CN116589547A - 紫云英chi基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供紫云英CHI基因及其应用。紫云英CHI基因及其编码蛋白的序列见SEQ ID NO:1和2。本发明首次从紫云英中克隆得到紫云英CHI基因，并通过农杆菌介导的遗传转化方法，在拟南芥中验证了紫云英CHI基因具有调控植物花青素含量功能，具体为提高植物花青素含量。转紫云英CHI基因的拟南芥株系总花青素含量比野生型平均高31.91μg/g。实验结果表明，紫云英CHI基因与花青素合成关系密切，其具有调节花青素含量的功能。将该基因应用于植物性状改良，具有良好的应用前景。本发明提供的紫云英CHI基因及其编码蛋白为培育植物新品种提供了宝贵资源。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和植物遗传育种领域，具体地说，涉及紫云英CHI基因及其应用。
背景技术
紫云英(Astragalus sinicus L.)是豆科，黄耆属越年生草本植物，主要分布于中国长江流域，是重要的绿肥作物，对土壤资源的可持续利用，具有重要意义。此外，紫云英在我国民间有悠久的食用历史，植株硒、蛋白质含量丰富，含有多种矿物质和维生素，有毒有害物质含量均符合国家标准，食用安全且营养价值高于绿豆芽、空心菜等蔬菜。紫云英中的花青素被认为是最富保健潜力的天然活性物质之一，能够清除人体内的自由基，延缓机体衰老，预防癌症、心血管疾病和老年痴呆症，增强机体免疫力，提升视力，降低肝脏和血清中脂肪的含量。开发紫云英中花青素的健康保健食用潜力，可以为实现紫云英多功能利用，提高经济效益提供新思路，对促进紫云英产业可持续发展具有重要意义。
研究紫云英花青素生物合成代谢途径，挖掘高效促进花青素合成的关键基因，并进行功能评价和调控模式分析，为花青素的合成及调控提供分子证据，对于探寻影响花青素品质形成的关键遗传信息具有重要科学意义和研究价值，对促进紫云英产业可持续发展具有重要意义。但目前还没有对于紫云英花青素合成机制的研究。
发明内容
本发明的目的是提供紫云英CHI基因及其应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供紫云英CHI基因，CHI基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
本发明利用RACE技术获得CHI基因的全长cDNA序列大小为972bp(SEQ ID NO:1)，含有一个660bp的开放阅读框，5’和3’非编码区的长度分别为131bp和181bp。
第二方面，本发明提供含有所述紫云英CHI基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。
第三方面，本发明提供所述紫云英CHI基因或含有该基因的生物材料在调控植物花青素含量中的应用。
所述调控是指提高植物花青素含量。
前述应用包括：
1)使植物包含紫云英CHI基因；或者，
2)使植物过表达紫云英CHI基因。
所述应用包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
可选地，过表达紫云英CHI基因的方法选自以下1)～5)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述CHI基因的质粒；
2)通过增加植物染色体上所述CHI基因的拷贝数；
3)通过改变植物染色体上所述CHI基因的启动子序列；
4)通过将强启动子与所述CHI基因可操作地连接；
5)通过导入增强子。
本发明中，所述植物包括但不限于拟南芥、紫云英。
进一步地，所述应用包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导等方法将包含紫云英CHI基因的重组表达载体导入植物，获得转基因植株。
第四方面，本发明提供所述紫云英CHI基因或含有该基因的生物材料在植物育种中的应用。育种目的为提高植物花青素含量。
第五方面，本发明提供所述紫云英CHI基因或含有该基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。
本发明中，所述花青素包括但不限于飞燕草素、芍药素、矢车菊素、天竺葵素、矮牵牛素、锦葵色素。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明首次从紫云英中克隆得到紫云英CHI基因，并通过农杆菌介导的遗传转化方法，在拟南芥中验证了紫云英CHI基因具有调控植物花青素含量功能，具体为提高植物花青素含量。转紫云英CHI基因的拟南芥株系总花青素含量比野生型平均高31.91μg/g。实验结果表明，紫云英CHI基因与花青素合成关系密切，其具有调节花青素含量的功能。将该基因应用于植物性状改良，具有良好的应用前景。本发明提供的紫云英CHI基因及其编码蛋白为培育植物新品种提供了宝贵资源。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中紫云英CHI基因5’-RACE PCR电泳结果分析。其中，M:DL2000 Marker：100，250，500，750，1000，2000bp；1：CHI 5-RACE PCR电泳结果(约220bp)。
图2为本发明较佳实施例中紫云英CHI基因3’-RACE PCR电泳结果分析。其中，M:DL2000 Marker：100，250，500，750，1000，2000bp；1：CHI 3-RACE PCR电泳结果(约217bp)。
图3为本发明较佳实施例中紫云英CHI基因编码蛋白的氨基酸序列与其它9个物种的序列同源性比对结果。
图4为本发明较佳实施例中CHI蛋白质二级结构预测及功能位点注释。
图5为本发明较佳实施例中利用MEGA5.2构建的CHI基因氨基酸序列的NJ系统进化树(数字为置信度)。
图6为本发明较佳实施例中预测的CHI蛋白的三维结构图。紫云英CHI的三维结构图。
图7为本发明较佳实施例中CHI基因Q-PCR表达量分析。其中，R:根，S:茎，L:叶，FB:花芽，F：花。
图8为本发明较佳实施例中不同组织紫云英花青素含量分析。
图9为本发明较佳实施例中超表达CHI基因拟南芥植株的PCR阳性检测结果。
图10为本发明较佳实施例中转基因(紫云英CHI基因)拟南芥的花青素含量分析结果。其中，WT为野生型，CHI为转基因植株。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中涉及的主要试剂及生产公司表1。
表1主要试剂及生产公司
实施例1紫云英CHI基因的克隆及序列分析
本发明利用RACE技术从紫云英中获得CHI基因的全长cDNA序列大小为972bp(SEQID NO:1)，含有一个660bp的开放阅读框，5’和3’非编码区的长度分别为131bp和181bp。其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。具体方法如下：
1、试验材料：新鲜紫云英组织样本。
2、RNA提取：紫云英总RNA提取采用Plus RNA Purification Kit进行，具体提取过程参照试剂盒说明书。
3、5’-RACE-PCR实验
5’-RACE模板采用GeneRacerTM Kit进行合成。
(1)引物设计及序列
采用Primer Premier 5.0软件设计三条特异性5’RACE引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。引物序列见表2。
表2 5’-RACE引物序列
(2)目的基因第一链cDNA的合成
使用SUPERSCRIPT II RT酶和引物GSP-1对总RNA进行目的基因第一链cDNA的合成，使用RNase Mix对合成的cDNA进行去RNA处理。
(3)使用DNA Purification System:GLASSMAX DNA isolation spin cartridges对经RNAase处理过的cDNA进行纯化。
(4)使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA进行末端加上多聚C。
(5)使用引物GSP-2和试剂盒里面带的桥连铆钉引物AAP对已经加dC尾的cDNA进行PCR第一轮扩增。
5’-RACE PCR反应体系及条件见表3～表6。
表3 5’-RACE PCR第一轮反应体系
表4 5’-RACE PCR第一轮反应条件
| 预变性 | 94℃,2min |
| 5个循环 | 94℃30sec 72℃30sec |
| 5个循环 | 94℃30sec 70℃30sec |
| 25个循环 | 94℃30sec 66℃30sec |
(6)使用引物GSP-3和试剂盒中的桥连通用扩增引物AUAP进行巢式PCR第二轮扩增。
(7)目的片段的回收纯化
将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，步骤按回收试剂盒说明书进行。
(8)目的片段的克隆及测序。
纯化后的PCR产物与pMD18T进行连接，转化后对阳性克隆进行测序。
表5 5’-RACE PCR第二轮反应体系
表6 5’-RACE PCR第二轮反应条件
| 预变性 | 94℃,2min |
| 30个循环 | 94℃30sec 66℃30sec |
5’-RACE PCR电泳结果(图1)：
PCR结束后，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果显示5’-RACE PCR呈现出一条特异性条带，大小约577bp左右，切胶回收后，连接pGM-T载体，转化高效化学感受态细胞DH5α，送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
4、3’-RACE-PCR实验
(1)引物的设计及序列
利用转录组测序验证结果，采用Primer Premier 5.0软件设计两条特异性3’-RACE引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。引物序列见表7。
表7 3’-RACE引物名称及序列
(2)使用逆转录酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase和引物3’CDS primer A对总RNA进行逆转录合成cDNA。
(3)使用引物3’896-1和UPM(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′(long)；5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3‘(short))，以前述合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。
(4)将第一轮PCR扩增产物稀释50倍，然后用引物3’896-2和UPM进行第二轮PCR扩增。
3’-RACE PCR反应体系及条件见表8～表11。
表8 3’-RACE PCR第一轮反应体系
表9 3’-RACE PCR第一轮反应条件
| 预变性 | 94℃,2min |
| 5个循环 | 94℃30sec 72℃30sec |
| 5个循环 | 94℃30sec 70℃30sec |
| 25个循环 | 94℃30sec 66℃30sec |
表10 3’-RACE PCR第二轮反应体系
表11 3’-RACE PCR第二轮反应条件
| 预变性 | 94℃,2min |
| 30个循环 | 94℃30sec 66℃30sec |
3’-RACE PCR电泳结果(图2)：
PCR结束后，采用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果显示3’-RACE PCR呈现出一条特异性条带，大小约403bp左右，切胶回收后，连接pGM-T载体，转化高效化学感受态细胞DH5α，送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
5、根据转录组序列验证，5’-RACE和3’-RACE结果，拼接出实验目的基因的全长cDNA序列。
紫云英CHI基因的生物信息分析：
紫云英CHI基因编码蛋白的氨基酸序列与其它9个物种Astragalus membranaceus(ATY39974.1),Astragalus mongholicus(ABA55017.2),Glycine max(Q53B70.1),Pueraria montana var.lobata(ADV71377.1),Pisum sativum(XP_050892596.1),Vignaunguiculata(QCE05742.1),Medicago sativa(AAB41524.1))序列同源性比对结果见图3。
使用ProtParam进行蛋白质氨基酸含量和理化性质分析。Chalcone isomerase基因编码的蛋白质含有219个氨基酸，其分子量为24140.52道尔顿，理论等电点为5.17，其化学组分如表12所示。该蛋白含有31个带负电荷的氨基酸残基和25个带正电荷的氨基酸残基，它的N端以蛋氨酸起始。该蛋白共含有3416个原子，其中碳原子1087个，氢原子1715个，氮原子275个，氧原子334个，硫原子5个，其脂肪族指数为85.02，疏水性指数为-0.126，不稳定性指数为35.84。综合以上数据，该蛋白被归类为稳定性蛋白。CHI蛋白质二级结构预测及功能位点注释见图4。
表12CHI基因编码蛋白的化学组分
应用BLASTP程序对紫云英的CHI蛋白与其他9个物种同源蛋白进行了比较分析，结果显示物种之间有一定的相似性。其中，紫云英与Astragalus membranaceus的CHI蛋白的相似度达到82.65％，与Astragalus mongholicus CHI蛋白的相似度分别达到了82.19，这一结果表明紫云英CHI蛋白与这三个物种有一定的同源性。用CHI蛋白构建的进化树显示紫云英与Astragalus membranaceus和Astragalus mongholicus聚为一类(图5)。
紫云英CHI蛋白与其他物种CHI蛋白的比较分析结果见表13。包括氨基酸数量，相似度，E值，等电点和分子量等指标。
表13紫云英CHI蛋白与其他物种CHI蛋白的比较分析
利用MEGA软件构建CHI基因氨基酸序列的NJ系统进化树，bootstrep设置为1000，采用Jones-Thorton-Taylor模型构建NJ树。建树所涉及到的基因的序列号为：Astragalusmembranaceus(ATY39974.1),Astragalus mongholicus(ABA55017.2),Glycine max(Q53B70.1),Pueraria montana var.lobata(ADV71377.1),Pisum sativum(XP_050892596.1),Vigna unguiculata(QCE05742.1),Medicago sativa(AAB41524.1)。
预测的CHI蛋白的三维结构见图6。
实施例2CHI基因在紫云英各组织中的相对表达水平
1、总RNA提取
紫云英均为温室种植的植物材料，是用普通紫云英植株材料采集种子培养而成的新鲜紫云英组织样本。
2、荧光定量PCR引物设计和合成
采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8软件进行定量PCR引物设计，然后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所用内参基因为Tubulin，引物序列如下(5′-3′)：
Tubulin F：5CACCGAGGGAGCAGAGTTGAT
Tubulin R：CTGAAACCCTTGAAGGCAGTCA
3、Real-Time PCR(Q-PCR)基因表达差异统计分析
每个样品重复三次，各个基因的相对表达水平以2(Ct内参基因－Ct目的基因)进行统计分析。CHI基因Q-PCR表达量分析结果见图7。紫云英CHI基因在不同组织中表达差异显著，在叶片中表达量显著高于根、茎、花芽和花。
为探明紫云英CHI基因表达与花青素含积累的关系，分析了紫云英R：根，S：茎，L：叶，FB：花芽，F：花中6种花青素(飞燕草素、芍药素、矢车菊素、天竺葵素、矮牵牛素、锦葵色素)的含量，结果见图8。6种花青素在叶中表达量均显著高于根、茎、花芽、花。6种花青素在紫云英不同组织间的积累模式与CHI基因的表达量高度相关。表明CHI基因的表达与花青素合成密切相关。
实施例3转基因拟南芥的培养及其表型分析
1、含紫云英CHI基因(SEQ ID NO:1)的重组质粒的构建。
2、转化农杆菌感受态细胞
将测序正确的重组质粒转化农杆菌感受态细胞。菌落PCR鉴定表明载体质粒已成功转入到农杆菌中。
3、拟南芥转化流程(花序浸染法)
(1)种植：选择吸水性好，土质松软的蛭石配合营养土(体积比1:0.5)作为拟南芥种植土壤。直径9cm的花盆，每盆播种100-150颗。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。
(2)移栽：播种10-15天，待拟南芥幼苗长至四叶时期开始移栽，每盆4-5棵。
(3)去顶：拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。
(4)配制浸染液：在5％蔗糖溶液中重悬转化后的农杆菌使OD600＝0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌。100-200ml浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染，2-3个花盆(9cm)植株。在浸染之前加入表面活性剂至浓度0.05％(500ul/L)。
(5)浸染：将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在转化后的农杆菌悬浮液中20-30s，同时轻轻旋转。
(6)暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h。
(7)浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可。
(8)种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。
(9)转基因种子筛选：在含有潮霉素抗生素的平板上培养浸染后所得种子。40mg的种子大约200颗于含潮霉素10-50μg/ml的1/2MS培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。根据生长状况判断是否为转基因种子。成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天后死亡。
(10)转基因植株转土栽培。转基因种子在含潮霉素(3μg/ml)的MS平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。
(11)PCR鉴定：取阳性植株叶片进行基因组DNA的提取并使用目的基因序列和载体35S启动子序列引物进行PCR验证，超表达CHI基因拟南芥植株的PCR阳性检测结果见图9。从左至右依次是目的基因引物检测，使用的引物序列如下(5′-3′)：
CHI-F：GGGAACACACAGTGAAGCTGAA
CHI-R：GCTCAGATAAGCGAGTAGCCAAA
检测转基因阳性植株。
植物筛选标记潮霉素基因检测，使用的引物序列如下(5′-3′)：
HPT-F：GGTCGCGGAGGCTATGGATGC
HPT-R：GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT
将CHI基因转化到农杆菌pCAMBIA1302，利用花序法侵染拟南芥。将待检测的拟南芥种子在抗性培养基上种植，转化成功的植株能够正常生长，而未转化成功的植株是黄色死亡植株CHI基因未转化成功。将初筛得到的幼苗移栽到培养钵中继续培养，当生长至10～12片时，剪取叶片进行基因组DNA的提取，并使用目的片段扩增引物及载体35S启动子序列引物进行PCR检测，电泳结果出现目的条带，表明CHI基因已经整合到拟南芥基因组中。
4、转基因拟南芥花青素含量分析
播种转基因拟南芥T2代，分析转基因株系的花青素含量。图10结果表明，所检测的6种花青素，在转基因株系中含量均显著高于野生型。这表明CHI基因的超表达对拟南芥的6种花青素积累均有影响。CHI基因的表达可以提高植物花青素含量(表14)。
表14转基因株系及野生型的花青素含量
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.紫云英CHI基因，其特征在于，CHI基因为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
2.含有权利要求1所述CHI基因的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
3.权利要求1所述CHI基因或含有该基因的生物材料在调控植物花青素含量中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调控是指提高植物花青素含量。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
1)使植物包含CHI基因；或者，
2)使植物过表达CHI基因。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，过表达CHI基因的方法选自以下1)～5)，或任选的组合：
1)通过导入具有所述CHI基因的质粒；
2)通过增加植物染色体上所述CHI基因的拷贝数；
3)通过改变植物染色体上所述CHI基因的启动子序列；
4)通过将强启动子与所述CHI基因可操作地连接；
5)通过导入增强子。
8.根据权利要求3-7任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥、紫云英。
9.权利要求1所述CHI基因或含有该基因的生物材料在植物育种中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，育种目的为提高植物花青素含量。
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