BRPI0718101A2 - Produção de butanol em uma célula eucariótica - Google Patents

Description

PRODUÇÃO DE BUTANOL EM UMA CÉLULA EUCARIÓTICA

A presente invenção se refere a uma célula eucariótica transformada capaz de produzir butanol e um processo para a produção de butanol por emprego da célula eucariótica transformada.

O processo de fermentação de acetona/butanol/etanol (ABE) recebeu atenção considerável recentemente como um processo de prospecção para a produção de produtos químicos, tais como, butanol e acetona a partir da biomassa.

A fermentação dos carboidratos em acetona, butanol e etanol por Clostridia solventogênica é bem conhecido há décadas. Clostridia produz butanol por conversão de uma fonte de carbono apropriada em acetil-CoA. 0 substrato acetil-CoA então entra na via de solventogênese para produzir butanol usando seis reações de enzima combinadas. As reações e as enzimas catalisando essas reações são listadas a seguir:

2 Acetil-CoA -> Acetoacetil-CoA + HSCoA (acetil-CoA acetil transferase) Acetoacetil-CoA + NAD(P)H 3- hidróxilbutiril-CoA + NAD(P)+ (3 -hidróxi1-CoA desidrogenase) 3-hidróxilbutiril-CoA Crotonil-CoA + H2O (3-hidróxibutiril- CoA desidratase) Crotonil-CoA + NAD(P)H -> Butiril-CoA + NAD (P) + (butiril-CoA desidrogenase) Butiril-CoA + NAD(P)H Butiraldeído + CoA + NAD(P)+ (butiraldeído desidrogenase) Butiraldeído + NAD(P)H -> Butanol + (butanol NAD(P)

desidrogenase)

A formação do butanol requer a conversão de acetil-CoA em acetoacetil-CoA por acetil transferase. Esta reação é seguida por conversão de acetoacetil-CoA em 3- hidróxilbutiril-CoA por 3-hidróxil-CoA desidrogenase, que é seguida por conversão de 3-hidróxilbutiril-CoA em crotonil- CoA por 3-hidróxibutiril-CoA desidratase (também denominada crotonase) e a conversão de crotonil-CoA em butiril-CoA por butiril-CoA desidrogenase e seguido por conversão da butiril-CoA em butiraldeído por butiraldeído desidrogenase, com a conversão final de butiraldeído em butanol por butanol desidrogenase (Jones, D.T., Woods, D.R., 1986, Microbiol. Rev., 50, 484-524).

Contudo, a produção de butanol sofre com a fraca economia de processo, uma vez que o butanol produzido é tóxico às células microbianas e assim as titulações são baixas. Muitos estudos foram direcionados ao aumento da resistência das cepas Clostridia contra butanol e conseqüentemente encontram um aumento nas titulações. No US 6.960.465 é mostrado, por exemplo, que a superexpressão das proteínas de choque térmico no Clostridium acetobutylicum resultou no rendimento de produção de butanol aumentado em comparação à cepa do tipo selvagem.

Uma vez que as Clostridia são sensíveis ao oxigênio, as fermentações de Clostridia precisam ser operadas sob condições anaeróbicas estritas, o que torna difícil operar tais fermentações em grande escala. Fermentações anaeróbias geralmente resultam em concentrações de biomassa baixas devido ao ganho de ATP baixo sob condições anaeróbicas. Além disso, Clostridia são sensíveis aos bacteriófagos, causando Iise das células bacterianas durante fermentação. Uma vez que as fermentações de Clostridia são realizadas em pH neutro, as condições estéreis são essenciais para impedir contaminação do caldo de fermentação, por exemplo, por bactérias do ácido láctico, que conduzem aos altos custos para fermentações em uma escala industrial (Zverlov e outros, Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol. 71, p. 587-597, 2006, Spivey, Process Biochemistry November 1978) . Outra desvantagem da produção de butanol na Clostridia é que subprodutos indesejados, tais como, acetona, acetato e butirato são também produzidos, o que abaixa o rendimento do butanol no carbono.

0 W02007/041269 revela um microorganismo recombinante, por exemplo, uma levedura, tal como, Saccharomyces cerevisiae, que é transformada com pelo menos uma molécula de DNA codificando um polipeptídeo que catalisa uma das reações da via de butanol, conforme descrito acima. Contudo, a quantidade de butanol produzido em uma cepa de Saccharomyces geneticamente modificada revelada no WO 2 0 07/04126 9 estava apenas entre 0,2 a 1,7 mg/L, que é um fator cerca de 10.000-100.000 inferior à quantidade de butanol produzida em uma fermentação de ABE clássica.

0 objetivo da presente invenção é a provisão de uma célula eucariótica alternativa capaz de produzir uma quantidade maior de butanol em relação à conhecida no estado da técnica.

O objetivo é obtido de acordo com a invenção com uma célula eucariótica transformada compreendendo uma ou mais seqüências de nucleotídeo codificando acetil-CoA acetiltransferase, 3-hidróxibutiril-CoA desidrogenase, 3- hidróxibutiril-CoA desidratase, butiril-CoA desidrogenase, álcool desidrogenase ou acetaldeido desidrogenase e/ou butanol desidrogenase dependente de NAD(P)H pelo que a(s) seqüência (s) de nucleotídeo quando da transformação da célula confere(m) à célula a capacidade de produzir butanol.

A invenção também se refere a uma célula eucariótica transformada selecionada do grupo consistindo em Aspergillus, Penicillium, Piehia, Kluyveromyces, Yarrowia, Candida, Hansenula, Humicola, Torulaspora, Trichosporon, Brettanomyces, Zygosaccharomyces, Paehysolen e Yamadazyma, compreendendo uma ou mais seqüências de nucleotídeo codificando acetil-CoA acetiltransferase, 3-hidróxibutiril- CoA desidrogenase, 3-hidróxibutiril-CoA desidratase, butiril-CoA desidrogenase, álcool desidrogenase ou acetaldeido desidrogenase e/ou butanol desidrogenase dependente de NAD(P)H pelo que a(s) seqüência(s) de nucleotídeo quando da transformação da célula confere(m) à célula a capacidade de produzir butanol. Conforme usado neste documento, uma célula eucariótica

transformada é definida como uma célula eucariótica que é geneticamente modificada ou transformada com uma ou mais das seqüências de nucleotídeo, conforme definido neste documento. A célula eucariótica que não é transformada ou geneticamente modificada é uma célula que não compreende uma ou mais das seqüências de nucleotídeo permitindo que a célula tyo produza butanol. Conseqüentemente, uma célula eucariótica não transformada é uma célula que naturalmente não produz butanol. Conforme usado neste documento, o butanol é n-butanol ou 1-butanol. No escopo da presente invenção, álcool desidrogenase ou acetaldeído desidrogenase catalisa a mesma reação que a butiraldeído desidrogenase. A álcool desidrogenase ou a acetaldeído desidrogenase na presente invenção pode também possuir atividade de butanol desidrogenase.

Preferivelmente, a célula eucariótica de acordo com a presente invenção expressa uma ou mais seqüências de nucleotídeo selecionadas do grupo consistindo em:

a. uma seqüência de nucleotídeo codificando uma

acetil-CoA acetiltransferase, onde a dita seqüência de

nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em:

i) uma seqüência de nucleotídeo codificando uma acetil-CoA acetiltransferase compreendendo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 20%, preferivelmente pelo

menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO 1,

ii) uma seqüência de nucleotídeo que possui pelo menos 15%, preferivelmente pelo menos 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70,

80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N02.

iii) uma seqüência de nucleotídeo onde o filamento complementar da mesma hibridiza com relação uma molécula de ácido nucléico da seqüência de (i) ou (ii); e

iv) uma seqüência de nucleotídeo que difere da

seqüência de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético,

b. uma seqüência de nucleotídeo codificando uma 3- hidróxibutiri1-CoA desidrogenase, onde a dita seqüência de

nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: i. uma seqüência de nucleotídeo codificando uma 3- hidróxibutiril-CoA desidrogenase, dita 3-hidróxibutiril-CoA desidrogenase compreendendo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 25%, preferivelmente pelo menos 30,

40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO 3,

ii. uma seqüência de nucleotídeo que possui pelo menos 20% preferivelmente pelo menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65,

70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N04,

iii. uma seqüência de nucleotídeo onde o filamento complementar da mesma hibridiza com relação uma molécula de ácido nucléico da seqüência de (i) ou (ii); e,

iv. uma seqüência de nucleotídeo que difere da

seqüência de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético,

c. uma seqüência de nucleotídeo codificando 3- hidróxibutiril-CoA desidratase, onde a dita seqüência de

nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em:

i. uma seqüência de nucleotídeo codificando uma 3- hidróxibut iril-CoA desidratase, dita 3-hidróxibutiril-CoA desidratase compreendendo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 40, 50,

55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO 5;

ii. uma seqüência de nucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que possui pelo menos 25%,

preferivelmente pelo menos 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N06;

iii. uma seqüência de nucleotídeo onde o filamento complementar da mesma hibridiza com relação uma molécula de

ácido nucléico da seqüência de (i) ou (ii); e

iv. uma seqüência de nucleotídeo que difere da seqüência de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético,

d. uma seqüência de nucleotídeo codificando butiril- CoA desidrogenase, onde a dita seqüência de nucleotídeo é

selecionada do grupo consistindo em:

i. uma seqüência de nucleotídeo codificando uma butiril-CoA desidrogenase, dita butiril-CoA desidrogenase compreendendo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo

menos 20%, preferivelmente pelo menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO 7;

ii. uma seqüência de nucleotídeo que possui pelo menos 15%, preferivelmente pelo menos 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65,

70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N08;

iii. uma seqüência de nucleotídeo onde o filamento complementar da mesma hibridiza com relação uma molécula de

ácido nucléico da seqüência de (i) ou (ii); e

iv. uma seqüência de nucleotídeo que difere da seqüência de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético,

e. uma seqüência de nucleotídeo codificando álcool desidrogenase ou acetaldeído desidrogenase, onde a dita seqüência de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo era:

i. uma seqüência de nucleotídeo codificando uma álcool desidrogenase ou acetaldeído desidrogenase, dita álcool desidrogenase ou acetaldeído desidrogenase compreendendo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO 9 e/ou SEQ ID NO 11, respectivamente,

ii. uma seqüência de nucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que possui pelo menos 15%, preferivelmente pelo menos 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NOlO ou SEQ ID NO 12, respectivamente;

iii. uma seqüência de nucleotídeo onde o filamento complementar da mesma hibridiza com relação uma molécula de ácido nucléico da seqüência de (i) ou (ii); e

iv. uma seqüência de nucleotídeo que difere da seqüência de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético, e,

f. uma seqüência de nucleotídeo codificando butanol desidrogenase dependente de NAD(P)H, onde a dita seqüência de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em:

i. uma seqüência de nucleotídeo codificando butanol desidrogenase dependente de NAD(P)H, compreendendo uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 3 0%, preferivelmente pelo menos 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO 13 e/ou SEQ ID NO 15;

ii. uma seqüência de nucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que possui pelo menos 25%,

preferivelmente pelo menos 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N014 e/ou SEQ ID NO 16;

iii. uma seqüência de nucleotídeo onde o filamento complementar da mesma hibridiza com relação uma molécula de

ácido nucléico da seqüência de (i) ou (ii); e,

iv. uma seqüência de nucleotídeo que difere da seqüência de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético.

Identidade de Seqüência e Similaridade

A identidade da seqüência é definida neste documento como a relação entre duas ou mais seqüências de aminoácido (polipeptídeo ou proteína) ou duas ou mais seqüências de ácido nucléico (polinucleotídeo) , conforme determinado por comparação das seqüências. Geralmente, as identidades da seqüência ou similaridades são comparadas ao comprimento total das seqüências comparadas. Na técnica "identidade" também significa o grau de relação da seqüência entre as seqüências de aminoácido ou ácido nucléico, conforme for o caso, conforme determinado pela match entre os filamentos de tais seqüências. "Identidade" e "similaridade" podem ser prontamente calculadas por vários métodos, conhecidos dos versados na técnica. Métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para fornecer o maior emparelhamento entre as seqüências testadas. Os métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados nos programas de computador disponíveis publicamente. Os métodos de programa de computador preferidos para determinar a identidade e similaridade entre duas seqüências incluem, por exemplo, o BestFiti BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul, S. F. e outros, J. Mol. Biol. 215:403- 410 (1990), publicamente disponível na NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., e outros, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Parâmetros preferidos para comparação das seqüências de aminoácido usando BLASTP são fenda aberta 10,0, fenda estendida 0,5, matriz Blosum 62. Os parâmetros preferidos para comparação das seqüências de ácido nucléico usando BLASTP são fenda aberta 10,0, fenda estendida 0,5, matriz plena de DNA (matriz de identidade de DNA). Hibridização das Seqüências de Ácido Nucléico

As seqüências de nucleotídeo codificando as enzimas expressas na célula da invenção também podem ser definidas por sua capacidade de hibridizar com as seqüências de nucleotídeo das SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 respectivamente, sob condições de hibridização moderadas ou preferivelmente estringentes. As condições de hibridização estringentes são definidas neste documento como as condições que permitem que uma seqüência de ácido nucléico de pelo menos cerca de 25, preferivelmente cerca de 50 nucleotídeos, 75 ou 100 e mais preferivelmente cerca de 200 ou mais nucleotídeos, hibridize a uma temperatura de cerca de 650C em uma solução compreendendo cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 χ SSC ou qualquer outra solução possuindo uma resistência iônica comparável e lavagem a 650C em uma solução compreendendo cerca de 0,1 M de sal ou menos, preferivelmente 0,2 χ SSC ou qualquer outra solução possuindo uma resistência iônica comparável.

Preferivelmente, a hibridização é realizada por toda noite, isto é, pelo menos por 10 horas e preferivelmente a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas alterações da solução de lavagem. Estas condições geralmente permitirão a hibridização específica das seqüências possuindo cerca de 90% ou mais de identidade de seqüência.

Condições moderadas são definidas neste documento como

condições que permitem que seqüências de ácido nucléico de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeos hidrolisem a uma temperatura de cerca de 4 5 0C em uma solução compreendendo cerca de 1 M sal, preferivelmente 6 χ SSC ou qualquer outra solução possuindo resistência iônica comparável e lavagem a temperatura ambiente em uma solução compreendendo cerca de 1 M sal, preferivelmente 6 χ SSC ou qualquer outra solução possuindo uma resistência iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada a toda noite, isto é, pelo menos por 10 horas e, preferivelmente, a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas trocas da solução de lavagem. Estas condições geralmente permitirão a hibridização específica das seqüências possuindo até 50% de identidade de seqüência. Um versado na técnica será capaz de modificar estas condições de hibridização a fim de identificar especificamente as seqüências que variam a

identidade entre 50% e 90%.

As seqüências de nucleotídeo codificando uma acetil- CoA acetiltransferase, uma 3-hidróxibutiril-CoA desidrogenase, uma 3-hidróxibutiril-CoA desidratase, uma butiril-CoA desidrogenase, uma álcool desidrogenase ou acetaldeido desidrogenase e/ou butanol desidrogenase dependente de NAD(P)H podem ser de origem procariótica ou eucariótica. Uma seqüência de nucleotídeo procariótica codificando uma acetil-CoA acetiltransferase pode ser, por exemplo, o gene thiL de Clostridium acetobutylicum conforme mostrado na SEQ ID. NO: 2. Uma seqüência de nucleotídeo procariótica codificando 3-hidróxibutiril-CoA desidrogenase pode ser, por exemplo, o gene hbd de Clostridium acetobutylicum conforme mostrado na SEQ ID NO 4. Uma seqüência de nucleotídeo procariótica codificando uma 3- hidróxibut ir i1-CoA desidratase pode ser, por exemplo, o gene crt de Clostridium acetobutylicum conforme mostrado na SEQ ID NO 6. Uma seqüência de nucleotídeo procariótica codificando uma butiril-CoA desidrogenase pode ser, por exemplo, o gene bcd de Clostridium acetobutylicum conforme mostrado na SEQ ID NO 8. Uma seqüência de nucleotídeo procariótica codificando álcool desidrogenase ou acetaldeido desidrogenase pode ser, por exemplo, o gene adhE ou adhEl de Clostridium acetobutylicum conforme mostrado na SEQ ID NO 10 ou SEQ ID NO 12, respectivamente. Uma seqüência de nucleotídeo procariótica codificando butanol desidrogenase dependente de NAD(P)H pode ser, por exemplo, o gene bdhA ou JbdhB de Clostridium acetobutylicum conforme mostrado na SEQ ID NO 14 e SEQ ID NO 16, respectivamente.

De modo a aumentar a probabilidade de que as enzimas introduzidas sejam expressas na forma ativa em uma célula eucariótica da invenção, a seqüência de nucleotídeo de codificação correspondente pode ser adaptada para otimizar seu emprego de códon para aquele da célula hospedeira de eucarioto escolhida. A capacidade de adaptação das seqüências de nucleotídeo codificando as enzimas para o emprego do códon da célula hospedeira escolhida pode ser expressa como o índice de adaptação ao códon (CAI). 0 índice de adaptação ao códon é definido neste documento como uma medição da capacidade de adaptação relativa do uso do códon de um gene na direção do uso do códon de genes altamente expressos. A capacidade de adaptação relativa (w) de cada códon é a razão do uso de cada códon em relação aquele do códon mais abundante para o mesmo aminoácido. O índice CAI é definido como a média geométrica destes valores de capacidade de adaptação relativa. Códons que não são sinônimos e códons de terminação (que dependem do código genético) são excluídos. Os valores de CAI variam de 0 a 1, com valores maiores indicando uma proporção maior de códons mais abundantes (vide Sharp and Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; vide também: Jansen e outros, 2003, Nucleic Acids Res. 31 (8) :2242-51) . Uma seqüência de nucleotídeo adaptada possui preferivelmente um CAI de pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 ou 0,7.

Em uma concretização preferida a célula eucariótica de acordo com a presente invenção é geneticamente modificada com (a) seqüência (s) de nucleotídeos que é (são) adaptada(s) ao emprego do códon da célula eucariótica utilizando tecnologia de otimização do par de códons conforme descrito no PCT/EP2007/05594. A otimização do par de códons é um método para produzir um polipeptídeo em uma célula hospedeira, onde as seqüências de nucleotídeo codificando o polipeptídeo foram modificadas com relação ao seu emprego no códon, especificamente os pares de códons que são empregados para obter expressão aperfeiçoada da seqüência de nucleotídeos codificando polipeptídeo e/ou produção aperfeiçoada do polipeptídeo. Os pares de códons são definidos como um conjunto de dois tripletos subsequentes (códons) em uma seqüência de codificação.

Foi verificado surpreendentemente que, quando as seqüências de nucleotídeo na célula eucariótica transformada foram adaptadas para a célula eucariótica escolhida usando o método de otimização do par de códons, a quantidade de butanol produzido pela célula eucariótica aumentou em comparação à célula eucariótica que foi transformada com seqüências de nucleotídeos que não foram otimizadas em seu par de códons.

O aperfeiçoamento adicional da atividade das enzimas in vivo em uma célula hospedeira eucariótica da invenção pode ser obtido por métodos bem conhecidos como a PCR propensa a erros ou evolução direcionada. Um método preferido de evolução direcionada é descrito no W003010183 e no W003010311.

A célula eucariótica de acordo com a presente invenção pode ser qualquer célula hospedeira apropriada, preferivelmente de origem microbiana. Preferivelmente, a célula hospedeira é uma levedura ou um fungo filamentado. Mais preferivelmente, a célula hospedeira pertence a um dos gêneros Saccharomyces, Aspergillus, Penicillium, Pichia, Kluyveromyces, Yarrowia, Candida, Hansenular Humicola, Torulaspora, Trichosporon, Brettanomyces, Pachysolen ou Yamadazyma. Uma célula hospedeira mais preferida pertence às espécies Aspergillus niger, Penicilllum chrysogenum, Pichia stipidis, Kluyveromyces marxianus, K. Iactis, K. thermotolerans, Yarrowia lipolytica, Candida sonorensis, C. glabrata, Hansenula polymorpha, Torulaspora delbrueckii, Brettanomyees bruxellensis, Zygosaceharomyees bailii, Saccharomyees uvarum, Saccharomyees bayanus ou Saccharomyees eerevisiae. Preferivelmente, a célula eucariótica é Saccharomyees eerevisiae.

Preferivelmente, a célula eucariótica de acordo com a invenção é uma levedura, preferivelmente Saccharomyees eerevisae, compreendendo um ou mais dos genes selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21 OU SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 23 ou SEQ ID NO 24. As seqüências de nucleotídeo codificando as enzimas

que produzem acetoacetil-CoA, 3-hidróxibutiril-CoA, crotonil-CoA, butiril-CoA, butirilaldeído e butanol podem ser ligadas em uma construção de ácido nucléico para facilitar a transformação da célula eucariótica de acordo com a presente invenção. Uma construção de ácido nucléico pode ser um plasmídeo transportando os genes codificando todas as seis enzimas da via de metabólica de butanol conforme descrito acima ou uma construção de ácido nucléico compreende dois ou três plasmideos transportando cada três ou dois genes, respectivamente, codificando as seis enzimas da via de butanol distribuídas de qualquer modo apropriado. Qualquer plasmídeo apropriado pode ser empregado, por exemplo, um plasmídeo de cópia baixa ou um plasmídeo de cópia alta. É também possível que as enzimas selecionadas do grupo consistindo em acetil-CoA acetiltransferase, 3- hidróxibutiril-CoA desidrogenase, 3-hidróxibutiril-CoA desidratase, butiril-CoA desidrogenase, álcool

desidrogenase ou acetaldeído desidrogenase e butanol desidrogenase dependente de NAD(P)H sejam nativas a uma célula hospedeira e que a transformação com uma ou mais das seqüências de nucleotídeo codificando estas enzimas não precise conferir a capacidade da célula hospedeira de produzir butanol. 0 aperfeiçoamento adicional da produção de butanol pela célula hospedeira pode ser obtido por aperfeiçoamento da cepa clássica.

A construção do ácido nucléico pode ser mantida epissomicamente e assim compreender uma seqüência para replicação autônoma, tal como, seqüência de replicação autossômica. Se a célula hospedeira for de origem fúngica, uma construção de ácido nucléico epissômica apropriada pode ter, por exemplo, base nos plasmídeos de levedura de 2 μ ou ρKDl (Gleer e outros, 1991, Biotechnology 9: 968-975), ou nos plasmideos AMA (Fierro e outros, 1995, Curr Genet. 29:482-489). Alternativamente, cada construção de ácido nucléico pode ser integrada em uma ou mais cópias dentro do genoma da célula hospedeira. A integração dentro do genoma da célula hospedeira pode ocorrer aleatoriamente por recombinação heteróloga, porém preferivelmente a construção de ácido nucléico pode ser integrada ao genoma da célula hospedeira por recombinação homóloga, como é bem conhecido na técnica (vide, por exemplo, o W090/14423, a EP-A- 0481008, a EP-A-0635 574 e O US 6.265.186).

Opcionalmente, um marcador selecionável pode estar presente na construção do ácido nucléico. Conforme empregado neste documento "marcador" se refere a um gene codificando um traço ou fenótipo que permite a seleção ou classificação de uma célula hospedeira contendo o marcador. O gene marcador pode ser um gene resistente a antibiótico, pelo que, o antibiótico apropriado pode ser usado para selecionar as células transformadas dentre as células que não são transformadas. Preferivelmente, contudo, os marcadores de resistência não antibiótica são usados, tais como, marcadores auxotróficos (URA3, TRP1, LEU2). As células hospedeiras transformadas com as construções de ácido nucléico podem ser isentas de gene marcador. Os métodos para construção das células hospedeiras microbianas isentas de gene marcador recombinante são revelados na EP- A-O 635 574 e têm como base o emprego de marcadores bidirecionais. Alternativamente, um marcador selecionável, tal como, Proteína Fluorescente Verde, IacZ, luciferase, cloranfenicol acetiltransferase, beta-glucuronidase podem ser incorporadas às construções de ácido nucléico da invenção para permitir classificação das células transformadas. Um método isento de marcador preferido para a introdução de polinucleotídeos heterólogos é descrito no W00540186.

Em uma concretização preferida, as seqüências de nucleotídeo codificando as enzimas que produzem acetoacetil-CoA, 3-hidróxibutiril-CoA, crotonil-CoA,

butiril-CoA butirilaldeído e butanol, por exemplo, a enzima conforme descrita neste documento são independente e operavelmente ligadas a um promotor que fornece expressão suficiente das seqüências de nucleotídeos correspondentes em uma célula eucariótica de acordo com a presente invenção, de modo a conferir à célula a capacidade de produzir butanol.

Conforme empregado neste documento, o termo "operavelmente ligada" se refere a uma ligação de elementos de polinucleotídeo (ou seqüências de codificação ou seqüência de ácido nucléico) em uma relação funcional. Uma seqüência de ácidos nucléicos está "operavelmente ligada" quando a mesma for colocada em uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor ou melhorador é operavelmente ligado a uma seqüência de codificação se ele afetar a transcrição da seqüência de codificação.

Conforme empregado neste documento, o termo "promotor" se refere a um fragmento de ácido nucléico que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes, localizados a montante com relação à direção de transcrição do sítio de iniciação de transcrição do gene e é estruturalmente identificado pela presença de um sítio de ligação para RNA dependente de DNA polimerase, sítios de iniciação de transcrição e quaisquer outras seqüências de DNA, incluindo porém não limitado aos sítios de ligação do fator de transcrição, sítios de ligação de proteína repressora ou ativadora e quaisquer outras seqüências de nucleotídeos conhecidas de um versado na técnica para agirem direta ou indiretamente de modo a regular a quantidade de transcrição do promotor. Um promotor "constitutivo" é um promotor que é ativo sob condições mais ambientais e de desenvolvimento. Um promotor "induzível" é um promotor que é ativo sob normalização ambiental ou de desenvolvimento.

0 promotor que seria usado para obter a expressão das seqüências de nucleotídeo codificando uma enzima conforme definido neste documento anteriormente, pode não ser nativo à seqüência de nucleotídeos codificando a enzima a ser expressa, isto é, um promotor que é heterólogo à seqüência de nucleotídeo (seqüência de codificação) a qual ele está operavelmente ligado. Preferivelmente, o promotor é homólogo, isto é, endógeno à célula hospedeira.

Promotores apropriados nas células hospedeiras eucarióticas podem ser GAL7, GALlO, ou GAL 1, CYCl, HIS3, ADHl, PGL, PHO5, GAPDH, ADCl, TRPl, URA3, LEU2, ENO, TPI, e AOXl. Outros promotores apropriados incluem PDC, GPD1, PGKl, TEFl e TDH.

Qualquer terminador, que seja funcional na célula, poderá ser usado na presente invenção. Terminadores preferidos são obtidos de genes naturais da célula hospedeira. Seqüências terminadoras apropriadas são bem conhecidas na técnica. Preferivelmente, tais terminadores são combinados com mutações que previnem a decadência de RNAm mediado sem sentido na célula hospedeira da invenção (vide, por exemplo, Shirley e outros, 2002, Genetics 161:1465-1482).

Os promotores preferidos e os terminadores são mostrados nas SEQ ID NOs. 2 5 a 30.

0 termo "homóloga" quando usado para indicar a relação entre uma dada molécula de ácido nucléico (recombinante) ou de polipeptídeo e um dado organismo hospedeiro ou célula hospedeira é entendido como significando que, na natureza, a molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo é produzida por uma célula hospedeira ou organismos das mesmas espécies, preferivelmente da mesma variedade ou cepa. O termo "heterólogo" quando usado com relação ao ácido nucléico (DNA ou RNA) ou proteína se refere a um ácido nucléico ou proteína que não ocorre naturalmente como parte do organismo, célula, genoma ou seqüência de DNA ou RNA onde esteja presente, ou que seja encontrado em uma célula ou local ou locais no genoma ou seqüência de DNA ou RNA que possam diferir daqueles nos quais ele é encontrado na natureza. Ácidos nucléicos ou proteínas heterólogas não são endógenos com relação à célula na qual eles são introduzidos, porém foram obtidos de outra célula ou produzidos sintética ou recombinantemente.

Uma ou mais enzimas da via de butanol, conforme descrito acima podem ser superexpressas para obter da célula produção de butanol suficiente. Existem vários meios disponíveis na técnica para

superexpressão das enzimas nas células hospedeiras da invenção. Especificamente, uma enzima pode ser superexpressa por aumento do número de cópias do gene codificando a enzima na célula hospedeira, por exemplo, por integração de cópias adicionais do gene no genoma da célula hospedeira.

Uma célula hospedeira preferida de acordo com a invenção pode ser uma célula eucariótica que é naturalmente capaz de fermentação alcoólica, por exemplo, fermentação alcoólica anaeróbica, especificamente fermentação de etanol. Um grupo de células eucarióticas que é capaz de produzir etanol é, por exemplo, a levedura, tal como, Saccharomyces cerevisiae. Se a célula eucariótica for capaz de fermentar etanol, pode ser preferido que um ou mais genes codificando piruvato descarboxilase sejam silenciados, a fim de deslocar o metabolismo para a via de butanol.

De modo a aumentar adicionalmente a produção de etanol, pode ser preferido aumentar a quantidade de acetil CoA citossólico na célula hospedeira eucariótica por crescimento de uma célula eucariótica na presença de uma mistura de fonte de carbono fermentável (por exemplo, glicose ou galactose) e acetato ou fontes de acetato, tais como, ácidos graxos, a fim de prover a célula com acetil CoA citossólico suficiente.

Preferivelmente, a célula hospedeira de acordo com a presente invenção possui, adicionalmente, alta tolerância aos alcoóis, tais como, etanol, propanol, butanol, isopropanol, isobutanol, álcool isoamílico, pentanol, hexano, heptanol ou octanol. Uma alta tolerância ao álcool pode estar naturalmente presente na célula hospedeira ou pode ser introduzida ou alterada por modificação genética que pode incluir técnicas de aperfeiçoamento de cepa clássicas ou evolução dirigida. A célula eucariótica transformada preferida de acordo

com a presente invenção pode ser capaz de crescer em qualquer fonte de carbono apropriada conhecida na técnica e converter a mesma em butanol. A célula hospedeira eucariótica transformada pode ser capaz de converter diretamente biomassa da planta, celuloses, hemiceluloses, pectinas, ramnose, galactose, fucose, maltose,

maltodextrinas, ribose, ribulose ou amido, derivados de amido, sacarose, lactose e glicerol. Consequentemete, um organismo hospedeiro preferido expressa enzimas, tais como, celulases (endocelulases e exocelulases) e hemicelulases (por exemplo, endo e exo-xilinases, arabinases) necessárias para a conversão da celulose em monômeros de glicose e hemicelulose em monômeros de xilose e arabinose, pectinases capazes de converter pectinas em ácido glicurônico e ácido 5 galacturônico ou amilases para converter amido em monômeros de glicose. Preferivelmente, a célula hospedeira é capaz de converter uma fonte de carbono selecionada do grupo consistindo em glicose, xilose, arabinose, sacarose, lactose e glicerol. A célula hospedeira pode ser por 10 exemplo uma célula hospedeira, conforme descrito no W003/062430, W006/009434, EP1499708B1, W02006096130 ou W004/099381.

Em um aspecto preferido, a presente invenção se refere a um processo para a produção de butanol compreendendo fermentação de uma célula eucariótica transformada de acordo com a presente invenção em um meio de fermentação apropriado e opcionalmente recuperação do butanol.

O meio de fermentação usado no processo para a produção de butanol pode ser qualquer meio de fermentação 20 que permita o crescimento de uma célula hospedeira eucariótica específica. Os elementos essenciais do meio de fermentação são conhecidos do versado na técnica e podem se adaptados a uma célula hospedeira selecionada.

Preferivelmente, o meio de fermentação compreende 25 acetato. Foi verificado surpreendentemente que, quando uma célula eucariótica cresce na presença de acetato, uma quantidade aumentada de butanol é produzida em comparação à célula que cresce na ausência de acetato. A concentração de acetato no meio de fermentação está entre 0,5 e 5 g/L, 30 preferivelmente entre, 1 e 4 g/L, preferivelmente entre 1,5 e 3,5 g/L.

Preferivelmente, o meio de fermentação compreende uma fonte de carbono selecionada do grupo consistindo em biomassa de planta, celuloses, hemiceluloses, pectinas, 5 ramnose, galactose, fucose, frutose, maltose,

maltodextrinas, ribose, ribulose ou amido, derivados de amido, sacarose, lactose, ácidos graxos, triglicerídeos e glicerol. Preferivelmente, o meio de fermentação também compreende uma fonte de nitrogênio, tal como, uréia, ou um 10 sal de amônio, tal como, sulfato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio ou fosfato de amônio.

O processo de fermentação de acordo com a presente invenção pode ser realizado no modo de batelada, alimentação em batelada ou contínuo. Um processo de 15 hidrólise e fermentação separadas (SHF) ou um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) também pode ser aplicado. Uma combinação destes modos de processo de fermentação também pode ser possível para ótima produtividade. Um processo SSF pode ser especificamente 20 atraente se amido, celulose, hemicelulose ou pectina for usado como uma fonte de carbono no processo de fermentação, onde pode ser necessário adicionar enzimas hidrolíticas, tais como, celulases, hemicelulases ou pectinases para hidrolisar o substrato.

A célula eucariótica transformada empregada no

processo para a produção de butanol pode ser qualquer célula hospedeira apropriada conforme definido neste documento anteriormente. Foi verificado como sendo vantajoso o emprego de uma célula eucariótica transformada de acordo com a invenção no processo para a produção de butanol, uma vez que a maioria das células eucarióticas não querer condições estéreis para propagação e são insensíveis às infecções por bacteriófago. Além disto, as células hospedeiras eucarióticas podem se desenvolver em pH baixo 5 para impedir contaminação bacteriana.

Preferivelmente, a célula eucariótica de acordo com a presente invenção é um microorganismo anaeróbico facultativo. Um microorganismo anaeróbico facultativo é preferido uma vez eu um microorganismo facultativo pode ser 10 propagado aerobicamente para uma concentração de célula alta e butanol pode ser produzido subsequentemente sob condições anaeróbicas. Esta fase anaeróbica pode então ser realizada em densidade de célula alta o que reduz substancialmente o volume de fermentação necessário e 15 minimiza o risco de contaminação com microorganismos aeróbicos.

O processo de fermentação para a produção de butanol de acordo com a presente invenção pode ser um processo de fermentação aeróbico ou anaeróbico.

Um processo de fermentação anaeróbico é definido neste

documento como um processo de fermentação operado na ausência de oxigênio ou no qual o oxigênio não é substancialmente consumido, preferivelmente menos de 5, 2,5 ou 1 mmol/L/h e onde as moléculas orgânicas servem como 25 doadores de elétron e aceitadores de elétron. 0 processo de fermentação de acordo com a presente invenção pode também ser operado primeiro sob condições aeróbicas e subsequentemente sob condições anaeróbicas.

0 processo de fermentação também pode ser operado sob condições de oxigênio limitado ou microaeróbicas. Alternativamente, o processo de fermentação pode ser operado primeiro sob condições aeróbicas e subsequentemente sob condições limitadas de oxigênio. Um processo de fermentação de oxigênio limitado é um processo no qual o 5 consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. 0 grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e consumo de fluxo de gás em curso, bem como as propriedades de transferência de mistura/massa reais do equipamento de fermentação 10 utilizado. Preferivelmente, em um processo com condições de oxigênio limitado, a taxa de consumo de oxigênio é de pelo menos 5,5, mais preferivelmente pelo menos 6 e mesmo mais preferivelmente pelo menos 7 mmol/L/h.

A produção de butanol no processo de acordo com a 15 presente invenção pode ocorrer durante a fase de crescimento da célula hospedeira, durante a fase estacionária (estado firme) ou durante ambas as fases. Pode ser possível operar o processo de fermentação em temperaturas diferentes.

O processo para a produção de butanol é

preferivelmente operado a uma temperatura que é ótima para a célula eucariótica. A temperatura de crescimento ótima pode diferir de cada célula eucariótica transformada e é conhecida de um versado na técnica. A temperatura ótima 25 pode ser superior à ótima para organismos do tipo selvagem para desenvolvimento eficaz do organismo sob condições não estéreis sob sensibilidade de infecção mínima e custo de resfriamento mais baixo.

A temperatura ótima para desenvolvimento de uma célula eucariótica transformada pode estar acima de 20°C, 22°C, 25°C, 28°C, ou acima de 30°C, 35°C, ou acima de 37°C, 40°C, 42°C, e preferivelmente abaixo de 45°C. Contudo, durante a fase de produção do etanol, a temperatura ótima pode ser mais baixa que a média a fim de otimizar a estabilidade da 5 biomassa e reduzir a solubilidade do butanol. A temperatura durante esta fase pode estar abaixo de 45°C, por exemplo abaixo de 42°C, 40°C, 37°C, por exemplo, abaixo de 35°C, 3 O 0C ou abaixo de 28°C, 25°C, 22°C ou abaixo de 20 °C, preferivelmente acima de 15°C.

0 processo para a produção de butanol de acordo com a

presente invenção pode ser realizado em qualquer valor de ph apropriado. Se a célula eucariótica transformada for levedura, o pH no meio de fermentação preferivelmente terá um valor abaixo de 6, preferivelmente abaixo de 5,5, 15 preferivelmente abaixo de 5, preferivelmente abaixo de 4,5, preferivelmente abaixo de 4, preferivelmente abaixo de pH 3,5 ou abaixo de pH 3,0, ou abaixo de pH 2,5, preferivelmente acima pH 2. Uma vantagem de se realizar a fermentação nestes valores de pH baixos é que o crescimento 20 das bactérias contaminantes no meio de fermentação pode ser impedido.

A recuperação do butanol do meio de fermentação pode ser realizada por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por destilação, extração a vácuo, extração do solvente ou por evaporação.

Foi verificado que o processo para a produção de butanol de acordo com a invenção resulta em uma concentração acima de 5 mg/L do caldo de fermentação, preferivelmente acima de 10 mg/L, preferivelmente acima de 20 mg/L, preferivelmente acima de 30 mg/L do caldo de fermentação, preferivelmente acima de 40 mg/L, mais preferivelmente acima de 50 mg/L, preferivelmente acima de 60 mg/L, preferivelmente acima de 70, preferivelmente acima de 80 mg/L, preferivelmente acima de 100 mg/L, preferivelmente acima de 1 g/L, preferivelmente acima de 5 g/L, preferivelmente acima de 10 g/L, mais geralmente abaixo de 7 0 g/L.

A presente invenção também se refere ao caldo de fermentação compreendendo butanol que pode ser obtido pelo processo de acordo com a presente invenção. Foi verificado que o caldo de fermentação compreende uma concentração baixa ou nenhuma concentração de butirato e acetona.

O butanol produzido pelo processo de fermentação de acordo com a presente invenção pode ser usado em qualquer aplicação conhecida para butanol. Ele pode ser usado, por exemplo, como um combustível, por exemplo como aditivo para diesel ou gasolina. Alternativamente, butanol produzido de forma fermentativa pode ser convertido no butilacrilato por processos conhecidos na técnica.

Modificações Genéticas

Técnicas genéticas padrão, tais como, superexpressão de enzimas em células hospedeiras, bem como para modificação genética adicional das células hospedeiras são métodos bem conhecidos na arte, tais como descritos em Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ou F. Ausubel e outros, eds. , "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987) . Métodos para transformação e modificação genética das células hospedeiras fúngicas são conhecidos por exemplo, na EP-A-O 635 574, no WO 98/46772, WO 99/60102 e no WO 00/37671.

Os exemplos que se seguem são apenas ilustrativos e não são construídos como limitando a invenção.

EXAMPLOS

Geral

• Oligonucleotídeos foram sintetizados pela Invitrogen (Carlsbad CA, US) .

• Sequenciamento de DNA foi realizado na SEQLAB (Gõttingen, Alemanha) ou por Baseclear (Leiden, Países-

Baixos)

• Enzimas de restrição foram fornecidas pela Invitrogen ou New England Biolabs.

• Cepas utilizadas: Células competentes de Escherichia coli DHlOB electromax (Invitrogen). 0 protocolo

foi distribuído pelo fabricante.

• Sistema SDS-PAGE (Invitrogen)

• Géis NuPAGE Novex Bis-Tris (Invitrogen). Protocolo SimplyBlue SafeStain Microwave.

Exemplo 1

Clonagem da via de biossíntese de butanol em Saccharomyces cerevisiae por recombinação homóloga e produção de butanol

1.1. Genes e construções Para introdução da via de butanol em S. cerevisiae,

oito genes de Clostridium acetobutylicum são clonados no total:

• thíL codificando acetil CoA-acetiltransfrase [E.C. 2.3.1.9] (SEQ ID. N0:2)

· hbd codificando 3-hidróxibutiril-CoA desidrogenase [E.C.I.I.I.57] (SEQ ID N04)

• crt codificando crotonase ou 3-hidróxibutiril-CoA desidratase [E.C.4.2.1.55] (SEQ ID N06)

• bcd codificando butiril-CoA desidrogenase [E.C.1.3.99 . 2] (SEQ ID NO 8)

• adhE ou ad-hEl ambos codificando álcool desidrogenase ou acetaldeído desidrogenase [E.C.1.2.1.10] (SEQ ID NOS: 10 e SEQ ID N012)

• bdhA, bdhB ambos codificando, respectivamente, butanol desidrogenase AeB dependentes de NADH

[E. C. : 1. 1. 1. -] (SEQ ID NOs : 14 e 16).

As construções de expressão são sintetizadas em DNA2.0 (Menlo Park CA, USA) . Dois vetores de transporte bidirecional de expressão de cópia alta, derivados de 15 pRS425 e pRS426 (Sirkoski R. S. and Hieter P. Genetics, 1989, 122 (1) :19-27), são criados, cada um expressando 3 dos genes da biossíntese de butanol.

Todas as construções sintetizadas contêm flancos homólogos contendo 4 0 pares de base para recombinação 20 homóloga tripartite, conforme descrito por Raymon C.K. e outros, Biotechniques (1999) 26:134-141. 0 gene thiL· gene e o gene hbd são sintetizados como um fragmento expresso do promotor GALl-IO bidirecional e finalizados pelos terminadores de GALl-IO. Os genes crt e bcd são expressos 25 de uma construção semelhante. Os genes adhE e adhEl são sintetizados entre o promotor GAL7 e o terminador, bem como os genes bdhA e bdhB, resultando em quatro construções diferentes.

1.2. Transformação de S. cerevisiae As duas primeiras expressões são criadas por tripartite em recombinação homóloga in vivo em S. cerevisiae CEN.PK102-3A (ura3-52 e leu2-3) da construção de thiL/hbd com a construção de expressão de adhE ou adhEl e o vetor de expressão pRS425 linearizado (LEU2) resultando em 5 pRS4 25THE e pRS425THEl.

Os dois segundos vetores de expressão são criados por tripartite em recombinação homóloga in vivo em CEN.PK102-3A da construção de expressão de crt/bcd e da construção de expressão de bdhA ou bdhB com o vetor de expressão de 10 pRS426 linearizado (URA3) , resultando respectivamente em pRS4 2 6CBA e pRS4 2 6CBB.

Cada plasmídeo contém 3 genes na parte posterior dos promotores induzíveis por galactose.

Os plasmídeos são isolados das cepas de S. cerevisiae transformadas e E. coli DHlOb é transformado com vetores de expressão para selecionar e inspecionar os plasmídeos corretos.

CEN.PK102-3A é transformado com a) pRS425THE e pRS4 2 6CBA, b) pRS425THE e pRS426CBB, c) pRS425THEl e pRS426CBA, d) pRS425THEl e pRS426CBB. Os transformantes são colocados em placas de Base Nitrogênio para Levedura (YNB) sem AA (Difco) + glicose a 2%. No total 10 transf ormantes de cada combinação de plasmídeo são inoculados em YNB sem AA (Difco) + glicose a 0,1% + galactose a 2% e cresceram sob condições aeróbicas em frascos de agitação, condições de oxigênio limitado ou anaeróbicas em 10 mL de culturas. 0 meio para cultivo anaeróbico é suplementado com 0,01 g/L de ergosterol e 0,42 g/L de Tween 80 dissolvidos em etanol (Andreasen and Stier, 1953, J. cell. Physiol, 41, 23-36; Andreasen and Stier, 1954, J. Cell. Physiol, 43: 271-281). Todas culturas de levedura cresceram a 30°C. Após crescimento e indução por toda noite as célula são rotacionadas a jusante e a concentração de butanol é medida no sobrenadante por HPLC, conforme descrito a seguir.

1.3. Análise de Butanol por HPLC

Análise por HPLC: pré-coluna: Cartucho da Biorad Microguard Cation H+. Coluna: Biorad Aminex HPX-87H. Fase móvel: O,OlN H2S04. Reagente de Precipitação: 3 , 3N HC104. Detecção de RI: Refratômetro diferencial Waters 410.

Exemplo 2

Clonagem da via de biossintese de butanol em Saccharomyces cerevisiae empregando enzimas de restrição e produção de butanol usando genes otimizados em par de códons

2.1. Genes e construções

0 método de par de códons conforme revelado no PCT/EP2 007/05594 foi aplicado aos oito genes nativos fornecidos no Exemplo 1, parágrafo 1.1 para expressão em S. cerevisiae. Isto resultou em oito variantes otimizadas de

pares de códons.

SEQ ID NO 17: Par de códons otimizado (CPO) do gene

fchiL

SEQ ID NO 18 : Par de códons otimizado do gene hbd SEQ ID NO 19 : Par de códons otimizado do gene crt (sentido anti-horário) SEQ ID NO 20 : Par de códons otimizado do gene bcd SEQ ID NO 21: Par de códons otimizado do gene adhE SEQ ID NO 22 : Par de códons otimizado do gene adhEl SEQ ID NO 23 : Par de códons otimizado do gene bdhA SEQ ID NO 24 : Par de códons otimizado do gene bdhB. Os oito pares de códons otimizados projetados dos genes foram sintetizados em DNA2.0 (Menlo Park CA, USA). Os genes otimizados dos pares de códons foram usados para fabricar as construções de expressão conforme descrito a seguir.

2.2. Transformação de S. cerevisiae

As primeiras duas construções de expressão foram criadas após digestão dupla da enzima de restrição ApaI/ NotX do vetor pRS415 (LEU) e subseqüentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição Apal/Ascl consistindo tanto no gene adhE quanto no gene adhEl combinado com um fragmento de restrição AscX/Notl contendo o fragmento de thiL/hbd. Após esta ligação tripla, a mistura de ligação foi usada para transformação de E. coli DHlOB (Invitrogen) resultando respectivamente nas construções pRS415THE e pRS415THEl. Estas construções foram subseqüentemente empregadas para a transformação em S. cerevisiae CEN.PKlO2 - 3A (ura3-52 e leu2-3) .

Os segundos dois vetores de expressão foram criados após uma digestão dupla da enzima de restrição BamRX/NotX do vetor pRS416 (URA) e subseqüentemente ligando neste vetor um fragmento de restrição BamRX/AscX consistindo tanto no gene bdhA quanto no gene bdhB combinado com um fragmento de restrição Ascl/Notl contendo o fragmento de crt/bcd. Após esta ligação tripla, a mistura de ligação foi usada para transformação de E. coli DHlOB (Invitrogen) resultando respectivamente nas construções pRS416CBA e pRS416CBB. Estas construções foram usadas subseqüentemente para transformação em S. cerevisiae CEN.PK102-3A (ura3-52 e leu2-3) . Cada plasmídeo continha 3 genes na parte posterior dos promotores e terminadores induzíveis por galactose. A figura 1 mostra uma ilustração esquemática das construções. As listagens de seqüências dos promotores e terminadores são como se segue: SEQ ID NO 25: promotor GAL7; SEQ ID NO 26: terminador GAL 7; SEQ ID NO 27: terminador GAL 10, sentido anti-horário; SEQ ID NO 28: promotor GAL 10, sentido anti-horário; SEQ ID NO 29: promotor GAL 1; SEQ ID NO 30: terminador GAL 1. S. cerevisiae CEN.PK102-3A foi transformado com a)

pRS415THE e pRS416CBA, b) pRS415THE e pRS416CBB, c) pRS415THE1 e pRS416CBA ou d) pRS415THEl e pRS416CBB. Os transformantes são colocados em placas de Base Nitrogênio para Levedura (YNB) sem AA (Difco) + glicose a 2%. No total 10 transformantes de cada combinação de plasmídeo são inoculados em YNB sem AA (Difco) + glicose a 0,1% + galactose a 2% e cresceram sob condições aeróbicas. Subseqüentemente, as leveduras transformadas se desenvolveram microaerobicamente em culturas de 10 mL em frascos que foram fechados com batentes de borracha e tampas de alumínio. Todas as culturas de levedura foram desenvolvidas a 250C. Após indução por toda noite, alíquotas das culturas foram removidas após 40, 4 8 e 64 horas de cultivo. As células foram rotacionadas a jusante e a concentração de butanol foi medida no sobrenadante por cromatografia gasosa aérea (HS-GC) conforme descrito a seguir.

2.3. Análise de Butanol por HS-GC

As amostras foram analisadas em uma HS-GC com um detector de ionização por chama e um sistema de injeção automático. Coluna J&W DB-I de 2 0 m de comprimento, diâmetro interno de 0,53 mm, df de 5 pm. Foram utilizadas as seguintes condições: hélio como um gás de transporte com uma taxa de fluxo de 5 mL/min. A temperatura da coluna foi ajustada a IlO0C. O injetor foi ajustado a 140°C e o detector operou a 300°C. Os dados foram obtidos usando software Chromeleon. As amostras foram aquecidas a 600C por 2 0 minutos no amostrador aéreo. Um mL dos voláteis aéreos foi automaticamente injetado na coluna. Todos transformantes diferentes compreendendo tanto um

gene adhE e bdhA ou bdhA quanto adhEl e bdhA ou bdhB otimizados com códons foram capazes de produzir butanol. A concentração de butanol no sobrenadante esteve entre 5-10 mg de butanol/L após 4 0 horas de cultivo, 8-13 mg de butanol/L após 48 horas de cultivo e 15 e 20 mg de butanol/L após 64 horas de cultivo. Uma cepa de S. cerevisiae compreendendo genes não otimizados por par de códons produziu 0,1-2 mg/L após 64 horas de cultivo. Exemplo 3

Efeito do Acetato no Rendimento do Butanol

0 efeito da presença de acetato no meio de fermentação no rendimento do butanol foi determinado com a cepa de levedura produzindo butanol CEN.PK102-3A transformada com pRS425THE e pRS426CBB, conforme descrito no exemplo 2. Esta cepa de levedura foi inoculada em meio de Verduyn (Verduyn, C., Postma, E., Scheffers W. A., van Dijken, J. P. (1992), Yeast 8, 501-517), que foi ajustado como se segue: sulfato de amônio foi substituído com uréia (2 g/L) , galactose (40 g/L) era a única fonte de carbono e o meio foi suplementado com 2 g/L de acetato de potássio, 0,01 g/L de ergosterol e 0,42 g/L de Tween 80 dissolvido em etanol (Andreasen and Stier, 1953, J. cell. Physiol, 41, 23-36; Andreasen and Stier, 1954, J. Cell. Physiol, 43: 271-281). As culturas de referência não continham 2 g/L de acetato de potássio. As células se desenvolveram microaerobicamente em 50 mL de meio em frascos que foram fechados com batentes de borracha e tampas de alumínio. Os frascos são agitados brandamente a °C. Em uma densidade óptica de 1,5 a 600 nm (após 72 horas) as células foram giradas a jusante e a concentração de butanol foi medida no sobrenadante por HS-GC, conforme descrito no exemplo 2.

0 rendimento do butanol nas culturas compreendendo acetato foi de 2 0 mg/L. O rendimento de butanol nas culturas que não compreendiam acetato foi de 13 mg/L. LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> DSM IP Assets B.V. Raamsdonk, LM van den Berg, MA

de Laat, WTAM

<120> Produção de Butanol em uma Célula eucariótica.

<13 0 > 25755WO

<140> 25755WO <141> 30/10/2007

<160 > 30

<170> PatentIn na versão 3.2

<210> 1 <211> 392 <212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum <400> 1

25

Met Lys Glu Val Val Ile Ala Ser Ala Val Arg Thr Ala Ile Gly Ser 10 15

3 0 Tyr Gly Lys Ser Leu Lys Asp Val Pro Ala Val Asp Leu Gly Ala Thr 25 30

Ala Ile Lys Glu Ala Val Lys Lys Ala Gly Ile Lys Pro Glu Asp Val 35 40 45

Asn Glu Val Ile Leu Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Leu Gly Gln Asn 50 55 60

40

Pro Ala Arg Gln Ala Ser Phe Lys Ala Gly Leu Pro Val Glu Ile Pro 65 70 75 80

45

Ala Met Thr Ile Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Arg Thr Val Ser 85 90 95

0 Leu Ala Ala Gln Ile Ile Lys Ala Gly Asp Ala Asp Val Ile Ile Ala 100 105 110

Gly Gly Met Glu Asn Met Ser Arg Ala Pro Tyr Leu Ala Asn Asn Ala 55 115 120 125

Arg Trp Gly Tyr Arg Met Gly Asn Ala Lys Phe Val Asp Glu Met Ile 130 135 140

60 Thr Asp Gly Leu Trp Asp Ala Phe Asn Asp Tyr His Met Gly Ile Thr 145 150 155 160

Ala Glu Asn Ile Ala Glu Arg Trp Asn Ile Ser Arg Glu Glu Gln Asp

165 170 175

Glu Phe Ala Leu Ala Ser Gln Lys Lys Ala Glu Glu Ala Ile Lys Ser 180 185 190

Gly Gln Phe Lys Asp Glu Ile Val Pro Val Val Ile Lys Gly Arg Lys 195 200 205

15

Gly Glu Thr Val Val Asp Thr Asp Glu His Pro Arg Phe Gly Ser Thr 210 215 220

20

Ile Glu Gly Leu Ala Lys Leu Lys Pro Ala Phe Lys Lys Asp Gly Thr 225 230 235 240

2 5 Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Cys Ala Ala Val Leu

245 250 255

Val Ile Met Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Leu Gly Val Lys Pro Leu 260 265 270

Ala Lys Ile Val Ser Tyr Gly Ser Ala Gly Val Asp Pro Ala Ile Met 275 280 285

35

Gly Tyr Gly Pro Phe Tyr Ala Thr Lys Ala Ala Ile Glu Lys Ala Gly 290 295 300

40

Trp Thr Val Asp Glu Leu Asp Leu Ile Glu Ser Asn Glu Ala Phe Ala 305 310 315 320

4 5 Ala Gln Ser Leu Ala Val Ala Lys Asp Leu Lys Phe Asp Met Asn Lys

325 330 335

Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly Ala 50 340 345 350

Ser Gly Ala Arg Ile Leu Val Thr Leu Val His Ala Met Gln Lys Arg 355 360 365

55

Asp Ala Lys Lys Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Gln Gly 370 375 380

60

Thr Ala Ile Leu Leu Glu Lys Cys 15

385 390

<210> 2 <211> 1179 <212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum <400> 2

atgaaagaag ttgtaatagc tagtgcagta agaacagcga ttggatctta tggaaagtct 60

120 180 240 300

2 0 attataaaag caggagatgc tgacgtaata atagcaggtg gtatggaaaa tatgtctaga 360

420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1179

25

30

35

40

45

50

55

60

<400> 2 atgaaagaag ttgtaatagc tagtgcagta agaacagcga ttggatctta tggaaagtct cttaaggatg taccagcagt agatttagga gctacagcta taaaggaagc agttaaaaaa gcaggaataa aaccagagga tgttaatgaa gtcattttag gaaatgttct tcaagcaggt ttaggacaga atccagcaag acaggcatct tttaaagcag gattaccagt tgaaattcca gctatgacta ttaataaggt ttgtggttca ggacttagaa cagttagctt agcagcacaa attataaaag caggagatgc tgacgtaata atagcaggtg gtatggaaaa tatgtctaga gctccttact tagcgaataa cgctagatgg ggatatagaa tgggaaacgc taaatttgtt gatgaaatga tcactgacgg attgtgggat gcatttaatg attaccacat gggaataaca gcagaaaaca tagctgagag atggaacatt tcaagagaag aacaagatga gtttgctctt gcatcacaaa aaaaagctga agaagctata aaatcaggtc aatttaaaga tgaaatagtt cctgtagtaa ttaaaggcag aaagggagaa actgtagttg atacagatga gcaccctaga tttggatcaa ctatagaagg acttgcaaaa ttaaaacctg ccttcaaaaa agatggaaca gttacagctg gtaatgcatc aggattaaat gactgtgcag cagtacttgt aatcatgagt gcagaaaaag ctaaagagct tggagtaaaa ccacttgcta agatagtttc ttatggttca gcaggagttg acccagcaat aatgggatat ggacctttct atgcaacaaa agcagctatt gaaaaagcag gttggacagt tgatgaatta gatttaatag aatcaaatga agcttttgca gctcaaagtt tagcagtagc aaaagattta aaatttgata tgaataaagt aaatgtaaat ggaggagcta ttgcccttgg tcatccaatt ggagcatcag gtgcaagaat actcgttact cttgtacacg caatgcaaaa aagagatgca aaaaaaggct tagcaacttt atgtataggt ggcggacaag gaacagcaat attgctagaa aagtgctag

<210 > 3 <211> 282 <212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum <400> 3

Met Lys Lys Val Cys Val Ile Gly Ala Gly Thr Met Gly Ser Gly Ile 10 15 Ala Gln Ala Phe Ala Ala Lys Gly Phe Glu Val Val Leu Arg Asp Ile 25 30

Lys Asp Glu Phe Val Asp Arg Gly Leu Asp Phe Ile Asn Lys Asn Leu 40 45

Ser Lys Leu Val Lys Lys Gly Lys Ile Glu Glu Ala Thr Lys Val Glu 50 55 60

Ile Leu Thr Arg Ile Ser Gly Thr Val Asp Leu Asn Met Ala Ala Asp 65 70 75 80

15

Cys Asp Leu Val Ile Glu Ala Ala Val Glu Arg Met Asp Ile Lys Lys 85 90 95

20

Gln Ile Phe Ala Asp Leu Asp Asn Ile Cys Lys Pro Glu Thr Ile Leu 100 105 HO

Ala Ser Asn Thr Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Val Ala Ser Ala Thr 115 120 125

Lys Arg Pro Asp Lys Val Ile Gly Met His Phe Phe Asn Pro Ala Pro 130 135 140

Val Met Lys Leu Val Glu Val Ile Arg Gly Ile Ala Thr Ser Gln Glu 145 150 155 160

35

Thr Phe Asp Ala Val Lys Glu Thr Ser Ile Ala Ile Gly Lys Asp Pro 165 170 175

40

Val Glu Val Ala Glu Ala Pro Gly Phe Val Val Asn Arg Ile Leu Ile 180 185 190

4 5 Pro Met Ile Asn Glu Ala Val Gly Ile Leu Ala Glu Gly Ile Ala Ser 195 200 205

Val Glu Asp Ile Asp Lys Ala Met Lys Leu Gly Ala Asn His Pro Met 50 210 215 220

Gly Pro Leu Glu Leu Gly Asp Phe Ile Gly Leu Asp Ile Cys Leu Ala 225 230 235 240

55

Ile Met Asp Val Leu Tyr Ser Glu Thr Gly Asp Ser Lys Tyr Arg Pro 245 250 255

60

His Thr Leu Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Gly Trp Leu Gly Arg Lys 260 265 270

Ser Gly Lys Gly Phe Tyr Asp Tyr Ser Lys 275 280

<210> 4

<211> 849

<212> DNA

<213> Clostridium acetobultylicum

<400> 4

15

25

60 120 180

2 0 actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc ggaacagttg accttaatat ggcagctgat 240

300 360 420 480

3 0 acttttgatg cagttaaaga gacatctata gcaataggaa aagatcctgt agaagtagca 540

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tcaaaataa 849

35

40

55

atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt actatgggtt caggaattgc tcaggcattt gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga gatattaaag atgaatttgt tgatagagga ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa ttagttaaaa aaggaaagat agaagaagct actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc ggaacagttg accttaatat ggcagctgat tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa agaatggata ttaaaaagca gatttttgct gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca attcttgcat caaatacatc atcactttca ataacagaag tggcatcagc aactaaaaga cctgataagg ttataggtat gcatttcttt aatccagctc ctgttatgaa gcttgtagag gtaataagag gaatagctac atcacaagaa acttttgatg cagttaaaga gacatctata gcaataggaa aagatcctgt agaagtagca gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata ttaataccaa tgattaatga agcagttggt atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa gacatagata aagctatgaa acttggagct aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt gattttatag gtcttgatat atgtcttgct ataatggatg ttttatactc agaaactgga gattctaagt atagaccaca tacattactt aagaagtatg taagagcagg atggcttgga agaaaatcag gaaaaggttt ctacgattat

45 <210> 5

<211> 261 <212> PRT

<213> Clostrdium acetobutylicum 50 <400> 5

Met Glu Leu Asn Asn Val Ile Leu Glu Lys Glu Gly Lys Val Ala Val 10 15

Val Thr Ile Asn Arg Pro Lys Ala Leu Asn Ala Leu Asn Ser Asp Thr 25 30

6 0 Leu Lys Glu Met Asp Tyr Val Ile Gly Glu Ile Glu Asn Asp Ser Glu 40 45 Val Leu Ala Val Ile Leu Thr Gly Ala Gly Glu Lys Ser Phe Val Ala 50 55 60

5

Gly Ala Asp Ile Ser Glu Met Lys Glu Met Asn Thr Ile Glu Gly Arg 65 70 75 80

10

Lys Phe Gly Ile Leu Gly Asn Lys Val Phe Arg Arg Leu Glu Leu Leu 85 90 95

Glu Lys Pro Val Ile Ala Ala Val Asn Gly Phe Ala Leu Gly Gly Gly 100 105 110

Cys Glu Ile Ala Met Ser Cys Asp Ile Arg Ile Ala Ser Ser Asn Ala 115 120 125

Arg Phe Gly Gln Pro Glu Val Gly Leu Gly Ile Thr Pro Gly Phe Gly 130 135 140

25

Gly Thr Gln Arg Leu Ser Arg Leu Val Gly Met Gly Met Ala Lys Gln 145 150 155 160

30

Leu Ile Phe Thr Ala Gln Asn Ile Lys Ala Asp Glu Ala Leu Arg Ile 165 170 175

3 5 Gly Leu Val Asn Lys Val Val Glu Pro Ser Glu Leu Met Asn Thr Ala 180 185 190

Lys Glu Ile Ala Asn Lys Ile Val Ser Asn Ala Pro Val Ala Val Lys 40 195 200 205

Leu Ser Lys Gln Ala Ile Asn Arg Gly Met Gln Cys Asp Ile Asp Thr 210 215 220

45

Ala Leu Ala Phe Glu Ser Glu Ala Phe Gly Glu Cys Phe Ser Thr Glu 225 230 235 240

50

Asp Gln Lys Asp Ala Met Thr Ala Phe Ile Glu Lys Arg Lys Ile Glu 245 250 255

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<210> 6 60 <211> 786 <212> DNA 15

<213> Clostridium acetobutylicum <400> 6

60 120 180

tcatttgtag caggagcaga tatttctgag atgaaggaaa tgaataccat tgaaggtaga 240

300 360 420 480

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600 660 720 780

3 0 agatag 786

<210> 7

<211> 379

3 5 <212> PRT

<213> Clostridium acetobutlyicum

<400> 7

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10 15

Arg Glu Phe Ala Glu Asn Glu Val Lys Pro Ile Ala Ala Glu Ile Asp 45 20 25 30

Glu Thr Glu Arg Phe Pro Met Glu Asn Val Lys Lys Met Gly Gln Tyr 40 45

25

50

55

atggaactaa acaatgtcat ccttgaaaag gaaggtaaag ttgctgtagt taccattaac agacctaaag cattaaatgc gttaaatagt gatacactaa aagaaatgga ttatgttata ggtgaaattg aaaatgatag cgaagtactt gcagtaattt taactggagc aggagaaaaa tcatttgtag caggagcaga tatttctgag atgaaggaaa tgaataccat tgaaggtaga aaattcggga tacttggaaa taaagtgttt agaagattag aacttcttga aaagcctgta atagcagctg ttaatggttt tgctttagga ggcggatgcg aaatagctat gtcttgtgat ataagaatag cttcaagcaa cgcaagattt ggtcaaccag aagtaggtct cggaataaca cctggttttg gtggtacaca aagactttca agattagttg gaatgggcat ggcaaagcag cttatattta ctgcacaaaa tataaaggca gatgaagcat taagaatcgg acttgtaaat aaggtagtag aacctagtga attaatgaat acagcaaaag aaattgcaaa caaaattgtg agcaatgctc cagtagctgt taagttaagc aaacaggcta ttaatagagg aatgcagtgt gatattgata ctgctttagc atttgaatca gaagcatttg gagaatgctt ttcaacagag gatcaaaagg atgcaatgac agctttcata gagaaaagaa aaattgaagg cttcaaaaat agatag

Gly Met Met Gly Ile Pro Phe Ser Lys Glu Tyr Gly Gly Ala Gly Gly 50 55 60

Asp Val Leu Ser Tyr Ile Ile Ala Val Glu Glu Leu Ser Lys Val Cys 65 70 75 80

60 Gly Thr Thr Gly Val Ile Leu Ser Ala His Thr Ser Leu Cys Ala Ser

85 90 95 Leu Ile Asn Glu His Gly Thr Glu Glu Gln Lys Gln Lys Tyr Leu Val 100 105 110

5

Pro Leu Ala Lys Gly Glu Lys Ile Gly Ala Tyr Gly Leu Thr Glu Pro 115 120 125

10

Asn Ala Gly Thr Asp Ser Gly Ala Gln Gln Thr Val Ala Val Leu Glu 130 135 140

Gly Asp His Tyr Val Ile Asn Gly Ser Lys Ile Phe Ile Thr Asn Gly 145 150 155 160

Gly Val Ala Asp Thr Phe Val Ile Phe Ala Met Thr Asp Arg Thr Lys 165 170 175

Gly Thr Lys Gly Ile Ser Ala Phe Ile Ile Glu Lys Gly Phe Lys Gly 180 185 190

25

Phe Ser Ile Gly Lys Val Glu Gln Lys Leu Gly Ile Arg Ala Ser Ser 195 200 205

30

Thr Thr Glu Leu Val Phe Glu Asp Met Ile Val Pro Val Glu Asn Met 210 215 220

3 5 Ile Gly Lys Glu Gly Lys Gly Phe Pro Ile Ala Met Lys Thr Leu Asp 225 230 235 240

Gly Gly Arg Ile Gly Ile Ala Ala Gln Ala Leu Gly Ile Ala Glu Gly 40 245 250 255

Ala Phe Asn Glu Ala Arg Ala Tyr Met Lys Glu Arg Lys Gln Phe Gly 260 265 270

45

Arg Ser Leu Asp Lys Phe Gln Gly Leu Ala Trp Met Met Ala Asp Met 275 280 285

50

Asp Val Ala Ile Glu Ser Ala Arg Tyr Leu Val Tyr Lys Ala Ala Tyr 290 295 300

55 Leu Lys Gln Ala Gly Leu Pro Tyr Thr Val Asp Ala Ala Arg Ala Lys 305 310 315 320

Leu His Ala Ala Asn Val Ala Met Asp Val Thr Thr Lys Ala Val Gln 60 325 330 335 25

35

45

Leu Phe Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Lys Asp Tyr Pro Val Glu Arg Met 340 345 350

Met Arg Asp Ala Lys Ile Thr Glu Ile Tyr Glu Gly Thr Ser Glu Val 355 360 365

Gln Lys Leu Val Ile Ser Gly Lys Ile Phe Arg 370 375

<210> 8 <211> 1140 <212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum <400> 8

2 0 atggatttta atttaacaag agaacaagaa ttagtaagac agatggttag agaatttgct 60

120 180 240 300

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atggatttta atttaacaag agaacaagaa ttagtaagac agatggttag agaatttgct gaaaatgaag ttaaacctat agcagcagaa attgatgaaa cagaaagatt tccaatggaa aatgtaaaga aaatgggtca gtatggtatg atgggaattc cattttcaaa agagtatggt ggcgcaggtg gagatgtatt atcttatata atcgccgttg aggaattatc aaaggtttgc ggtactacag gagttattct ttcagcacat acatcacttt gtgcttcatt aataaatgaa catggtacag aagaacaaaa acaaaaatat ttagtacctt tagctaaagg tgaaaaaata ggtgcttatg gattgactga gccaaatgca ggaacagatt ctggagcaca acaaacagta gctgtacttg aaggagatca ttatgtaatt aatggttcaa aaatattcat aactaatgga ggagttgcag atacttttgt tatatttgca atgactgaca gaactaaagg aacaaaaggt atatcagcat ttataataga aaaaggcttc aaaggtttct ctattggtaa agttgaacaa aagcttggaa taagagcttc atcaacaact gaacttgtat ttgaagatat gatagtacca gtagaaaaca tgattggtaa agaaggaaaa ggcttcccta tagcaatgaa aactcttgat ggaggaagaa ttggtatagc agctcaagct ttaggtatag ctgaaggtgc tttcaacgaa gcaagagctt acatgaagga gagaaaacaa tttggaagaa gccttgacaa attccaaggt cttgcatgga tgatggcaga tatggatgta gctatagaat cagctagata tttagtatat aaagcagcat atcttaaaca agcaggactt ccatacacag ttgatgctgc aagagctaag cttcatgctg caaatgtagc aatggatgta acaactaagg cagtacaatt atttggtgga tacggatata caaaagatta tccagttgaa agaatgatga gagatgctaa gataactgaa atatatgaag gaacttcaga agttcagaaa ttagttattt caggaaaaat ttttagataa

55

<210 > 9 60 <211 > 858 <212 > PRT

1020 1080 1140 <213> Clostridium acetobutylicum <400> 9

Met Lys Val Thr Asn Gln Lys Glu Leu Lys Gln Lys Leu Asn Glu Leu 10 15

Arg Glu Ala Gln Lys Lys Phe Ala Thr Tyr Thr Gln Glu Gln Val Asp 20 25 30

Lys Ile Phe Lys Gln Cys Ala Ile Ala Ala Ala Lys Glu Arg Ile Asn 40 45

15

Leu Ala Lys Leu Ala Val Glu Glu Thr Gly Ile Gly Leu Val Glu Asp 50 55 60

20

Lys Ile Ile Lys Asn His Phe Ala Ala Glu Tyr Ile Tyr Asn Lys Tyr 65 70 75 80

2 5 Lys Asn Glu Lys Thr Cys Gly Ile Ile Asp His Asp Asp Ser Leu Gly

85 90 95

Ile Thr Lys Val Ala Glu Pro Ile Gly Ile Val Ala Ala Ile Val Pro 100 105 110

Thr Thr Asn Pro Thr Ser Thr Ala Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu 115 120 125

35

Lys Thr Arg Asn Ala Ile Phe Phe Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Lys 130 135 140

40

Ser Thr Ile Ala Ala Ala Lys Leu Ile Leu Asp Ala Ala Val Lys Ala 145 150 155 160

4 5 Gly Ala Pro Lys Asn Ile Ile Gly Trp Ile Asp Glu Pro Ser Ile Glu

165 170 175

Leu Ser Gln Asp Leu Met Ser Glu Ala Asp Ile Ile Leu Ala Thr Gly 50 180 185 190

Gly Pro Ser Met Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ala Ile 195 200 205

55

Gly Val Gly Ala Gly Asn Thr Pro Ala Ile Ile Asp Glu Ser Ala Asp 210 215 220

60

Ile Asp Met Ala Val Ser Ser Ile Ile Leu Ser Lys Thr Tyr Asp Asn 225 230 235 240

Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Ile Leu Val Met Asn Ser Ile 245 250 255

Tyr Glu Lys Val Lys Glu Glu Phe Val Lys Arg Gly Ser Tyr Ile Leu 260 265 270

10

Asn Gln Asn Glu Ile Ala Lys Ile Lys Glu Thr Met Phe Lys Asn Gly 275 280 285

15

Ala Ile Asn Ala Asp Ile Val Gly Lys Ser Ala Tyr Ile Ile Ala Lys 290 295 300

2 0 Met Ala Gly Ile Glu Val Pro Gln Thr Thr Lys Ile Leu Ile Gly Glu 305 310 315 320

Val Gln Ser Val Glu Lys Ser Glu Leu Phe Ser His Glu Lys Leu Ser 325 330 335

Pro Val Leu Ala Met Tyr Lys Val Lys Asp Phe Asp Glu Ala Leu Lys 340 345 350

30

Lys Ala Gln Arg Leu Ile Glu Leu Gly Gly Ser Gly His Thr Ser Ser 355 360 365

35

Leu Tyr Ile Asp Ser Gln Asn Asn Lys Asp Lys Val Lys Glu Phe Gly 370 375 380

4 0 Leu Ala Met Lys Thr Ser Arg Thr Phe Ile Asn Met Pro Ser Ser Gln 385 390 395 400

Gly Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Ala Ile Ala Pro Ser Phe Thr 45 405 410 415

Leu Gly Cys Gly Thr Trp Gly Gly Asn Ser Val Ser Gln Asn Val Glu 420 425 430

50

Pro Lys His Leu Leu Asn Ile Lys Ser Val Ala Glu Arg Arg Glu Asn 435 440 445

55

Met Leu Trp Phe Lys Val Pro Gln Lys Ile Tyr Phe Lys Tyr Gly Cys 450 455 460

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5

Ile Thr Lys Val Leu Asp Glu Ile Asp Ile Lys Tyr Ser Ile Phe Thr 500 505 510

10

Asp Ile Lys Ser Asp Pro Thr Ile Asp Ser Val Lys Lys Gly Ala Lys 515 520 525

Glu Met Leu Asn Phe Glu Pro Asp Thr Ile Ile Ser Ile Gly Gly Gly 530 535 540

Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Val Met His Leu Leu Tyr Glu Tyr Pro 545 550 555 560

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25

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30

Ile Pro Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ser Glu Ala Thr Pro Phe Ala Val 595 600 605

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Leu Thr Pro Asn Met Ala Ile Ile Asp Thr Glu Leu Met Leu Asn Met 40 625 630 635 640

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45

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50

Ala Leu Arg Ala Ile Lys Met Ile Phe Lys Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr 675 680 685

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Ser Asn Ile Ala Gly Met Ala Phe Ala Asn Ala Phe Leu Gly Val Cys 60 705 710 715 720 His Ser Met Ala His Lys Leu Gly Ala Met His His Val Pro His Gly 725 730 735

5

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20

Leu Lys Ile Asp Leu Ser Ile Pro Gln Asn Ile Ser Ala Ala Gly Ile 805 810 815

25

Asn Lys Lys Asp Phe Tyr Asn Thr Leu Asp Lys Met Ser Glu Leu Ala 820 825 830

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<210> 10

<211> 2577

4 0 <212 > DNA

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 10

atgaaagtta caaatcaaaa agaactaaaa caaaagctaa atgaattgag agaagcgcaa 60

45

aagaagtttg caacctatac tcaagagcaa gttgataaaa tttttaaaca atgtgccata 120

gccgcagcta aagaaagaat aaacttagct aaattagcag tagaagaaac aggaataggt 180

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aaaaatgaaa aaacttgtgg cataatagac catgacgatt ctttaggcat aacaaaggtt 3 00

gctgaaccaa ttggaattgt tgcagccata gttcctacta ctaatccaac ttccacagca 360

55

attttcaaat cattaatttc tttaaaaaca agaaacgcaa tattcttttc accacatcca 420

cgtgcaaaaa aatctacaat tgctgcagca aaattaattt tagatgcagc tgttaaagca 4 80

6 0 ggagcaccta aaaatataat aggctggata gatgagccat caatagaact ttctcaagat 54 0 ttgatgagtg aagctgatat aatattagca tattcatctg gaaaacctgc aattggtgtt gagagtgcag atatagatat ggcagtaagc ggagtaatat gcgcttctga acaatcaata aaagaggaat ttgtaaaacg aggatcatat

10

aaagaaacta tgtttaaaaa tggagctatt ataattgcta aaatggcagg aattgaagtt gtacaatctg ttgaaaaaag cgagctgttc atgtataaag ttaaggattt tgatgaagct ggtggaagtg gacacacgtc atctttatat

20

aaagaatttg gattagcaat gaaaacttca ggagcaagcg gagatttata caattttgcg

2 5 acttggggag gaaactctgt atcgcaaaat

agtgttgctg aaagaaggga aaatatgctt aaatatggat gtcttagatt tgcattaaaa

30

tttatagtaa cagataaaga tctttttaaa ctagatgaga tagatattaa atacagtata

3 5 gattcagtaa aaaaaggtgc taaagaaatg

attggtggtg gatcgccaat ggatgcagca gaagcagaaa ttgaaaatct agctataaac

40

ttccctaaat taggtacaaa ggcgatttca tcagaggcaa caccttttgc agttataact

4 5 acttcttatg aattgacccc aaacatggca

cctagaaaat taacagcagc aactggaata gtttcggtta tggctacgga ttatactgat

50

tttaaatatt tgcctagagc ctataaaaat atggcacatg cctctaatat tgcggggatg

5 cattcaatgg ctcataaact tggggcaatg

gtattaatag aagaagttat taaatataac ttccctcaat ataaatctcc taatgctaag

60

aatttaaagg gtactagcga taccgaaaag

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atactcaatc aaaatgaaat agctaaaata 84 0

aatgctgaca tagttggaaa atctgcttat 900

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tcacatgaaa aactatcacc agtacttgca 1020

ctaaaaaagg cacaaaggct aatagaatta 1080

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aggacattta ttaacatgcc ttcttcacag 1200

atagcaccat catttactct tggatgcggc 1260

gtagagccta aacatttatt aaatattaaa 1320

tggtttaaag tgccacaaaa aatatatttt 1380

gaattaaaag atatgaataa gaaaagagcc 144 0

cttggatatg ttaataaaat aacaaaggta 1500

tttacagata ttaaatctga tccaactatt 1560

cttaactttg aacctgatac tataatctct 1620

aaggttatgc acttgttata tgaatatcca 1680

tttatggata taagaaagag aatatgcaat 174 0

gtagctattc ctacaactgc tggtaccggt 1800

aatgatgaaa caggaatgaa atacccttta 1860

ataatagata ctgaattaat gttaaatatg 1920

gatgcattag ttcatgctat agaagcatat 1980

gaattagcct taagagcaat aaaaatgata 204 0

gggactaacg acattgaagc aagagaaaaa 2100

gcatttgcaa atgctttctt aggtgtatgc 2160

catcacgttc cacatggaat tgcttgtgct 2220

gctacagact gtccaacaaa gcaaacagca 2280

agaaaatatg ctgaaattgc agagtatttg 2340

gtaacagcct taatagaagc tatttcaaag 2400 ttaaagatag atttgagtat tccacaaaat ataagtgccg ctggaataaa taaaaaagat 24 60

ttttataata cgctagataa aatgtcagag cttgcttttg atgaccaatg tacaacagct 2520

5

aatcctaggt atccacttat aagtgaactt aaggatatct atataaaatc attttaa 2577

<210> 11 <211> 862 <212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum <400> 11

15

Met Lys Val Thr Thr Val Lys Glu Leu Asp Glu Lys Leu Lys Val Ile 10 15

2 0 Lys Glu Ala Gln Lys Lys Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Glu Met Val Asp 25 30

Glu Ile Phe Arg Asn Ala Ala Met Ala Ala Ile Asp Ala Arg Ile Glu 35 40 45

Leu Ala Lys Ala Ala Val Leu Glu Thr Gly Met Gly Leu Val Glu Asp 50 55 60

30

Lys Val Ile Lys Asn His Phe Ala Gly Glu Tyr Ile Tyr Asn Lys Tyr 65 70 75 80

35

Lys Asp Glu Lys Thr Cys Gly Ile Ile Glu Arg Asn Glu Pro Tyr Gly 85 90 95

4 0 Ile Thr Lys Ile Ala Glu Pro Ile Gly Val Val Ala Ala Ile Ile Pro 100 105 110

Val Thr Asn Pro Thr Ser Thr Thr Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu 45 115 120 125

Lys Thr Arg Asn Gly Ile Phe Phe Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Lys 130 135 140

50

Ser Thr Ile Leu Ala Ala Lys Thr Ile Leu Asp Ala Ala Val Lys Ser 145 150 155 160

55

Gly Ala Pro Glu Asn Ile Ile Gly Trp Ile Asp Glu Pro Ser Ile Glu 165 170 175

6 0 Leu Thr Gln Tyr Leu Met Gln Lys Ala Asp Ile Thr Leu Ala Thr Gly 180 185 190 Gly Pro Ser Leu Val Lys Ser Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ala Ile 195 200 205

5

Gly Val Gly Pro Gly Asn Thr Pro Val Ile Ile Asp Glu Ser Ala His 210 215 220

10

Ile Lys Met Ala Val Ser Ser Ile Ile Leu Ser Lys Thr Tyr Asp Asn 225 230 235 240

Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Val Ile Val Leu Lys Ser Ile

245 250 255

Tyr Asn Lys Val Lys Asp Glu Phe Gln Glu Arg Gly Ala Tyr Ile Ile 260 265 270

Lys Lys Asn Glu Leu Asp Lys Val Arg Glu Val Ile Phe Lys Asp Gly 275 280 285

25

Ser Val Asn Pro Lys Ile Val Gly Gln Ser Ala Tyr Thr Ile Ala Ala 290 295 300

30

Met Ala Gly Ile Lys Val Pro Lys Thr Thr Arg Ile Leu Ile Gly Glu 305 310 315 320

3 5 Val Thr Ser Leu Gly Glu Glu Glu Pro Phe Ala His Glu Lys Leu Ser

325 330 335

Pro Val Leu Ala Met Tyr Glu Ala Asp Asn Phe Asp Asp Ala Leu Lys 40 340 345 350

Lys Ala Val Thr Leu Ile Asn Leu Gly Gly Leu Gly His Thr Ser Gly 355 360 365

45

Ile Tyr Ala Asp Glu Ile Lys Ala Arg Asp Lys Ile Asp Arg Phe Ser 370 375 380

50

Ser Ala Met Lys Thr Val Arg Thr Phe Val Asn Ile Pro Thr Ser Gln 385 390 395 400

5 Gly Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Arg Ile Pro Pro Ser Phe Thr

405 410 415

Leu Gly Cys Gly Phe Trp Gly Gly Asn Ser Val Ser Glu Asn Val Gly 60 420 425 430 Pro Lys His Leu Leu Asn Ile Lys Thr Val Ala Glu Arg Arg Glu Asn 435 440 445

5

Met Leu Trp Phe Arg Val Pro His Lys Val Tyr Phe Lys Phe Gly Cys 450 455 460

Leu Gln Phe Ala Leu Lys Asp Leu Lys Asp Leu Lys Lys Lys Arg Ala 465 470 475 480

Phe Ile Val Thr Asp Ser Asp Pro Tyr Asn Leu Asn Tyr Val Asp Ser 485 490 495

Ile Ile Lys Ile Leu Glu His Leu Asp Ile Asp Phe Lys Val Phe Asn 500 505 510

20

Lys Val Gly Arg Glu Ala Asp Leu Lys Thr Ile Lys Lys Ala Thr Glu 515 520 525

25

Glu Met Ser Ser Phe Met Pro Asp Thr Ile Ile Ala Leu Gly Gly Thr 530 535 540

3 0 Pro Glu Met Ser Ser Ala Lys Leu Met Trp Val Leu Tyr Glu His Pro 545 550 555 560

Glu Val Lys Phe Glu Asp Leu Ala Ile Lys Phe Met Asp Ile Arg Lys 565 570 575

Arg Ile Tyr Thr Phe Pro Lys Leu Gly Lys Lys Ala Met Leu Val Ala 580 585 590

40

Ile Thr Thr Ser Ala Gly Ser Gly Ser Glu Val Thr Pro Phe Ala Leu 595 600 605

45

Val Thr Asp Asn Asn Thr Gly Asn Lys Tyr Met Leu Ala Asp Tyr Glu 610 615 620

0 Met Thr Pro Asn Met Ala Ile Val Asp Ala Glu Leu Met Met Lys Met 625 630 635 640

Pro Lys Gly Leu Thr Ala Tyr Ser Gly Ile Asp Ala Leu Val Asn Ser 55 645 650 655

60

Ile Glu Ala Tyr Thr Ser Val Tyr Ala Ser Glu Tyr Thr Asn Gly Leu 660 665 670 Ala Leu Glu Ala Ile Arg Leu Ile Phe Lys Tyr Leu Pro Glu Ala Tyr 675 680 685

Lys Asn Gly Arg Thr Asn Glu Lys Ala Arg Glu Lys Met Ala His Ala 690 695 700

Ser Thr Met Ala Gly Met Ala Ser Ala Asn Ala Phe Leu Gly Leu Cys 705 710 715 720

His Ser Met Ala Ile Lys Leu Ser Ser Glu His Asn Ile Pro Ser Gly 725 730 735

15

Ile Ala Asn Ala Leu Leu Ile Glu Glu Val Ile Lys Phe Asn Ala Val 740 745 750

20

Asp Asn Pro Val Lys Gln Ala Pro Cys Pro Gln Tyr Lys Tyr Pro Asn 755 760 765

2 5 Thr Ile Phe Arg Tyr Ala Arg Ile Ala Asp Tyr Ile Lys Leu Gly Gly 770 775 780

Asn Thr Asp Glu Glu Lys Val Asp Leu Leu Ile Asn Lys Ile His Glu 785 790 795 800

Leu Lys Lys Ala Leu Asn Ile Pro Thr Ser Ile Lys Asp Ala Gly Val 805 810 815

35

Leu Glu Glu Asn Phe Tyr Ser Ser Leu Asp Arg Ile Ser Glu Leu Ala 820 825 830

40

Leu Asp Asp Gln Cys Thr Gly Ala Asn Pro Arg Phe Pro Leu Thr Ser 835 840 845

4 5 Glu Ile Lys Glu Met Tyr Ile Asn Cys Phe Lys Lys Gln Pro 850 855 860

<210> 12

50 <211> 2589

<212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 12

60

atgaaagtca caacagtaaa ggaattagat gaaaaactca aggtaattaa agaagctcaa 60 aaaaaattct cttgttactc gcaagaaatg gttgatgaaa tctttagaaa tgcagcaatg 120 gcagcaatcg acgcaaggat agagctagca aaagcagctg ttttggaaac cggtatgggc 180 ttagttgaag acaaggttat aaaaaatcat tttgcaggcg aatacatcta taacaaatat 240 aaggatgaaa aaacctgcgg tataattgaa gcagaaccta taggagttgt agctgctata

5

atatttaaat ccttaatatc ccttaaaact agggcaaaaa aatccacaat actagcagct ggtgccccgg aaaatataat aggttggata ttaatgcaaa aagcagatat aacccttgca tattcttccg gaaaaccagc aataggtgtt

15

gaatctgctc atataaaaat ggcagtaagt ggtgttatat gtgcttctga acaatctgta

2 0 aaagatgagt tccaagaaag aggagcttat

cgtgaagtga tttttaaaga tggatccgta actatagcag ctatggctgg cataaaagta

25

gttacctcct taggtgaaga agaacctttt atgtatgagg ctgacaattt tgatgatgct

3 0 ggaggcctcg gccatacctc aggaatatat

gatagattta gtagtgccat gaaaaccgta ggtgcaagtg gagatctata taattttaga

35

ttttggggag gaaattctgt ttccgagaat accgtagctg aaaggagaga aaacatgctt

4 0 aagttcggtt gtcttcaatt tgctttaaaa

tttatagtta ctgatagtga cccctataat cttgagcacc tagatattga ttttaaagta

45

aaaaccataa aaaaagcaac tgaagaaatg ttaggtggta cccctgaaat gagctctgca

0 gaagtaaaat ttgaagatct tgcaataaaa

ttcccaaaac tcggtaaaaa ggctatgtta tctgaggtta ctccttttgc tttagtaact

55

gcagattatg aaatgacacc aaatatggca ccaaagggat taaccgctta ttcaggtata

6 0 acatccgtat atgcttcaga atacacaaac

cgaaatgaac cctacggaat tacaaaaata 3 00

atccctgtaa caaaccccac atcaacaaca 360

agaaatggaa ttttcttttc gcctcaccca 420

aaaacaatac ttgatgcagc cgttaagagt 4 80

gatgaacctt caattgaact aactcaatat 54 0

actggtggtc cctcactagt taaatctgct 600

ggtccgggta acaccccagt aataattgat 660

tcaattatat tatccaaaac ctatgataat 72 0

atagtcttaa aatccatata taacaaggta 780

ataataaaga aaaacgaatt ggataaagtc 840

aaccctaaaa tagtcggaca gtcagcttat 900

cctaaaacca caagaatatt aataggagaa 960

gcccacgaaa aactatctcc tgttttggct 1020

ttaaaaaaag cagtaactct aataaactta 1080

gcagatgaaa taaaagcacg agataaaata 1140

agaacctttg taaatatccc aacctcacaa 1200

ataccacctt ctttcacgct tggctgcgga 1260

gttggtccaa aacatctttt gaatattaaa 1320

tggtttagag ttccacataa agtatatttt 1380

gatttaaaag atctaaagaa aaaaagagcc 1440

ttaaactatg ttgattcaat aataaaaata 1500

tttaataagg ttggaagaga agctgatctt 1560

tcctccttta tgccagacac tataatagct 1620

aagctaatgt gggtactata tgaacatcca 1680

tttatggaca taagaaagag aatatatact 1740

gttgcaatta caacttctgc tggttccggt 1800

gacaataaca ctggaaataa gtacatgtta 1860

attgtagatg cagaacttat gatgaaaatg 1920

gatgcactag taaatagtat agaagcatac 1980

ggactagcac tagaggcaat acgattaata 2040 10

tttaaatatt tgcctgaggc ttacaaaaac ggaagaacca atgaaaaagc aagagagaaa 2100

atggctcacg cttcaactat ggcaggtatg gcatccgcta atgcatttct aggtctatgt 2160

cattccatgg caataaaatt aagttcagaa cacaatattc ctagtggcat tgccaatgca 2220

ttactaatag aagaagtaat aaaatttaac gcagttgata atcctgtaaa acaagcccct 2280

tgcccacaat ataagtatcc aaacaccata tttagatatg ctcgaattgc agattatata 2340

aagcttggag gaaatactga tgaggaaaag gtagatctct taattaacaa aatacatgaa 24 00

ctaaaaaaag ctttaaatat accaacttca ataaaggatg caggtgtttt ggaggaaaac 2460

ttctattcct cccttgatag aatatctgaa cttgcactag atgatcaatg cacaggcgct 2520

aatcctagat ttcctcttac aagtgagata aaagaaatgt atataaattg ttttaaaaaa 2580

caaccttaa 2589

20

<210> 13 <211> 389 <212 > PRT 2 5 <213> Clostridium acetobutylicum

<400> 13

Met Leu Ser Phe Asp Tyr Ser Ile Pro Thr Lys Val Phe Phe Gly Lys 1 5 10 15

Gly Lys Ile Asp Val Ile Gly Glu Glu Ile Lys Lys Tyr Gly Ser Arg 25 30

35

Val Leu Ile Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Lys Arg Asn Gly Ile Tyr 40 45

40

Asp Arg Ala Thr Ala Ile Leu Lys Glu Asn Asn Ile Ala Phe Tyr Glu 50 55 60

4 5 Leu Ser Gly Val Glu Pro Asn Pro Arg Ile Thr Thr Val Lys Lys Gly 65 70 75 80

Ile Glu Ile Cys Arg Glu Asn Asn Val Asp Leu Val Leu Ala Ile Gly 50 85 90 95

Gly Gly Ser Ala Ile Asp Cys Ser Lys Val Ile Ala Ala Gly Val Tyr 100 105 110

55

Tyr Asp Gly Asp Thr Trp Asp Met Val Lys Asp Pro Ser Lys Ile Thr 115 120 125

60

Lys Val Leu Pro Ile Ala Ser Ile Leu Thr Leu Ser Ala Thr Gly Ser 130 135 140

Glu Met Asp Gln Ile Ala Val Ile Ser Asn Met Glu Thr Asn Glu Lys 145 150 155 160

Leu Gly Val Gly His Asp Asp Met Arg Pro Lys Phe Ser Val Leu Asp 165 170 175

10

Pro Thr Tyr Thr Phe Thr Val Pro Lys Asn Gln Thr Ala Ala Gly Thr 180 185 190

15

Ala Asp Ile Met Ser His Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Ser Gly Val Glu 195 200 205

2 0 Gly Ala Tyr Val Gln Asp Gly Ile Ala Glu Ala Ile Leu Arg Thr Cys 210 215 220

Ile Lys Tyr Gly Lys Ile Ala Met Glu Lys Thr Asp Asp Tyr Glu Ala 225 230 235 240

Arg Ala Asn Leu Met Trp Ala Ser Ser Leu Ala Ile Asn Gly Leu Leu 245 250 255

30

Ser Leu Gly Lys Asp Arg Lys Trp Ser Cys His Pro Met Glu His Glu 260 265 270

35

Leu Ser Ala Tyr Tyr Asp Ile Thr His Gly Val Gly Leu Ala Ile Leu 275 280 285

4 0 Thr Pro Asn Trp Met Glu Tyr Ile Leu Asn Asp Asp Thr Leu His Lys 290 295 300

Phe Val Ser Tyr Gly Ile Asn Val Trp Gly Ile Asp Lys Asn Lys Asp 45 305 310 315 320

Asn Tyr Glu Ile Ala Arg Glu Ala Ile Lys Asn Thr Arg Glu Tyr Phe 325 330 335

50

Asn Ser Leu Gly Ile Pro Ser Lys Leu Arg Glu Val Gly Ile Gly Lys 340 345 350

55

Asp Lys Leu Glu Leu Met Ala Lys Gln Ala Val Arg Asn Ser Gly Gly 355 360 365

6 0 Thr Ile Gly Ser Leu Arg Pro Ile Asn Ala Glu Asp Val Leu Glu Ile 370 375 380 20

Phe Lys Lys Ser Tyr 385

<210> 14

<211> 1170

<212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum

<4 00 > 14

60

gtaattggag aagaaattaa gaaatatggc tcaagagtgc ttatagttta tggcggagga 120

180 240 300 360

gttaaagatc catctaaaat aactaaaqtt cttccaattq caaqtatact tactctttca 420

480 540 600 660

3 5 ttaaqaacat qtataaaqta tqqaaaaata qcaatqqaqa aqactqatqa ttacgagqct 720

780 840 900 960

4 5 aactatgaaa tagcacgaqa ggctattaaa aatacgagag aatactttaa ttcattgggt 1020

1080 1140 1170

30

40

50

atgctaagtt ttgattattc aataccaact aaagtttttt ttggaaaagg aaaaatagac gtaattggag aagaaattaa gaaatatggc tcaagagtgc ttatagttta tggcggagga agtataaaaa ggaacggtat atatgataga gcaacagcta tattaaaaga aaacaatata gctttctatg aactttcagg agtagagcca aatcctagga taacaacagt aaaaaaaggc atagaaatat gtagagaaaa taatgtggat ttagtattag caataggggg aggaagtgca atagactgtt ctaaggtaat tgcagctgga gtttattatg atggcgatac atgggacatg gttaaagatc catctaaaat aactaaagtt cttccaattg caagtatact tactctttca gcaacagggt ctgaaatgga tcaaattgca gtaatttcaa atatggagac taatgaaaag cttggagtag gacatgatga tatgagacct aaattttcag tgttagatcc tacatatact tttacagtac ctaaaaatca aacagcagcg ggaacagctg acattatgag tcacaccttt gaatcttact ttagtggtgt tgaaggtgct tatgtgcagg acggtatagc agaagcaatc ttaagaacat gtataaagta tggaaaaata gcaatggaga agactgatga ttacgaggct agagctaatt tgatgtgggc ttcaagttta gctataaatg gtctattatc acttggtaag gatagaaaat ggagttgtca tcctatggaa cacgagttaa gtgcatatta tgatataaca catggtgtag gacttgcaat tttaacacct aattggatgg aatatattct aaatgacgat acacttcata aatttgtttc ttatggaata aatgtttggg gaatagacaa gaacaaagat aactatgaaa tagcacgaga ggctattaaa aatacgagag aatactttaa ttcattgggt attccttcaa agcttagaga agttggaata ggaaaagata aactagaact aatggcaaag caagctgtta gaaattctgg aggaacaata ggaagtttaa gaccaataaa tgcagaggat gttcttgaga tatttaaaaa atcttattaa

<210 > 15

55 <211> 390

<212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum

60

<400> 15

Met Val Asp Phe Glu Tyr Ser Ile Pro Thr Arg Ile Phe Phe Gly Lys 15

Asp Lys Ile Asn Val Leu Gly Arg Glu Leu Lys Lys Tyr Gly Ser Lys 20 25 30

Val Leu Ile Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Lys Arg Asn Gly Ile Tyr 40 45

10

Asp Lys Ala Val Ser Ile Leu Glu Lys Asn Ser Ile Lys Phe Tyr Glu 50 55 60

15

Leu Ala Gly Val Glu Pro Asn Pro Arg Val Thr Thr Val Glu Lys Gly 65 70 75 80

Val Lys Ile Cys Arg Glu Asn Gly Val Glu Val Val Leu Ala Ile Gly

85 90 95

Gly Gly Ser Ala Ile Asp Cys Ala Lys Val Ile Ala Ala Ala Cys Glu 100 105 110

Tyr Asp Gly Asn Pro Trp Asp Ile Val Leu Asp Gly Ser Lys Ile Lys 115 120 125

30

Arg Val Leu Pro Ile Ala Ser Ile Leu Thr Ile Ala Ala Thr Gly Ser 130 135 140

35

Glu Met Asp Thr Trp Ala Val Ile Asn Asn Met Asp Thr Asn Glu Lys 145 150 155 160

4 0 Leu Ile Ala Ala His Pro Asp Met Ala Pro Lys Phe Ser Ile Leu Asp

165 170 175

Pro Thr Tyr Thr Tyr Thr Val Pro Thr Asn Gln Thr Ala Ala Gly Thr 45 180 185 190

Ala Asp Ile Met Ser His Ile Phe Glu Val Tyr Phe Ser Asn Thr Lys 195 200 205

50

Thr Ala Tyr Leu Gln Asp Arg Met Ala Glu Ala Leu Leu Arg Thr Cys 210 215 220

55

Ile Lys Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Glu Lys Pro Asp Asp Tyr Glu Ala 225 230 235 240

6 0 Arg Ala Asn Leu Met Trp Ala Ser Ser Leu Ala Ile Asn Gly Leu Leu

245 250 255 10

25

30

50

Thr Tyr Gly Lys Asp Thr Asn Trp Ser Val His Leu Met Glu His Glu 260 265 270

Leu Ser Ala Tyr Tyr Asp Ile Thr His Gly Val Gly Leu Ala Ile Leu 275 280 285

Thr Pro Asn Trp Met Glu Tyr Ile Leu Asn Asn Asp Thr Val Tyr Lys 290 295 300

Phe Val Glu Tyr Gly Val Asn Val Trp Gly Ile Asp Lys Glu Lys Asn 305 310 315 320

His Tyr Asp Ile Ala His Gln Ala Ile Gln Lys Thr Arg Asp Tyr Phe 325 330 335

Val Asn Val Leu Gly Leu Pro Ser Arg Leu Arg Asp Val Gly Ile Glu 340 345 350

Glu Glu Lys Leu Asp Ile Met Ala Lys Glu Ser Val Lys Leu Thr Gly 355 360 365

Gly Thr Ile Gly Asn Leu Arg Pro Val Asn Ala Ser Glu Val Leu Gln 370 375 380

3 5 Ile Phe Lys Lys Ser Val 385 390

<210> 16

40 <211> 1173

<212> DNA

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 16

60

gtggttgatt tcgaatattc aataccaact agaatttttt tcggtaaaga taagataaat 60 gtacttggaa gagagcttaa aaaatatggt tctaaagtgc ttatagttta tggtggagga 120 agtataaaga gaaatggaat atatgataaa gctgtaagta tacttgaaaa aaacagtatt 180 aaattttatg aacttgcagg agtagagcca aatccaagag taactacagt tgaaaaagga 240 gttaaaatat gtagagaaaa tggagttgaa gtagtactag ctataggtgg aggaagtgca 300 atagattgcg caaaggttat agcagcagca tgtgaatatg atggaaatcc atgggatatt 360 gtgttagatg gctcaaaaat aaaaagggtg cttcctatag ctagtatatt aaccattgct 420 gcaacaggat cagaaatgga tacgtgggca gtaataaata atatggatac aaacgaaaaa 480 ctaattgcgg cacatccaga tatggctcct aagttttcta tattagatcc aacgtatacg 540 tataccgtac ctaccaatca aacagcagca ggaacagctg atattatgag tcatatattt 600

gaggtgtatt ttagtaatac aaaaacagca tatttgcagg atagaatggc agaagcgtta 660

5

ttaagaactt gtattaaata tggaggaata gctcttgaga agccggatga ttatgaggca 720

agagccaatc taatgtgggc ttcaagtctt gcgataaatg gacttttaac atatggtaaa 780

gacactaatt ggagtgtaca cttaatggaa catgaattaa gtgcttatta cgacataaca 840

cacggcgtag ggcttgcaat tttaacacct aattggatgg agtatatttt aaataatgat 900

acagtgtaca agtttgttga atatggtgta aatgtttggg gaatagacaa agaaaaaaat 960

15

cactatgaca tagcacatca agcaatacaa aaaacaagag attactttgt aaatgtacta 1020

ggtttaccat ctagactgag agatgttgga attgaagaag aaaaattgga cataatggca 1080

2 0 aaggaatcag taaagcttac aggaggaacc ataggaaacc taagaccagt aaacgcctcc 1140

gaagtcctac aaatattcaa aaaatctgtg taa 1173

<210> 17

<211> 1179

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Par de códons de gene thil otimizado sentido anti-horário

35

45

<400> 17

60 120 180

4 0 gtcgaatttc aagtccttgg caacagccaa aqattqaqca gcqaaagctt cqttggattc 240

300 360 420 480

0 tggtttcaac ttgqccaaac cttcaatggt ggaaccgaat cttgggtgtt catcggtgtc 54 0

600 660 720 780

6 0 tctgtaaccc catctagcat tqttagccaa gtatggagct ctggacatgt tttccatacc 84 0

55

ctaacacttt tccaataaga tggcagtacc ttgaccacca ccgatacata gagtagccaa acccttcttg gcatcacgct tttgcatagc gtggactaaa gtaaccaaga ttctggcacc ggaagcacca attgggtgac ccaaagcaat ggcaccaccg ttaacgttga ccttgttcat gtcgaatttc aagtccttgg caacagccaa agattgagca gcgaaagctt cgttggattc aatcaaatcc aattcgtcaa cggtccaacc agccttttcg atagcagcct tggtagcgta gaaaggaccg taacccatga tggctgggtc aacaccagca gaaccgtagg agacaatctt ggccaatggc ttgacaccca attccttggc cttttcagca gacatgataa ccaaaacagc agcacagtcg ttcaaaccgg aagcgttacc agcagtgacg gtaccatcct tcttgaaagc tggtttcaac ttggccaaac cttcaatggt ggaaccgaat cttgggtgtt catcggtgtc gacaacggtt tcaccctttc tacccttgat gacaactggg acaatttcgt ccttgaattg accagatttg atggcttctt cagccttctt ttgagaagcc aaagcaaatt catcttgttc ttctctggag atgttccatc tttcagcaat gttttcagca gtgataccca tgtggtagtc gttgaaagcg tcccataaac cgtcagtgat catttcatcg acgaacttgg cgttacccat tctgtaaccc catctagcat tgttagccaa gtatggagct ctggacatgt tttccatacc accagcaatg atgacatcag cgtcaccagc cttgatgatt tgagcagcca aagaaacagt 900 tctcaaacca gaaccacaaa ccttgttgat ggtcatggct ggaatttcaa ctggcaaacc 960 agccttgaaa gaagcttgac gagctgggtt ttgacctaaa ccagcttgca aaacgttacc 1020 taagataact tcgttaacat cttctggctt gataccagcc ttcttgacag cttccttgat 1080 ggcggtagca cccaagtcga cagctgggac gtccttcaaa gacttaccgt aagaaccaat 1140 ggcagttctg acagcagaag caataacaac ttccttcat 1179 <210> 18 <211> 850 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <22 0 > <223 > par de cõdons de gene otimizado hbd <400> 18 catgaagaag gtttgtgtca ttggtgccgg taccatgggt tctggtattg ctcaagcttt 60 cgctgccaag ggtttcgaag ttgttttgag agatatcaag gacgaattcg ttgaccgtgg 120 tttggatttc atcaacaaga acttgtccaa gttggtcaag aagggtaaga ttgaagaagc 180 taccaaggtc gaaatcttga ccagaatctc cggtactgtt gacttgaaca tggctgctga 240 ctgtgatttg gtcattgaag ctgccgttga aagaatggac atcaagaagc aaatctttgc 300 tgatttggac aacatctgta agccagaaac cattttggct tccaacactt cttctttgtc 360 catcactgaa gttgcttctg ctaccaagag accagacaag gttatcggta tgcacttctt 420 caacccagct ccagtcatga agttggtcga agtcatcaga ggtattgcca cctctcaaga 480 40 aactttcgat gctgtcaagg aaacttccat tgccattggt aaggacccag ttgaagttgc 540 tgaagctcca ggtttcgttg tcaacagaat cttgattcca atgatcaacg aagctgtcgg 600 tattttggct gaaggtattg cttctgttga agatatcgac aaggccatga aattgggtgc 660 45 taaccaccca atgggtccat tggaattagg tgacttcatc ggtttggata tctgtttggc 720 catcatggat gtcttatact ctgaaaccgg tgactctaag tacagacctc acactttatt 780 50 gaagaagtac gttagagctg gttggttagg tagaaagtct ggtaagggtt tctacgacta 840

ctccaaatag 85O

<210> 19

55 <211> 789

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 O >

6 0 <223> Par de códons de gene otimizado crt sentido anti-horário <4 OO > 19

tcatcacctg ttcttgaaac cttcaatctt tctcttttcg atgaaagcgg tcatagcatc 60

cttttggtct tcagtggaga aacattcacc gaaagcttca gattcaaagg ccaaagcggt 120

5

gtcgatatca cattgcatac ctctgttgat ggcttgcttg gacaatttga cagcaactgg 180 agcgttggag acgatcttgt tagcaatttc cttggcagtg ttcatcaatt cagatggttc 24 0 aacaaccttg ttgactaaac caattctcaa agcttcgtca gccttgatgt tttgagcggt 300 gaagatcaat tgcttggcca tacccatacc aaccaatctg gataatcttt gagtaccacc 3 60 gaaacctgga gtgataccta gaccgacttc tggttgaccg aaacgagcgt tagaagaagc 420

15

aattctgatg tcacaggaca tggcaatttc acaaccacca cccaaagcga aaccgttgac 480 agcagcaatg actggctttt ccaacaattc caatcttctg aaaaccttgt tacctaagat 54 0 2 0 accgaacttt ctaccttcaa tggtgttcat ttccttcatt tcagagatat cagcaccagc 600 aacgaaagac ttttcaccgg caccggtcaa gatgacagcc aaaacttcag aatcgttttc 660 aatttcacca atgacgtagt ccatttcctt caaagtgtca gagttcaaag cattcaaagc 720

25

ctttggtctg ttgatggtga caacggcaac cttaccttcc ttttccaaga taacgttgtt 780 caattccat 789

30

<210> 20 <211> 1141 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

35

<220>

<223> par de códons de gene otimizado bcd <400> 20

4 0 catggacttc aacttgacca gagaacaaga attggtcaga caaatggtta gagaatttgc 60

tgaaaacgaa gttaagccaa ttgctgctga aatcgatgaa actgaaagat tcccaatgga 120 aaacgtcaag aagatgggtc aatacggtat gatgggtatt ccattctcta aggaatacgg 180

45

tggtgctggt ggtgacgtct tgtcttacat cattgctgtc gaagaattgt ccaaggtttg 24 0 tggtaccact ggtgtcatct tatctgctca cacttctcta tgtgcctcct tgatcaacga 300

0 acacggtact gaagaacaaa agcaaaagta cttggttcca ttggccaagg gtgaaaagat 3 60

tggtgcctac ggtttgactg aaccaaacgc tggtactgac tctggtgctc aacaaactgt 420 tgccgttttg gaaggtgacc actacgtcat caacggttcc aagatcttca tcaccaacgg 480

55

tggtgttgct gacacctttg tcatcttcgc tatgaccgat cgtaccaagg gtaccaaggg 540 tatctctgct ttcattattg aaaagggttt caagggtttc tccatcggta aggtcgaaca 600 60 aaagttgggt atcagagctt cctctaccac tgaattggtt ttcgaagaca tgattgttcc 660 agttgaaaac atgatcggta aggaaggtaa gggtttccca attgccatga agactttaga 720 tggtggtaga attggtattg ctgctcaagc tttgggtatt gctgaaggtg ccttcaacga 780 agctagagct tacatgaagg aaagaaagca attcggtaga tctttggaca aattccaagg 840 tttggcttgg atgatggctg acatggacgt tgccatcgaa tctgctcgtt acttggtcta 900 caaggctgct tacttgaagc aagctggttt gccatacacc gtcgatgctg ccagagctaa 960 gttgcacgct gccaacgttg ccatggatgt caccaccaag gctgtccaat tattcggtgg 1020 ttacggttac accaaggact acccagttga aagaatgatg agagatgcta agatcactga 1080 aatctacgaa g ggtacttctg aagttcaaaa gttggttatc tccggtaaga tcttcagata 1140 1141 <210> 21 <211> 2577 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220 > <223 > par de códons de gene otimizado adhE <400 > 21 atgaaggtta ccaaccaaaa ggaattgaag caaaagttga acgaattgag agaagctcaa 60 aagaagttcg ctacctacac tcaagaacaa gttgacaaga tcttcaagca atgtgccatt 120 gctgctgcca aggaacgtat caacttggcc aagttggctg tcgaagaaac cggtattggt 180 ttggttgaag acaagatcat caagaaccac ttcgctgctg aatacatcta caacaagtac 240 aagaacgaaa agacctgtgg tatcatcgac cacgatgact ctttgggtat caccaaggtt 300 40 gctgaaccaa tcggtattgt cgccgccatt gtcccaacca ctaacccaac ttccactgcc 360 atcttcaaat ctttgatctc cttgaagacc agaaacgcta tcttcttctc cccacaccca 420 agagccaaga agtccaccat tgctgctgcc aaattaatct tggatgctgc tgttaaggct 480 45 ggtgccccaa agaacattat tggttggatc gatgaacctt ccattgaatt gtctcaagac 540 ttgatgtctg aagctgatat catcttggct accggtggtc catccatggt caaggccgct 600 50 tactcttctg gtaagccagc tattggtgtt ggtgctggta acactccagc tatcatcgat 660 gaatctgctg acattgacat ggctgtctcc tccattatct tgtccaagac ttatgacaac 720 ggtgtcatct gtgcctctga acaatccatc ttggttatga actctatcta cgaaaaggtc 780 55 aaggaagaat ttgttaagag aggttcctac atcttaaacc aaaatgaaat tgccaagatc 840 aaggaaacca tgttcaagaa cggtgccatc aacgctgaca ttgtcggtaa atctgcttac 900 60 atcattgcca agatggctgg tattgaagtt ccacaaacca ctaagatttt gatcggtgaa 960 gttcaatctg tcgaaaagtc tgaattattc tctcacgaaa agttgtctcc agtcttggct 1020 atgtacaagg tcaaggattt cgacgaagct ttgaagaagg ctcaaagatt aattgaatta 1080

ggtggttctg gtcacacctc ttctctatac attgactctc aaaacaacaa ggacaaggtc 114 0

5

aaggaattcg gtctagctat gaagacttcc agaactttca tcaacatgcc atcttctcaa 1200

ggtgcttctg gtgatttgta caactttgcc attgctccat ctttcacttt aggttgtggt 1260

acctggggtg gtaactctgt ttctcaaaac gttgaaccaa agcatttgct aaacatcaag 1320

tccgttgctg aaagaagaga aaacatgttg tggttcaagg ttccacaaaa gatctacttc 1380

aaatacggtt gtttgagatt tgctttgaag gaattgaaag atatgaacaa gaagcgtgct 144 0

15

ttcatcgtta ctgacaagga tttgttcaaa ttgggttacg ttaacaagat cactaaggtt 1500

ttggatgaaa ttgatatcaa gtactccatc ttcactgata tcaaatctga cccaaccatt 1560

2 0 gactccgtca agaagggtgc taaggaaatg ttgaacttcg aaccagatac cattatctcc 1620

attggtggtg gttctccaat ggatgctgcc aaggttatgc atttgttgta cgaataccca 1680

gaagctgaaa tcgaaaactt ggccatcaac ttcatggaca tcagaaagag aatctgtaac 1740

25

ttcccaaagt tgggtaccaa ggccatttct gttgccattc caaccaccgc tggtaccggt 1800

tctgaagcta ctccatttgc tgtcatcacc aacgacgaaa ccggtatgaa gtacccattg 1860

3 0 acctcttacg aattgactcc aaacatggcc atcattgaca ctgaattgat gttgaacatg 1920

ccaagaaagt tgactgctgc taccggtatt gacgctttag tccacgctat cgaagcttac 1980

gtctccgtta tggccactga ctacactgac gaattggctt tgagagctat caagatgatc 2040

35

ttcaagtact tgccaagagc ttacaagaac ggtactaacg atatcgaagc tcgtgaaaag 2100

atggctcacg cttccaacat tgctggtatg gctttcgcta acgctttctt gggtgtttgt 2160

4 0 cactccatgg cccacaagtt gggtgctatg caccacgttc ctcacggtat tgcttgtgct 2220

gttttgattg aagaagtcat caagtacaac gctactgact gtccaaccaa gcaaactgct 2280

ttcccacaat acaagtctcc aaacgccaag agaaagtacg ctgaaattgc tgaatacttg 2340

45

aacttgaaag gtacttctga cactgaaaag gtcactgctt taatcgaagc tatctccaag 2400

ttgaagattg acttatctat tcctcaaaac atctctgctg ctggtattaa caagaaggac 24 60

0 ttctacaaca ctttagacaa gatgtccgaa ttggctttcg atgaccaatg taccaccgct 2520

aacccaagat acccattgat ctctgaattg aaggatatct acatcaagtc cttttaa 2577

55 <210> 22

<211> 2589

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial 60 <220>

<223> Par de códons de gene otimizado adhEl 10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<400> 22 atgaaggtca ccactgtcaa ggaattggat gaaaagttga aggtcatcaa ggaagctcaa 60 aagaagttct cttgttactc tcaagaaatg gttgacgaaa tcttcagaaa cgctgctatg 120 gctgccattg acgccagaat tgaattggcc aaggctgccg tcttggaaac cggtatgggt 180 ttggttgaag acaaggttat caagaaccac ttcgctggtg aatacatcta caacaaatac 240 aaggatgaaa agacttgtgg tatcatcgaa agaaacgaac catacggtat caccaagatt 300 gctgaaccta tcggtgtcgt tgctgccatc atcccagtta ccaacccaac ttccaccacc 360 attttcaaat ccttgatctc tttgaagacc agaaacggta ttttcttctc tcctcaccca 420 agagctaaga agtccactat cttagctgcc aagactatct tagatgctgc tgtcaagtct 480 ggtgctccag aaaacattat tggttggatt gacgaaccat ccattgaatt gactcaatac 540 ttgatgcaaa aggctgatat cactttggcc actggtggtc catctttggt caagtctgct 600 tactcctctg gtaagccagc tattggtgtc ggtccaggta acactccagt catcattgat 660 gaatctgctc acatcaagat ggctgtctcc tctatcatct tgtccaagac ttacgacaac 720 ggtgttatct gtgcttctga acaatctgtt atcgttttga aatccatcta caacaaggtc 780 aaggacgaat tccaagaaag aggtgcttac atcatcaaga agaacgaatt ggacaaggtc 840 agagaagtca ttttcaagga cggttccgtt aacccaaaga ttgttggtca atctgcctac 900 accattgctg ctatggctgg tatcaaggtt ccaaagacca ccagaatctt gattggtgaa 960 gtcacctctt taggtgaaga agaaccattt gctcacgaaa aattgtctcc agttttggcc 1020 atgtacgaag ctgacaactt tgacgatgct ttgaagaagg ctgttacctt aatcaactta 1080 ggtggtttgg gtcacacttc tggtatctac gctgatgaaa tcaaggcccg tgacaagatt 1140 gacagattct cctctgctat gaagaccgtt agaacctttg ttaacattcc aacttcccaa 1200 ggtgcttctg gtgatttgta caacttcaga attccacctt ctttcacttt aggttgtggt 1260 ttctggggtg gtaactccgt ttctgaaaac gttggtccaa agcatttgtt gaacatcaag 1320 actgttgctg aaagaagaga aaacatgtta tggttccgtg ttccacacaa ggtctacttc 1380 aagttcggtt gtttgcaatt tgctttgaag gacttaaagg atttgaagaa gaagagagct 1440 ttcattgtca ctgactccga tccttacaac ttgaactacg ttgactctat catcaagatc 1500 ttggaacact tggatatcga tttcaaggtc ttcaacaagg ttggtagaga agctgatttg 1560 aagactatca agaaggctac tgaagaaatg tcctctttca tgccagacac tatcattgct 1620 ttaggtggta ccccagaaat gtcttctgcc aagttgatgt gggttttgta cgaacatcca 1680 gaagttaagt tcgaagactt ggccatcaag ttcatggaca tcagaaagag aatctacact 1740 ttcccaaagt tgggtaagaa ggctatgttg gttgccatta ccacctctgc tggttctggt 1800 tctgaagtca ctccatttgc tttggttacc gacaacaaca ccggtaacaa atacatgttg 1860 gctgactacg aaatgacccc aaacatggcc attgtcgacg ctgaattgat gatgaagatg 1920

5

ccaaagggtt tgactgctta ctccggtatc gatgctttgg tcaactctat tgaagcttac 1980 acttccgttt acgcctccga atacaccaac ggtttggctt tggaagccat cagattaatc 2040 ttcaagtact tgccagaagc ttacaagaac ggtcgtacca atgaaaaggc tagagaaaag 2100 atggctcacg cttccaccat ggctggtatg gcttccgcta acgctttctt aggtttgtgt 2160 cactccatgg ccatcaaatt gtcctctgaa cacaacattc catccggtat tgccaatgct 2220

15

ttgttgattg aagaagtcat caagttcaat gctgttgaca acccagtcaa gcaagctcca 2280 tgtccacaat acaagtaccc aaacaccatt ttccgttacg ccagaattgc tgactacatc 2340 2 0 aagttgggtg gtaacactga cgaagaaaag gtcgatttat taatcaacaa gattcacgaa 24 00 ttgaagaagg ctttgaacat tccaacttct atcaaggatg ctggtgtttt ggaagaaaac 24 60 ttctactctt ctttggacag aatctctgaa ttggccttgg atgaccaatg taccggtgct 252 0

25

aacccaagat tcccattgac ttctgaaatc aaggaaatgt acattaactg tttcaagaag 2580 caaccatag 2589

30

<210> 23 <211> 1170 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

35

<22 0 >

<223> par de códons de gene otimizado bdhA <4 00 > 23

4 0 atgttgtctt tcgactactc cattccaact aaggttttct tcggtaaggg taagatcgat 60

gttatcggtg aagaaatcaa gaaatacggt tccagagttt tgattgtcta cggtggtggt 120 tccatcaaga gaaacggtat ctacgatcgt gccactgcca tcttaaagga aaacaacatt 180

45

gctttctacg aattatctgg tgttgaacca aacccaagaa tcactaccgt caagaagggt 240 attgaaatct gtagagaaaa caacgttgac ttggtcttgg ccattggtgg tggttctgct 3 00

0 attgactgtt ccaaggtcat tgctgctggt gtttactacg atggtgacac ctgggacatg 3 60

gttaaggacc cttccaagat caccaaggtt ttgccaattg cttccatctt gactttatct 420 gctaccggtt ctgaaatgga ccaaatcgcc gtcatctcca acatggaaac caatgaaaag 480

55

ttgggtgttg gtcacgatga catgagacca aagttctctg tcttggaccc aacctacact 54 0 ttcaccgttc caaagaacca aactgctgct ggtactgctg atatcatgtc tcacactttc

6 0 gaatcttact tctctggtgt cgaaggtgct tacgttcaag atggtattgc tgaagctatc

600 660 30

40

50

55

60

ttgagaacct gtatcaaata cggtaagatt gctatggaaa agaccgatga ctacgaagct 720 agagctaact tgatgtgggc ttcttccttg gctatcaacg gtttattgtc tttaggtaag 780 gacagaaagt ggtcctgtca cccaatggaa cacgaattgt ctgcttacta cgatatcact 840 cacggtgttg gtttggccat cttgactcca aactggatgg aatacatctt gaacgatgac 900 actttgcaca agtttgtctc ctacggtatc aacgtctggg gtattgacaa gaacaaggac 960 aactacgaaa ttgccagaga agctatcaag aacaccagag aatacttcaa ctctttgggt 1020 attccatcca agttgcgtga agtcggtatt ggtaaggaca aattggaatt gatggccaag 1080 caagctgtca gaaactctgg tggtaccatt ggttctttga gaccaatcaa tgctgaagat 1140 gttttggaaa tcttcaagaa gtcttactaa 1170

10

15

<210> 24

<211> 1173

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Par de códons de gene otimizado bdhB

<400> 24 atggtcgatt tcgaatactc tatcccaacc agaatcttct tcggtaagga caagatcaac gttttgggta gagaattgaa gaaatacggt tccaaggttt tgattgtcta cggtggtggt tccatcaaga gaaacggtat ctacgacaag gctgtctcca ttttggaaaa gaactctatc aaattctacg aattggctgg tgttgaacca aacccaagag ttaccaccgt cgaaaagggt gtcaagatct gtcgtgaaaa cggtgttgaa gttgttttgg ccatcggtgg tggttctgcc attgactgtg ccaaggtcat tgctgctgcc tgtgaatacg atggtaaccc atgggacatt gtcttggatg gttctaagat caagcgtgtc ttaccaattg cttccatctt gactatcgct gctactggtt ctgaaatgga cacctgggct gttatcaaca acatggacac taacgaaaag ttgattgctg ctcacccaga tatggcccca aagttctcta ttttggaccc aacctacact tacactgttc caaccaacca aactgctgct ggtactgctg atatcatgtc tcacatcttt gaagtttact tctccaacac caagaccgct tacttgcaag acagaatggc tgaagctcta ttaagaacct gtatcaagta cggtggtatt gctttggaaa agccagatga ctacgaagcc agagctaact tgatgtgggc ttcctctttg gctatcaacg gtttattgac ttacggtaag gacaccaact ggtccgttca tttgatggaa cacgaattgt ctgcttacta cgatatcact cacggtgtcg gtttggccat cttgactcca aactggatgg aatacatttt gaacaacgac actgtctaca agttcgtcga atacggtgtt aacgtctggg gtattgacaa ggaaaagaac cactacgaca ttgctcacca agccatccaa aagaccagag actatttcgt caacgttttg

60 120 180

3 5 aaattctacg aattggctgg tgttgaacca aacccaagag ttaccaccgt cgaaaagggt 240

300 360 420 480

4 5 ttgattgctg ctcacccaga tatggcccca aagttctcta ttttggaccc aacctacact 540

600 660 720 780 840 900 960

1020 ggtttaccat ccagattaag agatgttggt attgaagaag aaaaattgga tatcatggct 1080

aaggaatctg tcaaattgac tggtggtacc attggtaact tgagacctgt taacgcttct 1140

5

gaagttttgc aaatcttcaa gaaatctgtt tag 1173

<210> 25 <211> 290 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Promotor gal7 <400> 25

tccctatact tcggagcact gttgagcgaa ggctcattag atatattttc tgtcattttc 60

2 0 cttaacccaa aaataaggga aagggtccaa aaagcgctcg gacaactgtt gaccgtgatc 120

cgaaggactg gctatacagt gttcacaaaa tagccaagct gaaaataatg tgtagctatg 180 ttcagttagt ttggctagca aagatataaa agcaggtcgg aaatatttat gggcattatt 240

25

atgcagagca tcaacatgat aaaaaaaaac agttgaatat tccctcaaaa 2 90

<210 > 26 <211> 348 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

3 5 <223> terminador Gal7

<400> 26

aaagaaagtg gaatattcat tcatatcata ttttttctat taactgcctg gtttctttta 60

4 0 aattttttat tggttgtcga cttgaacgga gtgacaatat atatatatat atatttaata 120

atgacatcat tatctgtaaa tctgattctt aatgctattc tagttatgta agagtggtcc 180 tttccataaa aaaaaaaaaa aagaaaaaag aattttagga atacaatgca gcttgtaagt 240 aaaatctgga atattcatat cgccacaact tcttatgctt ataaaagcac taatgcctga 3 00 atttatgttg aaaatatgtg tcacaaataa agaaactgtg acatctgg 348

45

50

<210 > 27 <211> 356

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

55

<220>

<223> terminador GallO sentido anti-horário

<400> 27

60 cgcgcccaat aatatttaca acttttcctt atgatttttt cactgaagcg cttcgcaata 60 10

30

gttgtgagtg atatcaaaag taacgaaatg aactccgcgg ctcgtgctat attcttgttg 120

ctaccgtcca tatctttcca tagattttca atttttgatg tctccatggt ggtacagaga 180

acttgtaaac aattcggtcc ctacatgtga ggaaattcgc tgtgacactt ttatcactga 240

actccaaatt taaaaaatag cataaaattc gttatacagc aaatctatgt gttgcaatta 3 00

agaactaaaa gatatagagt gcatattttc aagaaggata gtaagctggc aaatca 3 56

<210> 28

<211> 336

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<22 0 >

<223> Promotor GallO sentido anti-horário <400> 28

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120 tggaaatgta aagagcccca ttatcttagc ctaaaaaaac cttctctttg gaactttcag 180 taatacgctt aactgctcat tgctatattg aagtacggat tagaagccgc cgagcgggcg 24 0 acagccctcc gacggaagac tctcctccgt gcgtcctcgt cttcaccggt cgcgttcctg

300

aaacgcagat gtgcctcgcg ccgcactgct ccgaac 336

<210> 29 <211> 300 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

4 0 <223> Promotor Gall <400> 29

aataaagatt ctacaatact agcttttatg gttatgaaga ggaaaaattg gcagtaacct 60

4 5 ggccccacaa accttcaaat taacgaatca aattaacaac cataggatga taatgcgatt 120 agttttttag ccttatttct ggggtaatta atcagcgaag cgatgatttt tgatctatta 180 acagatatat aaatggaaaa gctgcataac cactttaact aatactttca acattttcag 240

50

tttgtattac ttcttattca aatgtcataa aagtatcaac aaaaaattgt taatatacct

<210 > 30

55 <211> 347 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

60 <223> Terminador Gall

300 <400> 30

gtatacttct tttttttact ttgttcagaa caacttctca tttttttcta ctcataactt 60

tagcatcaca aaatacgcaa taataacgag tagtaacact tttatagttc atacatgctt 120

5

caactactta ataaatgatt gtatgataat gttttcaatg taagagattt cgattatcca 180

caaactttaa aacacaggga caaaattctt gatatgcttt caaccgctgc gttttggata 24 0

cctattcttg acatgatatg actaccattt tgttattgta cgtggggcag ttgacgtctt 300

atcatatgtc aaagtcattt gcgaagttct tggcaagttg ccaactg 347

Claims (11)

1. Célula eucariótica transformada caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequencias de nucleotídeo codificando acetil-CoA acetiltransferase, 3- hidróxibutiril-CoA desidrogenase, 3-hidróxibutiril-CoA desidratase, butiril-CoA desidrogenase, álcool desidrogenase ou acetaldeído desidrogenase e/ou butanol desidrogenase dependente de NAD(P)H, pelo que a(s) sequencia(s) de nucleotídeo mediante a transformação da célula confere(m) à célula a capacidade de produzir butanol.

2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a(s) sequencia(s) de nucleotídeo foi(foram) adaptada(s) ao uso do códon da célula eucariótica empregando otimização do par de códons.

3. Célula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que expressa uma ou mais sequencias de nucleotídeo selecionadas do grupo consistindo em: a. uma sequencia de nucleotídeo codificando uma acetil-CoA acetiltransferase, pelo que a dita sequencia de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: i. uma sequencia de nucleotídeo codificando uma acetil-CoA acetiltransferase, dita acetil CoA acetiltransferase compreendendo uma sequencia de aminoácido que possui pelo menos 20% de identidade de sequencia com a sequencia de aminoácido da SEQ ID NO:1. ii. uma sequencia de nucleotídeo que possui pelo menos15% de identidade de sequencia com a sequencia de nucleotídeo da SEQ ID NO:2 . iii. uma sequencia de nucleotídeo onde o filamento complementar da mesma hibridiza com relação uma molécula de ácido nucléico da sequencia de (i) ou (ii); e, iv. uma sequencia de nucleotídeo que difere da sequencia de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético, b. uma sequencia de nucleotídeo codificando uma 3- hidróxibutiril-CoA desidrogenase, pelo que a dita sequencia de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: i. uma sequencia de nucleotídeo codificando uma 3- hidróxibutiril-CoA desidrogenase, dita 3-hidróxibutiril-CoA desidrogenase compreendendo uma sequencia de aminoácido que possui pelo menos 25% de identidade de sequencia com a sequencia de aminoácido da SEQ ID NO: 3, ü. uma sequencia de nucleotídeo que possui pelo menos2 0% de identidade de sequencia com a sequencia de nucleotídeo da SEQ ID NO:4, iii. uma sequencia de nucleotídeo onde o filamento complementar da mesma hibridiza com relação uma molécula de ácido nucléico da sequencia de (i) ou (ii); e iv. uma sequencia de nucleotídeo que difere da sequencia de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético, c. uma sequencia de nucleotídeo codificando 3- hidróxibutiril-CoA desidratase, onde a dita sequencia de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: i. uma sequencia de nucleotídeo codificando uma 3- hidróxibutiril-CoA desidratase, dita 3-hidróxibutiril-CoA desidratase compreendendo uma sequencia de aminoácido que possui pelo menos 30% de identidade de sequencia com a sequencia de aminoácido da SEQ ID NO: 5; ii. uma sequencia de nucleotídeo compreendendo uma sequencia de nucleotídeo que possui pelo menos 25% de identidade de sequencia com a sequencia de nucleotídeo da SEQ ID NO:6; iii. uma sequencia de nucleotídeo onde o filamento complementar da mesma hibridiza com relação uma molécula de ácido nucléico da sequencia de (i) ou (ii); e iv. uma sequencia de nucleotídeo que difere da sequencia de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético, d. uma sequencia de nucleotídeo codificando butiril- CoA desidrogenase, pelo que a dita sequencia de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: i. uma sequencia de nucleotídeo codificando uma butiril-CoA desidrogenase, a dita butiril-CoA desidrogenase compreendendo uma sequencia de aminoácido que possui pelo menos 20% de identidade de sequencia com a sequencia de aminoácido da SEQ ID NO: 7; ii. uma sequencia de nucleotídeo que possui pelo menos 15% de identidade de sequencia com a sequencia de nucleotídeo da SEQ ID NO: 8; iii. uma sequencia de nucleotídeo onde o filamento complementar da mesma hibridiza com relação uma molécula de ácido nucléico da sequencia de (i) ou (ii); e iv. uma sequencia de nucleotídeo que difere da sequencia de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético, e. uma sequencia de nucleotídeo codificando álcool desidrogenase ou acetaldeído desidrogenase, pelo que a dita sequencia de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: i. uma sequencia de nucleotídeo codificando uma álcool desidrogenase ou acetaldeído desidrogenase, dita álcool desidrogenase ou acetaldeído desidrogenase compreendendo uma sequencia de aminoácido que possui pelo menos 20% de identidade de sequencia com a sequencia de aminoácido da SEQ ID NO: 9 e/ou SEQ ID NO: 11 respectivamente, ii. uma sequencia de nucleotídeo compreendendo uma sequencia de nucleotídeo que possui pelo menos 15% de identidade de sequencia com a sequencia de nucleotídeo da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12 respectivamente; iii. uma sequencia de nucleotídeo onde o filamento complementar da mesma hibridiza com relação a uma molécula de ácido nucléico da sequencia de (i) ou (ii); e, iv. uma sequencia de nucleotídeo que difere da sequencia de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético, e f. uma sequencia de nucleotídeo codificando butanol desidrogenase dependente de NAD(P)H, pelo que a dita sequencia de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: i. uma sequencia de nucleotídeo codificando butanol desidrogenase dependente de NAD(P)H, compreendendo uma sequencia de aminoácido que possui pelo menos 3 0% de identidade de sequencia com a sequencia de aminoácido da SEQ ID NO: 13 e/ou SEQ ID NO: 15; ii. uma sequencia de nucleotídeo compreendendo uma sequencia de nucleotídeo que possui pelo menos 25% de identidade de sequencia com a sequencia de nucleotídeo da SEQ ID NO: 14 e/ou SEQ ID NO 16; iii. uma sequencia de nucleotídeo onde o filamento complementar da mesma hibridiza com relação a uma molécula de ácido nucléico da sequencia de (i) ou (ii); e, iv. uma sequencia de nucleotídeo que difere da sequencia de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético.

4. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que é uma Saccharomyces cerevisiae que compreende sequencias de nucleotídeo heterólogas codificando acetil-CoA acetiltransferase, 3-hidróxibutiril-CoA desidrogenase, 3- hidróxibutiril-CoA desidratase, butiril-CoA desidrogenase, álcool desidrogenase ou acetaldeído desidrogenase e butanol desidrogenase dependente de NAD(P)H.

5. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que é uma Saccharomyces cerevisiae compreendendo uma ou mais sequencias de nucleotídeo selecionadas do grupo consistindo nas SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21 ou SEQ ID NO 22 e SEQ ID NO 23 ou SEQ ID NO24 .

6. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que um ou mais genes codificando piruvato descarboxilase são silenciados (knocked out) .

7. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que é capaz de converter uma fonte de carbono selecionada do grupo consistindo em amido, pectinas, ramnose, galactose, fucose, frutose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose, celulose, hemicelulose, glicose, xilose, arabinose, sacarose, lactose, ácidos graxos, triglicerídeos e glicerol.

8. Processo para produção de butanol caracterizado pelo fato de que compreende a fermentação de uma célula eucariótica transformada conforme definido em qualquer uma das reivindicações precedentes em um meio de fermentação apropriado e opcionalmente recuperação do butanol.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é realizado em um pH inferior a 5 .

10. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o meio de fermentação compreende acetato.

11. Caldo de fermentação caracterizado pelo fato de que compreende butanol obtido pelo processo de qualquer uma das reivindicações 8, 9 ou 10.