BRPI0923597A2 - Célula microbiana eucariótica, e, processo para produzir um produto de fermentação - Google Patents

Abstract

“célula microbiana eucariótica, e, processo para. produzir um produto de fermentação” a presente invenção diz respeito a células eucarióticas que têm a capacidade para isomerizar xilose diretamente em xilulose. as células adquiriram esta capacidade pela transformação com sequências de nucleotídeo que codificam quanto a uma xilose isomerase que tem um ou mais elementos de sequência específicos típicos para as isomerases tendo a capacidade de expressão funcional em leveduras, tal como por exemplo xilose isomerases obteníveis de wma bactéria do gênero clostridium e fusobacterium ou uma forma tunicada do gênero ciona. a célula preferivelmente é uma levedura ou um fungo filamentoso, mais preferivelmente uma levedura é capaz de fermentação alcoólica anaeróbica. o pode compreender ainda uma ou mais modificações genética que aumentam o fluxo do caminho do fosfato de pentose, reduzir a atividade de aldose redutase não específica, conferir à célula a capacidade para aumentar a atividade de xilulose cinase específica, converter a l-arabinose em 5-fosfato de d-xilulose, aumentar o transporte de pelo menos um de xilose e arabinose na célula hospedeira, diminuir a sensibilidade para a repressão de catabólito, tolerância aumentada ao etanol, osmolaridade ou ácidos orgânicos; e/ou reduzir a produção de subprodutos. a célula preferivelmente é uma célula que tem a capacidade para produzir um produto de fermentação tal como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3 propano-diol, etileno, glicerol, antibióticos de b-lactama e cefalosporinas. a invenção diz respeito ainda a processos para produzir estes produtos de fermentação em que uma célula da invenção é usada para fermentar xilose nos produtos de fermentação.

Description

“CÉLULA MICROBIANA EUCARIÓTICA, E, PROCESSO PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO” : Campo da invenção A presente invenção diz respeito ao uso de sequências de ácido ' 5 — nucléico que codificam as xilose isomerases na transformação de uma célula hospedeira microbiana eucariótica para conferir à célula hospedeira a capacidade de isomerizar xilose para xilulose.

A célula hospedeira transformada é usada em um processo para a produção de etanol e outros produtos de fermentação pela fermentação de um meio contendo pentose.

Fundamentos da invenção A produção de etanol economicamente viável da fração de hemicelulose de biomassa vegetal requer a conversão simultânea tanto de pentoses quanto de hexoses em taxas comparáveis e com rendimentos altos.

As leveduras, em particular Saccharomyces spp., são os candidatos mais apropriados para este processo visto que elas podem crescer rápido em hexoses, tanto aeróbica quanto anaerobicamente.

Além disso, elas são muito mais resistentes ao ambiente tóxico dos hidrolisados de lignocelulose do que as bactérias (geneticamente modificadas). Embora as cepas de S. cerevisiae do tipo selvagem possam —metabolizar lentamente a xilulose do açúcar de pentose, elas não são capazes de metabolizar a xilose.

Já nos idos de 1980 foi sugerido que o engendramento metabólico de leveduras para a utilização de xilose devem ser fundamentados na introdução da xilose isomerase (XI, EC 5.3.1.5) ao invés de expressar a xilose redutase heteróloga e a xilitol desidrogenase para — converter xilose em xilulose.

Infelizmente, todas as tentativas de introduzir uma xilose isomerase bacteriana em SS. cerevisiae falhou em produzir uma xilose isomerase funcionalmente expressada com a exceção notável da 7. thermophilus isomerase.

Esta enzima foi funcionalmente expressada em SS. cerevisiae mas apenas atividades muito baixas foram observadas nas temperaturas permissivas do crescimento. Esta situação drasticamente mudou quando uma xilose isomerase recém descoberta do fungo anaeróbico Piromyces Sp.E2 foi introduzido em S. cerevisiae e altos níveis de atividades i de enzima foram observados que possibilitam que esta cepa cresça - 5 — anaerobicamente e produza etanol a partir da xilose (WO 03/062340 e WO 06/009434). Tais cepas de levedura pela primeira vez forneceu taxas específicas de consumo de xilose e formação de etanol que são compatíveis com a produção de etanol em uma escala comercial.

Desde a descoberta da expressão funcional da xilose isomerase de Piromyces na levedura diversos relatos têm aparecido de expressão funcional em leveduras de outras xilose isomerases, todas as quais compartilham mais do que 70 % de identidade sequência de aminoácido com a enzima Piromyces, tal como por exemplo a xilose isomerase bacteriana de Bacteróides (WO 04/099381; WO 06/009434; WO 09/109633), e as xilose isomerases fúngicas de Cillamyces (WO 04/099381) e Orpinomyces (Madhavan et al/., 2008, DOI 10, 1007/s00253-008-1794-6).

Entretanto, antes de 24 de dezembro de 2008 nenhum relato foi publicado da expressão funcional em leveduras de xilose isomerases tendo menos do que 70 % de identidade de sequência de aminoácido com a enzima —Piromyces. Mais recentemente, em fevereiro de 2009, Brat et al. (2009, Appl. Environ. Microbiol. 75: 2304-2311) publicou a expressão funcional na levedura S. cerevisiae de uma xilose isomerase da bactéria anaeróbica Clostridium phytofermentans, a sequência de aminoácido da qual compartilha apenas 52 % de identidade com aquela da enzima Piromyces.

Até agora umas 450 sequências de aminoácido de xilose isomerase estão publicamente disponíveis no Genbank e outras bases de dados de sequência, incluindo as sequências de xilose isomerase de Piromyces, Cillamyces aberensis, Physcomitrella patens, Arabidopsis thaliana, Haemophilus somnus, Ciona intestinalis, Clostridium difficile,

Thermatoga maritime, Bacteroides fragilis, Burkholderia phytofirmans, Arthrobacter aurescens e Fusobacterium mortiferum.

Existe, entretanto, ainda uma necessidade na técnica quanto a sequências de nucleotídeo que codificam outras xilose isomerases que podem ' 5 ser usadas para transformar células hospedeiras como S. cerevisiae para conferir a elas a capacidade de isomerizar xilose para xilulose, de modo a permitir o uso da célula hospedeira assim transformada nos processos para a produção de etanol ou outros produtos de fermentação pela fermentação de estoque de alimentação que contém pentose.

Descrição da invenção Definições A enzima “xilose isomerase” (EC 5.3.1.5) é aqui definida como uma enzima que catalisa a isomerização direta de D-xilose em D- xilulose e vice e versa.

À enzima também é conhecida como uma D-xilose —cetoisomerase.

Algumas xilose isomerases também são capazes de catalisar a conversão entre D-glicose e D-frutose e são portanto algumas vezes aludidos como glicose isomerase.

As xilose isomerases requerem magnésio como cofator.

As xilose isomerases da invenção podem ser definidas ainda pela sua sequência de aminoácido como aqui descrita abaixo.

Do mesmo modo as —xilose isomerases podem ser definidas pelas sequências de nucleotídeo que codificam a enzima assim como pelas sequências de nucleotídeo que hibridizam a uma sequência de nucleotídeo de referência que codifica uma xilose isomerase como aqui descrita abaixo.

Uma unidade (U) de atividade de xilose isomerase é aqui definida como a quantidade de enzima que produz 1 —nmolde xilulosepor minuto, em uma mistura de reação contendo 50 mM de tampão de fosfato (pH 7,0), 10 mM de xilose e 10 mM de MgCl,, a 37ºC.

A xilulose formada foi determinada pelo método de Dische e Borenfreund (1951, J.

Biol.

Chem. 192: 583-587) ou pela HPLC como descrito nos Exemplos.

A identidade de sequência é aqui definida como uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácido (polipeptídeo ou proteína) ou : duas ou mais sequências de ácido nucléico (polinucleotídeo), como determinada pela comparação das sequências.

Na técnica, “identidade” ' 5 também significa o grau de relacionabilidade de sequência entre sequências de aminoácido ou ácido nucléico, como o caso pode ser, como determinado pelo emparelhamento entre cadeias de tais sequências.

A “Similaridade” entre duas sequências de aminoácido é determinada comparando-se a sequência de aminoácido e os seus substitutos de aminoácido conservados de um —polipeptídeo com a sequência de um segundo polipeptídeo. “Identidade” e “similaridade” pode ser facilmente calculadas pelos métodos conhecidos.

Os termos “identidade de sequência” ou “similaridade de sequência” significa que dois (poli)peptídeos ou duas sequências de nucleotídeo, quando otimamente alinhadas, preferivelmente no comprimento total (pelo menos da sequência mais curta na comparação) e maximizando o número de emparelhamentos e minimiza o número de intervalos tais como pelos programas ClustalW (1.83), GAP ou BESTFIT usando parâmetros pré- definidos, compartilham pelo menos uma certa porcentagem de identidade de sequência como definido aqui em outro lugar.

GAP usa o algoritmo de — alinhamento global de Needleman e Wunsch para alinhar duas sequências no seu comprimento total, maximizando o número de emparelhamentos e minimiza o número de intervalos.

No geral, os parâmetros pré-definidos de GAP são usados, com uma penalidade de criação de intervalo = 50 (nucleotídeos) / 8 (proteínas) e penalidade de extensão de intervalo = 3 — (nucleotídeos) /2 (proteínas). Para os nucleotídeos a matriz de contagem pré- definida usada é nwsgapdna e para as proteínas a matriz de contagem pré- definida é Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Um programa de alinhamento múltiplo preferido para alinhar as sequências de proteína da invenção é Clustal W (1.83) usando uma matriz blosum e ajustes pré-definidos (Penalidade de abertura de intervalo: 10; Penalidade de extensão de intervalo: 0,05). Está claro que quando sequências de RNA são ditas serem essencialmente similares ou têm um certo grau de identidade de | sequência com sequências de DNA, timina (T) na sequência de DNA é f 5 — considerada igual a uracila (U) na sequência de RNA.

Os alinhamentos e contagens de sequência quanto a identidade de sequência percentual podem ser determinados usando programas de computador, tais como o GCG Wisconsin Package, Versão 10.3, disponível da Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA ou o software de código aberto Emboss para Windows (versão corrente 2.7.107). Alternativamente a similaridade ou identidade percentuais podem ser determinadas pesquisando-

se contra bases de dados tais como FASTA, BLAST, etc.

Os métodos preferidos para determinar a identidade são planejados para dar o maior emparelhamento entre as sequências testadas.

O métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis.

Os métodos de programa de computador preferidos para determinar a identidade e similaridade entre duas sequências incluem por exemplo o pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 — (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul, S.

F. er al., J.

Mol.

Biol. 215: 403-410 (1990). O programa BLAST X está publicamente disponível da NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Betesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J.

Mol.

Biol. 215: 403-410 (1990). O algoritmo de Smith Waterman bem conhecido também

— pode ser usado para determinar identidade.

Os parâmetros preferidos para comparação de sequência de polipeptídeo incluem os seguintes: Algoritmo: Needleman e Wunsch, J.

Mol.

Biol. 48: 443-453 (1970); Matriz de Comparação: BLOSSUMO6?2 de Hentikoff e Hentikoff, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA. 89: 10915-10919 (1992); Penalidade de Intervalo: 12; e Penalidade de Comprimento de Intervalo: 4. Um programa útil com estes parâmetros está publicamente disponível como o programa “Ogap” da Genetics Computer Group, localizado em Madison, WI. Os parâmetros anteriormente mencionados são os parâmetros pré-definidos para : 5 as comparações de aminoácido (junto com nenhuma penalidade para intervalos de extremidade).

Os parâmetros preferidos para a comparação de ácido nucléico incluem os seguintes: Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); Matriz de comparação: emparelhamentos = +10, —desemparelhamentos = 0; Penalidade de Intervalo: 50; Penalidade de Comprimento de Intervalo: 3. Disponível como o programa Gap da Genetics Computer Group, localizado em Madison, Wis. Dados acima estão os parâmetros pré-definidos para as comparações de ácido nucléico. Opcionalmente, na determinação do grau de similaridade de aminoácido, a pessoa habilitada também podem levar em conta as chamadas substituições de aminoácido “conservativas”, como estará evidente para a pessoa habilitada. As substituições de aminoácido conservativas referem-se à intercambialidade dos resíduos tendo cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, —valina, leucina, e isoleucina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais de hidroxila alifática é serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina, e triptofano; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais básicas é lisina, arginina, e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Os grupos de substituição de aminoácidos — conservativos “preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, e asparagina-glutamina. As variantes substitucionais da sequência de aminoácido aqui divulgada são aquelas em que pelo menos um resíduo nas sequências divulgadas foi removido e um resíduo diferente inserido no seu lugar. Preferivelmente, a mudança de aminoácido é conservativa. As substituições conservativas i preferidas para cada um dos aminoácidos que ocorrem naturalmente são como f 5 — segue: Ala para ser; Arg para lis; Asn para gln ou his; Asp para glu; Cys para ser ou ala; Gln para asn; Glu para asp; Gly para pro; His para asn ou gln; Ile para leu ou val; Leu para ile ou val; Lis para arg; gln ou glu; Met para leu ou ile; Phe para met, leu ou tir; Ser para thr; Thr para ser; Trp para tir; Tir para trp ou phe; e, Val para ile ou leu.

As sequências de nucleotídeo que codificam as xilose isomerases da invenção também podem ser definidas pela sua capacidade para hibridizar com as sequências de nucleotíideco da SEQ ID NO. 2, respectivamente, sob condições de hibridização moderada, ou preferivelmente sob severas. As condições de hibridização severas são aqui definidas como condições que permitem que uma sequência de ácido nucléico de pelo menos cerca de 25, preferivelmente cerca de 50 nucleotídeos, 75 ou 100 e o mais preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, hibridizem a uma temperatura de cerca de 65ºC em uma solução que compreende cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma — concentração iônica comparável, e lavagens a 65ºC em uma solução que compreende cerca de 0,1 M de sal, ou menos, preferivelmente 0,2 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma concentração iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada durante a noite, isto é pelo menos por 10 horas e preferivelmente a lavagem é realizada por pelo menos uma — horacom pelo menos duas mudanças da solução de lavagem. Estas condições usualmente permitirão a hibridização específica de sequências tendo cerca de 90 % ou mais de identidade de sequência.

As condições moderadas são aqui definidas como condições que permitem que uma sequência de ácido nucléico de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, hibridize em uma temperatura de cerca de 45ºC em uma solução que compreende cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma concentração iônica comparável, e lavagem na temperatura ambiente em uma . 5 — solução que compreende cerca de 1. M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma concentração iônica comparável.

Preferivelmente, a hibridização é realizada durante a noite, isto é pelo menos por 10 horas, e preferivelmente a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas trocas da solução de lavagem.

Estas condições usualmente permitirão a hibridização específica de sequências tendo até 50 % de identidade de sequência.

A pessoa habilitada na técnica será capaz de modificar estas condições de hibridiziçção de modo a identificar especificamente sequências que variam em identidade entre 50 % e 90 %. Uma “construção de ácido nucléico” ou “vetor de ácido —nucléico” são aqui entendidos significar uma molécula de ácido nucléico feita pelo ser humano que resulta do uso da tecnologia de DNA recombinante.

O termo “construção de ácido nucléico” portanto não inclui moléculas de ácido nucléico que ocorrem naturalmente embora uma construção de ácido nucléico pode compreender (partes de) moléculas de ácido nucléico que ocorrem naturalmente.

Os termos “vetor de expressão” ou “construção de expressão” referem-se às sequências de nucleotídeo que são capazes de efetuar a expressão de um gene em células hospedeiras ou organismos hospedeiros compatíveis com tais sequências.

Estes vetores de expressão tipicamente incluem pelo menos sequências reguladoras de transcrição adequadas e — opcionalmente, sinais de terminação de transcrição 3º.

Os fatores adicionais necessários ou úteis em efetuar a expressão também podem estar presentes, tais como elementos realçadores de expressão.

O vetor de expressão será introduzido em uma célula hospedeira adequada e será capaz de efetuar a expressão da sequência codificadora em uma cultura de célula in vitro da célula hospedeira. O vetor de expressão será adequado para a replicação na célula hospedeira ou organismo da invenção. * Como aqui usado, o termo “promotor” ou “sequência reguladora de transcrição” refere-se a um fragmento de ácido nucléico que ' 5 funciona para controlar a transcrição de uma ou mais sequências codificadoras, e está localizado a montante com respeito à direção de transcrição do sítio de início de transcrição da sequência codificadora, e é estruturalmente identificado pela presença de um sítio de ligação para a RNA polimerase dependente de DNA, os sítios de início de transcrição e quaisquer — outras sequências de DNA, incluindo, mas não limitadas aos sítios de ligação do fator de transcrição, sítios de ligação de proteína repressora e ativadora, e quaisquer outras sequências de nucleotídeos conhecidas por uma pessoa de habilidade na técnica para atuar direta ou indiretamente para regular a quantidade de transcrição do promotor. Um promotor “constitutivo” é um promotor que é ativo na maior parte dos tecidos sob a maioria das condições fisiológicas e desenvolvimentais. Um promotor “indutível” é um promotor que é fisiológica ou desenvolvimentalmente regulado, por exemplo pela aplicação de um indutor químico.

O termo “marcador selecionável” é um termo familiar a uma pessoa de habilidade comum na técnica e é aqui usada para descrever qualquer entidade genética que, quando expressada, pode ser usada para selecionar uma célula ou células contendo o marcador selecionável. O termo “repórter” pode ser usado intercambiavelmente com marcador, embora o mesmo seja principalmente usado para se referir aos marcadores visíveis, tais como proteína fluorescente verde (GFP). Os marcadores selecionáveis podem ser dominantes ou recessivos ou bidirecionais.

Como aqui usado, o termo “operavelmente ligado” refere-se a uma ligação de elementos de polinucleotídeo em uma relação funcional. Um ácido nucléico é “operavelmente ligado” quando o mesmo é colocado em uma relação funcional com uma outra sequência de ácido nucléico. Por exemplo, uma sequência reguladora de transcrição é operavelmente ligada a uma : sequência codificadora se a mesma afeta a transcrição da sequência codificadora. Operavelmente ligado significa que as sequências de DNA que ' 5 — sãoligadassão tipicamente contíguas e, onde necessário unir duas regiões que codificam proteínas, contíguas e na matriz de leitura.

Os termos “proteina” ou “polipeptídeo” são usados intercambiavelmente e referem-se às moléculas que consistem de uma cadeia de aminoácidos, sem referência a um modo específico de ação, tamanho, 10 estrutura 3-dimensional ou origem.

“Fungos” (fungo singular) são aqui entendidos como microorganismo eucarióticos heterotróficos que digerem o seu alimento externamente, absorvendo as moléculas de nutriente dentro das suas células. Os fungos são um reino separado de organismos eucarióticos e incluem leveduras, mofos, e cogumelos. Os termos fungos, fungo e fúngico como aqui usado incluem assim expressamente leveduras assim como fungos filamentosos.

O termo “gene” significa um fragmento de DNA que compreende uma região (região transcrita), que é transcrita em uma molécula de RNA (por exemplo um mRNA) em uma célula, operavelmente ligado às regiões reguladoras adequadas (por exemplo um promotor). Um gene usualmente compreenderá vários fragmentos operavelmente ligados, tais como um promotor, uma sequência líder 5º, uma região codificadora e uma sequência não traduzida 3º (extremidade 3º) que compreende um sítio de —poliadenilação. “Expressão de um gene” refere-se ao processo em que uma região de DNA que é operavelmente ligada às regiões reguladoras apropriadas, particularmente um promotor, é transcrita em um RNA, que é biologicamente ativo, isto é que é capaz de ser traduzido em uma proteína ou peptídeo biologicamente ativos.

O termo “homólogo” quando usado para indicar a relação entre uma dada molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo (recombinantes) e um dado organismo hospedeiro ou célula hospedeira, é entendido significar que na natureza a molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo é produzida por ' 5 uma célula hospedeira ou organismos da mesma espécie, preferivelmente da mesma variedade ou cepa.

Se homólogo a uma célula hospedeira, uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tipicamente será (mas não necessariamente) operavelmente ligado a uma outra sequência promotora (heteróloga) e, se aplicável, uma outra sequência de sinal secretora e/ou sequência terminadora (heteróloga) do que no seu ambiente natural.

É entendido que as sequências reguladoras, sequências de sinal, sequências terminadoras, etc. também podem ser homólogas para a célula hospedeira.

Neste contexto, o uso apenas de elementos de sequência “homólogos” possibilita a construção de organismos geneticamente modificados “auto- clonados” (GMO's) (auto-clonagem é definida aqui como no European Directive 98/81/EC Anexo II). Quando usado para indicar a relacionabilidade de duas sequências de ácido nucléico o termo “homólogo” significa que uma sequência de ácido nucléico de filamento único pode hibridizar a uma sequência de ácido nucléico de filamento único complementar.

O grau de hibridização pode depender de vários fatores incluindo a quantidade de identidade entre as sequências e as condições de hibridização tais como temperatura e concentração salina como debatido mais tarde.

O termo “heteróloga” quando usado com respeito a um ácido nucléico (DNA ou RNA) ou proteína refere-se a um ácido nucléico ou proteína que não ocorrem naturalmente como parte do organismo, célula, genoma ou sequência de DNA ou RNA em que os mesmos estão presentes, ou que é encontrado em uma célula ou localização ou localizações no genoma ou sequência de DNA ou RNA que diferem daquela em que os mesmos são encontrados na natureza.

Os ácidos nucléicos ou proteínas heterólogas não são endógenas à célula na qual os mesmos são introduzidos, mas foram obtidos de uma outra célula ou sintética ou recombinantemente produzidos. No geral, embora não necessariamente, tais ácidos nucléicos codificam proteínas que não são normalmente produzidos pela célula na qual o DNA é " 5 — transcrito ou expressado. Similarmente RNA exógeno codifica proteínas não normalmente expressadas na célula na qual o RNA exógeno está presente. Ácidos nucléicos e proteínas heterólogos também podem ser aludidos como ácidos nucléicos ou proteínas estranhos. Qualquer ácido nucléico ou proteína que uma pessoa de habilidade na técnica reconheceria como heterólogos ou estranhos para a célula na qual os mesmos são expressados são aqui abrangidos pelo termo ácido nucléico ou proteína heterólogos. O termo heterólogo também aplica-se às combinações não naturais de sequências de ácido nucléico ou aminoácido, isto é combinações onde pelo menos duas das sequências combinadas são estranhas com respeito uma à outra.

Descrição detalhada da invenção Até agora umas poucas 450 sequências de aminoácido da xilose isomerase estão publicamente disponíveis no Genbank e outras bases de dados de sequência. Entre elas estão várias sequências de aminoácido de xilose isomerases que são conhecidas pela capacidade de expressão funcional em leveduras, incluindo por exemplo as xilose isomerases de fungos anaeróbicos tais Piromyces, Cillamyces, e Orpinomyces, assim como xilose isomerases bacterianas de Bacteróides, todas as quais compartilham mais do que 70 % de identidade de sequência de aminoácido com a enzima de Piromyces. Os presentes inventores surpreendentemente descobriram agora — sequências de aminoácido de xilose isomerases que não estão relacionadas com a enzima Piromyces no sentido de que elas compartilham menos do que 70 % de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido da enzima de Piromyces, e que não obstante têm a capacidade de expressão funcional (isto é ativas) em leveduras. Além disso, os presentes inventores identificaram vários elementos de sequência de aminoácido que são compartilhados entre todas as xilose isomerases com a capacidade de expressão funcional em leveduras.

A expressão funcional de uma xilose isomerase em uma levedura é aqui entendida como a expressão de uma ' 5 — sequência codificadora otimizada no códon para uma xilose isomerase a partir de um promotor glicolítico em um plasmídeo com base 2g na S. cerevisiae que permite o crescimento detectável da levedura em xilose como a única fonte de carbono, preferivelmente sob condições anaeróbicas com produção de etanol às custas da xilose, mais preferivelmente com pelo menos um de uma taxa de crescimento, rendimento de biomassa e etanol que seja pelo menos 10, 20, 50 ou 80 % daquela obtida com uma sequência codificadora da xilose isomerase de Piromyces otimizada no códon sob condições de outro modo idênticas.

Preferivelmente a expressão funcional é a expressão que permite o crescimento detectável da levedura em xilose como a única fonte de carbono em uma temperatura que é mais baixa do que 35, 33, 30 ou 28ºC e em uma temperatura que é mais alta do que 20, 22, ou 25ºC.

Em um primeiro aspecto a presente invenção diz respeito a uma célula hospedeira transformada que tem a capacidade de isomerizar a xilose para xilulose.

A capacidade de isomerizar xilose para xilulose é conferida à célula hospedeira pela transformação da célula hospedeira com uma construção de ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma xilose isomerase.

A capacidade da célula hospedeira transformada para isomerizar a xilose em xilulose é entendida significar a isomerização direta de xilose, em uma única reação catalisada por —uma xiloseisomerase, para xilulose, como oposto à conversão de duas etapas de xilose em xilulose via um intermediário de xilitol como catalisada pela xilose redutase e xilitol desidrogenase, respectivamente.

Em uma forma de realização a sequência de nucleotídeo que codifica a xilose isomerase é selecionada do grupo que consiste de:

(a) uma sequência de nucleotídeo que codifia um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, polipeptídeo este que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, ' 5 69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98, ou 99 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 (C. difficile); (b) uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, polipeptídeo este que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,70, 71, 72,73, 74,75, 76,77, 78,79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98, ou 99 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 2 (Ciona); (c) uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, polipeptídeo este que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 45, 46, 47, 48,49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73, 74,75, 76,77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, —90,91,92,93,94,95,95,96,97,98, ou 99 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 35 (F. mortiferum); (d) uma sequência de nucleotídeo o filamento complementar da qual hibridiza a uma sequência de nucleotídeo de (a), (b) ou (c); e, (e) uma sequência de nucleotídeo a sequência da qual difere da — sequência de uma sequência de nucleotídeo de (d) devido à degenerescência do código genético.

Em uma forma de realização a sequência de nucleotídeo que codifica a xilose isomerase codifica uma sequência de aminoácido que compreende um ou elementos de sequência de aminoácido que são compartilhados entra as xilose isomerases com a capacidade de expressão funcional em leveduras.

Nesta forma de realização a sequência de nucleotídeo que codifica a xilose isomerase codifica uma sequência de aminoácido que i compreende um ou elementos de sequência de aminoácido selecionados do ' 5 grupoque consiste de: (a) um resíduo de metionina na posição 91; (b) a sequência de aminoácido TGIKLL nas posições 134-139; (c) um resíduo de fenilalanina na posição 230; (d) os aminoácidos fenilalanina e lisina nas posições 264 e 265, respectivamente; (e) a sequência de aminoácido TLAGH nas posições 274-278; (D a sequência de aminoácido RYASF nas posições 387-391; (g) um resíduo de glicina na posição 394; e, (b) um resíduo de alanina na posição 431. Nesta forma de realização a xilose isomerase codificada pode compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os 8 dos elementos de (a) a (h) em todas as combinações possíveis.

Assim, nesta forma de realização a xilose isomerase codificada pode compreender o seguinte elemento ou combinações de elementos: (a); (b); (c); (d); (e); (O); (8); (b); (a) e (b); (a) e (0;(8)e(d); (a e(s); (3 e(; (a e(g; (a) e(b); (b)e(co);(b)e(d);(b)e (e); (b) e (O); (b) e (g); (b) e (D); (o) e (d); (c) e (e); (o) e (O; (0) e (8); (o) e (D); () e (e); (d) e (1); (d) e (g); (d) e (b); (e) e (O); (e) e (g); (e) e (d); ) e (8); (D e (Ob; (g) e (b; (3), (b) e (0); (a), (b) e (d); (a), (b) e (e); (a), (b) e (D; (a), (Db) e &); (a), (b) e (b); (a), (o) e (d); (a), (c) e (o); (a), (o) e (O; (2), (o) e (g); (a), (c) e(b;(3) (de (o); (a), (d) e (O); (a), (d) e (8); (a), (d) e (D); (a), (e) e (O; (a), (e) e (8); (a), (e) e (D); (a), (É) e (8); (a), (O) e (b); (a), (g) e (Db); (b), (c) e (d); (b), (o) e (e); (b), (o) e (O); (b), (c) e (g); (b), (c) e (b); (b), (d) e (e); (b), (d) e O; (b), (D) e (8); (b), (d) e (b); (b), (e) e (O; (b), (e) e (8); (b), (&) e (b); (b), (D) e (&); (b), (O) e (b); (b), (8) e (); (o), (d) e (e); (o), (d) e (8); (o), (d) e (8); (O),

(d) e (b); (o), (e) e (O); (c), (e) e (g); (o), (6) e (b); (o), (8) e (8); (0), (E) e (b);

(o), (8) e (b); (0), (e) e (O; (d), (e) e (g); (d), (e) e (); (d), (D) e (8); (d), () e

: (b); (d), (8) e (b); (e), (O e (g); (e), (O) e (b); (e), (g) e (b); (O, (8) e (D); (&), (b), (o) e (d); (a), (b), (c) e (e); (a), (b), (c) e (O; (a), (b), (c) e (8); (a), (b), (c) e 75 (&;(9),(b)(de(s); (a), (b), (d) e (O; (a), (b), (d) e (8); (a), (b), (d) e (b); (a), (b), (e) e (O; (a), (b), (e) e (8); (a), (b), (e) e (b); (a), (b), () e (8); (a), (b), (&) e

(b); (a), (b), (g) e (b; (a), (o), (d) e (e); (a), (o), (d) e (O; (a), (c), (d) e (g); (a),

(o), (d) e (b); (a), (c), (e) e (O; (2), (c), (e) e (g); (a), (c), (6) e (D); (a), (o), (É) e

(8); (), (0), O e (b); (a), (o), (g) e (b); (a), (d), (e) e (1); (a), (d), (e) e (8); (a),

(d),(e)e(h) (a), (d), (1 e(g; (a), (d), (O e (b); (a), (d), (g) e (b); (a), (e), () e (8); (a), (e), (O) e (b); (a), (e), (8) e (b); (a), (O, (g) e (D); (b), (c), (d) e (e); (db),

(o), (d) e (O); (b), (o), (d) e (g); (b), (e), (d) e (b); (b), (c), (e) e (O); (b), (c), (e) e

(&); (b), (o), (e) e (b); (b), (o), () e (g); (b), (o), O) e (b); (b), (O), (g) e (6); (db),

(d), (e) e (O); (b), (d), (6) e (g); (b), (d), (e) e (b); (b), (d), (É e (8); (b), (DD, (O)

15º e(b; (b, (O, (g) e (D; (b), (o), (O) e (8); (D), (O), (O e (b); (b), (e), (9) e (D); (b), O), (g) e (b); (e), (d), (e) e (O; (o), (d), (e) e (g); (0), (d), (e) e (b); (c), (D),

(O e (g); (o), (d), (O e (b); (c), (d), (g) e (b); (c), (e), (É) e (8); (c), (6), (O e (b);

(o), (e), (8) e (6); (0), (O, (g) e (b); (d), (e), (É) e (8); (d), (e), (É) e (b); (d), (e),

(g) e (b); (d), (0, (g) e (b); (6), (O, (g) e (b); (a), (b), (o), (d) e (e); (a), (b), (c),

(de(D;(a,(b), (c), (d) e (g); (a), (b), (o), (D) e (D); (a), (Db), (O), (e) e (O); (2), (b), (o), (8) e (8); (a), (b), (c), (e) e (b); (a), (b), (o), (O e (g); (a), (Db), (0), ( e

(bb); (a), (b), (o), (&) e (b); (a), (b), (d), (e) e (O; (a), (db), (d), (e) e (8); (a), (b),

(d), (e) e (b); (a), (b), (d), (O) e (8); (8), (b), (d), (O e (b); (2), (b), (d), (g) e (b);

(a), (b), (e), (O e (8); (a), (b), (e), (É) e (D); (2), (b), (e), (8) e (D); (a), (D), O,

(8)e(h) (a), (c), (d), (e) e (O; (a), (c), (dd), (e) e (8); (a), (o), (D), (e) e (6); (a), (o), (d), (O) e (8); (a), (o), (d), (É) e (b); (a), (0), (d), (g) e (b); (a), (c), (e), ( e

(g); (a), (o), (e), (O) e (b); (9), (o), (e), (g) e (D; (a), (o), (O, (8) e (b); (2), (0),

(e), (O) e (8); (3), (d), (6), (O) e (b); (a), (d), (e), (g) e (D); (a), (), (O), (8) e (D);

(a), (e), (0, (g) e (b); (b), (0), (d), (e) e (O; (b), (o), (d), (e) e (8); (b), (0), (O),

(e) e (b); (b), (o), (d), (O e (8); (b), (o), (d), (O e (b); (b), (o), (d), (8) e (h); Ob), (o), (e), (O e (8); (b), (o), (e), (É) e (b); (b), (o), (e), (g) e (Db); (b), (o), (O), (8) e (b); (b), (d), (e), (O) e (8); (b), (0), (e), (O e (D); (b), (9), (&), (8) e (D); (b), (OD), O, (8) e (b); (b), (o), (O, (g) e (b); (0), (d), (e), (S) e (8); (0), (d), (6), O) e (D); 75 (0,(0,(69)(8)e(b) (o), (dd), (O, (&) e (b); (o), (e), (O, (8) e (D); (0), (6), (D, (8) e (b; (a), b), (0), (d), (e) e (O; (a), (b), (o), (d), (e) e (8); (a), (b), (o), (0), (e) e (b); (a), (b), (c), (d), (O) e (8); (a), (b), (o), (d), (O e (D); (a), (b), (0), (D), (8) e (D; (a), (b), (o), (6), (O e (8); (a), (b), (o), (e), (É) e (b); (a), (bD), (c), (O), (g) e (b); (a), (b), (o), (O, (g) e (D); (a), (b), (d), (e), (É e (8); (2), (b), (d), (e), (HO e(b);(&), (b, (d), (e), (8) e (b); (a), (b), (d), (O, (8) e (D); (a), (D), (&), D, (&) e (b); (&), (o), (d), (o), (H) e (8); (a), (o), (9), (e), (É) e (b); (a), (o), (d), (e), (g) e (b); (a), (0), (d), (O, (g) e (b); (a), (o), (e), (O, (g) e (D; (2), (d), (6), D, (8) e (b); (b), (o), (d), (e), (O e (8); (b), (o), (d), (e), (O) e (b); (b), (o), (D), (e), (g) e (b); (b), (o), (OD), (O, (8) e (b); (b), (o), (e), (O, (8) e (b); (b), (d), (e), D, 15º (8) e(b; (o), (d) (e), (OD, (g) e (b); (a), (b), (o), (d), (e), (O e (8); (a), (D), (O), (d), (e), (O) e (b); (3), (b), (0), (D), (e), (8) e (b); (a), (b), (0), (d), (O), (g) e (D); (a), (b), (0), (6), (O, (g) e (b); (a), (b), (d), (o), (O, (8) e (b); (a), (0), (OD), (e), (O, (8) e (Db); e finalmente, (b), (c), (d), (e), (OD, (g) e (h). Além disso, as sequências de aminoácido nas posições que correspondem a aquelas das — sequências de aminoácido em (b), (d), (e) e (f) podem diferir preferivelmente em não mais do que 1, 2, ou 3 aminoácidos da sequência de aminoácidos em (b), (d), (e) e (OD.

Preferivelmente, o elemento (b) pelo menos consiste de I na posição 136; o elemento (d) pelo menos consiste de F na posição 264; o elemento (£) pelo menos consiste de um F ou um Y na posição 391. Em uma — forma de realização preferida, a xilose isomerase codificada compreende pelo menos um dos elementos (a), (1), (g) e (h). Mais preferivelmente, a xilose isomerase codificada além disso compreende pelo menos um dos elementos (b) e (c) e o mais preferivelmente a xilose isomerase codificada além disso compreende pelo menos um dos elementos (d) e (e). Em uma forma de realização preferida, a xilose isomerase codificada compreende pelo menos o elemento (a), mais preferivelmente além disso a isomerase compreende pelo menos os elementos (b), (c) e/ou (g), ainda mais preferivelmente além disso a isomerase compreende pelo menos os elementos (d), (£) e/ou (bh), o mais ' S — preferivelmente a isomerase adicionalmente compreende o elemento (e).

As posições de aminoácido dos elementos da sequência acima de (a) a (h) referem-se às posições na sequência de aminoácido de referência da xilose isomerase de Piromyces da SEQ ID NO: 3. Nas sequências de aminoácido da invenção outra que não a SEQ ID NO: 3, preferivelmente, as posições de aminoácido dos elementos de sequência de (a) a (h) estão presentes nas posições de aminoácido que correspondem às posições dos elementos de sequência de (a) a (h) na SEQ ID NO: 3, preferivelmente em um alinhamento de sequência ClustalW (1.83) usando ajustes pré-definidos. A pessoa habilitada saberá como identificar as posições de aminoácido — correspondentes nas sequências de aminoácido da xilose isomerase outras que não a SEQ ID NO: 3 usando algoritmos de alinhamento de sequência de aminoácido como definido acima. Um exemplo de um tal alinhamento é representado na Tabela 4, que mostra um alinhamento de sequência múltipla Clustal W (1.83) das sequências de aminoácido da xilose isomerase dos — organismos indicados na esquerda. Os aminoácidos sombreados da sequência de Piromyces (SEQ ID NO: 3) na Tabela 4 indicam elementos de sequência que são compartilhados entre xilose isomerases que têm a capacidade de expressão funcional na levedura.

Em uma forma de realização a sequência de nucleotídeo que —codificaaxilose isomerase codifica uma sequência de aminoácido que não é um ou mais das SEQ ID NOs: 3 a 7. Preferivelmente a sequência de nucleotídeo que codifica a xilose isomerase não tem uma sequência de aminoácido que tenha mais do que (ou tem uma sequência de aminoácido que tem menos do que) 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85,

84, 83, 82, 81, 80, 79, 78,77, 76,75, 74, 73, 72, 71 ou 70 % de identidade de sequência com pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 3 a 7. i Em uma forma de realização a sequência de nucleotídeo que ' 5 —codificaa xiloseisomerase codifica uma sequência de aminoácido que não é uma ou mais da SEQ ID NO: 35. Preferivelmente a sequência de nucleotídeo que codifica a xilose isomerase não tem uma sequência de aminoácido que tenha mais do que (ou tem uma sequência de aminoácido que tem menos do que) 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80,79,78,77,76,75, 74,73, 72,71 ou 70 % de identidade de sequência com pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo da SEQ ID NO: 35. Em uma forma de realização a sequência de nucleotídeo que codifica a xilose isomerase codifica uma sequência de aminoácido que não é umadas sequências de aminoácido selecionadas do grupo que consiste de: (a) a xilose isomerase de Piromyces divulgada na WO 03/062340; (b) as tetaiotaomícron xilose isomerases de Bacteróides divulgadas na WO 04/099381 e na WO 06/009434); (0) A xilose isomerase de Cillamyces divulgada na WO 04/099381]; e, (d) a xilose isomerase de Orpinomyces divulgada em Madhavan et al. (2008, supra). Preferivelmente a sequência de nucleotídeo que codifica a —xiloseisomerase não tem uma sequência de aminoácido que tenha mais do que (ou tem uma sequência de aminoácido que tem menos do que) 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77,76, 75, 74, 73, 72, 71 ou 70 % de identidade de sequência com pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de:

(a) a xilose isomerase de Piromyces divulgada na WO 03/062340; (b) as tetaiotaomícron xilose isomerases de Bacteróides divulgada na WO 04/099381 e na WO 06/009434); . 5 (c) a xilose isomerase de Cillamyces divulgada na WO 04/099381; e, (d) a xilose isomerase de Orpinomyces divulgada em Madhavan et al. (2008, supra).

Em uma forma de realização a sequência de nucleotídeo que —codificaa xilose isomerase codifica uma sequência de aminoácido que não é um aminoácido de uma xilose isomerase de um fungo anaeróbico da Família Neocallimastigaceae, tal como um fungo de um gênero selecionado do grupo que consiste de: Anaeromyces, Caecomyces, Cillamyces, Neocallimastix, Orpinomyces, Piromyces, e Ruminomyces.

Em uma forma de realização a sequência de nucleotídeo que codifica a xilose isomerase codifica uma sequência de aminoácido que não é um aminoácido de uma xilose isomerase de uma bactéria do gênero Bacteróides ou Parabacteróides.

As sequências de nucleotídeo da invenção codificam uma nova classe de xilose isomerases que podem ser funcionalmente expressadas em células hospedeiras microbianas eucarióticas da invenção como definidas abaixo. As sequências de nucleotídeo da invenção preferivelmente codificam xilose isomerases que naturalmente ocorrem em certos fungos, bactérias e tunicado.

Uma sequência de nucleotídeo preferida da invenção codifica assim uma xilose isomerase com uma sequência de aminoácido que é idêntica àquela de uma xilose isomerase que é obtenível de (ou naturalmente ocorre em) uma bactéria da Família Clostridiaceae, mais preferivelmente uma bactéria do gênero Clostridium, do qual C. difficile é mais preferido.

Uma sequência de nucleotídeo preferida da invenção codifica assim uma xilose isomerase com uma sequência de aminoácido que é idêntica àquela de uma xilose isomerase que é obtenível de (ou naturalmente ocorre em) uma bactéria da Família Fusobacteriaceae, mais preferivelmente uma ' 5 — bactéria do gênero Fusobacterium, do qual F. mortiferum é a mais preferida.

Uma sequência de nucleotídeo preferida da invenção codifica assim uma xilose isomerase com uma sequência de aminoácido que é idêntica àquela de uma xilose isomerase que é obtenível de (ou naturalmente ocorre em) um tunicado, preferivelmente um tunicado da Família Cionidae, mais preferivelmente um tunicado do gênero Ciona, do qual o C. intestinales é o mais preferido.

Em uma outra forma de realização a sequência de nucleotídeo que codifica a xilose isomerase é selecionada do grupo que consiste de: (a) uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, polipeptídeo este que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73, 74,75, 76,77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 96, 97, 98, ou 99 % de identidade de sequência com —asequênciade aminoácido de pelo menos uma da SEQ ID NO: 8, 9, 11 ou 13; (b) uma sequência de nucleotídeo o filamento complementar da qual hibridiza a uma sequência de nucleotídeo de (a) ou (b); e, (c) uma sequência de nucleotídeo a sequência da qual difere da sequência de uma sequência de nucleotídeo de (d) devido à degenerescência — docódigo genético.

É entretanto entendido que as sequências de nucleotídeo que codificam formas engendradas de qualquer uma das xilose isomerases definidas acima e que compreendem uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido quando comparada às xilose isomerases que ocorrem naturalmente correspondentes mas que estão dentro das faixas de identidade ou similaridade como aqui definidas são expressamente incluídas

. na invenção.

Portanto, em uma forma de realização a sequência de nucleotídeo da invenção codifica uma sequência de aminoácido da xilose

' 5 — isomerase que compreende uma sequência de assinatura da xilose isomerase como definida por Meaden er al. (1994, Gene, 141: 97-101): VXWIGPIGREG[YSTA] (presente nas posições 187 a 195) e [LIVM]EPKPX[EQ]P (presente nas posições 232 a 239), em que “X” pode ser qualquer aminoácido e em que os aminoácidos em colchetes indicam que um dos aminoácidos em colchetes pode estar presente nesta posição na sequência de assinatura.

Uma sequência de aminoácido da xilose isomerase da invenção preferivelmente compreende ainda os resíduos de aminoácido conservados His-102, Asp-105, e Asp-340, que constitaem uma tríade diretamente envolvida na catálise, Lis-235 desempenha um papel estrutural assim como um catalítico funcional, e Glu-233, que está envolvido na ligação do magnésio (Vangrysperre et al., 1990, Biochem.

J. 265: 699-705; Henrick et al., J.

Mol.

Biol. 208: 129-157; Bhosale et al., 1996 Microbiol.

Rev. 60: 280-300). As posições de aminoácido das sequências de assinatura acima e resíduos conservados referem-se às posições na sequência de aminoácido de referência da xilose isomerase de Piromyces da SEQ ID NO: 3. Nas sequências de aminoácido da invenção outras que não a SEQ ID NO: 3, preferivelmente, as posições de aminoácido das sequências de assinatura acima e resíduos conservados estão presentes nas posições de aminoácido que correspondem às posições das sequências de assinatura e resíduos

— conservados na SEQ ID NO: 3, preferivelmente em um alinhamento de sequência ClustalW (1.83 ou 1.81) usando ajustes pré-definidos.

A pessoa habilitada saberá como identificar posições de aminoácido correspondentes nas sequências de aminoácido da xilose isomerase outras que não a SEQ ID

NO: 3 usando algoritmos de alinhamento de sequência de aminoácido como definidos acima.

Um exemplo de um tal alinhamento é representado na Tabela 4. Além disso, até agora umas 450 sequências de aminoácido das xilose isomerases são conhecidas na técnica e as novas estão sendo continuamente adicionadas.

Os alinhamentos de sequência da SEQ ID NO: 3 ' 5 e das sequências de xilose isomerase da invenção com estas sequências de aminoácido da xilose isomerase conhecidas e novas indicarão regiões e posições aminoácido ainda mais conservadas, a conservação das quais é importante para a estrutura e atividade enzimática.

Estas regiões e posições não tolerarão nenhuma ou apenas substituições de aminoácido conservativas.

As substituições de aminoácido fora destas regiões e posições são improváveis de afetar enormemente a atividade da xilose isomerase.

A sequência de nucleotídeo codifica uma xilose isomerase que é preferivelmente expressada na forma ativa na célula hospedeira transformada.

Assim, a expressão da sequência de nucleotídeo na célula hospedeira produz uma xilose isomerase com uma atividade específica de pelo menos 10 U de atividade de xilose isomerase por mg de proteína a 25ºC, preferivelmente pelo menos 20, 25, 30, 50, 100, 200 ou 300 U por mg a 25ºC.

A atividade específica da xilose isomerase expressada na célula hospedeira transformada é aqui definida como a quantidade das unidades de atividade de —xilose isomerase por mg de proteína do lisado isento de célula da célula hospedeira, por exemplo um lisado isento de célula de levedura.

À determinação da atividade de xilose isomerase, quantidade de proteína e preparação do lisado isento de célula são como descritas nos Exemplos.

Preferivelmente, a expressão da sequência de nucleotídeo na célula — hospedeira produz uma xilose isomerase com um K para xilose que é menor do que 50, 40, 30 ou 25 mM, mais preferivelmente, o K,, para xilose é de cerca de 20 mM ou menos.

As sequências de nucleotídeo da invenção, que codificam polipeptídeos com atividade de xilose isomerase, são obteníveis de genômico e/ou cDNA de um fungo, levedura ou bactéria que pertencem a um filo, classe ou gênero como descritos acima, usando método para isolação das sequências de nucleotídeo que são bem conhecidas na técnica por si (ver por exemplo Sambrook e Russell (2001) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3º . 5 edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque). As sequências de nucleotídeo da invenção são por exemplo obteníveis em um processo em que a) iniciadores de PCR (tais como aqueles nas SEQ ID Nos: 14 e 15) são usados no genômico e/ou cDNA de um organismo adequado (por exemplo um fungo, bactéria ou tunicado como — indicado acima) para gerar um fragmento de PCR que compreende parte das sequências de nucleotídeo que codificam os polipeptídeos com atividade de xilose isomerase; b) o fragmento de PCR obtido em a) é usado como sonda para triar um cDNA e/ou biblioteca genômica do organismo; e c) que produz um cDNA ou DNA genômica que compreende a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase.

Para aumentar a probabilidade de que a xilose isomerase é expressada em níveis suficientes e na forma ativa nas células hospedeiras transformadas da invenção, a sequência de nucleotídeo que codifica estas enzimas, assim como outras enzimas da invenção (ver abaixo), são preferivelmente adaptadas para otimizar seu uso de códon àquela da célula hospedeira em questão. A adaptabilidade de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma enzima para o uso de códon de uma célula hospedeira pode ser expressada como índice de adaptação de códon (CAD). O índice de adaptação de códon é aqui definido como uma medida da adaptabilidade relativa do uso de códon de um gene contra o uso de códon de genes altamente expressados em uma célula hospedeira ou organismo particulares. A adaptabilidade relativa (w) de cada códon é a razão do uso de cada códon, àquela do códon mais abundante para o mesmo aminoácido. O índice CAI é definido como a média geométrica destes valores de adaptabilidade relativa.

Códons não sinônimos e códons de terminação (dependentes do código genético) são excluídos. A faixa de valores CAI de 0 a 1, com valores mais altos indicando uma proporção mais alta dos códons mais abundantes (ver Sharp e Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; também ver: Jansen ' 5 et al, 2003, Nucleic Acids Res. 31(8): 2242-51). Uma sequência de nucleotídeo adaptada preferivelmente tem um CAI de pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 ou 0,9. Mais preferidas são as sequências como listadas nas SEQ ID NOs: 16, 17 e 38, que foram otimizadas no códon para a expressão nas células de S. cerevisiae. | A célula hospedeira a ser transformada com uma construção de ácido nucléico que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma xilose isomerase da invenção preferivelmente é um hospedeiro microbiano eucariótico, mais preferivelmente uma célula hospedeira fúngica, tal como uma levedura ou célula hospedeira fúngica filamentosa.

Preferivelmente a célula hospedeira é uma célula cultivada. A célula hospedeira da invenção, preferivelmente é um hospedeiro capaz de transportar pentose ativa ou passiva (xilose e preferivelmente também arabinose) para dentro da célula. A célula hospedeira preferivelmente contém glicólise ativa.

A célula hospedeira pode preferivelmente ainda conter um caminho do fosfato —depentoseendógeno e podem conter atividade de xilulose cinase endógena de modo que a xilulose isomerizada a partir da xilose pode ser metabolizada para piruvato. O hospedeiro preferivelmente ainda contém enzimas para a conversão de uma pentose (preferivelmente através do piruvato) a um produto de fermentação desejado tal como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi- — propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, antibióticos de B-lactama e cefalosporinas. Um célula hospedeira particularmente preferida é uma célula hospedeira que é naturalmente capaz de fermentação alcoólica, preferivelmente, fermentação alcoólica anaeróbica. A célula hospedeira preferivelmente ainda tem uma alta tolerância ao etanol, uma alta tolerância ao pH baixo (isto é capaz de crescer a um pH mais baixo do que 5, 4, ou 3) e aos ácidos orgânicos como o ácido láctico, ácido acético ou ácido fórmico e produtos da degradação de açúcar tais como furfural e hidróxi-metilfurfural, e 7 5 uma alta tolerância às temperaturas elevadas. Qualquer uma destas características ou atividades da célula hospedeira podem estar naturalmente presentes na célula hospedeira ou podem ser introduzidas ou modificadas pela modificação genética, preferivelmente pela auto clonagem ou pelos métodos da invenção descritos abaixo. Uma célula adequado é uma célula cultivada, uma célula que pode ser cultivada no processo de fermentação por exemplo em fermentação submergida ou no estado sólido. Particularmente as células adequadas são microorganismos eucarióticos como por exemplo fungos, entretanto, mais adequados para o uso na presente invenções são leveduras ou fungos filamentosos.

As leveduras são aqui definidas como microorganismos eucarióticos e incluem todas as espécies da subdivisão Eumycotina (Yeasts: characteristics and identification, J. A. Barnett, R. W. Payne, D. Yarrow, 2000, 3º ed., Cambridge University Press, Cambridge UK; e, The yeasts, a taxonomic study, C. P. Kurtzman e J. W. Fell (eds) 1998, 4º ed., Elsevier Science Publ. B. V., Amsterdam, Países Baixos) que predominantemente crescem na forma unicelular. As leveduras podem crescer por brotamento de um talo unicelular ou pode crescer pela fissão do organismo. As leveduras preferidas como células hospedeiras pertencem ao gênero Saccharomyces, Klwveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, e Yarrowia. Preferivelmente a levedura é capaz de fermentação anaeróbica, mais preferivelmente fermentação alcoólica anaeróbica. Durante anos sugestões foram feitas para a introdução de vários organismos para a produção de bio-etanol a partir de açúcares de safra. Na prática, entretanto, todos os processos de produção de bio-etanol principais têm continuado a usar as leveduras do gênero Saccharomyces como produtor de etanol. Isto é devido às características muito atraentes da espécie Saccharomyces para os processos industriais, isto é, uma alta ácido-, etanol- e osmo-tolerância, capacidade de crescimento anaeróbico, e naturalmente a sua ' 5 — alta capacidade fermentativa alcoólica. A espécie de levedura preferida como células hospedeiras fúngicas incluem S. cerevisiae, S. exiguus, S. bayanus, K. lactis, K. marxianus e Schizosaccharomyces pombe.

Os fungos filamentosos são aqui definidos como microorganismos eucarióticos que incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina. Estes fungos são caracterizados por um micélio vegetativo composto de quitina, celulose, e outros polissacarídeos complexos. Os fungos filamentosos da presente invenção são morfológica, fisiológica, e geneticamente distintos das leveduras. O crescimento vegetativo pelos fungos filamentosos é pelo alongamento hifal e o catabolismo de carbono da maioria dos fungos filamentosos é obrigatoriamente aeróbico. Os fungos filamentosos preferidos como células hospedeiras pertencem ao gênero Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremonium, Fusarium, e Penicillium.

Em um célula hospedeira transformada da invenção, a sequência de nucleotídeo que codifica a xilose isomerase como definida acima é de modo preferível operavelmente ligada a um promotor que causa expressão suficiente das sequências de nucleotídeo na célula para conferir à célula a capacidade para converter xilose em xilulose. Mais preferivelmente o promotor causa expressão suficiente das sequências de nucleotídeo para conferir à célula a capacidade para crescer em xilose como a única fonte de — carbono e/ou energia, mais preferivelmente sob condições anaeróbicas. Os promotores adequados para a expressão da sequência de nucleotídeo como definida acima incluem promotores que são insensíveis à repressão do catabólito (glicose) e/ou que requerem xilose para a indução. Os promotores tendo estas características são amplamente disponíveis e conhecidos pela pessoa habilitada. Os exemplos adequados de tais promotores incluem por exemplo promotores de genes glicolíticos tais como os promotores da fosfofrutocinase (PPK), triose fosfato isomerase (TPI), gliceraldeído-3- i fosfato desidrogenase (GPD, TDH3 ou GAPDH), piruvato cinase (PYK), ] S — fosfoglicerato cinase (PGK), promotor da glicose-6-fosfato isomerase (PGII) de leveduras ou fungos filamentosos; mais detalhes a cerca de tais promotores de levedura podem ser encontrados na (WO 93/03159). Outros promotores úteis são promotores do gene que codifica a proteína ribossômica, o promotor do gene da lactase (LACZ), promotores do gene da álcool desidrogenase

10. (ADHJ, ADH4, e outros), o promotor da enolase (ENO), o promotor transportador da hexose(glicose) (HXT7), e o promotor da citocromo cl (CYCI). Outros promotores, tanto constitutivos quanto indutíveis, e sequências realçadoras ou ativadoras a montante serão conhecidas por aqueles de habilidade na técnica. Preferivelmente o promotor que é operavelmente ligado à sequência de nucleotídeo como definido acima é homólogo à célula hospedeira.

A célula hospedeira transformada da invenção preferivelmente compreende ainda atividade da xilulose cinase de modo que a xilulose isomerizada a partir da xilose possa ser metabolizada para piruvato.

Preferivelmente, a célula contém atividade de xilulose cinase endógena. Mais preferivelmente, uma célula da invenção compreende uma modificação genética que aumenta a atividade da xilulose cinase específica. Preferivelmente a modificação genética causa a super-expressão de uma xilulose cinase, por exemplo pela super-expressão de uma sequência de —nucleotídeo que codifica uma xilulose cinase. O gene que codifica a xilulose cinase pode ser endógena para a célula ou pode ser uma xilulose cinase que é heteróloga para a célula. Uma sequência de nucleotídeo que pode ser usada para a super-expressão da xilulose cinase nas células da invenção é por exemplo o gene da xilulose cinase da S. cerevisiae (XKST) como descrito por

Deng e Ho (1990, Appl.

Biochem.

Biotechnol. 24-25: 193-199). Uma outra xilulose cinase preferida é uma xilose cinase que está relacionada com a xilulose cinase de Piromyces (xilB; ver a WO 03/0624430). Esta xilulose : i cinase de Piromyces está de fato mais relacionada com a cinase procariótica ' S — doque todas as cinases eucarióticas conhecidos tal como a cinase de levedura.

As xilulose cinases eucarióticas foram indicadas como cinases não específicas de açúcar, que têm uma ampla faixa de substrato que inclui xilulose.

Ao contrário, as xiluloses cinases procarióticas, às quais a cinase de Piromyces está mais intimamente relacionada, foram indicadas ser cinases mais específicas para a xilulose, isto é tendo uma faixa de substrato mais estreita.

Nas células da invenção, uma xilulose cinase a ser super-expressada é super- expressada em pelo menos um fator de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ou 20 quando comparada a uma cepa que é geneticamente idêntica exceto quanto à modificação genética que causa a super-expressão.

Deve ser entendido que estes níveis de super-expressão podem ser aplicados ao nível de estado constante da atividade de enzima, o nível de estado constante da proteína da enzima assim como ao nível de estado constante do transcrito que codifica a enzima.

Uma célula da invenção preferivelmente compreende ainda uma modificação genética. que aumenta o fluxo do caminho do fosfato de pentose como descrito na WO 06/009434. Em particular, a modificação genética causa um fluxo aumentado da parte não oxidativa do caminho do fosfato de pentose.

Uma modificação genética que causa um fluxo aumentado da parte não oxidativa do caminho do fosfato de pentose é aqui entendido significar uma modificação que aumenta o fluxo em pelo menos um fator de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ou 20 quando comparado com o fluxo em uma cepa que é geneticamente idêntica exceto quanto à modificação genética que causa o fluxo aumentado.

O fluxo da parte não oxidativa do caminho do fosfato de pentose pode ser medido como descrito na WO 06/009434.

As modificações genéticas que aumentam o fluxo do caminho do fosfato de pentose podem ser introduzidas nas células da invenção de vários modos. Estes incluindo por exemplo a obtenção de níveis de atividade de estado constante mais altos de xilulose cinase e/ou uma ou mais das . 5 enzimas da parte não oxidativa do caminho do fosfato de pentose e/ou um nível de estado constante reduzido de atividade da aldose redutase não específica. Estas mudanças nos níveis de atividade de estado constante pode ser efetuada pela seleção de mutantes (espontâneos ou induzidos pelos produtos químicos ou radiação) e/ou pela tecnologia de DNA recombinante por exemplo pela super-expressão ou inativação, respectivamente, de genes que codificam as enzimas ou fatores que regulam estes genes.

Em uma célula preferida da invenção, a modificação genética compreende a super-expressão de pelo menos uma enzima do caminho da fosfato de pentose (parte não oxidativa). Preferivelmente a enzima é selecionada do grupo que consiste das enzimas que codificam a ribulose-5- fosfato — isomerase, —ribulose-S-fosfato —3-epimerase, transcetolase e transaldolase. Várias combinações de enzimas do caminho do fosfato de pentose (parte não oxidativa) podem ser super-expressadas. Por exemplo as enzimas que são super-expressadas podem ser pelo menos as enzimas —ribulose-5-fosfato isomerase e ribulose-5-fosfato 3-epimerase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transcetolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato 3-epimerase e transcetolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato 3-epimerase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5- fosfato 3-epimerase, transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-S-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato 3-epimerase, e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase,

ribulose-5-fosfato 3-epimerase, e transcetolase.

Em uma forma de realização da invenção cada uma das enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5- fosfato 3-epimerase, transcetolase e transaldolase são super-expressadas na célula da invenção.

Preferida é uma célula em que a modificação genética . 5 — compreende pelo menos a super-expressão da enzima transaldolase.

Mais preferida é uma célula em que a modificação genética compreende pelo menos a super-expressão tanto da enzima de transcetolase quanto a de transaldolase como tal uma célula hospedeira já é capaz de crescimento anaeróbico em xilose.

De fato, sob algumas condições nós descobrimos que —ascélulas que super-expressam apenas a transcetolase e a transaldolase já têm a mesma taxa de crescimento anaeróbico na xilose como o fazem as células que super-expressam todas as quatros das enzimas, isto é a ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato 3-epimerase, transcetolase e transaldolase.

Além disso, as células da invenção que super-expressam tanto as enzimas de ribulose-5-fosfato isomerase e ribulose-5-fosfato 3-epimerase são preferidos em relação às células que super-expressam apenas a isomerase ou apenas a 3- epimerase visto que a super-expressão de apenas uma destas enzimas pode produzir desequilíbrios metabólicos.

Existem vários meios disponíveis na técnica para a super- expressão de enzimas nas células da invenção.

Em particular, uma enzima pode ser super-expressada aumentando-se o número de cópia do gene que codifica a enzima na célula, por exemplo pela integração de cópias adicionais do gene no genoma da célula, pela expressão do gene de um vetor de expressão de cópia múltipla epissômica ou pela introdução de um vetor de — expressão epissômico que compreende cópias múltiplas do gene.

A sequência codificadora usada para a super-expressão das enzimas preferivelmente é homóloga à célula hospedeira da invenção.

Entretanto, as sequências codificadoras que são heterólogas à célula hospedeira da invenção podem do mesmo modo ser aplicado.

Alternativamente a super-expressão das enzimas nas células da invenção podem ser obtidas usando-se um promotor que não é nativo à sequência que codifica a enzima a ser super-expressada, isto é um promotor que é heterólogo para a sequência codificadora à qual a mesma é 7 5 — operavelmente ligada.

Embora o promotor seja preferivelmente heterólogo à sequência codificadora à qual a mesma é operavelmente ligada, também é preferido que o promotor seja homólogo, isto é endógeno à célula da invenção.

Preferivelmente o promotor heterólogo é capaz de produzir um nível de estado constante mais alto do transcrito que compreende a sequência —codificadora (ou é capaz de produzir mais moléculas transcritas, isto é moléculas de mRNA, por unidade de tempo) do que é o promotor que é nativo para a sequência codificadora, preferivelmente sob condições onde a xilose ou xilose e glicose são disponíveis como fontes de carbono, mais preferivelmente como fontes de carbono principais (isto é mais do que 50 % da fonte de carbono disponível consiste de xilose ou xilose e glicose), mais preferivelmente como a única fonte de carbono.

Os promotores adequados neste contexto incluem promotores como descritos acima para a expressão das sequências de nucleotídeo que codificam xilose isomerases como definidas acima. 20 . Uma outra célula da invenção preferida compreende uma modificação genética que reduz a atividade da aldose redutase não específica na célula.

Preferivelmente, a atividade da aldose redutase não específica é reduzida na célula hospedeira por uma ou mais modificações genéticas que reduzem a expressão de ou inativa um gene que codifica uma aldose redutase não específica.

Preferivelmente, as modificações genéticas reduzem ou inativam a expressão de cada cópia endógena de um gene que codifica uma aldose redutase não específica que é capaz de reduzir uma aldopentose, incluindo, xilose, xilulose e arabinose, no genoma da célula.

Uma dada célula pode compreender cópias múltiplas de genes que codificam aldose redutases não específicas como um resultado da di-, poli- ou aneu-ploidia, e/ou um célula pode conter várias (iso)enzimas diferentes com atividade de aldose redutase que diferem na sequência de aminoácido e que são cada uma i codificadas por um gene diferente. Também em tais casos preferivelmente a ' 5 — expressão de cada gene que codifica uma aldose redutase não específica é reduzida ou inativada. Preferivelmente, o gene é inativado pela deleção de pelo menos parte do gene ou pelo rompimento do gene, pelo qual neste contexto o termo gene também inclui qualquer sequência não codificadora a montante ou a jusante da sequência codificadora, a deleção ou inativação (parcial) do qual resulta em uma redução da expressão da atividade da aldose redutase não específica na célula hospedeira. Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma aldose redutase cuja atividade deva ser reduzida na célula da invenção e sequências de aminoácido de tais aldose redutases são descritas na WO 06/009434 e incluem por exemplo os genes da aldose redutase (não específica) do gene GRE3 da S. cerevisiae (Traff et al., 2001, Appl.

Environm. Microbiol. 67: 5668-5674) e ortólogos destes em outras espécies. Em uma outra forma de realização preferida, a célula transformada da invenção que tem a capacidade de isomerizar xilose para xilulose como descrito acima, além disso tem a capacidade para converter L- —arabinose em D-xilulose 5-fosfato como por exemplo descrito em Wisselink et al. (2007, AEM Accepts, publicado online antes da impressão em 1 Junho de 2007; Appl. Environ. Microbiol. doi: 10.1128/AEM.00177-07) e na EP 1 499 708. A capacidade de converter L-arabinose em D-xilulose 5-fosfato é preferivelmente conferida à célula pela transformação com uma construção(s) — de ácido nucléico que compreende sequências de nucleotídeo que codificam a) uma arabinose isomerase; b) uma ribulocinase, preferivelmente uma L- ribulocinase, uma xilose isomerase; e c) uma ribulose-5-P-4-epimerase, preferivelmente uma Lr-ribulose-5-P-4-epimerase. Preferivelmente, nas células da invenção, a capacidade para converter L-arabinose em D-xilulose

5-fosfato é a capacidade para converter L-arabinose em Dxilulose 5-fosfato através das reações subsequentes de 1) isomerização de arabinose em ribulose; 2) fosforilação de ribulose para ribulose 5-fosfato; e, 3) i epimerização de ribulose 5-fosfato em D-xilulose 5-fosfato.

As sequências de ' 5 — nucleotídeo adequadas que codificam arabinose isomerases, uma ribulocinase e ribulose-5-P-4-epimerases podem ser obtidas a partir de Bacillus subtilis, Escherichia coli (ver por exemplo EP 1 499 708), Lactobacilli, por exemplo Lactobacillus plantarum (ver por exemplo Wisselink et al. supra), ou espécies de Clavibacter, Arthrobacter e Gramella, das quais preferivelmente

Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens e Gramella forsetii.

Uma outra célula hospedeira transformada preferida de acordo com a invenção pode compreender outras modificações genéticas que resulta em uma ou mais das características selecionadas do grupo que consiste de (a) transporte aumentado de xilose e/ou arabinose na célula; (b) sensibilidade diminuída à repressão de catabólito; (c) tolerância aumentada ao etanol, osmolaridade ou ácidos orgânicos; e, (d) produção reduzida de subprodutos.

Os subprodutos são entendidos significar moléculas contendo carbono outro que não o produto de fermentação desejado e incluem por exemplo xilitol, arabinitol, glicerol e/ou ácido acético.

Qualquer modificação genética aqui — descrita pode ser introduzida pela mutagênese clássica e triagem e/ou seleção para o mutante desejado, ou simplesmente pela triagem e/ou seleção quanto aos mutantes espontâneos com as características desejadas.

Alternativamente, as modificações genéticas podem consistir da super-expressão de genes endógenos e/ou a inativação de genes endógenos.

Os genes, a super-expressão — dos quaisé desejada quanto ao transporte aumentado de arabinose e/ou xilose na célula, são preferivelmente escolhidos de genes que codificam um transportador de hexose ou pentose.

Na S. cerevisiae e outras leveduras estes genes incluem HXTJ, HXT2, HXT4, HXT5, HXT7 e GAL2, dos quais HXT7, HXT5 e GAL?2 são os mais preferidos (ver Sedlack e Ho, Yeast 2004;

21: 671-684). Um outro transportador preferido para a expressão em levedura é o transportador de glicose codificado pelo gene SUT1 de P. stipitis (Katahira er al., 2008, Enzyme Microb. Technol. 43: 115-119). Similarmente i ortólogos destes genes transportadores em outras espécies podem ser super- . 5 —expressados. Outros genes que podem ser super-expressados nas células da invenção incluem genes que codificam as enzimas glicolíticas e/ou enzimas etanologênicas tais como álcool desidrogenases. Os genes endógenos preferidos para a inativação incluem os genes da hexose cinase por exemplo o gene HXK2 da S. cerevisiae (ver Diderich er al., 2001, Appl. Environ.

—“Microbiol. 67: 1587-1593); os genes MIG1 ou MIG2 de S. cerevisiae; os genes que codificam enzimas envolvidas no metabolismo de glicerol tal como os genes | e/ou 2 da glicerol-fosfato desidrogenase da S. cerevisiae; ou (que hibridizam) ortólogos destes genes em outras espécies. Outras modificações ainda mais preferidas de células hospedeiras para a fermentação de xilose são descritas em van Maris ef al. (2006, Antonie van Leeuwenhoek 90: 391-418), WO2006/009434, WO2005/023998, WO2005/111214, e WO2005/091733. Qualquer uma das modificações genéticas das células da invenção como aqui descritas são, tanto quanto possível, preferivelmente introduzidas ou modificadas pela modificação genética de auto clonagem.

Em uma célula hospedeira preferida transformada de acordo com a invenção, a construção de ácido nucléico confere à célula hospedeira a capacidade para crescer em xilose como fonte de carbono/energia, preferivelmente como a única fonte de carbono/energia, e preferivelmente sob condições anaeróbicas, isto é condições como definidas aqui abaixo para o — processo de fermentação anaeróbica. Preferivelmente, quando cultivado em xilose como fonte de carbono/energia o hospedeiro transformado não produz essencialmente nenhum xilitol, por exemplo o xilitol produzido está abaixo do limite de detecção ou por exemplo menor do que 5, 2, 1, 0,5, ou 0,3 % do carbono consumido em uma base molar. Preferivelmente, no caso da fonte de carbono/energia também incluir arabinose, a célula não produz essencialmente nenhum arabinitol, por exemplo o arabinitol produzido está abaixo do limite de detecção ou por exemplo menor do que 5, 2, 1, 0,5, ou 0,3 i % do carbono consumido em uma base molar.

. 5 Uma célula hospedeira transformada da invenção preferivelmente tem a capacidade para crescer em xilose como a única fonte de carbono/energia em uma taxa de pelo menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 ou 0,3 h" sob condições aeróbicas, ou, mais preferivelmente, em uma taxa de pelo menos 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08, 0,1, 0,12, 0,15 ou 0,2 h' sob condições anaeróbicas. Uma célula da invenção preferivelmente tem a capacidade para crescer em uma mistura de glicose e xilose (em uma razão de 1:1 em peso) como a única fonte de carbono/energia a uma taxa de pelo menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 ou 0,3 h' sob condições aeróbicas, ou, mais preferivelmente, a uma taxa de pelo menos 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08,

15. 0,1,0,12,0,15 ou 0,2 h? sob condições anaeróbicas. Assim, em uma célula hospedeira transformada preferida de acordo com a invenção, a construção de ácido nucléico confere à célula hospedeira a capacidade para fermentar anaerobicamente xilose como a única fonte de carbono em um processo em que por fim o piruvato é usado como um elétron (e aceitador de hidrogênio) e —éreduzido para produtos de fermentação tais como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, fB-lactama antibióticos e cefalosporinas. Preferivelmente, uma célula da invenção tem uma taxa de — consumo de xilose específica de pelo menos 200, 300, 400, 600, 700, 800, 900 ou 1000 mg h" (g em peso seco). Preferivelmente, uma célula da invenção tem um rendimento de produto de fermentação (tal como etanol) em xilose que é pelo menos 20, 40, 50, 60, 80, 90, 95 ou 98 % do rendimento da célula de produto de fermentação (tal como etanol) em glicose. Mais preferivelmente, o rendimento da célula hospedeira modificada de produto de fermentação (tal como etanol) em xilose é igual ao rendimento da célula hospedeira de produto de fermentação (tal como etanol) em glicose. Do mesmo modo, o rendimento de biomassa da célula hospedeira modificada em . 5 —xiloseé preferivelmente pelo menos 55, 60, 70, 80, 85, 90, 95 ou 98 % do rendimento de biomassa da célula hospedeira em glicose. Mais preferivelmente, o rendimento da biomassa da célula hospedeira modificada em xilose é igual ao rendimento de biomassa da célula hospedeira em glicose. É entendido que na comparação de rendimentos em glicose e xilose ambos os rendimentos são comparados sob condições aeróbicas ou ambos sob condições anaeróbicas.

Em um outro aspecto a invenção diz respeito a um processo para produzir um produto de fermentação selecionado do grupo que consiste de etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, antibióticos de fB-lactima e cefalosporinas. O processo preferivelmente compreende as etapas de: a) fermentar um meio contendo uma fonte de xilose, e opcionalmente arabinose, com uma célula como definido acima, por meio da qual a célula fermenta xilose, e opcionalmente — arabinose, para o produto de fermentação, e opcionalmente, b) recuperação do produto de fermentação.

Além de uma fonte de xilose a fonte de carbono no meio de fermentação também pode compreender uma fonte de glicose. A pessoa habilitada avaliará ainda que o meio de fermentação pode também — compreender ainda outros tipos de carboidratos tais como por exemplo em particular uma fonte de arabinose. As fontes de xilose, glicose e arabinose podem ser xilose, glicose e arabinose como tal (isto é como açúcares monoméricos) ou eles podem estar na forma de qualquer carboidrato oligo- ou polimérico que compreenda unidades de xilose, glicose e/ou arabinose, tais como por exemplo lignocelulose, arabinanos, xilanos, celulose, amido e outros.

Para a liberação de unidades de xilose, glicose e/ou arabinose a partir de tais carboidratos, as carboidrases apropriadas (tais como arabinases, i xilanases, glicanases, amilases, celulases, glicanases e outras) podem ser ' 5 — adicionadas ao meio de fermentação ou podem ser produzidas pela célula hospedeira modificada.

No último caso a célula hospedeira modificada pode ser geneticamente engendrada para produzir e excretar tais carboidrases.

Uma vantagem adicional de usar fontes oligo- ou poliméricas de glicose é que as mesmas permitem manter uma concentração baixa(mais baixa) de glicose livre durante a fermentação, por exemplo usando-se quantidades limitantes de taxa das carboidrases preferivelmente durante a fermentação. isto, por sua vez, impedirá a repressão de sistemas requeridos para o metabolismo e transporte de açúcares que não glicose tais como xilose e arabinose.

Em um processo preferido a célula hospedeira modificada fermenta tanto xilose quanto glicose, e opcionalmente arabinose, de modo preferível simultaneamente caso este em que preferivelmente uma célula hospedeira modificada é usada que é insensível à repressão da glicose para impedir o crescimento diáuxico.

Além de uma fonte de xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação compreenderá ainda o ingrediente apropriado — requerido para o cultivo da célula hospedeira modificada.

As composições do meio de fermentação para o crescimento de microorganismos eucarióticos tais como leveduras e fungos filamentosos são bem conhecidos na técnica.

O processo de fermentação pode ser um processo de fermentação aeróbico ou um anaeróbico.

Um processo de fermentação —anaeróbica é aqui definido como um processo de fermentação conduzido na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido, preferivelmente menos do que 5, 2,5 ou 1 mmol/L/h, mais preferivelmente O mmol/L/h é consumido (isto é o consumo de oxigênio não é detectável), e em que as moléculas orgânicas servem tanto como doador de elétron quanto aceitadores de elétron. Na ausência de oxigênio, o NADH produzido na glicólise e a formação de biomassa, não pode ser oxidada pela fosforilação oxidativa. Para resolver este problema muitos microorganismos usam o piruvato ou um de seus derivados como um aceitador de elétron e : 5 — hidrogênio regenerando deste modo NADH. Assim, em um processo de fermentação anaeróbica preferido o piruvato é usado como um aceitador de elétron (e aceitador de hidrogênio) e é reduzido aos produtos de fermentação tais como etanol, assim como produtos de fermentação que não etanol tais como ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido suceínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, ácido butírico, caproato, butanol, glioxilato, antibióticos de B- lactama e cefalosporinas. Os processos anaeróbicos da invenção são preferidos em relação aos processos aeróbicos porque Os processos anaeróbicos não requerem investimentos e energia para aeração e além disso, os processos anaeróbicos produzem rendimentos de produto mais altos do que os processos aeróbicos. Alternativamente, o processo de fermentação da invenção pode ser conduzido sob condições limitadas em oxigênio aeróbicas. Preferivelmente, em um processo aeróbico sob condições limitadas de oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é de pelo menos 5,5, mais preferivelmente de pelo menos 6 e ainda mais preferivelmente de pelo menos 7 mmoles/L/h.

O processo de fermentação é preferivelmente conduzido em uma temperatura que seja ideal para as células modificadas da invenção. Assim, para a maior parte das células de leveduras ou fúngicas, o processo de fermentação é realizado a uma temperatura que seja menor do que 42ºC, preferivelmente menor do que 38ºC. Para as células de levedura ou fúngicas filamentosas, o processo de fermentação é preferivelmente realizado em uma temperatura que é mais baixa do que 35, 33, 30 ou 28ºC e em uma temperatura que é mais alta do que 20, 22, ou 25ºC.

Preferivelmente nos processos de fermentação da invenção, as células estavelmente mantém as construções de ácido nucléico que conferem à célula a capacidade de isomerizar xilose em xilulose, e opcionalmente converter arabinose em D-xilulose 5-fosfato. Preferivelmente no processo . 5 — pelomenos 10,20,50 ou75 % das células retêm as capacidades de isomerizar xilose em xilulose, e opcionalmente converter arabinose em D-xilulose 5- fosfato depois de 50 gerações de cultivo, preferivelmente sob condições de fermentação industriais.

Um processo de fermentação preferido de acordo com a invenção é um processo para a produção de etanol, pelo qual o processo compreende as etapas de: a) fermentar um meio contendo uma fonte de xilose, e opcionalmente arabinose, com uma célula como definido acima, pelo qual a célula fermenta xilose, e opcionalmente arabinose, para etanol, e opcionalmente, b) recuperação do etanol. O meio de fermentação pode ser realizado ainda como descrito acima. No processo, a produtividade de etanol volumétrica é preferivelmente de pelo menos 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 ou 10,0 g de etanol por litro por hora. O rendimento de etanol em xilose e/ou glicose e/ou arabinose no processo preferivelmente é de pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 98 %. O rendimento de etanol é aqui definido como uma porcentagem do rendimento máximo teórico, que, para xilose, glicose e arabinose é de 0,51 g de etanol por g de xilose, glicose ou arabinose.

Um outro processo de fermentação preferido de acordo com a invenção é um processo que compreende fermentar um meio contendo uma fonte de xilose e uma fonte de arabinose em que entretanto duas cepas — separadas de células são usadas, uma primeira cepa de células como definida acima exceto que as células da primeiro cepa não têm a capacidade para converter arabinose em D-xilulose 5-fosfato, que as células da primeira cepa fermentam xilose para o produto de fermentação; e uma segunda cepa de células como definidas acima exceto que as células da segunda cepa não têm a capacidade para isomerizar (diretamente) a xilose para xilulose, que as células da segunda cepa fermentam arabinose para o produto de fermentação. O processo opcionalmente compreende a etapa de recuperação do produto de i fermentação. As células da primeira e segunda são ainda como de outro modo : 5 aquidescrito acima. : Neste documento e nas suas reivindicações, o verbo “compreender” e as suas conjugações são usados no seu sentido não limitante para significar que os itens a seguir da palavra são incluídos, mas itens não especificamente mencionados não são excluídos. Além disso, referência a um elemento pelos artigos indefinidos “o” ou “a” não exclui a possibilidade de que mais do que um do elemento esteja presente, a menos que o contexto claramente requeira que haja um e apenas um dos elementos. Os artigos indefinidos “um” ou “uma” assim usualmente significam “pelo menos um”.

Todas as referências de patente e literatura citadas no presente relatório descritivo são por meio deste incorporadas por referência em sua totalidade.

Os seguintes exemplos são oferecidos apenas com propósitos ilustrativos, e não são intencionadas a limitar o escopo da presente invenção de nenhum modo.

Descrição da figura Figura 1 Árvore filogenética das xilose isomerases testadas quanto a expressão em levedura.

Exemplos

1. Expressão funcional de xilose isomerases da invenção em levedura

1.1 Organismo Hospedeiro A cepa hospedeira de levedura foi RN1000. Esta cepa é um derivado da cepa RWB 218 (Kuyper et al., FEMS Yeast Research 5, 2005, 399-409). O plasmídeo pAKX002 que codifica a XyIA de Piromyces é perdida em RN1000. O genótipo da cepa hospedeira é: MatA, ura3-52, leu2- 112, gre3::hpbhMX, loxP-Ptpi::TALI, loxP-Ptpi::RKII, pUGPtpiTKLI, PUGPtpi-RPE1,fp415 PadhlXKS1Tcycl-LEU2). i 1.2 Construções de expressão com genes XI sintéticos . 5 Os genes XI otimizados no códon sintéticos (para Saccharomyces cerevisiae) foram clonados em um derivado de pRS306 (Sikorski R. S., Hieter P., 1989, “A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae” Genetics 122: 19-27) que compreende as sequências do promotor TPII (899 pares de base) de Saccharomyces cerevisiae e do terminador CYC!1 (288 pares de base), usando os sítios de restrição Xbal (na extremidade 5º do gene sintético) e BamHI (na extremidade 3º dos genes sintéticos). Os primeiros três nucleotídeos em frente do ATG foram modificados em AAA de modo a otimizar a expressão. A tabela 1 fornece uma lista da sequência XI que foram testadas e as SEQ ID NO's correspondentes que representam as sequências sintéticas. Os genes foram sintetizados pela GenScript Corporation (zie www.genscript.com) e liberados clonados em pUC57: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fegi?db=nuccore& id=2440162. O promotor TPI foi obtido usando DNA genômico de levedura como padrão em uma PCR com iniciadores: avançado: AAACCGGTTTCTTCTTCAGATTCCCTC reverso: TIAGATCTCTAGATTTATGTATGTGTTTTTTGTAGT. O terminador CYCI foi obtido usando DNA genômico de levedura como padrão em uma PCR com iniciadores: avançado: AAGAATTCGGATCCCCTTTTCCTTTGTCGA reverso: AACTCGAGCCTAGGAAGCCTTCGAGCGTC.

1.3 Transformação do organismo hospedeiro e seleção de — transformantes

RN1000 foi transformado com plasmídeos usando o “método de Gietz* (Gietz er al., 1992, Nucleic Acids Res. 25 de março de 1992; 20(6):

1425.). A seleção primária de transformantes foi feita em meio mineral (YNB + 2 % de glicose) via complementação de uracila. . 5 1.4 Ensaios de Enzima A atividade de xilose isomerase é ensaiada a 37ºC em uma mistura de reação contendo 50 mM de tampão de fosfato (pH 7,0), 10 mM de xilose, 10 MM de MgCl, e uma quantidade adequada de extrato isento de — célula. Uma unidade de atividade é definida como a quantidade de enzima — que produz 1 nmol de xilulose por min sob as condições de ensaio. A xilulose formada é determinada pelo método de Dische e Borenfreund (Dische e Borenfreund, 1951, J. Biol. Chem. 192: 583-587) ou pela HPLC usando uma Coluna Biorad HPX-87N operada a 80ºC e eluída a 0,6 ml/min usando 0,01 M de Na;HPO, como o eluente. A xilose e xilulose são detectadas por um —detetorde Índice Refrativo em uma temperatura interna de 60ºC. A atividade específica é expressada como unidades por mg de proteína. A proteína é determinada com o reagente de proteína Bio-Rad (Bio- Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) com y-globulina bovina como um padrão.

1.5 Caracterização fisiológica das células transformadas As células transformadas foram purificadas em colônia em meio mínimo com glicose como a única fonte de carbono várias vezes. Subsequentemente as células transformadas purificadas em colônia são cultivadas em frascos agitados na presença de oxigênio em meio sintético —com2% (p/v)de xilose como fonte de carbono/energia. Os resultados são mostrados na Tabela 2 onde “+” indica que as células mostraram crescimento significante. O sinal “-” indica que nenhum crescimento significante ocorreu. As cepas que crescem às custas da xilose foram subsequentemente testadas quanto a sua capacidade para crescer anaerobicamente às custas de xilose com uma formação concomitante de etanol. As cepas transformadas com as xilose isomerases de Cillamyces aberensis, Ciona intestinalis, Clostridium difficile, Bacteroides fragilis e Fusobacterium mortiferum foram capazes de crescer anaerobicamente em . 5 xilose com taxas de crescimento, rendimentos de biomassa e etanol comparáveis com aquelas da enzima de Piromyces da técnica anterior, por exemplo comparável com aquelas de RWB218 como anteriormente descritas por Kuyper et al. (2005, FEMS Yeast Res. 5: 925-934). Entretanto, as células transformadas com a C. difficile XI mostraram o melhor desempenho na fermentação de xilose em termos de taxa de cultivo.

Similarmente as células transformadas da invenção são também capazes de utilização de substrato misturado. Quando as células transformadas são cultivadas em uma mistura de glicose e xilose (20 g 1" de cada uma) ambos os açúcares são completamente consumidos mas a glicose foio substrato preferido. O consumo de xilose começa apenas depois que aproximadamente 80 % da glicose é consumida. O etanol produzido foi responsável pelo consumo do total de glicose e xilose em cada caso das cepas transformadas com as xilose isomerases de Cillamyces aberensis, Ciona intestinalis, Clostridium difficile, Bacteroides fragilis e Fusobacterium —mortiferum.

Tabela 1 ; Genes Genes Nucleotídeo | Aminoácido 0547] oo ag pg Cyllamyces aberensis 0,569 9,989 a 2 US" | Clostridium dificite | 1338 | ong | og ço QT 0,104 | Ciona intestinais a a a 0,983 | 23 | 16 | Haemophilus somas 32 oa oa 1434 as o a ag | Arthrobacier aurescens — | arg oo oa a ss Burkholderia phytofirmans 1333 | cos | oo a “gs; Orpinomyces sp. UkKI BM |Fusobacterium mortiferum — |ÉW13191 | oro og ag USOS

Tabela 2 Organismo fonte XI Dona . meio sintético com Piromyces XI [Biromees E a A [Plyscomirellapatems — e o E [arabidopsis afiama o o [Flaemophifus somas e [hermatoga marítima — o A |Burkholderia plvtefímmans fe [Arihrobacter anrescems — fo

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Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Célula microbiana eucariótica, caracterizada pelo fato de que compreende as sequências de nucleotídeo a expressão das quais confere à, Í ou aumenta na, célula a capacidade para isomerizar diretamente a xilose em . 5 —xilulose, em que a sequência de nucleotídeo codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, polipeptídeo este que compreende uma sequência de aminoácido que compreende um ou elementos de sequência de aminoácido selecionados do grupo que consiste de: (a) um resíduo de metionina na posição 91; (b) a sequência de aminoácido TGIKLL nas posições 134-139; (c) um resíduo de fenilalanina na posição 230; (d) os aminoácidos fenilalanina e lisina nas posições 264 e 265, respectivamente; (e) a sequência de aminoácido TLAGH nas posições 274-278; (D a sequência de aminoácido RYASF nas posições 387-391; (g) um resíduo de glicina na posição 394; e (bh) um resíduo de alanina na posição 431; em que o polipeptídeo não compreende uma sequência de aminoácido tendo mais do que 95 % de identidade de sequência com uma das —SEQIDNOs:3-7.

2. Célula microbiana eucariótica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeo que codificam a xilose isomerase é selecionada do grupo que consiste de: (a) uma sequência de nucleotídeo que codifica um —polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, polipeptídeo este que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 45 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1; (b) uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, polipeptídeo este que compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 45 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2; (c) uma sequência de nucleotídeo que codifica um Í polipeptídeo com atividade de xilose isomerase, polipeptídeo este que e 5 — compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 45 % de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 35; . (d) uma sequência de nucleotídeo o filamento complementar da qual hibridiza a uma sequência de nucleotídeo de (a), (b) ou (c); e, (e) uma sequência de nucleotídeo a sequência da qual difere da — sequência de uma sequência de nucleotídeo de (d) devido à degenerescência do código genético.

3. Célula de acordo com reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeo codifica uma sequência de aminoácido que é obtenível de uma bactéria do gênero Clostridium e Fusobacterium ou de —umtunicado do gênero Conia.

4. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a célula é uma levedura ou um fungo filamentoso de um gênero selecionado do grupo que consiste de Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, Yarrowia, Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremonium, Fusarium, e Penicillium.

5. Célula de acordo com reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a célula é uma levedura e é capaz de fermentação alcoólica anaeróbica.

6. Célula de acordo com reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a levedura pertence a uma espécie selecionada do grupo que consiste de S. cerevisiae, S. exiguus, S. bayanus, K. lactis, K. marxianus e Schizosaccharomyces pombe.

7. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações precedente, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo com atividade de xilose isomerase é operavelmente ligado a um promotor que causa expressão suficiente das sequências de ' nucleotídeo na célula para conferir à célula a capacidade para isomerizar a « 5 xiloseemxilulose.

8. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, a célula caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma modificação genética que aumenta a atividade da xilulose cinase específica.

9. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, a célula caracterizada pelo fato de que compreende uma modificação genética que aumenta o fluxo do caminho do fosfato de pentose.

10. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira compreende uma modificação genética que reduz a atividade de aldose redutase não específicana célula.

11. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, a célula caracterizada pelo fato de que exibe a capacidade para converter L-arabinose em 5-fosfato de D-xilulose.

12. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações — precedentes, a célula caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma modificação genética adicional que resulta em uma característica selecionada do grupo que consiste de: (a) transporte aumentado de pelo menos uma de xilose e arabinose dentro da célula hospedeira; (b) sensibilidade diminuída à repressão de catabólito; (co) tolerância aumentada ao etanol, osmolaridade ou ácidos orgânicos; e, (d) produção reduzida de subprodutos.

13. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, a célula caracterizada pelo fato de que tem a capacidade para produzir pelo menos um produto de fermentação selecionado do grupo que consiste de etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ' ácido acético, ácido succeínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3-propano-diol, e 5 — etileno, glicerol, ácido butírico, caproato, butanol, glioxilato, antibióticos de B-lactama e cefalosporinas.

14. Processo para produzir um produto de fermentação selecionado do grupo que consiste de etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi- propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, ácido butírico, caproato, butanol, glioxilato, antibióticos de B-lactama e cefalosporinas, o processo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fermentar um meio contendo uma fonte de xilose, e opcionalmente uma fonte de arabinose, com uma célula como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, por meio do qual a célula fermenta xilose para o produto de fermentação, e opcionalmente, (a) recuperação do produto de fermentação.

15. Processo de acordo com reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o meio também contém uma fonte de glicose.