JP5391510B2 - β―グルコシダーゼ活性を有するタンパク質及びその利用 - Google Patents
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Description
配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼは、好熱性真正細菌であるサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)由来のβ−グルコシダーゼである。このβ−グルコシダーゼは、糖質関連酵素のアミノ酸配列を解析することにより区分されたタンパク質構造的分類であるglycosyl hydrolase family(GHF)によれば、β−グルコシダーゼの属する3ファミリーのうちGH1ファミリーに分類される。また、このβ−グルコシダーゼの理化学的性質としては、30℃での至適pHはpH6.2であり、至適温度は85℃である。
配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼは、好熱性真正細菌であるサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)由来のβ−グルコシダーゼである。このβ−グルコシダーゼは、glycosyl hydrolase family(GHF)によれば、β−グルコシダーゼの属する3ファミリーのうちGH3ファミリーに分類される。また、このβ−グルコシダーゼの理化学的性質としては、30℃での至適pHはpH5であり、至適温度は65〜85℃である。
本発明のタンパク質は、30℃、pH5.0以下のいずれかのpHにおいて、配列番号1又は2に記載のアミノ酸配列からなる既知のβ−グルコシダーゼの同条件下におけるβ−グルコシダーゼ活性よりも高いβ−グルコシダーゼ活性を有するものである。このタンパク質によれば、例えば、これを用いてセルロースから乳酸を生産する場合、生成する乳酸によって培養液中のpHが低下しても、セルロースの糖化を効率的に行うことができる。配列番号1又は2のβ−グルコシダーゼよりも高いβ−グルコシダーゼ活性となるpHとしては、pH5.0以下の範囲のうち、他の雑菌によるコンタミネーションも効果的に防止することができる点において好ましくはpH4.0以下のいずれかのpHである。また、セルロースから乳酸を生産する際において生成する乳酸を中和するための工程が不要になることからより好ましくは3.0以下のいずれかのpHである。また、配列番号1又は2のβ−グルコシダーゼに対する活性の比率は、2.0倍以上が好ましく、より好ましくは2.5倍以上であり、さらに好ましくは3.0倍以上である。
本発明の細胞を、セルロースを炭素源の少なくとも一部として含有する培地を用いて培養することにより、有機酸又はエタノールを生産することができる。このとき、本発明の細胞として有機酸生産に関連する1種又は2種以上の酵素をコードするポリヌクレオチドを発現可能に保持する細胞を用いれば有機酸を生産することができ、エタノール生産に関連する1種又は2種以上の酵素をコードするポリヌクレオチドを発現可能に保持する細胞を用いればエタノールを生産することができる。本発明の細胞の培養にあたっては、細胞の種類に応じて培養条件を選択することができる。有機酸の生産にあたっては、必要に応じて産物である有機酸等の中和を行うか、あるいは、連続的に有機酸又はエタノールを除去する等の処理を行うこともできる。細胞を培養する培地としては、本発明の細胞に対応したセルロースの他、窒素源、無機塩類等を含有し、本細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。
配列番号1で表されるThermotoga maritima 由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子bglA(GH1ファミリー、Genebank:X74163)をerror-prone PCR(10mM Tris-HCl pH9.0,50mM KCl,0.1% TritonX-100,2-6mM MaCl2,0.2-0.6mM MnCl2、0.2mM dATP,0.2mM dGTP,1mMdCTP,1mM dTTP,1-100ng/μl MnP,0.3μM primer,25 mU/μl Promega Taq DNA polymerase)により増幅し、100塩基当たり平均1個の変異(error率 1%)をランダムに導入したライブラリーを作製した。このerror-prone PCRによる増幅反応は95℃で3分間の熱処理を行った後、94℃で30秒と60℃で30秒と72℃でX分(X:増幅遺伝子の大きさが1kbにつき1分とした)との3つの温度変化を1サイクルとし、これを20サイクル繰り返し、最後に4℃とした。ライブラリーにpH3.0,4.0,6.5となるようにそれぞれ調製した酵素活性測定液80μl(2mM p-nitrophenyl β- D-glucopyranosideを含む100mM乳酸ナトリウムバッファー)を添加し、30℃で60分間incubateした後、分解されて生成するp-nitrophenolの発色の有無を405nmの吸光度を測定することにより確認し、30℃かつpH3.0,4.0,6.5でも高い活性を示すものをスクリーニングした。その結果、2つのクローン(それぞれLib1-33,Lib1-91と称する)を得た。
次に、得られた2種類のクローン遺伝子を等量ずつ混合したものを鋳型として、再度ランダム変異2次ライブラリーを作製した。スクリーニングの結果、pH4.0での活性が野生株(Wild)の至適pHでの活性よりも高いクローンが得られた。その代表的な5クローンをそれぞれLib2-3,Lib2-12,Lib2-26,Lib2-30,Lib2-93と称する。
第1スクリーニングにより得られたクローンLib1-33,Lib1-91及び第2スクリーニングの結果得られたクローンLib2-3,Lib2-12,Lib2-26,Lib2-30,Lib2-93について30℃でのpH依存性を調べた。その結果を図1に示す。図1に示すように、Lib1-91では、野生株(Wild)と比較して30℃かつpH3.0,4.0,6.5のそれぞれにおいてβ−グルコシダーゼ活性が約2倍に向上した。Lib1-33では、野生株(Wild)と比較して至適pHがpH5.5〜6からpH5へと酸性側にシフトしていた。また、第2スクリーニングにより得られたクローンLib2-3,Lib2-12,Lib2-26,Lib2-30,Lib2-93のうち、Lib2-12,Lib2-26,Lib2-30,Lib2-93では、至適pHが酸性側にシフトしていた。このうち、Lib2-12,Lib2-26,Lib2-93では、至適pHでの比活性も野生株(Wild)の2.5倍程度上昇していた。
これらの変異体のアミノ酸配列の決定を行った。その結果を図2及び配列番号:3〜9に示す。なお、第2スクリーニングでは、第1スクリーニングで得られた変異体(Lib1-33,Lib1-91)を親株として変異を導入しているため、図2中にどちらの変異体を由来としているのかを示した。すなわち、Lib1-33を親株とするものはLib2-12であり、Lib1-91を親株とするものはLib2-3,Lib2-26,Lib2-30,Lib2-93である。また、図2のうちアミノ酸の種類を表すアルファベットが記載されていないセルは、野生株(wild)と同じアミノ酸であることを表す。図1のpH依存性の確認で良好な結果が得られたLib2-12,Lib2-26,Lib2-93について見ると、まず、Lib1-33由来の変異体Lib2-12は、Lib1-91と同じ変異が導入されており、130番目のアミノ酸残基がロイシン(L)からグルタミン(Q)に変異されていることがわかった。また、Lib1-91由来の変異体Lib2-93では、Lib1-33と同じ位置に変異が導入されており(169番目のアミノ酸残基がバリン(V)からアスパラギン酸(D)に変異)、Lib2-26でも169番目のアミノ酸残基がバリン(V)からアラニン(A)に変異していることがわかった。これらのことから、共通して変異が導入されていた2カ所のアミノ酸(130番目と169番目)が耐酸性に寄与していると推測される。さらに、Lib2-93では382番目のアミノ酸残基がアラニン(A)からトレオニン(T)に変異し、Lib2-12では385番目のアミノ酸残基がアラニン(A)からトレオニン(T)に変異していることがわかった。また、他のクローン(Lib1-33,Lib1-91,Lib2-3,Lib2-26,Lib2-30)においてもこのいずれかの変異が見られた。このことから、382番目又は385番目のアミノ酸についても耐酸性に寄与していると推測される。
160番目のバリン(V)をアスパラギン酸(D)へ変換した変異体(以下、V169Dと称する)と、130番目のロイシン(L)をグルタミン(Q)へ変換した変異体(以下、L130Qと称する)とを作製し、30℃でのpH3.0,pH4.0,pH6.5における活性を測定した。その結果を図3に示す。V169Dでは、pH6.5よりもpH4.0での活性が向上しており、至適pHの酸性側へのシフトに直接関与していることが示された。また、L130Qでは、全体的に活性が野生株よりも向上しており、至適温度低下に寄与していると考えられた。
アミノ酸配列と立体構造との関係を考察するために、野生型酵素のPDB(10DO)データを参照とし、得られた改変酵素AのうちLib2-93についてInsightIIソフトによる変異体の立体構造モデリングを行った。また、活性中心近傍の電荷をDelphiソフトにより評価した。立体構造モデリングの結果から、169番目のアミノ酸はポケット内部に位置し、130番目のアミノ酸は分子表面に位置していることがわかった。このうち、169番目のアミノ酸は活性中心のアミノ酸(166番目のグルタミン酸(E)と351番目のグルタミン酸(E))の隣で、酸性のアスパラギン酸(D)に変異することで活性中心の表面電荷が酸性側にシフトしていると推測された。これにより、至適pHが低下した可能性が示唆される。130番目のアミノ酸については、分子表面に位置しており、また130番目のアミノ酸が変異しかつ169番目のアミノ酸が変異していない変異体(Lib1-91,Lib2-3)では比活性の向上は認められたが至適pHのシフトが認められないことから、表面のアミノ酸が疎水性から親水性へと変換されていたことにより、至適温度低下に影響した可能性があると示唆される。また、382番目及び385番目のアミノ酸についても分子表面に位置していたことから、130番目のアミノ酸と同様、至適温度低下に影響した可能性があると示唆される。
配列番号2で表されるThermotoga maritima 由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子bglB(GH3ファミリー、Genebank:AE001690)をerror-prone PCR(10mM Tris-HCl pH9.0,50mM KCl,0.1% TritonX-100,2-6mM MaCl2,0.2-0.6mM MnCl2、0.2mM dATP,0.2mM dGTP,1mMdCTP,1mM dTTP,1-100ng/μl MnP,0.3μM primer,25 mU/μl Promega Taq DNA polymerase)により増幅し、100塩基当たり平均2個の変異(error率 2%)をランダムに導入したライブラリーを作製した。このerror-prone PCRによる増幅反応は95℃で3分間の熱処理を行った後、94℃で30秒と60℃で30秒と72℃でX分(X:増幅遺伝子の大きさが1kbにつき1分とした)との3つの温度変化を1サイクルとし、これを20サイクル繰り返し、最後に4℃とした。ライブラリーにpH2.5,3.5,6.5となるようにそれぞれ調製した酵素活性測定液80μl(2mM p-nitrophenyl β-D-glucopyranosideを含む100mM乳酸ナトリウムバッファー)を添加し、30℃で60分間incubateした後、分解されて生成するp-nitrophenolの発色の有無を405nmの吸光度を測定することにより確認し、30℃かつpH2.5,3.5,6.5でも高い活性を示すものをスクリーニングした。その結果、野生株(Wild)と比較して酸性側での活性が向上した6クローン(Lib1-14,Lib1-16,Lib1-20,Lib1-24,Lib1-25,Lib1-32と称する)を得た。
スクリーニングにより得られたLib1-14,Lib1-16,Lib1-20,Lib1-24,Lib1-25,Lib1-32について30℃でのpH依存性を確認した。その結果を図4及び図5に示す。なお、図4は、各クローンにおけるpH2.5,3.5,6.5でのBGL活性を示すものであり、図5は、各クローンにおけるpH依存性を示すものである。得られたクローンのうち、Lib1-24では、野生株に比べてpH2.5での活性が3倍弱、pH3.5での活性が3.5倍程度向上していた。また、至適pHについては、野生株の至適pHがpH5.0であるのに対し、このLib1-24では至適pHがpH4.0へと酸性側にシフトしていた。また、Lib1-32では、pH2.5での活性はほとんど変わらないがpH5.0での活性が約2倍に向上し、Lib1-16では、pH5.0での活性が約5倍に向上した。
これらの変異体のアミノ酸配列の決定を行った。その結果を図6及び配列番号:10〜15に示す。なお、図6のうちアミノ酸の種類を表すアルファベットが記載されていないセルは、野生株(wild)と同じアミノ酸であることを表す。図4のpH依存性の確認で良好な結果が得られたLib1-16Lib1-24,Lib1-25について見ると、161番目のアミノ酸残基がシステイン(C)からセリン(S)に変異し、345番目のアミノ酸残基がロイシン(L)からヒスチジン(H)に変異し、420番目のアミノ酸残基がトリプトファン(W)がアルギニン(R)に変異し、492番目のアミノ酸残基がリシン(K)からグルタミン酸(E)に変異していることがわかった。なお、Lib1-14についても同様の変異が導入されているが、このLib1-14のみにおいて89番目のセリン(S)がプロリン(P)に変異しており、この変異がβ−グルコシダーゼ活性の低下につながったと推測される。
実施例1及び2で得られた変異体をコードするDNAをTDC3プロモーターで発現させるためにpB7-TDH3pベクターに導入し、これをL乳酸合成酵素を発現するよう形質転換された特願2002-362891号公報に記載の酵母T165株にインテグレーションすることによりβ―グルコシダーゼを細胞表層に発現する株(以下、TmBGLB変異体と称する)を作製した。形質転換体は、YPDクロラムフェニコール培地を用いて選抜した。また、形質転換体がβ−グルコシダーゼ活性を発現していることを以下の方法で確認した。YPD培地で一晩培養したあと滅菌水で洗浄した菌体をリン酸バッファー(50mM リン酸ナトリウム、pH5.0)に懸濁して菌体液とした。リン酸バッファー中に2mM p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside及び菌体液をOD600=0.5となるように懸濁し、30℃で10分間反応させた後1M Na2CO3を添加して反応を停止させた。15,000rpmで5分間遠心分離して菌体を取り除いた上澄の波長405nmの吸光度を測定した。その結果、TmBGLB変異体においても、実施例1及び2において野生株と比較してβ−グルコシダーゼ活性が向上したのと同等のpH依存性が見られることが確認された。
Claims (15)
- 30℃、pH4.0において、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるβ−グルコシダーゼの2.0倍以上の活性を有し、かつ
配列番号1に記載のアミノ酸配列において1又は2以上のアミノ酸による置換、欠失、付加及び挿入から選択されるいずれか又はこれらを組み合わせた変異を有する配列であって配列番号1に記載のアミノ酸配列と98%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
当該変異を有する配列は、少なくとも、前記置換であって、配列番号1に記載のアミノ酸配列における第169位に対応するバリンのアスパラギン酸又はグルタミン酸への置換を有する、タンパク質。 - 置換後の前記第169位に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸である、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記変異を有する配列は、前記置換であって、配列番号1に記載のアミノ酸配列における第130位及び/又は第382位若しくは第385位に対応するアミノ酸の極性アミノ酸への置換を有する、請求項1又は2に記載のタンパク質。
- 前記極性アミノ酸は中性アミノ酸から選択される、請求項3に記載のタンパク質。
- 置換後の前記第130位に対応するアミノ酸が、グルタミンである、請求項3又は4に記載のタンパク質。
- 置換後の前記第382位又は前記第385位に対応するアミノ酸が、トレオニンである、請求項3〜5のいずれかに記載のタンパク質。
- 配列番号3、6及び9のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項1〜6のいずれかに記載のタンパク質。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現可能に保持する細胞。
- 前記タンパク質を細胞表層提示型タンパク質又は分泌型タンパク質として発現可能である、請求項8に記載の細胞。
- 1種又は2種以上の有機酸生成酵素をコードするポリヌクレオチドを発現可能に保持する、請求項8又は9に記載の細胞。
- 前記有機酸は乳酸であり、前記酵素は乳酸脱水素酵素である、請求項10に記載の細胞。
- 1種あるいは2種以上のエタノール生成酵素をコードするポリヌクレオチドを発現可能に保持する、請求項8又は9に記載の細胞。
- 前記細胞は酵母である、請求項8〜12のいずれかに記載の細胞。
- 請求項10又は11に記載された細胞を用いて有機酸を生産する工程、を備える、有機酸の生産方法。
- 請求項12に記載された細胞を用いてエタノールを生産する工程、を備える、エタノールの生産方法。
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