TWI541353B - 產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）之胞外蛋白的方法 - Google Patents

產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）之胞外蛋白的方法 Download PDF

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Description

產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬( Tepidimonas )之 胞外蛋白的方法
本發明關於一種產生細菌胞外蛋白的方法，特別是關於一種產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas)之胞外蛋白的方法。
本發明之發明人於先前自臺灣花蓮縣安通溫泉之水樣，經菌株的純化、分離後，獲得一新穎的嗜熱菌，命名為微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)。此菌株Tepidimonas fonticaldi sp.nov.所分泌的胞外蛋白具有優良的金屬離子鍵結效能，且不受高溫、高壓、酸鹼度的環境條件影響，而可有效地防止鍋爐設備、地表管線、地熱生產井、工業廢水或硬水中的金屬鹽的結垢，特別是碳酸鈣的生成，以維持機器的運轉，並降低操作時間與成本。
嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas)之菌為革蘭氏陰性(gram-negative)、絕對好氧(strictly aerobic)、氧化酶(oxidase)與過氧化氫酶(catalase)陽性、桿狀、微嗜熱之細菌。
而，由於嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas)之菌的生長與自體代謝蛋白速率緩慢，導致胞外蛋白取得不 易，因此目前亟需新穎之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas)之胞外蛋白的方法。
本發明提供一種產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas)之胞外蛋白的方法，包括：將一嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌以一培養基進行一醱酵培養，以形成一醱酵液，其中於該培養基成分包括，包括：一碳源，為一有機酸，其係擇自於由乙酸、乳酸與丁酸所組成之群組；一氮源，其係擇自於由硫酸銨、硝酸銨、氯化銨與尿素所組成之群組；磷酸鹽；碳酸鹽；氯化鎂；一酵母萃取物；以及微量元素，又其中，該醱酵培養的通氣速率為約0-0.1 vvm；以及於該醱酵培養完成之後，收集該醱酵液，其中該醱酵液中含有該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌所分泌的胞外蛋白。
100‧‧‧醱酵槽
101‧‧‧通氣管
103‧‧‧培養基
105‧‧‧自醱酵槽100之頂部延伸至醱酵槽內部之一管路
107‧‧‧外部管路
109‧‧‧自醱酵槽100之頂部延伸至醱酵槽100內部之另一管路
111‧‧‧液體循環控制器
113‧‧‧與外部管路107連接之通氣管113
115‧‧‧自醱酵槽之頂部延伸進入醱酵槽內部上方的通氣管
第1A圖顯示，本發明一實施例的通氣方式，於其中，直接通氣於培養基底部；第1B圖顯示，本發明另一實施例的通氣方式，於其中，將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形成一液體循環，且在將培養基導回醱酵槽前，對培養基進行通氣；第1C圖顯示，本發明另一實施例的通氣方式，於其中，將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形成一液體循環，且通氣於醱酵槽頂部；第2圖顯示微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同培養溫 度的蛋白質產量與蛋白質生產速率；第3圖顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同空氣通氣速率的蛋白質產量與蛋白質生產速率；第4圖顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同通氣方式的蛋白質產量、蛋白質生產速率與每克乙酸之蛋白質產率；第5圖顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在將系統控制於不同最終pH值下的蛋白質產量與蛋白質生產速率；第6圖顯示，以將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形成一液體循環，且在將培養基導回醱酵槽前，對培養基進行通氣的通氣方式，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391，在不同之液體循環速度的蛋白質產量與蛋白質生產速率；以及第7圖顯示微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同植菌量下的蛋白質產量與蛋白質生產速率。
本發明提供一種產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas)之胞外蛋白的方法。藉由本發明之方法，可有效獲得嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌所分泌的胞外蛋白。
本發明之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，可包括下列步驟，但不限於此。
首先，將一嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌以一培養基進行一醱酵培養，以形成一醱酵液。在一實施例中，培養時間可為約48-270小時。
上述步驟中所培養之嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬的菌，可為任何嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬的菌。而上述嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬的菌的例子可包括，但不限於，微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi)、遲緩微嗜熱菌(Tepidimonas ignava)、水生微嗜熱菌(Tepidimonas aquatica)、臺灣溫單胞菌(Tepidimonas taiwanesis)等。
在一實施例中，上述步驟中所培養之嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬的菌，可為微嗜熱乙型變形桿菌。而，上述微嗜熱乙型變形桿菌可以是，在2011年11月21日公開寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心。(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)之微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)，其寄存編號為BCRC 80391，而此菌也在2011年11月28日公開寄存於比利時菌種保存中心(Laboratorium voor.Microbiologie Gent' Belgium；LMG)，其寄存編號為LMG26746，目前此菌為可公開自由分讓。
微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)BCRC 80391具有分泌具胞外蛋白的能力，又以本發明方法能夠使微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391有效分泌其胞外蛋白，並獲得此胞外蛋白。
而，上述本發明方法中用來培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌之培養基的成分可包括，但不限於，一碳源、一氮源、磷酸鹽、碳酸鹽、氯化鎂、一酵母萃取物與微量元素。
上述培養基之成分中的碳源可為一有機酸，而有機酸，可包括，乙酸(acetate)、乳酸(lactate)與丁酸(butyrate) 等，但不限於此。在一實施例中，上述培養基之成分中的碳源可為乙酸。
又，上述培養基之成分中之氮源的例子可包括，但不限於，硫酸銨((NH4)2SO4)、硝酸銨(NH4NO3)、氯化銨(NH4Cl)與尿素(urea)等。在一實施例中，上述培養基之成分中的氮源可為硫酸銨。
此外，於上述培養基之成分中，適合之磷酸鹽的例子可包括，但不限於，磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)等與上述之任意組合。在一實施例中，於上述培養基之成分中之磷酸鹽為磷酸二氫鉀。
於上述培養基之成分中，碳酸鹽的例子可包括碳酸氫鈉(NaHCO3)，但不限於此。
再者，於上述培養基之成分中，微量元素可包括，例如，鋅(Zn)、錳(Mn)、硼(B)、鈷(Co)、銅(Cu)、鎳(Ni)、鉬(Mo)等，但不限於此。在一實施例中，於上述培養基之成分中的微量元素可包括，鋅、錳、硼、鈷、銅、鎳與鉬。於此實施例中，各元素可分別為下述形態，但不限於此：鋅可為硫酸鋅(ZnSO4)之形態，錳可為氯化錳(MnCl2)之形態，硼可為硼酸(H3BO3)之形態，鈷可為氯化鈷(CoCl2)之形態，銅可為氯化銅(CuCl2)之形態，鎳可為氯化鎳(NiCl2)之形態，而鉬可為鉬酸鈉(Na2MoO4)之形態。
在一實施例中，上述於本發明產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法所使用的培養基中，碳源的含 量可為約0.1g/L-15.0g/L，氮源的含量可為0.1g/L-15.0g/L，磷酸鹽的含量可為約0.1g/L-30g/L，碳酸鹽的含量可為約0.1g/L-20g/L，氯化鎂的含量可為約0.01g/L-10g/L，酵母萃取物的含量可為約0.1g/L-20g/L，而微量元素的含量可為約0.01g/L-1g/L，但不限於此。
於上述本發明產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法所使用的培養基中，碳源與氮源之碳氮重量比可為約1-60，例如約11。
而關於前述將一嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌以一培養基進行一醱酵培養之步驟中所述的醱酵培養的各種條件，則說明如下。
在一實施例中，醱酵培養可於一醱酵槽中進行，但不限於此。在一特定實施例中，醱酵培養所使用之醱酵槽為5L醱酵槽。在另一特定實施例中，醱酵培養所使用之醱酵槽為100L醱酵槽。在又另一特定實施例中，醱酵培養所使用之醱酵槽為噸級醱酵槽。
上述醱酵培養的攪拌速率，可為約50-500rpm，例如200rpm，但不限於此。
又，上述醱酵培養之溫度可為約40-80℃，但不限於此。在一實施例中，上述醱酵培養之溫度可為約50℃。
此外，於上述醱酵培養中可對培養基進行一通氣程序，或者也可不需進行通氣而進行醱酵培養。於上述醱酵培養中的通氣速率可為約0-0.1 vvm，但不限於此。而，當上述通氣速率為0時，即代表在無通氣狀態進行醱酵培養。又，上 述通氣程序中所使用的氣體，可包括，但不限於空氣。
在一實施例中，醱酵培養可於一醱酵槽中進行。於此實施例中，上述通氣方式可包括分別如第1A圖、第1B圖與第1C圖中所示之三種通氣方式，但不限於此。
第一種通氣方式為，直接通氣於培養基底部。第1A圖顯示第一種通氣方式。第1A圖顯示，藉由自醱酵槽100之頂部延伸至中醱酵槽100內部下端之一通氣管101，將氣體通入培養基103底部。
第二種通氣方式為，將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形成一液體循環，且在將培養基導回醱酵槽前，對培養基進行通氣。第1B圖顯示第二種通氣方式。第1B圖顯示，醱酵槽100之頂部延伸至醱酵槽內部之一管路105與一外部管路107的一端連接，且外部管路107之另一端與自醱酵槽之頂部延伸至醱酵槽100內部之另一管路109連接，且外部管路107藉由一液體循環控制器111控制，以使醱酵槽中之培養基103可自持續自醱酵槽100引出，並再導回醱酵槽100中以形成一液體循環。又外部管路107具有一額外之通氣管113與其連接，以便在將培養基103導回醱酵槽100前，對培養基100進行通氣。
第三種通氣方式為，自培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形成一液體循環，且通氣於醱酵槽頂部。第1C圖顯示第三種通氣方式。第1C圖顯示，醱酵槽100之頂部延伸至醱酵槽內部之一管路105與一外部管路107的一端連接，且外部管路105之另一端與自醱酵槽之頂部延伸至醱酵 槽100內部之另一管路109連接，且外部管路107藉由一液體循環控制器111控制，以使醱酵槽100中之培養基103可自持續自醱酵槽100引出，並再導回醱酵槽100中以形成一液體循環。又一通氣管115自醱酵槽之頂部延伸進入醱酵槽內部上方，以藉此將氣體導入醱酵槽100內部上方，達成通氣於醱酵槽頂部。
在一實施例中，通氣方式為，直接通氣於培養基底部。於此實施例中，通氣程序中所使用的氣體可為空氣。
又在通氣方式為直接通氣於培養基底部的情況下，在通氣程序中所使用的氣體為空氣的一特定實施例中，通氣速率可為約0.001-0.1 vvm，例如0.025 vvm。
在一實施例中，通氣方式為，將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形成一液體循環，且在將培養基導回醱酵槽前，對培養基進行通氣。於此實施例中，通氣程序中所使用的氣體可為空氣，且通氣速率可為約0.001-0.1 vvm，例如0.025 vvm，而培養基的液體循環的速率可為約0.1-12L/小時，例如3L/小時。
此外，於本發明產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法中，所使用的培養基的起始pH值，可為約pH 5-pH 9，但不限於此。在一實施例中，上述於本發明產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法中，所使用的培養基的起始pH值為約pH 7。
另外，於本發明產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法中，醱酵培養的最終pH值，可為約pH 4-pH 10，但不限於此。在一實施例中，於本發明產生嗜熱性鹼性蛋 白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法中，醱酵培養的最終pH值為pH 8。
又，於本發明產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法中，嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌植入培養基的量為約培養基之0.1-40 v%，例如5 v%，但不限於此。
在一實施例中，上述本發明方法中用來培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌之培養基的成分包括一碳源、一氮源、磷酸鹽、氯化鎂、一酵母萃取物與微量元素，而所述碳源為乙酸，又所述氮源為硫酸銨，且所述碳酸鹽為碳酸氫鈉，其中乙酸的含量為約0.1g/L-15.0g/L，硫酸銨的含量為約0.1g/L-15.0g/L，磷酸鹽的含量為約0.1g/L-30g/L，碳酸氫鈉的含量為約0.1g/L-20g/L，氯化鎂的含量為約0.01g/L-10g/L，酵母萃取物的含量為約0.2g/L-5g/L，而微量元素的含量為約0.01g/L-1g/L。
於前方所述之實施例中，於本發明產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法中的醱酵培養係於一醱酵槽中進行，且其中嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌植入培養基的量為約培養基之0.1-40 v%、培養基的起始pH值為約pH 5-pH 9、醱酵培養的最終pH值為約pH 4-pH 10、醱酵培養的攪拌速率為約50-500rpm、醱酵培養之溫度為約40-80℃，又其中醱酵培養的通氣方式為將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形一成液體循環，且在培養基導回醱酵槽前，對培養基進行通氣，液體循環的速率為約0.1-12L/小時、醱酵培養之通氣氣體為空氣，醱酵培養的通氣速率為約0.001-0.1 vvm。
然後，於本發明方法中，在於上述醱酵培養完成之後，收集醱酵液，而醱酵液中含有嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌所分泌的胞外蛋白。
藉由本發明之方法，可使嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌有效分泌的胞外蛋白
實施例 實施例1
溫度對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白的影響
在不同溫度下，藉由5L醱酵槽，分別培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391，以確定菌株微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的適合培養溫度。測試培養溫度分別為45℃、50℃與55℃。
用以培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的培養基之成分如表1中所示。乙酸濃度為3.11g/L，硫酸銨濃度為0.53g/L，碳氮比為11。培養系統中的初始菌體濃度(OD600)為0.03，初始酸鹼度控制為pH 7.0，轉速控制為200rpm，總反應體積為4L，且培養時間為80小時。
結果如第2圖所示。第2圖顯示微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同培養溫度的蛋白質產量與蛋白質生產速率。
根據第2圖可以得知，相較於45℃與55℃之培養溫度，當培養溫度為50℃時，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的蛋白生產濃度與蛋白生產速率較高，分別為8.59mg/L與5.67mg/L/天。
故，由此可知，對於微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白質而言，50℃為較佳培養溫度。
實施例2
通氣速率對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白的影響
微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391為一株高溫微喜氧菌。於本實施例中，藉由5L醱酵槽，在不同之空氣通氣速率下分別培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391，以確定適合 培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的通氣速率。測試之空氣通氣速率分別為0 vvm、0.0125 vvm與0.025 vvm。通氣方式為直接通氣於培養基底部，如第1A圖中所示。
用以培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的培養基之成分如表1中所示。乙酸濃度為3.11g/L，硫酸銨濃度為0.53g/L，碳氮比為11。培養系統中的初始菌體濃度(OD600)為0.03，培養溫度為50℃，初始酸鹼度控制為pH 7.0，轉速控制為200rpm，總反應體積為4L，且培養時間為80小時。
結果如第3圖所示。第3圖顯示微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同空氣通氣速率的蛋白質產量與蛋白質生產速率。
根據第3圖可以得知，相較於0 vvm、0.0125 vvm之空氣通氣速率，當空氣通氣速率為0.025 vvm時，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的蛋白生產濃度與蛋白生產速率較高，分別為21.77mg/L與10.90mg/L/天。
故，由此可知，對於微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白質而言，0.025 vvm為較佳空氣通氣速率。
因此，於後續之實驗中，將空氣通氣速率控制在0.025 vvm，以進行通氣方式、最終酸鹼度控制以及液體循環速率的探討，藉以提升蛋白濃度與蛋白生產速率。
實施例3
通氣方式對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白的影響
由實施例2發現，藉由直接通氣於培養基底部的通 氣方式，會使培養系統中的氣提現象會隨著通氣速率的提升而愈發明顯。又，氣提現象會導致培養液中的菌體濃度與蛋白濃度下降。
因此，於本實施例中，藉由5L醱酵槽，在不同的通氣方式下分別培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391，以確定適合培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的通氣方式。測試之通氣方式，分別為，(a)直接通氣於培養基底部(參見第1A圖)，或(b)將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形成一液體循環，且在將培養基導回醱酵槽前，對培養基進行通氣(參見第1B圖)，以及(c)將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形成一液體循環，且通氣於醱酵槽頂部(參見第1C圖)。
用以培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的培養基之成分如表1中所示。乙酸濃度為3.11g/L，硫酸銨濃度為0.53g/L，碳氮比為11。培養系統中的初始菌體濃度(OD600)為0.03，培養溫度為50℃，空氣通氣速率為0.025 vvm，液體循環速率1.5L/小時(通氣方式(b)與(c))，初始酸鹼度控制為pH 7.0，轉速控制為200rpm，總反應體積為4L，且培養時間為130小時。
結果如第4圖所示。第4圖顯示微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同通氣方式的蛋白質產量、蛋白質生產速率與每克乙酸之蛋白質產率。
在蛋白生產速率方面，當在系統以通氣方式(a)(直接通氣於培養基底部)來培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391時，蛋白生產速率約可達11.45mg/L/天，為三種通氣方式中的 最大值。但，以通氣方式(a)培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391所產生之蛋白濃度卻因氣提現象的產生而未能提升，進而導致每克乙酸的蛋白產率降低。
當系統以通氣方式(b)(將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形成一液體循環，且在將培養基導回醱酵槽前，對培養基進行通氣)來培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391時，相較於通氣方式(a)與(c)，可獲得較高的蛋白生產濃度及每克乙酸的蛋白產率。但，以通氣方式(b)培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391之蛋白生產速率則略低於以通氣方式(a)培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391，推測影響因素為液體的液體循環速率。
而當系統以通氣方式(c)(將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形成一液體循環，且通氣於醱酵槽頂部)來培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391時，蛋白生產濃度與蛋白生產速率皆低於以通氣方式(a)或以通氣方式(b)培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391。
根據蛋白生產濃度及每克乙酸的蛋白產率測定結果，於後續之實驗中通氣方式(b)(將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形成一液體循環，且在將培養基導回醱酵槽前，對培養基進行通氣)，以最終酸鹼度控制以及液體循環速率的探討，藉以提升蛋白濃度與蛋白生產速率。
實施例4
最終酸鹼度對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分 泌蛋白的影響
系統中的酸鹼值會直接影響菌體生長，進而影響蛋白濃度生產。由前方實驗過程發現，培養後期之pH值大多高於pH 8.5。
為了避免系統中的酸鹼度影響蛋白生產濃度與蛋白生產速率，於本實施例中，藉由5L醱酵槽，並在將系統控制於不同最終pH值下分別培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391，以確定適合培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的最終pH值。測試之最終pH值分別為pH 7、pH 8與pH 8.5，由蛋白生產濃度及蛋白生產速率決定最終酸鹼度的數值。
用以培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的培養基之成分如表1中所示。乙酸濃度為3.11g/L，硫酸銨濃度為0.53g/L，碳氮比為11。培養系統中的初始菌體濃度(OD600)為0.03，培養溫度為50℃，空氣通氣速率為0.025 vvm，通氣方式為將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形成一液體循環，且在將培養基導回醱酵槽前，對培養基進行通氣，液體循環速率1.5L/小時，初始酸鹼度控制為pH 7.0，轉速控制為200rpm，總反應體積為4L，且培養時間為250小時。
結果如第5圖所示。第5圖顯示微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在將系統控制於不同最終pH值下的蛋白質產量與蛋白質生產速率。
根據第5圖可以得知，培養系統只要進行酸鹼度的控制，菌體及蛋白生產濃度皆可提升。因此，最終酸鹼度控制為直接影響蛋白生產的必要因子。而當系統中最終酸鹼度控制 為pH 8.0時，蛋白生產濃度與蛋白生產速率分別可高達約36.84mg/L與18.17mg/L/天，較控制在pH 7.5及pH 8.5時為佳。
因此，於後續之實驗中，將系統中最終酸鹼度控制為pH 8.0，以進行液體循環速率的探討，藉以提升蛋白濃度與蛋白生產速率。
實施例5
液體循環速率對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白的影響
本實施例中，藉由5L醱酵槽，以將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形成一液體循環，且在將培養基導回醱酵槽前，對培養基進行通氣的通氣方式，在不同之液體循環速度下，分別培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391，以確定適合培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的液體循環速度。測試之液體循環速分別1.5L/小時、3.0L/小時與6.0L/小時。
用以培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的培養基之成分如表1中所示。乙酸濃度為3.11g/L，硫酸銨濃度為0.53g/L，碳氮比為11。培養系統中的初始菌體濃度(OD600)為0.03，培養溫度為50℃，空氣通氣速率為0.025 vvm，初始酸鹼度控制為pH 7.0，最終pH值控制為pH 8.0，轉速控制為200rpm，總反應體積為4L，且培養時間為240小時。
結果顯示於第6圖。第6圖顯示，以將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵槽中以形成一液體循環，且在將培養基導回醱酵槽前，對培養基進行通氣的通氣方式，微嗜熱 乙型變形桿菌BCRC 80391，在不同之液體循環速度的蛋白質產量與蛋白質生產速率。
根據第6圖可以得知，除了6.0L/小時的液體循環流速未能有效提升蛋白生產濃度與蛋白生產速率之外，1.5L/小時與3.0L/小時的液體循環流速，皆可有效提升蛋白生產濃度與蛋白生產速率。又，相較於1.5L/小時的液體循環流速，當系統的液體循環流速控制為3.0L/小時時，蛋白生產濃度與蛋白生產速率皆為較高，分別可高達36.43mg/L與25.14mg/L/天。
因此，可將5L醱酵槽所採用之3.0L/小時液體循環流速，做為未來運轉100L醱酵槽之液體循環流速的主要條件依據。
實施例6
不同植菌量對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白的影響
於本實施例中，藉由100L醱酵槽，在不同植菌量下分別培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391，以評估植菌量對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白的影響。測試之不同植菌量分別為2.5 v%、5.0 v%與10.0 v%(植入之菌體濃度OD600=1.5)。
用以培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的培養基之成分如表1中所示。乙酸濃度為3.11g/L，硫酸銨濃度為0.53g/L，碳氮比為11。培養溫度為50℃，空氣通氣速率為0.025 vvm，通氣方式為將培養基持續自醱酵槽引出，並再導回醱酵 槽中以形成一液體循環，且在將培養基導回醱酵槽前，對培養基進行通氣，液體循環速率3.0L/小時，初始酸鹼度控制為pH 7.0，最終pH值控制為pH 8.0，轉速控制為200rpm，總反應體積為80L，且培養時間為225小時。
結果如第7圖所示。第7圖顯示微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同植菌量下的蛋白質產量與蛋白質生產速率。
根據第6圖可以得知，當植菌量為5 v%時，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 803914之最大平均蛋白生產速率為最大，且所生產的蛋白產率皆維持一定值。
因此，當以100L醱酵槽來進行量產微生物蛋白時，植菌量可以採用5.0 v%。

Claims (35)

  1. 一種產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas)之胞外蛋白的方法，包括：將一嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌以一培養基進行一醱酵培養，以形成一醱酵液，其中該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌為微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi)，其中於該培養基成分，包括：一碳源，為一有機酸，其係擇自於由乙酸、乳酸與丁酸所組成之群組；一氮源，其係擇自於由硫酸銨、硝酸銨、氯化銨與尿素所組成之群組；磷酸鹽；碳酸鹽；氯化鎂；一酵母萃取物；以及微量元素，又其中，該醱酵培養的通氣速率為0.001-0.1vvm；以及於該醱酵培養完成之後，收集該醱酵液，其中該醱酵液中含有該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌所分泌的胞外蛋白。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該微嗜熱乙型變形桿菌為微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)BCRC 80391。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該碳源的含量為0.1g/L-15.0g/L，該氮源的含量為0.1g/L-15.0g/L，該磷酸鹽的含量為0.1g/L-30g/L，該碳酸鹽類的含量為0.1g/L-20g/L，該氯化鎂的含量為0.01g/L-10g/L，該酵母萃取物的含量為0.1g/L-20g/L，而該微量元素的含量為0.01g/L-1g/L。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，該碳源與該氮源之碳氮重量比為1-20。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該碳源為乙酸。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該氮源為硫酸銨。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該磷酸鹽包括磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)或上述之任意組合。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該磷酸鹽為磷酸二氫鉀。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該碳酸鹽為碳酸氫鈉(NaHCO3)。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該微量元素包括鋅、錳、硼、鈷、銅、鎳與鉬。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養係於一醱酵槽中進行。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養的攪拌速率為50-500rpm。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養的攪拌速率為200rpm。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養之溫度為40-80℃。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養之溫度為50℃。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養之通氣氣體包括空氣。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養係於一醱酵槽中進行，且該醱酵培養的通氣方式包括，直接通氣於該培養基底部，或將該培養基持續自該醱酵槽引出，並再導回該醱酵槽中 以形成一液體循環，且在將該培養基導回該醱酵槽前，對該培養基進行通氣，或者將該培養基持續自該醱酵槽引出，並再導回該醱酵槽中以形成一液體循環，且通氣於該醱酵槽頂部。
  18. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養係於一醱酵槽中進行，且該醱酵培養的通氣方式為直接通氣於該培養基底部。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養之通氣氣體為空氣。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養通氣速率為0.025vvm。
  21. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養係於一醱酵槽中進行，且該醱酵培養的通氣方式為將該培養基持續自該醱酵槽引出，並再導回該醱酵槽中以形成一液體循環，且在將該培養基導回該醱酵槽前，對該培養基進行通氣。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養之通氣氣體為空氣。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該液體循環的速率為0.1-12L/小時。
  24. 如申請專利範圍第22項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白 酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該液體循環的速率為3L/小時。
  25. 如申請專利範圍第22項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養通氣速率為0.025vvm。
  26. 如申請專利範圍第22項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該液體循環的速率為3L/小時，而該醱酵培養的通氣速率為0.025vvm。
  27. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該培養基的起始pH值為pH 5-pH 9。
  28. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該培養基的起始pH值為pH 7。
  29. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養的最終pH值為pH 4-pH 10。
  30. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養的最終pH值為pH 8。
  31. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌植入該培養基的量為該培養基之0.1-40v%。
  32. 如申請專利範圍第1項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶 生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌植入該培養基的量為該培養基之5v%。
  33. 如申請專利範圍第3項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該碳源為乙酸，該氮源為硫酸銨，而該碳酸鹽為碳酸氫鈉。
  34. 如申請專利範圍第33項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該乙酸的含量為0.1g/L-15.0g/L，該硫酸銨的含量為0.1g/L-15.0g/L，該磷酸鹽的含量為0.1g/L-30g/L，該碳酸氫鈉的含量為0.1g/L-20g/L，該氯化鎂的含量為0.01g/L-10g/L，該酵母萃取物的含量為0.1g/L-20g/L，而該微量元素的含量為0.01g/L-1g/L。
  35. 如申請專利範圍第34項所述之產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之胞外蛋白的方法，其中該醱酵培養係於一醱酵槽中進行，且其中該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌植入該培養基的量為該培養基之0.1-40v%、該培養基的起始pH值為pH 5-pH 9、該醱酵培養的最終pH值為pH 4-pH 10、該醱酵培養的攪拌速率為50-500rpm、該醱酵培養之溫度為40-80℃，又其中該醱酵培養的通氣方式為將該培養基持續自該醱酵槽引出，並再導回該醱酵槽中以形一成液體循環，且在該培養基導回該醱酵槽前，對該培養基進行通氣，該液體循環的速率為0.1-12L/小時、該醱酵培養之通氣氣體為空氣。
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