CN104603275A - 用于提高饲料品质的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种选择饲用价值提高和管理灵活性增加的苜蓿植物的方法，用于提高所提供饲料的品质或增加早期可得到的生物质。

Description

用于提高饲料品质的方法和组合物
相关申请的引用
本申请要求2012年6月26日提交的美国临时专利申请号61/664,359的优先权，所述申请的全部公开内容以引用方式并入本文。
发明领域
本发明涉及植物基因工程。更确切来说，本发明涉及用于改善饲料作物营养品质的方法。
序列表的并入
将电子方式提交并且创建于2013年6月25日的文件名为“MONS336WO_ST25.txt”的序列表文件以引用方式并入本文，其大小为18千字节(在Microsoft中计算出文件大小)。
发明背景
本发明通过基因工程来提供方法和组合物，其中转基因苜蓿植物的酸性洗涤木质素(ADL)水平降低，愈创木基木质素(G木质素)水平降低，中性洗涤纤维消化率水平(NDFD)提高，并且植物活力与野生型相当，这使得农业适应性改善。饲料作物(包括豆科植物、禾本科植物、玉米青贮料和芸苔属(brassica)等)在全世界种植以提供具有可消化纤维的动物饲料。苜蓿和/或苜蓿干草是美国最重要的干草作物。虽然主要作为成捆干草来饲喂，但是它也可以作为青贮料、碎干草、方粒饲料或颗粒饲料来饲喂。苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))是饲料豆科植物，它占奶牛饲料的23％至34％。优质苜蓿干草是高度可消化的并且提供较高的蛋白质、能量、维生素和矿物质。优质苜蓿也含较少纤维素和半纤维素、较少木质素、较低纤维和较高相对饲用价值。苜蓿饲用价值常用NDFD来衡量。分析苜蓿饲料的NDFD可提供奶牛能够从饲料获得能量的估计，并且有必要提高苜蓿中的纤维消化率。例如，提高一个百分比单位的NDFD可使每天摄入的饲料干料提高0.37磅，使4％乳脂校正奶(FCM)产量提高0.55磅/天。饲喂具有更高NDFD饲料的奶牛能够从饲料中获得更多的总能量和营养价值。因此，在饮食中提供较少的谷物就能满足能量需求。饲料豆科植物中较低的NDFD最常与饲料植物成熟度有关系，这伴随有木质素浓度的升高并且与纤维素纤维升高有关。
影响NDFD的因素包括酸性洗涤纤维(ADF)的量。ADF是指饲料的细胞壁部分，它是饲料最难消化的部分，包括木质素、纤维素、二氧化硅和氮的不溶性形式。这些数值是特别重要的，因为它们涉及家畜对饲料的消化率。具有较高ADF的饲料与具有较低ADF的饲料相比消化能较低。因此，随着ADF水平升高，消化能水平降低。
发明内容
本发明通过基因工程来提供一种方法和组合物，其中可以选择具有较高饲用价值成分的转基因苜蓿植物，如与不包含本发明的DNA分子的非转基因对照植物相比，ADL和G木质素的浓度降低，下茎部中的NDFD水平升高而活力至少相当，以及农业适应性。具有较低木质素的苜蓿事件是通过使用RNAi构建体下调木质素生物合成酶紫花苜蓿(Medicago sativa)S-腺苷-L-甲硫氨酸：咖啡酰基-CoA 3-O-甲基转移酶(CCoAOMT)而产生的。所有构建体都使用了美国专利申请公开2005/0176670中描述的稳定反义技术，以引用方式并入本文中。选择较低木质素苜蓿的事件的方法是“木质素含量的降低，从而在10％开花成熟阶段之前切割时整株植物消化率提高8-15％。所述方法从苜蓿植物种群中选择苜蓿植物，其中所述苜蓿植物种群包含与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2同源或互补的重组DNA分子。所述方法包括分析苜蓿植物种群的下茎部并且选择满足以下条件的植物：与不包含这些重组DNA分子的苜蓿植物相比时，(1)酸性洗涤木质素浓度降低，其中酸性洗涤木质素浓度的降低介于12％和31％之间；(2)愈创木基木质素浓度降低，其中所述浓度降低约25％或更高；(3)中性纤维消化率升高，其中NDFD值升高18％以上。
在本发明的一个方面中，选择出的具有较高饲用价值成分的苜蓿植物具有大体上等于不包含所述重组DNA分子的苜蓿植物的活力。
在另一个方面中，本发明提供一种分析和选择已经用咖啡酰基CoA 3-O-甲基转移酶(CCoAOMT)的抑制构建体(SEQ ID NO:7)转化的具有较高饲用价值成分的转基因苜蓿植物的方法，它进一步包含维管-增强启动子(vascular-enhanced promoter)以调控与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2同源或互补的重组DNA分子的转录。
在又一个方面中，本发明提供通过本发明方法选择的苜蓿植物或所述植物的子代，或来源于所述植物或子代植物的干草或青贮料，其中所述苜蓿植物或植物产品包含与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2同源或互补的DNA分子，并且包含由下茎部中较低的ADL和G木质素浓度、较高的NDFD水平带来的较高饲用价值成分。
附图简述
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括来进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个和以下对它们的相应描述并结合本文中提供的特定实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1-用黑体例示并概述了与非转基因事件相比，具有抑制的咖啡酰基CoA 3-O-甲基转移酶(CCoAOMT)的良种转基因苜蓿事件的ADL浓度介于80％和91％之间；NDFD值介于110％和125％之间；并且具有较低的G木质素值。
图2-例示符合所要求的表现标准的KK179-2的良种事件和木质素降低苜蓿事件(定义为“甜蜜点”)，这些标准是以饲料消化率提高和营养品质提高的百分比ADL、NDFD和活力的水平为基础。
序列简述
SEQ ID NO:1-CCoAOMT基因1139987:1CR-紫花苜蓿CCoAOMT-1:1:1的序列(有义方向)。
SEQ ID NO:2-1150536:1CR-蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)CCoAOMT-1:1:2的序列(反义方向)。
SEQ ID NO:3-介于有义臂与反义臂之间的RNA环的序列(374-530bp)。
SEQ ID NO:4-RNA环的5’端的序列(7-73bp)。
SEQ ID NO:5-1141266:1启动子(P)-Pv.Pal2-1:1:1的序列。
SEQ ID NO:6-1141267:1前导序列(L)-Pv.Pal2-1:1:1的序列。
SEQ ID NO:7-pMON100052CAS-Pv.Pal2//SUP-CCoAOMT//nos；CAS-CaMV.35S//npt2//nos的序列。
发明详述
本发明提供一种方法，所述方法用于选择需要提高饲用价值的饲料作物。所述方法的方面可应用于多种饲料作物，例如，包括但不限于瑞士三叶草(Alsike clover)、红豆草(Sainfoin)、胡枝子(Lespedeza)、库拉三叶草(Kuraclover)、拉地诺三叶草(Ladino clover)、红三叶草(Red clover)、白三叶草(whiteclover)、甜三叶草(sweet clover)、角果百脉根(Birdsfoot trefoil)、鹰嘴紫云英(Cicer milkvetch)、小冠花(Crown Vetch)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)和苜蓿(alfalfa)。
根据本发明的方法可以包括但不限于，选择用重组DNA构建体转化的转基因饲料作物苜蓿植物的方法，所述重组DNA构建体降低木质素生物合成途径中S-腺苷-L-甲硫氨酸：咖啡酰基-CoA 3-O甲基转移酶(CCoAOMT或CCOMT)酶的表达或活性，所述方法使用与不用所述重组DNA构建体转化的苜蓿植物相比酸性洗涤木质素(ADL)降低、愈创木基木质素(G-木质素)降低、中性洗涤纤维消化率(NDFD)升高以及活力至少大体上相当或提高的选择标准。本发明方法中的综合选择标准可选择具有较高饲用价值的苜蓿植物。本发明涉及与选择并提高饲料作物营养相关的植物、植物部分、植物种子、植物细胞、农产品和方法。
本发明还提供一种包含启动子分子的DNA分子，它在与对应于SEQ IDNO:1(SEQ ID NO:7的核苷酸6583-6882)的DNA片段或其互补片段连接的苜蓿植物细胞的维管组织中起作用。本发明还提供一种包含SEQ ID NO 1的DNA分子(连接于SEQ ID NO 3，连接于SEQ ID NO 2)，这个组合包含在SEQID NO:7的构建体之内)。在本发明的另一个方面中是包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的苜蓿植物细胞、植物部分、干草或种子。
本发明涉及一种具有改善的经济学重要特性、更高饲用价值的转基因植物。更具体地讲，本发明涉及一种包含本发明核苷酸序列、本发明的SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2并且与非转基因对照植物相比饲用价值提高的转基因植物。
在一个特定实施方案中，“饲用价值提高”被描述与不包含本发明DNA分子的非转基因对照植物相比，ADL和G木质素的浓度降低、下茎部中的NDFD水平升高而活力至少相当以及农业适应性。
本发明的植物可以将重组DNA传递给子代。本文中使用的“子代”包括来源于原代植物的任何植物、种子、植物细胞和/或包含所述重组DNA的再生植物部分。转基因植物、子代和种子可以含有所述转基因的一个、两个、三个或四个复本。在本发明的实践中，转基因植物的杂交以及选择分离子代之内的转基因可用于提高特征纯度。如同营养繁殖，还涵盖对亲本植物的反交以及与非转基因植物的异交。常用于不同特征和作物的其他方法的描述可以在一些参考文献中找到，例如，Fehr,Breeding Methods for Cultivar Development,Wilcox J.编著，American Society of Agronomy,Madison WI(1987)。
本文中公开的方法中使用的植物和种子还可以含有一个或多个额外的转基因。这种转基因可以是编码带来希望特征的蛋白或RNA分子的任何核苷酸分子，这些特征包括但不限于抗虫性提高、用水效率提高、产量表现提高、抗旱性提高、种子质量提高、营养品质提高、瘤胃非降解蛋白(RUP)提高和/或除草剂耐受性提高，其中所述希望的特征是相对缺乏这种额外转基因的饲料植物测量的。
木质素途径开始于苯丙氨酸通过苯丙氨酸氨解酶(PAL)转化成肉桂酸。第二个反应是通过肉桂酸4-羟化酶(C4H)将肉桂酸转化成4-香豆酸进行的。这两种酶构成包括木质素生物合成的类苯基丙烷途径的核心。所述途径中的其他酶包括C3H或4-香豆酸3-羟化酶，它将4-香豆酰基莽草酸或奎尼酸转化成咖啡酰基莽草酸或奎尼酸；HCT，羟基肉桂酰基CoA：羟基肉桂酰基转移酶在两个位置起催化从4-香豆酰基CoA形成4-香豆酰基莽草酸(或奎尼酸)(C3H的底物)的作用，并且还在咖啡酰基莽草酸(或奎尼酸)的相反方向起作用，得到咖啡酰基CoA。CCoAOMT(咖啡酰基-CoA 3-O-甲基转移酶)将咖啡酰基CoA转化成阿魏酰基CoA并且可能同时涉及其他反应。COMT(咖啡酸O-甲基转移酶)作用于5-羟基松柏醛并且将其转化成芥子醛。阿魏酸5-羟化酶(F5H)将松柏醛转化成5-羟基松柏醛。来自各种植物物种的木质素生物合成途径酶基因的DNA序列在美国专利公开号2007/0079398中公开，以引用方式并入本文。本发明的DNA序列包括但不限于SEQ ID NO:1-7。
单木纤维素分别以类苯基丙烷对羟基苯基(H)、愈创木基(G)和丁香醛(S)木酚素的形式并入木质素。双子叶木质素通常是G和S的混合物，单子叶木质素是所有三种的混合物。
制备的DNA构建体含有植物中非编码和编码序列表达所必需的各种遗传元件。编码多核酸的启动子、前导序列、内含子、转运肽和3’转录终止区全部是可以由植物分子生物学领域技术人员可操作连接以提供希望的表达或功能水平的遗传元件。
在维管组织或蓄积木质素的组织中起作用的各种启动子都可以用于表达本发明的RNA分子。在木质部组织中起作用的启动子可以包括但不限于与类苯基丙烷生物合成途径有关的启动子，如苯丙氨酸氨解酶(PAL)启动子、肉桂酸4-羟化酶(C4H)启动子、香豆酸3-羟化酶启动子、O-甲基转移酶(OMT)启动子、4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)启动子(美国专利号6,831,208)、肉桂酰基-CoA还原酶(CCR)启动子和肉桂醇脱氢酶(CAD)启动子(美国专利号7,429,649)。维管启动子的典型实例是PAL启动子。在本发明的一个优选实施方案中，使用来自Phaseolus vulgares的PAL2启动子来调控苜蓿中的CCoAOMT基因的抑制。
在本文中使用的重组DNA技术中的实验室操作是本领域众所周知并且常用的那些。使用标准技术来进行克隆、DNA和RNA分离、扩增和纯化。一般来讲，涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制内切核酸酶等的酶反应是按照制造商说明书进行的。这些技术和各种其他技术通常是按照Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor,New York(1989)进行的，本文中称为Sambrook等，(1989)。
也可以通过技术文献中描述的众所周知的技术来合成(完全或部分)感兴趣的多核酸分子，特别是希望在多核苷酸序列中提供修饰的时候，参见，例如，Carruthers等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47:411-418(1982)和Adams等，J.Am.Chem.Soc.105:661(1983)。因此，全部或部分本发明的多核酸分子可以是合成的并且可以根据需要修饰以在选择的饲料作物中提供希望的结果。
可以通过本领域技术人员熟知的各种常规的转化技术将本发明的DNA构建体引入希望的植物宿主的基因组中。植物细胞或组织的转化方法包括但不限于土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化方法和基因枪(Biolistics)或粒子枪介导的转化方法。用于土壤杆菌介导转化的合适的植物转化载体包括来源于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒的那些，以及例如以下文献公开的那些：Herrera-Estrella等，Nature 303:209(1983)；Bevan,Nucleic AcidsRes.12:8711-8721(1984)；Klee等，Bio-Technology 3(7)：637-642(1985)。除了来源于土壤杆菌的Ti或根诱导(Ri)质粒的植物转化载体之外，可以使用替代方法将本发明的DNA构建体插入植物细胞。本文中使用的术语“转化”是指已经向其中引入外部多核苷酸分子(如构建体)的细胞、组织、器官或有机体。优选地，引入的多核苷酸分子被整合到受体细胞、组织、器官或有机体的基因组DNA中，以使引入的多核苷酸分子被随后的子代继承。“转基因”或“转化”细胞或有机体也包括细胞或有机体的子代以及由杂交中使用这种转基因植物作为亲代并且表现由外部多核苷酸分子的存在引起的改变表现型的育种计划中产生的子代。可以通过任何植物转化方法将含有本发明DNA分子的植物转化构建体引入植物。在本发明的实践中通过将植物表达构建体引入植物基因组来转化植物的方法和材料可以包括任何众所周知并且证实的方法，包括美国专利号5,384,253中说明的电穿孔；美国专利号5,015,580、美国专利号5,550,318、美国专利号5,538,880、美国专利号6,160,208、美国专利号6,399,861和美国专利号6,403,865中说明的基因枪法；美国专利号5,635,055、美国专利号5,824,877、美国专利号5,591,616、美国专利号5,981,840和美国专利号6,384,301中说明的土壤杆菌介导的转化；以及美国专利号5,508,184中说明的原生质体转化。
在本发明的一个实施方案中，这些豆科植物可以包括苜蓿(苜蓿(lucerne)；紫花苜蓿或镰荚苜蓿(Medicago falcata)或它们之间的杂交品种)；可以经改良提高反刍动物饲用价值的与苜蓿相似的其他饲料，包括白三叶草(Trifoliumrepens)、红三叶草(T.pretense)、瑞士三叶草(T.hybridum)、甜三叶草(Melitotusalba和M.officinalis)和地三叶草(T.subterranium)、红豆草(Onobrychisviciifolia)、湿地百脉根(Lotus uliginosis)、角果百脉根(L.corniculatus)、紫云英(Astragalus cicer)、sericea(截叶胡枝子(Lespedeza cuneata))、Kobe lespedeza(Kummerowia striata)、朝鲜胡枝子(K.stipulacea)、树木、灌木和一般的草本植物。
包括的以下实施例是为了证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解实施例中公开的技术表示由本发明人发现的，在本发明实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以被认为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。
提供以下定义和方法是为了更好地界定本发明以及指导本发明的一般技术人员。除非另外说明，否则术语应按照相关技术领域的一般技术人员的常规用法来理解。
本文中使用的术语“饲料作物”表示饲料豆科植物，包括可以用饲料作物(包括相关的野生饲料物种)繁殖的所有植物品种。
苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))是常用于动物饲料(特别是奶牛)的饲料豆科植物。本文中使用的术语“苜蓿”表示任何苜蓿物种，包括但不限于紫花苜蓿、M.murex、镰荚苜蓿、平卧苜蓿(M.prostrata)和蒺藜苜蓿。因此，本文中使用的术语“苜蓿”表示任何类型的苜蓿，包括但不限于通常称为载培苜蓿、二倍体苜蓿、腺苜蓿、紫花苜蓿、黄花苜蓿(sickle alfalfa)、杂花苜蓿、野生苜蓿或黄花苜蓿。
本发明提供DNA分子和它们对应的核苷酸序列。本文中使用的术语“DNA”、“DNA分子”、“多核苷酸分子”是指基因组或合成的双链DNA分子，如脱氧核糖核苷酸碱基或多核苷酸分子的聚合物，从5’(上游)端向3’(下游)端读取。本文中使用的术语“DNA序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”是指DNA分子的核苷酸序列。
“DNA构建体”或“重组DNA分子”是指可操作的连接中的异源DNA遗传元件的组合，它常用于向受体有机体提供新的特征。本文中使用的术语“重组”是指通常在自然界中不会被发现的DNA和/或蛋白和/或有机体形式，比如通过人的干预创造的那些。这种人的干预可以产生重组DNA分子和/或重组植物。本文中使用的“重组DNA分子”是包含自然中不会同时出现并且是人的干预产生的DNA分子的组合的DNA分子，例如，由至少两种相互异种的DNA分子组合组成的DNA分子，和/或人工合成并且包含与通常在自然界中存在的多核苷酸序列不同的多核苷酸序列的DNA分子。本文中使用的“重组植物”是通常不会在自然界中存在的植物，是人干预的结果，并且含有转基因和/或并入其基因组的重组DNA分子。本发明中使用的“DNA构建体”包含至少一个表达盒、在植物细胞中可操作的启动子，以及编码功能上限于维持转基因苜蓿活性的蛋白、蛋白变体或蛋白片段的本发明多核苷酸，包括植物细胞、植物部分、外植体和植物。本文中使用的DNA构建体中的至少一个表达盒也可以包含抑制编码目标植物中的反式-咖啡酰基-CoA 3-O-甲基转移酶(CCoAOMT)编码序列的至少一个多肽表达的一个或多个多核苷酸。
本文中使用的术语“包括”表示“包括但不限于”。
本文中使用的术语“同源或互补”是指通常与本文中提供的DNA分子的有义或反义链有相当大百分比的序列一致性的多核苷酸分子。特别感兴趣的是与本文中描述的多核苷酸序列共有至少约90％序列一致性或更高序列一致性(如98％或99％序列一致性)的DNA分子。因此，可以使用本发明的核苷酸序列选择性地与多核苷酸分子片段的互补链形成双螺旋分子的能力。取决于本申请所预见的，人们可能希望使用不同的杂合条件来实现对目标序列不同程度的选择性。
本发明的多核苷酸分子能够调控内源性饲料植物基因(咖啡酰基-CoA3-O-甲基转移酶(CCoAOMT))的表达，并且大体上与提供相同功能的多核苷酸分子同源，它们涵盖在本发明的范畴内。
当第一核酸分子被放在第二核酸分子的功能关系中时，如果第一核酸分子“可操作地”与第二核酸分子连接就可认为是“可操作连接的”或“连接的”。例如，如果启动子影响DNA分子的转录或表达，所述启动子就是与DNA分子可操作连接的。一般来讲，可操作连接的DNA分子是连续的，然而，在DNA构建体中可能包含额外的分子，它隔开物理连接而不影响功能连接。
术语“启动子”或“启动子区”是指起调控元件作用的多核酸分子，通常在DNA编码序列的上游(5’)，所述调控元件通过控制信使RNA(mRNA)的产生来控制编码序列的表达，通过提供在正确位点开始转录所需的RNA聚合酶识别位点和/或其他因素。正如本文中所涵盖的，启动子或启动子区包括通过向各种调控序列连接DNA取得的启动子变体、随机或受控诱变和增强子分子的增加或重复。当作为合适的重组载体的一部分引入宿主时，本文中公开的启动子区及其生物学上的功能等价物负责驱动在它们的控制下的编码序列的转录，这可以通过其产生mRNA的能力来证明。包含启动子的DNA构建体也可用于引导非编码RNA分子的转录。
“3’非翻译序列”是位于结构核苷酸序列下游的DNA序列并且包括编码多聚腺苷酸化和其他能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的序列。多聚腺苷酸化信号在植物中起到向mRNA前体3'端添加多聚腺苷酸核苷酸的功能。多聚腺苷酸化序列可以来源于天然基因、各种植物基因或T-DNA。
“转化”是指向细胞或原生质体引入外源性多核酸分子(例如，DNA构建体、重组多核酸分子)的过程，并且所述外源性多核酸分子被并入宿主细胞基因组或细胞器基因组(例如，叶绿体或线粒体)或能够自主复制。“转化的”或“转基因”是指已经向其中插入外部多核酸(DNA构建体或重组DNA分子)的细胞、组织、器官或有机体。“转基因”或“转化的”细胞或有机体也包括所述细胞或有机体的子代和由杂交中使用这种“转基因”植物作为亲代的“转基因”植物并且表现由所述外部多核酸分子的存在引起的改变表现型的育种计划产生的子代。使用土壤杆菌介导转化向双子叶植物(包括苜蓿和植物细胞)中引入DNA在本领域是众所周知的。参见例如，Fraley等，(1985)，Rogers等，(1987)和美国专利号5,563,055描述的方法，明确地将其以引用方式全部并入本文。植物转化是表示向植物基因组中引入外部核酸序列。转化技术包括磷酸钙转染、DEAE-Betran转染、电穿孔、显微注射、原生质体融合和脂质体介导的转染。此外，可以使用植物病毒(如CaMV)作为载体向植物细胞中引入外部核酸或者可以是使用小粒子的高速弹道侵入(ballistic penetration)(Klein等，1987)。向植物细胞中引入核酸片段的最优选方法是用已经用选择的核酸片段转化的根癌土壤杆菌感染植物细胞或植物组织(Horsch等，1984)。苜蓿是按照1996年McKersie等的操作规程转化。借助于土壤杆菌或者使用其他生物、化学或物理方法的其他苜蓿转化方法是可行的，因此可以用于本发明。用于产生适当的载体、用那些载体转化细胞以及鉴定转化体的方法在科学文献中有描述，例如，但不限于，Sambrook等，(1989),Molecular Cloning：A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,Gelvin和Schilperoort(1991)Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Press，以及更重要的是Glick,B.R.和Thompson,J.E.1993,Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology,CRC Press,Boca Raton。
本文中使用的术语“转基因”是指人工并入宿主细胞基因组的多核苷酸分子。这种转基因可能与宿主细胞异源。术语“转基因植物”是指包含这种转基因的植物。“转基因”还涵盖通过定向或定点突变插入非天然多核酸分子修饰的天然植物基因的组成部分。插入植物基因组的重组DNA分子是转基因。“转基因”定义为已经并入宿主基因组或能够在宿主细胞中自主复制并且能够引起一个或多个编码序列表达的DNA片段。示例性转基因将为宿主细胞或从所述宿主细胞再生的植物提供相对于对应的非转化细胞或植物增强的表现型。转基因可以通过遗传转化直接引入植物中，或者可以从转基因子代植物继承下来。
用于转化的本发明的“转化载体”可以含有一个或多个“表达盒”，每个表达盒包含与目标多核苷酸序列可操作连接的天然或非天然植物启动子，所述目标多核苷酸序列与3’UTR终止信号可操作连接，用于在适当的宿主细胞中表达。转化载体一般还包含正确翻译核苷酸序列或转基因需要的序列。本文中使用的术语“转基因”是指人工并入宿主细胞基因组的多核苷酸分子。这种转基因可能与宿主细胞异源。术语“转基因植物”是指包含这种转基因的植物。编码区通常编码目标蛋白，但是也可能编码目标功能RNA(例如反义RNA，一种非翻译的RNA，以有义或反义方向)，microRNA、非编码RNA，或在抑制或过表达目标基因序列中使用的合成RNA。包含目标核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这指的是它的至少一种组分相对于它的至少一种其他组分是异源的。本文中使用的术语“嵌合”是指由两个或两个以上遗传上不同的来源产生的DNA分子，即来自一个基因或有机体的第一分子和来自另一个基因或有机体的第二分子。“转化构建体”是被设计成通过遗传转化引入宿主基因组的嵌合DNA分子。优选的转化构建体将包含引导一个或多个外源性基因表达必需的所有遗传元件。在本发明的特定实施方案中，可能希望以表达盒的形式将转化构建体引入宿主细胞。
“再生”是指从植物细胞(例如，原生质体、愈伤组织或外植体)培育植物的过程。
术语“植物”包含整株植物、芽营养器官/结构(例如，叶子、茎和块根)、根、花和花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊、花药和胚珠)、种子(包含胚胎、胚乳和种皮)和果实(成熟卵巢)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞等)以及其子代。植物是指整株植物以及植物部分(如种子、果实、叶子或根、植物组织、植物细胞或任何其他植物物质，例如，植物外植体)，以及指其子代，以及模拟细胞中的生物化学或细胞组分或过程。
本公开中使用的“对照植物”是指为了鉴定转基因或基因改良的植物的增强表现型，用于与转基因或基因改良的植物比较的植物细胞、种子、植物成分、植物组织、植物器官或整株植物。在一些情况下对照植物可以是包含空载体或标记基因但是不含有在所述转基因或基因改良的植物中表达的本发明的重组多核苷酸的转基因植物系。对照植物在其他情况下可能是不含有重组DNA的半合子转基因植物系的子代，称为阴性分离子或阴性同系。一般来讲，对照植物是与检测的转基因或基因改良的植物相同系或种类的植物。合适的对照植物可以包括用于产生本文中的转基因植物的亲代系的基因不变的或非转基因植物。
“转基因植物”是指含有在相同物种、种类或品种的野生型植物中未发现的遗传物质的植物。遗传物质可以包括转基因、插入的诱变事件(如通过转座子或T-DNA插入诱变)、激活标签序列、突变序列、同源重组事件或通过嵌合修复术修饰的序列。一般地，外部的遗传物质已经通过人的操作引入到植物中，但是可以使用本领域技术人员知道的任何方法。转基因植物可以含有表达载体或表达盒。“转基因植物”是来源于所述植物或子代的任何后代的植物或子代植物，其中所述植物或子代含有不是天然存在于非转基因植物中的引入的外源性DNA分子。所述转基因植物此外可以含有对被转化植物来说天然的序列，但是为了修改所述基因的表达水平或类型，其中所述“外源性”基因已经被修改，例如，通过使用一个或多个异种调控或其他元件。
本文中使用的“野生型”是指在实验意义上没有基因修饰或处理的植物细胞、种子、植物成分、植物部分、植物组织、植物器官或整株植物。野生型细胞、种子、成分、部分、组织、器官或整株植物可以用作对照，以比较其中的多肽表达被改变的相同物种、品种或栽培品种的细胞、组织或植物的表达水平、特征改良程度和性质，所述改变是，例如，已经被敲除、过表达或异位表达。
R0转基因植物是指已经被基因转化或已经从已基因转化的植物细胞或细胞再生的植物。
植物“种群”是指正常情况下在种群之内可以混种并且共有等位基因和基因型频率相似性的相同物种的局部生物群。
本文中使用的术语“愈伤组织”是指能够重复细胞分裂和生长的未分化植物细胞团，并且在一些物种中可以诱导形成整株植物。
本文中使用的术语“体细胞组织”是指不包括性细胞或配子的组织。体细胞组织由营养组织和细胞组成。
本文中使用的术语“体细胞胚胎发育”是指从营养或非配子细胞胚胎起始和发育的过程。假定来自给定组织源的胚胎是基因相同的。体细胞胚胎发育是植物从细胞培养系统再生的重要途径并且是大规模生产植物和合成种子中常用的方法(Stuart等，1987)。在体细胞(无性)胚胎发育中，胚胎样结构以类似于由体细胞组织形成的合子胚的方式发育成整株植物。体细胞胚胎可以不经中间(intervening)愈伤组织的产生就可从细胞或小细胞群产生。体细胞胚胎也可以从中间愈伤组织或由从所述愈伤组织产生的细胞悬浮液产生。体细胞胚胎发育是用于希望的物种或各种植物增殖的若干本领域已知方法之一。选择体细胞胚胎发育作为增殖方法有许多优势。一个优势是可以选择具有已知和希望的表现型的植物作为细胞源，并且根据体细胞胚胎发育技术，这些细胞可以被迅速培养成许多基因相同的胚胎。随后可以将所得胚胎培育成具有根和芽的整个植物。因此，根据这些技术，可以大量生产具有与亲代相同的所需表现型的植物，与美国专利号5,187,092中描述的其他增殖技术比，这样的成本相当并且往往更快速并且基因一致性更好，以引用方式将美国专利号5,187,092并入本文。
培养的细胞可以在固体载体上或以液体混悬液的形式生长。在任何一种情况下，都可以以培养基的形式向细胞提供营养剂，并且环境条件可控。有许多类型由各种氨基酸、盐、糖、生长调节因子和维生素组成的组织培养培养基。适用于植物细胞培养的各种类型的培养基已经在先前描述过。这些培养基的实例包括但不限于Schenk和Hildebrandt配方(1972)描述的培养基。胚胎发育愈伤组织培养可以与某些转化技术一起使用来制备用于转化的细胞以及饲料植物(例如，苜蓿)的再生。Schenk和Hildebrant培养基配方(S&H培养基，1972)用于胚胎发育组织培养的转化和维持。S&H培养基是大部分细胞类型生长需要的各种类型成分(盐、氨基酸、生长调节因子、糖、缓冲液)的混合物。S&H培养基(pH为5.8)提供补充有激素、0.2μM最终浓度的2,4-D和0.5μM浓度的激动素的宏量营养剂、微量营养剂、维生素、铁的混合物。12-15周之后在选择条件下初级体细胞胚胎是可见的。
本文中使用的术语“外植体”是指从用于培养的供体植物上取下的一块组织。
“宿主细胞”可以定义为被传染剂入侵或能够被传染剂入侵的细胞。已经用DNA(或RNA)转化的宿主细胞(如细菌细胞作为重组DNA的宿主细胞)能够随着宿主细胞的繁殖而复制重组DNA。对“宿主细胞”的引用包含多个这种宿主细胞。用于引入重组DNA的合适的宿主细胞包括但不限于植物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、合成细胞或其组合。合成宿主细胞可以涵盖化学合成的染色体被移植到细胞中产生的合成细胞(例如，合成细菌)，它能够自我复制。合成细菌宿主细胞的基因组可以在天然生长的宿主细胞(例如，酵母菌宿主细胞)中组装。合成宿主细胞对于制备含有生物全部性质的小量合成基因组是特别有用的。
术语“表达”是指细胞内过程的组合，包含编码DNA分子(如结构基因)进行转录和翻译产生多肽。
本文中使用的术语“抑制”是指在基因的任何发展或瞬时阶段，与野生型或对照植物、细胞或组织中的表达相比植物、植物细胞或植物组织中的基因的较低表达水平。抑制可以使用许多方法来施加；抑制导致蛋白质活性降低的突变，抑制抑制剂的产生，升高、降低或消除酶活性需要的底物水平，以产生新的蛋白质；或者活化通常沉默的基因，蓄积自然条件下通常不升高的产品。所述抑制基因可以是不同基因上的另一个突变，在相同基因上但是与第一突变有一些距离的抑制基因突变，或者是在由于非染色体DNA改变产生的细胞质中的抑制基因。有多种方法来抑制基因，例如，RNAi介导的基因抑制可用于抑制植物内的目标基因的表达。包含在植物细胞中起作用并且在植物细胞中表达时与多核苷酸可操作连接的启动子的重组DNA构建体被转录成相对于对照抑制所述植物细胞中的内源性蛋白质水平的RNA分子，其中所述RNA分子是被加工成siRNA且靶向编码所述蛋白质的信使RNA的dsRNA；靶向编码所述蛋白质的信使RNA的miRNA；被加工成siRNA并且编码所述蛋白质的信使RNA的ta-siRNA；或者被转录成相对于对照导致miRNA活性抑制的RNA分子，并且其中一种RNA分子是miRNA的裂解阻滞剂或者是miRNA的miRNA诱饵(美国专利公开2009/61288019中公开了这些RNAi介导的基因抑制方法的实例并且以引用方式并入本文)。“抑制”是指植物或植物细胞在所述植物或细胞的至少一个基因中有干扰，其中与对照细胞相比，所述干扰导致由那个基因编码的多肽表达或活性的降低。敲除可以是，例如，基因组干扰的结果，包括转座子、tilling和同源重组、反义构建体、有义构建体、RNA沉默构建体或RNA相互作用。基因内的T-DNA插入是可以消除基因表达的基因型改变的实例。
在“事件”的选择中，通过转化方法将负责某种特征的转化构建体引入基因组。通常针对各种构建体生成许多独立的转化体(事件)。评价这些事件以选择具有优良表现的那些。事件评价过程基于一些标准，包括：1)转基因表达和特征的表现型“效果”；2)所述特征的分子表征，如显示清晰的单个完整插入的事件选择是通过进行分子试验分析拷贝数、插入数、插入复杂性、载体骨架的存在和开发事件特异性的分析并且用于进一步开发发现的；3)特征的分离，检测特征的分离以选择伴随单位点分离方式的转基因事件。直接的方法是评价所述特征的分离；4)开发的事件的农业经济学；以及5)转基因特征表达的稳定性。大的独立事件群体的评价以及更全面的评价可产生更大的成功机会。转基因特征表达的稳定性是通过在不同代、环境以及不同遗传背景中的检测确定的。显示不稳定表现型效果的事件被丢弃。一般来讲，具有作为单显性基因继承并且遵循孟德尔分离比的单个完整插入的事件被用于诸如回交和正向繁殖等的商业化特征整合策略。
“G木质素”是指愈创木基木质素。愈创木基木质素主要由松柏醇单元组成，而愈创木基-丁香酚基木质素含有来自松柏醇和芥子醇的单体单元。一般来讲，愈创木基木质素在软木中含有，而愈创木基-丁香酚基木质素存在于硬木中。
“饲用价值提高”是指饲料品质如纤维含量、消化率和可利用碳水化合物资源可被牲畜利用。饲用价值或苜蓿品质的提高是通过相对饲用价值(RFV)确定的，表示为100％开花的苜蓿百分比并且在领域内用作饲用价值的预测值。影响饲用价值的成分是酸性洗涤木质素浓度和G木质素和中性洗涤纤维消化率。这些饲用价值成分的测定是本发明的一个方面。
植物“活力”是衡量农业适应性的尺度，如超过播种后规定时间的植物生长、叶体积或生物质。
“酸性洗涤木质素”(ADL)是木质素含量的估计。木质素是饲料纤维的难消化成分(NDF)，被认为限制反刍动物消化饲料纤维的程度。
饲料的“中性洗涤纤维消化率”(NDFD)含量是饲料纤维消化率的量度并且可以在体外测量并且使用近红外反射光谱法(NIRS)来预测。NDFD值越高，饲料越容易被消化。
苜蓿植物的“下茎部”被描述为高出地面2.5”收割的叶子完全除去的苜蓿植物茎部的15-cm茎部切段。下茎部是苜蓿植物最木质化的部分，并且是最难消化的。
苜蓿一般是作为苜蓿“干草”或“青贮料”收割的，两者之间的差异在于含水率和粗蛋白。对于苜蓿青贮料，可消化蛋白应该是粗蛋白的60％至70％。例如，在苜蓿青贮料中，可消化蛋白应该是粗蛋白的60％至70％。苜蓿最经常地是作为“干草”收割并且可以成捆或成堆储存，但是也可以制成青贮料、放牧或作为切碎青草饲喂。为了本发明的目的，“整株植物”是“干草”的等价物。以干物质为基准，牲畜吃的青贮料比干草更多。青贮料或半干青贮料由直接切割的苜蓿制成。
本文中使用的“瘤胃非降解蛋白”或“RUP”是指饲料品质的一种衡量标准。苜蓿的饲料品质“营养价值”可以通过其RUP浓度的升高大大改善。饲料蛋白质往往不可被反刍动物利用，这是因为它们在青贮料发酵期间就降解并且至此苜蓿中的RUP浓度的升高可增强其营养价值。
本文中使用的“一个(种)”可以表示一个(种)或多个(种)。如同在本文中的权利要求中所使用的，当与词语“包含(括)”一起时使用时，词语“一个(种)”可以表示一个或一个以上。
正如本文中所使用的，虽然本公开支持只是指替代方案的定义和"和/或"，除非明确指出只是指替代方案或者所述替代方案是互斥的，否则权利要求书中的术语“或”用于表示“和/或”。本文中使用的“另一个”可以表示至少第二个或更多个。
实施例
以下实施例提供本发明的说明性实施方案。然而，根据本公开，本领域技术人员应该理解不脱离本发明的概念、精神和范畴就可以对这些实施方案的特定方面做许多改变。此外，显然某些化学和生理学上都相关的试剂可以替代本文中描述的试剂而获得相同或类似的结果。对本领域技术人员来说显而易见的所有所述这些类似的替换和修改均被认为是在附加的权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念之内。
实施例1
用于苜蓿转化的植物表达构建体
这个实施例说明表达构建体的构建，所述表达构建体用于将重组DNA转移到可以再生到转基因苜蓿植物中的苜蓿植物细胞核中。包含表1中描述的元件的转化载体pMON100052(也称为pFG118)被制造用于制备重组DNA，所述重组DNA用于土壤杆菌介导的转化成苜蓿组织以抑制咖啡酰基-CoA3-O-甲基转移酶(CCoAOMT)，它包含标识为本发明的SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2的序列。用本发明的表达盒SEQ ID NO:7转化苜蓿细胞、植物部分或种植，所述表达盒SEQ ID NO:7包含来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的Pv.PAL2启动子，它允许木质素沉积位点中的CCoAOMT多肽的受控表达。所述表达盒可以通过转化或通过亲代植物转化之后繁殖并且收获子代种子引入植物。
表1：转化载体pMON100052(也称为pFG118)的元件
使用土壤杆菌菌株ABI，用包含与咖啡酰基-CoA 3-O-甲基转移酶(CCoAOMT)的编码序列互补的DNA片段的DNA构建体pFG118(SEQ IDNO:8；pMON100052)转化苜蓿无性繁殖系R2336(选自良种种质)。通过下调来自紫花苜蓿的木质素生物合成酶CCoAOMT产生木质素降低转基因事件的所有RNAi构建体均使用美国专利公开号US2005/0176670中描述的稳定反义技术，以引用方式并入本文。在转化构建体pMON100052中使用了两个不同的编码序列，一个编码含有RNA环的5’端的CCoAOMT基因(SEQ ID NO:1)的RNAi臂和环，另一个序列(SEQ ID NO:2)含有抑制或下调CCoAOMT酶表达的反义臂、环(374-530bp)和有义臂(531-836bp)。在pMON100052构建体中，用于抑制CCoAOMT基因的基因表达是在来自Phaseolus vulgarus的单个PAL2启动子的控制下调控的。来自苜蓿无性繁殖系R2336的小叶或源自叶子的外植体的转化是使用标准的土壤杆菌方法实现的(Walker和Sato，PlantCell Tissue Organ Cult,1:109-121,1981)。使用新霉素磷酸转移酶基因(它带来新霉素和卡那霉素的抗性)作为选择性标记来选择转化的材料，随后将所述材料转移至补充有替卡西林(250μg/mL)或泰门汀(150μg/mL)的芽诱导培养基。大约20-24周后将转化的植物转移至土壤中。当芽形成时，使它们生根并且起初放入品红箱中并且随后放入锅中并且在适度的光照下保持在25-26℃，所述锅中含有比例为5:1的灭菌蛭石:珍珠岩混合物合并等量的含生物杀菌剂(Hummert,目录号10-2093)的灌注预混PGX。将所述植物在品红箱盖子或用薄塑料袋密封的密封条件下保持7-10天，随后随着植物适应新环境逐渐降低湿度。用通用的肥料为植物施肥。一旦植物形成，就将它们转移至常规的土壤混合物中并且转移至温室。
实施例2
用于抑制咖啡酰基-CoA3-O-甲基转移酶的序列的识别(CCoAOMT)
这个实施例说明表达DNA构建体的转基因苜蓿的酚酸分析，所述DNA构建体用于抑制木质素生物合成途径中的酶的表达。为了下调所述酶的表达，用包含与咖啡酰基-CoA 3-O-甲基转移酶(CCoAOMT)编码序列互补的DNA片段(SEQ ID NO:7)转化苜蓿细胞。得到的转基因苜蓿植物细胞、植物部分或植物包含本发明的重组DNA分子，其中一部分所述DNA分子与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2同源或互补。
实施例3
具有较低酸性洗涤木质素的苜蓿植物的选择方法
通过改进Goering和Van Soest的标准规程测量酸性洗涤纤维(ADF)(Forage Fiber Analysis,USDA Agricultural Handbook No.379,1970)。将粉末样品(0.35g)放入F57ANKOM滤袋(ANKOM Technology Corporation,Fairport,NY)中，并且在ANKOM纤维分析仪中的相应溶液中在100℃加热搅拌1h。在接近沸腾的水中冲洗之后，将样品在105℃干燥6h，并且随后称重以确定纤维损失。ADL测定是在来自ADF测定的残余物上进行的，在72％(v/v)硫酸中孵育3h，彻底冲洗并且在称重之前在105℃干燥6h(Guo等，Transgenic Res,10(5):457-464,2001)。
将样品(30mg)在50℃干燥过夜，随后称量到配备特氟隆线螺旋盖子的玻璃培养小瓶(16x150mm)中。向样品中添加3mL新制备的25％(v/v)乙酰溴的冰醋酸溶液，之后在50℃加热4h。样品冷却之后，向管中添加3mL乙酸并且以3000rpm离心5min。将一小份(5mL)上层定量地转移至含有10mL 2MNaOH和12mL乙酸的50-mL容量瓶中。向每个瓶中加入羟胺(1mL 0.5M)并且用乙酸将样品稀释至50mL。测定每个样品的吸收光谱(250至350nM)并且用于确定在280nm的最大吸收值。使用以下回归方程：乙酰溴木质素(mg/mL)＝吸光度读数/F，其中对于末成熟组织F＝17.20，对于成熟组织F＝17.12。
硫代酸解和木质素组成
向15-mL玻璃小瓶中的30mg干磨样品中加入三毫升硫代酸解试剂[2.5％三氟化硼乙醚络合物和10％乙硫醇，在二氧六环中(v/v)]。随后将密封的小瓶放入带有定期(每30min)人工搅拌的油浴(>80℃)4h。通过把小瓶放在冰上终止反应。添加内标物(200μL)、水(3mL)和饱和碳酸氢钠(直到pH～3到4)。涡旋混合物并且使其沉降。将下层(含有木质素分解产物的一氯甲烷)转移至另一个玻璃小瓶。用3mL一氯甲烷再萃取水层两次。合并一氯甲烷层并且经无水硫酸钠干燥。在氮气下干燥一小份(3mL)。用25微升(μL)吡啶和80μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(MSTFA)将干燥的萃取木质素单体衍生化。在37℃孵育30min之后，通过GC/MS分析0.5μL这种反应产物。GC/MS是在带有5971系列质量选择性检测器的Hewlett Packard 5890系列II气相色谱仪(柱子：HP-1，60m x 0.25mm x 0.25μm膜厚度)上进行的，并且质谱是以具有60到650m/z扫描范围的电子轰击模式(70eV)记录的。
实施例4
具有较高饲用价值成分的苜蓿植物
苜蓿(Medicago sativa L.)是美国最重要的饲料之一。提高苜蓿纤维消化率可改善饲料品质、日粮配合(ration formulation)灵活性以及提高饲用价值。目前，种植者和育种者依靠近红外光谱学(NIRS)来预测苜蓿的饲料品质。随着木质素下调苜蓿植物的引入，NIRS分析方法和公式可准确预测新的低木质素苜蓿样品的饲料品质特征。NIR分析已经用于木质素含量和组成的预测，例如测定硫酸木质素(Klason lignin)和丁香基(S-木质素)与愈创木基(G-木质素)亚单元的定量(Bailléres等，2002)。这个实施例报告体外中性洗涤纤维消化率(NDFD)和木质素分析(ADL，Klason，总硫代酸解产量，咖啡酸3-O-甲基转移酶(COMT)和咖啡酰基CoA 3-O-甲基转移酶(CCoAOMT)下调苜蓿的S-木质素和G-木质素。
作为干物质(DM)百分比的ADL的量和作为中性洗涤纤维百分比的NDFD是使用分别用转基因苜蓿(40株COMT和40株CCoAOMT下调植物)和20株非转基因对照无效型苜蓿植物的组织为下茎部和整株植物样品开发的NIRS公式计算的。化学分析得出苜蓿植物下茎部中的木质素总量，它包括以DM百分比为基准的ADL、硫酸木质素、总硫代酸解木质素、S-木质素、G-木质素和H-木质素。
通过地点组合从总共10地点中的三个以上地点采集40株COMT、40株CCoAOMT和20株无效型苜蓿植物的下茎部样品，总共为2900个现场样品。NIRS分析的结果表明COMT和CCoAOMT转基因苜蓿茎部有较低的木质素和较高的消化率。结果还显示硫代酸解测量的木质素与ADL和硫酸木质素相比，下调的苜蓿之间的相对值不同。总硫代酸解产量似乎是NDFD的最佳预测值。具体来讲，S-木质素水平与苜蓿茎部组织中的NDFD高度相关。
表2提供了ADL和NDFD值的总结，它表示为与整株植物中的Round-upReady(RR)事件相比，木质素降低的苜蓿转基因事件(KK179-2)的非转基因苜蓿对照植物百分比，这等价于干草(A)和下茎部(B)。第1列标识了苜蓿转基因事件KK179-2和Round-up Ready(RR)事件。第2列提供了表示为非转基因苜蓿对照植物百分比的ADL平均量。第3列提供了作为非转基因苜蓿对照植物百分比的NDFD的平均量。
表2.带有pMON100052的转基因苜蓿事件KK179-2和Round-up Ready(RR)苜蓿事件J-101之间的ADL和NDFD分析的比较(ATCC登记号PTA-4814，如美国专利申请号US7566817中所述)。
表3展示用于建立图2中描绘的木质素降低苜蓿事件的“甜蜜点”选择的原始数据值，是由以ADL百分比、G木质素百分比、NDFD的量度和活力评价分数为基础的表现标准界定的。第1列提供与单独的苜蓿植物(图2中展示)有关的图形识别号。第2列提供事件标识。第3列含有从1-10分等级的活力评价分数，10分是最好的活力。第4列提供平均ADL测量结果。第5列提供基于与非转基因无效对照植物比较的百分比ADL测量结果。第7列提供平均NDFD的测量结果。第8列提供基于与非转基因无效对照植物的比较的百分比NDFD的测量。第9列提供平均G木质素的测量结果。第10列提供基于非转基因无效对照植物的比较的百分比G木质素测量结果。符合表现标准的苜蓿事件如下分类：相对于具有低于所述表现标准的苜蓿干草ADL和NDFD值的事件，下茎部中的ADL浓度降低大约15至30％之间，ADL浓度介于80至91％之间，G木质素降低至少25％，NDFD值介于110和125％之间。
表3：用于创建图2中提供的木质素降低苜蓿事件“甜蜜点”选择的原始数据值。
实施例5
ADL、NDFD和产量结果的数据质量
在使用线性模型分析之前进行数据质量检查，并且鉴别具有大的剔除学生化残差的逸出点。使用两遍这种方法，以便在第二遍中发现可能被第一遍中除去的较大逸出值隐藏的隐蔽逸出值。从品质特征的分析中除去通过这种方法鉴别出的逸出值。对于产量的分析，从分析中除去具有25％或更大CV的点。使变异模型的标准分析来完成响应变量的分析，所述变异模型用具有固定和随机影响的混合。实际的统计计算是使用SAS/STAT软件版本9.1.3进行的。方差分析计算是使用PROC MIXED进行的。构建体中的模型处理的构建体和事件作为固定影响，而地点、地点中的reps和通过构建体相互作用的地点作为随机影响处理。试验的另一个事件属性涉及秋眠或非休眠种质(FD，ND)。这些都作为固定影响处理。在跨年分析中，年份作为随机影响处理。在不同地点不同年份完成了不同的收获切割次数。在每个地点分析了每次切割的产量。在跨地点、跨代和跨年份分析中，产量是切割的总和，以获得每个点的总产量。实验设计包括一些事件的配对阴性分离子以及汇集的无效分离子。这允许两个分析如下进行：在第一个分析中，所有事件与汇集的无效分离子比较，而在第二个分析中，事件与它们的配对阴性分离子比较。
实施例6
木质素降低的苜蓿事件的下茎部中的ADL测量结果
表4.2008年来自3个地点的两个秋眠(FD)种质中的6个木质素降低苜蓿事件的下茎部ADL测量结果。事件阳性植物下茎部ADL有显著的(p≤0.05)降低，与汇集的阴性对照相比在18-31％范围内。通过“甜蜜点”选择方法鉴定，KK179苜蓿事件具有木质素降低的表现型。
缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％；
LSD＝最小显著差异；
FD＝秋眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表5.2009年4个地点种植的秋眠(FD)种质1中的6个木质素降低苜蓿主导事件的下茎部ADL测量结果。
缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％；
LSD＝最小显著差异；
FD＝秋眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表6.2009年2个地点种植的不休眠(ND)种质1中的6个木质素降低苜蓿主导事件的下茎部ADL测量结果。
缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％；
LSD＝最小显著差异；
FD＝秋眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表7.2009年4个地点种植的秋眠(FD)种质2中的6个木质素降低苜蓿主导事件的下茎部ADL测量结果。
缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％；
LSD＝最小显著差异；
ND＝非休眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表8.2009年2个地点种植的不休眠(ND)种质2中的6个木质素降低苜蓿主导事件的下茎部ADL测量结果。
缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％；
LSD＝最小显著差异；
ND＝非休眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表4-8展示2009年分别在4个和2个地点的秋眠(FD)和不休眠(ND)种质中的下茎部ADL数据。与汇集的阴性对照相比时，6个事件阳性线显示出ADL有在12-26％范围内的显著(p≤0.05)降低，而主导事件KK179的ADL降低为18-22％。
实施例7
木质素降低苜蓿事件的下茎部中的NDFD测量结果
表9.2008年3个地点种植的秋眠(FD)种质中的6个木质素降低苜蓿主导事件的下茎部NDFD测量结果。
缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF的％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中的难消化和可缓慢消化的成分(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))；
FD＝秋眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
3个地点的秋眠(FD)种质中的6个木质素降低事件的下茎部NDFD。与汇集的阴性对照相比时，事件阳性植物显示出下茎部NDFD有在18-35％范围内的显著(p≤0.05)提高。
表10.2009年4个地点种植的秋眠(FD)种质1中的6个木质素降低苜蓿主导事件的下茎部NDFD测量结果。
缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF的％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中的难消化和可缓慢消化的成分(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))；
FD＝秋眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表11.2009年2个地点种植的不休眠(ND)种质1中的6个木质素降低苜蓿主导事件的下茎部NDFD测量结果。
缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF的％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中的难消化和可缓慢消化的成分(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))；
ND＝非休眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表12.2009年4个地点种植的秋眠(FD)种质2中的6个木质素降低苜蓿主导事件的下茎部NDFD测量结果。
缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF的％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中的难消化和可缓慢消化的成分(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))；
FD＝秋眠；
ND＝非休眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表13.2009年2个地点种植的不休眠(ND)种质2中的6个木质素降低苜蓿主导事件的下茎部NDFD测量结果。
缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF的％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中的难消化和可缓慢消化的成分(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))；
ND＝非休眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表10-13展示2009年分别在4个和2个地点的秋眠(FD)和不休眠(ND)种质中的下茎部NDFD数据。与汇集的阴性对照相比时，所述6个事件阳性木质素降低苜蓿事件显示NDFD有在22-36％范围内的显著(p≤0.05)提高，而主导事件KK179显示NDFD有22-28％的提高。
实施例8
木质素降低苜蓿事件的活力评价
表14.2个木质素降低苜蓿事件(JJ266和KK179)与3个地点的商业检查标准(commercial check)和无效对照相比的活力评价。木质素降低事件KK179对于活力评价等级未产生杂型。植物活力(评分为1-10，10分最好)是在先前采集的21天之后进行的，并且对于春季分数是在5月的第二周。
事件 地点1 地点2 地点3 均值
JJ266 8.0 7.4 7.8 7.7
JJ266，无效 7.8 7.4 8.0 7.7
KK179 8.0 7.6 7.6 7.7
KK179，无效 7.4 7.7 8.1 7.7
商业检查标准1 6.9 6.7 7.1 6.9
商业检查标准2 7.1 7.0 6.7 6.9
商业检查标准3 7.8 8.1 8.1 8.0
商业检查标准4 7.3 7.6 7.9 7.6
实施例9
木质素降低苜蓿事件整株植物中的ADL测量结果
表15.2009年4个地点种植的秋眠(FD)种质1中的6个木质素降低苜蓿主导事件的整株植物干草ADL测量结果。
缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％；
LSD＝最小显著差异；
FD＝秋眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表16.2009年2个地点种植的不休眠(ND)种质1中的6个木质素降低苜蓿主导事件的整株植物干草ADL测量结果。
缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％；
LSD＝最小显著差异；
ND＝非休眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表17.2009年4个地点种植的秋眠(FD)种质2中的6个木质素降低苜蓿主导事件的整株植物干草ADL测量结果。
缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％；
LSD＝最小显著差异；
FD＝秋眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表15和17中展示来自2009年跨4个地点的整株植物ADL数据。对于两种秋眠种质来说，与汇集的阴性对照相比时，所述6个木质素降低阳性事件显示出ADL有在8-19％范围内的显著(p≤0.05)降低。在秋眠种质1和2中，事件KK179的ADL分别有9.8％和9.4％的降低。
表18.2009年2个地点种植的不休眠(ND)种质2中的6个木质素降低苜蓿主导事件的整株植物干草ADL测量结果。
缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％；
LSD＝最小显著差异；
ND＝非休眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表16和18中展示来自2009年跨2个地点的整株植物ADL数据。与汇集的阴性对照相比时，不休眠种质中的6个木质素降低阳性事件显示出ADL有在10-16％范围内的显著(p≤0.05)降低。与汇集的阴性对照相比时，6个事件中的5个显示ADL有在10-18％范围内的显著降低。在不休眠种质1和2中，事件KK179的ADL分别有12.3％和10.9％的降低。
表19.2009年4个地点种植的两种秋眠(FD)种质中的木质素降低苜蓿事件KK179与商业检查标准相比的整株植物干草ADL测量结果。
缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％；
FD＝秋眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表20.2009年2个地点种植的两种不休眠(ND)种质中的木质素降低苜蓿事件KK179与商业检查标准相比的整株植物干草ADL测量结果。
缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％；
ND＝非休眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表19和20含有木质素降低苜蓿事件KK179与商业检查标准相比的整株植物ADL数据。与4个秋眠商业检查标准中的3个相比时，KK179事件显示ADL有显著(p≤0.1)降低，降低在6.8-16.7％范围内(表19，数据来自4个地点)。与所有4个不休眠商业检查标准相比，不休眠背景种质(ND种质1)中的KK179事件显示ADL有在7.6-10.6％范围内的降低(p≤0.2)(表20，数据来自2个地点)。与所有4个不休眠商业检查标准相比，不休眠背景种质2中的KK179事件显示ADL有全面的降低(p≤0.2)，与商业检查标准4相比有8.8％的显著(p≤0.1)降低(数据来自2个地点)。
实施例10
木质素降低苜蓿事件整株植物中的NDFD测量结果
表21.2009年4个地点种植的秋眠(FD)种质1中的6个木质素降低苜蓿主导事件的整株植物干草NDFD测量结果。
缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF的％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中的难消化和可缓慢消化的成分(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))；
FD＝秋眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表22.2009年2个地点种植的不休眠(ND)种质1中的6个木质素降低苜蓿主导事件的整株植物干草NDFD测量结果。
缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF的％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中的难消化和可缓慢消化的成分(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))；
ND＝非休眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表23.2009年4个地点种植的秋眠(FD)种质2中的6个木质素降低苜蓿主导事件的整株植物干草NDFD测量结果。
缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF的％；(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中的难消化和可缓慢消化的成分(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))；
FD＝秋眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表21和23中展示2009年跨越4个地点个整株植物NDFD数据。与汇集的阴性对照相比时，秋眠种质中的6个木质素降低阳性事件显示NDFD有在7-16％范围内的显著(p≤0.05)提高。在秋眠种质1和2中，事件KK179的NDFD分别提高7.5％和9.2％。
表24.2009年2个地点种植的不休眠(ND)种质2中的6个木质素降低苜蓿主导事件的整株植物干草NDFD测量结果。
缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF的％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中的难消化和可缓慢消化的成分(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))；
ND＝非休眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表22和24中展示2009年跨越2个地点个整株植物NDFD数据。与汇集的阴性对照相比时，不休眠种质中的6个木质素降低阳性事件显示NDFD有在8-15％范围内的显著(p≤0.1)提高。在不休眠种质1和2中，事件KK179的NDFD分别具有14.0％和11.5％的提高。
表25.2009年4个地点种植的两种秋眠(FD)种质中的木质素降低苜蓿事件KK179与商业检查标准相比的整株植物干草NDFD测量结果。
缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF的％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中的难消化和可缓慢消化的成分(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))；
FD＝秋眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表26.2009年2个地点种植的两种不休眠(ND)种质中的木质素降低苜蓿事件KK179与商业检查标准相比的整株植物干草NDFD测量结果。
缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF的％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中的难消化和可缓慢消化的成分(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))；
ND＝非休眠；δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表25和26含有木质素降低苜蓿事件KK179与商业检查标准相比的整株植物NDFD数据。与4个秋眠商业检查标准中的3个相比时KK179事件显示NDFD有提高(p≤0.2)，提高在4.2-16.8％范围内(表25，数据来自4个地点)。KK179事件显示与所有4个不休眠商业检查标准(ND种质1)相比NDFD有在9.8-19.4％范围内的提高(p≤0.2)(表26，数据来自2个地点)。KK179事件显示与所有4个不休眠商业检查标准(ND种质2)相比NDFD有在8.8-16.3％范围内的提高(p≤0.2)(表26，数据来自2个地点)。
实施例11
木质素降低苜蓿事件的产量跨地点分析
表27.与汇集的阴性对照相比，秋眠(FD)和非休眠(ND)背景中的6个木质素减少事件的产量(鲜重)跨地点分析。与汇集的阴性对照相比时主导事件KK179的产量没有显著降低。
缩写：
产量＝基于每株植物以克为单位计算的产量；
FD＝秋眠；
ND＝非休眠；
δ＝事件和对照均值之间的差异(事件-对照)；
差异％＝事件和对照之间的差异％(δ/对照*100)；
δLCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的下置信区间；
δUCI90％＝使用0.10的α水平的δ值的上置信区间；
P值＝在无效假设下更大绝对差异的可能性(双尾显著性检测)。
表27中的数据显示秋眠(FD)和非休眠(ND)种质中的6个木质素降低事件与汇集的阴性对照相比的跨地点产量分析。与汇集的阴性对照相比时对KK179检测到的产量没有显著的降低。
改善苜蓿的纤维消化率可向栽培者提供管理风险的能力并且提高收获高质量苜蓿干草/半干青贮料的可能性。起初在2007年研究了六十一个事件，在2008年建立了具有六个良种事件的多年份、多地点。结果表明通过测量在10％开花期的中性洗涤组分(NDFD)饲料消化率有显著的提高。
多地点试验是在两种休眠背景中在2008年种植的；数据是在2008和2009年中的两个季节收集的。对于所有休眠组合的六个事件来说，阳性选择对比无效对照均观察到了整株植物消化率有显著的升高(6.7-16％)。田间表现连同分子分析鉴别出一个主导事件KK179，它显示出跨两种休眠(秋眠(FD)和非休眠种质组)的显著的消化率提高。与汇集的无效对照相比，KK179显示消化率(NDFD)提高7.5-14％，与商业检查标准相比，消化率提高2-19％并且在经过多年的下茎部中提高20-28％(与汇集的无效对照相比)。与汇集的无效对照相比，整株植物KK179木质素水平(ADL)降低大约10-12％，并且在经过多年的下茎部中降低18-22％(与汇集的无效对照相比)。与汇集的无效对照相比没有检测到KK179的产量有显著降低。
实施例12
苜蓿管理实践
种植(苜蓿管理指南，2011)：在北方地区春季相对于晚夏播种是种植苜蓿的优选季节并且可增加杆(stand)形成的机会。一旦春天晚霜的潜在危害过去就可以开始苜蓿的春播。对于晚夏播种，为了提升冬季期间的存活率苜蓿萌芽之后至少生长6周。这允许植物的冠积蓄为了越冬和春天再次生长的根储备。
影响品质的因素(Orloff和Marble，1997)：苜蓿管理包括切割和收获实践，它们是栽培者能够影响苜蓿干草营养品质的主要方法，这对饲料产量和杆寿命有重要影响。从营养的角度讲，苜蓿的高营养饲料品质取决于家畜来源种类，因为它涉及干草的饲用价值。饲料品质是饲料摄入和消化率两者的正函数。随着饲料品质提高，饲料摄入和消化率增加。苜蓿管理实践影响苜蓿干草品质。在切割时的成熟阶段是苜蓿管理中的最重要的因素之一。产量随着成熟的推进而提高。相比于产量，饲料品质随着苜蓿植物成熟度的推进而下降，因此收获管理是产量最大化和品质最大化之间的平衡。饲料品质也受苜蓿品种选择、干草制造实践和环境输入(如光、水分、温度和光周期或日长中的季节变化)的影响。
收获管理(Orloff和Marble，1997)：决定何时切割以及如何切割苜蓿是产量、品质和杆持久性的主要因素。作为多年生植物，苜蓿在它的冠和根中储存一些碳水化合物。切割之后，这个过程需要2至3周，或直到苜蓿植物达到6至8英寸的高度。植物从这个点开始补充根储备。根和冠中储备的碳水化合物随植物成熟度的增加而增加直到完全开花。当苜蓿到达完全开花时栽培者可以获得最大产量，然而有时在约50％开花时获得最高产量。第一和第二次切割或第二和第三次切割之间的间隔一般来讲在30至50天之间。时间取决于天气条件和苜蓿品种。太频繁的切割导致活力降低并且常常导致杂草丛生。另一个计划苜蓿收获的方法使用苜蓿的生长阶段来指示切割的适当时间以及每个季节切割的次数。也可以在特定的生长阶段(如花蕾期、花蕾晚期、10％开花等)收获苜蓿。这种方法考虑了环境和品种间差异的影响，这样会获得一致、可预测的饲料产量和品质。
切割(苜蓿管理指南，2011)：最大产量可以在3-英寸切割高度获得，建议以二至三周的时间作为再生长期或直到苜蓿达到6至8英寸的高度。植物从这个点开始补充它的冠和根中储存的碳水化合物储备。当前的与苜蓿切割高度有关的建议是为了使产量最大化而保持高品质的饲料和杆寿命。饲料栽培者频繁地在3-英寸或更高的高度切割饲料。然而，当在1-英寸高度切割与在3英寸或更高切割比较时，每季收获三或四次苜蓿饲料产生更多的总饲料量(Kust和Smith，1961，Smith和Nelson，1967)。当苜蓿植物没有压力或者根碳水化合物水平含量低时，这些实践导致饲料产量有利于在较短高度时切割(Sheaffer等，1988)。
第一次切割
第一次切割秋天种植或先前形成的苜蓿植物杆的时间通常定在与形成花蕾的大多数植物一致或者新的冠芽生长不多于1至2英寸。因为开花受日长控制，所以第一次生长往往在花形成之前就可收获，通常出现在4月后期或5月初期。第一次生长倾向于很快并且高度增加，这样倒伏的倾向就增加，因此建议在倒伏出现之前收获。春天的苜蓿生长主要来自冠花蕾并且依赖于温度和可用的根部能量储备。第一次收获之后的芽生长来源于冠和腋生花蕾两者。当苜蓿被切割得非常短(1-英寸或更短)时，大部分腋生花蕾被除去，新芽必须来自冠花蕾(Wiederholt和Schneider，2007)。春天种植的秧苗杆应该在至少50％的茎形成花或倒伏明显时才能收获。延迟收获将使秧苗根进一步发育。
第二次和随后的切割
当10％至25％的茎有花时进行第二次和后续的切割。苜蓿从生长的花蕾阶段到25％开花阶段大约需要5至10天。一般来讲每28至35天苜蓿的再生长期将到达有利切割的阶段。在炎热、干燥的天气期间，植物可能在再生长期30天之前并且在植物到达10英寸的高度之前开出繁茂的花。在这些情况下，当距上次收获切割已经35至40天时，最好放牧或者切割短的生长。一旦植物大面积开花，那些特定的茎不会再生长并且它们的持续存在往往妨碍新的生长，即使出现有利的条件也是这样。
秋天切割管理
对于秋天切割管理来说，植物需要四至六周的再生长来制造第一次霜冻(24℉)之前的碳水化合物；推荐生长10至14英寸。几次下霜之后但在叶子开始枯萎并且落下之前，应该收获长成的植物以保持饲料的品质并且减少残余物，这有助于害虫防治。
农业实践和样品采集：用于这个点的最佳农业实践包括肥度管理、杂草控制、昆虫控制和水分。为了避免初期移植体上的可变数据，切断田地中的移植体上的第一次长成物并且不采集数据。其余数据采集的目标成熟度是10％开花。这种成熟度水平允许茎的木质化有助于分选事件。使用手剪收集植物组织以避免任何样品的损失并且保持切割高度一致。所有收获一致切割高度是高出地面2.5”。这是商业化饲料收获的典型高度。管理所有地点以实现最佳生长和越冬。根据需要进行昆虫和杂草控制以消除试验区内的不定性。行内的植物间隔是在行之间有15”与30”。
参考文献
Kust,C.A.和D.Smith.1961.Influence of harvest management on levels ofcarbohydrate reserves,longevity of stands and yield so hay and protein fromVernal alfalfa.Crop Sci.1:267-269。
Orloff,S.B.和Marble,V.L Intermountain Alfalfa Management Steve B.Orloff,Editor Cooperative Extension Siskiyou County,CA,University of California版权日期＝1997
Sheaffer,C.C.,G.D.Lacefield和V.L.Marble.1988.Cutting schedules andstands.411-437页。A.A.Hanson等(编著)Alfalfa and alfalfa improvement.Agron.Monogr.29.ASA,CSSA,SSSA,Madison,WI。
Smith,D.和C.J.Nelson.1967.Growth of birdsfoot trefoil and alfalfa.I.Responses to height and frequency of cutting.Crop Sci.7:130-133。
University of Wisconsin Forage and Research Extension–AlfalfaManagement Guide
University of Wisconsin Cooperative Extension,Minnesota Extension Center,University of Minnesota,Iowa State University,Alfalfa Management Guide,American Society of Agronomy,Crop Science Society of America,Soil ScienceSociety of America,版权2011。
Wiederholdt,R.和Schneider N.2007.The long and short of Alfalfa cuttingheight,Marshfield Agriculture Research Station(MARS)Agriculture ResearchStation(MARS)

Claims (15)

1.一种从苜蓿植物种群中选择具有较高饲用价值成分的苜蓿植物的方法，其中所述苜蓿植物种群包含重组DNA分子并且其中一部分所述重组DNA分子与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2同源或互补，所述方法包括：
(a)测量所述苜蓿植物种群中的每种所述苜蓿植物的下茎部组织中的酸性洗涤木质素(ADL)浓度，其中与不包含所述DNA分子的苜蓿植物的下茎部组织相比，所述ADL浓度的降低介于12％和约31％之间；
(b)测量所述下茎部组织中的愈创木基木质素(G木质素)浓度，其中与不包含所述DNA分子的苜蓿植物的下茎部组织相比，所述下茎部组织中的所述G木质素降低约25％或更高；
(c)测量所述下茎部组织中的中性洗涤纤维消化率(NDFD)成分，其中与不包含所述DNA分子的苜蓿植物的下茎部组织相比，所述下茎部组织中的所述NDFD值升高18％以上；
(d)选择包含步骤(a)-(c)的所述较高饲用价值成分的苜蓿植物；以及
(e)种植步骤(d)中选择的所述苜蓿植物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述重组DNA分子包含能够转录植物维管组织中的可操作连接的DNA分子的启动子分子，并且其中一部分所述可操作连接的DNA分子与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2同源或互补。
3.如权利要求1所述的方法，其进一步包括测量所述生长苜蓿植物的活力的步骤，其中与不包含所述重组DNA分子的苜蓿植物相比，所述活力是90％或更高。
4.如权利要求1所述的方法，其中干草或半干青贮料是通过种植所述苜蓿植物生产的。
5.如权利要求4所述的方法，其中测量所述干草或半干青贮料的较高饲用价值成分包括：
(a)测量所述干草或半干青贮料样品的ADL浓度，其中与不包含所述重组DNA分子的苜蓿干草相比，所述ADL浓度介于80％和92％之间；以及
(b)测量所述干草或半干青贮料样品中的所述中性洗涤纤维消化率(NDFD)成分，其中与不包含所述重组DNA分子的苜蓿干草相比，所述NDFD值介于107％和125％之间。
6.如权利要求1所述的方法，其进一步包括种植所述苜蓿植物到成熟并且从所述植物采集子代苜蓿种子。
7.一种通过权利要求6所述的方法产生的苜蓿种子，其中所述种子包含重组DNA分子并且其中一部分所述重组DNA分子与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2同源或互补。
8.一种由权利要求7所述的种子长成的苜蓿植物，其中与不包含所述重组DNA分子的苜蓿植物的下茎部组织和干草相比，所述植物下茎部组织中的ADL浓度的降低介于12％和31％之间，并且由所述植物生产的干草中的ADL浓度的降低介于80％和92％之间。
9.一种由权利要求7所述的种子长成的苜蓿植物，其中与不包含所述重组DNA分子的苜蓿植物的下茎部组织或干草相比，所述植物的下茎部组织中的G木质素浓度降低约25％或更高。
10.一种由权利要求7所述的种子长成的苜蓿植物，其中与不包含所述重组DNA分子的苜蓿植物的下茎部组织相比，所述植物下茎部组织中的NDFD值为122％或更高。
11.一种由权利要求7所述的种子长成的苜蓿植物，其中与不包含所述重组DNA分子的苜蓿植物的干草相比，所述植物的从所述植物生产的干草中的NDFD值介于约107％和约125％之间或更高。
12.一种具有较高饲用价值成分的苜蓿干草，所述干草包含重组DNA分子，其中一部分所述重组DNA分子与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2同源或互补，其中所述苜蓿干草进一步包含：
(a)介于约80％和约92％之间的不包含所述重组DNA分子的苜蓿干草的ADL浓度的ADL浓度，
(b)与不包含所述重组DNA分子的苜蓿干草相比降低约25％或更高的G木质素浓度；以及
(c)与不包含所述重组DNA分子的苜蓿干草相比介于107％和125％之间的NDFD值。
13.一种包含较高饲用价值成分的加工苜蓿产品，所述产品包含重组DNA分子，其中一部分所述DNA分子与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2同源或互补，其中所述加工苜蓿产品进一步包含：
(a)介于约80％和约92％之间的不包含所述重组DNA分子的苜蓿产品的ADL浓度的ADL浓度，
(b)与不包含所述重组DNA分子的苜蓿产品相比降低约25％或更高的G木质素浓度；以及
(c)与不包含所述重组DNA分子的苜蓿产品相比介于107％和125％之间的NDFD值。
14.如权利要求4所述的方法，其中测量所述半干青贮料的所述较高饲用价值成分包括测量所述干草样品的ADL浓度，其中所述下茎部中的所述ADL浓度与商品苜蓿相比降低介于15％和30％之间并且所述植物中的降低介于8％和15％之间。
15.如权利要求1所述的方法，其中选择一种或多种转基因事件来产生较高的饲料品质和优良的农业表现。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9854778B2 (en) 2011-06-30 2018-01-02 Monsanto Technology Llc Alfalfa plant and seed corresponding to transgenic event KK 179-2 and methods for detection thereof
CA2840630C (en) 2011-06-30 2021-11-30 Monsanto Technology Llc Alfalfa plant and seed corresponding to transgenic event kk 179-2 and methods for detection thereof
NZ629197A (en) * 2012-06-26 2016-07-29 Forage Genetics Internat Llc Methods and composition for enhanced forage quality
AU2015323919B2 (en) 2014-09-29 2019-01-31 Dlf Usa Inc. Low lignin non-transgenic alfalfa varieties and methods for producing the same
KR102198787B1 (ko) * 2019-09-05 2021-01-05 한국과학기술연구원 변이된 comt 유전자를 포함하는 사료용 작물 및 이의 용도

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001073090A2 (en) * 2000-03-24 2001-10-04 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Method for modifying lignin composition and increasing in vivo digestibility of forages
US20070079398A1 (en) * 2004-07-24 2007-04-05 Samuel Roberts Noble Foundation Modification of lignin biosynthesis

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE87032T1 (de) 1986-12-05 1993-04-15 Ciba Geigy Ag Verbessertes verfahren zur transformation von pflanzlichen protoplasten.
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
GB8829298D0 (en) 1988-12-15 1989-01-25 Ici Plc Improved fodder crops
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
WO1991010725A1 (en) 1990-01-22 1991-07-25 Dekalb Plant Genetics Fertile transgenic corn plants
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5187092A (en) 1990-03-22 1993-02-16 Institute Of Paper Science And Technology, Inc. Somatic embryogenesis in gymnosperms
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
WO1994000977A1 (en) 1992-07-07 1994-01-20 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
JP2952041B2 (ja) 1992-07-27 1999-09-20 パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル，インコーポレイテッド 培養ダイズ細胞のａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の改良法
US5635055A (en) 1994-07-19 1997-06-03 Exxon Research & Engineering Company Membrane process for increasing conversion of catalytic cracking or thermal cracking units (law011)
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
US6455762B1 (en) 1997-11-12 2002-09-24 Board Of Control Of Michigan Technological University Methods of modifying lignin in plants by transformation with a 4-coumarate coenzyme a ligase nucleic acid
JP2002534129A (ja) 1999-01-14 2002-10-15 モンサント テクノロジー エルエルシー ダイズ形質転換方法
US20040049802A1 (en) 2001-03-23 2004-03-11 Dixon Richard A. Method for modifying lignin composition and increasing in vivo digestibility of forages
AUPQ815400A0 (en) 2000-06-14 2000-07-06 Dairy Research And Development Corporation Modification of lignin biosynthesis
EP1587931B1 (en) 2003-01-31 2012-04-11 Monsanto Technology LLC Glyphosate tolerant alfalfa events and methods for detection thereof
WO2005068625A1 (en) 2004-01-05 2005-07-28 The Regents Of The University Of California Plants transformed for elevated levels of gallic acid and methods of producing said plants
US7855323B2 (en) 2004-02-10 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Recombinant DNA for gene suppression
US20090199308A1 (en) 2005-08-30 2009-08-06 Kimberly Zobrist Duff Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US7652195B2 (en) 2005-10-04 2010-01-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alfalfa variety 53V52
US20110229625A1 (en) 2010-02-17 2011-09-22 William Ralph Hiatt Transgenic Forage Crops with Enhanced Nutrition
UY33992A (es) * 2011-04-21 2012-09-28 Basf Plant Science Co Gmbh Métodos para modificar la biosintesis de la lignina y mejorar la digestibilidad
US9854778B2 (en) 2011-06-30 2018-01-02 Monsanto Technology Llc Alfalfa plant and seed corresponding to transgenic event KK 179-2 and methods for detection thereof
CA2840630C (en) 2011-06-30 2021-11-30 Monsanto Technology Llc Alfalfa plant and seed corresponding to transgenic event kk 179-2 and methods for detection thereof
NZ629197A (en) * 2012-06-26 2016-07-29 Forage Genetics Internat Llc Methods and composition for enhanced forage quality

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001073090A2 (en) * 2000-03-24 2001-10-04 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Method for modifying lignin composition and increasing in vivo digestibility of forages
US20070079398A1 (en) * 2004-07-24 2007-04-05 Samuel Roberts Noble Foundation Modification of lignin biosynthesis

Also Published As

Publication number Publication date
US9771597B2 (en) 2017-09-26
WO2014004683A3 (en) 2014-04-24
AR091572A1 (es) 2015-02-11
ZA201408419B (en) 2015-12-23
MX2014015422A (es) 2015-04-09
AR124881A2 (es) 2023-05-17
PL2864486T3 (pl) 2019-05-31
MX362498B (es) 2019-01-21
AU2013280398A1 (en) 2014-12-04
EP2864486B1 (en) 2018-09-26
NZ629197A (en) 2016-07-29
CA2877873C (en) 2020-11-24
EP2864486A4 (en) 2016-03-02
BR122019026534B1 (pt) 2022-07-19
JP2018108079A (ja) 2018-07-12
AU2013280398B2 (en) 2018-07-12
US10704053B2 (en) 2020-07-07
US20180080038A1 (en) 2018-03-22
WO2014004683A2 (en) 2014-01-03
CA2877873A1 (en) 2014-01-03
US20150135370A1 (en) 2015-05-14
JP2015527878A (ja) 2015-09-24
EP2864486A2 (en) 2015-04-29
BR112014032343A2 (pt) 2017-08-01

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Application publication date: 20150506

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