TWI510618B - 抑制鹽類生成的方法及高溫廢水的處理方法 - Google Patents
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Description
本發明關於新穎的嗜熱菌及其胞外蛋白的應用。
地熱能為一極具發展潛力且蘊藏量豐富的潔淨能源。由於地熱流體化學組成成分特殊,熱液生產過程因溫度及壓力的改變,容易在生產井的井壁以及生產井附近的儲集層裂隙中產生結垢(scaling)沉積,對於熱液的穩定生產是一項重大障礙。
酸處理(acid treatment)及化學抑制(chemical inhibition)為近年來國際間常用之地熱井防垢技術。但是,無論是使用酸處理或化學藥劑擠注技術,雖可處理/抑制結垢問題,但施作工程後產生的廢液對生態環境有相當大之衝擊性。隨著環保意識抬頭,減少污染、改善生態環境之高效能綠色技術開發逐漸受到專家學者的重視。
本發明有鑑於上述之議題,開發對環境友善的生物結垢抑制技術。
本發明一實施型態,提供一種單離的新穎嗜熱菌,為微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi
sp.nov.),寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC),寄存編號為BCRC80391。
本發明另一實施型態提供一種蛋白質,為上述新穎嗜熱菌分泌於菌體外之蛋白質。
本發明另一實施型態提供一種抑制鹽類生成的方法,包括使上述單離的嗜熱菌的胞外蛋白與含有金屬離子之溶液接觸,生成金屬離子與蛋白的複合物。
本發明再一實施型態提供一種高溫廢水的處理方法,包括使上述單離的嗜熱菌的胞外蛋白與含金屬離子之廢水接觸,生成金屬離子與蛋白的複合物。
本發明之具體實施詳細說明如下,然而以下的實施例僅用於進一步揭露本發明之技術內容,不應藉以限制本案的發明範疇。
本發明之一實施型態,提供一新穎的嗜熱菌,採集自台灣花蓮縣安通溫泉,經純化、分離後所獲得。本案所分離的嗜熱菌經分析其16S核醣體DNA(16S rDNA)序列,顯示如序列識別號1所示之序列。根據該16S rDNA的序列,顯示與習知的嗜熱溫單胞菌(Tepidimonas thermarum
AA-1T
)(序列相似度97.5%)、水生溫單胞菌(Tepidimonas aquatica
CLN-1T
)(序列相似度96.8%)、竹溫單胞菌(Tepidimonas ignava
SPS-1037T
)(序列相似度96.4%)及台灣溫單胞菌(Tepidimonas taiwanensis
I1-1T
)(序列相似度95.8%)的16S rDNA序列相近。根據16S rDNA的序列相似度所繪的親緣關係圖如第1圖所示。
在一方面,使該嗜熱菌與嗜熱溫單胞菌(Tepidimonas thermarum
AA-1T
)進行雜交,獲得23.9±0.2%的DNA-DNA關係值(relatedness),確定該嗜熱菌為溫單胞菌屬(Tepidimonas
sp.)。
在生理特徵上,該嗜熱菌顯示為革蘭氏陰性好氧菌株,具單極鞭毛,有運動性,菌落呈現透明。該嗜熱菌較佳的生長溫度為35~60℃,更佳為55℃,較佳的生長鹽度為0~1.0重量%的氯化鈉,更佳為0.2重量%的氯化鈉,較佳的pH生長條件為pH 7.0~9.0,更佳為pH 7.0。該嗜熱菌的主要脂肪酸構成包括C16:0
(40.2%)、組合脂肪酸(summed feature 3;包括C16:1
ω7c及/或C16:1
ω6c)(20.1%)及C17:0
cyclo(11.5%),主要的極性脂肪為磷脂乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)及磷脂甘油(phosphatidylglycerol,PG),且細胞中的總DNA的G+C含量為70.1mol%。
基於上述的核苷酸資訊以及生理特徵,確認其為新穎菌種,並命名為微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi
sp.nov.),寄存於韓國菌種保存中心(Korean Collection of Type Culture;KCTC),寄存編號為KCTC 23862,寄存日期為2012年1月10日;以及寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center;BCRC),寄存編號為BCRC 80391,寄存日期為2011年11月21日;以及寄存於比利時菌種保存中心(Laboratorium voor.Microbiologie Gent' Belgium;LMG),寄存編號為LMG
26746,寄存日期為2011年11月28日。
該微嗜熱乙型溫單胞菌分泌的胞外蛋白在適當的環境條件下具有優良的金屬離子的鍵結效能,特別是二價或三價的金屬離子。此述的二價或三價的金屬離子,具體例如鈰(Ce)、鏑(Dy)、鉺(Er)、銪(Eu)、釓(Gd)、鈥(Ho)、鑭(La)、鎦(Lu)、釹(Nd)、鐠(Pr)、鈧(Sc)、釤(Sm)、鋱(Tb)、釷(Th)、銩(Tm)、鈾(U)、鐿(Yb)、釔(Y)、銀(Ag)、鋁(Al)、硼(B)、鋇(Ba)、鉍(Bi)、鈣(Ca)、鎘(Cd)、鈷(Co)、鉻(Cr)、銅(Cu)、鐵(Fe)、鎵(Ga)、銦(In)、鉀(K)、鋰(Li)、鎂(Mg)、錳(Mn)、鈉(Na)、鎳(Ni)、鉛(Pb)、鍶(Sr)、鉈(Tl)、或鋅(Zn),但不限於此。
再者,本案所述之微嗜熱乙型溫單胞菌所分泌的胞外蛋白具有優良的金屬離子鍵結效能,不受高溫、高壓、酸鹼度的環境條件影響。具體地說,在一實施例中,本案之微嗜熱乙型溫單胞菌分泌的胞外蛋白在一大氣壓、pH 7的條件下,在75~150℃的高溫環境,特別是在125~150℃的高溫環境下,與金屬離子的鍵結效能仍然優良。在一實施例中,在25℃、pH 7的條件下,本案之微嗜熱乙型溫單胞菌分泌的胞外蛋白在1~50atm的壓力下,特別在10~30atm的壓力下,與金屬離子的鍵結效能仍然優良。在另一實施例中,在25℃、一大氣壓的條件下,本發明之微嗜熱乙型溫單胞菌分泌的胞外蛋白在pH 2~10的酸鹼條件、特別是pH 7~10的酸鹼條件下,與金屬離子的鍵結效能仍然優良。
由於此胞外蛋白對金屬離子的優良鍵結效能,可與溶
液中的酸性離子競爭,而抑制酸性離子與金屬離子鍵結所形成的金屬鹽。特別是在高溫的地熱水、鍋爐內溶液、工業廢水或硬水中,酸性離子與金屬離子的結合形成的金屬鹽,例如碳酸鈣,會形成結垢(scaling)而造成機器、管線等的阻塞、運轉困難,甚至損壞等的問題。因此,本案之胞外蛋白的金屬離子鍵結效能,可有效地防止鍋爐設備、地表管線、地熱生產井、工業廢水或硬水中的金屬鹽的結垢,特別是碳酸鈣的生成,以維持機器的運轉,並降低操作時間與成本。再者,藉由本案之胞外蛋白的優良鍵結效能,可避免使用酸或化學藥劑處理金屬鹽結垢所造成的環境污染問題,為具有環保優勢的綠色工程技術。
因此,本發明再一實施型態,提供一種高溫廢水的處理方法,包括使上述微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi
sp.nov.)的胞外蛋白與含有二價或三價的金屬離子之廢水接觸,生成金屬離子與蛋白的複合物。藉由該胞外蛋白的優良鍵結效能,與廢水中的酸性離子競爭,而降低及防止金屬離子與酸性離子形成鹽類而結垢於機器、管線等設備中造成操作困難,甚至機器、管線破損的問題。並且,縮短操作時間及降低成本,並具有環保優勢。
於台灣花蓮安通溫泉區,以鋁箔包覆遮光的採樣瓶,
採集每個採樣點之採樣體積為10 L的水樣,並在盡可能接近無菌操作狀態下以0.45 μm的濾紙過濾水樣。過濾完成後,將濾膜貼在1.5%固態培養基上(300 mL地熱水樣+4.5 g洋菜粉,在121℃下滅菌15分鐘後,倒於培養皿中待涼),於55℃下培養7~14天。培養期程結束後,以無菌接種環挑出具有特殊顏色或形態之單離菌落,三區劃線於新的培養基上,重複數次,直至得到純菌株。純化之菌株於4℃下保存。
以接種環刮取適量的新鮮菌落加於1 mL的無菌水中,並以無菌水清洗3次後利用萃取套組(Blood & Tissue genomic DNA extraction minoprep system)抽取菌株的基因體DNA(genomic DNA),儲存於-20℃冰箱。
將抽取菌株的基因體DNA以原核生物通用的引子對FD1(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)及RD1(5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’),以及下列表1、表2所示之聚合酶鏈鎖反應(PCR)試劑及條件,增幅該菌株的16S rDNA片段,之後委託明欣生物科技有限公司進行定序。
將上述定序之16S
rDNA於美國衛生暨醫療研究院(National Institues of Health,NIH)所設立的基因庫網站(National Center for Biotechnology Information,NCBI;http://www.ncbi.nlm.nih.gov),應用網站中的BLAST軟體將定序出的16S
rDNA序列與GenBank資料庫中已發表序列進行比對,分析其序列相似度,並完成微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi
sp.nov.)株AT-A2T
於NCBI序列資料庫(www.ncbi.nlm.nih.gov.)的註冊,序號為JN713899。
根據上述的序列相似度,將與實驗菌株相似度較高之
已知模式菌株的16S rDNA基因序列及編號(accession number),利用BioEdit軟體與CLUSTAL_X建構親緣關係樹,並計算各菌株間之同源性關係,並繪製出樹狀圖如第1圖,由此確認所採集之菌株為新穎、親緣關係接近已知的嗜熱溫單胞菌(Tepidimonas thermarum
AA-1T
)。
為驗證新穎的微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi
sp.nov.)及模式菌株(水生棲熱菌(Thermus aquaticus BCRC 17110))與其他嗜熱菌株所分泌的蛋白(含胞內及胞外)與鈣離子鍵結的能力,分別以接種環刮取瓊脂平板培養基上的純菌落加入100 mL的1/5 TSB液態培養基(配方:經胰蛋白酶分解的酪蛋白1.7g/L、經酵素分解的大豆粉0.3g/L、右旋糖0.25g/L、氯化鈉0.5g/L及亞磷酸甲0.25g/L)中,在200 rpm、55℃狀態下增殖培養3~5天。
增殖培養完成後,將培養得到的菌液以10,000 rpm離心10分鐘,含胞外蛋白的上清液再以氣壓式蛋白質濃縮儀濃縮,濃縮倍數為10倍,作為後續試驗的胞外蛋白樣品。離心後的菌體顆粒利用超音波破碎器將細胞打破,使胞內蛋白流出,作為後續實驗用之胞內蛋白樣品。
取100 μL試驗用蛋白質溶液,加入400 μL Bio-Rad蛋白質測定液,經15分鐘呈色反應後,以分光光度計在595
nm的可見光源下量測吸光度,將吸光度代入檢量線求出蛋白質濃度,以評估微生物分泌之蛋白質含量。
為了探討胞內和胞外蛋白與金屬離子的鍵結效能,將上述獲得之各嗜熱菌的胞內與胞外蛋白進行鈣離子鍵結效能試驗。
將上述的胞內/胞外蛋白溶液50ppm與以CaCl2
‧2H2
O配製成100ppm的鈣離子儲備溶液1:1均勻混合,混合液於100℃溫度下隔水加熱1小時。隔水加熱結束後,混合液以薄膜孔徑大小為3KDa的超過濾系統(ultrafiltration system)過濾,使蛋白被截流在薄膜上,而未與蛋白鍵結的鈣離子濾出液則以去離子水稀釋至儀器檢測範圍內(0~5ppm)後,以感應耦合電漿原子發射光譜儀(ICP)量測分析,最後由濾液中的殘留Ca2+
濃度推算蛋白對鈣離子之鍵結效能。結果如下表3與第2圖所示。
由上表3與第2圖所示,胞外蛋白的鈣離子鍵結效能遠比胞內蛋白來的顯著,同時,菌株AT-A2的鈣離子鍵結效能最佳,為每毫克蛋白0.327mg的Ca2+
離子,其餘菌株的鈣離子鍵結效能均低於每毫克蛋白0.1mg的Ca2+
。
為了探討溫度、壓力、酸鹼度等的環境因子對微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi
sp.nov.)的胞外蛋白與鈣離子鍵結效能的影響,設計下列實驗:(1)將50ppm的上述胞外蛋白樣品在25℃、pH 7的環境下,以試驗壓力分別為10atm、30atm、50atm的條件處理10分鐘;(2)將50ppm的上述胞外蛋白樣品在25℃、1大氣壓環境下,以試驗酸鹼度分別為pH 2、pH 4、pH 6、pH 7、pH 8、pH 10的條件處理10分鐘;(3)將50ppm的上述胞外蛋白樣品在pH 7環境下,以試驗溫度分別為100℃、125℃、150℃的條件處理10分鐘。
之後,以上述的蛋白溶液50ppm與以CaCl2
‧2H2
O配製成100ppm的鈣離子儲備溶液1:1均勻混合,混合液於上述試驗環境條件下再處理10分鐘。試驗完成後,混合液以薄膜孔徑大小為3KDa的超過濾系統(ultrafiltration system)過濾,使蛋白被截流在薄膜上,而未與蛋白鍵結的鈣離子濾出液則以去離子水稀釋至儀器檢測範圍內(0~5
ppm)後,以感應耦合電漿原子發射光譜儀(ICP)量測分析,最後由濾液中的殘留Ca2+
濃度推算蛋白對鈣離子之鍵結效能。
結果如第3至5圖所示,本發明之微嗜熱乙型溫單胞菌在高溫、高壓及廣pH條件下,皆具有對鈣離子的優良鍵結效能。
為了探討微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi
sp.nov.)之胞外蛋白與二價及三價金屬離子的鍵結效能,設計下列實驗:
(1)將上述胞外蛋白樣品10ppm與含有鈰(Ce)、鏑(Dy)、鉺(Er)、銪(Eu)、釓(Gd)、鈥(Ho)、鑭(La)、鎦(Lu)、釹(Nd)、鐠(Pr)、鈧(Sc)、釤(Sm)、鋱(Tb)、釷(Th)、銩(Tm)、鈾(U)、鐿(Yb)及釔(Y)金屬離子10ppm的標準溶液1:1均勻混合,在100℃、pH 2的條件下反應20分鐘,之後,依上述方法,測定該胞外蛋白與鏑(Dy)、鑭(La)、釹(Nd)、鈧(Sc)、釤(Sm)、鐿(Yb)金屬離子的鍵結效能,鍵結效能以每毫克微莫耳金屬離子(μmole metal/mg protein)表示,結果如第6至11圖所示。
(2)將上述胞外蛋白樣品10ppm與含有銀(Ag)、鋁(Al)、硼(B)、鋇(Ba)、鉍(Bi)、鈣(Ca)、鎘(Cd)、鈷(Co)、鉻(Cr)、銅(Cu)、鐵(Fe)、鎵(Ga)、銦(In)、鉀(K)、鋰(Li)、鎂(Mg)、錳(Mn)、鈉(Na)、鎳(Ni)、鉛(Pb)、鍶(Sr)、鉈(Tl)、鋅(Zn)金屬離子10ppm的標準溶液1:1均勻混合,在
100℃、pH 2的條件下反應20分鐘,之後,依上述方法,測定該胞外蛋白與鋇(Ba)與鈣(Ca)金屬離子的鍵結效能,鍵結效能以鍵結效能以每毫克微莫耳金屬離子(μmole metal/mg protein)表示,結果如第12至13圖所示。
從第6至13圖之數據可知,本發明之微嗜熱乙型溫單胞菌之胞外蛋白對於廣泛的二價或三價金屬離子皆具有優良的鍵結能力。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上,然其並非用以限定本發明,任何熟悉此項技藝者,在不脫離本發明之精神和範圍內,當可做些許更動與潤飾,因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖顯示以16S rDNA序列相似性建立的微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi
sp.nov.)的親緣關係圖。
第2圖顯示微嗜熱乙型溫單胞菌的胞內與胞外蛋白對鈣離子的鍵結能力。
第3圖顯示在不同溫度下各嗜熱菌的胞外蛋白對鈣離子的鍵結能力。
第4圖顯示在不同壓力下各嗜熱菌的胞外蛋白對鈣離子的鍵結能力。
第5圖顯示在不同酸鹼度的環境下各嗜熱菌的胞外蛋白對鈣離子的鍵結能力。
第6圖顯示各嗜熱菌的胞外蛋白對鏑(Dy)離子的鍵結能力。
第7圖顯示各嗜熱菌的胞外蛋白對鑭(La)離子的鍵結能力。
第8圖顯示各嗜熱菌的胞外蛋白對釹(Nd)離子的鍵結能力。
第9圖顯示各嗜熱菌的胞外蛋白對鈧(Sc)離子的鍵結能力。
第10圖顯示各嗜熱菌的胞外蛋白對釤(Sm)離子的鍵結能力。
第11圖顯示各嗜熱菌的胞外蛋白對鐿(Yb)離子的鍵結能力。
第12圖顯示各嗜熱菌的胞外蛋白對鋇(Ba)離子的鍵結能力。
第13圖顯示各嗜熱菌的胞外蛋白對鈣(Ca)離子的鍵結能力。
<110> 財團法人工業技術研究院
<120> 抑制鹽類生成的方法及高溫廢水的處理方法
<130> 0965-A24070-TW
<150> US61,652,522
<151> 2012-05-29
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1276
<212> DNA
<213> Tepidimonas thermarum AA-1
<400> 1
Claims (18)
- 一種抑制鹽類生成的方法,包括:使分離自微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)培養液的蛋白質溶液與含有金屬離子之溶液接觸,其中,該蛋白質溶液含有微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)的胞外蛋白混合物,該胞外蛋白混合物與該金屬離子生成金屬離子與蛋白的複合物。
- 如申請專利範圍第1項所述之抑制鹽類生成的方法,其中,該微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)包括如序列識別號1所示之16S rDNA序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之抑制鹽類生成的方法,其中,該金屬離子包括二價或三價金屬離子。
- 如申請專利範圍第1項所述之抑制鹽類生成的方法,其中,該金屬離子包括鈰(Ce)、鏑(Dy)、鉺(Er)、銪(Eu)、釓(Gd)、鈥(Ho)、鑭(La)、鎦(Lu)、釹(Nd)、鐠(Pr)、鈧(Sc)、釤(Sm)、鋱(Tb)、釷(Th)、銩(Tm)、鈾(U)、鐿(Yb)、釔(Y)、銀(Ag)、鋁(Al)、硼(B)、鋇(Ba)、鉍(Bi)、鈣(Ca)、鎘(Cd)、鈷(Co)、鉻(Cr)、銅(Cu)、鐵(Fe)、鎵(Ga)、銦(In)、鉀(K)、鋰(Li)、鎂(Mg)、錳(Mn)、鈉(Na)、鎳(Ni)、鉛(Pb)、鍶(Sr)、鉈(Tl)、鋅(Zn)或前述之組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之抑制鹽類生成的方法,其中,該方法在75~150℃的高溫環境進行。
- 如申請專利範圍第1項所述之抑制鹽類生成的方法,其中,該方法在1~50atm的壓力下進行。
- 如申請專利範圍第1項所述之抑制鹽類生成的方 法,其中,該方法在pH 2~10的酸鹼度下進行。
- 如申請專利範圍第1項所述之抑制鹽類生成的方法,其中,該溶液包括地熱水、鍋爐內溶液、工業廢水或硬水。
- 如申請專利範圍第1項所述之抑制鹽類生成的方法,其用於鍋爐設備、地表管線、地熱生產井、工業廢水或硬水的處理。
- 一種高溫廢水的處理方法,包括:使分離自微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)培養液的蛋白質溶液與含有金屬離子之廢水接觸,其中,該蛋白質溶液含有微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)的胞外蛋白混合物,該胞外蛋白混合物與該金屬離子生成金屬離子與蛋白的複合物。
- 如申請專利範圍第10項所述之高溫廢水的處理方法,其中,該微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)包括如序列識別號1所示之16S rDNA序列。
- 如申請專利範圍第10項所述之高溫廢水的處理方法,其中,該金屬離子包括二價或三價金屬離子。
- 如申請專利範圍第10項所述之高溫廢水的處理方法,其中,該金屬離子包括鈰(Ce)、鏑(Dy)、鉺(Er)、銪(Eu)、釓(Gd)、鈥(Ho)、鑭(La)、鎦(Lu)、釹(Nd)、鐠(Pr)、鈧(Sc)、釤(Sm)、鋱(Tb)、釷(Th)、銩(Tm)、鈾(U)、鐿(Yb)、釔(Y)、銀(Ag)、鋁(Al)、硼(B)、鋇(Ba)、鉍(Bi)、鈣(Ca)、鎘(Cd)、鈷(Co)、鉻(Cr)、銅(Cu)、鐵(Fe)、鎵(Ga)、銦(In)、鉀(K)、 鋰(Li)、鎂(Mg)、錳(Mn)、鈉(Na)、鎳(Ni)、鉛(Pb)、鍶(Sr)、鉈(Tl)、鋅(Zn)或前述之組合。
- 如申請專利範圍第10項所述之高溫廢水的處理方法,其中,該方法在75~150℃的高溫環境進行。
- 如申請專利範圍第10項所述之高溫廢水的處理方法,其中,該方法在1~50atm的壓力下進行。
- 如申請專利範圍第10項所述之高溫廢水的處理方法,其中,該方法在pH 2~10的酸鹼度下進行。
- 如申請專利範圍第10項所述之高溫廢水的處理方法,其中,該廢水來自地熱水、鍋爐內溶液、工業廢水或硬水。
- 如申請專利範圍第10項所述之高溫廢水的處理方法,其用於鍋爐設備、地表管線、地熱生產井、工業廢水或硬水的處理。
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