体赖氨酸375天冬酰胺和组氨酸481酪氨酸。
J.Martin等分析了嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌青霉素酰基转移酶中突变体蛋氨酸168丙氨酸并报道了改变的动力学性质(J.Martin & I.Prieto，Biochimica et Biophysica Acta 1037(1990)133-139)。这些参考文献表明168位上的残基在大肠杆菌和嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌酰基部分特异性上的重要性。然而，这一文献没有揭示出有关转化所需底物的特异性改变的蛋氨酸如何取代的任何细节。
Wang Min报道了在大肠杆菌青霉素G酰基转移酶中诱变丝氨酸177成甘氨酸，苏氨酸，亮氨酸，精氨酸以获得活性酰基转移酶(Wang Min等实验生物学报24(1991)，1，51-54)。
Kyeong Sook Choi等(细菌学杂志，174，(1992)，6270-6278)用苏氨酸，精氨酸，甘氨酸和半胱氨酸取代大肠杆菌青霉素酰基转移酶中β-亚单位N-末端丝氨酸。只有当N-末端残基是半胱氨酸时酶才被正确的加工，并获得成熟酶但是是失活酶。此外，β-亚单位N-末端丝氨酸的化学诱变也导致严格/几乎完全丧失活性(Slade等，欧洲生物化学杂志197(1991)75-80；J.Martin等，生物化学杂志，280(1991)659-662)。
Sizman等(欧洲生物化学杂志192(1990)143-151)把大肠杆菌中丝氨酸838取代成半胱氨酸，在翻译后加工中和酶的催化活性上没有任何作用。此外，Sizman等制备了青霉素酰基转移酶的各种缺失突变体，其显示酰基转移酶的正确的成熟对诱变非常敏感。除了缺乏最后3个残基的突变体(然而其非常不稳定)之外，所有β-亚单位C-末端缺失突变体不被表达除了突变体都不被表达。
在大肠杆菌中位置827插入4个残基也不能给出活性酶。
Prieto等在嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌青霉素酰基转移酶中将甘氨酸310取代成谷氨酸。然而，没有获得活性酶。
在EP-453048中描述了蛋白质工程如何用于改变IIa型和IIb型酰基转移酶的特异性。然而，所使用的方法被限制在产生随机产生的酰基转移酶突变体文库，必须筛选所需的活性。尽管经该专利申请中描述的方法，可以突变的氨基酸的数量被降低，但剩下的位置的数量仍然很大，因此位置定点诱变将是一种艰辛的工作。然而，本发明在更大程度上限制了可被突变的位置的数量。此外，这些位置的氨基酸与底物直接接触，这意味着取代会影响与底物的直接的相互作用。而且，导致本发明的所述方法使得人们可以选择特定的氨基酸取代，以获得对特定底物的所需作用。
发明概述
本发明提供了具有下列特征的分离的突变原核生物青霉素G酰基转移酶或或其酶原或前酶原：
-在相应于粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)青霉素G酰基转移酶或其酶原或前酶原的以下一个或多个位置上具有氨基酸取代：A139至A152，B20至B27，B31，B32，B49至B52，B56，B57，B65至B72，B154至B157，B173至B179，B239至B241，B250至B263，B379至B387，B390，B455，B474至B480；和
-具有相对于相应的野生型未取代的青霉素G酰基转移酶来说的改变的底物特异性或者改变的比活。
优选地，所说的分离的突变原核青霉素G酰基转移酶来源于粪产碱菌。
此外，本发明也提供了编码所说突变酰基转移酶的核酸序列，包含所说核酸序列的载体，以及用所述载体转化的微生物宿主菌株。
按照本发明的另一方面，本发明提供了制备所说的分离的突变青霉素G酰基转移酶的方法，该方法包括：
-培养如上所限定的用包含编码突变酰基转移酶之核酸序列的表达载体转化的微生物宿主菌株，由此产生所述的突变酰基转移酶；和
-分离所说的酰基转移酶。
最后，本发明提供了用于进行酰化或脱酰化的方法，所说的方法包括使所说的分离的突变青霉素G酰基转移酶在适于发生所说的反应的条件下与所说酰基转移酶的底物接触。优选地，由所说的方法产生β-内酰胺化合物。
特别是，本发明提供了用于使6-酰化青霉酸、7-酰化(去乙酸基)头孢菌酸或者它们的盐或酯脱酰化，分别形成相应的6-氨基青霉或7-氨基(去乙酸基)头孢菌酸或它们的盐或酯的方法，该方法包括在适于发生脱酰化的条件下使所说的6-酰化的或者7-酰化的化合物与以上限定的突变酰基转移酶接触；本发明也提供了用于产生半-合成6-酰化青霉酸，7-酰化(去乙酸基)头孢菌酸或者它们的盐或酯的方法，该方法包括在适于发生酰化的条件下分别使相应的6-氨基的或者7-氨基β-内酰胺或者它们的盐或酯与具有以上限定的突变酰基转移酶的酰化剂接触。
附图简要描述
图1：用于IIa型青霉素酰基转移酶催化转化的反应方案。
EH代表酶，其中H代表转移到离去基团上的质子，X代表酰基部分或侧链。Y是待酰化(酰化作用)或待脱酰化(脱酰作用)的化合物。化合物X-CO-OR也可以是简单的酰胺X-CO-NH2。
图2：IIa型青霉素酰基转移酶成熟酶的α(2a)与β(2b)亚单位的序列对比。粪产碱菌(afae)，大肠杆菌(ecol)，嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌(kcit)，粘节杆菌(avis)，雷氏普罗威登斯菌(pret)。链识别符A和B分别用于α和β链。星号指序列在那一位置包含与粪产碱菌序列相同的氨基酸。雷氏普罗威登斯菌酰基转移酶的α亚单位的N末端和C末端未知。雷氏普罗威登斯菌的β亚单位的N末端与前体酰基转移酶进行序列对比。
图3：用于表2和3的涉及命名法的PenG原子命名。
图4：粪产碱菌PenG酰基转移酶苯乙酰部分周围活性位点的立体图。
图5：具有粪产碱菌青霉酸G酰基转移酶基因，大肠杆菌ori“高拷贝”，Tac启动子，Fd-终止子，cap-，amp*fl起点的pMcAF诱变载体。
图6：野生型粪产碱菌酰基转移酶和突变体A：M143V，B：LS6K，A：F147Y对各种底物的最大脱酰速度。各变体的速度是相对于penG的：Vmax(X)/Vmax(PenG)。X代表PenV，CefG，氨苄青霉素(Ampi)，(D)苯基甘氨酰胺((D)PGA)或NIPAB。
图7：野生型粪产碱菌酰基转移酶和突变体B：L56G，B：L56A，E：L56V，B：I177V，B：I177S，B：A67S，B：A67G对各种底物的最大脱酰速度。各变体的速度是相对于PenG的：Vmax(X)/Vmax(PenG)。X代表PenV，CefG，氨苄青霉素(Ampi)，(D)苯基甘氨酰胺((D)PGA)或NIPAB。
发明的详细描述
水解/脱酰作用
本发明涉及改变青霉素G酰基转移酶的动力性质的残基的鉴别。因而所形成的青霉素G酰基转移酶变体就伯氨基脱酰化(例如，出现在青霉素和头孢菌素中的)而言比前体青霉素G酰基转移酶更有用。这些动力性质包括比活，动力学参数的pH依赖性，底物特异性，立体-选择性以及转移酶对水解酶活性比率。
合成/酰化作用
本发明涉及青霉素G酰基转移酶变体，这些变体是经由重组体DNA方法通过在前体中改变至少一个氨基酸残基从所说前体青霉酸G酰基转移酶衍生的，就伯氨基的酰化(例如，发生于β-内酰胺核(P-aration semi-合成)和肽类中的)而言，所说的青霉素G酰基转移酶变体比所说的前体青霉素G酰基转移酶更有用。
本发明涉及青霉素G酰基转移酶变体，这些变体是经由重组体DNA方法通过在前体中改变至少一个氨基酸残基从所说前体青霉酸G酰基转移酶衍生的，所说的青霉素G酰基转移酶变体的特征在于具有比所说的前体青霉素G酰基转移酶更高的转移酶对水解酶活性比率。
作为本发明的目的的青霉素G酰基转移酶：
-是从原核生物分离的；
-被转录为一个单肽链前体；
-在转录之后被胞内加工与小的N-末端结构域(α结构域)和大的C-末端结构域(β链)形成异源双体。N-末端结构域的分子量范围为16-28kDa。C-末端结构域的分子量范围为54-68kDa；
-可以作为αβ异源双体的多聚体出现在溶液中；
-β-亚单位的N-末端有一个丝氨酸。
产生这样的酰基转移酶的微生物是下列种的一些菌株：大肠杆菌，嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌，雷氏普罗威登斯菌，假单胞菌的种，粪产碱菌，巨大芽孢杆菌和粘节杆菌。
几种编码青霉素G酰基转移酶的基因编码已被测序，所说基因即来源于大肠杆菌，嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌，粪产碱菌，雷氏变形菌和粘节杆菌的基因。
青霉素G酰基转移酶的底物特异性的改变是以这样一种方式完成的，即，使突变酶能够裂解或者合成具有不是苯乙酰(其是青霉素G的天然侧链)的侧链的青霉素和头孢菌素衍生物。不明显受青霉素G酰基转移酶影响的侧链的例子是来源于二羧酸琥珀酸、戊二酸、脂肪酸、氨基脂肪酸的酰基基团(后者是CefC的天然侧链)。
在另一方面，完成了青霉酸G酰基转移酶对侧链(其已是所说的酰基转移酶的底物)的特异性和活性的改变。利用蛋白质工程，可以改变底物亲和性(例如，增加的，由对所说底物的较低Km表达的)，可以改变催化周转率(例如，增加的，由对所说底物的较高的Kcat表达的)，或者可以改变二级速率常数(例如，由改变的Kcat/Km比率表达的，一个经常用于比较酶对不同底物特异性的参数)。在这一方面相关的底物包括改变的β-内酰胺衍生物青霉素V(PenV)，氨苄青霉素，阿莫西林，头孢氨苄，羟氨苄头孢菌素或氯氨苄头孢菌素。此外酰基部分的简单酰胺和酯的动力性质的改变对获得增加的酰基酶媒介物(其可以改进生物合成方法的产率)的积累是有用的。
在另一方面，完成青霉素G酰基转移酶的特异性与活性的改变，以增加青霉素G酰基转移酶的立体特异性，导致产生在手性化合物的外消旋混合物的转化中显示出改进的对映异构体过量的酶。这种性质使得青霉酸G酰基转移酶在从苯乙酰侧链的外消旋混合物或激活的苯基-乙酰基侧链的衍生物(例如，苯基甘氨酸-酰胺或其酯，P-羟苯基甘氨酸-酰胺或其酯等)合成具有旋光纯度的半合成抗生素上特别有用，所说衍生物包含手性α碳原子，这是因为其存在氨基基团(例如，氨苄青霉素，头孢氨苄，阿莫西林，羟氨苄头孢菌素，氯氨苄头孢菌素)或羟基基团(头孢羟苄唑)。
除了对酰基Cα位的立体选择性以外，青霉酸G酰基转移酶也显示出对底物氨基部分的立体选择性。在氨基酸的情况下，酰基转移酶需要在Cα碳原子上的L构型。在本发明的另一方面，所说酶对底物氨基部分的立体选择性可被改变。
在本发明的另一方面，野生型酶的产物抑制被降低。在形成较高产率的转化期间，所需变体保持其起始高脱酰化速率较长时间。这样的抑制产物的例子是苯乙酸酯，苯氧乙酸酯，苯基甘氨酸，p-羟基苯基甘氨酸等。
在本发明的另一方面，相对水解酶活性而言，酶的转移酶活性得到改善，这使得酶在生物合成转化中更有用。特别是在酶促合成阿莫西林，氨苄青霉素，氯氨苄头孢菌素，羟氨苄头孢菌素，cefprozil，头孢力新，和头孢拉定中具有改进的性能的变体是优选的具体例子。
与前体酰基转移酶比较，生物合成所需的变体更容易被β内酰胺核(与水比较，氨解/水解比率)脱酰化。这可以由改善相对于水的对亲核试剂的结合获得。相对于前体酶来说，所需变体对特定的底物具有改变的酯酶/酰胺酶比率，即，对某些侧链，与对相应侧链的酯的酯酶活性比较，所需酶显示出对那些侧链的酰胺衍生物的降低的酰胺酶活性。
为了获得酶分子中的改变，非常需要获得所说酶的3D结构。迄今还没有酰基转移酶的高分辨3D结构出版。
以可以获得最高同源性的方式将已知的青霉素G酰基转移酶基因序列衍生的氨基酸序列进行序列对比。对基于相同性也基于类似性的序列对比而言，氨基酸的类别可以用作参数，例如，丝氨酸类似于苏氨酸，天冬氨酸类似于谷氨酸等，结果在图2中示出，图2给出了得自大肠杆菌，嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌，粪产碱菌，雷氏普罗威登斯菌和粘节杆菌的青霉素G酰基转移酶的序列对比。5种氨基酸序列的序列对比揭示出青霉酸G酰基转移酶之间的明显的同源性(其给出类似的3D结构)。
在本发明的一个实施方案中，其它青霉素C酰基转移酶(其结构上类似于粪产碱菌青霉酸G酰基转移酶)的相应的位置可以被以与粪产碱菌相同的方式在类似于粪产碱菌青霉素G酰基转移酶的位置上被取代。这些蛋白酶的相应的位置可以从图2所示的氨基酸对比获得。在图2中，各种酰基转移酶的氨基酸序列与粪产碱菌(A.fae)酰基转移酶的序列进行了对比。
尽管本文将用粪产碱菌青霉素G酰基转移酶的特定例子说明残基的选择，但明显的是由于同源性，在得自其它物种的青霉素G酰基转移酶中可以选择取代位点。在来源于其它物种的青霉酸G酰基转移酶中氨基酸取代后，所述方法也产生类似的改变的动力学性质。“类似的”指取代具有的动力学参数改变上的影响的种类。
在本发明的一个实施方案中，编码已知的青霉素G酰基转移酶(例如得自大肠杆菌，嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌，粪产碱菌，雷氏普罗威登斯菌和粘节杆菌以及其它产生所述酶的生物体的青霉素G酰基转移酶)的基因被以使酶获得对底物的改变的特异性的方式突变。
在本发明的一个实施方案中，编码结构上类似的青霉素G酰基转移酶(例如得自大肠杆菌，嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌，粪产碱菌，雷氏普罗威登斯菌和粘节杆菌的青霉素G酰基转移酶)的基因被以使酶获得对底物的改变的特异性或新的特异性的方式突变。
本发明所说明的底物特异性改变包括青霉素和头孢菌素衍生物的Vmax和Vm的增加和减少的所有的组合。本领域技术人员将会理解，这包括其它动力学参数的变化。此外，对其它底物的特异性也因此被改变。所提出的改变底物特异性的规则并不限于所提到的底物，它们可以用于其它底物，这些底物是氨基酸，氨基烷基膦酸，伯和仲醇，cefamicines，诺卡杀菌素，monobactams，核酸，碳水化物，肽类的苯乙酰或苯氧乙酰衍生物。
青霉素G酰基转移酶从一个肽链到活性二聚体的成熟机制也是本发明的隐含的另一方面，其说明取代青霉素G酰基转移酶中活性位点的残基不影响酰基转移酶的成熟是可能的。
本发明提供了使IIa型青霉酸G酰基转移酶获得新的特异性的方法。为引入点突变，采用了一种合理的方法，其依赖于蛋白质结晶学，分子模拟和计算方法，酶学以及动力学，分子生物学和蛋白质化学技术的应用。在青霉素G酰基转移酶中的定向突变的鉴别策略是全新的，其意义是认识到点突变可以同时影响蛋白质结构的几种不同性质。特别是一些点突变可以阻止适当折叠或正确加工，导致产生失活酶。因此，所描述的策略充分利用所建立的结构-功能关系，它们也提供一种合理的方法避免或更正不需要的二级性质的改变。
按照本发明，被取代的氨基酸位置已被鉴别为在粪产碱菌青霉素G酰基转移酶分子的可用的753位置，这些突变影响所述酶的特定性质。就酶的酶促性质而言，A139至A152，B1，B2，B20至B27，B31，B32，B49至B52，B56，B57，B65至B72，B154至B157，B173至B179，B239至B241，B250至B263，B379至B387，B390，B455，B474至B480被鉴别为重要的位置。就底物的特异性而言，已鉴别了各种重要的特定的残基，这些残基包括：A：蛋氨酸143，A：精氨酸146，A：苯丙氨酸147，A：苏氨酸150，B：脯氨酸22，B：苯丙氨酸24，B：甘氨酸25，B：酪氨酸27，B：酪氨酸31，B：苏氨酸32，B：脯氨酸49，B：酪氨酸52，B：亮氨酸56，B：苯丙氨酸57，8：甘氨酸66，B：丙氨酸67，B：苏氨酸68，B：丙氨酸69，B：甘氨酸70，B：脯氨酸71，B：色氨酸154，B：缬氨酸157，B：蛋氨酸173，B：异亮氨酸175，B：丝氨酸176，B：异亮氨酸177，B：色氨酸179，B：天冬酰胺239，B：色氨酸240，B：苏氨酸251，B：苏氨酸253，B：酪氨酸254，B：酪氨酸255，B：色氨酸256，B：精氨酸261，B：蛋氨酸262，B：天冬酰胺379，B：脯氨酸380，B：甘氨酸381，B：丝氨酸382，B：异亮氨酸383，B；天冬酰胺384，B：赖氨酸390，B：苯丙氨酸455，B：苏氨酸477，B：谷氨酸478.。这些位置(包括已被突变的那些)的鉴别基于粪产碱菌青霉素G酰基转移酶的3D模型(参见图4a和4b)。
改变所需性质的残基的选择方法，所需性质是改变的催化性质，改变的特异性，改进的转移酶活性
为了改变酶的动力性质的完成定点诱变的决定性的第一步是获得与兴趣β-内酰胺化合物复合的目标青霉素G酰基转移酶的3D结构模型。这可由两种方法完成，即经直接实验方法，以及经利用分子模拟的间接方法。
直接方法
经X光衍射确定在与兴趣β-内酰胺化合物的复合物中的目标青霉素G酰基转移酶的3D结构模型。然而，当特殊β-内酰胺化合物是特殊的青霉素G酰基转移酶的底物时，在结构测定实验的时间过程中它将转化成为反应产物。在这种情况下cryo-结晶学中或十分快速的数据-收集技术可以利用。利用常规技术底物的结合片段可以揭示结合位点。可以以使底物中易切断的键不能被酶裂解的方式修饰替换性底物(例如，磷酰胺或膦酸酯键替代肽中的肽键，D.E.Tronrud等，科学235(1987)571-574)。然而，完善的方法是替换一个或多个催化残基，形成不能转化底物但是仍然能结合底物的的失活酶。例如，在青霉素G酰基转移酶中，β-亚单位N-末端丝氨酸可以突变成半胱氨酸。当通过实验获得与所需的β-内酰胺衍生物复合的目标酰基转移酶的3D结构是不可能的时，可以使用常规计算机模拟技术。化学修饰研究和定点诱变揭示β-亚单位的N-末端丝氨酸对酶促活性是关键的。令人惊奇地是，粪产碱菌青霉酸G酰基转移酶模型中易接近的残基的计算揭示出一个深的疏水腔，其接近β-亚单位N-末端丝氨酸，完善地调节青霉素G苯乙酰侧链，而将β-亚单位N-末端丝氨酸置入一个供亲核试剂在PenG的肽羰基进攻的理想的位置。
在下一步骤中，置入β-内酰胺部分而保持苯乙酰基团固定在其结合区。尽可能地避免底物和酶之间的原子重叠，此时正相互作用最大。由结合产生的正相互作用是氢键合，静电相互作用，和有利的VanderWaals接触。通过计算被酶底物掩盖的可接近的非极性表面可以估计疏水相互作用的贡献。
除了底物的手工操作外，计算技术可以用来优化底物-酶复合物。分子力学技术(如能量最小化作用和分子动力学)十分有用。可以使用用于蛋白质的forcefields，如CVFF，AMBER，CHROMOS。
最后模型用来考察PenG分子的环境。这一考察提供了在与PenG分子相互作用的的残基中的至关紧要的考察结果(参见实施例1)。此外，它提供了残基与底物哪一部分相互作用的考察结果。这一信息给分子生物学工作者提供了可用来调节青霉素G酰基转移酶的催化性质的有限的一组残基而不是完整的酰基转移酶(753残基)。这样定点诱变的本领域技术人员只需把注意力集中在仅仅有限数量的残基上，取代这些残基，并且选择所需改变的催化性质。
一般来说，当底物结合到游离酶上时，产生酶中和底物中的某些张力(strain)。这种张力可以通过使原子相互变换位置的分子力学计算揭示。酶-底物复合物与游离酶的比较将指示出哪一个残基被与底物结合影响最多。在这一方面重要的参数是相对于游离酶的残基的RMS移动，相对于游离酶的残基周围的静电环境的改变，氢键形成或残基自由能的改变。可以用程序DELPKI(Biosym Technologies)计算静电势能。受底物结合影响的残基反过来影响底物的结合，考虑到在蛋白质结构中的氨基酸的取代的限制作用，这些残基的取代是本发明的优选的实施方案。应该避免的取代是预料影响典型的结构排列的那些取代，如：盐桥，单环(helices)包装(packing)，在螺旋起始处保持阴性电荷的单环的稳定作用，单环起始，例如，在螺旋起始处的脯氨酸，将插入的残基的允许的区之外的Phi-psi角度。
所提出的改变对某些底物的活性的规则并不限于PenG，它们也可以用于其它底物。例如，可以用于头孢菌素分子而不是PenG，如CefG，其具有与PenG相同的苯乙酰侧链。在这种情况下，可以重复以上所述的全模拟方法。然而，我们较喜欢在计算机中替代PenG分子的6-APA部分，其与7-ADCA部分的青霉素酰基转移酶复合，接着由分子力学推敲分子。青霉素G-酰基转移酶复合物的结构与CefG-酰基转移酶复合物的比较将给出被底物修饰影响的残基。被PenG修饰影响的残基反过来调节修饰底物的结合。就PenG而言，为了改变这种修饰底物的动力学性质，这样的残基取代是优选的实施方案。
对某些底物的修饰，对β-亚单位N-末端丝氨酸亲核试剂而言，解除由修饰产生的张力而不影响易断裂的肽键的位置被证明是不可能的。在这种情况下，从β-亚单位N-末端丝氨酸亲核试剂到易断裂的肽键的距离在能量最小化和分子动力学中被限制在2到3范围内。此外，完成了酰基转移酶计算的诱变，以降低与底物的不需要的相互作用并增加有益的相互作用(相关的相互作用以上已描述过)。然而，当修饰的底物的结合是不需要的并且应被阻止时，经定点突变甚至可以在这一位置上增加不需要的相互作用。这种方法确立有限数量的以所需方向改变动力学性质的突变。其后，可以实施这些有限数量的突变，并试验所需的性质。
所需的修饰意指PcnG侧链苯环被五-或六-元碳环(例如，环己二烯基，环己烯基，环己基)取代，可被可不被包含1-4个杂原子(N，O或S)的五元杂环(例如噻吩基，呋喃基)取代，或可被可不被脂肪侧链(例如，丙基，丁基，戊基，己基)取代。侧链可以具有一个或多个取代基，所述启动子包括但不限于羟基，卤原子，烷基，烷氧基，羧基，硝基，氨基等。此外，苯乙酰侧链也可以在α位被取代形成D-或L-立体异构体，取代基可以包括但不限于羟基，卤原子，烷基，烷氧基，羧基，硝基，氨基等。选择影响酰基转移酶立体异构体选择性的残基是本发明优选的实施方案。所需侧链的例子是例如2-噻吩乙酰基，α-羟基苯乙酰基，p-羟苯乙酰基，p-羟苯甘氨酰基，苯甘氨酰基，琥珀酰基，戊二酰基，己二酰基，α-氨基己二酰基等。
除了修饰β-内酰胺侧链以外，β-内酰胺部分本身也可以被修饰。如以上例证说明的，6-APA部分可以被7-ADCA替代，也可以采用7-ACA。此外，可以β-内酰胺部分可以在一个或多个位置上取代。具体的说，头孢菌素可以在硫原子，3位和4位上具有取代基。例如3位可以由卤原子，甲氧基，甲基或亚甲基取代，所述亚甲基经桥原子O，N，或S连接到有机部分或五-或六元(杂)环基团上，所述(杂)环基团可以是取代的。在4位，羧酸取代基可以被各种羧基保护基修饰。而且，给出的方法也使得可以分析可以转化β-内酰胺部分(如carbapenems，nacarcidines，monobactams或它们的衍生物)的酰基转移酶的结构需要。
为了生物转化的目的，可以调节酰基转移酶与所需侧链的反应性衍生物的相互作用。这些侧链衍生物的有用的例子是烷基酯，酰胺和酰化的氨基酸。
本发明的方法可以用来选择II-型青霉素C酰基转移酶中的那些位置，为了影响青霉素/头孢菌素和它们的衍生物的相互作用产生具有改变的性质的酶，在所述位置上的氨基酸是应被取代的。位置定点诱变将提供有限数量的易于试验对所需底物的改善的转化的变体。这与随机方法相反，后者形成大量的突变体，处理非常困难。
材料和方法
诱变
为了构建突变酰基转移酶基因，基本上按Ho等(77(1989)51-59)的描述使用重叠延伸聚合酶链反应。突变的寡核苷酸用于与侧翼寡核苷酸组合以产生具有所需突变的DNA扩增产物。将这一突变DNA片段与野生型基因的相应的限制片段交换，例如pMcAF。突变寡核苷酸已设计来引入单一或多重突变。
借助质粒pMa/c系统，也可以按Stanssens(Stanssen等，核酸研究17(1989)4441-4454)的描述进行克隆DNA片段的定点诱变。构建酰基转移酶的合适的带缺口的双链体分子。用特定的错配寡核苷酸，引入了定点诱变。在大肠杆菌中从同源表达信号或从大肠杆菌lac，tac或trp启动子(DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国80(1983)21-25)获得酰基转移酶基因的表达。按EP-453048的描述进行缺口DNA的“穿刺(spiked)”寡核苷酸诱变和随机诱变。
PCR重叠延伸和带缺口的双链体两者都与另一种类型的诱变结合：定向随机诱变(TRM)。它包括在寡核苷酸合成期间，包含在特定氨基酸的密码子上的两个或多个碱基。为此，可以合成能够产生所有其它可能的选择的密码子的氨基酸的突变寡核苷酸。以这种方式可以突变单个氨基酸位置或几个位置的组合。
选择培养基
按Garcia(Garcia等，生物技术杂志3(1986)187-195)描述的方法制备苯乙酰L-亮氨酸选择培养基(“fal”)。基本平板如下：M63基本琼脂，2g/l葡萄糖，1mg/l硫胺素，10mg/l L-脯氨酸和合适的抗生素(50μg/ml氯霉素(cap)或25μg/ml氨苄青霉素(amp))。为了选择酰基转移酶的侧链特异性选择(例如苯乙酰基，苯氧乙酰基，苯甘氨酰基，p-羟苯甘氨酰基，己二酰基，α-氨基己二酰基)，将100μg/ml相应的酰基L-亮氨酸添加进基本平板中。唯一的在酰基L-亮氨酸存在下生长的大肠杆菌HB101(Leu-)的突变体和转化体被认为携带具有所需特异性的酰基转移酶基因。除了亮氨酸外，选择的底物的氨基酸部分也可以变化。在这种情况下，大肠杆菌的合适的营养缺陷突变体可以用于选择。例如用大肠杆菌菌株PC2051(从Phabagen，Utrecht，荷兰，获得)作为宿主进行底物N-己二酰-L-亮氨酸上的选择。所述的特定的筛选底物从LGSS，Transterbureau Nijmegen，the Netherlands购得。
将苯乙酰胺以终浓度15mM添加到基本M63培养基中，所述培养基补充有作为碳源的0.2％琥珀酸乙酯，甘油或葡萄糖，以及硫胺素(1μg/ml)，L-脯氨酸(10μg/ml)和合适的抗生素。所有基本培养基中的盐都由包含钠离子或钾离子的相应的盐代替，以保证在酰胺上的选择生长。具有所需侧链的酰胺从化学品供应商购得或按标准技术制备。大肠杆菌菌株JM101，WK6，HB101，PC2051以及PC1243用作选择具有对选择的酰胺的特异性的突变基因的宿主。
分离和纯化野生型和突变酰基转移酶
经离心收获细胞，并重悬于包含140mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)中。经超声处理(6×20秒，100W，100毫米池，Labsonic1510；每隔20秒将细胞在冰上冷却30秒)裂解细胞。接着离心悬液。用重悬的离心沉淀重复超声处理过程，最后经离心除去细胞碎片。经超滤，用milli-Q水充分洗涤上清液，接着用Q-琼脂糖凝胶的起始缓冲液洗涤：20mM NaH2PO4H2O pH值7.0+迭氮化物。具有Verder泵的过滤器系统由Filtron供给。切下的过滤物是5Kda。超滤后用milli-Q稀释样品，直到导电率少于或等于开始的缓冲液。
样品上样到Q-琼脂糖凝胶柱上，所述柱用20mM NaH2PO4H2O pH值7.0+0.02％迭氮化物(导电率＝2.60mS)平衡，以20ml/min的流速洗脱，在用开始缓冲液充分洗涤后，开始梯度(50分钟至100％20mMNaH2PO4H2O+0.5M NaCl pH7.0+0.02％迭氮化物)洗脱。在280nm下检测。在下一步中，将酰基转移酶进一步在由10mM NaH2PO4H2O+10μMCaCl2+0.02％迭氮化物(pH6.8)平衡过的Hydroxylapetit(HA-ultragelIBF)上纯化。以4ml/min的流速洗脱。用平衡缓冲液洗脱酰基转移酶。用350mM NaH2PO4H2O+10μM CaCl2+0.02％迭氮化物(pH6.8)再生柱。在需要非常纯的蛋白质时，用更长的柱子重复第一柱步骤(Q-琼脂糖凝胶)。
蛋白质浓度
采用BSA标准用Bradford方法测定分离和纯化期间的总蛋白质含量。可以从280nm的摩尔消光系数计算纯化的粪产碱菌青霉素G酰基转移酶的蛋白质浓度。用氨基酸组合计算摩尔消光系数。所计算的摩尔消光系数是161210M-1cm-1，其相应于在1cm池中1毫克/毫升的1.87的光密度。
野生型酶的催化中心的浓度用以不同的浓度溶解在异丙醇中的苯甲磺酰基氟化物(PMSF)滴定青霉素酰基转移酶测定。此外，最终酰基转移酶样品的酰基转移酶含量由分析型反向色谱法测定。柱：RP300 7micron20×2.1mm，注射体积5μl。梯度(用100％A(水)开始，45分钟变成80％B(70％乙腈水溶液))洗脱蛋白质。酰基转移酶以相应于α和β亚单位的两个峰被洗脱。因为从活性位点滴定率实验计算的样品的酰基转移酶含量与从HPLC数据计算的酰基转移酶含量一致，所以用PMSF不能很好滴定的酰基转移酶突变体用于RP-HPLC以便测定酰基转移酶含量。
用NIPAB作为底物测定青霉素酰基转移酶活性。
酶测定
为了测定酶促活性，于室温下将酰基转移酶与底物一起在缓冲液中温育。在预计β-内酰胺酶杂质存在于酶制剂中时，在测定中添加1.0mM β-内酰胺酶抑制剂6-溴-青霉酸。通过添加过量的PMSF终止反应。对于对PMSF抑制不太敏感的一些突变体，提高添加0.5MHCl或0.5M醋酸直到pH值在3和4之间来终止反应。当反应物接着用HPLC分析时，通过用相应的洗脱溶剂(参见表1)稀释终止反应。此外，将底物在缺少酶的情况下在测定条件下温育。如果需要，酶测定可以由非酶促水解校正。
用高效液相色谱(HPLC)测定反应混合物的组成(表1)。用已知的浓度标准确定浓度。
表1
用高效液相色谱(HPLC)分析反应混合物的组成的方法。通过用右栏所示的合适溶剂稀释反应混合物终止反应。检测在214nm进行。流速1ml/min。SDS＝十二烷基硫酸钠。
    样品             柱                  溶剂
PenG与溶剂A1∶1 CP-Microspher C18(chrompack，cat.no 28410) A：30％乙腈，在具有0.75g/l SDS的0.1M KH2PO4(pH3)中
PenV与溶剂A1∶1 CP-Microspher C18 A：30％乙腈，在具有0.75g/l SDS的0.1M KH2PO4(pH3)中
CefG与溶剂A1∶1 CP-Microspher C18 A：20％乙腈，在具有0.68g/l SDS的0.05M KH2PO4(pH3)中
氨苄青霉素与溶剂A 1∶3 CP-Microspher C18 A：15％乙腈，在具有0.68g/l SDS的0.05M KH2PO4(pH3)中，6分钟B：50％乙腈，15分钟
PGA与溶剂A1∶1 CP-Microspher C18 A：25％乙腈，在具有0.68g/l SDS的0.05M KH2PO4(pH3)中
阿莫西林与溶剂A 1∶2 Chromspher C18(chrompack，cat.no28267) A：25％乙腈，在具有2g/l SDS的0.012M KH2PO4(pH2.6)中
氨苄青霉素，PGA，PG，6APA混合物 Chromspher C18 A：30％乙腈，在具有0.68g/l SDS的0.005M KH2PO4(pH3)中
在低浓度时，经用荧光胺滴定测定6-APA，7-ACA或7-ADCA的形成。经在用390毫微米激发后测定在475毫微米的荧光确定浓度。此外用与p-二甲氨基苯甲醛的指示性反应测定。接着在415毫微米测定席夫碱的形成(K.Balasingham等，生物化学生物物理学报276(1972)250-256)。
在继续测定中，青霉素G酰基转移酶用生色底物NIPAB(6-硝基-3-苯乙酰氨基-苯甲酸)经分光光度法测定。通过在Kontron 610动力学分光光度计测定在405毫微米的消光监测6-硝基苯甲酸的释放。为测量最大速率，测定在25℃下进行，采用20mM NaH2PO4H2O(pH7.5)及20mMNIPAB和100微升酶溶液(以合适的稀释度)。用NIPAB的不同浓度进行起始速率的测定。
用辐射计pH-stat也经碱滴定研究PenG，PenV，CefG的酶促水解的动力学。所有实验都在无缓冲液的介质中进行。
用超过酶的过量底物进行起始速率测定。催化参数来自根据Michaelis-Menten方程式为各种底物浓度作图的测定的起始速率的最小矩形适配(squares fitting)。
经温育酰基氨基酸和酶进行用于筛选的酰化的L-氨基酸的脱酰作用。接着用基于与O-phthaldehyde和巯基-乙醇反应的方法标记脱酰基化的氨基酸，并用反向HPLC定量。
在pH-stat或缓冲液中进行合成反应。典型的使用的条件是：10mMPGA，PH7.0，30℃和30mM 6-APA。经HPLC定量分析产物。
试验酰基转移酶的反应条件取决于各种参数，特别是反应试剂，反应时间，温度和酶浓度。优选的条件可以容易由本领域技术人员确定，一般地，反应温度可以在0℃和40℃之间变化。
可以由本发明的突变酰基转移酶产生的半-合成β-内酰胺的例子是阿莫西林，氨苄青霉素，氯氨苄头孢菌素，头孢羟氨苄，cefprozil，头孢力新，以及头孢拉定。
所述的酰化剂可以是D(-)-苯基甘氨酸，D(-)-4-羟基苯基甘氨酸或D(-)-2，5-二氢-苯基甘氨酸的衍生物，如低级烷基(甲基，乙基，正丙基和异丙基)酯或在-CONH2基团上未取代的酰胺。
一般地，本发明的方法的反应温度可以在0℃和35℃之间变化。
实施例
实施例1
探讨在青霉素G-酰基转移酶：PenG复合物中青霉素G的环境并鉴别影响青霉素G酰基转移酶的催化性质的残基位置
用Connolly算法计算粪产碱菌青霉素G酰基转移酶活性位点的溶剂易接近的表面。探针大小是1-4。利用分子图表的可接近性轮廓分析揭示出一个深的腔室，其邻近β-亚单位N-末端丝氨酸，这种丝氨酸由溶剂易接近。计算机辅助分析显示苯乙酸盐非常适合在该腔室中。在将苯乙酸盐置入该腔室后，β-亚单位N-末端丝氨酸便在亲核试剂在PenG的肽羰基上进攻的最理想的位置上。
在后续步骤中，β-内酰胺部分将被置入，而保持苯基-乙酰基基团固定在其结合区中。尽量避免底物和酶之间的原子重叠，而使阳性相互作用最大化。对结合有贡献的阳性相互作用是氢键合，静电相互作用和有利的VanderWaals接触。从被与底物的相互作用掩盖的易接近的非极性表面估计疏水相互作用。
在手工操作后，附加计算技术用于优化底物-酶复合物。用CVFF力场(forcefield)(Biosym Technologues)完成复合物的能量最小化和分子动力学。在一些分散的步骤中完成最小化。当第一衍生物的能量小于0.01kcal/mol时停止最小化。
-首先，复合的PenG底物被最小化而保持酰基转移酶原子固定，丝氨酸B1 OG到PenG易裂开的羰基碳的距离限制在2和3.5之间。不考虑电荷。
-然后，使酰基转移酶的氢原子变化。
-其后，使在PenG底物的12内具有至少一个原子的侧链变化，而保持骨架固定。丝氨酸B1 OG到PenG易裂开的羰基碳的距离仍然限制在2和3.5之间。不考虑电荷。
-在侧链优化之后，也使主链移动。由于连接主链原子，第一移动是受到限制的。约束力逐渐缓和。
将由这一方法获得的起始模型用于分析PenG分子的环境。图4a显示形成PenG底物的苯乙酸盐部分的结合位点的残基。所涉及的链区段包括：A139至A152，B1，B2，B20至B25，B31，B32，B49至B52，B56，B57，B65至B72，B154至B157，B173至B179，B239至B241，B478至B480。表2显示了在从PenG苯乙酰部分8的范围内具有至少一个原子的残基。其给出了与青霉素分子的侧链部分相互作用的残基的概况。催化作用必需残基不应被取代，因为取代基导致严重的降低或灭活酰基转移酶。这些残基包括：B：丝氨酸I，B：谷氨酰胺23，B：天冬酰胺241。
粪产碱菌青霉素G酰基转移酶中为结合青霉素侧链之特别目标的残基是：A：蛋氨酸143，A：苯丙氨酸147，B：脯氨酸22，B：苯丙氨酸24，B：酪氨酸31，B苏氨酸32，B：脯氨酸49，B：酪氨酸52，B：亮氨酸56，B：苯丙氨酸57，B：甘氨酸66，B：丙氨酸67，B：苏氨酸68，B：丙氨酸69，B：甘氨酸70，B：脯氨酸71，B：色氨酸154，B：缬氨酸157，B：蛋氨酸173，B：异亮氨酸175，B：丝氨酸176，B：异亮氨酸177，B：色氨酸179。
此外，β-内酰胺部分6-APA的环境被作图。表3显示了在从PenG6-APA部分中的原子8的范围内具有至少一个原子的残基。表4b显示了形成PenG底物的β-内酰胺部分的结合位点的残基。所涉及的链区段包括：A146至A150，B21至B27，B71，B250至B263，B379至B387，B390，B454至B456，B474至B477。图4b显示了集中在β-内酰胺部分残基上的粪产碱菌青霉素G酰基转移酶活性位点。
粪产碱菌青霉素G酰基转移酶中为结合青霉素β-内酰胺部分之特别目标的残基是A：精氨酸146，A：苯丙氨酸147，A：苏氨酸150，B：甘氨酸25，B：酪氨酸27，B：丙氨酸69，B：脯氨酸71，B：苏氨酸251，B：苏氨酸253，B：酪氨酸254，B：酪氨酸255，B：色氨酸256，B：精氨酸261，B：蛋氨酸262，B：天冬酰胺379，B：脯氨酸380，B：甘氨酸381，B：丝氨酸382，B：异亮氨酸383，B：天冬酰胺384，B：蛋氨酸387，B：赖氨酸390，B：苏氨酸477，B：谷氨酸478。
表2：苯乙酰部分在与PenG复合的青霉素G酰基转移酶中的环境
酰基转移酶中在离PenG一定距离范围内的原子。仅给出了最靠近的原子。距离用表示。原子表示法：链-残基编号：原子
PenG原子(图3) 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8
C15 B1:OGB23:O A147:CZB69:CBB241:ND2 B22:CB24:CD2B68:C B2:NB21:OB67:OB382:OG A147:CZB25:NB70:NB71:CGB240:CD1B256:CZ2B261:CZB477:OG1
O16 B1:CBB69:NB241:ND2 A147:CE2B23:OB68:CA B2:NB21:OB22:CAB24:CE2B67:OB70:NB71:CG B176:OB177:CD1B178:ND2B239:OD1B240:CD1B256:CZ2B261:CZB352:OG
C17 B1:OGA147:CE2B23:OB24:CD2 B22:CB69:CB B68:CAB241:ND2 A146:CZB21:OB25:NB57:CZB67:O A143:SDB2:NB31:CE2B56:CD2B70:NB177:CD1B477:OG1
C18 B24:CE2 A147:CZB1:CBB22:CBB23:OB68:CAB69:CB B57:CZB67:OB241:ND2 A143:SDB21:OB56:CD2B177:CD1 A146:CZB2:NB20:ND2B31:CE2B49:CGB70:NB177:CG1B477:OG1
C19 A147:CGB24:CE2B69:N B1:OGB68:C A143:SDB22:CBB23:OB56:CD2B67:CB177:CD1B241:ND2 B57:CZB70:N A142:OA146:CB31:CE2B49:CGB71:CDB154:CZ2B176:OB178:N
C20 B69:N A143:SDA147:CBB24:CE2B56:CD2B67:CBB68:CB177:CG2 B1:OGB22:CBB57:CZB154:CZ2 B23:OB49:CGB70:NB176:OB178:NB241:ND2 A142:OA146:CB20:ND2B31:CE2B52:CE1B66:CB71:CDB173:CEB175:CG2
表2(续)：苯乙酰部分在与PenG复合的青霉素G酰基转移酶中的环境
酰基转移酶中在离PenG一定距离范围内的原子。仅给出了最靠近的原子。距离用表示。原子表示法：链-残基编号：原子
 PenG原子(图3)  3-4  4-5  5-6  6-7  7-8
 C21  B24:CE2B56:CD2  A143:CEB22:CBB57:CZB67:CBB68:NB69:N  A147:CD1B1:OGB49:CGB56:CGB154:C22B177:CG2  B20:ND2B23:NB66:CB176:O  B21:CB31:CE2B52:CE1B70:NB176:OB179:CD1B241:ND2
 C22  B22:CBB24:CE2B57:CZ  B1:OGB56:CD2B67:OB68:CA  A143:CA147:CB49:CG  B20:ND2B21:CB23:OB31:CE2B66:CB69:CBB154:CZ2B177:CG2  B2:OB32:CG2B52:CE1B178:OB41:ND2B478:OE1
 C23  B1:OGB22:CBB24:CD2  B23:NB57:CZB67:OB66:CAB69:N  A147:CE1B49:CGB56:CD2  A143:CEB20:ND2B21:CB31:CE2B241:ND2  A146:CZB2:NB32:CG2B56:CBB154:CZ2B177:CG2B476:OE1B477:OG1
表3：6-APA部分在与PenG复合的青霉素G酰基转移酰中的环境
酰基转移酶中在离6-APA部分PenG一定距离范围内的原子。仅给出了最靠近的原子。距离用表示。原子表示法：链-残基编号：原子
 PenG原子(图3)  3-4  4-5  5-6  6-7  7-8
 S1  A147:CE2  B23:O  A146:NEB24:CA  B1:OGB25:NB69:CBB241:OD1B256:CZ2B361:CAB382:N  B380:CB455:CG
 C2  A147:CE2B23:O  B381:CA  A146:NEB24:NE25:NB241:OD1B256:NE1B380:CB382:CA  B1:NB69:CBB261:CZB379:OD1B383:NB384:ND2
表3(续)：6-APA部分在与PenG复合的青霉素G酰基转移酶中的环境
酰基转移酶中在离6-APA部分PenG一定距离范围内的原子。距离用表示。原子表示法：链-残基编号：原子
 PenG原子(图3)  3-4  4-5  5-6  6-7  7-8
 C3  B256:CZ2B382:OG  A147:CE2B23:OB241:OD1  B1:NB241:CGB261:CZB381:CAB384:ND2  A146:NEB24:NB25:NB89:CBB256:CGB379:OD1B380:OB383:N
 N4  A147:CE2B241:OD1B256:CZ2  B23:OB69:CBB382:OG  B1:NB71:CGB261:CZB384:ND2  B24:NB381:CA
 C5  A147:CE2  B69:CB  B23:OB241:OD1B256:CZ2  A146:OB1:OGB24:CAB71:CGB256:CE2B382:OG  A150:CG2B25:NB261:CZB381:CA
 C6  A147:CE2  B1:OGB23:OB69:CBB241:OD1  B256:CZ2  B24:NB58:CB71:CGB261:CZ382:OGB  B2:NB22:CB70:NB240:CB241:NB384:ND2
 C7  B241:OD1  A147:CE2B1:NB256:CZ2B362:OG  B23:OB69:CBB261:CZ  B71:CGB240:O  B2:NB24:NB68:CB254:CE1B381:CAB384:CG
 O8  B1:OD1B241:OD1B382:OG  B23:OB256:CZ2B261:CZ  A147:CE2B240:NE1B384:ND2  B69:CBB241:CAB381:C  B2:NB22:CB24:NB71:CGB383:OB390:NZ
 C9  B23:ON382:N  B381:CA  A147:CE2B24:CAB25:NB380:O  A146:CZB1:OGB241:OD1B379:OD1B383:N  B22:CB26:CZ3B27:OHB256:CZ2B261:CZB384:ND2B477:OG1
表3(续)：6-APA部分在与PenG复合的青霉素G酰基转移酶中的环境
酰基转移酶中在离6-APA部分PenG一定距离范围内的原子。距离用表示。原子表示法：链-残基编号：原子
PenG原子(图3) 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8
 C10 A147:CE2B23:OB380:OB381:CA A146:CZB24:CB25:NE379:OD1B380:CB381:OB382:OG B256:NE1
 C11 B256:NE1 B382:OG A147:CE2B241:OD1B384:ND2 A150:CG2B23:OB69:CBB71:CGB261:CZB331:CA
 O12 B256:NE1 A147:CE2 A150:CG2 A146:OB23:OB69:CBB71:CGB241:OD1B382:OGB384:ND2
 O13 B256:NE1 B382:OGB384:ND2 A147:CE2B241:OD2B255:CD1B256:CE3B379:OD1B381:CAB383:NB384:N
实施例2
酰基转移酶诱变/表达载体的构建
使用已描述的质粒pMcTANde(EP-453048)作为构建组合诱变/表达载体的起始材料。这一载体从pMcTNde和pAF1构建，包含完全的粪产碱菌青霉素酰基转移酶基因。为了有利于方便插入双分子的构建，并且有利于交换PCR重叠延伸片段，插入三个新的不改变编码信息的单一限制位点：EcoRV(5239位)，Nsil(5972位)和Clal(6420位)。所形成的载体pMcAF示于图5中，将其用于构建突变的酰基转移酶基因。突变的酰基转移酶在大肠杆菌WK6或HB101 laqIq中在规定的启动子控制下产生。
实施例3
粪产碱菌酰基转移酶的诱变
用以前描述的PCR重叠延伸方法产生在选择位置上的氨基酸的突变。表4中示出了各亚单位(A或B)中的氨基酸位置。也示出了用于构建的寡核苷酸。需指出的是，在位置A143和B67，B68，B69上，使用具有随机密码子的寡核苷酸。
实施例4
用合适的营养缺陷型大肠杆菌进行青霉素酰基转移酶的正确折叠和翻译后加工的位点定向诱变的试验
在包含选择培养基的琼脂平板上试验鉴别的突变酰基转移酶基因的大肠杆菌HB101 laqIq细胞。
按Garcia(同上)描述的方法制备苯乙酰L-亮氨酸(fal)选择培养基。基本平板如下：M9基本琼脂，1mg/l硫胺素，10mg/l L-脯氨酸，0.2mM IPTG和合适的抗生素(50μg/ml氯霉素(cap)或25μg/ml氨苄青霉素(amp))。有关青霉素酰基转移酶表达的文献的可供使用的数据表明处理的链的适当的折叠和翻译后加工是获得催化上稳定的青霉素酰基转移酶的关键因素。为了确定突变的青霉素酰基转移酶是否作为酰基的活性酰基转移酶适当地被表达，将200微克/毫升酰基L-亮氨酸包含进基本培养基。唯一的在苯基-酰基-L-亮氨酸存在下生长的大肠杆菌HB101(Leu-)的转化体和突变体被认为携带活性的合适表达的酰基转移酶基因。表5显示了几种选择的突变体的结果。
此外，这种方法可以用于初步筛选具有改变的特异性的酰基转移酶。为了选择酰基的酰基转移酶的侧链特异性，将200微克/毫升所需的酰基L-亮氨酸包括进基本平板。在酰基部分不能被野生型青霉素酰基转移酶识别的情况下，唯一的在所需的酰基L-亮氨酸存在下生长的大肠杆菌HB101(Leu-)的转化体和突变体被认为携带具有所需特异性的酰基转移酶基因(例如戊二酰-L-亮氨酸)。这样的选择性底物的例子是α-D-氨基己二酰亮氨酸，己二酰-亮氨酸和戊二酰亮氨酸。这些化合物从LGSS(TransferbureauNijmegen，荷兰)购买。
表4
用于PCR突变的合成DNA-寡核苷酸
(X＝所有可能的氨基酸)
(R＝A或者G；Y＝C或者T；S＝C或者G；W＝A或者T；B＝C，G或者T；V＝A，C，G；N＝A，C，G或者T)
 A.A.-位置   A.A.-突变   DNA-寡核苷酸：5’-3’
  A143   M:R，K 5’GGGTGGGCTCCARGGCCAATCG 3’5’GCGATTGGCCYTGGAGCCCAC 3’
  A147   F:Y，HF:W 5’TGGGCT CCATGGCCAATCGCYACTCCGACACGAA3’5’TGGGCT CCATGGCCAATCGCTGGTCCGACACGAA 3’
  B24   F:R，K 5’CGGCCCACAGARGGGCTGGTACA3’5’GTACCAGCCCYTCTGTGGGCC 3’
  B56   L:R，KL:HL:G，A，V 5’TCCGATCGTAARGTTTGGCACC 3’5’GGTGCCAAACYTTACGATCGGAT 3’5’TCCGATCGTACATTTTGGCACC 3’5’GGTGCCAAAATGTACGATCGGAT 3’5’CCGATCGTAGBCTTTGGCAC 3’5’GTGCCAAAGVCTACGATCGG 3’
  B71   P:F，Y 5’GCTGGCTWCCAAGATGTGGTG 3’5’ATCTTGGWAGCCAGCAGTCGC 3’
  B177   I:R，KI:HI:V，MI:S，T 5’GATGGC GATATCCARGAACTGGTACTA 3’5’GATGGC GATATCCCACAACTGGTACTA 3’5’CAGCAAGATGGCGATATCCRTGAACTGGTACTACGC 3’5’CAGCAAGATGGCGATATCCASCAACTGGTACTACGC 3’
  A143   M:X 5’GGGTGGGCTCCNNSGCCAATCGCTTCTC 3’5’AAGCGATTGGCSNNGGAGCCCACCCAG 3’
  B67   A:S，G，TA:S，G 5’GGGR/SCACTGCTGGGCCTCAAG 3’5’AGTGS/YCCCCCAGGCAATCTC 3’5’GCCTGGGGGRCACTGCTGGCCCGCAAG 3’5’GCCAGCAGTGCYCCCCCAGGCAATCTC 3’
  B67B68B69   A:XT:XA:X 5’CGAGATTGCCTGGGGGNNSNNSNNSGGCCCGCAAGATGTGGTGGAC 3’5’CCACATCTTGCGGGCCSNNSNNSNNCCCCCAGGCAATCTCGC 3’
当野生型具有对酰基基团的低活性时，可以通过将突变体产生的晕圈的大小与野生型的比较用这一方法挑选出具有增加的活性的突变体。有用的侧链是苯氧乙酰基，p-羟苯基甘氨酰基，苯基甘氨酰基。
表5
突变的酰基转移酶的体内特异性。第一栏中A和B指α和β亚单位。++，可与野生型比较的生长率；+，与野生型比较生长率降低；-，在3周期间不生长。
    突变体 苯乙酰基-L-亮氨酸
    A：M143RA：M143K     ++
    A：F147YA：F147HA：F147W     ++++++
    B：F24RB：F24K ++
    B：L56RB：L56KB：L56H ++
    B：I177RB：I177KB：I177H ++++
也可以变化选择底物的氨基酸部分代之以亮氨酸。在这样的情况下，将合适的营养缺陷型突变体大肠杆菌用于选择。此外，酰基部分的酰胺对选择也是有用的化合物。将侧链酰胺(例如，苯乙酰胺，戊二酰胺，己二酰胺，α-D-氨基己二酰胺)以15mM的终浓度添加到基本M9培养基中，所述培养基补加有作为碳源的0.2％琥珀酸、甘油或葡萄糖以及硫胺素(1微克/毫升)，L-脯氨酸(10毫克/毫升)，0.2毫米IPTG和合适的抗生素。
所有基本培养基中的铵盐都由包含钠离子或钾离子的相应的盐代替，以保证在酰胺上的选择生长。具有所需侧链的酰胺从化学品供应商购得或按标准技术制备。大肠杆菌菌株JM101，WK6和HB101用作选择具有对选择的酰胺的特异性的突变基因的宿主。
实施例5
试验青霉素酰基转移酶定向随机突变体
在TRM诱变的情况下，在DNA测序前，将突变体样品平板接种到选择平板上。仅确定在一种或多种选择培养基中生长的菌落的特征。表6中显示了2个TRM诱变实验的结果。
表6
突变的酰基转移酶的体内特异性。第一栏中A和B指α和β亚单位。++，可与野生型比较的生长率；+，与野生型比较生长率降低；-，在3周期间不生长。
    突变体     苯乙酰基-L-亮氨酸
    A：M143CA：M143GA：M143DA：M143TA：M143VA：M143L     ++++++++++
实施例6
增加的比活和改变的特异性
测定粪产碱菌PenG酰基转移酶突变体对不同底物的催化参数。突变体改变的特异性在表7和8中以例说明。与野生型比较，突变体A：M143V和B：L56K显示出对PenV和CefG的脱酰作用更高的周转速率，，当用于D-苯基甘氨酰胺脱脱酰胺时，A：F147Y与野生型比较活性更强。
在高的底物浓度(在许多工业转化过程中常见的情形)下，酰基转移酶将被底物完全饱和，结果是转化以最大速度进行。在图6中，将一些底物的最大速度对野生型粪产碱菌酰基转移酶和某些突变体作图。相对于PenG(其Vmax设置为1)确定了速率的等级。如同所期待的，野生型PenG酰基转移酶显示出对PenG最高的活性。然而取代A：M143V把酶转变成为CefG酰基转移酶，而取代A：F147Y把酶转变成为D-苯基甘氨酰胺((D)PGA)的脱酰胺作用的强的酰胺酶。此外，A：F147Y对氨苄青霉素和NIPAB的脱酰作用速度比对PenG的高。在图7中，用与图6类似的方式比较突变体B：L56G，B：L56A，B：LS6V，B：177V，B I177S，B：A67S，B：A67G对给定底物的测得的Vmax值和PenG的Vmax值。相对野生型而言，特异性发生变化。
例如，突变体B：I177S显示出在氨苄青霉素上的减少的脱酰作用速率和在D-苯基甘氨酰胺((D)PGA)上的提高的活性。
一般来说，在两个竞争性底物之间酶的特异性或者选择性的区别通过比较两个底物的比率Vmax/Km(Kcat/Km)确定。
表9中比较了不同底物组合的比率。尤其是A：F147Y突变体对(D)PGA的特异性的大量增加是非常显著的。
表9
野生型酶与突变体比较对一些底物的选择性
(Vmax/Km)S1/(Vmax/Km)S2(×100) 野生型 A：M143V B：L56K A：F147Y
    S1     S2
    PenVCefGPenVAmpi(D)PGA     PenGPenGCefGPenGAmpi     0.9754.951.7614.809.50     4.93119.334.1322.704.10     1.217.0017.353.403.00  1.1044.442.4835.30367.60
表7
测定的野生型粪产碱菌PenG酰基转移酶的某些突变体的催化参数Km和Vmax。试验条件：NIPAB，0.1M NaH2PO4，pH7.5，25℃；PenG和PenV，40mM NaH2PO4，pH7.5，，37℃；CefG，20m M NaH2PO4，pH7.5，37℃；阿莫西林，氨苄青霉素和D-苯基甘氨酰胺((D)PGA)，20mM NaH2PO4，pH7.0，37℃。
        野生型          A：143V         B：L56K       A：F147Y
 Km(μM)   Vmax(U/mg)  Km(μM)   Vmax(U/mg) Km(μM)   Vmax(U/mg) Km(μM)   Vmax(U/mg)
  NTPABPenGPenVCefGAmpi(D)PGAAmoxi     42181700860014000     37.045.54.012.523.527.5.9     17631715003500021000     35.740.510.356.423.022.2.2   2813510170049000     47.336.415.525.520.918.2   545162600170019000     18.05.90.84.013.632.70.1
表8
测定的野生型粪产碱菌PenG酰基转移酶和某些突变体的催化参数Km和Vmax。试验条件：NIPAB，0.1M NaH2PO4，pH7.5，25℃。突变体B：A67S和B：A67G Vmax以U/ml表示。
    Km(μM)     Vmax(U/mg)     Vmax/Km
    wt AFB：L56GB：L56AB：L56VB：I177VB：I177SB：A67SB：A67G     4121491076511     37.021.337.128.234.530.27.11.1     9.31.82.73.13.50.4
实施例7
PenG酰基转移酶提高的特异性
野生型粪产碱菌和大肠杆菌PenG酰基转移酶显示出对具有α-碳取代的侧链的青霉素的D-对映异构体的活性。例子是氨苄青霉素，头孢氨苄，阿莫西林，羟氨苄头孢菌素及氯氨苄头孢菌素。为了获得在转化具有手性化合物的外消旋混合物时表现出提高的对映异构体过量的青霉素G酰基转移酶，青霉素G酰基转移酶提高的立体特异性是所需的。这种性质使得青霉素G酰基转移酶在从α-碳取代的苯乙酰侧链的外消旋混合物或激活的α-碳取代的苯基-乙酰基侧链的衍生物(例如，苯基甘氨酸-酰胺或其酯，P-羟苯基甘氨酸-酰胺或其酯等)合成具有旋光纯度的半合成抗生素上特别有用，所说衍生物包含手性α碳原子，这是因为其存在氨基基团(例如，氨苄青霉素，头孢氨苄，阿莫西林，羟氨苄头孢菌素，氯氨苄头孢菌素)或羟基基团(头孢羟苄唑)。
表10示出了对苯基甘氨酰胺而言，野生型PenG酰基转移酶表现出对D-对映异构体的活性。对D和L苯基甘氨酰胺的外消旋混合物(1∶1)，VD/VL等于(Vmax/Vm)D-PGA/(Vmax/Vm)L-PGA，其中，VD和VL分别代表D和L对映异构体的脱酰胺作用的速度，对野生型粪产碱菌，D异构体的脱酰胺速度快于L异构体的5倍。对突变体A：P143Y，以(Vmax/Vm)D- PGA/(Vmax/Vm)L-PGA表示的立体选择性从5.10增加至36.52。这意味着D异构体脱酰胺速度比野生型的快36.52倍，而L异构体仅快5.10倍。
表10
野生型粪产碱菌和大肠杆菌酶与突变体对DL-苯基甘氨酰胺(PGA)的立体选择性。测定条件，DL-苯基甘氨酰胺：20mM NaH2PO4，pH7.0，37℃
    (Vmax/Km)D-PGA/(Vmax/Km)L-PGA
    野生型大肠杆菌野生型粪产碱菌A：M143VB：L56KA：F147Y     3.325.105.703.2536.52
实施例8
降低的产物抑制性
随着在405nm吸收的增加，在20，50和100μM NIPAB时，NIPAB的完成转化是时间的函数。这一转化的产物是苯乙酸和3-氨基-6-硝基苯甲酸。转化在0.1M NaH2PO4缓冲液(pH7.5)中25℃下进行。当考虑苯乙酸的产物抑制作用时，NIPAB的脱酰作用的进程曲线能吻合得很好。表11中示出了可从进程曲线中得出的苯乙酸的分解常数(通常指抑制常数Ki)。表12中示出了对产物抑制作用比较不敏感的突变体的带来的益处。用突变体获得的产量在一定的时间期限内比用野生型的要高。此外，为了获得一定的产率，要求突变体具有短的转化时间。
PenG的转化通常在高达200mM的浓度下进行。采用相同量的PenG单位，突变体A：M143V在20分钟内的转化率可达90％，而野生型在这一时间期限内达84％。
表11
苯乙酸(PA)对PenG酰基转移酶的抑制作用。Ki(抑制常数PA)代表分解常数。在25℃下，0.1M NaH2PO4缓冲液(pH7.5)中测定催化参数。
  Ki 苯乙酸(μM)
    wt AF     11
    B：156K     115
    B：L56V     31
    B：L56A     59
    B：L56G     55
    B：A67G     65
    B：I177S     252
    B：I177V     35
    A：M143V     74
表12
NIPAB转化随时间的进程。产率代表已转化的底物组分。在0.1M NaH2PO4缓冲液(pH7.5)中25℃下用0.1单位的酶(NIPAB单位)进行200μMNIPAB的转化。
    产率(％)15min     产率(％)30min
    wt AF     61.8     91.8
    B：L56A     61.3     93.3
    B：L56G     62.3     94.5
    B：A67G     63.8     96.4
    A：M143V     60.5     92.7
实施例9
改变的氨基/水解摩尔比率。用PenG酰基转移酶从从(D)苯基甘氨酰胺(D-PGA)和6APB合成氨苄青霉素
向包含(D)苯基甘氨酰胺和6APA的缓冲液中添加PenG酰基转移酶野生型或者突变体。在不同的时间间隔分析样品，并且按照在实验段中所描述的方法测定样品的组合。结果在表13和14中示出。某些突变体显示出改善的氨解/水解摩尔比率。
表13
在由PenG酶合成氨苄青霉素中获得的氨解或合成对水解(S/H)的摩尔比率。起始浓度12.4mM D-PGA和62mM氨苄青霉素。实验条件：0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH7.8，温度4℃，酶用量为每毫升0.7 NIPAB单位。
  氨解/水解摩尔比：氨苄青霉素/D-苯基甘氨酸
  t＝5min   t＝15min   t＝30min  t＝60min
  wt AFA：M143VB：L56GB：I177S   0.950.750.780.30   0.920.921.030.79   0.690.941.021.05   0.360.710.791.17
表14
在由PenG酶合成氨苄青霉素中获得的氨解或合成对水解(S/H)的摩尔比率。起始浓度10mM D-PGA和30mM氨苄青霉素。实验条件：0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH7.8，温度25℃，酶用量为每毫升1.4D-PGA单位。
   氨解/水解摩尔比：氨苄青霉素/D-苯基甘氨酸
    t＝10min     t＝30min     t＝60min
  wt AFA：M143V     0.430.50     0.200.31     0.060.15

Claims (10)

1.一种具有下列特征的分离的突变原核生物青霉素G酰基转移酶：-在相应于粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)青霉素G酰基转移酶的以下一个或多个位置上具有氨基酸取代：A143，A147，B20至B27，B31，B32，B49至B52，B56，B57，B65至B72，B154至B157，B173至B179，B239至B241，B250至B263，B379至B387，B390，B455，B474至B480；和
-具有相对于相应的野生型未取代的青霉素G酰基转移酶来说的改变的底物特异性或者改变的比活。
2.按照权利要求1的突变的酰基转移酶，其中所说的酰基转移酶来源于粪产碱菌。
3.按照权利要求2的突变的酰基转移酶，其在以下一个或多个位置上具有氨基酸取代：A143，A147，B22，B24，B25，B27，B31，B32，B49，B52，B56，B57，B66，B67，B68，B69，B70，B71，B154，B157，B173，B175，B176，B177，B179，B239，B240，B251，B253，B254，B255，B256，B261，B262，B379，B380，B381，B382，B383，B384，B390，B455，B477或B478。
4.按照权利要求3的突变的酰基转移酶，其中所说的氨基酸取代是下列一种：
A143(蛋氨酸)取代成精氨酸，赖氨酸，半胱氨酸，甘氨酸，苏氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，亮氨酸或任何其它氨基酸；
A147(苯丙氨酸)取代成酪氨酸，组氨酸或者色氨酸；
B24(苯丙氨酸)取代成精氨酸或赖氨酸；
B56(亮氨酸)取代成精氨酸，赖氨酸，组氨酸，甘氨酸，丙氨酸或缬氨酸；
B177(异亮氨酸)取代成精氨酸，赖氨酸，组氨酸，缬氨酸，蛋氨酸，丝氨酸或苏氨酸；
B71(脯氨酸)取代成苯丙氨酸或酪氨酸：或
B67(丙氨酸)，B68(苏氨酸)或B69(丙氨酸)取代成任何其它氨基酸。
5.一种编码以上权利要求之任一中限定的突变的酰基转移酶的核酸序列。
6.一种包含权利要求5中限定的核酸序列的表达载体，其可操作连接到能指导其在宿主细胞中表达的启动子上。
7.一种用如权利要求6中限定的表达载体转化的原核生物。
8.一种制备按照以上权利要求1-4之任一中限定的分离的突变的酰基转移酶的方法，该方法包括：
-培养如权利要求7中限定的原核生物，从而产生所说的突变的酰基转移酶；和
-分离所说的酰基转移酶。
9.一种用于脱酰化6-酰化青霉酸、7-酰化(去乙酸基)头孢菌酸或者它们的盐或酯，分别形成相应的6-氨基青霉酸或7-氨基(去乙酸基)头孢菌酸或它们的盐或酯的方法，该方法包括在适于发生脱酰化的条件下使所说的6-酰化的或者7-酰化的化合物与权利要求1-4任一中限定的突变的酰基转移酶接触。
10.用于产生半-合成6-酰化青霉酸，7-酰化(去乙酸基)头孢菌酸或者它们的盐或酯的方法，该方法包括在适于发生酰化的条件下分别使相应的6-氨基或者7-氨基β-内酰胺或者它们的盐或酯与具有权利要求1-4之任一中限定的突变的酰基转移酶的酰化剂接触。
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