CN1609215A - 编码海岛棉防卫反应基因的核苷酸序列、含有该序列的植物表达载体及植物细胞 - Google Patents

Abstract

本发明分离获得了海岛棉防卫反应调控基因GbRar1、GbSgt1和GbRac1，分别构建了三个组成型表达的植物表达载体，通过根瘤农杆菌法转化烟草，在烟草中过量表达这三种防卫调控基因，使转基因烟草对烟草赤星病抗病能力显著提高。这三种植物防卫反应基因及技术路线显然同样可用于其它作物的抗病基因工程育种，因而具有重要的实践意义和巨大的市场经济价值。

Description

编码海岛棉防卫反应基因的核苷酸序列、含有该序列的 植物表达载体及植物细胞

技术领域

本发明涉及编码海岛棉基因的核苷酸序列，含有该核苷酸序列的构建体，含有所述的构建体的重组表达载体及含有所述的构建体或重组表达载体的植物细胞。本发明特别涉及编码海岛棉GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因的核苷酸序列及其在培育抗病转基因植物中的应用，包括含有编码海岛棉GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因的核苷酸序列的构建体，含有所述的构建体的重组表达载体，由表达载体转化的植物细胞，以及由转化细胞产生的对病原菌表现高抗性的转基因植物及其后代，包括植物种子、整体植物或植物体的部分或组织器官。

背景技术

植物受病原物侵染后，若植物抗病蛋白(R)能识别病原物无毒因子(avr)，就会激发活性氧暴发，产生活性氧中间物(reactive oxygenintermediates，ROI)及超敏反应(hypersensitive response，HR)。HR导致侵染部位周围细胞迅速死亡，诱导植物产生系统获得性抗性(systemicacquired resistance，SAR)，从而提高未侵染部位的广谱抗病能力(McDowellJM，et al.Trends Biochem Sci.2000，25：79)。

根据结构特征，植物R蛋白可分为5大类，其中最大的一类是NB-LRRR蛋白，在靠近N端具有核苷酸结合位点(nucleotide-binding site，NBS)，C端有一个富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeat，LRR)。根据N端结构特点，NB-LRR R蛋白又可分为两类：TIR-NB-LRR(Toll andinterleukin-1 receptor，TIR)和CC-NB-LRR(Coiled-Coil domain，CC)(Dangl JL，et al.Nature.2001，411：826)。

有关植物R蛋白的研究已取得了重大进展，而迄今对植物R防卫反应信号的传导机制还知之甚少。利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)突变体鉴定植物防卫反应途径信号元件是阐明信号传导机制的一个重要途径，作为一个新兴的研究领域，已取得了一些引人瞩目的成就。RAR1(required forMla-specified resistance)、SGT1(suppressor of the G₂ allele of skp1)、Rac1是已鉴定的几个R下游参与植物防卫反应的信号元件。RAR1、SGT1、Rac1分别作用于不同类型的R蛋白下游与活性氧激发之间( Shirasu K，et al.Cell.1999，99：355；Tor M，et al.Plant Cell.2002，14：993；Ono E，et al.Proc NatlAcad Sci，USA.2001，98：759)，这些蛋白本身对病原物并无抑制作用，但作为信号元件参与不同植物防卫反应途径的调控。

Rar1编码大约30kD的锌结合蛋白，包含两个高度相似但截然不同的锌结合蛋白结构域(zinc-binding domains)，分别称为CHORD-I和-II(cysteine-and histidine-rich domain)( Shirasu K，et al.Cell.1999，99：355)。RAR1是首次发现的TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR R蛋白防卫信号途径的结合点(Liu Y，et al.Plant J.2002，30：415)。

Sgt1最早是在酵母中发现的一个与发育相关的重要基因，植物中与酵母同源的Set1基因编码一个40kD蛋白，有五个结构域：一个重复结构域(tetratricopeptide repeat domain，TPR)、两个可变区(VR1和VR2)、一个CS基元( CHORD和 SGT1)及一个SGS基元(SGT1-specific motif)。在植物R基因激发的信号途径中，SGT1可能通过泛肽途径指导某些蛋白降解，激发植物的防卫反应(Austin MJ，et al.Science.2002，295：2077；Azevedo C，etal.Science.2002，295：2073)。SGT1可同时介导NB-LRR及其他类型R蛋白的防卫反应，还与非寄主抗性有关(Peart JR，et al.Plant J.2002，29：569)。

RAR1与SGT1是两种相互作用的蛋白，参与作用的结构域是RAR1的CHORD-II与SGT1的CS基元(Schulze-Lefert P，et al.Trends PlantSci.2000，5：343)。大麦(Hordeum vulgare)Rar1和Sgt1共沉默增加了对白粉病(Erysiphe cichoracearum)的感病性(Azevedo C，et al.Science.2002，295：2073)，拟南芥sgt1/rar1双突变体高感霜霉病(Peronospra spp.)，超敏反应及活性氧积累下降(Parker JE，et al.Novartis Found Symp.2001，236：153)。由此推测RAR1与SGT1可能以三种形式(SGT1/RAR1、SGT1、RAR1)参与植物的防卫反应(Austin MJ，et al.Science.2002，295：2077；Muskett PR，et al.Plant Cell.2002，14：979)。

植物Rac是一类分子量约21～30kD的小GTP结合蛋白，目前统称为ROP(RHO-related GTPase from plants)，一般包括四个GTP结合基元、一个效应因子结合基元及一个参与异戊二烯化的基元，在植物体中充当多种特异信号途径的重要开关(Yang Z B.2002(supplement)：375)。其中，一些Rac蛋白参与调控H₂O₂/O₂ ^-产生(Yang Z B.Plant Cell，2002(supplement)：375；Kawasaki T，et al.Proc Natl Acad Sci，USA.1999，96：10922；Potikha TS，et al.Plant Physiol，1999，119：849；Park J，et al.Plant Physiol，2000，124：725)。H₂O₂/O₂ ^-是ROI，能够介导植物的超敏反应(HR)，导致细胞死亡。H₂O₂具有双重功能，一是直接杀死真菌(Peng & Kuc，Phytopathol.82：696-699，1992)，二是作为一种信号分子诱导植物的防卫反应(Leon et al.，Plant Physiol.108：1673-1678，1995；Chen et al.，Science 162：1883-1886，1993)。

研究表明，水稻(Oryza sativa)OsRac1是水稻防卫反应中的一个重要元件，其功能定位于R基因下游和ROI产生之间(Ono E，et al.Proc NatlAcad Sci，USA.2001，98：759)。组成型表达OsRac1的转基因水稻接种稻瘟病菌(pyricutaria oryzae)毒性小种，表现类HR反应，显著减少病斑数量和大小，同时对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)毒性小种也表现一定的抗性，进一步研究发现，转基因水稻中植保素产量增加，调控植物相关防卫基因的表达(Ono E，et al.Proc Natl Acad Sci，USA.2001，98：759)。OsRac1可能通过NADPH氧化酶调控ROI的产生和细胞死亡，细胞死亡的化学和形态特征类似于哺乳动物细胞的程序化死亡(programmed cell death，PCD)(Kawasaki T，et al.Proc Natl Acad Sci，USA.1999，96：10922)。在人噬菌细胞中，Rac调控NADPH氧化酶活性，产生过氧化物，从而有效地杀死侵入的微生物。细胞程序化死亡在多细胞生物的发育和防卫反应过程中发挥重要的作用(Pennell R，et al.Plant Cell，1997，9：1157；Morel J B，et al.Cell DeathDiffer，1997，4：671；Vaux DL，et al.Cell，1999，96：245)。另有报导，在大豆(Glycine hispida)悬浮细胞ROI暴发时，一种21kD Rac蛋白从胞浆大量转移到微粒体，推测可能参与调控NADPH氧化酶的活性；用高渗胁迫、harpin蛋白等不同因素处理含人Rac1基因的大豆悬浮细胞，发现与对照相比，ROI产量显著增加(Park J，et al.Plant Physiol，2000，124：725)。

细菌及真菌是危害农作物的主要病原菌。虽然目前对某些病害已找到有效的防治方法，但对大多数严重危害农作物的病害尚无切实有效的防治措施。培育抗病品种是防治植物病害的根本措施。但由于病原菌变异迅速，可供利用的抗原匮乏，常规育种的作用受到了很大限制。随着分子生物学、植物病理学及基因工程技术的迅猛发展，运用基因工程手段提高植物的抗病性为抗病育种开辟了一条崭新途径。

广谱抗病基因工程是一条令人振奋的途径，越来越多的研究小组已成功地将其应用到实践中(Keller H，et al.Plant Cell.1999，11：223)。广谱抗病基因工程的理论基础是HR和SAR，通过植物的超敏反应，导致侵染部位周围细胞死亡，诱导植物产生SAR，提高植物防卫反应的强度或加快防卫反应的速度，从而增强未侵染组织的广谱抗病能力，使植物表现抗病性。这一策略从理论上讲应该比导入单一的抗性基因(R)更有效。

发明内容

本发明的目的是开发研制调控植物防卫反应相关的基因元件：GbRar1、GbSgt1和GbRac1，为植物抗病基因工程的顺利开展提供新颖、实用的基因资源。

本发明涉及编码海岛棉GbRar1、GbSgt1和GbRac1基因的核苷酸序列，它们分别为如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的序列，或者是对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。

按照本发明所述的核苷酸序列，其中，其编码如SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：6所示的GbRar1、GbSgt1或GbRac1氨基酸序列，或对所述序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的氨基酸序列。

对本发明提供的核甘酸序列进行缺失、添加和/或取代一个或几个核甘酸，而产生的缺失、添加和/或取代一个或几个氨基酸残基的蛋白质，或对本发明提供的氨基酸序列进行缺失、添加和/或取代一个或几个氨基酸残基产生的蛋白质，定义为功能性衍生物，它们仍具有通过本领域内熟知技术可验证的功能。这种功能性衍生物可通过下列方法产生：利用本文公开的DNA序列、通过本领域熟知的方法或公开方法如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行的重组技术或通过本领域熟知的化学肽链合成路线。本领域都熟知组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met或Trp分别由ATG或TGG单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2～6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)，通过修改本发明提供的核酸序列，产生与本发明功能一致的氨基酸序列。本领域都熟知对蛋白质和多肽进行一般不影响分子活性的氨基酸替代，并已由多人描述如II.Neurach和R.L.Hill在“蛋白质”一书中的描述(学术出版社，纽约，1979，见第14页图6)，比较广泛的替代有：Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Ser/Thr，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly以及反向替代。

本发明还涉及适于在植物细胞中表达的、含有如上所述的核苷酸序列的植物表达载体。

按照本发明所述的植物表达载体，该载体包括：

a)5’端非编码区；

b)GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因的如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；

c)3’端非编码区。

按照本发明如上所述的植物表达载体，其中a)所述的5’端非编码区包括增强子序列、启动子序列和翻译增强序列；b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列单独或组合使用；c)所述的3’端非编码区包含终止子、mRNA切割序列。

按照本发明所述的植物表达载体，其中所述的启动子包括组成型、诱导型、组织或器官特异性，或发育阶段特异性启动子。

本发明进一步涉及含有如上所述的植物表达载体的植物细胞。

本发明还涉及根据本发明如上所述的核苷酸序列、如上所述的植物表达载体用于提高植物抗病能力的用途。

本发明还涉及获得对病原菌有抗性的转基因植物的方法，所述方法包括：

1)构建包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的GbRar1、GbSgt1或GbRac1基因的核苷酸序列的重组植物表达载体；

2)将上述步骤1)中得到的植物表达载体导入植物细胞内，由此获得对病原菌有抗性的转基因植物。

按照本发明所述的表达载体，其可进一步包括选择标记基因。

按照本发明所述的表达载体，所述选择标记基因是新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因。

按照本发明所述的表达载体，其中的载体部分来源于衍生自大肠杆菌的质粒载体pUC18(TaKaRa，产品目录号为#D3218)、pUC19(TaKaRa，产品目录号为#D3219)，植物表达载体pBI101(CLONTECH，产品目录号为#6017-1)、pBI121(CLONTECH，产品目录号为#6018-1)，pMD18-T-vector(TaKaRa公司，产品目录号为#D5o4A)和pCAMBIA2301(CAMBIA，Center for the Application of Molecular Biology to InternationalAgriculture，Canberra，Australia产品目录号为#2301)。

按照本发明所述的植物细胞，其中，所述植物为烟草(Nicotianatabacum)。

按照本发明所述的用途，其中，所述植物病为烟草赤星病(Alternariaalternata)和。

在本发明中，将包含GbRar1、GbSgt1或GbRac1基因的重组植物表达载体导入烟草，获得转基因植株。用离体叶片法鉴定转GbSgt1、GbRar1和GbRac1基因的烟草对烟草赤星病的抗性，结果显示，对照组叶片在接种2～3天时，在接种部位形成水渍状病斑，7天时，接种部位形成黑色病斑，在病斑处赘生白色菌丝，病斑周围出现退绿，病灶扩大，表明烟草赤星病孢子萌发后，已经成功侵染到叶片组织中。在供试的转GbSgt1、GbRar1和GbRac1烟草各15个单株中，分别有5株、7株、4株抗性水平显著提高，接种3天时，接种部位无明显变化，接种7天时，在接种部位制造的微伤处形成轻微的坏死，表现出明显过敏性坏死反应，病斑处无菌丝赘生，限制了病原菌的进一步侵染。本发明认为，GbSgt1、GbRar1和GbRac1三种基因能够强烈诱发植物的过敏反应，明显提高植物的抗病力，在植物抗病基因工程中具有广阔的应用应用前景。

附图说明

图1为pTΩ4A、pCRar、pCSgt、pCRac的构建流程图及图谱。其中对pTΩ4A构建做如下说明，用本领域所熟知的人工合成法合成了包括35S启动子、加倍的增强子、Ω序列及Kozak序列的DNA片段P5和包括多联终止序列、切割序列、NOS终止子的DNA片段T3。并在P5的5’端和3’端分别引入HindIII和PstI酶切位点，在T3的5’端和3’端分别引入PstI和EcoRI酶切位点。用HindIII/PstI酶切处理P5，用EcoRI/pstI处理T3，电泳后回收目的片段；用HindIII/EcoRI酶切pUC18载体质粒，回收载体片段，与p5和T3连接，构建中间载体pTΩ4A。

图2为转GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因烟草的Southern杂交检测，其中，a，b，c分别为转GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因烟草的Southern杂交检测结果：1为CK，2，3，4，5，6，7分别为转GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因烟草不同单株。

图3为转GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因烟草抗烟草赤星病鉴定结果(接种后7天)，其中，a，b为转GbRar1基因的烟草，c，d为转GbSgt1基因的烟草，e，f为转GbRac1基因的烟草，g，h为对照组烟草。

具体实施方式

海岛棉的抗病性明显优于陆地棉(Gossypium hirsutum)和中棉(Gossypium arboreum)，特别对当前棉花生产中危害最重的黄萎病(Verticillium dahliae)表现高抗(马存，等.中国农业科学，1997，30：58)。本发明克隆了海岛棉中R下游防卫反应信号元件的编码基因GbRar1、GbSgt1、GbRac1，具有SEQ ID NO：1、NO：3、NO：5所示的核苷酸序列。该核苷酸序列所编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、NO：4、NO：6所示。

为了使外源基因在植物细胞中在转录和翻译水平上获得高效表达，  在外源基因侧翼必须连接有适当的表达调控元件。因此，本发明设计了为在受体植物中高效表达上述GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因所需之启动子、增强子、终止子、转录产物的未翻译部分和多聚腺苷酸序列、以及便于在适当的培养基中筛选被转化细胞的选择标记基因等。

根据本发明的一个优选实施方案，在本发明所构建的表达载体中，所说的5′端非编码区由两个增强子序列、一个启动子序列、一个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列、和一个外源基因在植物细胞内翻译过程中起促进作用的短核苷酸序列组成。

在本发明的融合基因表达载体中使用的衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的翻译增强序列是Ω序列。该序列富集AAC序列，在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点(Richards et al.，Eur.J.Biochem.84：513-519，1987)。其中本发明使用的促进外源基因在植物细胞内翻译过程的短核苷酸序列是Kozak等人描述的Kozak序列(Kozak et al.，NucleicAcids Research 12：857-872，1984；Cell 44：283-292，1986)。

适于与本发明GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因连接，并在植物细胞中启动该编码DNA序列转录开始的启动子包括组成型、诱导型、组织或器官特异性或发育阶段特异性启动子。例如，它们包括但不只限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S或19S启动子、mannopine合成酶(MAS)启动、胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶启动子、玉米乙醇脱氢酶启动子，以及二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶小亚基启动子、伤诱导或病菌诱导启动子、组织或器官或发育特异性表达的启动子等。其中，本发明优选的是带有加倍增强子元件的CaMV35S启动子。该启动子全序列如SEQ ID NO：7所示。

根据本发明的一个优选实施方案，在本发明所构建的高效植物表达载体中，所说的3′端非编码区包括一个多联终止密码子序列，一个mRNA切割序列和一个mRNA切割后加工序列及多聚腺苷酸化序列。

另外，适用于本发明的GbRar1、GbSgt1、GbRac1高效植物表达载体还包括衍生于花椰菜花叶病毒或Nopaline(Nos)基因的终止子及其他类似的终止子。在本发明的一个实施方案中，我们使用了Nos基因的终止子。

可使用本领域中已知的方法将本发明提供的适于在植物细胞中表达GbRar1、GbSgt1、GbRac1的融合基因构建体连接到任何一种可在细菌细胞或植物细胞中自我复制的载体上。这样的载体例如包括衍生于大肠杆菌的质粒载体pUC18、pUC19。尤其是植物表达载体pBI101，pBI121系统等等。在本发明的一系列优选实施方案中，携带上述GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因构建体的载体是pMD18-T-vector、pCAMBIA2301等，后者特别适于作为制备植物表达载体的工具质粒载体。

如前所述，为了正确地选择和鉴定被转化的植物细胞，本发明的上述重组表达载体还含有选择标记基因。所使用的选择标记基因的两侧可带有各自的调节序列，以促使它们在植物中的表达。适用的选择标记是本领域内已知的。编码选择标记的外源基因及其他基因可以包含于同一个表达载体中，或者包含于转化时同时应用的不同的载体中。本发明优选的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因，并一同包含于同一个重组表达载体内，从而保证了对被转化细胞或植株选择的可靠性。

因此，归纳起来本发明提供的适于在植物细胞中表达GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因的植物表达载体包含：

1)GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因表达盒；

a)5′端非编码区；

b)编码GbRAR1、GbSGT1、GbRac1的如SEQ ID NO：1、NO：3、

NO：5所示的核苷酸序列；

c)3′端非编码区。

2)来源于pCAMBIA2301的载体部分：

a)新霉素磷酸转移酶基因(nptII)表达盒；

b)起始复制子及与植物转化相关的T-DNA左右边界序列等功能结构。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的5′端非编码区和3′端非编码区分别具有如前所述的构成元件及其功能。例如，5′端的带有加倍的增强子元件的启动子，Ω序列和Kozak序列；3′端的多联终止序列，正确切割和加工序列，多聚腺苷酸信号序列。

通过本发明所得到的符合SEQ ID NO：1、NO：3、NO：5的核苷酸序列可以通过DNA重组技术，连接到上面所描述的表达载体中，并使之转入并整合到植物基因组中。而且GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因在目标植物中的表达可赋予该植物对病害具有较强的抗性。

应该指出，上面所描述的表达载体只是本发明的一个优选实施例，它并不限制本发明。凡是应用本发明所描述的GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因所构建的任何表达载体均包括在本发明之内。包括如下的实现方式：

1.与其它一种或几种基因重组，构建多价基因的表达载体并转入植物；

2.与其它一种或几种基因融合，构建表达载体并转入植物；

3.与其它一种或几种基因相协同，分别构建植物表达载体，同时或分

步导入同一种植物受体。

为了在植物细胞中，特别是整株植物中表达外源抗病基因，以赋予整株植物及其种子和后代以抗病能力，必须使用适当的方法将按上述方法制备的携带本发明的GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因的重组表达载体转化或转导到适当的宿主细胞或植物体内。

将携带外源基因的重组载体导入宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技术人员熟知的。这些方法包括但并不仅限于：1)农杆菌介导的转化法(Agrobacterium-mediated transformation)；2)物理法，如基因枪法(Particle Bombardment或Particle gun或Gene gun)、电击法(Electroporation)、显微注射法(Microinjection)、超声波法(Ultrasonic)、激光微束法(Laser microwave)、碳化硅纤维介导法(Silicon carbide fiber)、电泳法(Electrophoretic transfection)等；3)化学法，如PEG介导法、脂质体介导法等；4)种质系统转化法，如花粉介导法、花粉管通道法(子房注射法)、浸泡法等；5)以花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒载体所介导的转化法等。

根据本发明的一个优选实施方案，我们选择烟草作为GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因转化受体植物。

因而，本发明涉及编码GbRAR1、GbSGT1、GbRac1的DNA序列、高效的植物表达载体，以及由此产生的对植物病害具有抵抗能力的转基因植物细胞以及由该转基因植物细胞得到的植物。

另一个方面，本发明提供了获得对病原菌有抗性的植物的方法，该方法包括：

1).构建包含GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因的植物表达载体；

2).用任何一种可行方法将步骤1)中得到的植物表达载体导入到植物细胞内，并由此获得对病原菌有抗性能力的转基因植物及其后代，包括任何植物的整株、部分、器官或组织和种子。

这里特别指出的是，虽然在下述实施例中以转基因烟草为例详细描述了本发明，但这绝不意味本发明的GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因及其重组表达载体只适用于转化和生产具有抗病能力的转基因烟草。因此，凡使用本发明所描述的GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因及其表达载体，以本领域技术人员已知的任何一种方法导入任何植物或其组织或细胞中，以及由此而获得的具有抗病能力的植物、种子和后代以及植物体的部分器官、组织或细胞，均包括在本发明之内。

实施例

实施例1：编码GbRAR1、GbSGT1、GbRac1蛋白质的结构基因的制备

从棉花黄萎病菌处理的海岛棉7124(中国农业科学院国家种质库，#00070074)叶片中提取总RNA，以5μg总RNA、oligo d(T)引物为底物，进行cDNA第一链的合成，具体操作参照试剂盒说明书(GIBCOBRL公司，产品目录号为#11146-024)进行。

1.1GbRar1基因的克隆

1.1.1GbRar1基因5’端的克隆

根据中棉EST克隆(GenBank登录号： BQ403789， BF276058， BG443488，BG446854， BQ412690)和陆地棉EST克隆(GenBank登录号： AW187113，AW187078)，设计引物：

pRR：5’ATGGCGGAGCAAGCTGTT 3’

pFR：5’ATTCCTCCTCATGCTTATGAC 3’

以海岛棉cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，反应条件为：96℃ 3min；94℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 30s，30个循环；72℃ 5min。PCR产物克隆到pMD18-T-vector，对阳性克隆测序。

1.1.2GbRar1基因3’端的克隆

根据获得的GbRar15’片段的测序结果，设计引物：

pRACE：5’CAGCTGTACTGGCTAAGAG 3’

采用3’RACE(TaKaRa公司，产品目录号为#D6121)，将得到的PCR产物克隆到pMD18-T-vector，对阳性克隆测序，获得GbRar13’端序列。

1.1.3全长GbRar1基因的克隆

根据获得的海岛棉GbRar1基因5’和3’的cDNA序列，设计引物：

pRarF：5’GA

AATGGCGGAGCAAGCTGTT 3’

               PstI

pRarR：5’TA TTAGGGCACTGGATCGGCA 3’

               SmaI

以海岛棉第一链cDNA为模板，PCR扩增，条件为94℃1分钟、50℃1分钟、72℃1分钟，循环35次。PCR获得的GbRar1基因连接到pMD18-T-vector中，命名为pMDRar。连同起始密码子ATG和终止密码子TAA共666个碱基对(序列如SEQ ID No：1)。它所编码的GbRAR1蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。

1.2GbSgt1基因的克隆

根据中棉EST克隆(GenBank登录号：BG443702，BG440215，BG443081，BM359396)和陆地棉EST克隆(GenBank登录号：AI728933)，设计简并引物：

pRT：5’ATGGCKTCTGATYTKGAGACCAA 3’

pFT：5’RKACTCCCAYTTCTTSASYTCCAT 3’

以海岛棉cDNA第一链为模板，采用Touch-Down PCR，反应条件：96℃ 3min；94℃ 30s、50℃/48℃/46℃/44℃ 30s、72℃ 30s，2个循环；94℃ 30s、42℃ 30s、72℃ 30s，28个循环；72℃ 5min。PCR产物克隆到pMD18-T-vector，对阳性克隆测序。

根据测序结果，设计下列引物：

pSgtF：5’GA

ATGGCGTCTGATTTTGAG 3’

                Sse8387I

pSgtR：5’TA CTAGGACTCCCATTTCTTC 3’

                SmaI

以海岛棉第一链cDNA为模板，PCR扩增获得GbSgt1基因，连接到pMD18-T-vector中，获得中间载体pMDSgt。连同起始密码子ATG和终止密码子TAG共1089个碱基对(序列如SEQ ID No：3)。它所编码的GbSGT1蛋白质序列如SEQ ID NO：4所示。

1.3GbRac1基因的克隆

1.3.1GbRac1基因5’端的克隆

根据中棉EST克隆(GenBank登录号：BE055015，BM360652，BE054555)，设计简并引物：

pRC：5’ATGAGYGCYTCBAGRTTCAT 3’

pFC：5’CYTTYACRTTCTSYTGTG 3’，

以海岛棉cDNA第一链为模板，用Touch-Down PCR扩增，具体步骤：96℃ 3min；94℃ 30s、48℃/46℃/44℃/42℃ 30s、72℃ 30s，2个循环；94℃ 30s、40℃ 30s、72℃ 30s，28个循环；72℃ 5min。PCR产物克隆到pMD18-T-vector，对阳性克隆测序。

1.3.2GbRac1基因3’端的克隆

根据获得GbRac1基因5’端序列，设计引物：

pRACE：5’ATTGCGGCTCCTGCATACATTG3’，

利用3’RACE得到目的PCR产物，克隆到pMD18-T-vector，对阳性克隆进行序列测定，获得GbRac1 3’端序列。

1.3.3全长GbRac1基因的克隆

根据获得的海岛棉GbRac1基因5’和3’的cDNA序列，设计引物：

pRacF：5’GA

ATGAGTGCTTCTAGGTTC 3’

               Sse8387 I

pRacR：5’TA TCATAATATTGAGCAACCAC 3’

                SmaI

以海岛棉第一链cDNA为模板进行PCR扩增，目的基因片段连接到pMD18-T-vector中，获得pMDRac。连同起始密码子ATG和终止密码子TGA共588个碱基对(序列如SEQ ID No：5)。它所编码的GbRac1蛋白质序列如SEQ ID NO：6所示。

实施例2：GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因植物表达载体的构建

2.1目的基因表达盒的构建

如前所述，本实施例所构建的基因表达盒中包括以下基因表达调控元件：5’端的35S启动子、加倍的增强子、Ω序列及Kozak序列，3’端的多联终止序列、切割序列、NOS终止子。用本领域所熟知的人工合成法合成了包括35S启动子、加倍的增强子、Ω序列及Kozak序列的DNA片段P5和包括多联终止序列、切割序列、NOS终止子的DNA片段T3。为了构建便利，在P5的5’端和3’端分别引入HindIII和PstI酶切位点，在T3的5’端和3’端分别引入PstI和EcoRI酶切位点。用HindIII/PstI酶切处理P5，用EcoRI/pstI处理T3，电泳后回收目的片段；用HindIII/EcoRI酶切pUC18载体质粒，回收载体片段，与p5和T3连接，构建中间载体pTΩ4A如附图1-1所示。

利用质粒pTΩ4A，用HindIII/EcoRI切下所包含的基因表达盒，克隆到植物表达载体pCAMBIA2301中的HindIII/EcoRI位点上，获得重组质粒pCT(附图1-2，3，4)。

2.2GbRar1基因植物表达载体的构建

pCT质粒经PstI和HpaI双酶切后，回收目的片段作为载体，将pMDRar中的GbRar1基因用PstI/SmaI切下，连接到所回收的载体pCT上去，得到重组质粒pCRar。这就是所构建的GbRar1基因的植物表达载体。其质粒图谱及构建过程如附图1-2所示。

2.3GbSgt1基因植物表达载体的构建

pCT质粒经PstI和HpaI双酶切后，回收目的片段作为载体，将pMDSgt中的GbSgt1基因用Sse8387I/SmaI切下，连接到所回收的载体pCT上去，得到重组质粒pCSgt。这就是所构建的GbSgt1基因的植物表达载体。其质粒图谱及构建过程如附图1-3所示。

2.4GbRac1基因植物表达载体的构建

pCT质粒经PstI和HpaI双酶切后，回收目的片段作为载体，将pMDRac中的GbRac1基因用Sse8387I/SmaI切下，连接到所回收的载体pCT上去，得到重组质粒pCRac。这就是所构建的GbRac1基因的植物表达载体。其质粒图谱及构建过程如附图1-4所示。

实施例3：GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因植物表达载体向模式植物烟草中的导入及鉴定

3.1 LBA4404感受态细胞的制备

挑取LBA4404(CLONTECH公司，产品目录号为#6027-1)单菌落接种于5ml YEB(含链霉素100μg/ml，蔗糖5g+蛋白胨5g+牛肉膏5g+酵母提取物1g+MgSO4.7H2O 0.049g/L，pH7.2)中，28℃，250rpm培养过夜。吸取2ml菌落加入50ml YEB培养基中，继续培养至OD₆₀₀值约为0.6。将菌液转至无菌离心管中，冰浴30分钟，5000rpm离心5分钟，用2ml 20mM的CaCl₂重悬菌体，按每管200μl分装于无菌小离心管中。

3.2重组质粒转入LBA4404细胞

在200μl LBA4404感受态细胞中分别加入2μg重组质粒pCRar、pCSgt、pCRac DNA，置冰浴5分钟，然后转至液氮中冷冻8分钟，迅速于37℃水浴中温育5分钟后，加入800μl YEB培养基，28℃250rpm预培养4～5小时，然后涂铺含有卡那霉素(50μg/ml)的YEB固体平板，28℃培养24～48小时。长出的农杆菌菌落带有相应的转化质粒。

3.3烟草的遗传转化

(1)农杆菌的准备：28℃过夜分别培养带有植物表达载体的农杆菌50ml，5000rpm离心5分钟，收集菌体沉淀，用液体MS(GIBCOBRL，产品目录号为#10632-040)培养液洗涤一次，再用MS重悬至OD600＝0.2～0.4。

(2)浸染：取烟草(Nicotiana tabacum)品种NC89(中国农业科学院国家种质库，#00002293)无菌苗叶片，用刀切成边长约0.5厘米的小方块，在农杆菌悬液中浸泡5～10分钟，然后用灭菌滤纸吸干。

(3)共培养：将叶块摆放在不加抗生素的共培养培养基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L)中(上面垫两层滤纸)于25℃避光共培养3天。

(4)选择培养：将叶片继代到选择培养基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中在光照培养箱中(光照12小时，黑暗12小时)培养至抗性芽的出现。

(5)抗性小苗的获得：将愈伤组织转移至生根培养基(MS+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)，每隔两周继代培养一次，最后种植到小塑料钵中。

3.4转基因烟草的Southern鉴定

取1～3克烟草鲜叶片，加等量Al₂O₃用液氮研磨，将粉末置于50ml离心管中，加入20ml DNA提取缓冲液(100mM Tris.HCl pH8.0，500mMNaCl，10mM β-巯基乙醇，50mM EDTA pH8.0)，剧烈振荡1分钟，加入4ml 10％SDS，轻轻混匀，于65℃加热10～20分钟，至颜色翠绿，加入冰冷5M KAc 4ml，冰上放置30分钟，然后在4℃、12000rpm离心15分钟，取上清，用0.6倍异丙醇沉淀后，用Rnase处理，纯化备用。

(1)取20μg转GbRar1烟草的总DNA用PstI/XhoI彻底酶切，转GbSgt1、GbRac1的烟草总DNA用Eco RV/Xho I彻底酶切，通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳并照相。

(2)将胶置于小盘中加入200ml变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)振荡45分钟。

(3)弃去变性液，用蒸馏水漂洗数次，加入中和液(1M Tris，pH7.4，1.5MNaCl)200ml，振荡30分钟，然后更换新的中和液，继续中和15分钟。

(4)剪相应大小的硝酸纤维素膜(NC膜)，于蒸馏水中均匀湿透后，将NC膜浸于10×SSC(20×SSC：每1000ml含NaCl 175.3g，柠檬酸钠88.2g pH7.0)中，放置20分钟。

(5)使用Bio-rad公司的转膜仪转膜1小时。

(6)去掉胶块，标记好加样孔位置，用6×SSC洗膜5分钟，然后紫外照射5分钟，以固定DNA。2×SSC洗膜，室温风干。

(7)将NC膜卷入杂交瓶中，加入20ml预杂交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，200μg/ml鱼精DNA)，使膜均匀浸润无气泡，然后置于DNA分子杂交仪中68℃预杂交过夜。

(8)探针的标记：采用随机引物试剂盒标记(Promega公司，产品目录号为#U1100)。分别取适量GbRar1、GbSgt1、GbRac1片段为模板，95～100℃变性2分钟迅速置于冰上，在一新的Eppendrof管中，依次加入：

    5×labeling buffer                 10μl

    dCTP，dGTP，dTTP，混合物           2μl

    变性模板                           25ng

    BSA                                2μl

    α-³²P-dATP                       5μl

    Klenow酶                           1μl

    加H₂O至总体积                     50μl

(9)轻轻混匀，室温反应60分钟。95℃变性2分钟置于冰上。加入2μl 0.5MEDTA。

(10)向预杂交完毕的袋中加入变性探针30～50μl，重新封好继续于68℃杂交8～10小时。

(11)取出杂交膜用2×SSC、0.5％SDS洗膜30分钟，用2×SSC、0.1％SDS洗15分钟，再用0.1×SSC、0.5％SDS于42℃洗膜30分钟～数小时，中间更换新的洗膜液。

(12)1×SSC洗膜2分钟，用吸水纸吸去水珠，用保鲜膜包好膜，暗室中压片。

(13)-70℃放射自显影3～6h后洗片。

结果示于图2中。如图所示，本发明的转GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因烟草的Southern杂交结果为阳性。

实施例4：转GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因烟草的抗病性测试

测试以烟草赤星病菌(Alternaria alternata)为供试菌种，采用离体叶片接种法，以非转基因烟草为对照。

4.1烟草赤星病菌孢子制备

将烟草赤星病菌接种在燕麦培养基上25℃培养2～3周，收集孢子，调整孢子浓度5×10⁴/mL；

4.2离体叶片接种实验

在转GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因的烟草中各取长势良好均一的15个单株用于检测，取供试烟草的顶部第3片叶，叶背面朝上置于无菌的湿纱布上，用石英砂制造微伤，在伤口处接种10μl孢子悬浮液，100％的相对湿度保湿24h，接种后1-7d观察发病情况。

实验结果示于图3中。如图3所示，对照组叶片在接种2～3天时，在接种部位形成水渍状病斑，7天时，接种部位形成黑色病斑，在病斑处赘生白色菌丝，病斑周围出现退绿，病灶扩大(g，h)，表明烟草赤星病孢子萌发后，已经成功侵染到叶片组织中。在本发明的转GbRar1、GbSgt1和GbRac1烟草各15个单株中，分别有5株、7株、4株抗性水平显著提高，接种3天时，接种部位无明显变化，接种7天时，在接种部位制造的微伤处形成轻微的坏死，表现出明显过敏性坏死反应，无菌丝赘生，限制了病原菌的进一步侵染(a，b，c，d，e，f)。由此表明本发明的转GbRar1、GbSgt1、GbRac1基因的烟草对烟草赤星病菌抗性明显提高。

序列表

(1)一般信息：

(I)申请人：中国农业科学院生物技术研究所

(II)发明名称：编码海岛棉防卫反应基因的核苷酸序列、含有该序列的植物表达载体及植物细胞

(III)序列数：6

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(I)序列特征：

(A)名称：GbRar1基因

(B)长度：666碱基对

(C)类型：核苷酸

(D)链型：单链

(E)拓扑结构：线性

(II)分子类型：编码GbRAR1基因的核苷酸序列

(III)假定的：非

(IV)反义：非

(V)序列描述：SEQ ID NO：1

ATGGCGGAGC AAGCTGTTAA GCTTCGGTGC CAACGAATCG GCTGCAATGC TACCTTCACC     60

GAAGACGATA ATCCCGAGGG TTCCTGCACT TTCCACACTT CCGGTCCTAT TTTTCATGAT    120

GGAATGAAAG AGTGGAGTTG TTGCAAAAAA AGAAGCCACG ACTTTTCTTT ATTCCTAGAA    180

ATTCCTGGGT GTAAGACAGG TAAGCACACA ACCGAGAAGC CAGTGTTGAA TAAGCCAGTA    240

GCTACTAAGA CGATTCCAAC TTCTAGTCCT GCTGTTACTC TTTCCACCAG TGCAACATCA    300

AAAGAATCCT GCCCTAGGTG CTCTCAGGGT TTCTTTTGCT CTGATCATGG TTCACAGCCC    360

AAAGTACCGA ACCCTACCCC AGCTGTACTG GCTAAGAGCA GTGCGGATGT TAAGGAGTCT    420

TCTCCTCCAC CAAAGAAGAA AGTTGACATA AACCAGCCTC AGACTTGCAA AAATAAAGGA    480

TGTGGCAAAG TTTTCAAAGA AATAGAGAAC CATGGGTCTG CATGTAGTTA CCATCCCGGA    540

CCTGCTGTTT TCCACGATCG AGTGAGAGGG TGGAAGTGCT GTGACATTTA TGTGAAGGAA    600

TTTGATGAGT TCATGACCAT TCCACCATAC AAGAAGGGAT GGCACGATGC CGATCCAGTG    660

CCCTAA                                                               666

(3)SEQ ID NO：2的信息：

(I)序列特征：

(A)名称：GbRAR1

(B)长度：221个氨基酸

(C)类型：氨基酸

(D)链型：单链

(E)拓扑结构：线性

(II)分子类型：GbRAR1的氨基酸序列

(III)假定的：非

(IV)反义：非

(V)序列描述：SEQ ID NO：2

MET Ala Glu Gln Ala Val Lys Leu Arg Cys Gln Arg Ile Gly Cys Asn Ala Thr Phe Thr     20

Glu Asp Asp Asn Pro Glu Gly Ser Cys Thr Phe His Thr Ser Gly Pro Ile Phe His Asp     40

Gly MET Lys Glu Trp Ser Cys Cys Lys Lys Arg Ser His Asp Phe Ser Leu Phe Leu Glu     60

Ile Pro Gly Cys Lys Thr Gly Lys His Thr Thr Glu Lys Pro Val Leu Asn Lys Pro Val     80

Ala Thr Lys Thr Ile Pro Thr Ser Ser Pro Ala Val Thr Leu Ser Thr Ser Ala Thr Ser    100

Lys Glu Ser Cys Pro Arg Cys Ser Gln Gly Phe Phe Cys Ser Asp His Gly Ser Gln Pro    120

Lys Val Pro Asn Pro Thr Pro Ala Val Leu Ala Lys Ser Ser Ala Asp Val Lys Glu Ser    140

Ser Pro Pro Pro Lys Lys Lys Val Asp Ile Asn Gln Pro Gln Thr Cys Lys Asn Lys Gly    160

Cys Gly Lys Val Phe Lys Glu Ile Glu Asn His Gly Ser Ala Cys Ser Tyr His Pro Gly    180

Pro Ala Val Phe His Asp Arg Val Arg Gly Trp Lys Cys Cys Asp Ile Tyr Val Lys Glu    200

Phe Asp Glu Phe MET Thr Ile Pro Pro Tyr Lys Lys Gly Trp His Asp Ala Asp Pro Val    220

Pro                                                                                221

(4)SEQ ID NO：3的信息：

(I)序列特征：

(F)名称：GbSgt1基因

(G)长度：1o89碱基对

(H)类型：核苷酸

(I)链型：单链

(J)拓扑结构：线性

(II)分子类型：编码GbSGT1基因的核苷酸序列

(III)假定的：非

(IV)反义：非

(V)序列描述：SEQ ID NO：3

ATGGCGTCTG ATTTTGAGAC CAAAGCCAAA GAAGCCTTCA TCGATGACCA CTTCGAGCTT     60

GCGCTCCATC TCTACTCTCA AGCCATCCAA CTTAATCCTA AACACGCCGA GCTCTATGCT    120

GACCGTGCTC AAGCCAACAT CAAACTCAAT AATCTCACTG AGGCTGTGGC GGATGCGAAC    180

AAAGCGATTG AGTTGGATCC TTCCATGTCT AAAGCTTATC TGCGTAAAGC CACTGCCTGC    240

ATGAAGCTTG AAGAGTATCA AACTGCTAAG TCTGCGCTGG GGACTGGCGC TGCTTTGGCA    300

CCTGCAGAGT CAAGATTTTC CAAGTTGATA AAAGAATGTG AAGAGCGAAT TGCAGAAGAA    360

ACTGGTGATG TATCTATGCA GATGCCAGAA GCATTGGCTA AAAATGATGT ACCCGCAAAA     420

GAAATTGAGC TGGACAAGGA TCAGCCTAAT CTAGAGATTG AGGCTGCACC TCCCAAACCA     480

GCGTACAGGC ATGAATTTTA CCAGAAACCA GAGGAAGTGG TTGTCACAAT ATTTGCTAAA     540

GGAATACCGC ATGATTGTGT TAAAGTAGAT TATGGTGAAC AAACACTAAG TGTTGCTATC     600

GATGCTCCTG GTAAGGAGGC ATATCATTTC CAACCTCGAT TATTTGCAAA GATAATACCT     660

GAGAAGTGCA GATATGATGT TTTGCCAACC AAAGTTGAGA TTAGGCTAGC AAAATCTGTA     720

CCCATTCATT GGACATCTCT TGAATTCAGC AGGGAAGTTG CTATAACCCA AAGGGTTAAT     780

GTATCTTCTG TTTCTGCAAG TCAACGACCA TCATACCCAT CCTCCAAACC ACAAAGGGTA     840

GATTGGGATA AAATTGAAGC TCAAGTAAAG AAGGAGGAGA AAGATGAAAA GCTAGATGGT     900

GATGCGGCTT TGAACAAATT TTTCCGGGAC ATTTATAAGG ATGCGGATGA AGACACAAGA     960

AGGGCCATGC AAAAATCTTT TGTGGAGTCT AATGGGACAG TGCTATCAAC AAATTGGAAA    1020

GAAGTTGGTG CAAAGGTGGT GGAAGGAAGT CCTCCTGATG GTATGGAGCT GAAGAAATGG    1080

GAGTCCTAG                                                            1089

(5)SEQ ID NO：4的信息：

(I)序列特征：

(F)名称：GbSGT1

(G)长度：362个氨基酸

(H)类型：氨基酸

(I)链型：单链

(J)拓扑结构：线性

(II)分子类型：GbSGT1的氨基酸序列

(III)假定的：非

(IV)反义：非

(V)序列描述：SEQ ID NO：4

MET Ala Ser Asp Phe Glu Thr Lys Ala Lys Glu Ala Phe Ile Asp Asp His Phe Glu Leu   20

Ala Leu His Leu Tyr Ser Gln Ala Ile Gln Leu Asn Pro Lys His Ala Glu Leu Tyr Ala   40

Asp Arg Ala Gln Ala Ash Ile Lys Leu Asn Asn Leu Thr Glu Ala Val Ala Asp Ala Asn   60

Lys Ala Ile Glu Leu Asp Pro Ser MET Ser Lys Ala Tyr Leu Arg Lys Ala Thr Ala Cys   80

MET Lys Leu Glu Glu Tyr Gln Thr Ala Lys Set Ala Leu Gly Thr Gly Ala Ala Leu Ala  100

Pro Ala Glu Ser Arg Phe Ser Lys Leu Ile Lys Glu Cys Glu Glu Arg Ile Ala Glu Glu  120

Thr Gly Asp Val Ser MET Gln MET Pro Glu Ala Leu Ala Lys Asn Asp Val Pro Ala Lys  140

Glu Ile Glu Leu Asp Lys Asp Gln Pro Asn Leu Glu Ile Glu Ala Ala Pro Pro Lys Pro  160

Ala Tyr Arg His Glu Phe Tyr Gln Lys Pro Glu Glu Val Val Val Thr Ile Phe Ala Lys  180

Gly Ile Pro His Asp Cys Val Lys Val Asp Tyr Gly Glu Gln Thr Leu Ser Val Ala Ile  200

Asp Ala Pro Gly Lys Glu Ala Tyr His Phe Gln Pro Arg Leu Phe Ala Lys Ile Ile Pro  220

Glu Lys Cys Arg Tyr Asp Val Leu Pro Thr Lys Val Glu Ile Arg Leu Ala Lys Ser Val  240

Pro Ile His Trp Thr Ser Leu Glu Phe Ser Arg Glu Val Ala Ile Thr Gln Arg Val Asn   260

Val Ser Ser Val Ser Ala Ser Gln Arg Pro Set Tyr Pro Ser Ser Lys Pro Gln Arg Val   280

Asp Trp Asp Lys Ile Glu Ala Gln Val Lys Lys Glu Glu Lys Asp Glu Lys Leu Asp Gly   300

Asp Ala Ala Leu Asn Lys Phe Phe Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Ala Asp Glu Asp Thr Arg   320

Arg Ala MET Gln Lys Ser Phe Val Glu Ser Asn Gly Thr Val Leu Ser Thr Asn Trp Lys   340

Glu Val Gly Ala Lys Val Val Glu Gly Ser Pro Pro Asp Gly MET Glu Leu Lys Lys Trp   360

Glu Ser                                                                           362

(6)SEQ ID NO：5的信息：

(I)序列特征：

(K)名称：GbRac1基因

(L)长度：588碱基对

(M)类型：核苷酸

(N)链型：单链

(O)拓扑结构：线性

(II)分子类型：编码GbRac1基因的核苷酸序列

(III)假定的：非

(IV)反义：非

(V)序列描述：SEQ ID NO：5

ATGAGTGCTT CTAGGTTCAT AAAGTGCGTC ACCGTCGGCG ATGGAGCCGT CGGAAAGACC     60

TGCTTGCTGA TTTCCTACAC CAGCAACACT TTCCCTACGG ACTATGTCCC GACTGTTTTC    120

GACAATTTCA GTGCAAATGT CGTCGTCGAT GGCAGCACTG TCAACTTAGG TTTATGGGAC    180

ACTGCTGGTC AGGAGGATTA CAATAGACTA CGACCACTGA GCTATCGTGG GGCTGATGTG    240

TTTATTCTTG CATTTTCTCT CATCAGCAAG GCCAGTTATG AAAACGTTGC CAAGAAGTGG    300

ATTCCTGAAC TAAAGCATTA TGCCCCTGGT GTTCCGATAG TTCTTGTTGG AACTAAGCTT    360

GATCTCCGAG ATGATCAACA ATTCTTAACA GACCATCCTA ACGCAGTGCC CATTTCTACA    420

GCTCAGGGAG AGGAATTAAA GAAACAGATT GCGGCTCCTG CATACATTGA GTGTAGCTCA    480

AAAACACAGC AGAATGTGAA AGCAGTGTTT GATGCAGCCA TTAAGGTAGT GCTGCAGCCT    540

CCGAATAAAA ATAAGAAGAA AAAGTCAGGT GGTTGCTCAA TATTATGA                 588

(7)SEQ ID NO：6的信息：

(I)序列特征：

(K)名称：GbRac1

(L)长度：195个氨基酸

(M)类型：氨基酸

(N)链型：单链

(O)拓扑结构：线性

(II)分子类型：GbRac1的氨基酸序列

(III)假定的：非

(IV)反义：非

(V)序列描述：SEQ ID NO：6

MET Ser Ala Ser Arg Phe Ile Lys Cys Val Thr Val Gly Asp Gly Ala Val Gly Lys Thr   20

Cys Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Ser Asn Thr Phe Pro Thr Asp Tyr Val Pro Thr Val Phe   40

Asp Asn Phe Ser Ala Asn Val Val Val Asp Gly Ser Thr Val Asn Leu Gly Leu Trp Asp   60

Thr Ala Gln Gln Glu Asp Tyr Asn Arg Leu Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Gly Ala Asp Val   80

Phe Ile Leu Ala Phe Ser Leu Ile Ser Lys Ala Ser Tyr Glu Ash Val Ala Lys Lys Trp  100

Ile Pro Glu Leu Lys His Tyr Ala Pro Gly Val Pro Ile Val Leu Val Gly Thr Lys Leu  120

Asp Leu Arg Asp Asp Gln Gln Phe Leu Thr Asp His Pro Asn Ala Val Pro Ile Ser Thr  140

Ala Gln Glu Glu Glu Leu Lys Lys Gln Ile Ala Ala Pro Ala Tyr Ile Glu Cys Ser Ser  160

Lys Thr Gln Gln Asn Val Lys Ala Val Phe Asp Ala Ala Ile Lys Val Val Leu Gln Pro  180

Pro Ash Lys Ash Lys Lys Lys Lys Ser Gly Gly Cys Ser Ile Leu                      195

Claims (9)

1、编码海岛棉防卫反应调控基因(Gossypium barbadense)GbRar1、GbSgt1或/和GbRac1基因的核苷酸序列，它们分别为如SEQ ID NO：1、SEQID NO：3或/和SEQ ID NO：5所示的序列，或者是对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。

2、根据权利要求1的核苷酸序列，特征在于其编码如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的GbRar1、GbSgt1或GbRac1氨基酸序列，或对所述序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的氨基酸序列。

3、适于在植物细胞中表达的、含有权利要求1所述核苷酸序列的植物表达载体。

4、根据权利要求3所述的植物表达载体，其包括：

a)5’端非编码区；

b)根据权利要求1的核苷酸序列；

c)3’端非编码区。

5、根据权利要求4的植物表达载体，其中a)所述的5’端非编码区包括增强子序列、启动子序列和翻译增强序列；b)权利要求1的核苷酸序列单独或组合使用；c)所述的3’端非编码区包含终止子、mRNA切割序列。

6、根据权利要求5的植物表达体，其中所述启动子包括组成型、诱导型、组织或器官特异性，或发育阶段特异性启动子。

7、含有根据权利要求3至6中任一项的植物表达载体的植物细胞。

8、根据权利要求1或2的核苷酸序列、根据权利要求3至6中任一项的植物表达载体用于提高植物抗病能力的用途。

9、获得对病原菌有抗性的转基因植物的方法，所述方法包括：

1)构建包含权利要求1所述的GbRar1、GbSgt1或GbRac1基因的核苷酸序列的重组植物表达载体；

2)将步骤1)中得到的植物表达载体导入植物细胞内，由此获得对病原菌有抗性的转基因植物。

Images