MX2009001506A - Marcadores de genes leptina y receptor de hormona de crecimiento asociados con la crianza, atributos del canal y vida productiva en ganado vacuno. - Google Patents

Marcadores de genes leptina y receptor de hormona de crecimiento asociados con la crianza, atributos del canal y vida productiva en ganado vacuno.

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Abstract

La invención proporciona un método para subagrupar animales de acuerdo con el genotipo, en donde los animales de cada subgrupo tienen un polimorfismo similar o combinación de polimorfismos en el gen leptina seleccionados del grupo que consiste de UASMS1, UASMS2, UASMS3, EXON2-FB Y E2JW. La combinación de polimorfismos de nucleótido individual del gen leptina, especialmente combinaciones que pueden comprender alelos de la posición E2JW, puede indicar un incremento en la blandura de la carne así como indicación de la calidad de otros atributos de los animales. Los polimorfismos de leptina también se pueden combinar con polimorfismos del gen receptor de hormona de crecimiento bovino. La invención también proporciona métodos para identificar un animal que tiene un fenotipo deseable relacionado con cierta ingesta de alimento, ingesta de materia seca, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valía y composición del canal, y rendimiento de leche, en comparación con la población general de animales de esa especie, que pueden comprender la determinación de la presencia de un polimorfismo de nucleótido individual o combinación de polimorfismos de nucleótido individual en los genes leptina y/o bGHr.

Description

MARCADORES DE GENES LEPTINA Y RECEPTOR DE HORMONA DE CRECIMIENTO ASOCIADOS CON LA CRIANZA, ATRIBUTOS DEL CANAL Y VIDA PRODUCTIVA EN GANADO VACUNO CAMPO DE LA INVENCIÓN I,a presente invención se relaciona a polimorfismos de nucleótido individual en el gen leptina u oh, y a la asociación de estos SNPs solos o en combinación, o en combinación con SNPs de otros genes, con ciertos atributos que son económ camente importantes en las especies de ganado, tales como los niveles de leptina circulante, ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, va Lia del canal, blandura de la carne y composición dei canal, área de ribeye, grado de rendimiento e ingesta de materia seca. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las mejoras significantes en el desempeño del animal, eficiencia y el canal y la calidad de la carne se han hecho durante los años a través de la api icación de técnicas de reproducción y selección de animales estándares. Sin embargo, tales técnicas de reproducción de animales clásicas requieren varios años de evaluación genética de registros de desempeño sobre animales indiviciuaics y sus parientes y por lo tanto son muy costosas. Otros esfuerzos se han hecho para mejorar la productividad y calidad a través de la aplicación de tales prácticas de manejo como el uso de aditivos aliment cios, Implantes hormonales de animales y quimioterapéuticos . Sin embargo, hay una resistencia política y reguladora significante a la introducción y uso de tales metodologías. TaJ.es metodologías también no son heredables y necesitan ser aplicadas de manera diferente en cada sistema de producción . Hay una necesidad por métodos que permitan la selección relati amente fácil! y más eficien e y la reproducción de animales de granja con una ventaja para un atributo heredable de niveles de leptina circulante, ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valía del canal y composición del canal. El significado económico del uso de marcadores genéticos que están asociados con atributos específicos económ camente importantes (espec almente atributos con baja he redab i.1 idad) en el ganado a través de la selección y/o manejo asistido por marcador por lo tanto no puede ser sobre-enfatizado . La leptina, el producto hormonal del gen ob (obeso) , se ha mostrado que es predominantemente sintetizado y expresado en tejidos adiposos (Zhang y colaboradores, Nature. 1994 Dec 1; 372 ( 6505 ) : 25- 3 , Ji y colaboradores, Anim Biotechnol. i 998 ; 9 ( i ) : 1 - ? ) . Esta funciona como una señal fisiológica potente en Ja regulación del peso del cuerpo, consumo de energía, ingesta de alimento, adiposidad, fertilidad y funciones inmunes (Houseknecht y colaboradores, J Anim Sel. 1998 May; 76 ( 5 ) : 1 0 -20 , Lord y colaboradores, Nature. 1998 Aug 27; 39 ( 6696 ) : 897 - 901 , García y colaboradores, J ????? Sci . 2002 Aug; 80 ( 8 ) : 2158 - 67 ) . La leptina se ha propuesto como uno de los mayores factores de control que contribuyen a la variación fenotipica y genética en el desempeño y eficiencia del ganado vacuno. Los polimorfismos en Las regiones de codificación del gen IcpLina en el ganado vacuno so han asociado con el rendimiento y la composición de la leche (Liefers y colaboradores, J Dairy Sci. 2002 Jun; 85 ( 6 ) : 1633- 8 ) , ingesta de alimento (Liefers y colaboradores, J Dairy Sci. 2002 Jun; 85 (6) : 1633-8; Lagonigro y colaboradores, An.iin Genet. 2003 Oct; 34 ( 5 ) : 371 - ) , y grasa del cuerpo (Buchanan y colaboradores, Gcnet Sel Evol. 2002 Jan-Feb; 34 ( 1 ) : 105 - 16 ; Lagonigro y colaboradores, Anirn Genet. 2003 Oct; 34 (5) :371-4) . Sin embargo, parecería que los polimo fismos localizados en la región de promotor del gen leptina (es decir, la región del gen que regula el nivel de expresión de leptina a través de sus elementos aumentadores y s.i lenciadores asociados) pueden tener un efecto más fuerte sobre la regulación de estos atributos económicamente .importantes, y por lo tanto son de valor predictivo más grande. Los estudios en humanos han mostrado que las mutaciones en la región de proteína que enlaza CCAAT/aumentador (C/???-a) del promotor de leptina anuló la inducibi I idad del promotor por C/???-a (Miller y colaboradores, Proc Nati Acad Se i U S A. 1996 May 28; 93(1 1) :5507-1 1) . Masón y colaboradores ( Endocr inology . 1998 Ma r,· 139(3) :1013-22) han mostrado que las mutaciones en el C/EBP-a y las porciones TATA asi como en un sitio Spl consensúa! de leptina redujo la actividad de promotor por 10, 10 y 2.5 veces, respectivamente, y anuló el enlace de estos factores. Masón y colaboradores (1998) también mostraron que la regulación de la expresión del gen leptina es parcialmente enlazada a un factor novedoso que enlaza a una porción LP1 en el promotor. La función del receptor activado de proliferador de peroxizoma-? (PPAR-?) en la di ferenciación de adipocito también se ha enlazado a la función del promotor de leptina (De Vos y colaboradores, J Clin Invest. 1996 Aug 15; 98(4) : 1004-9) . Aunque varios polimorfismos se han detectado en el promotor de leptina bovino (Liefers y colaboradores, Mamm Genome. 2003 Sep; 14 ( 9 ) : 657 - 63 ) , poco se ha hecho para asociar cual. quiera de éstos con cualquiera de los atributos económicamente importantes en el ganado vacuno. Los SNPs de otros genes de Posiciones de Genes Cuantitativas (QTL) también están asociados con atributos económicamente significantes del ganado vacuno tal como la calidad de la carne o el rendimiento de leche. Un SNP, en el exón 8 del gen que codifica el receptor de hormona de crecimiento bovino (bGHr) se ha mostrado que Influencia el rend.imi.ento y la composición de la leche (Blott y colaboradores, Gcnetlcs 163:253-266 (2003) . En la presente invención se ha mostrado de manera sorprendente que tres polimorfismos de nucleótido individual (SNPs) previamente desconocidos en ia región de promotor del gen leptina, solos o en combinación con SNPs en el exón 2 del gen leptina, están fuertemente asociados con varios atributos económicamente importantes en el ganado vacuno. Además, la presente invención ha mostrado que un SNP en el exón 8 de la posición bGHr está cuantitativamente asociado con la calidad de la carne y .La ingesta de alimento diaria de los animales y, por lo tanto, proporciona un marcador útil adicional en el ganado de carne de res asi como en el ganado lechero. La cita o identificación de cualquier documento en esta solicitud no es una admisión de que tal documento esté disponible como la técnica previa para la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona generalmente a tres polimorfismos de nucleótido individual (SNPs) previamente desconocidos en el promotor del gen leptina u ob (SEQ ID NO:l) , a dos SNPs previamente conocidos en el exón 2 del gen ob (SEQ ID NO:5) , a otros SNPs, particula mente el gen de receptor de hormona de crecimiento bovino (bGHr) , y a la asociación de cada uno de estos SNPs, solos o en combinación, con ciertos atributos que son de importancia económica significante en las especies de ganado, tales como los niveles de leptina circulante, ingesta de alimento diaria, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valia del canal y composición del cana] en las especies de ganado. Los tres SNPs local zados en el promotor de gen leptina son llamados UASMS1, UASMS2 y UASMS3. Estos tres SNPs, en el contexto de la secuencia de promotor de gen ob, se pueden observar en la SF,Q ID NO: 2, SEQ l'D NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. Los SNPs localizados en el exón 2 del gen leptina es llamado EX0N2-FB, observado en el contexto del exón 2 del gen ob en la SEQ ID NO: 6. En un aspecto, la presente invención proporciona métodos para agrupar animales de acuerdo con el genotipo en donde los animales de cada sub-grupo pueden tener un polimorfismo similar en el gen leptina. ta presente invención también puede abarcar al agrupamiento de Jos animales de acuerdo con los SNPs de otras posiciones genéticas, y en combinación con uno o más SNPs asociados con el gen leptina. Tales métodos pueden comprender la determinación del genotipo de cada animal a ser sub-agrupado aJ determinar la presencia de un SNP en el gen leptina, en donde el SNP se selecciona del grupo que consiste de UASMSi, UASMS2, UASMS3, E2JW y EX0N2-FB, o en tal como la posición del gen bGHr (por ejemplo SNP F279Y) , y en donde animales individuales se colocan en sub-grupos donde cada animal en un subgrupo tiene un polimorfismo simiLar en los genes seleccionados. En una modalidad preferida el animal a ser agrupado es un bovino, y el gen leptina es el gen leptina bovino. En o Lira modalidad, la presente invención proporciona métodos para identi ficar animales que tienen atributos deseables relacionados con los niveles de leptina circulante, ingesta de a limen Lo diaria, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valia del canal y composición del canal, como es comparado con la población general de animales de esa especie. Tales métodos pueden comprender la dete minación de la presencia de SNPs en el gen leptina u otros genes relevantes del anima] que pueden proporcionar predicción de atributos deseables del ganado, en donde los polimorfismos de leptina se pueden seleccionar del grupo que consiste de UASMS1, UASMS2, UASMS3, E2JW, EXON2-FB y bGHr F279Y, y en donde la presencia de los SNP UASMSi, UASMS2, UASMS3 , E2 JW , EXON2-FB, o bGHr F279Y es indicativo de un atributo deseable relacionado con los niveles de leptina circulante, ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valia del canal y composición del canal. En una modalidad preferida el animal a ser agrupado es un bovino, y el gen leptina es el gen leptina bovino. En una modalidad adiciona L la presente invención proporciona sondas de oligonucleótido aisladas que son útiles en la detección de los SNPs UASMSI, UASMS2, UASMS3, E2JW y EXON2-FB en el gen ob . La presenLe invención ven La j osamen Le proporciona sondas de oligonucleóLido para la detección de los dos alólos alternativos de cada SNP. Por ejemplo, en el caso del polimorfismo UASMS1, que constituye una sustitución de C a - T en la posición de nucleótido 207 del promotor del gen ob, La presente invención proporciona sondas de oligonucleóLido que pueden ser utilizadas pa a detectar y distinguir entre el alelo que contiene C y el alelo que contiene T. En el caso del polimorfismo UASMS2, que constituye una sustitución de C a T en la posición de nucleótido 528 del promotor de gen ob, la presente invención proporciona sondas de oiigonucleótido que pueden ser utilizadas para detectar y distinguir entre el alelo que contiene C y el alelo que contiene T. En el caso del polimor ismo u7\3M53 que constituye una sustitución de C a G en la posición de nucleótido 1759 del promotor de gen ob, la presente invención proporciona sondas de o 1 igonucleótido que pueden ser utilizadas para detectar y distinguir entre el alelo que contiene C y el alelo que contiene G. De manera similar, en el caso del polimorfismo EXON2-FB, que contiene una sustitución de C a T en la posición de nucleótido 305 del exón 2 del gen ob, la presente invención proporciona sondas de oligonucleóLido que pueden ser uL.i.1 i adas para detectar y d i s t i n g u i r e n t, re e i. ale1o que con t i c n e C y el alelo que contiene T . En el caso del SNP bGHr F279Y, que da por resultado una sustitución de F a Y en la posición de aminoácido 279 dentro del exón 8 del gen bGHr, la presente invención proporciona sondas de oligonucleótido que pueden ser utilizadas para detectar y distingui r entre los alelos respectivos. En una modalidad preferida, Las sondas de oligonucleótido de la presente invención son marcadas con una porción detectable, tal como, por ejemplo, digoxigenina-dUTP, biotina, porciones fluorescentes, porciones qu imiol uminiscen tes , porciones e] ect roqu imio.1 umi niscen tes y porciones radioactivas. En una modalidad adicional la presente invención proporciona cebadores aislados y paros de cebadores que son útiles en la amplificación de fragmentos del gen ob que abarcan los SNPs UASMS1, UASMS2, UASMS3, E2JW, EXO 2 - FB y bGHr F279Y. Fn una modalidad los fragmentos del gen ob que son amplificados utilizando tales cebadores son subsecuentemente detectados util izando las sondas de oligonucleótido de la presente invención. Un aspecto de la invención, por lo tanto, proporciona un método para sub-agrupar animales de acuerdo con el genotipo en donde los animales de cada sub-grupo tienen un polimorfismo similar o combinación de polimorfismos en el gen leptina que comprende (a) determinar el genotipo de cada animal a ser sub-agrupado al determinar la presencia de un polimorfismo de nucleótido individua] o una combinación de polimorfismos de nucleótido individual en el gen leptina (ob) , en donde los polimorfismos de nucleótido individual se seleccionan del grupo que consiste UASMS1, UASMS2, UASMS3, EXON2-FB y E2JW; y segregar animales individuales en sub-grupos en donde cada animal en un subgrupo tiene un polimorfismo similar o combinación de polimorfismos en el gen leptina . En una modalidad de la invención, el método además puede sub-agrupar los animales de acuerdo con el genotipo para el gen bGHr y en particular aquel relacionado con el SNP F279Y. En varias modalidades de este aspecto de la invención, la combinación de polimorfismos de nucleótido individual del gen leptina se puede seleccionar del grupo que consiste de UASMS1/UASMS2 , UASMS 1 /UASMS3 , UASMS2/UASMS3, UASMS 1 / EXON2 - FB, UASMS2 / EXON2 - FB , UASMS 3 / EXON2 - FB , EXON2 - FB/ E2 JW , UASMS1/E2JW, UASMS2/E2JW y UASMS3/E2 JW, y en donde los animales individuales son segregados en sub-grupos dependiendo de si los animales tienen, o no tienen, las combinaciones de polimorfismos de nucleótido individual UASMS 1 /UASMS2 , UASMS 1 /UASMS 3 , UASMS2 /UASMS 3 , UASMS 1 / EXON2 - FB , UASMS2 /EXON2-FB, UASMS 3 / EXON2 - FB , EXON2-FB/E2 JW, UASMS 1 / E2 JW , UASMS2/E2JW, y UASMS 3 / E2 JW del gen leptina. En una modalidad, la combinación de polimorfismos de nucleótido individual del gen leptina comprende los marcadores UASMS 1 / EXON2 - FB , UASMS3 / EXON2 - FB , EXON2-FB/E2 JW, UASMS 1 / E2 JW o UASMS 3 /E2 JW , en donde la combinación de SNPs I I indica un incremento en la blandura de la carne. En otra modalidad de acuerdo con la invención, la combinación de polimorfismos de nucleótido individual del gen leptina comprende los marcadores UASMS1 /EX0N2- FB , UASMS3/EXON2-FB, EXON2-FB/E2JW, UASMS1/E2JW, o UASMS3/E2 JW . En todavía otra modalidad de la invención, la combinación de polimorfismos de nucleótido individual del gen leptina comprende los marcadores EX0N2- FB/E2 JW . En otras modalidades de la invención, la combinación de polimorfismos de nucleótido individual del gen leptina comprende los marcadores UASMS1 /EX0N2-FB o UASMS 3 / EXON2 - FB . En todavía otras modalidades de la invención, la combinación de pol imorfismos de nucleótido individual del gen leptina comprende los marcadores UASMS 1 / E2 JW o UASMS3/E2 J . En estas modalidades de la invención, los SNPS individuales o combinados del gen leptina también se pueden combinar con SNP F279Y del gen bGHr. Otro aspecto de la invención proporciona un método para identificar un animal que tiene un fenotipo deseable relacionado con cierta ingesta- de al mento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valla y composición del canal, y rendimiento de leche, como es comparado con la población general de animales de esa especie, que comprende determinar el genotipo del animal, en donde los polimorfismos de nucleótido individual se seleccionan del grupo que consiste de UASMS1, UASM52, UASMS3, EX0N2-FB, E2JW y F279Y, y en donde la combinación de polimorfismos de nucleótido individual se selecciona del grupo que consiste de UASMS1 /UASMS2 , UASMSl / UASMS 3 , UASMS2. /UASMS3 , UASMS1 / EX0 2 - FB , UASMS2 / EX0 2 -FB, UASMS3 / X0N2 - FB , EX0N2 - FB/E2 J , UASMS1/E2JW, UASMS2/E2JW, y UASMS3/E2JW, UASMS 1 /UASMS2 / F279Y , UASMS 1/UASMS3/F279Y, UASMS2 / UASMS 3 / F279Y , UASMS 1 / EX0N2 - FB/ F279 Y , UASMS2 /EX0N2 -FB/F279Y UASMS3 /EX0N2 - FB/ F279Y , EX0 2 - FB/E2 JW/ F279Y , UASMS1/E2 JW/F279Y, UAS S2/E2 JW/F279Y, y UASMS 3 / E2 JW/ F279Y y en donde la presencia de cualquiera del. polimorfismo de nucleótido individual UASMSl, UASMS2 , UASMS 3 o EXON2-FB o la presencia de las combinaciones de polimorfismos de nucleótido individual UASMSl/UASMS2 , UASMS 1 /UASMS3 , UASMS2 /UASMS 3 , UASMS i / EX01M2 - FB , UASMS2 / EXON2 - FB , UASMS 3 / EXON2 - FB, EXON2-FB/E2JW, UASMSl /E2 JW , UASMS2/E2JW, UASMS3/E2 JW, UASMS 1/UASMS2/F279Y, UASMS 1 /UASMS3 / F279Y , UASMS2 /UASMS3/-F279Y, UASMS1/EXON2-FB/F279Y, UASMS 2 /EXON2-FB/ F279Y UASMS 3 / XO 2 - FB/ F279Y , EXON2- FB/ 2 JW/ F 79 Y , UASMS 1 / E2 JW/ -F279Y, UASMS2/E2 JW/F279Y, o UASMS 3 / E2 JW/ F279Y es indicativo de un fenotipo deseable relacionado con cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valia de composición del canal, calidad de la carne, blandura de la carne y/o rendimiento de leche. Todavía otro aspecto de la invención proporciona una composición para la detección de una combinación de polimorfismos del gen ob seleccionada del grupo que consiste de UASMS1/UASMS2, UASMS1 /UASMS3 , UASMS2 /LJASMS3 , UASMS 1 / EX0N2 -FB , UASMS2 / FX0 2 - FB , UASMS 3 / EX0N2 - FB , EX0N2- FB/E2 JW, UASMS1/E2JW, UASMS2 /E2 JW , UASMS3/E2JW, UASMS 1/UASMS2/F279Y, UASMS 1 / UASMS 3 / F279 Y , UASMS2 /UASMS 3 / F279Y , UASMS 1 /EX0N2 - FB/F279Y, UAS S 2 / EX0N2 - FB/ F279Y , UASMS 3 / EXON2 - FB/ F279Y , EXO -FB/E2 JW/F279Y, UASMS 1 / E2 JW / ?·'279 Y , UASMS2 / E2 J W/ F279Y , o UASMS3/E2 JW/ F279Y , que comprende por lo menos dos sondas de oligonucleótido, en donde cada sonda de oligonucleótido es capaz de detectar selectivamente un so Lo polimorfismo, y en donde cada sonda es opciona Imen te marcada con una porción detectanle. Una modalidad de este aspecto de la invención es una sonda de oligonucleótido aislada en donde la porción detectada se selecciona del grupo que consiste de una radiomarca 3I-I, 125I, 35S, 14C, 32P, una enzima detectable, peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatasa alcalina, un tinte fluorescente, isotioci anato de G l.uoresceina , rojo de Texas, rodamina, Cy3, Cy5, Bodipy, Bodipy F'ar Red, Lucifer Yellow, Bodipy 630/650-X, Bodipy R6G-X, 5-CR 6G, una marca colorimé t rica , d.igoxigenina-dUTP de oro coloidal o biotina. En una modalidad de la invención, el o L igonucleótido es inmovilizado sobre un soporte sólido. Todavía otro aspecto de la invención proporciona un método para determinar el genotipo de un animal en una posición polimórfica del gen ob que comprende: (a) obtener una muestra de DNA del animal; (b) poner en contacto la muestra de DNA con por lo menos dos pa es de cebadores de oligonucleót ido bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridación de los cebadores de oligonucleótido a la muestra de DNA; (c) amplificar enzimáticamente las regiones especificas del gen ob utilizando 'Los pares de cebadores para formar por lo menos dos productos de amplificación de ácido nucleico; (d) poner en contacto los productos de amplificación de la etapa c) con sondas especificas de alelo de gen ob marcadas, marcadas con una porción detectable, bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridación de las sondas especificas de alelo marcadas a los productos de amplificación; (e) detectar la presencia de los productos de amplificación al detectar la porción detectable de las sondas especi ticas de alelo marcadas, hibridadas a los productos de amplif icación . En varias modalidades de este aspecto de la invención, los pares de cebadores de oligonucleótido se pueden seleccionar del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 y cebadores capaces de permitir la amplificación de una región del gen ob que abarca una posición polimórfica E2JW.
En otras modalidades de este método de la invención, los pares de cebadores de oligonucleótido son capaces de amplificar regiones de un gen bovino que tiene por lo menos una posición de nucleótido polimórfica seleccionada del grupo que consiste de UASMS1, UASMS2 , UASMS 3 , EX0N2-FB, and E2JW, o combinaciones de los mismos seleccionadas del grupo que consiste de UASMS 1 /UASMS 2 , UASMS 1 /UASMS3 , UASMS 2 /UASMS 3 , UASMS 1 / EX0 2 - FB , UASMS2 / EX0 2 - FB , UASMS3/EXON2-FB, EX0N2 - B/E2 JW , U SMS 1 / E2 JW , UASMS2/E2JW, UASMS3/E2 JW . En otras modalidades de la invención, los pares de cebadores de oligonucleótidos son capaces de amplificar regiones de un gen de hormona de crecimiento bovino que tiene por lo menos una posición de nucleótido polimórfica tal como el SNP F279Y. En otras modalidades, el genotipo indica un incremento en la blandura de la carne bovina. Las sondas de oligonucleótido y cebadores descritos en la presente son útiles para identificar animales que tienen SNPs asociados con atributos deseables relacionados con los niveles de leptina circulante, ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valia del canal y composición del canal,, como es comparado con la población general de animales de esa especie. Una vez que los animales individuales que poseen estos SNPs se han identificado, los animales pueden ser luego agrupados de acuerdo con el genotipo, en donde los animales de cada subgrupo tienen un polimorfismo similar en el gen lepLina . La presente invención también ventajosamente proporciona composiciones y equipos que comprenden 'Las sondas de oligonucleótido y cebadores descritos en la presente. Se observa que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, los términos tales como "se comprende", "comprendido", "que comprende" y los similares pueden tener el significado atribuido a este en la ley de patentes de los Estados Unidos, por ejemplo, ellos pueden significar "se incluye", "incluido", "que incluye" y los similares; y que los términos tales como "que consiste esencialmente de" y "consiste esencialmente de" tienen el significado adscrito a estos en la ley de patentes de ios Estados Unidos, por ejemplo, ellos permiten elementos no explícitamente mencionados, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica previa o que afectan una característica básica o novedosa de la invención . Estas y otras modalidades son divulgadas o son obvias de y abarcadas por, la siguiente Descripción Detallada . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La siguiente descripción detallada, dada a manera de ejemplo, pero no propuesta para limitar la invención solamente a las modalidades especificas descritas, se puede entender mejor en conjunción con los dibujos acompañantes, en los cuales: La FIG. 1 ilustra la secuencia de nucleótidos para la región de promotor flanqueante 5' y el e.xón 1 del gen ob bovino de "tipo silvestre". Esta secuencia de "tipo silvestre" tiene GenBank acceso número ABO'70368 (Taniguchi y colaboradores IU13MB Life Voi 53, pl31-135 (2002) ) , y es designada en la presente como SEQ ID NO.l. La FIG. 2 ilustra la secuencia de nucleótidos del polimorfismo de nucleótido individual UAS S1 en el promotor de gen ob bovino (SEQ ID NO. 2) . Esta secuencia polimórfica difiere de aquella de la secuencia de gen ob bovino de "tipo silvestre" (SEQ ID NO. 1) en que la posición de nucleótido 207 tiene una sustitución de citosina a timina. La FIG. 3 ilustra la secuencia de nucleótidos del polimorfismo de nucleótido individual UASMS2 del gen ob bovino (SEQ ID NO.. 3) . Esta secuencia polimórfica difiere de aquella de la secuencia de ge ob bovino de "tipo silvestre" (SEQ ID NO. 1) en que la posición de nucleótido 528 tiene una sust i. t u c i ó n de c i tos i na a t imi n a . La FIG. 4 ilustra la secuencia de nucleótidos del polimorfismo de nucleótido individual UASMS 3 del gen ob bovino (SEQ ID NO: 4) . Esa secuencia polimórfica difiere de aquella de la secuencia de gen ob bovino de "tipo silvestre" (SEQ ID N0:1) en que la posición de nucleótido 1759 tiene una sustitución de citosina a guanina. FIG. 5 ilustra la secuencia de nucleótidos para el exón 2 del gen ob bovino de "tipo silvestre" (SEQ ID NO: 5) . Esta secuencia de exón 2 de "tipo silvestre" tiene GenBank acceso número ??138588. La FIG. 6 ilustra la secuencia de nucleótidos para el polimorfismo de nucleótido individual EX0N2-FB del gen ob bovino (SEQ ID NO: 6) . Esta secuencia polimórfica difiere de aquella de la secuencia de gen ob bovino de "tipo silvestre" (SEQ ID NO: 5) en que la posición de nucleótido 305 tiene una sustitución de citosina a timina. La FIG. 7 ilustra la utilización de un diagrama de flujo de cómo los animales pueden ser clasificados para el SNP UASMS1, y como la información del genotipo se puede utilizar para seleccionar animales para reproducir y/o usar para la producción de alimento. La FIG. 8 ilustra la utilización de un diagrama de flujo de cómo los animales se pueden clasificar para SNP UASMS2, y como la información de genotipo se puede utilizar para seleccionar animales para reproducir y/o usar para la producción de alimento. La FIG. 9 ilustra la utilización de un diagrama de flujo de cómo los animales pueden ser clasificados para el 10 SNP UASMS3, y como la información de genotipo puede ser utilizada para seleccionar animales para reproducir y/o usar para la producción de alimento. La FIG. 10 ilustra la utilización de un diagrama de flujo de cómo los animales se pueden clasificar para el SNP EXON2-FI3, y como la información de genotipo se puede utilizar para seleccionar animales para reproducir y/o usar para la producción de alimento. La FIG. 11 ilustra el genotipo de marcador y la estadística descriptiva para los SNPs de gen leptina entre una población de ganado vacuno de prueba . La FIG. 12 ilustra estimaciones de los efectos del genotipo de ma cador individual. La FIG. 13 ilustra los resultados de la prueba F de los efectos de genotipo. La FIG. 14 ilustra los efectos de genotipo de los SNPs UASMS2 y EXON2 - FB y las frecuencias de genotipo para UASMS2 y EXON2-FB. La FIG. 15 ilustra un análisis de regresión del número de a le los. La FIG. 16 ilustra la regresión sobre la frecuencia de haplotipo de UASMSl y UASMS2. La FIG. 17 ilustra la regresión sobre la frecuencia de haplotipo de UASMSl y EX0N2-FB. La FIG. 18 ilustra la regresión sobre la frecuencia de haplotipo de UASMS2 y EX0N2-FB. La FIG. 19 ilustra la regresión sobre la frecuencia de haplotipo de UASMSl , UASMS2 y EX0N2-FB. La FIG. 20 ilustra un resumen de coeficientes significantes para atributos de ganado de carne de res regresados por las frecuencias de haplotipo. La FIG. 21 ilustra la asociación de los atributos del canal y de desempeño con los SNPs de la posición de leptina . La FIG. 22 ilustra la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 21 para el exón 2 del gen oh bovino. Este SNP E2JW de la secuencia de exón 2 tiene GenBank acceso número AY138588. La FIG. 23 ilustra la utilización de un diagrama de flujo de cómo los animales pueden ser clasificados para la combinación de SNP EXON2-FB/E2 JW, y como la información de genotipo se puede utilizar para seleccionar animales para reproducir y/o usar para la producción de alimento con blandura de carne incrementada. La FIG. 24 ilustra la secuencia de cDNA del receptor de hormona de crecimiento de B. ta urus (SEQ ID NO:24) (GenBank acceso No. X70041) , en donde el codón de inicio está en la posición de nucleótido 19 y el SNP F279Y está en la pos.ioión 854 (Blott y colaboradores, 2003) . DESCRIPCIÓN DETALLADA El término "animal" se utiliza en la presente para incluir todos los animales vertebrados, incluyendo humanos. Este también incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluyendo las etapas embriónica y fetal. Como se utiliza en la presente, el término "animales de producción" se utiliza intercambiablemente con "animales de ganado" y se refiere generalmente a animales criados principalmente para alimento. Por ejemplo, tales animales incluyen, pro no están limitados a, ganado vacuno (bovino) ovejas (ovino) , cerdos (porcino o marranos) , aves de corral (aves) y los similares. Como se utiliza en la presente, el término "vaca" o "ganado vacuno" se utiliza generalmente para referirse a un animal de origen bovino de cualquier edad. Términos intercambiables incluyen "bovino", "becerro", "novillo", "toro", "vaquilla", "vaca" y los similares. Como se utiliza en la presente, el término "cerdo" se utiliza generalmente para referirse a un animal de origen porcino de cualquier edad. Términos intercambiables incluyen "cerdito", "marrana" y los similares. Por el término "complementariedad" o "complementario" se propone, pa a los propósitos de la especificación o reivindicaciones, un número suficiente en el oligonucleótido de pares de bases complementarias en su secuencia para interactuar específicamente (hibridar) con la secuencia de ácido nucleico objetivo de] polimorfismo de gen ob a ser amplificado o detectado. Como es conocido para aquellos expertos en la técnica, un muy alto grado de complementa r Ledad es necesario para la especificidad y sensibilidad que involucra la hibridación, aunque no necesita ser el 100%. Asi, por ejemplo, un ol igonucleótido que es idéntico en la secuencia de nucleótidos a un ol igonucleótido divulgado en la presente, excepto para un cambio o sustitución de base, puede funcionar de manera equivalente a los oligonucleótidos divulgados. Un gen "DNA complementario" o "cDNA" incluye genes recombinan tes sintetizados mediante la transcripción inversa de RNA mensajero ("mRNA") . Una "reacción mediada por polirnerasa cíclica" se refiere a una reacción bioquímica en la cual una molécula de plantilla o una población de moléculas de plantilla es periódica y repetidamente copiada para crear una molécula de plantilla complementaria o moléculas de plantilla complementarias para de esta manera incrementar el número de las moléculas de plantilla durante el tiempo. La "desnaturalización" de una molécula de plantilla se refiere al desplegamien to u otra alteración de la estructura de una plantilla para hacer la plantilla accesible a la duplicación. En el caso de DNA, la "desnaturalización" se refiere a la separación de dos hebras complementarias de la doble hélice, para de esta manera crear dos moléculas de plantilla de una sola hebra, complementarias. La "desnaturalización" se puede realizar en cualquiera de una variedad de maneras, incluyendo mediante calor o mediante el tratamiento del DNA con una base u otro desnaturalizante. Una "cantidad detectable de producto" se refiere a una cantidad de ácido nucleico amplificado que puede ser detectada utilizando herramientas de laboratorio estándares. Un "marcador detectable" se refiere a un análogo de nucieótido que permite la detección utilizando medios viduales u otros medios. Por ejemplo, los nucleótidos fluorescentemente marcados pueden ser incorporados en un ácido nucleico durante una o más etapas de una reacción mediada por polimerasa cíclica, para de esta manera permitir la detección del producto de la reacción utilizando, por ejemplo, microscopía de fluorescencia u otra instrumentación de detección de fluorescencia. Por el término "porción detectable" se propone, para propósitos de la especificación o reivindicaciones, una molécula de marca (isotópica y no isotópica) que se incorpora directamente o indirectamente en un oligonucleótido, en donde la molécula de marca facilita la detección del oligonucleótido en la cual es .incorporada, por ejemplo, cuando el oligonucleótido es hibridado a secuencias de polimorfismos de gen ob amplificado. Así, "porción detectable" se utiliza sinónimamente con "molécula de marca". La síntesis de oligonucleótidos se puede realizar mediante cualquiera de varios métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica. Las moléculas de marca, conocidos por aquellos expertos en la técnica como que son útiles para la detección, incluyen moléculas quimioiuminiscentes o fluorescentes. Varias moléculas fluorescen es son conocidas en la técnica que son adecuadas para el uso pa a marcar un ácido nucleico para el método de la presente invención. El protocolo para tal incorporación puede variar dependiendo de la molécula fluorescente utilizada. Tales protocolos son conocidos en la técnica para la molécula fluorescente respectiva. Por "de tectablemen te marcado" se propone que un fragmento o un oligonucleótido contiene un nucleótido que es radioactivo, o que es sustituido por un fluoróforo, o que es sustituido con alguna de otras especies moleculares que induce una respuesta física o química que puede ser observada o detectada a simple vista o por medio de .instrumentación tal como, sin limitación, contadores de centelleo, colorímetros, espec tro fotóme t ros de UV y los similares. Como se utiliza en la presente, una "marca" o "etiqueta" se refiere a una molécula que, cuando, se adjunta mediante, por ejemplo, sin limitación, el enlace cova lente o hibridación, a otra molécula, por ejemplo, también sin limitación, un polinucleótido o fragmento de pol inucieótido, proporciona o aumenta un medio de detección de la otra molécula. Una marca o etiqueta de fluorescencia o fluorescente emite luz detectable en una longitud de onda particular cuando se excita en una longitud de onda di frécente. Una radiomarca o etiqueta radioactiva emite partículas radioactivas detectadles con un instrumento taJ como sin limitación, un contador de centelleo. Otro método de detección de generación de señal incluyen: quimioluminiscencia, elec t roqu im.i.ol umi n i scencia , raman, co] or ¡.métrico, ensayo de protección de hibridación y espectromet ía de masas. "Amplificación de DNA" como se utiliza en la presente se refiere a cualquier proceso que incrementa el número de copias de una secuencia de DNA específica al amplificar en zimá t icamen te la secuencia de ácido nucleico. Una variedad de procesos son conocidos. Uno de los más comúnmente utilizados es el proceso de reacción en cadena de polimerasa (PCR) , que es definido y descrito en secciones posteriores enseguida. El proceso de PCR de Mullís es descrito en las patentes norteamericanas Nos. 4,683,195 y 4,683,202. PCR involucra el uso de una DNA polimerasa termoes able , secuencias conocidas como cebadores, y ciclos de calen amiento, que separan el ácido deoxi rr ibonucleico (DNA) eplicante, hebras y exponencia Imen te amplificar un gen de interés. Cualquier tipo de PCR, tal como PCR cuantitativa, RT-PCR, PCR de inicio caliente, LAPCR, PCR múltiplex, PCR de toque directo, etc., se puede utilizar. Venta osamente, se utiliza la PCR en tiempo real. En general, el proceso de amplificación de PCR involucra una reacción de cadena enzimática para preparar cantidades exponenciales de la secuencia de ácido nucleico especifica. Ésta requiere una pequeña cantidad de una secuencia para iniciar la reacción en cadena y los cebadores de oligonucleótido que hibridarán a la secuencia. En E3CR los cebadores se recocen a ácido nucleico desnaturalizado seguido por la extensión con un agente de inducción (enzima) y nucleótidos. Esto da por resultado productos de extensión recien emente sintetizados. Puesto que estas secuencias recientemente sintetizadas llegan a ser plantillas para los cebadores, ciclos repetidos de desnaturalización, recocimiento de cebador y la extensión da por (resultado la acumulación exponencial de la secuencia especifica que es amplificada. El producto de extensión de la reacción de cadena será un dúplex de ácido nucleico discreto con terminales correspondientes a los extremos de los cebadores específicos empleados. "DNA" se refiere a la forma polimérica de deoxiribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) en ya sea una forma de una sola hebra o como una hélice de doble hebra. Este término se refiere solamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a cualquiera de las formas terciarias pa ticulares. Así, este término incluye DNA de doble hebra encontrado, ínter alia, en moléculas de DNA lineales (por ejemplo, fragmentos de restricción) , virus, plásmidos y cromosomas. En la discusión de la estructura de moléculas de DNA de doble hebra particulares, las secuencias pueden ser descritas en la presente de acuerdo con la convención normal de dar solamente a la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra no transcri a de DNA (es decir, la hebra que tiene una secuencia homologa al mRNA) . Por los términos "enzimá ticamente amplificados" o "amplificado" se propone, para Jos propósitos de la especificación o reivindicaciones, amplificación de DNA, es decir, un proceso mediante el cual las secuencias de ácido nucleico son amplificadas en número. Existen varios medios para amplificar enzimá icamen e secuencias de ácido nucleico. Actualmente, el método más comúnmente utilizado es la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Otros métodos de amplificación incluyen LCR (reacción en cadena de ligasa) que utiliza DNA ligada, y una sonda que consiste de dos mitades de un segmento de DNA que es complementaria a la secuencia de DNA a ser amplificado, enzima QB replicasa y una plantilla de secuencia de ácido ribonucleico (RNA) unida a una sonda complementaria al DNA a ser copiado que es utilizado para hacer una plantilla de DNA para la producción exponencial de RNA complementario; amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) ; amplificación de Q . be ta . repl ica sa (Q. beta. RA) ; repücación au tosostenida (3SR) y NASBA (amplificación basada en secuencia de ácido nucleico) que puede ser realizada sobre RNA o DNA conforme la secuencia de ácido nucleico es amplificada . Un "fragmento" de una molécula tal como una proteína o ácido nucleico se propone para referirse a cualquier porción de la secuencia genética de aminoácidos o nucleóLidos. Como se utiliza en la presente, el término "genoma" se refiere a todo el material genético en los cromosomas de un organismo particular. Su tamaño generalmente se da como su número total, de pares de bases. Dentro del genoma, el término "gen" se refiere a una secuencia ordenada de nucleótidos localizada en una posición particular sobre un cromosoma particular que codifica un producto funcional específico (por ejemplo, una proteína o molécula de RNA) . Por ejemplo, es conocido que la proteína leptina es codificada por el gen ob (obeso) y aparece para estar involucrada en la regulación del apetito, metabolismo basal y deposición de grasa. En general, las características genéticas de un animal, como es definido por la secuencia de nucleótidos de su genoma, son conocidas como su "genotipo", mientras que ios atributos físicos del animal son descritos como su "fenotipo". Por "heterocigoto" o "polimorfismo he te rocigoto" se propone que los dos alelos de una célula diploide u organismo en una posición dada son diferentes, es decir, que tienen un nucleótido diferente intercambiado por el mismo nucleótido en el mismo lugar en sus secuencias. Por "homocigoto" o "polimorfismo homocigoto" se propone que los dos alelos de una célula diploide u organismo en una posición dada son idénticos, es decir, que tienen el mismo nucleótido para el intercambio de nucleótido en el mismo lugar en sus secuencias. Por "hibridación" o "hibridante" como se utiliza en la presente, se propone la formación 'de pares de bases A-T y C-G entre las secuencias de nucleótidos de un fragmento de un segmento de un polinucleótido y una secuencia de nucleótidos complementa ios de un oligonucleótido . Por complementario se propone que en la posición de cada A, C, G o T (o U en un r ibonucleó t ido ) en la secuencia del fragmento, el oligonucleótido secuenciado tiene una T, G, C o A, respectivamente. El f ragmento/oligonucleótido hibridado es llamado un "dúplex". Un "complejo de hibridación", tal como un ensayo de intercalación, significa un complejo de moléculas de ácido nucleico que incluye por lo menos el ácido nucleico objetivo y una sonda sensora. Este también puede incluir una sonda fi adora . Por "inmovilizado sobre un soporte sólido" se propone que un fragmento, cebador u oligonucleótido se une a una sustancia en una ubicación particular de tal manera que el sistema que contiene el fragmento inmovilizado, cebador u oligonucleótido puede ser sometido a lavado u otra manipulación física o química sin ser desalojado de esa ubicación. Un número de soportes sólidos y medios para inmovilizar moléculas que contienen nucleótidos a éstos son conocidos en la técnica; cualquiera de estos soportes y medios se pueden utilizar en los métodos de esta invención. Como se utiliza en la presente, el término "ganancia de peso incremen ada" significa un incremento biológicamen e significante en la ganancia de peso arriba de la media de una población dada. Como se utiliza en la presente, el término "posición" o "posiciones" se refiere al sitio de un gen sobre un cromosoma. Un solo alelo de cada posición es heredado de cada origen. Cada combinación particular de alelos del animal es referido como su "genotipo". Donde ambos alelos son idénticos, el individuo que se dice que es homocigoto para el atributo controlado por ese par de alelos; donde los alelos son diferentes, el individuo se dice que es heterocigoto para el atributo. Una "temperatura de fusión" se propone en la temperatura en la cual los dúplexes hibridados se deshibridan y regresan a su estado de una sola hebra. Del mismo modo, la hibridación no ocurrirá en el primer lugar entre dos oligonucleót i dos o, en la presente, un oligonucleótido y un fragmento, a temperaturas arriba de la temperatura de fusión del dúplex resultante. Es actualmente ventajoso que la diferencia en las temperaturas de punto de fusión de dúplexes de oliqonucleótido-f agmento de esta invención sea de aproximadamente 1°C a aproximadamente 10 C para ser fác lmente detectadle. Como se utiliza en la presente, el término "molécula de ácido nucleico" se propone para incluir moléculas de DNA (por ejemplo, cDNA o DNA genómico) , moléculas de RNA (por ejemplo, mRNA) , análogos de DNA o RNA generados utilizando análogos de nucleótidos y derivados, fragmentos y homólogos de los mismos. La molécula de ácido nucleico puede ser de una sola hebra o de doble hebra, pero venta osamente es DNA de doble hebra. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que es separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Un "nucleósido" se refiere a una base enlazada a un azúcar. La base puede ser a d e n i n a (A) , guanina (G) (o su sustituto, inosma (I) ), citosina (C) , o timina ( T ) (o su sustituto, uracilo (U) ) . El azúcar puede ser ribosa (el azúcar de un nucleótido natural en RNA) o 2 -deoxir ibosa (el azúcar de un nucleótido natural en DNA) . Un "nucleótido" se refiere a un nucleósido enlazado a un solo grupo fosfato. Como se utiliza en la presente, el término "oligonucleótido" se refiere a una serie de residuos de nucleótidos enlazados, el oligonucleótido que tiene un número suficiente de bases de nuc eótido para ser utilizado en una reacción de PCR. Una secuencia de oligonucleótido corta puede estar basada sobre, o diseñada de, una secuencia genómica o de cDNA y se utiliza para amplificar, confirmar o revelar la presencia de un DNA o RNA idéntico, similar o complementario en una célula o tejido particular. Los ol igonucleótidos pueden ser sintetizados químicamente y se pueden utilizar como cebadores o sondas. Oligonucleótido significa cualquier nucieótido de más de tres bases en longitud utilizado para facilitar la detección e identificación de un ácido nucleico objetivo incluyendo sondas y cebadores. "Reacción en cadena de polimerasa" o "PCR" se refiere a una reacción de amplificación de DNA mediada por polimerasa, termocí clica . Una PCR típicamente incluye moléculas de plantilla, cebadores de oligonucleótido complementario a cada hebra de las moléculas de plantilla, una DNA polimerasa termoes table , y deoxiribonucleótidos, e involucra tres procesos distintos que son múltiplemente repetidos para efectuar la amplificación del ácido nucleico origina.! . Los tres procesos (desnaturalización, hibridación y extensión de cebador) frecuentemente se realizan en distintas temperaturas, y en distintas etapas temporales. En muchas modalidades, sin embargo, los procesos de hibridación y extensión de cebador se pueden realizar concurrentemente. La muestra de nucieótido a ser analizada pueden ser productos de amplificación de PCR proporcionados utilizando las técnicas de ciclado rápido descritas en las patentes norteamericanas Nos. 6,569,672 ; 6,569,627; 6,562,298; 6,556,940 ; 6,569,672; 6, 569, 627 ; 6, 562, 298; 6, 556, 940 ; 6, 489, 112; 6, 482, 615 6,472,156; 6,413,766; 6, 387 , 621 ; 6, 300, 124 ; 6, 270, 723 6,245,514; 6, 232, 079; 6,228, 634 ; 6,218, 193; 6 , 210 , 882 6, 197, 520; 6,174, 670; 6, 132, 996; 6,126,899; 6, 124 , 138 6, 07 , 868 ; 6, 036, 923; 5,985,651; 5,958,763; 5, 942, 32 5, 935, 522; 5, 897, 842; 5,882,918; 5,840,573; 5,795,784 5,795,547 ; 5, 785, 926; 5,783, 39; 5 , 736 , 106 ; 5, 720, 923 5,720,406; 5,675,700; 5,616,301; 5,576,218 y 5,455,175, las descripciones de las cuales son incorporadas por referencia en sus totalidades. Otros métodos de amplificación incluyen, sin limitación, NASBR, SDA, 3SR, TSA y replicación de circulo de enrollamiento. Se entiende que, en cualquier método para producir un polinucieótido que contiene nucleótidos modificados dados, se puede utilizar una o varias polimerasas o métodos de amplificación. La selección de las condiciones de polimerización óptimas depende de la aplicación. Una "polimerasa" es una enzima que cataliza la adición secuencia! de unidades monoméricas o una cadena polimérica, o enlaza dos o más unidades monoméricas para iniciar una cadena polimérica. En modalidades ventajosas de esta invención, la "polimerasa" trabajará al adicionar unidades monoméricas cuya identidad es determinada mediante y que es complementaria a una molécula de plantilla de una secuencia especifica. Por ejemplo, las DNA polimerasas tales como DNA pol 1 y Taq polímera sa adicionan deoxir ibonucleót idos al extremo 3' de una cadena de polinucleótido en una manera dependiente de plantilla, para de esta manera sintetizar un ácido nucleico que es complementario a la molécula de plantilla. Las polimerasas se pueden utilizar ya sea para extender un cebador una vez o repetitivamente o para amplificar un polinucleótido mediante el cebado repetitivo de dos hebras complementarias utilizando dos cebadores . Un "polinucleótido" se refiere a una cadena lineal de nucleótidos conectada por un enlace de fosfodiéster entre el grupo 3'-hidroxilo y el grupo 5'-hidroxilo de un segundo nucleósido que a su vez es enlazado a través de su grupo 3'-hidroxilo al grupo 5'-hidroxilo de un tercer nucleósido y así sucesivamente para formar un polímero comprendido de nucíeósidos enlazados por un esqueleto principal de fosfodiéster. Un "polinucleótido modificado" se refiere a un polinucleótido en el cual uno o más nucleótidos naturales han sido parcialmente o sustancialmente reemplazados con nucleótidos modificados . Un "cebador" es un oligonucleótido, la secuencia de por lo menos una porción de la cual es complementaria a un segmento de un DNA de plantilla que va a ser amplificado o replicado. Cebadores típicos se utilizan en la realización de la reacción en cadena de poiimerasa (PCR) . Un cebador híbrida con (o recoce a) "el DNA" de plantilla y se utiliza mediante la enzima de poiimerasa como el punto de partida para el proceso de replicación/amplif icación . Por "complementario" se propone que la secuencia de nucleótidos de un cebador es tal que el cebador puede formar un complejo de enlace de hidrógeno estable con la plantilla; es decir, el cebador híbrida r o recocer a la plantilla en virtud de la formación de pares de bases sobre una longitud de por lo menos diez pares de bases consecutivas. Los cebadores en la presente se seleccionan para ser " susta ncia Imen te" complementarios a diferentes hebras de una secuencia de DNA objetivo particular. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridar con sus hebras respectivas. Por lo tanto, la secuencia de cebadores no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla. Por ejemplo, un fragmento de nucleótido no complementario se puede unir al extreme 5' del cebador, con el resto de la secuencia de cebador que es complementaria a la hebra. Alternativamen e, las bases no complementarias o sus secuencias más largas se pueden in erdispersar en el cebador, con la condición de que la secuencia de cebador tenga suficiente complemen tariedad con la secuencia de la hebra para hibridar con la misma y de esta manera formar la plantilla para la síntesis del producto de extensión . "Sondas" se refiere a oligonucleótidos de secuencias de ácido nucleico de longitud variable, utilizadas en la detección de secuencias de ácido nucleico idénticas, similares o complementarias para la hibridación. Una secuencia de oligonucleótido utilizada como una sonda de detección puede ser marcada con una porción detectadle . Varias porciones de marcación son conocidas en la técnica. La porción puede, por ejemplo, ser ya sea un compuesto radioactivo, una enzima detectadle (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante ( HRP ) ) o cualquier otra porción capaz de generar una señal detectable tal como señal calorimétrica, fluorescente, quimioluminiscente o eiectroquimioluminiscente . La porción detectable puede ser detectada utilizando métodos conocidos . Como se utiliza en la presente, el término "proteína" se refiere a una molécula grande compuesta de una o más cadenas de aminoácidos en un orden específico. El orden es determinado por la secuencia de base de nucleótidos en el gen que codifica para la proteína. Las proteínas son requeridas para la estructura, función y regulación de las células, tejidos y órganos del cuerpo. Cada proteína tiene una función única. Como se utiliza en la presente, los términos "atributos" o "características físicas" se refieren a las propiedades ventajosas del animal que resultan de la genética. Los atributos de calidad incluyen, pero no están limitados a, los atributos relacionados con la calidad del canal del animal, atributo cuantif icable tal como la habilidad genética del animal para metabolizar energía, producir leche, colocación de la grasa intramuscular, postura de huevos, producir descendientes, producir proteínas particulares en la carne o en la leche, o retener la proteína en la leche. Las características físicas incluyen, pero no están limitadas a, carnes marmoleadas o magras o blandura de la carne. Los términos se utilizan intercambiablemente. Los atributos de desempeño incluyen, pero no están limitados a, peso mismo, ingesta de materia seca, ingesta de alimento residual, duración de la alimentación, visitas al alimento, peso de punto medio metabólico y los similares. Una "enzima de restricción" se refiere a una endonucleasa (una enzima que segmenta enlaces de fosfodiéster dentro de una cadena de polinucleótido) que segmenta DNA en respuesta a un sitio de reconocimiento sobre el DNA. El sitio de reconocimiento (sitio de restricción) consiste de una secuencia específica de nucleótidos de manera típica aproximadamente 4-8 nucleótidos de largo. Un "polimorfismo de nucleótido individual" o "SNP" se refiere a un ¦ polinucleótido que difiere de otro polinucleótido mediante una diferencia de nucleótido individual. Por ejemplo, sin limitación, el intercambio de un A por un C, G o T en la secuencia completa del polinucleótido constituye SNP. Por supuesto, es posible tener más de un SNP en un polinucleótido particular. Por ejemplo, en una posición en un polinucleótido, un C puede ser intercambiado por un T, en otra posición un G puede ser intercambiado por un A y asi sucesivamente. Cuando se refiere a SNPs, el polinucleótido es más frecuentemente DNA. Como se utiliza en la presente, una "plantilla" se refiere a una hebra de polinucleótido objetivo, por ejemplo, sin limitación, una hebra de DNA que ocurre naturalmente no modificada, una polimerasa que usa como un medio para reconocer el nucleótido debe incorporar enseguida en una hebra de crecimiento para polimerizar el complemento de la hebra que ocurre naturalmente. Tal hebra de DNA puede ser de una sola hebra o puede ser parte de una plantilla de DNA de doble hebra. En aplicaciones de la presente invención que requieren ciclos repetidos de polimerización, por ejemplo la reacción en cadena de polimerasa (PCR) , la hebra de plantilla misma puede llegar a ser modificada mediante la incorporación de nucleótidos modificados, pero todavía servir como una plantilla para una polimerasa para sintetizar polinucleótidos adicionales. Una "reacción termociclica" es una reacción de multietapas en donde por lo menos dos etapas son realizadas al cambiar la temperatura de la reacción. Una "polimerasa termoes table" se refiere a una enzima de DNA o NA polimerasa que puede resistir temperaturas ex remadamente altas, tales como aquellas aproximadas a 100°C. Frecuentemente, las polimerasas termoes tables se derivan de organismos que viven en temperaturas extremas, tal como Thermus aqua icus. Ejemplos de polimerasas termoes ables incluyen Taq, Tth, Pfu, Vent, deep vent, UlTma, y variaciones y derivados de las mismas. Una "variación" es una diferencia en la secuencia de nucleóti dos entre polinucleótidos relacionados. La diferencia puede ser la supresión de uno o más nucleótidos de la secuencia de un polinucleótido comparado con la secuencia de un polinucleótido relacionado, la adición de uno o más nucleótidos o la sustitución de un nucl.eótido por otro. Los términos "mutación", "polimorfismo" y "variación" se utilizan intercambiablemente en la presente. Como se utiliza en la presente, el término "variación" en lo singular se va a considerar que incluye múltiples variaciones; es decir, dos o más adiciones, supresiones y/o sustituciones de nucleótidos en el mismo polinucleótido. Una "mutación puntual" se refiere a una sola sustitución de un nucleótido por otro. ? menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica de biología molecular. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o la prueba de la presente invención, métodos y materiales adecuados son descritos en la presente. Se proporcionan definiciones adicionales en el contexto enseguida. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido con uno de habilidad ordinaria en la técnica de biología molecular. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o la prueba de la presente invención, métodos y materiales adecuados son descritos en la presente. La presente invención abarca métodos para la identificación y selección de animales basados sobre la presencia de SNPs en el gen oh (obeso) - un gen que codifica la proteína leptina. La leptina es un polipéptido específico de adiposito de 16-kDa involucrado en la regulación del apetito, metabolismo basal, deposición de grasa y producción de leche. El gen oh se ha mapeado a cromosomas específicos en varios animales diferentes, permitiendo al gen ser secuenciado en diversas especies diferentes. Se ha encontrado que hay conservación significante de los DNAs de oh y los polipépt idos de leptina entre las especies. Los SNPs que tienen los mismos efectos fenotípicos o similares a aquellos de la presente invención pueden ocurrir en muchas especies de animales diferentes. Los métodos de la presente invención se pueden utilizar para determinar s . un animal individual de una especie de interés posee los SNPs descritos en la presente. En modalidades ventajosas, el gen ob de un animal bovino se clasifica para la presencia de los SNPs de la presente invención. En un aspecto, la presente invención se relaciona a la identificación de polimorfismos de nucleóti.do individual (SNPs) en el promotor de leptina, y a métodos para la identificación de animales que llevan aleios específicos de esos SNPs que están asociados con los niveles de leptina circulante, ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valia y composición del canal y rendimiento de leche. En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona a la asociación de un SNP previamente reportado en el exón 2 del gen leptina, con niveles de leptina circulante, ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valía y composición del canal, rendimiento de leche y los similares. La presente invención también proporciona oligonucleótidos que pueden ser utilizados como cebadores para amplificar secuencias de ácido nucleico específicas del gen ob, y oligonucleótidos que pueden ser utilizados como sondas en la detección de las secuencias de ácido nucleico del gen ob . En otro aspecto, la invención se relaciona a la asociación de un SNP previamente reportado en el exón 8 del gen receptor de hormona de crecimiento bovino (bGHr) , con la ingesta de alimento, ingesta de material seca, relación de ingesta de alimento diaria a leche, relación de materia seca sobre la leche y el balance de energía efec ivo acumulativo (CEEB) . La invención también abarca combinaciones de estos SNPs que conjun amente están asociados con los atributos del canal y desempeño del Ganado de carne de res y/o lechero. La FIG. 1 ilustra la secuencia de nucleótidos para la región de promotor flanqueante 5' y el exón 1 del gen ob bovino de "tipo silvestre". Esta secuencia de "tipo silvestre" tiene GenBank acceso número AB070368, y es designada en la presente como SEQ ID N0:1. En la presente invención se ha mostrado de manera sorprendente que tres SNPs previamente desconocidos (específicamente UASMS1, UASMS2 y UASMS3) localizadas en la región del promotor de gen ob, y un SNP previamente conocido en el exón 2 del gen están asociados con ciertos atributos económicamente valiosos en animales, en particular en ganado bovino . El SNP llamado UASMSl constituye una sustitución de citosina (C) a tirnina (T) (C/T) en la posición 207 del promotor de gen leptina bovino. El SNP 'llamado UASMS2, constituye una sustitución de citosina (C) a timina (T) (sustitución de C/T) en la posición 528 del promotor de gen leptina bovino. El SNP llamado UASMS3 constituye una sustitución de citosina (C) a guanina (G) (sustitución de C/G) en la posición 1759 del promotor de gen leptina bovino. El sistema de numeración de nucleótidos utilizada en la presente para la identificación de los SNPs de promotor de leptina UASMS1, UASMS2 y UASMS3 es aquel utilizado para la secuencia de promotor de leptina bovino de "tipo silvestre" SEQ ID NO: 1. Los polimorfismos UAS S1, UASMS2 y UASMS3 están localizados en la secuencia reguladora 5' del gen leptina, no la región de codificación del gen, y de esta manera no dan por resultado alguna sustitución de aminoácido en el producto de gen leptina. En SNP llamado EXON2-FB descrito en la presente fue identificado previamente por Buchanan y colaboradores (2002), y constituye una mutación de mal sentido de citosina (C) a timina (T) en la posición 306 del exón 2 de la región de codificación del gen de leptina bovino de "tipo silvestre" (GenBank acceso No. AY138588 y SEQ ID NO:5) . El sistema de numeración de nucleótidos utilizado en la presente para identificación del SNP EXON2 - FB es aquel utilizado para la secuencia del exón 2 de leptina bovino de "tipo silvestre" SEQ ID NO: 5. !_·',.I SNP .llamado E2JW descrito en la presente identificado previamente por Lagoni.ro y colaboradores (2002), y constituye una mutación de mal sentido de citosina (C) a timina (T) en la posición 1759 en el exón 2 de la región de codificación del gen leptina bovino de "tipo silvestre" (GenBank acceso No. AY138588, y SEQ ID NO:5) . El sistema de numeración de nucleótidos utilizado en la presente para la identificación del SNP EXON2-FB es aquel utilizado para la secuencia del. exón 2 de leptina bovino de "tipo silvestre" SEQ ID NO: 5. Para determinar el genotipo de un animal dado de acuerdo con los métodos de la presente invención, es necesario obtener una muestra de DNA genómico de ese animal. Típicamente, esa muestra de DNA genómico será obtenida de una muestra de tejido o de células tomadas de ese animal. Una muestra de tejido de células se puede tomar de un animal en cualquier tiempo en el lapso de vida de un animal pero antes de que se pierda la identidad del canal. La muestra de tejido puede comprender pelo (incluyendo raíces), piel, huesos, frotaciones bucales, sangre, saliva, leche, semen, embriones, músculos o cualquiera de los órganos internos. En el método de la presente invención, la fuente de la muestra de te ido, y de esta manera también la fuente de la muestra de ácido nucleico de prueba, no es crítica. Por ejemplo, el ácido nucleico de prueba se puede obtener de las células dentro de un fluido corporal del animal, o de células que constituyen un tejido corporal del animal. El fluido corporal particular del cual se obtienen las células también es critico para la presente invención. Por ejemplo, el fluido corporal se puede seleccionar del grupo que consiste de sangre, ascitis, fluido pleural y fluido espinal. Además, el tejido corporal particular del cual se obtienen las células no es critico para la presente invención. Por ejemplo, el tejido corporal se puede seleccionar del grupo que consiste de piel, endometrio, uterino y tejido cervical. Se pueden utilizar tejidos tanto normales como de tumor. Típicamente, la muestra de tejido es marcada con un número de identi icación u otros indicios que se relacionan a la muestra con el animal individual del cual se tomó la muestra. La identidad de la muestra ventajosamente permanece constante por todos los métodos de la invención para de esta manera garantizar la integridad y continuidad de la muestra durante la extracción y análisis. Alternativamente, los indicios pueden ser cambiados en un aspecto regular que asegura que los datos, y cualquiera de otros datos asociados, pueden ser relacionados nuevamente con el animal del cual se obtuvo la muestra. La cantidad/tamaño de muestra requerida es conocida para aquellos expertos en la técnica. Idealmente, el tamaño/volumen de la muestra de tejido recuperada debe ser tan consistente como sea posible dentro del tipo de muestra y la especie de animal. Por ejemplo, para ganado, ejemplos no limitativos de tamaño/métodos de muestra incluyen carne sin grasa: 0.0002 g a 0.0010 g ; cuero: 0.0004g a 0.0010 g; raices de pelo; mayor que 5 y menor que 20; frotaciones bucales: 15 a 20 segundos de frotación con presión leve en el área entre el labio externo y la encía utilizando un cepillo de citología Cytosof t . TM : ; hueso: 0.0020 g a 0.0040 g; y sangre: 30 a 70 pL. Generalmente, la muestra de tejido se coloca en un recipiente que es marcado utilizando un sistema de numeración que lleva un código correspondiente al animal, por ejemplo, a la etiqueta de la oreja del animal. Por consiguiente, el genotipo de un animal particular es fácilmente rastreable en todos los tiempos. En una modalidad de la invención, un dispositivo de muestreo y/o contenedor puede ser suministrado al granjero, un matancero o detallista. El instructivo de muestreo venta osamente toma una muestra consistente y reproductible de animales individuales mientras que de manera simultánea evita cualquier contaminación cruzada del tejido. Por consiguiente, el tamaño y volumen de los tejidos de muestra derivados de los animales individuales sería consistente. De acuerdo con la presente invención, una muestra de DNA genómico se obtiene de la muestra de tejido del animal de ganado de interés. Cualquier fuente de células o tejido es utilizada, una cantidad suficiente de células debe ser obtenida para proporcionar una cantidad suficiente de DNA para el análisis. Esta cantidad será fácilmente conocida o determinable por aquellos expertos en la técnica. El DNA se aisla del te ido/células mediante técnicas conocidas para aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 6,548,256 y 5,989,431, Hirota y colaboradores, Jinrui Idengaku Zasshi. September 1989; 34(3) : 217-23 y John y colaboradores, Nucleic Acids Res. Jan. 25. 1991; 19(2) :408 ; las descripciones de las cuales son incorporadas por referencia en sus totalidades) . Por ejemplo, el DNA de alto peso molecular se puede purificar de las células o tejido utilizando la extracción de proteinasa K y la precipitación con etanol. El DNA se puede extraer de una muestra de animal utilizando cualquiera de los métodos adecuados conocidos en la técnica. Es un objetivo de la presente invención determinar el genotipo de un animal dado de interés, con el fin de identificar animales que llevan a l dos específicos de los SNPs de la invención que están asociados con Los niveles de leptina circulante, ingesta de aJimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valia y composición del canal y rendimiento de leche. Existen muchos métodos conocidos en la técnica para determinar el genotipo de un anima J y pa ra determinar si una muestra de DNA dada contiene un SNP particular. Cualquier método para determinar el genotipo se puede utilizar para determinar el genotipo ob en la presente invención. Tales métodos incluyen, pero no están limitados a, secuenciación de amplimero, secuenciación de DNA, espectroscopia de fluorescencia, análisis de hibridación basado en la transferencia de energía de resonancia de fluo escencia (o "FRE "') , clasificación de alto rendimiento, espectroscopia de masas, hibridación de ácido nucleico, reacción en cadena de polimerasa (PCR) , análisis de RFLP y cromatografía de tamaño (por ejemplo, cromatografía capilar o de geí) , todas las cuales son bien conocidas pa a uno de habilidad en la técnica. En particular, los métodos para determinar los polimorfismos de nucleótidos, particularmente polimorfismos de nucleóticlo individual, son descritos en las patentes norteamericanas Nos. 6,514,700; 6,503,710; 6,468,742; 6,448,407; 6,410,231; 6,383,756; 6,358,679; 6,322,980; 6,316,230 y 6,287,766 y revisadas por Chen y Sullivan, Pnarmacogenomics J 2003; 3(2) :77-96, las descripciones de las cuales son .incorporadas por referencia en sus totalidades. En una modalidad, la presencia o ausencia de los SNPs de la presente invención es determinado al secuenciar la región de la muestra de DNA genóm.ica que abarca la posición polimórfica. Muchos métodos para secuenciar el DNA genómico son conocidos en la técnica, y cualquiera de tal método se puede utilizar, ver por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Clonmg; A Laboratory Manual 2d ed . (1989) . Por ejemplo, como es descrito enseguida, un fragmento de DNA que abarca la ubicación de la SNP de interés puede ser amplificada utilizando la reacción en cadena de polimerasa o alguna otra reacción de amplificación mediada por polimerasa cíclica. La región amplificada de DNA luego puede ser secuenciada utilizando cualquier método conocido en la técnica. Ven a osamente, la secuenciación de ácido nucleico es mediante métodos automatizados (revisado por Meldrum, Genome Res. September 2000; 10 ( 9 ) : 1288 - 303 , la descripción de la cual es incorporada por referencia en su totalidad) , por ejemplo utilizando un Sistema de Análisis Genético Beckman CEQ 8000 (Beckman Coulter Instruments, Inc.) . Los métodos para secuenciar ácidos nucleicos incluyen, pero no están limitados a, la secuenciación de DNA fluorescente automatizado (ver, por ejemplo, Watts & MacBeath, Methods Mol Biol. 2001; 167:153-70 y MacBeath y colaboradores, Methods Mol Biol. 2001; 167:119-52) , electroforesis capilar (ver, por ejemplo, Bosserhoff y colaboradores, Comb Chem High Throughput Screen. December 2000; 3 ( 6 ) : 455 - 66 ) , chips de secuenciación de DNA (ver, por ejemplo, Jain, Pha rmacogenomics . August 2000; 1 ( 3 ) : 289-307 ) , espectrometría de masas (ver, por ejemplo, Yates, Trends Genet. January 2000; 16(1) :5-8) , pi rosecuenciación (ver, por ejemplo, Ronaghi, Genome Res. January 2001 ; 11(1) : 3-11) , y electroforesis de gel de capa ultra fina (ver, por ejemplo, Guttman & Roña .i, Elect rophoresis . December 2000; 21(18) :3952-64), las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en sus totalidades. La secuenciación también se puede hacer por cualquier compañía comercial. Ejemplos de tales compañías incluyen, pero no están limitadas a, la University of Georgia Molecular Genetics Instrumenta Lion Facility (Athens, Ga . ) o SeqWright DNA Technologies Services (Houston, Tex. ) . En ciertas modalidades de la presente invención, la detección de un SNP dado se puede realizar utilizando los métodos de amplificación mediados por polimerasa cíclica. Cualquiera de los métodos conocidos en la técnica para amplificación de DNA puede ser utilizado, tal como, por ejemplo, la reacción en cadena de polimerasa (PCR) , la reacción en cadena ele ligasa (LCR) (Barany, !·'., Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S. A.) 88:189-193 (1991) ) , el ensayo de desplazamiento de hebra (SDA) , o el ensayo de ligación de oligonucleótido ("OLA") (Landegren, U. y colaboradores, Science 241:1077-1080 (1988) ) . Nickerson, D. A. y colaboradores han escrito un ensayo de detección de ácido nucleico que combina los atributos de PCR y OLA (Nickerson, D. A. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S. A.) 87:8923-8927 (1990) ) . OLros procedimientos de amplificación de ácido nucleico conocidos tal como los sistemas de amplificación basados en ranscripción (Malek, L. T. y colaboradores, patente nor eamericana No. 5,130,238; Davey, C. y colaboradores, solic tud de patente europea 329,822; Schuster y colaboradores, patente norteamericana No. 5,169,766; M iier, 11. i. y colabo.t:radores, solicitud de PCT W089/06700; Kwoh, D. y co 1 abo radore s, Proc. Nati. Acad . Sci .
(U.S. A.) 86:1173 (1989) ; G i. ngera s , 'I 1. R. y colaboradores, solicitud de PCT W088/10 315) ) , o métodos de amplificación i so té rmica (Walker, G. 1. y colaboradores, Proc. Nati. Acad.
Sci. (U.S. A .) 89:392-396 ( 1992) ) tambi én puede ser utilizada. E: L método más ventajoso de amplificación de fragmentos de DNA que contienen 1 os SNPs de la invención emplea PCR (ver por ejemplo, las pa ten tes norteamericanas Nos. 4,965,188; 5,066,584 ; 5,338,671; • 5,348,853; 5,364, 790; 5,374, 553; 5,403, 707; 5,405,774; 5,418,149; 5,451,512; 5, 470,724; 5,487, 993; 5, 523, 225; 5, 527, 510; 5, 567, 583; 5, 567, 809; 5, 587, 287; b, 597, 910; 5, 602, 01 ; 5, 622, 820; 5, 658, 764 ; 5, 674 , 679; 5, 674, 738; 5, 681. , 741 ; 5, 702, 901; 5,710, 381 ; 5, 733, 751 ; 5,741 , 640; 5, 7 1 , 676; 5, 753, 67; 5,756,285; 5,776, 686; 5, 811,295; 5, 817, 797; 5,827, 657; 5,869,249; 5, 935, 522; 6, 001, 645; 6,015,53 ; 6, 015, 666; 6, 033, 854 ; 6, 043, 028; 6, 077, 664 ; 6, 090, 553; 6, 168, 918; 6, 174 , 668; 6, 174 , 670; 6, 200, 747 ; 6,225,093; 6, 232, 079; 6,261,431; 6,287,769; 6,306,593; 6,440,668; 6,468,743; 6,485,909; 6,511,805; 6,544,782; 6,566,067; 6,569,627; 6,613,560; 6,613,560 y 6,632,645; las descripciones de las cuales son incorporadas por referencia en sus totalidades), utilizando pares de cebadores que son capaces de hibridar a las secuencias próximas que definen o flanquean un sitio pol imórf i co en su forma de dob.l e hebra. Para realizar una reacción de amplificación mediada por polimerasa cíclica de acuerdo con la presente invención, los cebadores se hibridan o se recocen a hebras opuestas del DNA objetivo, la temperatura luego se eleva para permitir a la DNA polimerasa te rmoes table extender los cebadores y de esta manera replicar el segmento específico del DNA que abarca la región entre los dos cebadores, luego la reacción es te rmoc i c 1 acia de modo que cada cielo la cantidad que representa la secuencia entre los dos cebadores es duplicada, y la amplificación específica de la secuencia de DNA del gen ob está presente, resulta. Cualquiera de una variedad de polimerasas se pueden utilizar en la presente invención. Para reacciones termocíclicas , las polimerasas son polimerasas termoestables tales Taq, KienTaq, StoffeJ b'ragment, Deep Vent, Tth, Pfu, Vent, y UJ.Tma, cada una do las cuales son fácilmente disponibles a partir de fuentes comerciales. Para reacciones no termocí clicas , y en ciertas reacciones termocí clicas , la polimerasa frecuen temen Le será una de muchas polimerasas comúnmente utilizadas en el campo, y comercialmente disponibles, ta] como DN/\ poli, fragmento Klenow, DNA polimerasa T7 y DNA poiimerasa . La guia para el uso de tales polimerasas se puede encontrar fácilmente en la literatura de productos y en general las guias de biología molecular. Típicamen e, el recocido de Jos cebadores a la secuencia de DNA objetivo se lleva a cabo durante aproximadamen e 2 minutos a aproximadamente 37-55°C, la extensión de la secuencia de cebador por la enzima polimerasa (tal Taq polimerasa) en la presencia de trifosfatos de nucleósido se lleva a cabo durante aproximadamente 3 minutos a aproximadamente 70-75°C, y la etapa de desnaturalización para .liberar el cebador extendido se .lleva a cabo durante aproximadamen e 1 minuto a aproximadamente 90-9S°C. Sin embargo, estos parámetros pueden ser variados, y uno de habilidad en la técnica fácilmente sabría como ajusfar los parámetros de temperatura y de tiempo de la reacción para lograr los resultados deseados. Por ejemplo, los ciclos pueden ser tan cortos como 10, 8, 6, 5, 4.5, 4, 2, 1, 0.5 minutos o menos. También, las técnicas de "dos temperaturas" se pueden util izar donde las etapas de recocido y extensión ambas se pueden llevar a cabo a la misma temperatura, típicamente entre aproximadamente 60-65°C, para de esta manera reducir 1.a longitud de cada ciclo de amplificación y da por resultado un tiempo de ensayo más corto. Típicamente, las reacciones descritas en la presente se repiten hasta que se genera una cantidad detectable de producto. Frecuen emente, tales cantidades detectabl.es de producto están entre aproximadamente 10 ng y aproximadamente 100 ng, aunque cantidades más grandes, por ejemplo, 200 ng, 500 ng, 1 mg o más también pueden ser detectadas, por supuesto. F,n términos de la concentración, la cantidad de producto detectable puede ser de aproximadamente 0.01 pinol, 0.1 pinol, 1 pinol, 10 pinol, o más. Así, el número de ciclos de la reacción que se realiza puede ser variado, entre más ciclos se realicen, más producto amplificado es producido. En ciertas modalidades, la reacción comprende 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, o más ciclos. Por ejemplo, la reacción de PCR se puede llevar a cabo utilizando muestras de aproximadamente 25-50 . mu .1 que contiene aproximadamente 0.01 a 1.0 ng de secuencia de amplificación de plantilla, aproximadamente 10 a 100 pmol de cada cebador genérico, aproximadamente 1.5 unidades de Taq DNA polimerasa (Promega Corp.), dDATP de aproximadamente 0.2 mM, dCTP de aproximadamente 0.2 mM, dGTP de aproximadamente 0.2 mM, dTTP de aproximadamente 0.2 mM, MgCl.sub.2 de aproximadamente 15 mM, Tris-HCl de aproximadamente 10 mM (pH 9.0) , KC1 de aproximadamente 50 mM, aproximadamente 1 . mu.g/ml de gelatina, y aproximadamente 10 . mu.l/ml de Tritón X-100 (Saik:i , 1988) . Aquel Jos de habi lidad en la técnica están conscientes de la variedad de nucleótidos disponibles para el uso en las reacciones mediadas por polimerasa cíclica. Típicamente, ios nucleótidos consistirán por lo menos en parte de deoxinucleót ido trifosfatos (dNTPs) , que son de manera fácil comercia Imen te disponibles. Los parámetros para el uso óptimo de dNTPs también son conocidos para aquellos de habilidad en la técnica, y son descritos en la literatura. Además, un número grande de derivados de nucleótidos son conocidos para aquellos de habilidad en la técnica y se pueden utilizar en la presente reacción. Tales derivados incluyen nucleótidos fluo escentemente marcados, que permiten la detección del producto incluyendo tales nucleótidos marcados, como es descrito enseguida. También se incluyen en este grupo nucleótidos que permiten la secuenciación de ácidos nucleicos que incluyen tales nucleótidos, tales como nucleótidos de terminación de cadena, dideoxinucleótidos y nucleótidos resistentes a nucleasa boronada. Los equipos comerciales que contienen los reactivos más típicamente utilizados para estos métodos de secuenciación de DNA están disponibles y ampliamente utilizados. Otros análogos de nucleótidos incluyen nucleótidos con grupos de modificación de bromo o de yodo u otros grupos modificadores, que afectan numerosas propiedades de los ácidos nucleicos resultantes incluyendo su antigenicidad , su replicabilidad, sus temperaturas de fusión, sus propiedades de enlace, etc. Además, ciertos nucleótidos incluyen grupos laterales reactivos, tales como grupos sul fhidri lo , grupos animo, grupos N-bidoxisuccinimidilo, que permiten la modificación de los ácidos nucleicos que los comprenden. La presente invención proporciona oligonucleótidos que pueden ser utilizados como cebadores para amplificar secuencias de ácido nucleico especificas del gen ob en las reacciones de amplificación mediadas por polimerasa cíclica, tales como reacciones de PCR. Estos cebadores son útiles en la detección de los SNPs UASMS1, UASMS2 o UASMS3 en el promotor de leptina, y el SNP EX0N2-FB en el exón 2 del gen leptina. En ciertas modalidades, estos cebadores consisten de fragmentos de oi igonucleótido . Tales fragmentos deben ser de longitud suficiente para permitir el recocido o hibridación específica a la muestra de ácido nucleico. tas secuencias típicamente serán de aproximadamente 8 a aproximadamente 44 nucleótidos en longitud, pero pueden ser más largas. Secuencias más largas, por ejemplo, de aproximadamente 14 a aproximadamente 50, son ventajosas para ciertas modalidades. En modalidades donde se desea amplificar un fragmento de DNA que comprende los SNPs UASMS1, UASMS2 o UASMS3, los cebadores que tienen estiramien os contiguos de aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 nucleótrdos de la SEQ ID NO: 1 (la secuencia de promotor de ieptina) son contemplados. En modalidades donde se desea amplificar un fragmento de DNA que comprende el SNP EX.ON2-FB, los cebadores que tienen estiramientos contiguos de aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 (exón 2 del gen Ieptina) son contemplados. Aunque se pueden utilizar varias longitudes diferentes de cebadores, y .la ubicación exacta del estiramiento de nucleótidos contiguos en el gen Ieptina utilizado para hacer el cebador puede variar, es importante que las secuencias a las cuales recocen los cebadores delantero y trasero están localizados sobre cualquier lado de la posición de nucieótido particular que esta sustituida en el SNP a ser amplificado. Por ejemplo, cuando se diseñan cebadores para la amplificación del polimorfismo UASMS1 un cebador debe ser localizado corriente arriba de (no sobrepuesto con) la posición de nucieótido 207 del promotor de Ieptina (SEQ ID NO: 1, o 2) , y el otro cebador debe ser localizado corriente debajo de (no sobrepuesto con) la posición de nucieótido 207 del promotor de ieptina (SEQ ID NO: 1, o 2) . Cuando se diseñan cebadores para la amplificación del polimorfismo UASMS2, un cebador debe ser localizado corriente arriba de (no sobrepuesto con) la posición de nucleótido 528 del promotor de leptina (SEQ ID NO: 1, o 3) , y el otro cebador debe ser localizado corriente debajo de (no sobrepuesto con) la posición de nucleótido 528 del promotor de leptina (SEQ ID NO: 1, o 3) . De manera similar, cuando se diseñan cebadores para la amplificación del polimorfismo UASMS3 un cebador debe ser localizado corriente arriba de (no sobrepuesto con) la posición de nucleótido 1759 del promotor de leptina (SEQ ID NO: 1 o 4) y el otro cebador debe ser localizado corriente abajo de (no sobrepuesto con) la posición de nucleótido 1759. Finalmente, cuando se diseñan cebadores para la amplificación del polimorfismo EX0N2-FB un cebador debe ser localizado corriente arriba de (no sobrepuesto con) la posición de nucleótido 305 del e ón 2 (SEQ ID NO: 5) , y el otro cebador debe ser localizado corriente abajo de (no sobrepuesto con) la posición de nucleótido 305 del exón 2. En una modalidad preferida, un fragmento de DNA que abarca y contiene la ubicación del polimorfismo UASMS1 se amplifica a partir de una muestra de ácido nucleico utilizando un cebador delantero que tiene la secuencia 5'-GGCACAATCCTGTG' A TGGTAAGA- 3 ' (SEQ ID NO: 7), y un cebador trasero que tiene la secuencia 5 ' -GTCCATGTACCA'l'TGCCCAATTT- 3 ' (SEQ ID NO: 8) . De manera similar, en una modalidad preferida, un fragmento de DNA que abrí rea la ubicación del polimorfismo UASMS2 se amplifica a partir de una muestra de ácido nucleico utilizando un cebador delantero que tiene la secuencia 5'-AGGTGCCCAGGGACTGA- 3 ' - (SEQ ID NO : 11 ) , y un cebador trasero que tiene la secuencia 5 ' -CAACAAAGGCCGTGTGACA- 3 ' (SEQ ID N0:12) . Para la amplificación de un fragmento de DNA que abarca la ubicación del polimorfismo UAS S3, se prefiere que un cebador delantero que tiene la secuencia 5' -ATGTATATT OGTGTGAGAGTGTGTGT-B' (SEQ ID NO: 15) , y un cebador t asero que tiene la secuencia 5 ' - AGCTGGAAAGAACGGAT ATAAAATGGT- 3 ' (SEQ ID NO: 16) , sea u t :¡.1 izado. Del m smo modo, para la amplificación de un fragmento de DNA que abarca la ubicación del polimorfismo EX0N2-FB, se prefiere que un cebador delantero que tiene la secuencia 5 ' -GGCTTTGGCCCTATCTGTCTTAC- 3 ' (SEQ ID NO: 19) , y un cebador trasero que tiene la secuencia 5'- CTTGATGAGGGTT' I."GGG?'GTCA- 3 ' (SEQ ID NO: 20) , sea utilizado. Los métodos anteriores emplean cebadores localizados en cualquier lado de, y no sobrepuestos con el SNP con el fin de amplificar un fragmento de DNA que incluye la posición de nucieótido en la cual se localiza el SNP. Tales métodos requieren tapas adicionales, tal como la secuenciación del fragmento, o hibridación de sondas especificas de alelo al fragmento, con el fin de determinar el genotipo del sil; Lo poJ Lmórfico. Sin embargo, algunas modalidades de La presente invención, el método de amplificación es por si mismo un método para determinar el genotipo de] sitio polimórfico, como por ejemplo, en la "PCR especifica de alelo". Ln la PCR especifica de alelo, pares de cebadores se eligen tal que la amplificación misma es dependiente del ácido nucleico de plantilla de entrada que contiene el polimorfismo de interés. En tales modalidades pares de cebadores se eligen tai que por lo menos un cebador abarca la posición de nucleótido real del SNP y es por lo tanto un cebador de oliqonuc] eót ido especifico de alelo. Típicamente, los cebadores contienen un nucleótido específico de alelo individua] en el 3' terminal precedido por bases que son complementarias al gen de interés. Las condiciones de reacción de PCR se ajustan tal que la amplificación mediante una DNA polimerasa procede de las terminaciones 3' -cebador igualadas, pero no procede donde ocurre una desigualación. La PCR específica de alelo se puede realizar en la presencia de dos cebadores específicos de alelo diferentes, un específico para cada alelo, donde cada cebador es marcado con un tinte diferente, por ejemplo, un cebador específico de alelo que puede ser marcado con un tinte verde (por ejemplo, fluoresceí na ) y el otro cebador específico de alelo marcado con un tinte rojo (por e jemplo, su 1 Fo rhodamina ) . Después de la amplificación, los productos se analizan para la fluorescencia verde y roja. El objetivo es para un genotipo homocigoto para producir fluorescencia verde solamente, el otro genotipo homocigoto para dar fluorescencia roja solamente y el genotipo heterocigoto para dar fluorescencia mezclada de rojo y verde. Asi, para realizar la PCR especifica de alelo para detectar el polimorfismo UASMS1, un cebador debe sobreponer la posición de nucleótido 207 de SEQ ID NO:l o SEQ ID NO:2 tal que la posición de nucleótido 207 está en el 3' terminal de cebador. De manera similar, para realizar la PCR especifica de alelo para detectar el polimorfismo UASMS2, un cebador debe sobreponer la posición de nucleótido 528 de SEQ ID N0:1 o SEQ ID NO:3 tai que la posición de nucleótido 528 está en el 3' terminal del cebador. Para realizar la PCR especifica de alelo pa a detectar el polimorfismo UASMS3, un cebador debe sobreponer Ja posición de nucleótido 1759 de SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 4 tal que la posición de nucleótido 1759 está en el 3' terminal del cebador. Finalmente, cuando se diseñan cebadores específicos de alelo para la detección del polimorfismo EXON2-FB, un cebador debe sobreponer .la posición de nucleótido 305 de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 tal que la posición de nucleótido 305 está en el 3' terminal del cebado . Eos métodos para rea] iza la PCR específica de alelo son bien conocidos en la técnica, y cualquiera de tales métodos pueden ser utilizados. Por ejemplo, métodos adecuados se diseñan en Myakishev y colaboradores Genome Research, vol 1, p 163-169 (2001) , Alexander y colaboradores Mol Biotechnol. vol 28(3), p 171-174 (2004) , y Ruano y colaboradores Nucleic Acids Res. vol 17(20) , p 8392 (1989) , los contenidos de las cuales son incorpo ados por referencia. En algunas modalidades de la presente invención, los cebadores específicos de alelo son seleccionados de modo que la ampli icación crea un sitio de restricción, facilitando la identificación de un sitio polimó t: f ico . Para realizar la PCR específica de alelo, las condiciones de reacción deben ser cuidadosamente ajustadas tal que el cebador específico de alelo solamente enlazará un alelo y no el alelo alternativo, por ejemplo, en algunas modalidades las condiciones se ajustan de modo que los cebadores solamente enlazarán donde hay un 100% de igualación entre la secuencia de cebador y el DNA, y no enlazará si hay una sola desigualación de n uc1eó 11do . En ciertas modalidades de la presente invención, la detección de un SNP dado se puede realizar utilizando sondas de oligonucleótido que enlazan o hibridan al DNA. La presente invención proporciona sondas de oligonucleótido para detectar los SNPs UASMS1, UAS1MS2 o UAS1MS 3 en el promotor de leptina bovino, o el SNP EXON2-FB en el exón 2 del gen de leptina bovino .
En ciertas modalidades, estas sondas consisten de fragmentos de oiigonucleóti do . Tales fragmentos deben ser de longitud suficien e para proporcionar hibridación especifica a la muestra de ácido nucleico. Las secuencias típicamente serán de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleótidos, pero pueden ser más largas. Las sondas de ácido nucleico que tiene estiramientos continuos de aproximadamente 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 nucleótidos de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO:l (promotor de leptina bovino de tipo silvestre) , SEQ ID NO:2 (promotor de leptina bovino con el polimorfismo UASMS1) , SEQ ID NO: 3 (promotor de leptina bovino con el polimorfismo UASMS2) , SEQ ID NO:4 (promotor de leptina bovino con el polimorfismo UAS1 S3 ) , SEQ ID NO:5 (exón 2 de leptina bovino de tipo silvestre) o SEQ ID NO: 6 (exón 2 de leptina con el polimo fismo EXON2-FB) son contemplados. Aunque diversas longitudes diferentes de sondas pueden ser utilizadas, y la ubicación precisa del estiramiento de nucleótidos contiguos en el gen leptina de la cual se deriva la secuencia de sonda puede variar, la secuencia de sonda puede abarcar la posición de nucleótido particular que es sustituida en el SNP particular a ser detectado. Por ejemplo, las sondas diseñadas para la detección del polimo fismo UASMS1 bovino deben abarcar la posición de nucleótido 207 del promotor de leptina bovino (SEQ ID NO: 2) . Las sondas diseñadas para la detección del polimorfismo U/\SIMS2 bovino deben abarcar la posición de nucleótido 528 del promotor de leptina bovino (SEQ ID N0:3) . De manera similar, las sondas diseñadas para la detección del polimorfismo U/-\SMS3 bovino deben abarcar la posición de nucleótido 1759 del promotor de leptina bovino (SEQ ID NO: 4) . Finalmente, las sondas diseñadas para la detección del polimorfismo exon2-FB bovino deben abarcar la posición 305 del exón 2 deJ gen Leptina bovino (SEQ lü NO: 6) . Estas sondas serán útiles en una variedad de modalidades de hibridación, tal como el manchado de Southern, manchado de Northern y el análisis de interrupción de hibridación. 'Tamb én las sondas de la invención se pueden utilizar para detectar SNLJs en secuencias amplificadas, tales como productos de 1JC amplificados generados utilizando los cebadores descritos en Lo anterior. Por ejemplo, en una modalidad, primero se amplifica un ácido nucleico objetivo, tal como mediante PCR o la amplificación de desplazamiento de hebras (SDA) , y el producto de DNA de doble hebra amplificado luego se desnatu aliza y se híbrida con una sonda. En ot a modalidad, el DNA de doble hebra (amplificado o no amplificado) es desnaturali ado e hibridado con una sonda de La presente invención y luego el complejo de hibridación es sometido a condiciones desestabilizantes o de interrupción. Ai. determinar el nivel de energía de interrupción requerida en donde la sonda tiene diferente energía de interrupción para un a Le] o como es comparado con otro alelo, el genotipo de un gen en una posición polimórfica puede ser determinado. En un ejemplo, puede haber energía de interrupción menor, por ejemplo, temperatura de fusión, -para un alelo que alberga un residuo de citosina en una posición polimórfica, y una energía requerida más alta para un alelo con un residuo de tirnina en esa posición polimórfica. Esto se puede lograr donde la sonda iene ] 00% de homología con un alelo (una sonda perfectamente igualada) pero tiene una sola desigualación con el alelo alternativo. Puesto que la sonda perfectamente igualada es enlazada más herméticamente al DNA objetivo que la sonda desigualada, esto requiere más energía para causar que se disocie la sonda hibridada. En una modalidad las condiciones desestabilizantes comprenden una elevación de temperatura. Entre más alta sea la temperatura, mayor es el grado de desestabilización. En otra modalidad, las condiciones desestabilizantes comprenden someter el completo de hibridación a un gradiente de temperatura, mediante lo cual conforme se incrementa la temperatura, se Incrementa el grado de desestabilización. En una modalidad alternativa, las condiciones desestabilizantes comprenden el tratamiento con un compuesto desestabilizante, o un gradiente que comprende cantidades incrementadas de tal compuesto. Los compuestos desestabilizantes adecuados incluyen, pero no están limitados a, sales y urea. Métodos de desestabilización y desnaturalización de complejos de hibridación son bien conocidos en la técnica, y cualquiera de tales métodos se puede utilizar de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, los métodos de desestabilización y desnaturalización de complejos de hibridación son enseñados por Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2d ecl . (1989) . Para la detección óptima de desigualaciones de pares de - bases individuales, es preferible que haya aproximadamente una diferencia de 1°C a aproximadamente a 10°C en la temperatura de fusión del complejo de DNA de sonda cuando se enlaza a un alelo como es opuesto al alelo alternativo en el sitio polimórf ico . Asi, cuando la temperatura es elevada arriba de la temperatura de fusión de un dúplex de sonda : DNA correspondiente a uno de los alelos, esa sonda se d i soc.ia á . En una modalidad del método anterior, una segunda sonda ("fijadora") puede ser utilizada. Generalmente, la sonda fijadora no es especifica a cualquier alelo, pero híbrida sin considerar qué nucl.eótido está presente en la posición polimórf ica . La sonda fijadora no afecta la energía de interrupción requerida para disociar el complejo de hibridación sino, en cambio, contiene una marca complementa ia para la u iliza ión con la primera sonda ("sensora") , por ejemplo para el uso en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia o "FRET." Una sonda sensora adquiere energía de la sonda fijadora una vez que las condiciones adecuadas para la hibridación entre el DNA objetivo y Las sondas fijadora y sensora. Una vez que ocurrió la hibridación, la sonda sensora transfiere su energía de fluorescencia a la sonda sensora que solamente emitirá una longitud de onda específica después de que ha adquirido la energía de la sonda fijadora. La detección de SNP ocurre conforme la temperatura es elevada a una proporción predeterminada, y una lectura es adquirida de la luz fluorescente emitida. Si hay una sola desigualación de base de la sonda y el DNA objetivo causado por la presencia del nucleótido polimó G ico alternativo (es decir, el SNP), la sonda sensora se disociará más rápido, o una temperatura menor, puesto que la homología del DNA genómico y la sonda sensora será menor que aquella del DNA genómico que no alberga el nucleótido alterado SNP. Así, habrá una pérdida de fluorescencia que puede ser detectada. Donde la sonda es diseñada para enlazar a la secuencia de tipo silvestre, la disociación de la sonda a partir del DNA (es decir, la "función") ocurrirá a una temperatura menor si el SNP está presente, puesto que la estabilidad del enlace de la sonda al SNP es ligeramente menor que para la secuencia de tipo silvestre. Esto ocurre, obviamente, sobre ambos cromosomas al mismo tiempo, pero siendo de esta manera ya sea una lectura de dos temperaturas de fusión idénticas para un homocigoto, o una lectura de dos diferentes temperaturas de fusión para el heterocigo o . Por ejemplo, donde una sonda es diseñada para tener la secuencia del alelo que contiene C del polimorfismo UASMS1, la sonda se disociará o fundirá a una temperatura menor en las muestras de DNA de individuos que albergan dos copias del alelo que contiene T poi imór.f ico, que individuos que albergan dos copias del alelo que contiene C. En otras modalidades, dos diferentes "sondas especificas de alelo" se puede utilizar para el análisis de un SNP, una primera sonda especifica de alelo para la detección de un alelo, y una segunda sonda especifica de alelo para la detección del alelo alternativo. Por ejemplo, en una modalidad los diferentes alelos del polimorfismo ob UASMS1 se pueden detectar utilizando dos sondas especificas de alelo diferentes, una para detectar el alelo que contiene T en la posición de nucleótido 207 del promotor del gen ob, y otro para detectar el alelo que contiene C en la posición de nucleótido 207 del promotor de gen ob . En una modalidad preferida una sonda de ol igonucleót i.do que tiene la secuencia de 5 ' -CTTTCACCTAGTATA CTAG-3 ' (SEQ ID NO: 9) se utiliza para detectar el alelo que contiene T, y una sonda de oligonucleótido de la secuencia de 5 ' -TCTi'L'CACCTAGTATGTCTAG-3' (SEQ 113 NO: 10) se utiliza pa a detectar el alelo que contiene C. En otra modalidad, los diferentes alelos del polimorfismo UASMS2 se pueden detectar utilizando dos sondas especificas de alelo diferentes, una para detectar el alelo que contiene T en la posición de nucleótido 528 del promotor de gen ob y otra para detectar el alelo que contiene C en la posición de nucleótido 528 del promotor de gen ob. En una modalidad preferida una sonda de oligonucleótido que tiene la secuencia de 5 ' -AAGCTCTAGAGCCTATGT-3 ' ( SEQ ID NO: 13) se utiliza para detectar el alelo que contiene 'i, y una sonda de oligonucleótido que tiene la secuencia de 5'-CAAGC'IC'l'AGAGCCTGTGT- 3 ' (SEQ ID NO: 14) se utiliza para detec ar: e i alelo que con l; i ene C . En o ra modalidad, los diferen es alelos del polimorfismo de ob UASMS3 se pueden detectar utilizando dos sondas especificas de alelo diferentes, una para detectar el alelo que contiene G en la posición de nucleótido 1759 del promotor de gen ob, y otra para detectar el alelo que contiene C en la posición de nucleótido 1759 del promotor del gen ob. En una modalidad preferida una sonda de oligonucleótido que tiene la secuencia de 5'-CACACATTCCAATCAA- 3 ' (SEQ ID NO: 17) se utiliza para detectar el alelo que contiene G y una sonda de oligonucleótido que tiene la secuencia de 5 ' -CACAI'I'GCAATCAA-3 ' (SEQ ID NO: 18) se utiliza para detectar el alelo que contiene C.
En una modalidad adicional los diferentes alelos del polimorfismo ob EXOM2-FB se pueden detectar utilizando dos diferentes sondas específicas de alelo, una para detectar el alelo que contiene T en la posición 305 del exón 2 del gen ob y otra para detectar el alelo que contiene C en la posición de nucleótido 305 del exón 2 del gen ob. En una modalidad preferida una sonda de ol igonucleótido que tiene la secuencia de 5 ' -CCTTGCAGATGGG- 3 ' (SEQ ID NO: 22) se utiliza para detectar el alelo que contiene T, y una sonda de oligonucleót do que tiene la secuencia de 5' -CCTTGCGGATGGG-3' (SEQ ID NO: 23) se utiliza para detectar el alelo que contiene C . Cualquiera que sean las secuencias de sondas y métodos de hibridación utilizados, un experto en la técnica puede fácilmente determinar las condiciones de hibridación adecuadas, tales como temperatura y condiciones químicas. Por ejemplo, para aplicaciones que requieren alta selectividad, típicamente se desean emplear condiciones relativamente severas para las reacciones de hibridación, por ejemplo, un experto seleccionará condiciones de relativamente baja sal y/o de alta temperatura, tal como es proporcionado por aproximadamente 0.02 I a ap oximadamente 0.10 M de NaCl a temperaturas de aproximadamente 50 C a aproximadamente 70 C. Tales condiciones de severidad toleran poca, si la hay, desigualación entre la sonda y la plantilla o hebra objetivo, y son particularmente adecuadas para detectar SNPs específicos de acuerdo con la presente invención. Se aprecia en general que las condiciones se pueden volver más severas mediante la adición de cantidades incrementadas de formamida. Otras variaciones en las condiciones de reacción de hibridación son bien conocidas en la técnica (ver por ejemplo, Sambrook y colaborado es, Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2d ed . (1989) ) . Además de ios SNPs descritos en lo anterior, será apreciado por aquellos expertos en la técnica que otros polimorfismos de secuencia de DNA de] gen ob pueden existir dentro de una población. Tales variaciones alélicas naturales típicamente pueden dar por resultado aproximadamente 1-5% de variación en la secuencia de nucleótido del gen. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 proporciona una secuencia de una región del promotor de gen ob que contiene un polimorfismo en la posición de nucieófido 20'7 (es decir, el SNP UASMS1) . Es posible que otras posiciones polimórficas también pueden existir dentro de este fragmento. Además de las variantes alélicas que ocurren naturalmente de la secuencia de nucieótidos, la persona experta además apreciará que se pueden introducir cambios mediante la mutación en la secuencia de nucieótidos de las secuencias de nucieótidos descritos en la presente. Cualquiera y todas de tales variaciones de nucieótidos adicionales se proponen para estar dentro del alcance de la invención. Asi, por ejemplo, una sonda de acuerdo con la presente invención se puede diseñar para enlazar a una secuencia del gen ob que contiene no solamente el polimorfismo UASMS1, sino también otros SNPs que pueden ocurrí r den ro de la misma región. Por otra parte, las moléculas de ácido nucleico que difieren de las secuencias de ios cebadores y sondas divulgadas en la presente, se proponen para estar dentro del alcance de la invención. Las secuencias de ácido nucleico que son complementarias a estas secuencias, o que son hibridables a las secuencias descritas en la presente bajo condiciones de hibridaciones estándar o severas y también análogos y derivados también se proponen para estar dentro del alcance de la invención. Venta osamen e, ta] es variaciones diferirán de las secuencias descritas en la presente por solamente un número pequeño de nucleótidos, por ejemplo por 1, 2 o 3 nuc1eó t idos . Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes aléiieas naturales, homólogos (es decir, ácidos nucleicos derivados de otras especies) u otras secuencias relacionadas (por ejemplo, pará.logos) de las secuencias descritas en la presente se pueden aislar basado en su homología a los ácidos nucleicos divulgados en la presente, por ejemplo, al realizar reacciones de hibridación estándares o severas utilizando toda una porción de las secuencias de la invención como sondas. 'Tales métodos para la hibridación y clonación de ácido nucleico son bien conocidos en la técnica. De manera similar, una molécula de ácido nucleico de la invención puede incluir solamente un fragmento de la secuencias especificas descritas. Los fragmentos propo cionados en ia presente se definen como secuencias de por lo menos 6 ácidos nucleicos (contiguos) , una longitud suficiente para permitir la hibridación especifica de cebadores o sondas de ácido nucleico y son en la mayoría alguna porción menor que una secuencia de Longitud completa. Los f agmentos pueden ser derivados de cualquier porción contigua de una secuencia de ácido nucleico de elección. Los derivados y análogos pueden ser de longitud completa o diferente longitud completa, si el derivado o análogo contiene un ácido nucleico o aminoácido modificado, como es descrito enseguida. Derivados, análogos, homólogos y variantes de los ácidos nucleicos de la invención incluyen, pero no están limitados a, moléculas que comprenden regiones que están sustancialmente homologas a los ácidos nucleicos de la invención, en varias modalidades, por al menos aproximadamente 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o aun 99% de identidad (con una identidad ventajosa de 80-99%) sobre una secuencia de ácido nucleico de tamaño idéntico o cuando se compara con una secuencia alineada en la cual la alineación se hace mediante un programa de homología de computadora conocida en la técnica. Para los propósitos de La presente invención, la identidad u homología de secuencia se determina al comparar las secuencias cuando se alinean para maximizar la sobreposición en la identidad mientras que se minimizan los espacios de secuencia. En particular, la identidad de secuencia se puede determinar utilizando cualquiera de un número de algoritmos matemáticos. Un ej-emplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias os el algoritmo de Karlin & Aitschul, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1990; 87:2264-2268, modificado como en Karlin & Aitschul, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1993; 0: 5873-5877. Otro ejemplo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers & Miller, CABIOS 1988; 4:11-17. Tal algoritmo es incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineación de secuencia GCG . Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, una tabla de residuos de ponderación PAM120, una sanción de longitud de espacio de 12 y sanción de espacio de 4 puede ser utilizado. Todavía otro algoritmo útil para identificar regiones de similitud de secuencia local y alineaciones es al algoritmo FASTA como es descrito en Pearson & Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 1988; 85:24 4-2 8.
Ventajoso para el uso de acuerdo con la presente invención es el software WU-BLAST (Washington University BLAST) versión 2.0. Los programas ejecutables de WU-BLAST versión 2.0 para varias plataformas UNIX pueden ser descargadas de ftp://bJast.wustl.edu/blast/executables. Este programa está basado sobre WU-BLAST versión 1.4, que a su vez está basado en el NCBI-BLAST versión 1.4 de dominio público (Altschul & Gish, 1996, Local aiignment statistics, Doolittle ed., ethods in Enzymology 266: 60- 80; Altschul y colaboradores, Journal of Molecular Biology 1990; 215:403-410; Gish & States, ] 993 ; a ture Genetics 3:266-272; Karlin & Altschul, 1993; Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90:5873-5877; todas las cuales son incorporadas por referencia en la presente) . En todos ios programas de búsqueda en el sitio de las rutinas de alineación espaciadas están integrales a la búsqueda de base de datos misma. El espaciamiento puede ser apagado si es deseado. La sanción de error (Q) para una sanción de longi tud uno es Q=9 para proteínas y BLASTP y Q=10 para BLASTN, pero puede ser cambiada a cualquier número entero. La sanción por residuo de error para la extensión de un espacio (R) es R-2 p ra proteínas y BLASTP y R=10 para BLASTN, pero puede ser cambiado a cualquier número entero. Cualquier combinación de valores para Q y R se puede utilizar con el fin de alinear secuencias para maximizar la sobreposición e identidad mientras que se minimizan los espacios de secuencia. La mat iz de comparación de aminoácidos de error es BLOSUM62, pero se pueden utilizar otras matrices de comparación de aminoácidos tal como PA . Alternativamente o adicionalmente, el término "homología" o "identidad" por ejemplo, con respecto a una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, puede indicar una medida cuantitativa de homología entre dos secuencias. El por ciento de homología de secuencia puede ser calculado como (Nref-Ndif) *100/-Nref, en donde Ndif es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en donde Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por consiguiente, la secuencia de DNA AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencia de 75% con la secuencia AATCAATC (Nre/;=8; dlf=2) . "Homología" o "identidad" puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos divididos entre el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en donde la alineación de las dos secuencias puede ser determinada de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur & Lipman, Proc Nati Acad Sci USA 1983; 80:726, incorporada en la presente por referencia) , por ejemplo, utilizando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de -i nucleótidos, y una sanción de espacio de ? y el anáJ i s.i s as stido por computadora y la interpretación de los datos en secuencia que incluyen la alineación puede ser convenientemen e realizados utilizando programas comercialmente disponibles (por ejemplo, Intelligenetics . TM . Suite, Intelligenetics Inc. CA) . Cuando las secuencias de RNA se dicen que son similares, o tienen un grado de identidad u homología de secuencia con las secuencias de DNA, la timidina (T) en la secuencia de DNA se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de RNA. Asi, la secuencia de RNA están dentro del alcance de la invención se pueden derivar de secuencias de DNA, por timidina (T) en la secuencia de DNA que es considerada igual a uracilo (U) en la secuencia de RNA. Sin experimentación indebida, la persona experta puede consultar con muchos otros programas o referencias pa a determinar el por ciento de homología. Los cebadores y sondas descritos en la presente se pueden preparar fácilmente mediante, por ejemplo, sintetización directa del fragmento por medios químicos o al introducir secuencias seleccionada en vectores recombinantes para producción recornbi na n te . Los métodos para hacer un vector o recombinantes o plásmidos para la amplificación del fragmento ya sea in vivo o in vi tro pude ser cualquier método deseado, pro ejemplo, un método que es mediante un análogo a los métodos divulgados en, o divulgados en los documentos citados en: patentes norteamericanas Nos. 4,603,112; 4,769,330; 4,394,448; 4,722,848; 4,745,051; 4,769,331; 4,945,050; 5,494,807; 5,514,375; 5,744,140; 5,7 4,1 1; 5,756,103; 5, 762, 938; 5,766,599; 5, 990, 091; 5,174, 993; 5, 505, 941; 5, 338, 683; 5, 494, 807; 5, 591, 639; 5,589, 466; 5, 677, 178; 5,591,439; 5, 552, 143; 5,580,859; 6, 130, 066; 6,004,777; 6,130,066; 6, 497, 883; 6, 464 , 984 ,· 6,451,770; 6, 391, 314; 6 , 387 , 376 ; 6,376,473 ; 6, 368, 603; 6, 348, 196; 6, 306, 00; 6,228,846; 6, 221, 362; 6,21 ,883; 6, 207, 166; 6,207, 165; 6,159, 77; 6, 153, 199; 6,090,393; 6, 07 , 649; 6,045,803; 6, 033, 670; 6,485,729; 6, 103, 526; 6,224,882; 6,312,682; 6,348,450 and 6; 312,683; so1 ci tud de patente norteamericana No. de serie 920,197, presentada el 16 de octubre de 1986; WO 90/01543; W091/11525; WO 94/16716; O 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; F,P 0 370 573; Andreansky y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996; 93:11313-11318; Ballay y colaboradores, ?', ?? J. 1993; 4:3861-65; Feigner y colaboradores, J. Biol. Chem. 1994; 269:2550-2561; Frolov y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996;93:11371-11377; Graham, Tibtech 1990; 8:85-87; Grunhaus y colaboradores, Sem. Virol. 1992; 3:237-52; Ju y colaboradores, Diabetologia 1998; 41:736-739; Kitson y colaboradores, J". Virol. 1991; 65:3068-3075; McClements y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996; 93:11414-11420; Moss, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996; 93:11341-11348; Paoletti, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1996; 93:11349-11353; Pennock y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 1984; 4:399-406; Richardson (Ed) , Methods in Molecular Biology 1995; 39, "Baculovirus Expression Protocols," Humana Press Inc.; Smith y colaboradores (1983) Mol. Cell. Biol. 1983; 3:2156-2165; Robertson y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sel. USA 1996; 93:11334-1 340; Robinson y colaboradores, Sem. Immunol. 1997 ; 9:271; y Roizman, Proc. Nati. Acad. Sel. USA 1996; 93:11307-11312. Las secuencias de o 1 igonuc leó t ido utilizadas como cebadores o sondas de acuerdo con la presente invención pueden ser marcadas con una porción detectadle. Como se utiliza en la presente el término "sensores" se refiere a tales cebadores o sondas marcadas con una porción detectadle. Varias porciones de marcación son conocidas en la técnica. La porción puede ser, por ejemplo, una radiomarca (por ejemplo, H, I, S, -"C, P, etc.) , en ima detectadle (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatase alcalina, etc.) , un tinte fluorescente (por ejemplo, isotiociana to de fluoresceina , rojo de Texas, rodamina, Cy3, Cy5, Bodipy, Bodipy ar Red, Lucifer Yellow, Bodipy 630/650-X, Bodipy R6G-X and 5-CR 6G y los similares) , una marca color imétrica tal como oro coloidal o vidrio o plástico coloreado (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.) , cuentas, o cualquier otra porción capaz de generar una señal detectadle tal como una señal coló rimé trica , fluorescente, quimioluminiscente o elect roquirn i.o.1 urm niscente (ECL) .
Los cebadores o sondas pueden ser marcados directamente o Indirectamente con una porción detectable, o sintetizados para incorporar la porción detectable. En una modalidad, una marca detectable se incorpora en ácido nucleico durante por lo menos un ciclo de una reacción de amplificación mediada por polimerasa cíclica. Por ejemplo, las polimerasas se pueden utilizar para incorporar nucleótidos fluorescentes durante el curso de las regiones de amplificación mediadas por polimerasa. Alternativamente, los nucleótidos fluorescentes pueden ser incorporados durante la síntesis de cebadores o sondas de ácido nucleico. Para marcar un oligonucí eótido con el t.inte fluorescente, se puede utilizar uno de los métodos de marcación convencionalmente conocidos (Nature Biotechnology , ]4, 303-308, 1996; Applied and Envi ronmental Microbiology , 63, 1143-1147, 1997; Nucleic Acids Research, 24, 4532-4535, 1996) . Una sonda ventajosa es una marcada con un tinte fluorescente en el extremo 3' o 5' que contiene G o C como Ja base en el extremo marcado. Si el extremo 5' es marcado y el 3' no es marcado, el grupo OH sobre el átomo C en la posición 3' de la ribosa o deoxiribosa del extremo 3' se puede modificar con un grupo fosfato o los similares aunque no se impone limitación a este respecto. Los medios especf oscópicos , fotoquímicos , bioquímicos, inmunoquímicos , eléctricos, ópticos o químicos se pueden utilizar para detectar tales marcas. El dispositivo y método de detección puede incluir pero no está limitado a, formación de imagen óptica, formación de imagen en electrónica, formación de imagen con una cámara CCD, formación de imagen óptica integrada y espectrometría de masa. Además, la cantidad de sonda marcada o no marcada enlazada al objetivo puede ser cuantif icada . Tal cuantificación puede incluir el análisis estadístico. En otras modalidades la detección puede ser por la vía de diferencias de conductividad entre sitios concordantes y discordantes, mediante enfriamiento, mediante perturbación de fluorescencia de análisis o mediante el transporte de electrones entre moléculas donadoras y aceptoras. En todavía otra modalidad, la detección puede ser por la vía de t ansferencia de energia entre moléculas en los complejos de hibridación en reacciones de PCR o de hibridación, tal como mediante la transferencia de energía de fluorescencia (FET) o la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (ERET) . En los métodos de FET y FRET, una o más sondas de ácido nucleico son marcadas con moléculas fluo escentes, una de las cuales es capaz de actuar como un donador de energía y la otra de las cuales es una molécula aceptora de energía. Hay algunas veces conocido como una molécula reportadora y una molécula enfriadora respectivamente. La molécula donadora es excitada con una longitud de onda de luz específica para la cual normalmente S2 exhibirá una longitud de onda de emisión de fluorescencia. La molécula aceptora también se excita en esta longitud de onda tal que pueda aceptar la energía de emisión de la molécula donadora por una variedad de mecanismos de transferencia de energía dependientes de Ja distancia. Generalmente, la molécula aceptora acepta la energía de emisión de la molécula donadora cuando están en estrecha proximidad (por ejemplo, sobre la misma, o una molécula cercana) . Las técnicas FET y FRET son bien conocidas en la técnica y se pueden utilizar fácilmente para detectar los SNPs en la presente invención. Ver por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,668,648, 5,707,80 , 5,728,528, 5,853,992 y 5,869,255 (para una descripción de tintes FRET) , 'tyagi y colaboradores Nature Biotech, voi . 14, p 303-8 (1996) y Tyagi y colaboradores, Nature Biotech, vol 16, p 49-53 (1998) (para una descripción de guías moleculares para FET) y Mergny y colaboradores Nuciere Acid Res. vol 22, p 920-928, (1994) y Wolf y colaboradores PNAS vol 85, p 8790-94 (1988) para descripciones y métodos generales de FET y FRET) , cada una de las cuales es incorporada en Ja presente por referencia. Los cebadores y sondas de oligonucleótido de la presente invención tienen aplicaciones comerciales en equipos de diagnóstico para la detección de los SNPs del gen ob UASMS1, UASMS2, UASMS3 y EXON2-FB en muestras de ganado. Un equipo de prueba de acuerdo con Ja invención puede comprender cualquiera de los cebadores o sondas de oiigonucleótido de acuerdo con la invención. Tal equipo de prueba adicionalmente puede comprender uno o más reactivos para el uso en las regiones de amplificación mediadas por polimerasa cíclica, tales como DNA polime rasas , nucleótidos (dNTPs) , soluciones reguladoras y los similares. Un equipo de detección de SNP también puede incluir, una solución reguladora Usante para lisar las células contenidas en la muestra. Un equipo de prueba de acuerdo con la invención puede comprender un par de cebadores de oiigonucleótido de acuerdo con la :i nvención y una sonda que comprende un oiigonucleótido de acuerdo con la invención. En algunas modalidades, tal equipo contendrá dos sondas de oiigonucleótido especificas de alelo. Venta osamente el equipo además puede comprender medios adicionales, tales como reactivos, para detectar o medir el enlace o los cebadores o sondas de la presente invención y también idealmente un control positivo y negativo. La presente .invención además abarca sondas de acuerdo con la presente invención que son inmovilizadas sobre un soporte sólido flexible, tal como papel, nylon u otro tipo de membrana, filtro, microplaqu i ta , platina de vidrio, microplaqui tas , microcuentas o cualquier otra matriz de tal clase, todas las cuales están dentro del alcance de esta invención. La sonda de esta forma es ahora llamada un "chip de DNA" . Estos chxps de DNA se pueden utilizar para analizar los SNPs de la presente invención. La presente invención además abarca arreglos o microarreglos de moléculas de ácido nucleico que están basadas sobre una o más de las secuencias descritas en la presente. Como se utiliza en la presente "arreglo" o "microarreglo" se refiere a un arreglo de distintos polinucleótidos u oligonucleótidos sintetizados sobre un soporte sólido flexible, tal como papel, nylon u otro tipo de membrana, filtro, ch.i.p, platina de vidrio o cualquier otro soporte sólido adecuado. En una modalidad, el microarreglo se prepara y se utiliza de acuerdo con los métodos y dispositivos descritos en las patentes norteamericanas Nos. 5,446,603; 5,545,531; 5,807,522; 5,837,832; 5,874,219; 6,114,122; 6,238,910; 6,365,418; 6,410,229; 6,420,114 ; 6,432,696; 6,475,808 y 6,489,159 y la publicación de PCI No. WO 01/45843 A2 , las descripciones de las cuales son incorporadas por referencia en sus totalidades . Como es descrito en detalle en lo anterior, la presente invención proporciona reactivos y métodos para la detección de los SNPs UASMS1, UASMS2, UASMS3, E2JW y EXON2-FB y el SNP F279Y de bGHr en muestras de DNA obtenidas de animales individuales. Por ejemplo, utilizando los métodos de la presente invención, se puede determinar si un animal dado tiene una citosina o una timina en la posición UASMS1 polimórfica (.Localizada con la posición de nucleótido 207 del promotor del gen ob) . Habiéndose utilizado los métodos de la invención para determinar el genotipo de un animal de interés en ya sea el UASMS1, UASMS2, UASMS3, E2JW y/o EXON2-FB una posición polimórfica, es además un objetivo de la presente invención utilizar esta información de genotipo para seleccionar y/o agrupar animales de acuerdo con su genotipo. Como es descrito en los Ejemplos, ciertos alelos de los SNPs UASMSl, UAS1 S2, UASI S3, E2JW y EXON2-FB y el SNP F279Y de bGHr, están asociados con ciertos atributos económicamente importantes tales como niveles de leptina circulante, ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valia y composición del canal, y rendimiento de leche. Por ejemplo, la presente invención demuestra que el alelo T de la posición UASMS2 está significativamente asociado con la concentración de leptina en el suero, que es más baja en animales homocigotos con el genotipo CC, intermediaria en los animales heterocigotos con el genotipo CT y más alta en los animales TT homocigotos. La asociación de los genotipos para SNP en el gen leptina con los atributos de calidad del canal y de la carne en el ganado para carne de res se examinó, asi como el SNP F279Y de bGHr con Los atributos de desempeño del ganado lechero. Cinco SNPs ( UASMSl , UASMS2 , UAS1 S3, E2JW y EXON2-FB) se determinaron en genotipo sobre toros cruzados, vaquillas y novillos. Los atributos medidos incluyeron grasa, rendimiento de carne magra y huesos (%) mediante la disección de la costilla parcial, grado de grasa, área del músculo longissimus (LM) , peso del canal caliente,' grado de calidad, grasa in ramuscular LM y evaluación de blandura de Lm y el músculo semitendinoso . Solo cuatro SNPs se analizaron (UASMS1, UASMS2, E2 JW y EX0N2-FB) , debido a que UASMS1 y UASMS3 se enlazaron completamen e. Un modelo de animal de herencia mezclada un va riada se utilizó para evaluar la asociación de los genotipos o haplotipos SNP con los atributos. Los dos SNPs del exón 2 de leptina se han asociado con el rendimiento de grasa y carne magra y el grado de grasa (E2JW, P < 0.01; EXON2-FB, P < 0.05) y ellos interaccionaron en su efecto sobre la blandura del músculo longissimus (LM) (P < 0.01) . Los SNPs del promotor de leptina ya sea que no estuvieron asociados con cualquiera de os atributos (UASMS2) o con solamente el rendimiento de grasa (UASMSl) . Tres haplotipos (TCAC, CCAT, T AC) estuvieron a alta frecuencia en la población (88%) y tuvieron efectos similares sobre todos los atributos. Comparados con los haplotipos comunes, una haplotipo (CCl'T) mostró un efecto significativamente diferente sobre el rendimiento de grasa (FATYL) , grado de grasa (GFAT) y rendimiento de carne magra (LEANYL) (P < 0.01) y un haplotipo (TTTT) sobre .la blandura de LM (P < 0.03) . Por lo tanto, se detectaron asociaciones importantes entre los polimorfismos de nucleótido individual dentro del gen leptina con el rendimiento de carne magra y blandura. Asi en una modalidad, donde es deseable agrupar animales de acuerdo con la concentración de leptina circulante (por ejemplo, para el uso en la producción de alimento para reproducción), ios animales se pueden seleccionar y agrupar de acuerdo con su genotipo en la posición UASMS1 polimórf ica . Asociaciones entre los genotipos de cada una de las posiciones polirnó r fricas UASMS1, UASMS2, UASMS3 y EX0N2-FB y otros diversos atributos económicamente importantes son descritos en los Ejemplos. Asi, para cada uno de estos atributos, los animales pueden ser agrupados de acuerdo con el genotipo. En contraste al es Ludio que es descrito el SNP E2JW (Lagonigro y colaboradores, (2003) ) , es la evidencia de la asociación de E2JW con EA'fYL, GFAT y LEANYL se encontró como es descrito en los Ejemplos 7-12 enseguida. En el estudio original, la asociación no significante de E2J con el porcentaje del espesor de grasa posterior subcutánea y de ultrasonido (en 10 meses de edad) de 169 becerros F2 Holstein-Charolais se reportó. Los mismos autores también reportaron nada de asociación significante de E2JW con la grasa intramuscular del canal y el registro de marmoleo, que está de acuerdo con los resultados del presente estudio que muestra nada de asociación de E2JW con ya sea CF o QG .
Lagonigro y colaboradores, (2003) reportaron una asociación significante de E2JW con la ingesta de alimento promedio de becerros desde los meses de edad, con el genotipo AT que tiene ingesta diaria más alta que el genotipo AA. Los descubrimientos contrarios de la presente invención mostraron, sin embargo, que ios animales AT tuvieron menor FATYL y GFAT y más alto LEAN YL que los animales AA, con la expectativa de que los animales AT tendrían menos ingesta de alimento, contrario a los descubrimientos de Lagonigro y colaboradores (2003) . Las relaciones fenotípicas y genéticas entre el marmoleo y la blandura (medida mediante ya sea la evaluación de fuerza cortante o el panel de pruebas) muestra dirección favorable (Bertrand y colaboradores) , indicando que el marmoleo más alto está ligeramente asociado con la blandura más alta. El marmoleo incrementado da por resultado un efecto de dilución sobre e] tejido conecti o (colágeno) en la carne, que ayuda a la mejora de la blandura. Los análisis de blandura de L también se llevaron a cabo ajusfando los registros para ya sea CE o la edad de sacrificio a través de la inclusión de una regresión lineal fijada sobre ya sea CE o la edad de sacrificio en el modelo (1) . Los resultados fueron similares a aquellos del análisis sin ajuste. Por ejemplo, las probabilidades para las pruebas F de Wald para los efectos de .Los genotipos conjuntos de E2 JW/EX0N2-FB sobre LI AVG fueron iguales a 0.001, ajusfando para ya sea CE o la edad de sac r.i f icio . Las medias de mínimos cuadrados para los genotipos E2 JW/EXON2-FB (AA.CC, AA.CT, AATT , AT.CT y ??.??) fueron 4.12 kg, 4.23 kg, 4.50 kg, 3.99 kg y 5.28 kg, ajustando para CE, respectivamente. Las mismas características ajustando para la edad de sacrificio fueron 4.14 kg, 4.23 kg, 4.49 kg, 3.99 kg y 5.31 kg, respectivamente . Los polimorfismos E2JW y EXO 2-EB están asociados con la blandura del LM y ellos interactúan en su efecto. Individualmente, estos dos SNP explican alrededor del 22% de la variación fenotípica sobre la blandura si se asume un efecto aditivo del alelo 2JW T. Dos SNP en el promotor de ieptina, UAS S 1 y UASMS3, están completamente enlazados en la población y están significativamente asociados con el rendimiento de grasa. Otro polimorfismo de promotor de Ieptina, UASMS2 no está significativamente asociado en esta población con cualquiera de los atributos de calidad del canal y de la carne analizada, que está en desacuerdo con dos estudios previamente reportados sobre este polimorfismo. Tres haplotipos particulares (TCAC, CCAT y TTAC) dentro del gen Ieptina son altamente frecuentes en la población y no difieren en sus efectos sobre los atributos de calidad del canal y de la carne, aunque ellos llevan diferentes alelos.
Esto podría indicar el efecto de otros SNPs enlazados a los cuatro SNP considerados en este estudio o algún grado de epistasis entre el DNP dentro del mismo cromosoma. Las FIGS . 7, 8, 9, 10 y 23 ilustran la utilización de diagramas de flujo de cómo los animales se pueden clasificar para los SNPs UASMS1, UASMS2, UASMS3 y EXON2-FB SNPs y la combinación de SNP F2 JW/EXON2 - FB , respectivamente, e ilustran cómo la información de genotipo utilizada para seleccionar animales para reproducir y/o usar para la producción de alimento. Los métodos resumidos en estos diagramas de flujo no se proponen para ser limitativos, y aquellos expertos en la técnica reconocerían que varios aspectos de estos métodos podrían ser alterados sin . afectar el resultado global. Las FIGs. 7-10 ilustran algunas de las características fenotípicas que están asociadas con cada genotipo. Otros fenotipos que muestran algún nivel de correlación a cada genotipo se muestra en la sección de E j emplos . Además se contempla que la invención puede abarcar el uso de posiciones de atributos cuantitativas (QTLs) diferentes de gel gen leptina bovino. Por ejemplo, un gen particularmente ventajoso es aquel que codifica el receptor de hormona de crecimiento bovino (bGHr) . En una modalidad en donde el gen de interés es e] receptor de hormona de crecimiento bovino ("bGHr") , la secuencia de nucleótido de bGHr puede tener La secuencia correspondiente a GenBank Acceso No. X70041, o un fragmento del mismo, y la secuencia de aminoácidos bGHr puede tener la secuencia correspondiente a Entrez Protein Acceso No. CAA49635, o un fragmento de la misma, las descripciones de las cuales son incorporadas por referencia en sus totalidades. Los cebadores para el uso en la amplificación, detección e Identificación de SNPs asociados con atributos deseables de los animales objetivo se han descrito, por ejemplo en Blott y colaboradores Genetics 163:253-266 (2003) la descripción de la cual es incorporada por referencia en su totalidad. El SNP mucho más ventajosamente útil en la presente invención corresponde a la posición de nucleótido 854 de la secuencia de cDNA SEQ ID NO: 24 (GenBank Acceso No. X70041) ilustrado en la Fig . 24, que genera un cambio de aminoácido de tenilalanina-tirosina en el exón 3 del gen bGHr. Asi, en una modalidad, i a presente invención proporciona métodos pa a agrupar animales y métodos para manejar la producción del ganado que comprende agrupar animales de ganado, tal como ganado vacuno, de acuerdo con el genotipo de los sitios poiimór fieos UASMS1, UASMS2, UASMS3, E2JW y/o EX0N2-FB. Es un aspecto adicional de la invención que los SNPs del gen leptina se pueden combinar como indicadores y predictores de la calidad del ganado previo a su sacrificio. En una modalidad ejemplar de la invención po lo tanto, los marcadores UASMS1(3) se pueden combinar con los marcadores E2JW o EX0N2-FB como un indicador de la blandura incrementada de la carne (corno es determinado por la resistencia al esfuerzo cortante de LM) . Se anticipa, por lo tanto que los métodos de la presente invención proporcionarán datos de genotipo de una o una combinación de marcadores, y mucho más ven a osamen e los marcadores UASMS1, UASMS2, UASMS3, E2JW y/o EX0N2-FB de la posición de gen leptma, que permite al productor de ganado predecir con conflabilidad incrementada la calidad de la carne y los animales. Los métodos de selección y agrupamien o genéticos de la presente invención se pueden utilizar en conjunción con otros métodos de agrupamien to genotipicos con encionales tal como el agrupamiento de animales mediante características visibles tales como el peso, tamaño de estructura, atributos de reproducción y los similares. Los métodos de la presente invención proporcionan la selección de ganado que tiene atributos heredables mejorados, y se puede utilizar para optimizar el desempeño de manadas de ganado en áreas tales como la reproducción, consumo de alimento, calidad del canal/carne y producción de leche. La presente invención proporciona métodos para clasificar ganado para determinar aque.1 los más probables para desarrollar una condición del cuerpo deseada al identificar la presencia o ausencia de un polimorfismo en los genes ob que está correlacionado con aquella de la condición del cuerpo . Como es descrito en lo anterior, y en los Ejemplos, existen varios atributos genotipicos con los cuales los SNPs de la presente invención están asociados. Cada uno de los atributos fenotipicos se puede probar utilizando los métodos descritos en los Ejemplos, o utilizando cualquiera de los métodos adecuados conocidos en la técnica. Utilizando los métodos de la invención, un granjero, u operador del lote de alimento, o los similares, pueden agrupar el Ganado de acuerdo con la propensión genética del animal para un atributo deseado tal como los niveles de leptina circulante, ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valia y composición del canal, y rendimiento de leche como es determinado por el genotipo S N P además de los presentes criterios que ordinariamente utilizan para el agrupamiento . El ganado se prueba para determinar la homocigocidad o hete rocigocidad con respecto a los aielos UASMS1, UASMS 2 , U AS1 S 3 , E 2 JW y EX0N2-FB del gen ob o F279Y del gen bGHr de modo que se pueden agrupar tal que cada corral contiene ganado con genotipos similares. Cada corral de animales luego se alimenta y de otra manera se mantiene de una manera y por un tiempo determinado por el operador de lote de alimento para ser ideal para la producción de carne antes del sacrificio, o para maximizar la producción de leche. Asi, ei granjero u operador del lote de alimentos se presente con oportunidades para eficiencias considerables. Actualmente, el alimentador alimenta todo su ganado él mismo, incurriendo en los mismos costos para cada animal, y típicamente, con excelentes prácticas de manejo, quizás 40% graduarán y recibirán el precio premio para el grado de agradabi i idad (dependiendo de otros diversos factores, tal como la edad del animal, y los inventores saben del ganado e entre 17-24 meses de edad que ha incrementado el marmoleo comparado con sus contrapartes más jóvenes. Aproximadamente 55% del ganado es sacrificado en una edad por debajo de 16 meses y 45% será sacrificado en la edad arriba de 17 meses) . De estos, un número significante tendrá grasa en exceso y de esta manera recibirá un grado de rendimiento reducido (ver la escala Canadiense para el grado de rendimiento) . El resto del ganado, 60%, se clasificará menor que AAA, y de esta manera recibirá un precio reducido, aunque los costos del. lote de alimento incurridos por el operador son los mismos. El agrupamiento y la alimentación del ganado por el genotipo permiten al granjero tratar cada grupo diferentemente con una pista para incrementar el aprovechamiento. Se contempla que, sin considerar la deseabilidad y el pago de premio por cualquier calidad de carne particular en cualquier tiempo dado, la provisión del granjero con un 05 grupo más uniforme que tiene una calidad de carne predecible proporcionarla al granjero con la oportunidad para demandar y recibir un premio, con relación a los grupos menos uniforme del ganado actualmente disponible. Los métodos de la invención también son útiles en los programas de reproducción para seleccionar aquellos animales que tienen fenotipos deseables para varios atributos económicamente importantes, tales como los niveles de leptina circulante, ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valia y composición del canal y rendimiento de leche. La selección y reproducción continua de animales, tai como ganado, que son por lo menos heterocigotos y venta osamente homocigotos para un polimorfismo deseable asociado con, por ejemplo, valia del canal mejorado, conduciría a una raza, línea o población que tiene altos números de descendientes con valía de canal mejorada. Así, los granjeros pueden incrementar el va.lor de sus becerros al utilizar los métodos de la presente invención para incrementar la ocurrencia de los a lelos específicos en los becerros que están asociados con atributos económicamente importantes. Así, los SNPs de la presente invención se pueden utilizar como herramientas de selección en programas de reproducción . Un aspecto de la invención, por lo tanto, proporciona un método para subagrupar animales de acuerdo con el genotipo en donde los animales de cada sub-grupo tiene un polimorfismo similar o combinación de polimorfismos en el gen leptina, que comprende (a) determinar el genotipo de cada animal a ser sub-agrupado al determinar la presencia de un polimorfismo de nucleótido individual o una combinación de polimorfismos de nucleótido individual en el gen leptina (ob) , en donde ios polimorfismos de nucleótido individual se seleccionan del grupo que consiste de UASMSl, UASMS2, UASMS3, EX0N2-FB, y E2JW; y segregar animales individuales en subgrupos en donde cada animal en un sub-grupo tiene un polimorfismo similar o combinación de polimorfismos en el gen leptina . En una modalidad de este aspecto de la invención, el animal es un bovino y el gen .leptina es el gen leptina bovino. En varias modalidades de este aspecto de la invención, la combinación de polimorfismos de nucleótido individual del gen leptina se pueden seleccionar del grupo que consiste de UASMSl / UASIMS2 , UASMSl / UASMS 3 , UASMS2 /UASMS 3 , UASMS 1 / EXON2 - FB , UASMS2 / EX0N2 - FB , UASMS 3 / EXON2 - FB , EXON2-FB/E2JW, UASMS1/E2JW, UASMS2/E2JW, y UASMS3/E2JW, y en donde los animales individuales son segregados en sub-grupos dependiendo de si los animales tienen, o no tienen, las combinaciones de polimorfismos de nucleótido individual UASMS1/UASMS2, UASMS 1 /UASMS 3 , UASMS2 /UASMS3 , UASMSl/ EXO 2 - FB , UASMS2/EXON2-FB, UASMS 3 /EX0N2 - FB , EX0N2 - FB/ E2 JW , UASMS1/E2 JW, UASMS2/E2JW y UASMS3/E2 JW del gen leptina. En una modalidad, la combinación de polimorfismos de nucleótido individual del gen leptina comprende los marcadores UASMS 1 / EX0 2 - FB , UASMS 3 / EX0N2 - FB , EXON2-FB/E2 JW, UASMS1/E2JW o UASMS3/E2 JW, y en donde la combinación de SNP indica un incremento en la blandura de la carne. En otra modalidad de acuerdo con la invención, la combinación de polimorfismos de nucleótido individual del gen leptina comprende los marcadores UASMS1/EX0N2-FB, UASMS 3 / EX0N2 - FB , EX0N2 - FB/E2 JW, UASMS1/E2JW o UASMS3/E2 JW . En todavía otra modalidad de la invención, la combinación de polimorfismos de nucleótido individual del gen leptina comprende los marcadores EXON2-FB/E2 J . En otras modalidades de la invención, la combinación de polimorfismos de nucleótido individual del gen leptina comprende los marcadores UASMS1/EX0N2-FB o UASMS 3 / EX0N2 - FB . En todavía otras modalidades de la invención, la combinación de polimorfismos de nucleótido individual del gen leptina comprende los marcadores UASMS1/E2JW o UASMS3/E2 JW . En las modalidades de este aspecto de la invención, el método además puede comprender la determinación de la presencia de un polimorfismo de nucleótido individual en el gen que codifica un receptor de hormona de crecimiento bovino . En una modalidad, el polimorfismo de nucleótido individual en el receptor de hormona de crecimiento bovino es F279Y, en donde F279Y es un determinante del área de ribeye, grado de rendimiento e ingesta de material seco. En las diversas modalidades de la invención, la combinación de polimorfismos de nucleótido individual se selecciona del grupo que consiste de UASMS1/F279Y, UASMS2/F279Y, UASMS3 / F279Y , EX0N2 - FB/ F279Y , F279Y/E2J , UASMS 1 /UASMS 2 / F279Y , UASMS 1 /UASMS 3 / F279Y , UASMS2/UASMS3/F279Y, UASMS 1 / FX0N - FB/ F279Y , UASMS2 / EX0N2 -FB/F279Y, UASMS 3 / EX0N2 - FB/ F279 Y , EX0 2 - FB/E2 J / F279Y , UASMS 1 / E2 JW/ F2 9Y , UASMS2 / E2 JW/ F2 9Y y UASMS3/E2 JW/F2 9Y . Otro aspecto de la invención es un método para identificar un animal que tiene un fenotipo deseable relacionado con cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valia y composición del canal, y rendimiento de leche, como es comparado con la población general de animales de esa especie, que comprende determinar la presencia de un polimorfismo de nucleótido individual o combinación de polimorfismos de nucleótido individual del animal, en donde el po I ¡mo tismo de nucleótido individual se selecciona del grupo que consiste de UASMS1, UASMS2, UASMS 3 , EX0N2-FB, E2J y F279Y, y en donde la combinación de polimorfismos de nucleótido individual se selecciona del 90 grupo que consiste de UASMS 1 /UASMS2 , UASMS 1 /UASMS3 , UASMS2 /UAS S3 , UASMS 1 / EXON2 - FB , UASMS2 / EXON2 - FB , UASMS 3 / EXON2 - FB , EXON2-FB/E2 JW, UASMS1/E2JW, UASMS2/E2JW, UASMS3/E2J , UASMS 1 / F279Y , UASMS2 / F279Y , UASMS3 / F279Y , EXON2-FB/F279Y, F279Y/E2JW, UASMS 1 /UASMS2 / F279Y , UASMS 1 /UASMS 3/ F279Y, UASMS2 /UASMS 3 / F279Y , UASMS 1 /EXON2- FB/F279Y, UASMS 2 / EXO 2 - FB/ F279 Y , UASMS 3 /EXON2 - FB / F279Y , EXON2-FB/E2 JW/F279Y, UASMS 1 / E2 JW / F279 Y , UASMS2 /E2 JW/ F279Y , y UASMS3/E2 JW/F279Y, y en donde la presencia de ya sea el polimorfismo de nucleótido individual UASMS1, UASMS2, UASMS3 o EXON2-FB o la presencia de las combinaciones de polimorfismos de nucleótido individual UASMS1/UASMS2 , UASMS 1 /UASMS3 , UASMS2 /UASMS 3 , UASMS 1 / EXON2 - FB , UASMS2 / EXON2-FB, UASMS 3 / EXON2 - FB , EXON2-FB/E2 JW, UASMS 1 / F,2 JW , UASMS2/E2 JW, UASMS3/E2JW, UASMS 1 / F279 Y , UASMS2 / F279Y , UASMS 3 / F279Y , EXON2-FB/F279Y, F279Y/E2JW, UASMS 1 /UASMS2 / F279Y , UASMS 1 /UASMS 3/ F279Y, UASMS 2 /UASMS 3/ F279Y, UASMS 1 / EXON2 - FB/F279Y, UASMS2/EXON2-FB/F279Y UASMS3/EXON2-FB/F279Y, EXON2-FB/E2 JW/F279Y, UASMS. /E2JW/F279Y, UASMS2/E2 JW/F279Y y UASMS3/E2 JW/F279Y que es indicativo de un fenotipo deseable relacionado con cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valia y composición del canal, calidad de la carne, blandura de la carne y/o rendimiento de leche . Todavía otro aspecto de la invención es una composición para la detección de una combinación de polimorfismos del gen ob seleccionado del grupo que consiste de UASMS 1 /UASMS2 , UASMS 1 /UASMS3 , UASMS2 /UASMS 3 , UASMS 1 / EXO 2 -FB , UASMS 2 / EXO 2 - FB , UASMS 3 / EXON2 - FB , EXON2-FB/E2 JW, UASMS1/E2JW, UASMS2/E2JW, UASMS3/E2 JW, UASMS 1 / F279Y , UASMS2 / F279Y , UASMS 3 / F279Y , EXON2 - FB/ F279Y , F279Y/E2JW, UASMS 1 /UASMS 2 / F279Y , UASMS 1 /UASMS 3 / F279Y , UASMS2 /LJASMS3 / F279 Y , UASMS 1 / EXO 2 - FB/ F279 Y , UASMS2 /EXON2 -FB/F279Y UASMS3 /EXO 2 - FB/ F279 Y , EXON2-FB/E2 JW/F279Y, UASMS1/E2JW/F279Y, UASMS2 / E2 JW/ F279 Y o UASMS 3 / E2 JW/ F279Y , que comprende por lo menos dos sondas de ol igonucleót ido , en donde cada sonda de oligonucleótido es capaz de detectar selectivamente un solo polimorfismo, y en donde cada sonda es opcionalmente marcada con una porción detectable. Una modalidad de este aspecto de la invención es una sonda de oligonucleótido aislada, en donde la porción detectable se selecciona del grupo que consiste de una radiomarca 3H, 1251 , 35S, 14C, 32P, una enzima detectable, peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatasa alcalina, un tinte fluorescente, isotiociana o de f luoresceina , rojo de Texas, rodamina, Cy3, Cy5, Bodipy, Bodipy Far Red, Lucifer Yellow, Bodipy 630/650-X, Bodipy R6G-X, 5-CR 6G, una marca colorimétrica , digoxigenina-dUTP de oro coloidal o biotina. En una modalidad de la invención, el oligonucleótido es inmovilizado sobre un soporte sólido.
Todavía otro aspecto de la invención es un método para determinar el genotipo de un animal en una posición polimórfica del gen ob que comprende: (a) obtener una muestra de DNA del animal; (b) poner en contacto la muestra de DNA con por lo menos dos pares de cebadores de oligonucleótido bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridación de los cebadores de oligonucleótido de la muestra de DNA; (c) amplificar enzimá ticamente las regiones específicas del gen ob utilizando el par de cebadores para formar por lo menos dos productos de amplificación de ácido nucleico; (d) poner en contacto los productos de amplificación de la etapa C con las sondas específicas de alelo del gen ob marcadas, marcadas con una porción detectadle, bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridación de las sondas específicas de alelo marcadas a los productos de amplificación; (e) detectar la presencia de los productos de amplificación al detectar la porción detectable de las sondas específicas de alelo marcadas, hibridadas a los productos de amplificación. En varias modalidades de este aspecto de la invención, los pares de cebadores de oligonucleótido se pueden seleccionar del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22. En otras modalidades de este método de la invención, los pares de cebadores de ol igonucleó ido son capaces de amplificar las regiones del gen leptina bovino que tiene por lo menos una posición de nucleótido polimórfica seleccionada del grupo que consiste de UASMS1, UASMS2, UASMS3, EXON2-FB y E2JW, o combinaciones de las mismas seleccionada del grupo que consiste de UASMS1 /UASMS2 , UASMS 1 /UASMS3 , UASMS2 /UASMS 3 , UASMS 1 / EXON2 - FB , UASMS2 /EXON2-FB, UASMS 3 / EXO 2 - FB , EXON2-FB/E2 JW, UASMS 1 / E2 J , UASMS2/E2J , o UASMS3/E2 J . En las modalidades el genotipo puede indicar un incremento en la blandura de la carne bovina. En otras modalidades de este aspecto de la invención, los pares de cebadores de oligonucleótido son capaces de amplificar la región del gen receptor de hormona de crecimiento bovino (bGHr) que tiene el SNP F279Y. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica de biología molecular. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o la prueba de la presente invención, métodos y materiales adecuados son descritos en la presente. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solamente y no se proponen para ser limitativos. La invención ahora será descrita adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitativos. EJEMPLOS Ejemplo 1 : Animales y recolección de datos fenotípicos Un total de 180 animales (139 novillos y Al toros) procreados por Angus Charoláis o toros híbridos de University of Alberta se manejaron y se probaron para el crecimiento y la eficiencia de alimento bajo condiciones de lote de alimento. La ingesta de alimento se midió para cada animal utilizando el sistema de alimentación automatizado GrowSafe® (GrowSafe© Systems Ltd., Airdrie, Alberta, Canadá) . Los datos de desempeño completo y eficiencia estuvieron disponibles sobre un total de 150 animales, excluyendo todos los toros en la prueba dos (total de 21 animales) más nueve de otros animales que murieron o tuvieron que ser excluidos de la prueba debido a la salud y otros problemas relacionados. Las mediciones de peso de todos los animales se tomaron semanalmente . Los ciatos de desempeño analizaron incluyeron la ganancia diaria promedio (ADG) , el peso de punto medio metabólico sobre la prueba (MWT) , ingesta de alimento residual (RFI) , relación de conversión de alimento (FCR) , ingesta de materia seca diaria promedio (DMI), consumo de energía metabolizable por peso metabólico unitario (MEWT°' /5) , y eficiencia parcial del crecimiento (PEG) . Cada ADG del animal durante la prueba se calculó, el coeficiente de la regresión lineal del peso ( kg ) sobre el tiempo (días) utilizando el procedimiento de regresión de SAS (SAS Institute, Inc., Cary, NC, 1999) . El M T de cada animal durante el periodo de prueba se calculó como el peso de cuerpo de punto medio°'7j. La ingesta de alimento total de cada animal durante ios 70 días del periodo de prueba se utilizó para calcular la ingesta de material seca (DMI) para cada animal. La energía metabolizable se calculó como el producto de DMI y el contenido de energía dietético (12.14 MJ ME/kg) dividido entre el peso metabólico de cada animal. La ingesta de alimento residual se calculó para cada animal como la diferencia entre cada ingesta de alimento real del animal a partir de la ingesta de alimento diaria esperada predicha basada en la ganancia diaria promedio y el peso metabólico de cada animal durante el período de prueba. La relación de la conversión de alimento de cada animal se calculó como la relación de ingesta promedio en la prueba a la ganancia diaria promedio en la prueba. La eficiencia parcial de crecimiento (PEG) arriba del mantenimiento de cada animal se calculó como la relación de ADG a la diferencia entre la ingesta de alimento promedio y la ingesta de alimento para el mantenimiento.
Datos de comportamiento de alimentación: La detección de un animal en un lote de alimento por el sistema Growsafe inicia con un evento de alimentación y termina cuando el tiempo entre las dos lecturas para el mismo animal fue mayor que 300 segundos. La detección de un animal dentro de 300 segundos se consideró que es un evento de alimentación continuo. Los datos de eventos de alimentación luego se utilizan para calcular la duración de alimentación promedio (FD) que es la diferencia entre el tiempo final promedio menos el tiempo de inicio. La duración de alimentación incluye el tiempo agotado en la aprehensión, masticadura, retroceso desde la litera y masticadura, socialización, rascamiento o lamedura. El tiempo hacia abajo de la alimentación (FHD) , por otra parte, principalmente incluye el tiempo asociado con comer y es determinado como el número promedio de detecciones de un animal durante los tiempos de eventos de alimentación, el tiempo de detección del sistema de 5.7 segundos . Datos de ultrasonido: Mediciones de ultrasonido de profundidad de grasa de la 12713a costilla, área del músculo longissimus y registro de marmoleo se tomaron aproximadamente cada 28 días con un ultrasonido en tiempo real con Aloka 500V con un transductor de arreglo lineal de 17 cm, 3.5-MHz. Cada animal tuvo cinco mediciones de ultrasonido repetidas, excepto para los animales retirados antes del punto final de la prueba para estudios metabóixcos. En este caso, el valor aproximado de la medición fue predicho a partir de la proporción de cambio en ese atributo de las mediciones previas . Predicción de mediciones de ultrasonido en peso del cuerpo constante de 500 kg: No se requirió el peso en el matadero para animales de Madurez I o jóvenes Canadienses (canales jóvenes de calidad superior) bajo el sistema de graduación de canal de carne de res canadiense. El peso del sacrificio promedio generalmente varia entre 550 a 600 kg para novillos para dar un peso promedio del canal caliente de aproximadamente 350 a 400 kg . Los pesos finales de los animales estuvieron por debajo del peso de sacrificio industrial mínimo de 500 kg . Sin embargo, se deseó determinar las mediciones del ultrasonido finales del espesor de la grasa posterior, el área torácica longissimus y el registro de marmoleo en el tiempo del peso de sacrificio industrial. Los procedimientos de regresión se utilizaron para predecir el espesor de la grasa posterior, registro de marmoleo y el área torácica de longissimus en ' un peso del cuerpo cortante de 500kg. Primero, las mediciones para cada animal (espesor de grasa posterior de ultrasonido, registro de marmoleo o área de músculo longissimus) registrada sobre cinco periodos consecutivos se regresaron en el peso del cuerpo medido sobre estas fechas anteriores para cada animal. Esto produce una ecuación de regresión Y = a-i-b(WT) para cada animal, donde Y es el valor de atributo a ser predicho (grasa posterior, marmoleo o área torácica de iongissimus ) , a = la intercepción de la ecuación de regresión; b = el coeficiente de regresión y WT es el peso del cuerpo del animal (en este caso ajustado a una constante de 500 kg) . Asi la ecuación se utilizó para predecir un valor para cada atributo en un peso del cuerpo constante de 500 kg para cada animal. Esto dio por resultado de un nuevo conjunto de datos para el marmoleo, grasa posterior o área de ribeye predicha. El nuevo conjunto de datos luego se analizó para determinar diferencias entre diferentes genotipos de los diferentes marcadores. Datos del sacrificio y del canal: De los 150 animales con datos de desempeño completos, 19 de estos fueron toros que no se enviaron al sacrificio. Además, los 20 animales con fenotipos extremos para REI se seleccionaron para las mediciones metabólicas y nada de datos del canal se recolectaron sobre estos animales. Los datos del canal estuvieron disponibles para solo 109 animales. Los atributos del canal se evaluaron de acuerdo con el sistema de graduación del canal de carne de res Canadiense. Los datos del canal estándares proporcionados bajo este sistema incluyeron el peso de sacrificio (peso vivo final) , peso del canal, espesor de grasa posterior promedio, grado de grasa IOS del canal, área de ribeye, calidad de marmoleo o grado de calidad, nivel de marmoleo y el rendimiento de carne vendible. El peso del canal de canal se determinó como el peso de las mitades izquierda y derecha del canal después de un enfriamiento de 24 hr a -4°C. El grado de grasa del canal se midió en la 12/13 costilla de cada canal. El espesor de grasa posterior promedio se midió en dos diferentes ubicaciones a lo largo del músculo ribeye diferente entre la 12 y 13a costillas. El grado de calidad del canal (A, AA, AAA o primario=4, 3, 2, 1 respecti amente) se decidieron de acuerdo con los siguientes criterios: el animal debe ser fisiológicamente menor que 30 meses de edad; la carne debe ser roja brillante, firme y de grano fino; la musculatura debe variar de buena (sin deficiencias) a excelente; el grado de grasa debe ser firme y blanco (o ambas) y no menos de 2 mm a en el sitio de medición (12/13a costilla) . El registro A, AA, AAA o primario no es directamente dependiente del nivel de marmoleo. Asociado con cada uno de estos grados de calidad está un registro para el nivel de marmoleo (varia de 0 a 90, tal como A0, A50, AA10, AAAO, AAA40 etc) . Para obtener un valor cuantitativo para el marmoleo por lo tanto, el grado de calidad y el nivel de marmoleo de cada canal graduado se combinan para calcular un valor para registro de marmoleo de acuerdo con la ecuación : regís t ro de marmoleo= (QG+ML) /100 , donde QG es el grado de calidad (100, 200, 300 y 400 para A, AA, AAA, y primario, respectivamente) y ML es el nivel de marmoleo y varia de 0 a 90 en unidades de 10. En unidades de marmoleo es una medida de la grasa intramuscula del músculo ribeye y puede ser clasificado como 1 a <2 unidades=marmoleo menor (grado de calidad A de Canadá) ; 2 a <3 unidades=marmoleo ligero) (grado de calidad AA de Canadá) ; 3 a <4 unidades=marmoleo pequeño moderado (grado de calidad AAA Canadá) y >4 unidades=marmoleo ligeramente abundante o mayor (Primario Canadá) . El rendimiento de carne magra es un estimado de la carne vendible y calculó de acuerdo con la ecuación: rendimiento de carne magra %= 57. 6+ ( 0.202x área de L. Lhoracis, era2) - (0.027 x peso del canal caliente, kg)- (0.703 x espesor de grasa posterior promedio, ram) . El rendimiento de carne magra del canal se puede utilizar para asignar un grado (grado de rendimiento) a cada animal de acuerdo con Yl=>59%, Y2=54 a <59% y Y3=<54%. Ejemplo 2: Muestreo de sangre, extracción de DNA y detección de SNP Muestras de sangre se recolectaron de cada animal en el inicio de la prueba de ingesta de alimento de la cual el DNA genómico se extrajo utilizando un procedimiento de fenol /cloroformo de sal saturado, modificado (Sambrook y colaboradores (2001) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed . , Cold Spring Harbor Press) . La identificación de polimorfismos en el promotor de leptina bovino utilizó la SEQ ID NO : 1 (GenBank acceso número AB070368, Taniguchi y colaboradores, UBMB Life. 2002 'eb; 53 ( 2 ) : 131 -5 ) . El DNA genómico de un panel de 16 animales se amplificó mediante la reacción en cadena de polimerasa utilizando los cebadores delantero y trasero diseñados para cubrir la región de promotor de leptina bovino completa. Los productos de PCR de cada animal se secuenciaron sobre un Sistema de Análisis Genético Beckman CEQ 8000 (Beckman Coulter Instruments, Inc.) . Los datos de la secuencia para cada animal se analizaron para identificar polimorfismos de nucleótido individual putativos. El análisis identificó tres nuevos polimorfismos de nucleótido individual (SNPs) , específicamente UASMS1, UASMS2 y UASMS3 localizados, respectivamente en las posiciones 207 (sustitución de C/T) , 528 (sustitución de C/T) y 1759 (sustitución de C/G) (la numeración es aquella de la SEQ ID NO:l, GenBank acceso número AB070368) . El SNP del exón 2 identificado por Buchanan y colaboradores (Genet Sel Evol. 2002 Jan-Feb; 3 ( 1 ) : 105- 16 ) está localizado en la posición 305 (mutación de mal sentido de C/T) (GenBank acceso No. AY138588) . La determinación del genotipo de cada polimorfismo específico del gen leptina se llevó a cabo utilizando el ensayo de discriminación alélica de nuclease 5' sobre un detector de secuencia ABI PRISM™ 7700 (Applied Biosystems Inc.) . Cebadores delantero y trasero (Tabla 1) se diseñaron para amplificar cada polimorfismo utilizando el DNA genó ico de cada animal. Adicionalmente, dos sondas f luorogénicas ABI TaqMan® (con un tinte reportador diferente sobre cada sonda) se diseñaron para dirigir dos alelos de cada SNP (Tabla 1) .
Tabla 1: Información de posición, cebador y de sonda para la determinación de genotipo de cada polimorfismo 3 Las posiciones son designadas de acuerdo con SEQ ID NO:l GenBank acceso número AB070368. La posición que es designada de acuerdo con SEQ ID NO: 5 GenBank accedo número AY138588. c Los nucleótidos en negritas dirigen los alelos específicos del SNP. Un subcon junto de los animales determinados en genotipo se secuenció a través de cada polimorfismo y los resultados de secuencia se utilizaron para confirmar los genotipos obtenidos mediante los ensayos de discriminación. Además de la manada experimental, un total de 160 animales de cinco lineas comerciales de animales relativamente no relacionados (lineas de selección genética BeefBooster MI, M2, M3, M4, y TX) también se determinaron en genotipo y las frecuencias de alelo de los SNPs se determinaron en estos animales. La raza (s) de base fueron Angus para MI, Hereford para M2 , varias razas pequeñas para M3, Limousin y Gelbvieh para M4, y Charoláis para TX (Kress y colaboradores, J Anim Sci. 1996 Oct; 74 ( 10 ) : 2344 -8 ) . Las pruebas de chi-cuadrado se utilizaron para examinar las frecuencias de genotipo de cada polimorfismo para desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg para ambas de las poblaciones experimental y comercial. Las diferencias entre las diversas lineas de selección de la manada comercial de frecuencias de alelo de los polimorfismos también se probaron entre los análisis de chi-cuadrado utilizando el Procedimiento de Modelo Categórico de SAS (SAS Institute, Inc., Cary, NC, 1999) . Las asociaciones de marcadores individuales luego se llevaron a cabo para evaluar la relación de" los diferentes genotipos de marcador de cada marcador sobre la concentración de leptina en el suero, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, ingesta de alimento, eficiencia de alimento y atributos de ultrasonido.
Los datos se analizaron utilizando PROC I IXED de SAS (SAS Institute, Inc., Cary, NC, 1999) . El análisis estadístico utilizado incluyó los efectos fijos del genotipo SNP, grupo de prueba (uno y dos) , sexo del animal (toro y novillo) y efectos aditivos del animal aleatorio. El animal se ajustó como un efecto aleatorio para tener en cuenta los genes antecedentes. El peso de inicio del animal en la prueba, la edad de la madre o la edad del animal sobre la prueba se incluyeron en el modelo como covariantes lineales. El modelo utilizado para analizar los datos del canal fue similar a aquel de los datos del animal vivo pero excluyeron los efectos fijos del sexo ya que solamente novillos se enviaron al matadero. Las asociaciones entre diferentes polimorfismos y el grado de calidad del canal se probaron mediante los análisis de chi-cuadrado utilizando el Procedimiento Modelo Categórico de SAS (SAS Institute, Inc., Cary, NC, 1999) . Efectos genéticos aditivos se estimaron para los atributos que fueron significativamente diferentes (P < 0.10) entre los animales con diferentes genotipos de SNP. Los (a) efectos genéticos aditivos significantes se calcularon al sustraer la solución del estimado para el efecto de atributo de los dos genotipos de homocigoto. Los inventores también estimaron la' desviación de dominancia (d) como la desviación del valor genotipico C'I' desde el punto medio entre los valores genotipicos TT y CC .
I 14 Ejemplo 3 : Frecuencias de genotipo y de alelo Las Tablas 2 y 3 muestran las frecuencias de genotipo y las pruebas de chi-cuadrado del equilibrio de Hardy-Weinberg para los diferentes polimorfismos en las poblaciones experimental y comercial, respectivamente. Las observaciones de los genotipos rebelaron que todos los animales que tuvieron genotipos CC, CT o TT de UASMS1 también tuvieron genotipos CC, CG o GG de UASMS 3, respectivamente. Asi, los dos polimorfismos estuvieron en desequilibrio de enlace complete y se designaron con untamente como UASMS1-3. Los alelos T-G de UASMS1-3 fueron 59% cada uno en la población experimental y los alelos T de UASMS2 fueron 21% y el EX0N2-FB 44%. De manera similar, las frecuencias de los alelos T-G o T de UASMS1-3, UASMS2 y EX0N2-FB fueron 48%, 20% y 53%, respecti amente, · en la población comercial. Los análisis de chi-cuadrado entre los genotipos observados y esperados mostraron que las frecuencias de todos los genotipos de todos los tres polimorfismos no se desviaron significativamente de las proporciones de Hardy-Weinberg en ambas poblaciones (P > 0.10) . Tabla 2: Frecuencia s de genotipo y pruebas de chi-cuadrado del equilibrio de Hardy-Weinberg de los tres marcadores de la población experimen tal Polimoi: fi sino CC/CC CT/CG TT/GG TOTAL í DE T-G Chi- valor py cuadrado' UASMS1-3 33 8 ^ 65 I 80 0.59 0.63 0.73 Polimorfismo CC CT TT TOTAL - T Chi- valor p cuad rado UAS S2 113 58 9 180 0.21 0.19 0.91 Polimorfismo CC CT T TOTAL T Chi- valor p cuadrado EX0N2-FB 59 84 37 180 0.44 0.50 0.78 z Grado de desviación de las frecuencias de genotipo observadas de las expecta ivas. y Probabilidad de un valor de chi-cuadrado significante Tabla 3: Frecuencias de genotipo y pruebas de chi-cuadrado del equilibrio de Ha rdy-Weinberg de los tres marcadores en la población comercia 1 z El grado de desviación de las frecuencias de genoti observadas de las expectativas y Probabilidad de un valor de chi-cuadrado significante.
I 16 x El tamaño de población total es 162 animales. Dos muestras no lograron amplificar para UASMS1, 2 y 3 y una muestra no logró amplificar para EX0N2-FB. La Tabla 4 muestra las secuencias de los diferentes polimorfismos en las diferentes razas de la población comercial. Las frecuencias de los alelos T-G de UASMS1-3 difirieron entre las diferentes lineas de la población comercial (P < 0.05, ?~ = 9.17) y fueron menores en la linea MI (Angus) comparada con TX (Charoláis) (P < 0.004, ?2 = 8.10) , M2 (Hereford) (P < 0.10, ?2 = 2.86) , M3 (varias razas pequeñas) (P < 0.02 = 5.48) y M4 (Gelbvieh y Limousin) ( PO .04 , ?2 = 4.10) . Tabla 4: Frecuencias de genotipo y de alelo de los diversos marcadores en cinco razas de una población comercia 1 de ganado vacuno a'D'c Frecuencias de alelo de UASMS1-3 (P = 0.01, LJASMS2 (P < 0.05, ?2 = 5.71) y EXON2-FB (P <0.04 en las columnas seguidas por diferentes sobreindices son diferentes . La frecuencia del alelo T de UASMS2 difirió entre las lineas de selección (P < 0.05, = 5.71) y fue más alta para Mi comparado con M2 (P < 0.05, ?2 = 4.19) , M3 (P < 0.10, X2 = 2.71) y TX (P < 0.05, y = 3.79) . Las diferencias en la frecuencia de alelo de UASMS2 en las otras razas no fueron significantes (P > 0.10) . Hubo diferencias en las frecuencias de alelo del EXON2-FB entre las lineas de selección de la población comercial (P <0.041, ?" = 9.93) . La linea de selección basada en Angus (MI) tuvo una frecuencia más alta del alelo T del EXON2-FB comparada con las lineas basadas en (Gelbvieh y Limousin (M4) (?: = 5.41, P < 0.05) y Charoláis (TX) (?~ =P < 0.01) y tendieron a ser más altas que la linea basada sobre varias razas pequeñas (M3) (?' = 3.82, P < 0.10) , pero no Hereford (M2) (P > 0.10) . La frecuencia de alelo del EXON2-FB no difirió entre las otras lineas de selección de la población comercial (P > 0.10) . Ejemplo 4: Asociaciones de UASMS1-3 con varios atributos fenotipicos La Tabla 5 y muestra el efecto de diferentes genotipos de UASMS1-3 sobre las medidas de concentración de leptina en el suero, desempeño, eficiencia del alimento y comportamiento de alimentación en la población experimental. El peso metabólico fue más alto (P < 0.01) para animales con ¦genotipo TT-GG que para CC-CC (efecto aditivo, a = -5.35 ± 1.65 kg'75) . La ganancia diaria promedio tendió a ser más alta (P < 0.10) para animales con genotipo TT-GG que para animales con genotipo CC-CC (efecto aditivo, a = -0.12 ± 0.04 kg d-1) . La ingesta de materia seca fue significativamente más alta (efecto aditivo, a = -0.88 ± 0.24 kg d"1) (P = 0.001) y la energía metabolizable por peso metabólico tendió a diferir (P < 0.10) [efecto aditivo, a = -49.06 ± 23.60 KJ (kg-75d)^] entre animales con diferentes genotipos de UASMS1-3. Sin embargo, las concentraciones de leptina en el suero, relación de conversión de alimento, ingesta de alimento residual y eficiencia parcial de crecimiento no mostraron cualquiera de las asociaciones significantes con los genotipos de UAS S1-3 (P > 0.10) . Para los atributos de comportamiento de alimentación, la duración de alimentación fue diferente (P = 0.04) (efecto aditivo, a = -7.66 ± 2.58 min d^1), entre los animales con diferentes genotipos de UASMS1-3. Por otra parte, la frecuencia de alimentación tendió a ser menor (P < 0.10) (efecto aditivo, a = 3.32 ± 1.07 eventos d"1, ) para animales con genotipo TT-GG que para CC-CC. Tabla 5: Efecto de diferentes genotipos de UASMS1-3 (media de mínimos cuadrados ± error estándar) sobre las medidas de leptina en el suero, desempeño, eficiencia y comportamiento de a 1 imen aci ón . 19 z UASMS1-3 están localizados en las posiciones 207 (sustitución de C/T) y 1759 (Sustitución de C/G) en el promotor de leptina bovino de acuerdo con SEQ ID NO:l (AB070368) y Valor P = probabilidad de diferencias entre diferentes genotipos marcadores. La Tabla 6 muestra el peso del cuerpo, las mediciones de ultrasonido y del canal de los animales con diferentes genotipos UASMS1-3. El. peso del cuerpo promedio (efecto aditivo, a = -29.73 ± 10.49 kg) , peso vivo final (efecto aditivo, a = -33.39 ± 11.80) (P < 0.01), peso de sacrificio (efecto aditivo, a = 37.07 ± 13.79 kg) y peso del canal (efecto aditivo, a = -18.49 ± 8.59 kg) (P = 0.01) fueron más altos en animales con el genotipo TT-GG que para el genotipo CC-CC de UAS S1-3. Con la excepción del espesor de grasa posterior de ultrasonido final, que fue más alto en animales con genotipo TT-GG que para CC-CC (P < 0.05) , no hubo diferencias entre los genotipos en las diferentes mediciones de ultrasonido (P > 0.10) . Además, el grado de grasa del canal, espesor de la grasa posterior, área del músculo longissimus, registro de marmoleo y rendimiento de carne magra no difirieron entre los diferentes genotipos de UASMS1-3. Los análisis de datos categóricos de los grados del canal (A, AA, AAA) entre los genotipos de UASMS1-3 no mostró asociación significantes entre el grado de calidad y los genotipos (?2 = 1.37, P = 0.50) (Tabla 11) . Tabla 6: Efecto de diferentes genotipos de UASMS1-3 (media de mínimos cuadrados ± standar) sobre las medidas del peso del cuerpo, ultrasonido y valía del canal del ganado vacuno híbrido UASMSl-3 Genotipo marcador Atributo CC CT TT valor P1' Número de animales 27 63 55 Peso y ultrasonido Mediciones iniciales (Enero 10) Peso del cuerpo, kg 335.24+8.88 33 .5116.09 335.12+6.25 0.03 Grasa posterior de ultrasonido, min 5.54±0.53 .10+0. 7 5.13+0.49 0.15 Registro de marmoleo de ultrasonido 4.2510.33 .34+0.32 4.3110.33 0.68 Area de longissimus thoracis, cu' 64.05±] .15 62.33+0. 9 61.95±0.82 0.22 Medición Final (Mayo 01) Peso del cuerpo, kg 477.46+ ] 1.60 485.24 +7.96 510.86+8.16 0.005 Grasa posterior de ultrasonido 5.84 ±0.91. 5. 1i0.84 6.45+0.88 0.04 Registro de marmoleo de ultrasonido 4.56±0.12 4.6310.08 5.6910.09 0.61 Area de longissimus thoracis, era' 74.71+1.35 73.2210.92 73.45+0.96 0.53 Mediciones Promedio" Peso del cuerpo, kg 402.90110.24 412.35 .02 432.64+6.20 0.01 Grasa posterior de ultrasonido 5.72±0.61 5.2610.55 5.8310.57 0.17 Registro de marmoleo de ultrasonido .39±0.10 .4710.07 4.67+0.08 0.76 Area de longissimus thoracis, enr 69.32±0.87 68.02+0.59 67.9310.62 0.26 Atributos del canal Número de animales 49 38 Peso de sacrificio, kg 490.6+10.9 501.2+7.3 527.6518.31 0.01 Peso del canal, kg 287.816.8 286.62+4.53 306.3115.18 0.01 Grado de grasa, mm 9.5210.71 8.11+0.43 9.29+0.54 0.15 Grasa posterior promedio, mm 10.96+0.75 9.67+0.50 10.81+0. 7 0.21 Registro de marmoleo del canal 2.3210.38 2.0010.33 ? .2 +0.39 0.18 Area de L. thoracis, cm~ 74.4511.39 76.58±0.92 76.6311.09 0.77 Rendimiento de carne magra, 57.52±ü .75 58.86±0.50 57.9310.59 0.25 z El polimorfismo UASMS1-3 están localizados en las posiciones 207 (sustitución de C/T) y 1759 (sustitución de C/G) en el promotor de leptina bovino de acuerdo con la SEQ ID NO:l (AB070368) y Valor P = probabilidad de diferencias entre diferentes genotipos marcadores x Promedio de cinco mediciones tomadas entre Enero 10 y Mayo 01 en intervalos aproximadamente mensuales. Ejemplo 5 : Asociaciones de UASMS2 con varios atributos fenotípicos El efecto de diferentes genotipos de UASMS2 sobre las medidas de concentración de leptina en el suero, desempeño y presencia del alimento y ultrasonido y valia del canal se presenta en las Tablas 7 y 8. El alelo T de UASMS2 fue altamente significativo asociado con la concentración de leptina en el suero (P < 0.0001), y fue más alto para los animales con genotipo TT que para CC (efecto aditivo, a = -11.79 ± 2.76 ng mi-1) . La leptina en el suero también fue más alta (P = 0.04) en animales CT que en animales CC (desviación de dominancia, d = -3.38 ± 1.81 ng mi'1) . El peso metabólico difirió entre los genotipos (P < 0.05) y fue más alto para animales con genotipo TT que para CC (efecto aditivo, a - -6.01 ± 2.50 kg'7j) . La ganancia diaria promedio fue significativamente diferente (P < 0.01) entre los genotipos y fue más alta para los animales con genotipo TT que para los animales con genotipo CC (efecto aditivo, a = -0.15 ± 0.04 kg cT1) . Tabla 7: Efecto de diferentes genotipos de UASMS2 (media de mínimos cuadrados ± error estándar) sobre las medidas de leptina en el suero, desempeño , eficiencia y comportamiento de alimentación del ganado vacuno híbrido UASMS2 Genotipo marcador" Atributo CC CT TT valor P: Número de animales 99 45 Leptina en el suero, desempeño y eficiencia Nivel de leptina en el suero, ng mi 11.92±0.93 1·! .43±1.24 23.71±2.80 <0.0001 Peso medio metataolic, kg' '' 85.77±1.09 38.19+1.20 92.14 ± 3.04 0.03 Ganancia diaria promedio, kg d 1 1.32+0.03 1.4710.04 1.4610.10 0.002 Ingesta de alimento residual, kg d ! -0.71±0.23 -0.4110.23 -0.95±0.40 0.09 Relación de conversión de alimento 6.06±0.12 5.95±0.13 5.82±0.34 0.63 Ingesta de material seca, kg d 1 7.44+0.15 8.13±0.17 7.89+0.43 0.001 Ingesta de ME, KJ kg"'7' d'! 1061.1+15. 1110.0+18.2 1047.3±48.9 0.04 Eficiencia parcial de crecimiento 0.34+0.01 0.33+0.01 0.36±0.02 0.64 Comportamiento de Alimentación Duración de alimentación, min d"1 49.69±3.39 54.89±3.31 49.9ó±S .39 0.02 Tiempo con la cabeza hacia abajo, 34.26+3.17 37.17±3.10 29.84+5.11 0.01 min d"1 Frecuencia de alimentación, eventos 33.12±1.87 30.86+1.86 28.64±3.34 0.09 z Polimorfismo UASMS2 es una sustitución de C/T localizada en la posición 528 del promotor de leptina bovino de acuerdo con SEQ ID NO: 1 (??070368) y Valor P = probabilidad de diferencias entre diferentes genotipos marcadores Tabla 8: Efecto de diferentes genotipos de UASMS2 (media de mínimos cuadrados ± error estánda r) sobre las medidas del peso del cuerpo, ultrasonido y valía del canal del ganado vacuno híbrido UASMS2 Genotipo Marcador1 Atributo CC CT TT valor Py Número de animáis 99 45 6 Peso del cuerpo y ultrasonido Mediciones Iniciales (Enero 10) Peso del cuerpo, kg 339.93±5.95 352.53±6.54 363.26116.39 0.01 Grasa posterior de ultrasonido, mm 4.38i0.25 4.61±0.27 5.64±0.68 0.15 Registro de marmoleo de ultrasonido .32±0.08 .46±0.08 4.5610.21 0.15 Area de longissimus thoracis, cnr 62.97±0.76 62.17±0.82 60.13+2.13 0.32 Mediciones Finales (Mayo 01) Peso del cuerpo, kg 488.33±7.86 502.86±8.64 530.35+21.93 0.07 Grasa posterior de ultrasonido 5.20±0.35 6.4310.38 9.51±0.96 <0.0001 Registro de marmoleo de ultrasonido 4.61 ±0.09 4.79±0.10 5.5210.25 0.001 Area de longissimus thoracis, cm 74.03+0.09 72.6410.10 68.43±2.48 0.05 Mediciones Promedio" Peso del cuerpo, kg 413.37±6.93 427.65+7.62 443.68±19.32 0.10 Grasa posterior cíe ultrasonido 4.83+0. '6 5.4310.29 7.12±0.73 0.003 Registro de marmoleo de ultrasonido 4.41+0.03 4.58±0.08 5.02+0.21 0.006 Area de longissimus thoracis, oír 68.37±0.57 67.77±0.62 64.34+1.60 0.04 Predicho @ 500 kg BW Grasa posterior de ultrasonido 5.3410.32 6.21±0.34 8.6510.88 0.0002 Registro de marmoleo de ultrasonido .57 ±0.40 .77±0. 0 5.361.46 0.002 Area de longissimus thoracis, cnr 7 .65±0.79 73.06±0.86 70.21+2.19 0.05 Datos del Canal Número de animáis 76 9 4 Peso en el sacrificio, kg 500.9±6.0 516.7±9.9 537.27126.2 0.20 Peso del canal, kg 290.6+3.8 299.4+6.2 295.9+16.5 0.48 Grado de Grasa, mm 8.34+0.43 9.54±0.70 109111.84 0.16 Grasa posterior promedio, mm 9.76+0.44 11.50±0.71 12.0911.92 0.08 Registro de marmoleo del canal 2.26±0.07 2.4210.11 2.71±0.30 0.20 Área de L. thoracis, cm2 76.08+0.75 77.30±1.22 74.63+3.32 0.61 Rendimiento de carne magra, ' 58.62±0.41 57.39±0.65 56.9011.77 0.22 z El polimorfismo UASMS2 polimorfismo es una sustitución de C/T localizada e la posición 528 del promotor de leptina bovino de acuerdo con la SEQ ID ??:1 (AB070368) y Valor P = probabilidad de diferencias entre diferentes genotipos marcadores. Promedio de cinco mediciones tomadas entre Enero 10 y Mayo 01 en intervalos aproximadamente mensuales. La ingesta de materia seca fue significativamente diferente (P = 0.001) entre los genotipos de UASMS2 y fue más alta en animales con TT comparado con (efecto aditivo, a = -0.45 ± 0.19 kg d"1) y CT comparado con CC (efecto de dominancia, d = -0.69 ± 0.26 kg d'1) . La energía metabolizable por peso metabólico también difirió entre los genotipos de UASMS2 (P = 0.04) y fue más alta en CT comparada con TT o CC (desviación de dominancia, d = -56.11 ± 25.24 KJ (kg'75 d)"1 UASMS2. La ingesta de DM más alta de los animales con el alelo T observado en este estudio es sorprendente ya que generalmente seria esperado que los animales con grasa del cuerpo más alta y leptina en el suero significativamente más alta hubiera disminuido el consumo de alimento. Se puede argumentar que este resultado puede ser debido al hecho de que hubo solamente muy pocos animales disponibles con el genotipo TT para comparación (como es observado por los altos errores estándares asociados con los valores de atributos de los animales TT) . Sin embargo, los resultados también mostraron que la ingesta de alimento fue más alta en animales heterocigotos , indicando que el alelo T de UASMS2 está de hecho asociado con la ingesta de alimento incrementada. Datos recientes de vacas lecheras (Liefers y colaboradores, Mamm Cenóme. 2003 Sep; 14 (9) : 657-63 y Liefers y colaboradores, J Dairy Sci . 2003 Mar; 86 ( 3 ) : 799- 807 ) muestran que las vacas con ingesta de material seca más alta fueron significativamente más pesadas y tuvieron concentración de leptina en el suero significativamente más alta. Además, estos autores también mostraron que las vacas con un balance de energía negativo (fuertemente relacionado con el peso del cuerpo inferior y la condición del cuerpo inferior) tuvieron concentración de leptina en el suero significativamente menor comparado con las vacas de balance de energía positivo. En los presentes datos, la concentración de leptina en el suero está positivamente relacionada con la ingesta de alimento (r = 0.26) y peso del cuerpo (r = 0.25), confirmando de esta manera los descubrimientos por Liefers y colaboradores (2003) . Se ha observado en ratones que los ratones obviamente obesos con leptina en el suero más alta todavía continuaron comiendo más (Houseknecht y colaboradores, J Amm Sci . 1998 May; 76 ( 5 ) : 1405-20 ) . La evidencia en la literatura muestra que la respuesta de los efectos de retroalimentación inhibidores de leptina es más sensible en animales más flacos, y la sensibilidad es grandemente reducida en animales con almacenes de grasa más grandes (el ganado vacuno generalmente tiene contenido de grasa del cuerpo más alto reminiscente de la obesidad en otras especies), aunque las concentraciones circulantes de leptina en el último grupo son altas (Houseknecht y colaboradores, J Anim Sci. 1998 May; 76 ( 5 ) : 1 05-20 ) . Quizás, los descubrimientos de este estudio puede formar la base de la resistencia del leptina en el ganado vacuno. Este fenómeno de la resistencia de leptina en ciertos individuos obesos todavía no es entendido claramente, aunque se ha sugerido que algunas de las formas de receptor de leptina pueden estar involucrada en la incidencia de la resistencia de leptina (Houseknecht y colaboradores, J Anim Sci. 1998 May; 76(5) : 1405-20) . El espesor de grasa posterior promedio (efecto aditivo, a = -2.29 ± 0.50 ram) ; espesor de grasa posterior (efecto aditivo, a = -4.31 ± 0.95 mm) ; y el espesor de grasa posterior de ultrasonido fueron significativamente más altos (P < 0.001) para animales con el alelo T de UASMS2 que para animales con el alelo C. De manera similar, el alelo T de UASMS2 fue significativamente asociado con el registro de marmoleo de ultrasonido promedio más alto (P < 0.01) (efecto aditivo, a = -0.61 ± 0.21) y el registro de marmoleo final (efecto aditivo, a = -0.89 ± 0.25, P < 0.01) comparado con el alelo C. Estos resultados no son sorprendentes ya que la relación entre el marmoleo de ultrasonido y el espesor de grasa posterior en el conjunto de datos presentes también fue alto (r = 0.54) (datos no mostrados) . Tomado con un peso del cuerpo constante de 500 kg a través de predicciones de regresión lineales, los animales con el genotipo TT de UASMS2 tuvieron grasa posterior de ultrasonido significativamente más alta (P < 0.001) y registros de marmoleo (P < 0.01) comparados con los animales con los genotipos CC . Los incrementos significantes en la grasa del cuerpo en animales con el alelo T de UASMS2 estuvo asociado con reducciones ligeras (P < 0.05) en el área de longissimus thoracis final (efecto aditivo, a = 5.60 ± 2.50 cnr, ) y promedio (efecto aditivo, a = 4.03 ± 1.58 cm2) . Las medidas del peso del canal y la grasa del cuerpo fueron generalmente más altas en animales con el alelo T comparados con el alelo C. Sin embargo, hubo solo unos cuantos animales con el genotipo TT que tuvieron datos del canal para comparación y asi no hubo diferencias significantes entre los genotipos de UASMS2 en estos atributos del canal. Lo opuesto es verdadero con medidas del canal del rendimiento de carne magra y el área del músculo longissimus. El análisis de datos categóricos de los grados del canal (A, AA, y AAA) entre los genotipos de UAS S2 no mostraron asociaciones significantes entre el grado de calidad y los genotipos (?2 = 1.14, P = 0.56) (Tabla 11) . La ingesta de alimento residual tendió a diferir (P < 0.10) entre los genotipos UAS S2 y fue menor en CT (efecto de dominancia, d = 0.42 ± 0.21 kg d"1) que en los homocigotos . La relación de conversión de alimento y la eficiencia parcial de crecimiento no difirió (P > 0.30) entre los genotipos de UASMS2. Los presentes datos también no mostraron significado estadístico en el peso final, peso del cuerpo medio, peso en el sacrificio y peso del canal entre los animales con diferentes genotipos UASMS2 (obviamente debido a los muy pocos animales TT disponibles para la comparación y asociados con los errores estándares altos de los medios de genotipos) . Sin embargo, el alelo T estuvo generalmente asociado con los pesos del cuerpo más altos con diferencias entre los animales TT y CC en el peso del cuerpo medio, el peso final y el peso en el sacrificio de 30.34 kg, 42.02 kg y 36.37 kg, respectivamente. La duración de alimentación (efecto de dominancia, J = 5.07 ± 2.61 min d"1) y el tiempo con la cabeza hacia abajo alimentándose (efecto de dominancia, d = 5.12 ± 2.51 min d"1) digirió entre los genotipos y fueron mas altos en heterocigotos de UASMS2 que los homocigotos (P < 0.05). La frecuencia de alimentación tendió a diferir entre los genotipos (P < 0.10) entre los genotipos de UASMS2 y fue más alta para los animales CC que para los animales TT (efecto aditivo, a = 4.47 ± 2.86 eventos d"1) . Ejemplo 6: Asociaciones de EXON2-FB con varios atributos fenotipicos El efecto de diferentes genotipos de EXON2-FB sobre las medidas de concentración de leptina en el suero, desempeño, eficiencia del alimento, comportamiento de alimentación y ultrasonido y valia del canal se presenta en las Tablas 9 y 10. El peso del punto medio metabólico fue inferior (P < 0.05) para animales con el genotipo TT que para CC (efecto aditivo, a = 4.16 ± 1.61 kg, 5) . La ganancia diaria promedio tendió a diferir entre los genotipos (P < 0.10) y fue menor en los animales TT comparado con los animales CC (efecto aditivo, a = 0.12 + 0.05 kg d'1) . El espesor de grasa posterior promedio (efecto aditivo, a = -0.56 ± 0.19 mm) y la grasa posterior de ultrasonido final (efecto aditivo, a = -1.07 ± 0.17 mm) fueron menores (P < 0.05) para animales con genotipo CC que para TT (Buchanan y colaboradores, Genet Sel Evol. 2002 Jan-Feb; 3 ( 1 ) : 105- 16 ) . La duración de alimentación tendió a diferir (P = 0.08) entre los genotipos del EXON2-FB y fue más alta para animales CC que para animales CT (desviación de dominancia, a = -2.71 ± 1.63 eventos d^1) . La frecuencia de alimentación fue diferente (P = 0.01) entre los genotipos del EXON2-FB y fue más alta para los animales TT que para los animales CT (desviación de dominancia, a = -2.66 ± 1.11 eventos d"1') o animales CC (efecto aditivo, a = -3.30 ± 1.51 eventos d~ 1 ) · Tabla 9: Efecto de los diferentes genotipos del EXON2-FB (media de mínimos cuadrados ± error es tanda r) sobre las medias de íeptina en el suero, desempeño , eficiencia y comportamiento de alimentación del ganado vacuno híbrido E:-:0M2-FB Genoipo de marcador1 Atrributo CC CT TT valor P1' Número de animales 50 63 32 Leptina en el suero, desempeño y eficiencia Nivel de leptina en el suero, ng ml"! 13.69±1.13 12.8610.99 13.02±1.43 0.78 Peso medio meta ólico, kg '' 88.9311.2-1 So.17±1.07 8-1.77±1.57 0.02 Ganancia diaria promedio, kg d ' 1. 3±0.0'! 1.36+0.04 132±0.05 0.07 Ingesta de alimento residual, kg d"' -0.44±0.24 -0.63+0.24 -0.61±0.27 0.40 Relación de conversión de alimento d .07 +0.11 .01+0.12 6.08±0.18 0.89 Ingesta de material seca, kg d ' 7.73±0.53 7.51+0.53 7.45+0.54 0.21 Consumo de ME, J kg" d ' 1069.3+62.7 10 1.1±62.9 1035.5+6 .4 0.22 Eficiencia parcial de crecimiento, 0.33+0.02 0.3410.02 0.33±0.02 0.50 Comportamiento de alimentación Duración de alimentación, min d 1 56.19±7.40 52.05+7.46 52. 6± .58 0.08 Tiempo con la cabeza hacia abajo, min d"1 36.44±3.24 33.19±3.09 33.55±3.35 0.18 Frecuencia de alimentación, eventos d'1 32.04±i .88 31.03+1.81 35.34±2.08 0.01 2 El polimof ismo EXON2-FB es una sustitución C/T localizada en la posición 305 del exón 2 del gen leptina bovino de acuedo con SEQ ID NO: 5 (GenBank acceso no. AY138588-Buchanan y colaboradores, 2002) . y Valor P = probabilidad de diferencias entre diferentes genotipos marcadores , Tabla 10: Efecto de diferentes genotipos de EXON2-FB (medía de mínimos cuadrados ± error estándar) sobre las medidas del peso del cuerpo, ultrasonido y valía del canal del ganado vacuno híbrido E ON2-FB Genotipo marcador"' Atributo CC CT TT valor P-'' Número de animales 50 68 32 Peso del cuerpo y datos de ultrasonido Mediciones Iniciales (Eneo 10) Grado de grasa, mm 8.98±0.56 3.19±0.48 9.55+0.65 0.23 Grasa posterior promedio, mm 10.51±0. 8 9.72+0.50 .10.99+0.68 0.29 Registro de marmoleo del canal 2.37±0.09 2.2110.08 2.4410.11 0.20 Area de L. thoracis, cnr 76.12+2.73 75.18+2.60 7 .63±2.54 0.67 Rendimiento de carne magra, 58.07+0.54 58.76+0.46 57.63±0.63 0.32 El polimorfismo EXON2-FB es una sustitución de C/T localizada en la posición 305 del exón 2 del gen leptina bovino de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 (GenBank acceso no. AY138588 - ver también Buchanan y colaboradores, 2002) . y Valor P = Probabilidad de diferencias entre diferentes genotipos marcadores ? Promedio de cinco mediciones tomadas entre Enero 10 y mayo 01 en intervalos aproximadamente mensuales El peso del cuerpo final (efecto aditivo, a = 30.32 ± 9.9 kg) y el peso del canal (efecto aditivo, a = 19.82 ± 5.78 kg), P = 0.01) fueron menos (P < 0.05) para animales TT del EXON2-FB comparado con los animales CC . No se detectaron asociaciones significantes entre EXON2-FB y los otros atributos estudiados. Las medidas de la grasa del canal fueron generalmente más altas y las medidas del rendimiento de carne magra del canal y el área del músculo longissimus fueron menores para los animales TT comparados con ios animales CC de EXON2-FB, aunque no se detectó significado estadístico. El análisis de chi-cuadrado de los grados del canal (A, AA, y AAA) entre los genotipos de EX0N2-FB no mostraron asociación significante entre el grado de calidad y los genotipos (?2 = 0.95, P = 0.62) (Tabla 11) . Tres polimorfismos en el promotor de leptina bovino están asociados con la proporción de crecimiento, peso del cuerpo, ingesta de alimento, comportamiento de alimentación y valia de ultrasonido. Aunque algunas diferencias en la grasa del canal se detectaron, estas no fueron estadísticamente significantes, posiblemente debido a la remoción de algunos animales extremos basados sobre la ingesta de alimento residual (correlación entre RFI y la grasa posterior es aproximadamente r = 0.25) para algunos estudios metabólicos. Además, uno de los marcadores, UASMS2 está asociado con los niveles de leptina en el suero en el Ganado vacuno. La frecuencia de este SNP fue muy baja en tanto la población experimental como las cinco líneas comerciales de ganado vacuno estudiadas. Tabla 11: Distribución de los grados de calidad del canal entre los genotipos de los diferentes marcadores Grados de calidad del canal Polimorf ismo Genotipo A AA AAA Prueba de chi-cuadrado CC-CC 5 10 7 UASMS1-3 CT-CG 13 27 9 ?2=1.37, P=0.50 TT-GG 7 23 8 CC 20 40 16 UASMS2 CT 4 18 7 ?2=1.14, P=0.56 T ]. 2 1 CC 6 22 8 EX0N2-FB C 14 25 8 ?2=0.95, P=0.62 TT 5 13 8 Distinto a los polimorfismos UASMS1 y UASMS3, los polimorfismos UASMS2 y UASMS3 no están enlazados. Esto se puede observar en la Tabla 12 que ilustra el desequilibrio de enlace entre los polimorfismos UAS S2 y UASMS3. Tabla 12 Prueba de desequilibrio de enlace utilizando desviaciones en porcentaje de las combinaciones de genotipo emparejadas observadas de las esperada s de UASMS3 y UASMS2 Ejemplo 7 : Asociación de múltiples SNPs en el gen leptina con los atributos de calidad del canal y de la carne en el ganado para carne de res Cinco SNPs (UASMS1, UASMS2, UASMS3, E2JW y EXON2- FB) se determinaron en genotipo sobre 1,111 toros, vaquillas y novillos cruzados. Los atributos medidos incluyeron el rendimiento de grasa, carne magra y huesos (%) mediante la disección de la costilla parcial, grado de grasa, área del músculo longissimus (LM) , peso del canal caliente, grado de calidad, grasa intramuscular de LM, y la evaluación de blandura de LM y músculo semi tendinoso . Solo cuatro SNPs se analizaron (UASMS1, UASMS2, E2JW y EX0N2-FB) debido a que UASMS1 y UASMS3 fueron completamente enlazados. Un modelo de animal de herencia mezclada univariada se utilizó para guardar la asociación de los genotipos o haplotipos SNP con ios atributos. Los dos SNPs del exón 2 de leptina se asociaron con el rendimiento de grasa y carne magra y el grado de grasa (E2J , P < 0.01; EXON2-FB, P < 0.05) e interactuaron en su efecto sobre la blandura de LM (P < 0.01) . El promotor de leptina SNP fueron ya sea no asociados con cualquiera de los atributos (UASMS2) o con el rendimiento de grasa solamente (UASMS1) . Tres haplotipos (TCAC, CCAT, TTAC) fueron de alta frecuencia en la población (88%) y tuvieron efectos similares sobre todos loa tributos. Comparado con los haplotipos comunes, un haplotipo (CCTT) mostró un efecto significativamente diferente sobre FATYL, GFAT y LEANYL (P < 0.01) y un haplotipo ( TTTT ) sobre la blandura de LM (P < 0.03) . Por lo tanto, asociaciones importantes entre polimorfismo de nucleótido individual dentro del gen leptina con el rendimiento y blandura de la carne magra se detectaron. Ganado vacuno: Los animales fueron vaquillas (165) , novillos (231) y toros (61) comercialmente alimentados de sementales industriales, vaquillas (40) , novillos (375) , y toros (48) del proyecto de reproducción de University of Guelph y los novillos de un experimento de alimentación de University of Guelph llevado a cabo en un lote de alimento en Rockwood, Ontario. Las tres fuentes de ganado se identificaron como Comrnercial, Elora y Rockwood, respectivamente. Los animales se cruzaron con la composición de raza formadas por varias razas. Las mayores razas contribuyentes fueron Angus (AN) , Charoláis (CH) , Limousin (LM) , y Simmental (SM) . La contribución promedio de estas cuatro razas a la composición de raza de los animales que tiene cualquier fracción de las razas mencionadas fueron 0.46, 0.50, 0.50, y 0.50 para AN , CH, LM, y SM, respectivamente, para ganado vacuno Comercial; 0.24, 0.36, 0.38, y 0.41 para ganado vacuno Elora; y 0.51, 0.53, 0.59, y 0.41 para ganado vacuno Rockwood. Aislamiento de DNñ, detección de polimorfismos y determinación de genotipo : EXON2-FB (Buchanan y colaboradores, Genet Sel Evol . 2002 Jan-Feb; 34 ( 1 ) : 105-16) y E2JW (Lagonigro y colaboradores, Anim Genet. 2003 Oct; 34(5) : 371-4, originalmente referido como 252-SNP) estuvieron dentro del exón 2 del gen ob. La determinación de genotipo de cada SNP se llevó a cabo utilizando el ensayo de discriminación alélica de nucleasa 5' sobre un detector de secuencia ??? PRISM™ 7700 (Applied Biosystems Inc.). Los detalles de los procedimientos fueron descritos por Nkrumah y colaboradores (J Anim Sci. 2005 Jan; 83(1) :20-8) incorporada en la presente por referencia en su totalidad. El DNA de un sobconjunto de animales determinados en genotipo se secuenció a través de cada polimorfismo y los resultados de la secuencia se utilizaron para confirmar los genotipos obtenidos mediante los ensayos de discriminación. Información fenotipica: Información sobre la blandura del músculo Longissimus (fuerza cortante) en 2(LM2), 7 (LM7), 14(LM14) y 21(LM21) días postmortem y del músculo Semitendinoso en 7(ST7) días postmortem, grasa química (CF) , grado de grasa (GFAT), grado de calidad (QG) , área del músculo Longissimus (LMA) , carne magra (LEANYL) , grasa (FATYL) y rendimiento del hueso (BONEYL) y peso del canal caliente (HCW) estuvieron disponibles en la mayoría de los 1,111 animales determinados en genotipo como es mostrado en la Tabla 13 enseguida. Tabla 13. Número de registros fenotípicos sobre los atributos de calidad del canal y de la carne con medias correspondientes SD, y coeficiente de variación (CV) Atributos3 Registros Media SD CV (%) FATYL (%) 905 24.5 5.12 20.9 LEANYL (%) 905 56.1 5.03 9.0 BONEYL (%) 905 19.4 2.62 13.5 GFAT (mm) 914 9.3 3.37 36.2 LMA (cm2) 892 86.7 13.64 15.7 HCW (kg) 911 336.0 49.23 14.7 LM2 (kg) 711 5.3 1.71 32.3 L 7 (kg) 876 4.8 1.40 29.2 LM14 (kg) 875 4.3 1.25 29.1 LM21 (kg) 869 3.8 0.96 25.3 L AVG (kg) 707 4.5 1.03 22.9 ST7 (kg) 869 5.3 1.10 20.7 CF (%) 920 4.0 1.58 39.5 QGb 915 A-15.4 AAA-25-5% aa-59.1% a Rendimiento de carne magra (LEANYL) , grasa (FATYL) y hueso (BONEYL) , grado de grasa (GFAT) , área del músculo Longissimus (LMA), peso del canal caliente (HCW), fuerza cortante del músculo Longissimus (LM) en 2, 7, 14 y 21 días postmortem y fuerza cortante promedio a través de los tiempos de enve ecimiento (LMAVG) , fuerza cortante del músculo semitendinoso (ST) en 7 dias postmortem, grasa química del músculo longissimus (CF) , grado de calidad (QG) . Frecuencia observada de los grados de calidad Las mediciones de fuerza cortante de Warner-Bratzler (kg) se utilizaron como un método objetivo para estimar la blandura (Shackelford y colaboradores, 1999). La fuerza cortante es la prueba física hecha sobre una muestra de núcleo de carne cocida que determina la fuerza (en kg) necesaria para separar las fibras de músculo. El grado de grasa es la medición de espesor de grasa posterior tomada en la interface de la 12a y 13a costilla. El área de músculo Longissimus es la medida del área del músculo dorsal Longissimus en la interfase de la 12a y 13a costilla utilizando un rastreo del músculo. La grasa química es análisis químico sobre una muestra de carne de núcleo que determina el por ciento de grasa intramuscular. El tendimiento de carne magra, grasa y huesos se determinaron mediante la disección de una sección de costilla de 4 huesos. El grado de calidad es el grado de marmoleo utilizado para la clasificación en Canadá con la mayoría de los canales que caen en uno de tres grados (A, AA, AAA) . Debido a que solo pocos canales se clasificaron como primarios, esos animales se combinaron con los canales AAA para los análisis. Resultados: Un total de 1,104, 1,111, 1,106, 1,068 y 1,109 animales tuvieron genotipos disponibles para los SNPs UASMS1, UASMS2, UASMS3, EXON2-FB y E2JW, respectivamente. Los genotipos para UASMS1 y UASMS3 fueron casi perfectamente enlazados. Solamente tres de cada 1,104 genotipos para UASMS1 y UASMS3 no se igualaron entre si (esto es, los alelos C y T en UAS S1 no se asociaron con los alelos C y G en UASMS3, respectivamente, en solamente tres animales) . Así, UASM3S fue quitado de los análisis y las f ecuencias de alelo y la asociación con los atributos para UASMS1 se extendieron a UASMS3. Los genotipos de todos los animales se utilizaron para determinar las frecuencias alélicas. Para el estudio de asociación en tres SNPs en el gen ob y los atributos de calidad del canal y de la carne, solamente los animales con información fenotipica requerida y con genotipos disponibles para todos los cuatro SNPs (UASMS1, UASMS2 , E2JW y EX0N2-FB) se utilizaron. El mismo resultante de registros varia de 711 para LM2 a 920 para CF. La Tabla 13 da el número de registros, la media, SD y el coeficiente de variación de los atributos analizados. Análisis estadístico : Todos los análisis se realizaron utilizando el software estadístico SAS ( SAS Institute Inc.,) y ASREML (Gilmour y colaboradores). Las características descriptivas de los atributos cuantitativos se obtuvieron utilizando SAS PROC MEANS. Las frecuencias de alelo fueron tabuladas y comparadas mediante el análisis de Chi-cuadrado utilizando SAS PROC FREQ. En un segundo lote de animales de prueba, las asociaciones entre las combinaciones de genotipos se estudiaron, los datos que son mostrados en las FIGS. 11-20. Asociaciones de los marcadores individuales y los atributos en el ganado vacuno de prueba se resumen en la FIG. 21. Ejemplo 8: Análisis de Genotipo La asociación de los genotipos con los atributos se evaluó mediante el análisis genético utilizando ASREML, ajusfando un modelo de herencia mezclada (genotipos SNP más efectos poligénicos ) . El modelo incluyó los genotipos SNP como efectos fijos: Yijkim=u + ?4 (:i=i, Geni(j, + Sexk + Slgi + ß??? + 2LM + ß3?? + ß4?? + Polm + ei kim (1) Donde : Yijkim es el atributo medido en el m-avo animal para k-avo sexo y 1-avo grupo de sacrificio; u es la media total para el atributo; Gen1(]) es el efecto del i-avo genotipo para j-avo SNP (UASMS1, UASMS2, E2JW, y EXON2-FB) en el gen leptina; Sexk es el efecto fijo del k-avo sexo (toro, vaquilla y novillo) ; Slgi es el efecto fijo del 1-avo grupo de sacrificio (94 niveles) ; ß?, ß2, ß3, ß¾ son los coeficientes de regresión sobre la composición de raza de AN, CH, LM, y SM, respectivamente; Polm es el efecto genético (poligénico) aditivo aleatorio del m-avo animal; e^kim es el efecto aleatorio residual asociado con el m-avo animal. Después de Fernando y colaboradores, (J Dairy Sci. 1998 Sep; 81 Suppl 2:64-75), como los genotipos fueron conocidos, las ecuaciones de modelo mezclado de CR Henderson para el modelo (1) se utilizaron en los análisis. La matriz de relación aditiva basada sobre el pedigree general se utilizaron para modelar las covariaciones entre los efectos poligénicos. Los animales se originaron de 125 sementales y todos los sementales fueron conocidos. Con respecto a las madres, 43% de los animales tuvieron madres identificadas. El tamaño promedio de las familias semi-consanguineas paternales fue 8.9. Los porcentajes de sementales con menor que 5, desde a, desde 6 a 10 y más de 15 descendientes fueron 36%, 26.4%, 27.2% y 10.4%, respecti amente. Los grupos de sacrificio se definieron como animales de la misma fuente (Commercial o Rockwood) y con la misma fecha de sacrificio o animales de Elora que vienen del mismo experimento y tratamiento de alimento, y matados en la misma temporada (Diciembre-Febrero, Marzo-Mayo, Junio-Agosto y Septiembre-Noviembre) . Las mediciones de fuerza cortante repetidas de LM a través de periodos postmortem se analizaron individualmente dentro de cada periodo, como la fuerza cortante promedio a través de los periodos (LMAVG) , y como la intercepción y pendiente de la regresión lineal individual de mediciones de fuerza cortante en días postmortem. El efecto de los cuatro SNP en el gen Leptina sobre el grado de calidad se analizó mediante el análisis de chi-cuadrado ( PROC FREQ) , asi como un atributo 1 ineal utilizando ASRE L , mode1o de aplicación (1). En este caso, los registros de 1, 2, y 3 se asignaron a los grados de calidad A, AA y AAA, respectivamente. Para conservar los valores de probabilidad razonables para el error de Tipo I, dos niveles de prueba se realizaron. Para la estimación inicial de los resultados, un valor total de P < 0.05 (a) se utilizó. Para una revisión más detallada de los resultados, se utilizó una corrección de Bonferroni modificada (a/Vn, Mantel, Arch Toxicol Suppl . 1980 ; 3:305-10, Mantel, Biometrics. 1980 Sep; 36 ( 3 ) : 381-99 ) para tener en cuenta el número de pruebas. El valor de n se determinó utilizando un procedimiento similar a SNP combinado con el agrupamiento de atributos de acuerdo con el tipo (Ye y colaboradores, Yi Chuan. 2003 Jan; 25 ( 1 ) : 89-92 ) . Los atributos se agruparon en dos grupos como sigue: atributos de rendimiento del canal (LEANYL, FA'fYL , BONEYL , GFAT , LMA, y HCW) y atributos de la calidad de la carne (CF, QG, LM, LM, LM, LM, LMAVG y ST) . Debido a que hubo cuatro SNPs, n fue igual a 24 (4x6) y 32 (4x8) para los atributos de calidad del canal y de la carne, respectivamente, con los niveles de significado corregidos de Bonferroni modificados correspondientes de 0.010 y 0.009. Inicialmente las interacciones de dos vías entre SNP se ajustaron en el modelo, pero hubo solamente una interacción significante entre el SNP E2JW y EXON2-FB para la fuerza cortante de L . Para todos los otros atributos, las interacciones fueron bajadas del modelo. Para la fuerza cortante de LM, el efecto de genotipo conjunto de E2JW y EX0N2-FB se incluyó en el modelo. Las variaciones se estimaron a partir de los datos y se supusieron conocidas para propósitos de estimación y de prueba. Las probabilidades asociadas con la salida estadística Wald F mediante ASREML se obtuvieron utilizando grados de libertad de error que tienen en cuenta los efectos fijados estimados, pero ignoran el hecho de las variaciones que fueron estimadas. Esto, sin embargo, no debe ser un problema, debido a que el número de registros sobre todos los atributos fue relativamente alto y las variaciones se estimaron mediante funciones invariantes de traducción de los datos mediante REML. Ejemplo 9: Análisis de haplotipo La asociación de los haplotipos para SNP en el gen Leptina y los atributos de calidad del canal de la carne se evaluó mediante el análisis genético utilizando ASREML, aplicando el modelo (1) que reemplaza los efectos de genotipo por regresiones sobre probabilidades de haplotipo. Las probabilidades de haplotipo se reconstruyeron utilizando el algoritmo y software (HAPROB) (Boettcher y colaboradores, J Dairy Sci. 2004 Dec; 87 ( 12 ) : 4303-10 ) . Este software estimó las probabilidades de combinaciones de haplotipo para miembros de familias semi consanguíneas, dados esos genotipos que son conocidos para todos los consanguíneos, pero desconocidos para todos los padres. La presión de la recons rucción de los haplotipos semi consanguíneos por el software HAPROB es considerablemente alta. Por ejemplo, la presión varía de 64% a 94% para la reconstrucción de haplotipos de individuos de familias semi consanguíneas del tamaño de 2 a 10 descendientes, donde tres posiciones con tres alelos con consideradas (Boettcher y colaboradores, J Dairy Sci . 2004 Dec; 87 ( 12 ) : 4303- 10 ) . La Tabla 14 muestra los dieciséis haplotipos posibles con sus probabilidades correspondientes . Tabla 14. Probabilidades de haplotipos en la población de ganado de carne de res Haplotipos UASMS1 UASMS2 E2JW EXON2 - Prob Ia Prob 2 Códigob FB T c A C 0.34241 0.35177 1 c c A T 0.33621 0.33133 2 T T A c 0.20399 0.20407 3 c c A c 0.02217 0.02116 4. T c A T 0.02037 0.02084 5 T T A T 0.01862 0.01532 6 c c T T 0.01757 0.01717 7 T T T T 0.01619 0.01215 8 c T A T 0.01550 0.01465 9 c T A c 0.00379 0.00362 10 T c T T 0.00272 0.00212 10 T c T c 0.00201 0.00237 10 T T T c 0.00166 0.00166 10 c T T T 0.00098 0.00104 10 c c T c 0.00038 0.00031 10 c T T c 0.00036 0.00047 10 a Prob 1 = Probabilidad del haplotipo en todos los animales determinados en genotipo; Prob 2 = Probabilidad del haplotipo en los animales determinados en genotipo para todos los cuatro SNP y con registros fenotipicos. Código de haplotipo para los análisis. Los tres haplotipos mucho más frecuentes tuvieron una probabilidad sumada de 0.88. Por lo tanto, hubo mucho haplotipos raros y algunos de estos se unieron en un grupo que contiene los haplotipos menos probables, que fueron referidos como haplotipo 10. Ejemplo 10 : Frecuencias de Alelo La prueba de Chi-cuadrado para diferencias en la frecuencia de alelo entre las razas (animales con composición de aza =5/8 para una raza dada) no fue significante para cualquier SNP en el gen Leptina como es mostrado en la Tabla 15. Tabla 15. Frecuencias de alelos (%) dentro de las razas y en la población de Ganado de carne de res complete para los SNP UASMS1, UASMS2 , E2JW y EXON2-FB en el gen Leptina Raza3 SNP Alelos Angus Limousin Charoláis Simmental Otra Total UASMS1 C 48.8 48.3 45.4 34.6 38.4 38.9 T 51.2 51.7 54.6 65.4 61.6 61.1 M 4 3 30 1 1 6S 952 1 , 1 04 UASMS2 C 73.3 65.5 77.3 69.8 74.4 73.8 T 26.7 34.5 22.7 30.2 25.6 26.1 N 4 3 29 1 1 63 950 1,111 EX0N2- C 45.4 51.7 54.6 58.8 58.3 57.6 FB T 54.6 48.3 45.4 41.2 41.7 42.4 N 4 3 30 1 1 6S 91 6 1 , 068 E2JW A 95.4 95.0 90.9 97.8 96.0 96.0 T 4.6 5.0 9.1 2.2 4.0 4.0 N 43 30 11 6S 957 1 , 1 09 a Animales con la composición de raza =5/8 para una raza dada. Otros animales incluidos con la composición de raza =5/8 para todas las razas. b Nada de diferencias significantes en las frecuencias de alelo entre las razas (P = 0.11, P = 0.46, P = 0.15, y P = 0.47 mediante la prueba de Chi-cuadrado para UASMS1, UASMS2, EXON2-FB, y E2JW, respectivamente) . c Número de animales. Sin embargo, para UASMS1, Simmental dió a tender la frecuencia menor del alelo C en las otras razas (P = 0.11) y, para EXON2-EB, Angus tendió a tender la frecuencia menor del alelo C que las otras razas (P =0.15) . El alelo T fue predominante sobre el alelo C para UASMS1 y EXON2-FB (57.6% contra 42.4% y 61.1% contra 38.9%, respectivamente) , mientras que para UASMS2 el alelo C fue mucho más común que T (73.8% contra 26.1%) . El SNP E2J mostró la diferencia más grande en las frecuencias de alelo en la población. A este SNP, el alelo T fue raro comparado con el alelo A (4.0% contra 96.0%) . Las frecuencias de ios genotipos estuvieron de acuerdo con el equilibrio de Hardy-Weinberg (Falconer y Mackay, 1996) dentro de todos los SNP (las probabilidades de las pruebas de Chi-cuadrado para la desviación del equilibrio fueron iguales a 0.745, 0.169, 0.975 y 0.995 para UASMS1, UASMS2 , E2JW y EXON2-FB, respectivamente) . El equilibrio en las frecuencias genotipicas cuando se consideran con untamente dos SNP se probó mediante una prueba de ChiCuadrado de las frecuencias esperadas y observadas de tipos gaméticos (Falconer y Mackay, 1996) . Los únicos dos SNP buyos genotipos estuvieron conjuntamente en equilibrio fueron UASMSi y E2JW. Todas las otras pruebas emparejadas mostraron un desequilibrio significante (P < 0.01) . Ejemplo 11 : Análisis de genotipo Los genotipos no influenciaron significativamente LMA, BONEYL, CF, HCW, S'1'7 y QG como es mostrado en la Tabla 16. Tabla 16. Prueba para la asociación de SNPs en el gen Leptina con el rendimiento de carne magra (LEANYL) , grasa (FATYL) y hueso (BONEYL) , grado de grasa (GFAT) , grasa química (CF) , área del músculo Longiss i us (LMA) , peso del canal caliente (HCW) , fuerza cortante del músculo Longissimus (LM) en 2, 7, 14 and 21 días postmortem y fuerza cortante promedio (LMAVG), fuerza cortante del músculo semi tendinoso (ST) en 7 días postmorte , y grado de calidad (QG) en la población de ganado de carne de res. P>Fa SNP en el gen Leptina Atributo UASMS1 IASMS2 E2JW EXON2-FB LEANYL 0.110 0.278 0.003 0.038 F'ATYL 0.012 0.387 0.010 0.013 BONEYL 0.664 0.101 0.277 1.000 GFAT 0.081 0.449 0.006 0.016 LMA 0.771 0.110 0.216 0.795 HCW 0.691 0.625 0.764 0.787 CF 0.861 0.932 0.603 0.712 LM2 0.779 0.819 0.005 LM7 0.403 0.795 0.054 L 14 0.098 0.364 0.009 LM21 0.733 0.353 0.085 LMAVG 0.566 0.419 0.001 ST7 0.887 0.0 0.011 0.502 QG 0.492 0.970 0.777 0.619 QG Chi- 0.14 ]. 0.734 0.300 0.472 a Nivel de significado en la prueba F de Walt; para el efecto de genotipos sobre los atributos de calidad del canal y déla carne. Para QG, una prueba Chi-cuadrado para los efectos de los genotipos también se realizó. Para la blandura del músculo longissimus, una interacción significante entre E2JW y EX0N2-FB se encontró. Los genotipos para estos dos SNP se analizaron con untamente. Los genotipos para E2JW y EX0N2-FB significativamente influenciaron LEA YL, FATYL y G AT, mientras que los genotipos para UASMS1 (o al ernativamente, UASMS3) significativamente influenciaron FATYL. Los an'qlisis de la fuerza cortante de LM cada día postmortem particular y como una fuerza cortante promedio durante los días postmortem mostró un efecto significante de los genotipos E2 J'W . EXON2- FB (la interacción de E2JW mediante EX0N2-FB fue significante (Tabla 16) ) . La Tabla 17 presenta las medias de mínimos cuadrados para los genotipos UASMSl, E2JW, y EX0N2-FB y las razas con los niveles de significado correspondientes de las pruebas F de Wald para LEANYL, FATYL, y GFAT. Tabla 17. Asociación de SNP en el g n Leptína con el rendimiento de carne magra (LEANYL) , rendimiento de grasa (FATYL) y grado de grasa (GFAT) en la población de ganado de carne de res Atributo FATYL ( % ) GFAT (nuil) LEANYL (%) Hereciabi 1 idad 0.62±0.14 0.45±0.15 0.52 + 0.14 poligénica : SNP Genotipo Medias de mínimos cuadrados'1 ?? 22.4 + 0.69a 8.9±0.59a 58.6+0.90a E2 JW ?? 23.9±087b 10.1 + 0.46b 56.8±0.71b P>F 0.010 * 0.006 * 0.003 * CT 21.8+1.00a 8.7±0.69a 59.1±1.04a EX0 2-FB CP 24.0 + 0.78b 10.2±0. 4b 57.1+0.71b T 23.7±0.88ab 9.7±0.61ab 56.9±0.91b P> F 0.013 0.016 0.038 CC 22.9 + 1.05ab 9.5±0.73a 58.1+1.10a UASMS1 CT 22.3±0.84a 9.1±0.57a 58.3+0.87a TT 24.410.81b 10.1±0.56a 56.7+0.85a P>F 0.012 0.081 0.110 Otros efectos Medias de mínimos cuadrados SM 20.1+1.12 8.2+0.77 59.1+1.16 Raza LM 22.411.33 9.4 ± 0.87 59.9±1.34 CH 23.311.26 9.410.86 58.3 + 1.30 AN 26.9+1.02 11.210.68 53.5+1.04 P>Ub 0.011 0.006 0.009 Sexo P>F 0.273 0.705 0.613 Slgrc P>F 0.000 0.000 0.000 a Medias seguidas por diferentes letras son significativamente diferentes (P < 0.05) b Prueba para ios coeficientes de regresión sobre la composición de raza. La prueba F de Walt más grande es mostrada . c Slgr es el efecto del grupo de sacrificio. * Efecto significante del genotipo después de la corrección de Bonferroni modificada para múltiples pruebas en P = 5% . La m sma tabla también presenta la hereclabilidad poligénica estimada para los atributos. Las heredabilidades para FATYL, LEANYL, y GFAT fueron moderadas a altas (0.62, 0.52, y 0.45, respectivamente) , que están de acuerdo con los valores esperados de la literatura (Utrera y colaboradores, Genet Mol Res. 2004 Sep 30; 3 ( 3 ) : 380- 94 ) . Para E2JW, hubo solamente dos animales con genotipo I , que se excluyeron de los análisis. Po lo tanto, solamente se obtuvieron soluciones para genotipos AA y AT . El alelo T fue asociado con menos FATYL y GFAT y más LEANYL cuando se compara con el alelo A. Las diferencias estimadas entre los genotipos heterocigotos y homocigotos fueron -1.5%, -1.2 mm y 1.9% para FATYL , GFAT, y LEANYL, respectivamente (P < 0.05 para todas las diferencias) , correspondientes a 0.29, 0.36, y 0.38 SD fenotipico de los atributos correspondien es, respec ivamente.
Para el E',X0N2-FB, el alelo C fue asociado con menos FATYL y GFAT y más LEANYL cuando se compara con el alelo T. Las diferencias estimadas entre los genotipos homocigotos CC y TT fueron -1.9%, -1.0 mm y 2.3% para FATYL, GFAT, y LEANYL (P = 0.09, P - 0.19 y P = 0.05) , respectivamente. El genotipo heterocigoto tuvo, sin embargo, similar FATYL, LEANYL y GFAT al genotipo TT homocigoLo, indicando un grado más grande de dominancia de T sobre el alelo C. las diferencias en el genotipo CC y el genotipo heterocigoto fueron todas significantes (P < 0.05) y corresponden a 0.43, 0.44, y 0.40 SD fenotipico de los atributos correspondientes, respect i vamen te . Para UASMSl, el alelo C fue asociado con menos FATYL que el alelo T con la diferencia estimada entre los genotipos homocigotos CC y TT igual a -1.5% (P < 0.05) . El genotipo heterocigoto tuvo FATYL similar como el genotipo CC homocigoto, indicando un grado grande de dominancia del alelo C sobre T. Hubo una tendencia (P < 0.15) de que el alelo C podría ser asociado con menos GFAT y más LEANYL comparado con T . La diferencia estimada entre los genotipos homocigotos CC y TT fueron -0.6 mm y 1.4% para GFAT y LEANYL, respectivamente . Las diferencias entre los genotipos para E2JW también fueron significantes considerando la corrección de Bonferroni modificada para pruebas múltiples, que no fue el caso para EX0N2-FB y UASMS, indicando más fuerte evidencia para la asociación de genotipo E2JW con IJ'ATYL, GF'AT, y LEANYL que para EX0N2-FB y UASMS. La Tabla 17 muestra que hubo un efecto significante de la raza sobre EATYL, GFAT, y LEANYL. Angus fue la raza de más grasa y con el menos LEANYL. Simmental tuvo el EATYL y GFAT más bajo seguido por Limousin y Charoláis. Sin embargo, Limousin mostró el LEANYL más alto. No hubo efecto significante del sexo sobre EATYL, GFAT y LEANYL, probablemente debido a que este efecto fue parcialmente confund do con el. grupo de sacrificio, que tuvo un efecto altamente significante (Tabla 17) . Los análisis de la fuerza cortante de LM en cada día postmortem particular mostraron que ios genotipos conjuntos E2 J"W . EX0N2- FB tuvieron un efecto significante sobre la blandura. La Tabla 18 presenta las medias de mínimos cuadrados para los genotipos E2 JW . EX0N2 - FB , con los niveles de significado correspondientes para las pruebas F de ald Tabla 18. Asociación de SNP en el gen Leptina con la blandura (fuerza cortante del músculo Longíssímus (LM) en la población de ganado para carne de res medida en diferentes días postmortem) (2, 7 , 14 y 21 días) . Atributo LM2 N LM7 N LM1 N LM21 N tf 0 . 37 ±0 . 14 720 0 . 09±0 . 10 834 0 . 39 + 0 . 1 4 883 0 . 1 4 ±0 . 10 877 poligénico SNP E2JWxEXO 2- Medias de Mínimos Cuadrados" FB A . CC 5.03±0.46a 240 4.4S±0.28a 299 3.91±0.26 298 3.5610.20a 296 A . CT 5.20+0.39a 328 4.57+0.23a 394 3.81±0.21a 394 3.60±0.17a 390 AA.TT 5.56±0.45a 32S 5.03±0.28a 126 4. 6±0.26b 126 3.62±0.20~ 126 AT . CC NA 0 A 1 HA 1 NA 1 AT . CT 5.00±0.45a 31 4.41±0.27a 41 3.92 +0.26a 41 3.42±0.21a 41 AT . TT 6. Q8+0.53b 1.6 5.53±0.34b 24 4.97±0.31b 24 .11+0.25a 24 P>F 0.005 0.054 0.009 0.035 Otros efectos Raza" P>F 0.033 0.039 0.176 0.130 Sexo 'P F 0.25-1 0. S61 0.763 0.165 Slgrc P>F 0.000 0.000 0.000 0.000 3 Las medias seguidas por diferentes .letras con el mismo genotipo para E2JW son signi icativamente diferentes (P < 0.05) b Prueba para los coeficientes de regresión sobre la composición de raza. La prueba de Wald más grande es mostrada . c Slgr es el efecto del grupo de sacrificio * Efecto significante del genotipo después de la corrección de Bonferroni modificada para pruebas múltiples en P = 5% El qenoLjpo AT . TT fue significativamente asociado con LM más duro. Las diferencias en la fuerza cortante entre los genotipos AT . TT y AT . CT fueron sustanciales (1.98 kg, 1.12 kg, 1.05 kg y 0.69 kg para LM2, LM7, LM14, y LM21, respectivamente) . Los estimados para el genotipo AT . CC no se obtuvieron, debido a que hubo solamente un animal con este genotipo. Las diferencias en la fuerza cortante entre los genotipos AA.TT y AA.CT fueron más pequeñas y principalmente nada significantes. La magnitud de las diferencias entre los genotipos AT . TT contra AT . CT y AA.TT contra AA.CT ilustra la interacción entre el SNP E2JW y EX0N2-FB, donde existe una diferencia más grande para el genotipo de SNP AT E2JW. Los estimados para los genotipos AA.CT y AA.CC no fueron significativamente diferentes. La Tabla 18 también da las heredabi 1 idades poligénicas estimadas, que para LM7 y LM21 fueron menores que para otros días postmortem. Ejemplo 12 : Efectos de los genotipos SNP sobre la blandura Los resultados para la fuerza cortante promedio sobre las cuatro medidas de postmortem (LMAVG) se muestran en la Tabla 19. Tabla 19. Asociación de SNP en el gen Leptina con blandura promedio del músculo hong i ssimus (LM) a través de diferentes días postmortem (LMAVG) y con la intersección (LMIN) y pendiente (LMSL) déla regresión de las mediciones de blandura en días postmortem Atributo LMAVG N LMIN N LMSL N h2 poligénico 0.4210.15 716 0.30±0.13 884 0.08+1.10 884 SNP F2JWXEXON2-F Medias de Mínimos Cuadrados3 AA.CC 4.19±0.27a 239 4.91±0.36a 299 -0.06410.017a 99 AA.CT 4.28±0.23a 325 5.09±0.29a 394 -0.078+0.014a 394 AA . TT 4.53+0.26a 105 5.85±0.35b 126 -0.106±0.017a 126 AT . CC A 0 MA 1 MA 1 AT . CT 4.04±0.26a 31 5.00±0.36a 41 -0.076±0.018a 41 AT . TT 5.36±0.31b 16 6.59±0.43b 24 -0.123+0.021a 24 P>F 0.001 0.007 0.205 Otros efectos Medias de Mínimos Cuadrado SM 5.43±0.34 7.2810.50 -0.16+0.02 Raza LM 4.60±0.37 5.82±0.54 -0.10+0.03 CH 4 ,50±0.36 5. 5±0. 4 -0.1010.03 A .34±0.32 6.12±0.46 -0.12±0.02 P>F" 0.112 0.146 0.127 Sexo P>F 0.105 0.763 0.942 Slgrc P>F 0.000 0.000 0.000 a Las medias seguidas por diferentes letras dentro del mismo genotipo para E2JW son significativamente diferentes (P < 0.05) b Prueba para los coeficientes de regresión sobre la composición de raza. La prueba F de Wald más grande es mos trada . c Slgr es el efecto del grupo de sacrificio. * Efecto significante en el genotipo después de la corrección de Bonferroni modificada para pruebas múltiples en P = 5% Además de Jas medias de mínimos cuadrados de los genotipos, las medias para las razas también se presentan. Los resultados pa a los genotipos E2 J'W . EXON2- IJ'B estuvieron en línea con aquellos encontrados dentro de los diferentes días postmorten, con el genotipo AT.TT que tiene el LM más duro promedio durante el periodo postmortem completo. Una regresión linea] de las medidas repetidas de la fuerza cortante en los días postmortem parra cada animal se estimó y las intersecciones individuales (LMIN) y pendientes (LMSL) se analizaron por el modelo (1) . Los resultados presentados en la Tabla 19 muestran un efecto significante a los genotipos E2JW. EXON2-FB sobre la intersección, pero no sobre la pendiente, indicando que los genotipos E2 JW . EXON2-FB no influenci ron el efecto de enve ecimiento sobre el ablandamiento de la carne de res. Las heredabilidades de la pendiente e intersección de la blandura de LM sobre los tiempos de enve ecimiento (Tabla 19) indican que la intersecc ón es moderadamente heredable, mientras que la pendiente tJene baja heredabií idad . Un efecto de la raza sobre la blandura también se muestra en la Tabla 19, que muestra que Simmental tiene el LM más duro. El grupo de sacrificio tuvo un efecto altamente significante sobre la blandura y el efecto del sexo no fue significante. Asumiendo ya sea las frecuencias de alelo estimadas o frecuencias de alelo iguales (p = q = 0.05) para EXON2-FB, E2JW y UASMS, y utilizando el efecto aditivo estimado (a = ½ de genotipo de Homocigoto l-½ genotipo 2 de Homocigoto ( y el efecto de desviación de dominancia (d = genotipo de Hete ocigoto- [½ de genotipo 1 de Homocigoto ·+ ½ de genotipo 2 de Homocigoto]) para los alelos, el porcentaje de* variación fenotipica explicada por cada polimorfismo se calculó utilizando la fórmula estándar (FALCONER, D. S . , y T. F. C. MAC AY , 1996 In troduction to Quantitative Genetics, Ed A. Longmans Green, Harlow, Essex, UK) : %V = 100* (2pq [a + d(q-p)]2 + [2pqd] ~) /o2p) , donde el %V es el porcentaje de variación fenotipica explicada por el polimorfismo y o2p en la variación fenotipica del atributo. Para E2JW, como el efecto de genotipo TT no se estimó se supuso que ya sea que el alelo T muestra la dominación completa sobre el alelo C o el alelo T tiene efecto aditivo solamente. Suponiendo en la frecuencia de alelo igual, EXON2- FB explicó 3.2%, 3.3%, 3.2% y 23.2% de variación fenotipica para FATYL , GFA'T , LEANYL, y LMAVG , respectivamente (Tabla 20) . Tabla 20. Porcentaje estimado de la variación fenotipica explicada por el SNP en el gen Leptina (E2.JW, EXON2-FB y UASMS1) para el rendimiento de carne magra (LEANYL) , rendimiento de grasa (FATYL), grado de grasa (GFAT) y blandura promedio del músculo Longissimus a través del período de 21 días pos mortem (LMAVG) a Dos frecuencias alélicas se consideraron en los cálculos: ya sea la frecuencia estimada o la misma frecuencia para ambos aleios (50%) b Los cálculos para LMAVG se hicieron utilizando los efectos principales de E2J"W'y EX0N2-FB. c Para E2JW, debido a que no se estimó el efecto de genotipo TT, se supuso que ya sea que el alelo ? que tiene un efecto dominante completo sobre el alelo A o que tiene un efecto aditivo solamente. d Efecto de UASMS1 no fue significante sobre GFAT, LEANYL, y LMAVG . De manera similar E2JW explicó 4.3%, 6.3%, 6.4% y 21.8%, y 1.6%, 2.4%, 2.4% y 8.2%, cuando se supusieron ya sea efectos aditivos o de dominancia completa del alelo T. UASMS1 explicó 2.8% de la variación fenotipica para F'ATYL. Como se muestra en la labia 20, el porcentaje de la variación fenotipica explicada por E2JW fue mucho más pequeña si las secuencias de alelo observadas se utilizaron en los cálculos, debido que el alelo 1 es raro en la población. Como las heredabiiidades poligénicas para FATYL , GFAT, LEANYL, y LMAVG fueron alrededor de 50% (de 42% a 62%), el porcentaje de la variación genética total explicada por cada SNP seria de aproximadamente 2 veces que en relación a la variación fenotipica . Ejemplo 13: Análisis de haplotipo El efecto lineal de 10 haplotipos se estimó. Hubo tres haplotipos altamente frecuentes en la población de ganado de carne de res (88% de todos los haplotipos) , cuyos efectos no difirieron para cualquier atributo analizado, aunque difieren con respecto a los alelos en todos los SNP, excepto E2JW. Esto puede indicar un efecto de otras SNP enlazado a los cuatro SNPs o algún grado de epistasis entre el SnP dentro del mismo cromosoma. El efecto promedio de los tres haplotipos comunes se utilizó como un control y todos los otros haplot pos se contrastaron contra este promedio. Las diferencias en los efectos de alelo dentro de cada SNP se obtuvieron a través de un contraste lineal de soluciones de aplotipo, que difirieron por solamente un alelo en un S P dado. Ftl ha p] o tipo 10 no se utilizó en estos contrastes, debido a que estuvo comprendido del efecto conjunto de varios haplotipos raros. Los haplotipos no difirieron significativamente de los haplotipos mucho más frecuentes y no mostraron cualquiera de las diferencias significantes para los alelos 'dentro de SNP para L A , BONEYL, CP, HCW, S 7 , y QG (datos no mostrados) , en linea con los análisis de genotipo. Para FATYL , GFAT y LEANYL, el efecto del haplotipo 7 (CCTT) fue significativamente diferente de los tres haplotipos más frecuentes en ]a población como se muestra en la Tabla 21. Tabla 21. Asociación de haplotipos para SNP en el gen Leptina con el rendimiento de carne magra (LEANYL) , rendimiento de grasa (FATYL) y grado de grasa (GFAT) en la población de ganado de c rne de res Atributo FATYL ( % ) GFA (mm) LEYANYL (%) Heredabilidad 0.6110.14 0.43±0.14 0.54±0.14 poligénica : Haplotipos mucho más Media de Mínimos Cuadrados frecuentes 1 25.19±1.03a 10.79+ 0.71a 55.7911.07a 2 25.05±1.03a 10.52+0.71a 56.16±1.07a 3 25.30±1.05a 10.83+0.72a 55.77 + 1.09a Contrastes de haplotipo Estimado 7-1/3 (1+2+3) -2.26+0.84 -1.84±0.58 2.42±0.87 P>Ta 0.007 * 0.002 0.006 * Contrastes de SNP Estimado Alelos ½(7+8) - · A-T E2JW 2.07+0.81 1.41+ 0.56 -2.87±0.85 ½(2+ 6) P>T 0.01] 0.012 0.001 * 1/3(4+3+1) - C-T EX0N2- -1.77±0.85 -1.02±0.59 1.7110.89 1/3 (2 + 6+5) FB P>T 0.036 0.086 0.053 1/3 (4 + 9+2) - C-T UASMS1 -1.2910.99 0.89+ 1.03 1/3 (1+ 6+5) 0.91±0.069 P>T 0.192 0.186 0.388 1/3 (5+1-1-2) - C-T UASMS2 0.12±0.73 0.47±0. 1 0.63+0.76 1/3(6+3+9) P>T 0.872 0.358 0.414 a Nivel de significado de la prueba R * Efecto significante del genotipo después de la corrección de Bonüecroni modificada para pruebas múltiples en P = 5% El reemplazo de los tres haplotipos más frecuentes 160 por el haplotipo 7 disminuirla significa ivamente FATYL y GFAT por -2.26% y -1.84 mm, respectivamente e incrementaría LEANYL por +2.42%, correspondiente a0.44, 0.55, y 0.48 SD fenotípica de los atributos correspondiente, respectivamente. La Tabla 21 también muestra los estimados de diferencias en los efectos de alelo dentro de cada SNP. De acuerdo con los análisis de genotipo, el alelo T para E2JW disminuyó FA YL y GFAT e incremento LEANYL comparado con el alelo A. Con respecto a EXON2-FB, los resultados también estuvieron de acuerdo con los análisis de genotipo, donde el alelo C disminuyó FATYL y GFAT e incrementó LEANYL comparado con el alelo T. Las diferencias en los efectos del alelo sobre FATYL, GFAT, y LEANYL para UASMS todos no fueron significantes. No obstante, el análisis de genotipo mostró que los genotipos UASMS1 significativamente influenciaron FATYL. En contraste entre los efectos de haplotipo es, sin embargo, estimativo de solamente el efecto lineal aditivo de los alelos. Para la tuerza cortante del músculo Longissimus en 12 y 14 días postmortem y para la fuerza cortante promedio durante los 21 días postmortem el efecto del haplotipo 8 (TTTT) fue significativamente diferente de los tres haplotipos mucho más frecuentes en la población como se muestra en la Tabla 22.
Tabla 22. Asociación de haploLipos para SNP en el gen Leptina con la fuerza cortante del músculo Longissimus en la población de ganado de carne de res. Atributo3 LM2 (kg) LM14 (kg) LMAVG (kg) Heredabilidad poligénica: 0.37 + 0.14 0.3 1-0.13 0.3910.15 Haplotipos mucho más Media de Mínimos Cuadrados frecuentes 1 4.87+0.52a 4.06±0.28a 3.84±0.31a 2. .72+0.51a .02±0.28a 3.90±0.30a 3 4.77±0.52a 3.93+0.28a 3.9310.30a Contrastes de haplotipo Estimado 8-1/3 (1-I-2 +3) 1.0610.41 0.58 + 0.28 0.5510.24 P>Tb 0.009 * 0.037 0.021 Contrastes de alelo SNP Estimado ½ (7+8) -½ (2+6) A-T E2 JW 0.721-3.33 -0.36±0.22 -0.40+0.20 lJ>T 0.031 0.096 0.0 1 1/3(4+3+1) - C-T EX0N2 0.24+0.042 -0.1510.23 0.0910.25 1/3(2 + 6-1-5) - FB P>T 0.559 0.502 0.719 1/3 (4+9+2) - C-T UASMS 0.30±0.47 -0.13+0.27 0.10±0.28 1/3 (1+ 6+5) 1 l?>T 0.527 0.633 0.711 1/3(5+1+2) - C-T UASMS 0.21±0.32 0.02 +0.20 0.10±0.19 1/3 (6+3+9) 2 I I P>T I 0.514 [ 0.933 0.586 a LM2, LM 14 y LMAVG = fuerza cortante de músculo Longissimus en 12 yl4 días postmortem y fuerza cortante promedio durante el período de 21 dias de postmortem, respectivamente. b Nivel de significado de la prueba T. b Efecto significante del genotipo después de la corrección de Bonferroni modificada para pruebas múltiples de P = 5%. El reemplazo de los tres haplotipos mucho más frecuentes para el haplotipo 8 significativamente incrementa LM2, LM14 y LMAVG por 1.06 kg, 0.58 kg y 0.55 kg, correspondientes a 0.62, 0.46 y 0.53 de SD fenotipico de las mediciones correspondientes, respectivamente. La Tabla 22 también muestra los estimados de diferencias en los efectos de alelo dentro de cada SNP. De acuerdo con los análisis de genotipo, el alelo T para E2JW incrementó la dureza comparado con el alelo A. No hubo diferencia signi ficante entre los alelos pa a el EXON2-FB. El análisis de genotipo mostró una interacción significante entre el SNP de E2JW y EXON2-FB, que no se tiene en cuenta cuando se estiman los efectos de alelo en contraste entre los efectos de haplotipo. Con respecto a los otros dos SNP, las diferencias de alelo también no fueron significantes. La interceptación y pendiente de las regresiones individuales de mediciones de fuerza cortante en los días postmortem mostraron que el efecto del haplotipo 8 (TTTT) fue significati vamen Le diferente del efecto de los haplotipos mucho más frecuentes para la in te rceptación (0.96 kg ± 0.39 kg ) y que hubo una diferencia significante entre los alelos T y A (0.57 kg ± 0.30 kg ) para E2JW, pero ninguno para el otro SNP. No hubo diferencia significante en ios efectos de haplotipo sobre ]a pendiente de las regresiones. Ejemplo 14 : Impacto de los genotipos de leptina y del receptor de hormona de crecimiento sobre los atributos de producción de leche, ingesta de alimento y energía del cuerpo en el ganado lechero Sangre se recolectó de 57] vacas Holstein en Escocia que han parido entre 1991 y el 2000 y participado en experimentos do alimento y de selección donde se han agrupado de acuerdo con la dieta (concentrados altos con trabajo) y mérito genético (procreadas por toros de mérito alto contra promedio) . Muestras de sangre se utilizaron pa a determinar los genotipos para las posiciones de los genes leptina, receptor de leptina y receptor de hormona de crecimiento. Los SNPs se determinaron como es mostrado en la Tabla 2, con 6 SNPs utilizados para definir el gen leptina y uno para los genes de receptor de hormona de crecimiento. Tabla 23. recuencia del gen y polimorfismos de nucleótido individual (SNPs) . Posición Ubicación Polimorfismos (frecuencia) de SNP Leptina C207T TT CT CC (UASMS1) ( 1%) (46%) (13%) C528T CC CT TT ( UASI S2 ) (82%) (17%) (1%) ?252? AA AT TT ( E2 JW) (95%) (5%) (0%) A1 57G AA AG GG (27%) (51%) (22%) C963T CC CT TT (42%) (45%) (13%) C305T CC CT TT (EXO 2-FB) (43%) (45%) (12%) Receptor de F279Y TT AT AA Hormona de (63%) (34%) (3%) Crecimiento frecuencias alélicas se calcularon a partir de las frecuencias genotipicas, y las pruebas de chi-cuadrado mostraron que las frecuencias para todas las posiciones fueron consistentes con el equilibrio de Hardy-Weinberg (P>0.05) . Los genotipos en los 6 SNPs individuales del gen leptina se combinaron para producir genotipos de leptina. Los datos fueron restringidos a aquellos casos donde todos los 6 SNPs fueron disponibles y las vacas con genotipos únicos se removieron de los análisis subsecuentes. Un total de 7 haplotipos se identificaron por parsimonia. Los genotipos del gen leptina y las haplotipos correspondientes se muestran en la Tabla "24 enseguida. En este subconjunto de datos, C963T y C305T estuvieron en desequilibrio completo. Tabla 24. Los genotipos de Leptina y el número de vacas; el orden de SNP individual sigue a aquel de la Tabla 1. Código de Secuencia de Haplotipos No. de vacas Genotipo Base involucrados Gl TT CC AA A CC CC TCAACC x 76 TCAACC G2 TTCTAAAACCCC TCAACC x 42 TTAACC G3 CTCCAAAGCTCT CCAGT x 145 TCAACC G4 CCCCAAGGTTTT CCAGTT x 54 CCAGTT G5 CTCCAAGGCTCT CCAGTT x 36 TCAGCC G6 TTCCAAAGCCCC TCAACC x 55 TCAGCC G7 CTCTAAAGCTCT CCAGTT x 28 TTAACC G9 CCCCATGGTTTT CCAGTT x 9 CC G T G10 TTCTAAAGCCCC TCAGCC x 8 TTAACC Gil C'l'CCATAGCTCT TCAACC x 7 CCTGTT G12 TTCCAAGGCCCC TCAGCC x 9 TCAGCC G 3 CTCCATGGCTCT TCAGCC x 6 CCTGTT G16 TTTTAAAACCCC TTAACC x 7 TTAACC Los genotipos de vacas se igualaron con los archivos de producción de vacas indi . iduales. En el primer caso, 5 atr:i ,.butos de produceión y de inges a de a 1 imen ó se definieron : rendimiento de leche diario (MY) , : Ingesta de alimento fresco diario (El), ingesta de material seca diaria (DM1), relación de alimento con respecto a la leche diaria (FMR) y relación de materia seca con respecto a la leche diaria (DMMR) . Los últimos dos atributos ofrecen medidas de conversión del alimento a leche. Además, atributos de energía del cuerpo se definieron: peso vivo por semana (LW) , registro de condición del cuerpo por semana (BCS), contenido de energía por semana (EC) y balance de energía efectivo acumulativo (CEEB) . El contenido de energía y CEEB fueron basados en los registros de LW y BCS (Baños y colaboradores, 2006). El contenido de energía fue una medida del nivel de energía real de la vaca en el día del registro. El balance de energía efectivo acumulativo fue una medida del cambio en el estado de enerqi a a medida que se acumula desde el inicio de la lactación (día de parisión) . La Tabla 25 enseguida resume estos atributos. Tabla 25. Resumen y estadística descriptiva de la producción , ingesta de alimento y energía dísi cuerpo. Atributo Unidad de Frecuencia de No . de No . de No . de Media Medición registro registros vacas lactaciones (desviación estándar MY Kg diaria 95,249 376 3 28.01 (8.06) FI Kg diaria 95,249 376 51.51 12.61) DMI Kg diaria 95,249 376 3 17.88 (4.39) FMR kg/kg diaria 95,249 376 3 1.97 (0.71) DMMR kg/kg diaria 95,249 376 3 0.68 (0.22) LW Kg semanalarnente 11,209 321 1 555.09 (51.62) BCS Registro sernanalmente 11,209 321 1 2.69 (0.32) (1-5) EC MJ semanalmente 11,249 321 1 4786.98 (699.08) CEEB MJ sernanalmente 11,209 321 1 142.07 (933.37 Análisis estadístico . Cada atributo de producción se analizó con un modelo que incluye los efectos fijados de la línea de selección, grupo de dieta, número de lactación, edad en la parisión, fecha de la parisión, porcentaje de genes Holstein y genotipo para cada uno de los tres genes (leptina, 12 d . f . ; receptor de leptina, ], d . f . ; y receptor de hormona de crecimiento, 1 d . f . ) . Las relaciones genéticas entre las vacas se incluyeron en el modelo analítico y también incluyeron un efecto de regresión aleatoria de 4o orden de la vaca en el día de la lactación. Los atributos de energía del cuerpo se analizaron con un modelo simila menos el número de lactación más el efecto fijado de rendimiento de la leche en el día de la medición. Tabla 2.6. Resumen y estadística descriptiva de la producción , ingesta de alimento y energía del cuerpo. Atributo Unidad de Frecuencia No . de No . de No . de Media medición de registro registros vacas lactaciones (desviación estándar) MY Kg Diaria 95,249 376 3 28.01(8.06) FI CJ Dia ria 95, 149 376 3 51.51 (12.61) DMI Kg Diaria 95,249 376 3 17.88 (4.39) FMR kg/kg Dia na 95,249 376 3 1.97 (0.71 ) DMMR kg/kg Diaria 95, 249 376 3 0.68(0.22) LW Kg semanalmente 11, 209 321 1 555.09(51.62) BCS Regís t ro semanalmente 11, 209 321 1 2.69)0.32) (1-5) EC MJ semanalmente 11, 209 321 1 4786.98 (699.08) CEEB MJ semanalmente 11, 209 321 1 142.07 (933.37) Las vacas con el "mejor" genotipo de leptina para leche (G9) en este estudio produjeron 7.3 kg e más leche por día comparado con los animales con el "peor" genotipo (G10) . De manera interesante, este último es el genotipo con el mayor estimado de BCS y EC pero el peor estimado de CEEB sugiriendo que tales vacas puede alcanzar altos niveles de condición del cuerpo y contenido de energía pero no logran mantenerlos; por lo tanto, ellos producen menos leche. La diferencia más grande de "me j or"-"peor" observada en este estudio fue pa a BCS (desviaciones estándares de 1.656) mientras que la diferencia correspondiente para MY cuantificó a desviaciones estándares de 0.91. En general, los haplotipos CCAGTT, TCAGCC y CCTGTT (siguiendo el orden de SNP de la Tabla 23) aparecieron para estar asociados con la alta producción de leche. Sin embargo, el haplotipo TTAACC también se asoció con pobre condición del cuerpo, quizás como un resultado de su tendencia a utilizar el alimento principalmente para la producción de leche. El SNP dentro del receptor de hormona de crecimiento significativamente (P<0.05) afectó FI, DMI, FMR, DMMR y CEER pero no MY . Los genotipos AA requirieron 0.34+0.12 y 0.0810.03 kg menos alimento fresco y material seca, respectivamente para producir 1 kg de leche, y también acumularon 206+96 MJ más CEEB comparado con los genotipos TT. El receptor de leptina afectó significativamente (P<0.05) solo a DMI, con Jos genotipos CT heterocigotos que consumen 3.011.4 kg menos materia seca que el homocigoto CC (el homocigoto ?"G fue muy raro) . Tabla 27. Comparación entre los genotipos de leptina (ver la Tabla 3 para códigos de genotipo) . * indica el efecto total estadísticamente significante (P < 0.05)- Los resultados indican que las posiciones de gen estudiadas aquí pueden afectar algunos atributos económicamente importantes deJ ganado lechero (rendimiento de leche, alimento e ingesta de materia seca, conversión del alimento, registro de condición del cuerpo y balance de energía acumulativo) . Ejemplo 15: Asociación del marcador de SNP F279Y de bGHr con los atributos del Ganado lechero Tabla 28: Asociación del marcador SNP F2.19Y de bGHr con los atributos de grado de rendimiento, peso del canal y área de ribeye3. 3 los datos se combinan para cuatro razas de Ganado: Red Angus, Chare.lo.is, Brangus y Brahmán . Ejemplo 16: Asociaciones de Marcador y Atributo Tabla 29: Atributos del canal Atributo C207T C528T C1180T A252T F279Y HCWT Ve Ve c MB c c c C REA c c Ve V BFAT e c Ve Ve V DP c Ve c QG c YG c c Ve V Blandura Ve Ve Rendimien to Ve Ve de grasa Rendimien to V V de carne magra Tabla 30 : A tribu tos de desempeño UASMS1 UASMS2 EXON2-FB Atributo C207T C528T C1180T ADG Ve Ve C DOF c c c Peso vivo Ve Ve c US V V BFAT US MB V V US V REA DMI V FI residual V En las Tablas 29 y 30 anteriores, V significa la asociación significante como un solo marcador. C significa la asociación significante en combinación con uno o más de otros marcado res . Ejemplo 17 También se evaluaron cuatro SNPs (UASMS1, UASMS2, UASMS3 y EXON2-FB) en el gen leptina, y un SNP en el gen receptor de hormona de crecimiento en una población de lote de alimento comercial grande con el desempeño del animal vivo y las mediciones del atributo del canal. Los polimorfismos utilizados en este estudio fueron UASMS1, UASMS2 , UASMS3 y F279Y de bGHr, este último como es descrito por Blott y colaboradores, (Genetics. 2003 Jan; 163 ( 1 ) : 253-66 ) incorporada por referencia en la presente en su totalidad. Este análisis de asociación fue predicho sobre la suposición de que los marcadores están en desequilibrio de enlace con la mutación casual que está ya sea en el gen para el cual el marcador poiimórfico está ubicado o un gen en estrecha proximidad al gen marcado. El conjunto de datos original consistió de 2,189 registros sobre novillos y vaquillas alimentadas en el Decatur County Feed Yard (DCFY) en Oberlm, KS . Después de formar grupos con emporáneos, un total de 1,633 novillos y vaquillas estuvieron disponibles para el análisis (Tabla 1) . Los atributos analizados (con abreviaciones apropiadas) incluyeron: peso del canal caliente, Ib (HCW) ; área de Ribeye, in' (REA) , área de Ribeye por ciento en peso del canal, in2/100 Ib HCW (REA/cwt) , valor del peso del canal Caliente, $ (valor de HCW) , peso vivo Calculado, Ib (Cale Lv Wt), ingesta de materia seca total Predicha, Ib (DMI), Días en el alimento, d (DOF) , DMI por DOF , Ib/d (DMI/DOF), ganancia diaria promedio, Ib/d (ADG) , porcentaje de abono, % (DP), proporción de deposición de grasa Posterior, % (BFAT dep rate) , grasa posterior del Canal en la planta, in (BFAT) , grado de rendimiento USDA calculado (YG) , grado de calidad USDA, (QG) , porcentaje de grasa Intramuscular, % (IMF%) , registro de <Marmoleo (MBS) , registro de Marmoleo por DOF, cambio en el registro/d (MBS/DOF) , valor del canal Adicional, $, retorno neto Ajustado, $, retorno neto Ajustado con costos de llegada removidos, $. Análisis Estadístico. Los datos se analizaron con los siguientes modelos, todos los cuales incluyeron un efecto CG fijado: 1) Genotipo - regresión sobre genotipos como efectos fijados. 2) Sustitución de alelo - regresión sobre el número de alelo (0, 1, 2) cuando se observa en ubicaciones de marcador individual, y 3) Haplotipo - regresión sobre el haplotipo cuando se ajustan múltiples marcadores de leptina. Los análisis del marcador de leptina se hicieron individualmente y como combinaciones de genotipo utilizando el Modelo 1, y como haplotipos que consisten de combinaciones de marcadores emparejados asi como todos los tres marcadores combinados uti] izando el Modelo 3. bGHr solamente se analizó con los Modelos 1 y 2. Los estimados del modelo de haplotipo son desviaciones del último ajuste de haplotipo en el software de análisis estadístico - esto es por lo que el valor "£>" es siempre ajustado a 0.0 para un haplotipo. Además, la baja frecuencia de haplotipo puede conducir a estimados extremos que son significantes; sin embargo, la diferencia biológica entre otros hap.lotipos bien represen ados no pueden ser tan grande . Resultados de determinación de genotipo indicaron que UASMS1 y UASMS3 están en desequilibrio de enlace perfecto. Por lo tanto, solamente los resultados UASMS1 se discuten adicionaimente . Las frecuencias de genotipo y de alelo están basadas en los genotipos observados de 1,954 registros (Tabla 31) . Tabla 31 Frecuencia Marcador Genotipo Número Genotipo Alelo cc 380 19.45 0.43 UASMS1 CT 935 47.85 TT 639 32.70 0.57 cc 977 50.00 0.71 UASMS2 CT 809 41.40 TT 168 8.60 0.29 cc 638 32.65 0.57 ECON2-FB CT 940 48.11 'G?' 376 19.24 0.43 AA 21 1.07 0.10 bGHr AT 362 18.53 TT 1571 80.40 0.90 La frecuencia del alelo raro en los marcadores de leptina es de moderada a alta. En contraste, la frecuencia del alelo raro en el gen bGHr fue muy bajo, dando por resultado muy pocos animales con el genotipo homocigoto para estos alelos. Resul ados: En la mayoría de los casos, los modelos identificaron efectos significantes similares; sin embargo, hubo casos donde se observó significado en algunos pero no en todos los análisis. Los resultados numéricos para los atributos y marcadores son solamente presentados cuando se detectó un efecto significante (P < 0.05). En algunos casos, esas asociaciones que se aproximaron al significado, es decir, P < 0.10 son presentadas.
Modelo de Sustitución del Gen Leptina -alelo . Las frecuencias de genotipo y de alelo indicaron que estos marcadores serán adecuados para la selección o manejo asistido por marcador (Tabla 32) . En general, los marcadores en el gen leptina estuvieron asociados con el tamaño del cuerpo y el músculo; todos los tres que se aproximan al significado o significantes para HCW, REA, y Cale Lv Wt (Tabla 32) . Tabla 32. Regresión sobre el Número de Alelos Marcador UASMS1 [C] UASMS2 [C] b se Prob. B se Prob.
HCW -5.536 2.221 0.013 6.650 2.433 0.006 REA -0.116 0.053 0.028 0.110 0.058 0.057 REA/cwt CaLc Lv -8.425 3.308 0.011 6.916 3.630 0.057 t DP 0.191 0.073 0.009 BFAT 0.013 0.005 0.010 YG 0.050 0.023 0.030 MBS Marcador EXON2-FB [C] bGHr [A] b se ProJ . B se Prob.
HCW 5.230 2.247 0.020 -7.627 REA 0.149 0.054 0.005 -0.352 REA/cwt -0.029 Cale Lv 7.292 3.342 0.029 t DP -0.225 BFAT 0.00004 0.0001 0.049 0.0004 0.0002 0.057 BFAT - 0.016 0.005 0.002 0.030 0.008 0.000 YG -0.072 0.024 0.002 0.162 0.038 <.0001 MBS -0.573 0.319 0.072 SNPs UASMS1 y EXON2-FB también son significativamente asociados con BFAT y YG. El alelo "C" de la posición de marcador UASMS1 se asoció con el peso del cuerpo disminuido (B ) y REA, y BFAT ligeramente más alto y YG. El alelo "C" en el EXON2-FB tiene exactamente el efecto puesto - está asociado con BW incrementado y REA, y BFAT ligeramente menor y YG, asi como una tendencia hacia MBS menor. El alelo "C" de UASMS2 "C" fue asociado con HCW incrementado y DI?, y el significado aproximado para REA incrementada y Cale Lv Wt . Los efectos de los alelos "C" en UASMS1 y EXON2-FB encontrados en este estudio fueron similares (con relación a los atributos y la dirección del efecto) a ios resultados publicados sobre estos marcadores (Nkrumah y colaboradores, 2004; Nkrumah y colaboradores, 2005) . De manera sorprendente, en este estudio, UASMS2 se encontró que afecta BW también pero la clasificación de genotipo es invertida. Modelo de Haplo tipo . Las Tablas 33 a 35 contienen los resultados de las diversas combinaciones de regresiones de haplotipo de leptina de dos y tres marcadores. Los resultados del análisis de haplotipo son similares en términos significantes como es reportado por los resultados de un solo marcador en la mayoría de los casos. gresión sobre el Haplotipo de Leptina - ÍJASMSI Haplotipo c-c C-T T-C T-T Atributo Frecuencia 0.435 0.002 0.267 0.296 se 0.008 0.001 0.007 0.008 b 2.709 -77.040 29.078 0.000 HCW se 5.290 66.014 6.074 Probabi 1 idad 0.609 0.243 <.0001 b 0.013 -2.158 0.526 0.000 REA se 0..126 1.575.0.145 Probabilidad 0.917 0.171 0.000 b 0.232 -0.742 0.582 0.000 DP se 0.158 1.971 0.171 Probabilidad 0.142 0.707 0.001 b -0.00061 0.000 BFAT dep 0.00006 0.00079 rate se 0.00027 0.00335 0.00031 Probabilidad 0.838 0.855 0.011 b 0.016 0.332 -0.021 0.000 BFAT se 0.012 0.149 0.014 Probabilidad 0.180 0.026 0.131 b -0.278 -110.727 34.821 0.000 Cale Lv se 7.892 98.477 9.061 Wt Probabilidad 0.972 0.261 0.000 b 0.439 -22.817 1.100 0.000 DOF se 0.879 10.963 1.009 Probabilidad 0.617 0.038 0.276 Tabla 34. Regresión sobre el Haplotipo de Leptina - UASMS2 & EXON2-FB Haplotipo c-c C-T T-C T-T Atributo Frecuencia 0.281 0.421 0.279 0.018 se 0.008 0.008 0.007 0.002 b 43.004 19.603 16.376 0.000 HCW se 19.516 19.929 20.223 Probabi 1 idad 0.028 0.325 0.418 b 1.275 0.706 0.738 0.000 REA se 0.465 0.475 0.482 Probabi 1 idad 0.006 0.138 0.126 b 1.620 1.411 1.232 0.000 DP se 0.581 0.593 0.602 Probabilidad 0.005 0.017 0.041 b -0.00246 -0.00168 -0.00174 0.000 BFAT se 0.00100 0.00102 0.00103 Probabilidad 0.014 0.100 0.093 b -0.11482 -0.07540 -0.09830 0.000 BFAT se 0.04484 0.04576 0.04646 Probab ¡ 1 i dad 0.011 0.100 0.035 b -0.529 -0.339 -0.420 0.000 YG s 0.211 0.215 0.218 Prob bi 1 idad 0.012 0.116 0.055 b -6.464 -6.151 -7.689 0.000 MBS se 3.108 3.147 3.195 Probabi 1 idad 0.038 0.051 0.016 b -0.048 -0.045 -0.054 0.000 MBS/DOF se 0.025 0.025 0.026 Probabilidad 0.054 0.078 0.036 Tabla 35. Regresión sobre el Haplotipo de Leptina - UASMS1 & EXON2-FB Haplotipo C-C C-T T-C T-T Atributo Frecuencia 0.025 0.414 0.535 0.026 se 0.003 0.008 0.008 0.003 b 0.134 0.029 0.044 0.000 REA/cwt se 0.065 0.045 0.044 Probabi 1 idad 0.040 0.521 0.319 b -0.00112 -0.00116 - 0.00157 0.000 BFAT dep se 0.00106 0.00072 0.00072 ra te Probab ¡. J ¡.dad 0.292 0.110 0.030 b -0.071 -0.055 -0.089 0.000 BFAT se 0.047 0.032 0.032 Probabil i dad 0.132 0.085 0.006 b -0.458 -0.206 -0.342 0.000 YG se 0.218 0.150 0.150 Probabi lidad 0.036 0.170 Asociaciones significantes para UASMS1 & UASMS2 son: HCW, REA, DP, BFAT dep ra te, BFAT, Cale Lv Wt, y DOF (Tabla 33) . El haplotipo T -C es superior para el rendimiento de carne roja. Las asociaciones significantes para UASMS2 & EXON2-FB son: HCW, REA, DP, BFAT dep rate, BFAT, YG, MBS, y MBS /DOF (Tabla 34) . Del haplotipo C-C es superior para rendimiento de carne roja, mientras que el haplotipo T-T es major para el Ganado dirigido en mercados de calidad donde la grasa posterior incrementada y ios resultados de marmoleo están en un precio superior. Asociaciones significantes para UASMS1 & EXON2-FB son:REA/cwt, BFAT dep rate, BFAT, y YG (Tabla 35) . La diferencia entre los haplotipos no son tan consistentes para estos dos marcadores como con las otras combinaciones. Asociaciones significantes para UASMS1 & UASMS2 con EXON2-FB son: HCW, REA, REA/cwt, DP, BFAT dep rate, BFAT, YG, ADG, y DOF (Tabla 33) . Como podría ser esperado basado en los resultados de leptina previos, los animales con el haplotipo T-C-C aparecen para el desempeño de otros en términos de la producción de los canales de alto rendimiento. Modelo de Sustitución del Gen de Receptor de Hormona de Crecimiento-Alelo . El marcador ubicado en el gen bGHr fue significa ivamente asociado con HCW, REA, REA/cwt, DP, BFAT, y YG (Tabla 32) . El alelo "T " está asociado con HCW incrementado, REA, REA/cwt, y DP, y BFAT y YG disminuidos. Las diferentes entre los homocigotos para REA y YG son dimensionables y en la dirección apropiada, .704 pg2 y .324 YG, respectivamente. La asociación entre bGHr y BFAT dep rate se aproxima ai significado, con el alelo "T" que tiende hacia una menor proporción de deposición. La frecuencia del alelo "T" en estos datos es muy alta, 0.90, sugiriendo a los productores que ya han sido efectivos en seleccionar el alelo favorable a través de medios diferentes a la selección asistida por marcador. Habiéndose descrito de esta manera en detalle modalidades preferidas de la presente invención, se va a entender que la invención definida por los párrafos anteriores no va a ser limitada a los detalles particulares expuestos en la descripción anterior ya que muchas variaciones evidentes en las mismas son posibles sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención.

Claims (1)

  1. REIVIND I CACIONES 1. Un método para sub-agrupar animales de acuerdo con el genotipo en donde los animales de cada sub-grupo tienen un polimorfismo similar o combinación de polimorfismos en el gen leptina, caracterizado porque comprende: (a) determinar el genotipo de cada animal a ser sub-agrupado al determinar la presencia de un polimofismo de nucleótido individual o una combinación de polimorfismos de nucleótido individual en la posición polimórfica del gen leptina (oh) , en donde las posiciones polimó f icas de nucleótido individual se seleccionan del grupo que consiste de UASMS1, UASMS2, UASMS3, EXON2-FB, y E2JW, y (b) segregar animales individuales en sub-grupos en donde cada animal en un subgrupo tiene un polimorfismo similar o combinación de polimorfismos. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el animal es un bovino y el gen leptina es el gen leptina bovino. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende determinar la presencia de un polimorfismo de nucleótido individual en el receptor de hormona de crecimiento bovino. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque además el polimorfismo de nucleótido individual en el receptor de hormona de crecimiento bovino es F279Y, y en donde F279Y es un determinante del área de ribeye, grado de rendimiento e ingesta de material diario . 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la combinación de polimorfismos de nucleótido individual del gen leptina se selecciona del grupo que consiste de UASMS1/UASMS2, UASMS 1 /UASMS3 , UASMS2 /UASMS3 , UASMS 1 /EX0N2 - FB , UASMS2/EXO 2-FB, UASMS 3 / EX0N2 - FB , EX0N2-FB/E2J , UASMS1/E2 JW, UASMS2/E2JW, y UASMS3/E2 JW, y en donde la segregación de animales individuales en sub-grupos depende de si los animales tienen, o no tienen, las combinaciones de polimorfismos de nucleótido individual UASMS 1/UASMS2, UASMS 1 /UASMS 3 , UASMS2 /UASMS3 , UASMS 1 / EXO 2 - FB , UASMS2 / EXON2-FB, UASMS3/EXON2-FB, EXON2-FB/E2 J'W, UASMS 1/E2JW, UASMS2/E2 JW, y UASMS3/E2JW del gen leptina. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la combinación de polimofismos de nucleótido individual del gen leptina comprende los marcadores UASMS 1 / EXON2'- FB , UASMS 3 / EXO 2 - FB , EXON2-FB/E2 JW, UASMS1/E2 J'W, o UASMS 3 /E2 JW , y en donde la combinación de SNPs indica un incremento en la blandura de la carne . 7. El método de conformidad con ia reivindicación 5, caracterizado porque la combinación de polimorfismos de nucleótido individual del gen leptina comprende los marcadores UASMS 1 / EX0N2 - FB , UASMS3/EXO 2-FB, EXO 2 - FB/E2 JW , UASMS1/E2J , o UASMS3/E2 JW . 8. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la combinación de polimorfismos de nucieótido individual en el gen leptina comprende los marcadores EXON2-FB/E2 JW . 9 El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la combinación de polimorfismos de nucieótido individual del gen leptina comprende los marcadores UASMS 1 /EXON2 - FB o UASMS3 / EXON2 - FB . 10. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la combinación de polimorfismos de nucieótido individual del gen leptina comprende los marcadores UASMS1/E2JW, o UASMS3/E2 JW . 11. El método de conformidad con la reivindicación A, caracterizado porque la combinación de polimorfismos de nucieótido individual se selecciona del grupo que consiste de UASMS 1 / F279Y , UASMS2 / F279Y , UASMS3 / F279Y , EXON2 - FB/ F279Y , F279Y/E2 JW, UASMS 1 /UASMS2 / F279Y , UASMS1/UASMS3/F279Y, UASMS2/UASMS3/F279Y, UASMS 1 /EXON2 - FB/ F279Y , UASMS2 /EXON2 -FB/F279Y, UASMS3/EXON2-FB/F279Y, EXON2 - FB/E2JW/ F279Y , UASMS1/E2 JW/F279Y, UASMS2 /E2 JW/ F279Y , y UASMS3/E2 JW/ F279Y . 12. Un método para identificar un animal que tiene un fenotipo deseable relacionado con cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valia y composición del canal y rendimiento de leche, como es comparado con la población general de animales de esa especie, caracterizado porque comprende determinar la presencia de un polimorfismo de nucleótido individual o combinación de polimorfismos de nucleótido individual del animal, en donde el polimorfismo de nucleótido individual se selecciona del grupo que consiste de UASMS1, UASMS2, UASMS3 , EX0N2-FB, E2JW y F279Y, y en donde la combinación de polimorfismos de nucleótido individual se selecciona del grupo que consiste de UASMS 1 / UASMS2 , UASMS1/UASMS3, UASMS2/UASMS3, UASMS 1 / EXO 2 - B , UASMS2 / EXO 2 - FB , UASMS 3 / EXON2 - FB , EXON2-FB/E2 JW, UASMS 1 / E2 JW , UASMS2/E2JW, UASMS 3 / E2 JW , UASMS 1 / F2 9Y , UASMS2 / F279Y , UASMS 3 / F279Y , EXON2-FB/F279Y, F279Y/E2JW, UASMS 1 /UASMS2 / F279Y , UASMS 1 /UASMS 3 / F279Y , UASMS2 /UASMS 3 / F279Y , UASMS1 /EXON2- FB/F279Y, UASMS2 / EXON2 - FB / F'279 Y , UASMS 3 /EXON2 - FB/ F279Y , EXON2-FB/E2 JW/F279Y, UASMS 1 /E2 JW/ F279Y , UASMS2 / E2 JW/ F279Y , y UASMS3/E2 JW/F279Y, y en donde la presencia de ya sea el polimorfismo de nucleótido individual UASMS1, UASMS2, UASMS3 o EXON2-FB o la presencia de Jas combinaciones de polimorfismos de nucleótido individual UASMS 1 /UASMS2 , UASMS 1/ UASMS 3 , UASMS2 /UASMS3 , UASMS 1 / EXON2 - FB , UASMS2 /EXON2-FB, UASMS3/EXON2-FB, EXON2-FB/E2 JW, UASMS1/E2JW, UASMS2/E2 JW, UASMS3/E2JW, UASMS 1 / F279Y , UASMS2 / F279Y , UASMS 3 / F279Y , EXON2-FB/F279Y, F279Y/E2JW, UASMS 1 /UASMS2 / F279Y , UASMS1 /UAS S3/F279Y, UASMS2 /UASMS3/ F279Y , UASMS1/EX0N2- FB/F279Y, U SMS2 /EXON2-FB/F279Y UASMS3 / ??0?2- FB/ F279Y , EX0N2-FB/E2 JW/F279Y, UASMS1/E2JW/F279Y, U SMS2 / E2 JW/ F279Y , y UASMS3/E2 JW/F279Y es indicativa de un fenotipo deseable relacionado con cierta ingesta de alimento, proporción de crecimiento, peso del cuerpo, valia y composición del canal, calidad de la carne, blandura de la carne y/o rendimiento de leche . 13. Una composición para la detección de una combinación de polimorfismos de nucleótido individual seleccionada del grupo que consiste de UASMS 1 /UASMS2 , UASMS1/UASMS3, UASMS2 /UASMS3 , UASMS 1 /EX0N2 - EB , UASMS2/EXON2-FB, UASMS3 /EX0 2 - FB , EX0N2 - FB/E2 JW, UASMS1/E2JW, UASMS2/E2JW, UASMS3/E2JW, UASMS 1/ F279Y, UASMS2/F279Y, UASMS3 / F279Y , EX0N2-FB/F279Y, F279Y/E2JW, UASMS1 /UASMS2 / F279Y , UASMS 1 /UASMS 3 / F279Y , UASMS2 /UASMS 3 / F279Y , UASMS 1 /EX0N2 -FB/F279Y, UASMS2 / EX0N2 - FB/ F279Y UASMS3 / EX0N2 - FB/ F279Y , EX0N2-FB/E2 JW/F279Y, UASMS1 / E2JW/F279Y, UASMS2/E2JW/F279Y, o UASMS3/E2JW/F279Y, caracterizada porque comprende por lo menos dos sondas de oligonucleótido, en donde cada sonda de oligonucleótido es capaz de detectar selectivamente un solo polimorfismo, y en donde cada sonda es opcionalmente marcada con una porción detectable. 1 . La sonda de oligonucleótido aislada de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la porción detectable se selecciona del grupo que consiste de una radiomarca 3H, 1251 , 35S, 14C, 3 P, una enzima detectable, peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatase alcalina, un tinte fluorescente, isotiocianato de f luoresceina , rojo de Texas, rodamina, Cy3, Cy5, Bodipy, Bodipy Far Red, Lucifer Yellow, Bodipy 630/650-X, Bodipy R6G-X, 5-CR 6G, una marca colorimétr ica , digoxigenina-dUTP de oro coloidal, o biotina . 15. El oligonucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el oligonucleótido se inmoviliza sobre un soporte sólido. 16. Un método para determinar el genotipo de un animal en una posición polimórfica del gen ob, caracterizado porque comprende: a) obtener una muestra de DNA del animal b) poner en contacto la muestra de DNA con por lo menos dos pares de cebadores de oligonucleótido bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridación de los cebadores de oligonucleótido a la muestra de DNA. c) amplificar enzimáticamente las regiones especificas del gen ob utilizando los pares de cebadores para formar por lo menos dos productos de amplificación de ácido nucleico , d) poner en contacto los productos de amplificación de la etapa c) con las sondas especificas de alelo de gen ob marcadas, marcadas con una porción detectable, bajo condiciones adecuadas para permitir la hibridación de las sondas especificas de alelo marcadas a los productos de amplificación, y e) detectar la presencia de los productos de amplificación al detectar la porción detectable de las sondas especificas de alelo marcadas, hibridadas a los productos de amplificación . 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque por lo menos un par de cebadores de oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22. 18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque los pares de cebadores de oligonucleótido son capaces de amplificar regiones del gen leptina bovino que tiene por lo menos una posición de nucleótido polimórfica seleccionada del grupo que consiste de UASMS1, UASMS2, UASMS3 , EXON2-FB, y E2 JW , o combinaciones de las mismas seleccionadas del grupo que consiste de UASMS1/UASMS2, UASMS 1 /UASMS3 , UASMS2 / UASMS 3 , UASMS 1 / EXON2 - FB , UASMS2 / EXON2 - FB , UASMS 3 /EXON2 - FB , EXON2-FB/E2 JW, UASMS1/E2 JW, UASMS2/E2JW o UASMS3/E2 JW . 19. El método de conformidad con la rei indicación 16, caracterizado porque los pares de cebadores de oligonucleótido son capaces de amplificar la región del gen de receptor de hormona de crecimiento bovino (bGHr) que tiene el SNP F279Y. t
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