ES2645963T3 - Una célula fermentadora de azúcar pentosa - Google Patents

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Abstract

Una célula que es capaz de fermentación y de uso de xilosa como fuente de carbono, célula que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una xilosa isomerasa, donde la secuencia de aminoácidos de la xilosa isomerasa tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO 2 y donde la secuencia de nucleótidos es heteróloga al huésped.

Description

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nucleótidos de referencia que codifiquen una transaldolasa. La secuencia de nucleótidos que codifica para la transcetolasa se designa aquí como TAL1.
Diversos medios son conocidos por los expertos en la técnica para la expresión y sobreexpresión de enzimas en una célula de la invención. En particular, una enzima puede ser sobreexpresada incrementando el número de copias del gen que codifica la enzima en la célula huésped, por ejemplo, integrando copias adicionales del gen en el genoma de la célula huésped, expresando el gen por un vector de expresión multicopias episomal o introduciendo un vector de expresión episomal que comprenda múltiples copias del gen.
Como alternativa, la sobreexpresión de las enzimas en las células huésped de la invención puede alcanzarse utilizando un promotor que no sea nativo a la secuencia que codifique para la enzima que va a ser sobreexpresada, esto es un promotor que sea heterólogo a la secuencia de codificación a la cual esta enlazado de forma operativa. Aunque el promotor preferiblemente es heterólogo a la secuencia de codificación a la cual está enlazado de forma operativa, también se prefiere que el promotor sea homólogo, esto es endógeno a la célula huésped. Preferiblemente el promotor heterólogo es capaz de producir un nivel de estado de equilibrio más alto del transcrito que comprende la secuencia de codificación (o es capaz de producir más moléculas transcritas, esto es, moléculas de ARNm, por unidad de tiempo) que el promotor que es nativo para la secuencia de codificación, preferiblemente bajo condiciones donde la xilosa o la xilosa y la glucosa están disponibles como fuentes de carbono, más preferiblemente como fuentes de carbono principales (esto es más del 50% de la fuente de carbono disponible consiste de xilosa o xilosa y glucosa), lo más preferiblemente como fuentes únicas de carbono. Los promotores adecuados en este contexto incluyen tanto promotores constitutivos como inducibles naturales así como promotores manipulados. Un promotor preferido para su uso en la presente invención será además insensible a la represión del catabolito (glucosa) y/o preferiblemente no requerirá xilosa para su inducción. Los promotores que tienen estas características están ampliamente disponibles y son conocidos para las personas experimentadas en la técnica. Ejemplos adecuados de tales promotores incluyen por ejemplo promotores de genes glicolíticos, tales como la fosfofructoquinasa (PFK), triosa fosfato isomerasa (TPI), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GPD, TDH3 o GAPDH), piruvato quinasa (PYK), fosfogliceratoquinasa (PGK) como promotores de levaduras u hongos filamentosos; más detalles acerca de tales promotores provenientes de levaduras pueden ser encontrados en (WO 93/03159). Otros promotores útiles son proteínas ribosomales que codifican promotores de genes, el promotor de gen lactasa (LAC4), promotores de alcohol deshidrogenasa (ADHI, ADH4, y similares), y el promotor enolasa (ENO). Otros promotores, tanto constitutivos como inducibles, y potenciadores o secuencias de activación de corriente arriba serán conocidos para los expertos en la técnica. Los promotores utilizados en las células huésped de la invención pueden ser modificados, si se desea, para afectar sus características de control.
La secuencia de codificación utilizada para la sobreexpresión de las enzimas mencionadas más arriba puede ser preferiblemente homóloga a la célula huésped de la invención. Sin embargo, pueden usarse secuencias de codificación que sean heterólogas a la célula huésped de la invención.
La sobreexpresión de una enzima, cuando se refiere a la producción de la enzima en una célula huésped genéticamente modificada, significa que la enzima se produce en un nivel más alto de actividad enzimática específica en comparación con la célula huésped no modificada bajo condiciones idénticas. Usualmente esto significa que la proteína activa enzimáticamente (o proteínas en el caso de enzimas multisubunidades) se producen cantidades mayores, o mejor a un nivel de estado de equilibrio más alto en comparación con la célula huésped no modificada bajo condiciones idénticas. De la misma forma esto significa usualmente que el ARNm que codifica para la proteína enzimáticamente activa se produce en cantidades mayores, o de nuevo en un nivel de estado de equilibrio más alto en comparación con la célula huésped no modificada bajo condiciones idénticas. La sobreexpresión de una enzima se determina así preferiblemente midiendo el nivel de la actividad específica de la enzima en la célula huésped utilizando ensayos enzimáticos apropiados tal como se describen aquí. Como alternativa, la sobreexpresión de la enzima puede determinarse indirectamente cuantificando el nivel de estado de equilibrio específico de la proteína enzimática, por ejemplo, utilizando anticuerpos específicos para la enzima o cuantificando el nivel de estado de equilibrio específico del ARNm que codifica para la enzima. Esto último puede ser particularmente adecuado para enzimas de la ruta del fosfato de pentosa para la cual los ensayos enzimáticos no son fácilmente factibles como sustratos para las enzimas y no son comercialmente disponibles. Preferiblemente, en una célula huésped de la invención, una enzima que va a ser sobreexpresada es sobreexpresada por al menos un factor de aproximadamente 1.1, aproximadamente 1.2, aproximadamente 1.5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con una cepa que sea genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que causa la sobreexpresión. Debe entenderse que estos niveles de sobreexpresión pueden aplicarse al nivel de estado de equilibrio de la actividad de la enzima, el nivel de estado de equilibrio de la proteína de la enzima así como el nivel de estado de equilibrio del transcripto que codifica para la enzima.
Una célula de la invención puede comprender una o más modificaciones genéticas para incrementar la actividad específica de la xilulosa quinasa. Preferiblemente la modificación o modificaciones genéticas producen sobreexpresión de una xilulosa quinasa, por ejemplo por sobreexpresión de una secuencia de nucleótidos que codifican una xilulosa quinasa. El gen que codifica la xilulosa quinasa puede ser endógeno a la célula huésped o puede ser una xilulosa quinasa que sea heteróloga a la célula huésped. Una secuencia de nucleótidos usada para sobreexpresión de xilulosa quinasa en la célula huésped de la invención es una secuencia de nucleótidos y codifica
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Después de varios ciclos de crecimiento y reinoculación en condiciones anaeróbicas, se diluye una alícuota de los cultivos a aproximadamente 100-1000 unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro y se cultivan con posterioridad alícuotas de 10 – 100 µl en placas de YEPh-agar que contienen glucosa al 2%. Se incuban las placas durante al menos 48 horas a 30ºC o hasta que son visibles colonias únicas.
Se ensayan aislados de colonias únicas en el MAB (véase supra). Se seleccionan aislados de colonias únicas sobre la base de la capacidad para fermentar los cinco azúcares con eficacia, como se deduce del perfil del dióxido de carbono y los datos RMN de los azúcares, etanol y subproductos.
Las mejores cepas se caracterizan por técnicas genéticas y de biología molecular conocidas para los expertos en la materia, tales como PCR, prueba(s) de Southern, FIGE y resecuenciación.
Ejemplo 6
Selección y caracterización de una cepa de levadura de fermentación de pentosa
Cuando el cultivo descrito en el Ejemplo 4 hubo alcanzado una densidad óptica a 600 nm mayor que 10, se transfirió un alícuota de 25 µl a un frasco agitador que contenía medio Verduyn enriquecido con xilosa al 2%. Se controló la densidad óptica con frecuencia y se determinó la velocidad de crecimiento con el uso de estos datos. Cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica a 600 nm mayor que 15, se transfirió una alícuota del cultivo a un frasco agitador que contenía medio Verduyn enriquecido con xilosa al 2% y se cerró el frasco agitador con un cierre hidráulico que permitía el cultivo anaeróbico. Desde este punto, se realizaron incubaciones en un agitador orbital a 30 °C y 10 rad/s (100 rpm). Se controló el crecimiento del cultivo midiendo la densidad óptica a 600 nm y se calculó la tasa de crecimiento basándose en estos datos. Cuando la densidad óptica a 600 nm del cultivo alcanzó un valor mayor que 3.75, se transfirió una alícuota del cultivo a un frasco agitador que contenía medio Verduyn enriquecido con arabinosa al 2%. Se cerró el frasco agitador con un cierre hidráulico. En el caso de que el cultivo alcanzara una densidad óptica a 600 nm con un valor mayor que 5, se transfirió de nuevo una alícuota del cultivo a un frasco agitador que contenía medio Verduyn enriquecido con xilosa al 2 % y se cerró este frasco agitador con un cierre hidráulico. Un resultado típico de este experimento de crecimiento se proporciona en la figura 3.
Como es evidente a partir de la figura 3, la transformación de BIE292 con XylA de Clostridium beyerinckii permitió que esta cepa obtuviera rápidamente un fenotipo consumidor de xilosa, al tiempo que la transformación de control no daba como resultado células consumidoras de xilosa.
La tabla 1 presenta las tasas de crecimiento de cepas S. cerevisiae transformadas con genes de xilosa isomerasa de varios organismos. La cepa BIE292XI (C. beyerinckii) demostró la tasa de crecimiento más alta en condiciones aeróbicas en el crecimiento inicial en xilosa como única fuente de carbono después de la transformación. Además, BIE292XI (C. beyerinckii) fue la única cepa capaz de crecer en xilosa en condiciones anaeróbicas sin ingeniería evolutiva exhaustiva.
Tabla 1: Tasas de crecimiento de BIE292XI (C. beyerinckii) y datos disponibles al público de cepas Saccharomyces cerevisiae transformadas con XI de Clostridium phytofermentans (ref. 1), Orpinomyces (ref. 2), Piromyces (RWB202) (ref. 3) y Thermus thermophilus (ref. 4), en el crecimiento inicial en xilosa.
Xilosa isomerasa
Aeróbico Anaeróbico
C. beyerincki
0.061 h-1 0.056 h-1
C. phytofermentans
0.039 h-1 --
Orpinomyces
0.01 h-1 --
Piromyces
0.005 h-1 --
T. thermophilus
- --
Los datos presentados en la tabla anterior están obtenidos todos a partir de diferentes antecedentes de cepas. 17
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Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
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