BR112014001950B1 - métodos para controle de uma praga de nemátodos e para produzir uma planta de soja protegida contra infestação de nemátodos - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA CONTROLE DE UMA PRAGA DE NEMÁTODOS E PARA PRODUZIR UMA PLANTA DE SOJA PROTEGIDA CONTRA INFESTAÇÃO DE NEMÁTODO, E COMPOSIÇÃO NEMATICIDA. A presente invenção refere-se a plantas transgênicas expressando uma proteína Vip3 são eficazes contra nemátodos infestantes de plantas. São divulgados métodos de controle de populações de nemátodos usando planta transgênicas expressando a proteína Vip3.

Description

MÉTODOS PARA CONTROLE DE UMA PRAGA DE NEMÁTODOS E PARA PRODUZIR UMA PLANTA DE SOJA PROTEGIDA CONTRA INFESTAÇÃO DE NEMÁTODOS CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a métodos para prevenir ou controlar a infestação de plantas por nemátodos. Mais particularmente, a invenção se refere ao controle de pragas de nemátodos em plantas usando proteínas inseticidas vegetativas. A invenção também se refere a plantas transgênicas tolerantes ou resistentes a infestação por nemátodos.

ANTECEDENTES

[002] As pragas das plantas são um maior fator da perda de culturas agrícolas importantes no mundo. Cerca de 8 biliões são perdidos todos os anos nos Estados Unidos somente devido a infestações de pragas de invertebrados incluindo nemátodos. Adicionalmente às perdas nas culturas agrícolas, as pragas de nemátodos são também um peso para os horticultores e fruticultores, para os produtores de flores ornamentais, e para os jardineiros. Os nemátodos infestantes de plantas, a maioria dos quais se alimentam de raízes, se encontram em associação com a maioria das plantas. Alguns são endoparasitas, vivendo e alimentando-se dentro dos tecidos das raízes, tubérculos, brotos, sementes, etc. Outros são ectoparasitas, alimentando-se externamente através das paredes das plantas. Um único nemátodo endoparasita pode matar uma planta ou reduzir a sua produtividade. Endoparasitas que se alimentam das raízes incluem as pragas economicamente importantes como os nemátodos do nódulo da raiz (espécies de Meloidogyne), nemátodos reniformes (espécies de Rotylenchulus), nemátodos císticos (espécies de Heterodera), e os nemátodos da lesão da raiz (espécies de Pratylenchus). A alimentação direta dos nemátodos pode diminuir drasticamente a absorção de nutrientes e água pela planta. Os nemátodos têm o maior dos impactos na produtividade das culturas quando atacam as raízes das mudas imediatamente após a germinação. A alimentação dos nemátodos também cria feridas abertas que favorecem a entrada de uma grande variedade de fungos e bactérias patogênicos de plantas. Estas infeções microbianas podem ser mais prejudiciais do ponto de vista econômico que os efeitos diretos da alimentação do nemátodo.

[003] Os nemátodos císticos são responsáveis por perdas diretas da produção da soja e perdas indiretas devidas ao custo dos pesticidas e ao uso não otimizado da terra para rotação. O nemátodo cístico da soja (Heterodera glycines) tem um impacto econômico negativo que pode exceder 1 bilião de dólares por ano na América do Norte. Densidades de nemátodos císticos economicamente significativos normalmente causam deficit de estatura das culturas vegetais. As plantas com déficit de estatura têm sistemas radiculares menores, apresentam sintomas de deficiências minerais nas folhas, e murcham facilmente.

[004] Práticas tradicionais para gerenciar infestações de nemátodos incluem a manutenção da fertilidade e dos níveis de pH do solo adequados no terreno infestado por nemátodos; o controle das doenças das plantas que ajudam à invasão dos nemátodos, assim como o controle de pragas de insetos e infestantes; utilizar práticas de sanidade tais como lavra, plantio, e cultivo dos campos infestados de nemátodos somente depois de se trabalharem os campos não infestados; limpar profundamente o equipamento após os trabalhos nos campos infestados; não usar as sementes de plantas crescidas em campos infestados para plantação em terrenos não infestados a menos que a semente tenha sido adequadamente limpa; rotação dos campos infestados e culturas hospedeiras alternativas com culturas não hospedeiras, tais como, milho, aveia e alfafa e plantação de variedades de plantas resistentes ou tolerantes. Embora muitas dessas possam ser eficientes são ao mesmo tempo demoradas e dispendiosas de implementar. Os nemátodos são pragas difíceis de controlar sem a utilização de pesticidas químicos ou fumigantes (por exemplo, nematicidas), e a disponibilidade desses nematicidas está a decrescer devido à alta toxicidade para humanos e para o ambiente. Mais ainda, de acordo com o Protocolo de Montreal de 1987, um dos principais químicos usados para o controle de infestação por nemátodos, o brometo de metilo, foi descontinuado. Assim, não existe atualmente qualquer abordagem eficiente e eficaz para o controle de infestação de nemátodos das plantas.

[005] Os agentes biológicos de controle de pragas, tais como estirpes de Bacillus thuringiensis expressando toxinas pesticidas do tipo delta-endotoxinas (também chamadas proteínas Cry), têm sido bem aplicadas a plantas de culturas com resultados satisfatórios, oferecendo uma alternativa ou complemento aos pesticidas químicos. Algumas proteínas Cry, por exemplo Cry1, Cry5, Cry6, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry21 e Cry22, têm mostrado fornecer alguma atividade contra certas espécies de nemátodos em bioensaios de laboratório. No entanto, o controle de pragas de nemátodos pela expressão das proteínas Cry em plantas não tem sido demonstrada, particularmente em culturas de campo tais como soja ou milho.

[006] Outros, genes não endotoxina e as proteínas inseticidas que elas codificam têm sido também identificados. As US 5,877,012, US 6,107,279, US 6,137,033, e US 6,291,156, assim como Estruch e outros(1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-5394) e Yu e outros(1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:532-536), descrevem uma nova classe das chamadas proteínas inseticidas chamadas. Vip3 (proteína inseticida vegetativa 3). Os genes Vip3 codificam proteínas de aproximadamente 88 kDa que são produzidas e secretadas por Bacillus durante o estágio vegetativo de crescimento (proteínas inseticidas vegetativas, VIP). Por exemplo, uma família da classe de proteínas Vip3, chamada Vip3A, possui atividade inseticida contra um largo espetro de pragas de lepidópteros, incluindo, mas não limitado a, lagarta-rosca (BCW, Agrotis ipsilon), lagarta-do-cartucho (FAW, Spodoptera frugiperda), lagarta-do-tabaco (TBW, Heliothis virescens) e lagarta da espiga de milho (CEW, Helicoverpa zea). Mais recentemente, as plantas expressando a proteína Vip3A têm revelado ser resistentes aos danos de alimentação causados pelas pragas de insetos hemípteros (US No. 6,429,360). Portanto, as proteínas Vip3A exibem um espetro único de atividades inseticidas. Outras divulgações, WO 98/18932, WO 98/33991, WO 98/00546, e WO 99/57282, identificaram também agora homólogos das proteínas da classe Vip3. Não foi até agora demonstrado que as proteínas da classe Vip3 tenham qualquer atividade contra pragas de não insetos tais como nemátodos.

[007] Devido às limitações da técnica acima descritas, permanece uma necessidade de desenvolver novos métodos para controlar pragas de nemátodos que proporcionem um efeito benéfico para os fazendeiros e que sejam ambientalmente aceitáveis.

SUMÁRIO

[008] As necessidades evidenciadas acima são satisfeitas pela invenção que, em várias modalidades, provê novos métodos de controle de pragas de nemátodos economicamente importantes. Em particular, verificou-se surpreendentemente, que as plantas transgênicas e/ou partes de plantas expressando a proteína inseticida vegetativa, Vip3, são capazes de inibirem a capacidade das pragas de nemátodos sobreviverem, crescerem e se reproduzirem, ou de limitarem os danos ou perdas das plantas de cultivo relacionadas com os nemátodos. A invenção é ainda desenhada para plantas transgênicas resistentes a nemátodos que expressem uma proteína Vip3 e os métodos de utilização de plantas transgênicas isoladamente ou em combinação com outras estratégias para conferir máxima eficiência de controle de nemátodos com mínimo impacte ambiental. Plantas e partes de plantas expressando uma proteína Vip3 são altamente tolerantes ou resistentes à infestação por nemátodos. Por exemplo, a praga de nemátodos economicamente importante, nemátodo cístico da soja (Heterodera glycines) pode ser controlada com plantas de soja transgênicas as quais expressam a proteína Vip3A.

[009] De acordo com outro aspecto, a invenção provê um método de controle de uma parga de nemátodos compreendendo contatar a praga de nemátodos com uma proteína Vip3 compreendendo a SEQ ID NO: 19. Em outro aspecto, a proteína Vip3 pode ser uma proteína Vip3A, por exemplo, SEQ ID NO:1 ou um homólogo da proteína Vip3A ativa para nemátodos possuindo pelo menos cerca de 82% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

[0010] De acordo com um aspecto, a invenção provê um método de controle de uma praga de nemátodos, compreendendo contatar a praga de nemátodos com uma planta ou parte de planta transgênica, compreendendo uma molécula de ácido nucleico heterólogo que dirija a expressão de uma proteína Vip3 da invenção na planta ou parte de planta transgênica, em que a planta ou parte de planta transgênica controla a praga de nemátodos em relação a uma planta ou parte de planta do mesmo tipo que não expresse a proteína Vip3.

[0011] Em um outro aspecto da invenção, a praga de nemátodos é selecionada de entre o grupo consistindo de Criconemella, Ditylenchus, Globodera, Helicotylenchus, Heterodera, Longidorus, Meloidogyne, Paratrichodorus, Pratylenchus, Radolpholus, Rotelynchus, Rotylenchulus, Tylenchulus e Xiphinema. Essas pragas de nemátodos selecionadas partindo desses gêneros podem ser nemátodos formadores de cistos. Em um outro aspecto, os nemátodos formadores de cistos são do gênero Heterodera. Ainda em um outro aspecto, a praga de nemátodos é Heterodera glycines (nemátodos císticos da soja).

[0012] Em um outro aspeto da invenção, a planta ou parte de planta transgênica é selecionada de entre o grupo que consiste de alfafa, maçã, damasco, Arabidopsis, alcachofra, aspargo, abacate, banana, cevada, feijão, beterraba, amora, mirtilo, Brassica, brócolis, couve-de-Bruxelas, repolho, canola, cenoura, mandioca, couve-flor, um cereal, aipo, cereja, frutas cítricas, clementina, café, milho, algodão, pepino, berinjela, escarola, eucalipto, figo, uva, toranja, amendoins, camapu, kiwi, alface, alho-poró, limão, lima, pinheiro, milho, manga, melão, painço, cogumelo, noz de aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta ornamental ou flor ou árvore, papaia, salsa, ervilha, pêssego, amendoim, turfa, pimento, caqui, ananás, banana-da-terra, ameixa, romã, batata, abóbora, chicória, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, soja, feijão de soja, espinafre, morango, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, uma videira, melancia, trigo, inhame e abobrinha. Ainda em um outro aspecto, a planta ou parte de planta transgênica é uma planta ou parte de planta de soja.

[0013] Em um outro aspeto da invenção, a parte de planta é uma raiz. Ainda em um outro aspecto, a raiz é uma raiz de soja.

[0014] Ainda em um outro aspecto da invenção, a proteína Vip3 é uma proteína Vip3A. Ainda em um outro aspecto, a proteína Vip3A compreende uma sequência de aminoácidos que é o produto de tradução de uma sequência de nucleotídeos cujo complemento hibridiza com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17 sob condições de alto rigor.

[0015] Em outro aspecto, a proteína Vip3 da invenção é selecionada de entre o grupo consistindo de Vip3Aa1 (AAC37036), Vip3Aa2 (AAC37037), Vip3Aa3 (US 6137033), Vip3Aa4 (AAR81079), Vip3Aa5 (AAR81080), Vip3Aa6 (AAR81081), Vip3Aa7 (AAK95326), Vip3Aa8 (AAK97481), Vip3Aa9 (CAA76665), Vip3Aa10 (AAN60738), Vip3Aa11 (AAR36859), Vip3Aa12 (AAM22456), Vip3Aa13 (AAL69542), Vip3Aa14 (AAQ12340), Vip3Aa15 (AAP51131), Vip3Aa16 (AAW65132), Vip3Aa17 (US 6603063), Vip3Aa18 (AAX49395), Vip3Aa19 (DQ241674), Vip3Aa19 (DQ539887), Vip3Aa20 (DQ539888), Vip3Aa21 (ABD84410), Vip3Aa22 (AAY41427), Vip3Aa23 (AAY41428), Vip3Aa24 (BI 880913), Vip3Aa25 (EF608501), Vip3Aa26 (EU294496), Vip3Aa27 (EU332167), Vip3Aa28 (FJ494817), Vip3Aa29 (FJ626674), Vip3Aa30 (FJ626675), Vip3Aa31 (FJ626676), Vip3Aa32 (FJ626677), Vip3Aa33 (GU073128), Vip3Aa34 (GU073129), Vip3Aa35 (GU733921), Vip3Aa36 (GU951510), Vip3Aa37 (HM132041), Vip3Aa38 (HM117632), Vip3Aa39 (HM117631), Vip3Aa40 (HM132042), Vip3Aa41 (HM132043), Vip3Aa42 (HQ587048), Vip3Aa43 (HQ594534), Vip3Aa44 (HQ650163), Vip3Ab1 (AAR40284), Vip3Ab2 (AAY88247), Vip3Ac1 (Publicação do Pedido de US 20040128716), Vip3Ad1 (Publicação do Pedido de US 20040128716), Vip3Ad2 (CAI43276), Vip3Ae1 (CAI43277), Vip3Af1 (CAI43275), Vip3Af2 (ADN08753), Vip3Af3 (HM117634), Vip3Ag1 (ADN08758),Vip3Ag2 (FJ556803),Vip3Ag3 (HM117633), Vip3Ag4 (HQ414237), Vip3Ag5 (HQ542193), e Vip3Ah1 (DQ832323).

[0016] Em um outro aspecto, uma proteína Vip3A da invenção compreende as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, ou um homologo ativo para nemátodos destas possuindo, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16. Em outra modalidade, a proteína Vip3A compreende a SEQ ID NO: 1 ou um homólogo ativo para nemátodos possuindo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.

[0017] Em um outro aspeto da invenção, uma planta transgênica da invenção compreende ou expressa adicionalmente pelo menos um agente pesticida adicional, por exemplo sem limitação, uma patatina, uma proteína inseticida Bacillus thuringiensis, uma proteína nematicida Bacillus thuringiensis, uma proteína inseticida Xenorhabdus, uma proteína inseticida Photorhabdus, uma proteína inseticida Bacillus laterosporous, uma proteína inseticida Bacillus sphearicus e/ou uma molécula RNAi que visa uma praga de nemátodos.

[0018] Em um outro aspeto, uma proteína nematicida de Bacillus thuringiensis é selecionada de entre o grupo consistindo de uma Cry1, uma Cry3, uma Cry11, uma Cry12, uma Cry13, uma Cry14, uma Cry21, e uma Cry22.

[0019] De acordo com outro aspecto, a invenção provê um método de conferir resistência a nemátodos a uma planta e/ou parte de planta compreendendo a inserção na planta e/ou parte de planta de uma molécula de ácido nucleico heterólogo codificando uma proteína Vip3, em que a planta e/ou parte de planta expressa a proteína Vip3 a um nível de inibição de nemátodos de modo a conferir resistência a nemátodos à planta e/ou parte de planta em relação ao mesmo tipo de planta e/ou parte de planta não expressando a proteína Vip3. Tal inserção pode ocorrer por transformação ou melhoramento.

[0020] De acordo com outro aspecto, a invenção provê um método de redução da infestação de nemátodos em uma planta e/ou parte de planta compreendendo contatar o nemátodo com uma proteína Vip3, em que a infestação de nemátodos é reduzida em relação à infestação de uma planta e/ou parte de planta por um nemátodo não contatado com uma proteína Vip3.

[0021] Ainda em um outro aspecto, a invenção provê uma planta ou parte desta planta de soja transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico heterólogo codificando uma proteína Vip3, em que a planta ou parte de planta de soja transgênica é resistente a infestação por nemátodos.

[0022] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de produção de uma planta de soja protegida contra a infestação de nemátodos, compreendendo transformar uma célula de planta de soja com uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína Vip3; e regenerar uma planta de soja transformada a partir de uma célula de planta, em que a planta transformada está protegida contra a infestação de nemátodos.

[0023] De acordo com outro aspecto, a invenção provê um método de produção de uma planta de soja protegida contra a infestação de nemátodos, compreendendo cruzar uma primeira planta parental de soja com uma segunda planta parental de soja, em que a primeira ou a segunda planta parental de soja compreendem uma molécula de ácido nucleico heterólogo codificando uma proteína Vip3, produzindo desse modo uma multiplicidade de plantas descendentes; e selecionando a partir da multiplicidade de plantas de progênie, uma planta transgênica que está protegida contra a infestação de nemátodos.

[0024] Em um outro aspecto da invenção, é provido um método para reduzir o desenvolvimento de nemátodos císticos em raízes de uma planta que pode ser infetada por um nemátodo, compreendendo introduzir nas células da raiz uma molécula de ácido nucleico capaz de dirigir a expressão de uma proteína Vip3, reduzindo desse modo o desenvolvimento de nemátodos císticos nas raízes da planta.

[0025] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de controle ou prevenção do crescimento de nemátodos compreendendo prover a praga de nemátodos com material vegetal compreendendo um DNA heterólogo capaz de dirigir a expressão de uma proteína Vip3, em que a referida planta inibe a atividade biológica de nemátodos.

[0026] Ainda em um outro aspecto da invenção é provido um método para prover um cultivador com um meio de controle de praga de nemátodos, o método compreendendo fornecer semente a um cultivador, em que a semente compreende uma molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica uma proteína Vip3 e em que a semente é capaz de produzir uma planta que é resistente à infestação por nemátodos.

[0027] Em um outro aspeto da invenção, é provido um método de supressão do crescimento de uma população de nemátodos patogênicos de plantas em uma localização capaz de apoiar o crescimento da população de nemátodos compreendendo o crescimento no local de uma população de plantas de soja transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico heterólogo capaz de dirigir a expressão de uma proteína Vip3, em que o crescimento da população de nemátodos patogênicos de plantas é suprimido.

[0028] A invenção também provê um método de controle de Heterodera glycines compreendendo fornecer uma planta de soja transgênica compreendendo uma cassete de expressão possuindo a SEQ ID NO: 1 ligada de modo operacional a um promotor capaz de dirigir a expressão de uma proteína Vip3 codificada a níveis suficientes para inibir nemátodos, em que a proliferação de Heterodera glycines que se alimenta da planta de soja é reduzida em relação a Heterodera glycines que se alimenta da planta de soja não transgênica não compreendendo a cassete de expressão.

[0029] De acordo com outro aspecto, a invenção provê um método para melhorar o rendimento da planta em campos infestados de nemátodos, compreendendo a expressão na planta de uma proteína Vip3, em que o rendimento da planta é melhorado em relação ao rendimento de uma planta do mesmo tipo não expressando uma proteína Vip3.

[0030] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de aumento do vigor ou do rendimento em uma planta de soja transgênica exposta a uma população de nemátodos compreendendo: a introgressão de um evento de soja transgênica em uma planta de soja resultando em uma planta de soja transgênica, em que o evento de soja transgênica compreende uma sequência de DNA heteróloga codificando uma proteína Vip3 que após o evento de soja transgênica confere resistência aos nemátodo; e crescendo a planta de soja transgênica ou a progênie desta a uma localização onde a infestação de nemátodos é limitante do rendimento de uma planta de soja que não compreenda a molécula de ácido nucleico heterólogo codificando a proteína Vip3, por meio da qual a planta de soja transgênica aumentou o vigor ou o rendimento em relação a planta de controle.

[0031] Em um outro aspecto, a invenção provê um método de melhorar o rendimento de um campo de soja, compreendendo: introduzir em uma planta de soja a molécula de ácido nucleico capaz de dirigir a expressão de uma proteína Vip3, produzindo assim uma planta transgênica; e cultivar uma multiplicidade de sementes transgênicas a partir da planta transgênica em um campo em produção, resultando em um campo de soja compreendendo uma multiplicidade de plantas de soja transgênicas possuindo resistência aumentada a uma infestação de nemátodos, melhorando desse modo o rendimento do campo de soja.

[0032] A presente invenção também provê uma cassete de expressão recombinante compreendendo uma sequência promotora heteróloga operativamente ligada a uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína Vip3. Além disso, a presente invenção proporciona um vetor recombinante compreendendo uma tal cassete de expressão. Ainda adicionalmente, a presente invenção provê uma célula hospedeira transgênica compreendendo uma tal cassete de expressão. Uma planta hospedeira transgênica de acordo com este aspecto da invenção pode ser uma célula vegetal. Ainda mais adicionalmente, a presente invenção provê uma planta ou parte de planta transgênica compreendendo tal célula vegetal.

[0033] A presente invenção também provê uma composição nematicida compreendendo uma quantidade de controle de nemátodos eficiente de uma proteína Vip3 e um veículo agricolamente aceitável. Em um outro aspecto, o veículo agricolamente aceitável é uma planta transgênica. Ainda em um outro aspecto, a planta transgênica é uma planta de soja transgênica e uma proteína Vip3 é uma proteína Vip3A possuindo pelo menos 82% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto, a proteína Vip3A compreende a SEQ ID NO: 1.

[0034] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método de produção de uma planta transgênica resistente a nemátodos, compreendendo introduzir a molécula de ácido nucleico codificando uma proteína Vip3 na célula da planta, formando deste modo uma célula vegetal transgênica; regenerar uma planta transgênica partindo da célula vegetal transgênica, em que a proteína Vip3A se expressa na planta transgênica em uma quantidade eficiente para controlar nemátodos. De acordo com outro aspecto, a planta é uma planta de soja. Em um outro aspecto, a proteína Vip3 é uma proteína Vip3A possuindo pelo menos 82% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. Ainda em um outro aspecto, a proteína Vip3A compreende a SEQ ID NO: 1. Ainda em um outro aspecto, o nemátodo é um nemátodo que forma cistos. Em um outro aspecto, o nemátodo que forma cistos é do gênero Heterodera. Ainda em outro aspecto o nemátodo cístico é um nemátodo cístico de soja (Heterodera glycines).

[0035] Outros aspectos e vantagens da invenção será tornado evidente para esses habilitados na arte a partir de um estudo da seguinte descrição da invenção e exemplos não limitativos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS NA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0036] A SEQ ID NO: 1 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína Vip3Aa20.

[0037] A SEQ ID NO: 2 é uma sequência de nucleotídeos codificando a SEQ ID NO: 1.

[0038] A SEQ ID NO: 3 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína Vip3Aa1.

[0039] A SEQ ID NO: 4 é uma sequência de nucleotídeos codificando a SEQ ID NO: 3.

[0040] A SEQ ID NO: 5 é uma sequência de nucleotídeos codificando a SEQ ID NO: 3.

[0041] A SEQ ID NO: 6 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína Vip3Aa2.

[0042] A SEQ ID NO: 7 é uma sequência de nucleotídeos codificando a SEQ ID NO: 6.

[0043] A SEQ ID NO: 8 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína Vip3Aa3.

[0044] A SEQ ID NO: 9 é uma sequência de nucleotídeos codificando a SEQ ID NO: 8.

[0045] A SEQ ID NO: 10 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína Vip3Af2.

[0046] A SEQ ID NO: 11 é uma sequência de nucleotídeos codificando a SEQ ID NO: 10.

[0047] A SEQ ID NO: 12 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína Vip3Af4.

[0048] A SEQ ID NO: 13 é uma sequência de nucleotídeos codificando a SEQ ID NO: 12.

[0049] A SEQ ID NO: 14 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína Vip3Af5.

[0050] A SEQ ID NO: 15 é uma sequência de nucleotídeos codificando a A SEQ ID NO: 14.

[0051] A SEQ ID NO: 16 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína Vip3Ag1.

[0052] A SEQ ID NO: 17 é uma sequência de nucleotídeos codificando a SEQ ID NO: 16.

[0053] A SEQ ID NO: 18 é uma sequência de nucleotídeos do vetor pKS214.

[0054] A SEQ ID NO: 19 é uma sequência de aminoácidos de identificação de Vip3.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0055] Antes de explicar as várias modalidades da divulgação, é para entender que a invenção não está limitada na sua aplicação a pormenores de construção e o arranjo dos componentes estabelecidos na descrição seguinte. Outras modalidades podem ser praticadas ou realizadas de várias modos. Também, deve entender-se que as frases e a terminologia aqui empregues são para fins de descrição e não devem ser vistas como limitantes.

[0056] Ao longo desta divulgação, são referidas várias publicações, patentes e especificações de patentes publicadas. Onde permitido, as divulgações destas publicações, patentes e especificações de patentes publicadas são aqui incorporadas integralmente como referência na presente divulgação para descrever mais completamente o estado da arte. A menos que indicado de outro modo, a divulgação engloba técnicas convencionais de melhoramento de plantas, imunologia, biologia molecular, microbiologia, biologia celular e de DNA recombinante, as quais estão dentro dos conhecimentos da arte. Ver, por exemplo, Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição (2001); Current Protocols in Molecular Biology [(F. M. Ausubel, e outros eds., (1987)]; Plant Breeding: Principles and Prospects (Plant Breeding, Vol 1) M. D. Hayward, N. O. Bosemark, I. Romagosa; Chapman & Hall, (1993.); Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher e Wingfeld, eds. (1995) CURRENT Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc.); a série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Flames e G. R. Taylor eds. (1995)], Harlow e Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1987)].

[0057] Salvo disposição em contrário, os termos técnicos são usados de acordo com utilização convencional. Definições dos termos comuns em biologia molecular pode ser encontrada em Lewin, Genes VII, publicado por Oxford University Press, 2000; Kendrew e outros(eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Wiley-Interscience, 1999; e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology, a Comprehensive Desk Reference, publicada por VCH Publishers, Inc., 1995; Ausubel e outros(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing; Sambrook e Russell. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a. edição.

[0058] A fim de facilitar a compreensão da divulgação, são fornecidas as seguintes definições:

[0059] "Atividade" das proteínas Vip3 da invenção significa que as proteínas Vip3 têm um efeito tóxico sobre os nemátodos perturbando ou impedindo a alimentação, inibindo a capacidade de a praga de nemátodos sobreviver, crescer e se reproduzir o que pode ou não causar a morte dos nemátodos, ou limitar os danos ou perdas das plantas relacionados com nemátodos.

[0060] Conforme usado no presente documento, "e/ou" se refere a e engloba qualquer uma e todas as combinações possíveis de um ou mais dos itens listados associados, assim como à falta de combinações quando interpretado na alternativa (ou).

[0061] "Associada a/ligada de modo operacional" se refere a duas sequências de ácido nucleico que estão física ou funcionalmente relacionadas. Por exemplo, uma sequência de DNA promotora ou reguladora se diz estar "associada a" uma sequência de DNA que codifica um RNA ou uma proteína no caso de as duas sequências estarem ligadas de modo operacional, ou situadas de modo a que a sequência de DNA reguladora venha a afetar o nível de expressão da sequência de DNA estrutural ou de codificação.

[0062] Conforme usado no presente documento, o termo "contatar" se refere a um processo através do qual uma proteína Vip3 da invenção ou a planta transgênica ou parte de planta expressando a proteína Vip3 da invenção são aplicadas ou administradas à praga de nemátodos alvo ou a populações da praga de nemátodos. Contatar descreve a proximidade física das proteínas Vip3 ou plantas ou partes de plantas transgênicas expressando uma proteína Vip3 e o nemátodo alvo de modo a que eles interajam. As plantas ou partes de plantas transgênicas podem ser contatadas com um nemátodo ou população de nemátodos alvo através da semente transgênica, das plântulas transgênicas, das mudas, estolhos, tubérculos, e afins em uma localização capaz de suportar o crescimento de uma praga de nemátodos ou população de praga de nemátodos.

[0063] Um "gene quimérico" é uma sequência de ácido nucleico recombinante na qual uma sequência de ácido nucleico promotor ou regulador estão ligados de modo operacional a, ou associados a, uma sequência de ácido nucleico que codifica um mRNA ou que é expressado como uma proteína, de modo a que a sequência de ácido nucleico reguladora é capaz de regular a transcrição ou expressão da sequência de ácido nucleico associada. A sequência de ácido nucleico reguladora do gene quimérico não está normalmente ligada de modo operacional à sequência de ácido nucleico associada tal como encontrado na natureza.

[0064] Uma "sequência de codificação" é uma sequência de ácido nucleico que é transcrita em RNA como mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, RNA sentido ou RNA antissentido. De preferência, o RNA é, então, traduzido em um organismo para produzir uma proteína.

[0065] Conforme aqui usados os termos "controlar" ou "controle" de nemátodos significa inibir, por meio um efeito tóxico, a capacidade da praga de nemátodos para sobreviver, crescer, se alimentar, e/ou se reproduzir, ou limitar os danos ou perdas das plantas de cultivo relacionados com nemátodos. "Controlar" nemátodos podem ou não significar matar os nemátodos.

[0066] Correspondente a: no contexto da presente invenção, "correspondente a" ou "corresponde a" significa que quando as sequências codificando ácido nucleico ou sequências de aminoácidos de diferentes genes ou proteínas Vip3 são alinhadas com cada outro, os ácidos nucleicos ou amino que "correspondem a" certas posições enumeradas são aqueles que se alinham com as posições mas que necessariamente não são nestas exatas posições numéricas em relação a respetiva sequência codificando o ácido nucleico ou sequência de aminoácidos das Vip3 particulares. Igualmente, quando a sequência de codificação ou de aminoácidos de uma Vip3 particular (por exemplo, Vip3Ag1) é alinhada com a sequência de codificação ou aminoácidos de uma Vip3 de referência (por exemplo, Vip3Aa20), o ácido nucleicos ou aminoácidos na sequência Vip3Ag1 que "corresponde a" certas posições enumeradas das sequências Vip3Aa20 são aquelas que alinham com estas posições da sequência Vip3Aa20, mas não são necessariamente nestas exatas posições numéricas da sequência codificando o aminoácido ou sequência de aminoácidos respetivas da proteína Vip3Ag1.

[0067] "Aplicar" uma toxina significa que a toxina fica em contato com um nemátodo ou população de nemátodos, resultando em um efeito tóxico e controle do nemátodo ou população de nemátodos. A toxina pode ser aplicada em muitos modos de reconhecimento, por exemplo, oralmente por ingestão pelo nemátodo ou por contato com o nemátodo por expressão da planta transgênica, composição(ões) de proteína formuladas, composição(ões) de proteína pulverizável, uma matriz de engodo, ou qualquer outro sistema de aplicação da toxina reconhecida da arte.

[0068] O termo "limite econômico" é definido como a população de praga de nemátodo que produz incremento de danos igual ao custo de controle ou prevenção desse dano. É o nível da população de nemátodo onde o beneficio do controle de nemátodos é equivalente ao seu custo. Com este objetivo, o limite econômico pode ser definido como o nível de dano da praga de nemátodos a partir do qual o valor de redução do incremento do rendimento da cultura é equivalente ao custo de prevenção da sua ocorrência. Por outras palavras, o limite econômico tenta determinar o ponto ao qual se torna economicamente viável controlar a população da praga de nemátodos. Os danos econômicos para a cultura hospedeira normalmente são infligidos pela primeira geração da progênie de nemátodos e são prevenidos pelas plantas transgênicas expressando uma proteína Vip3 através da redução da concentração da progênie de nemátodos na zona da raiz da planta.

[0069] Uma "quantidade eficaz de controlo de nemátodos" conforme usado no presente documento se refere à concentração de uma toxina Vip3 capaz de inibir, através de efeito tóxico, a capacidade dos nemátodos sobreviverem, crescerem, se alimentarem e/ou se reproduzirem, ou de reduzir ou prevenir os danos ou perda das plantas de cultivo relacionados com os nemátodos. "Quantidade eficaz de controlo de nemátodos" pode significar ou não matar os nemátodos.

[0070] "Cassete de expressão" conforme usado no presente documento significa uma sequência de ácido nucleico capaz de dirigir a expressão de uma sequência de nucleotídeos específica em uma célula hospedeira adequada, compreendendo um promotor ligado de modo operacional a sequência de nucleotídeos de interesse que é ligado de modo operacional a sinais de terminação. O mesmo também compreende tipicamente sequências necessárias para tradução apropriada da sequência de nucleotídeos. A cassete de expressão compreendendo a sequência de nucleotídeos de interesse pode ser quimérica, significando que ao menos um de seus componentes é heterólogo em relação ao menos a um dos seus outros componentes. A cassete de expressão também pode ser aquela de ocorrência natural, mas que foi obtida em uma forma recombinante útil para expressão heteróloga. Tipicamente, no entanto, a cassete de expressão é heteróloga em relação ao hospedeiro, isto é, a sequência de ácidos nucleicos particular do cassete de expressão não ocorre naturalmente na célula hospedeira e deve ser introduzida na célula hospedeira ou um ancestral da célula hospedeira através de um evento de transformação. A expressão da sequência de nucleotídeos na cassete de expressão pode ser sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor induzível que inicia a transcrição somente quando a célula hospedeira é exposta a algum estímulo externo particular. No caso de um organismo multicelular, como uma planta, o promotor também pode ser específico para um órgão ou tecido particular, ou estágio do desenvolvimento.

[0071] Um "gene" é uma região definida que está situada em um genoma e que, além da sequência de ácidos nucleicos codificadora mencionada anteriormente, compreende outras sequências de ácidos nucleicos, primariamente reguladoras, responsáveis pelo controle da expressão, isto é, a transcrição e tradução, da porção codificadora. Um gene também pode compreender outras sequências 5' e 3' não traduzidas e sequências de terminação. Outros elementos que podem estar presentes são, por exemplo, íntrons.

[0072] Uma sequência de ácidos nucleicos "heteróloga" é uma sequência de ácidos nucleicos que não está naturalmente associada a uma célula hospedeira na qual é introduzida, incluindo múltiplas cópias de ocorrência não natural de uma sequência de ácidos nucleicos de ocorrência natural.

[0073] "Nematicida" é definido como uma atividade biológica tóxica capaz de controlar nemátodos, preferencialmente matando-os.

[0074] Uma sequência de ácido nucleico é "isocodificada com" uma sequência de ácido nucleico de referência quando a sequência de ácido nucleico codifica um polipeptídeo possuindo a mesma sequência de aminoácidos como o polipeptídeo codificado pela sequência do ácido nucleico de referência. Por exemplo, uma sequência de codificação nativa de Bacillus spp. que codifica uma proteína Vip3 é isocodificada com um códon da sequência de codificação otimizada para expressão em uma planta que codifica a mesma proteína Vip3.

[0075] Uma molécula de ácido nucleico "isolada" ou uma proteína ou toxina isolada é uma molécula de ácido nucleico ou proteína ou toxina que, pela mão do homem, existe para além do seu ambiente nativo e não é, portanto, um produto de natureza. Uma molécula de ácido nucleico isolada ou proteína ou toxina pode existir em uma forma purificada ou pode existir em um ambiente não nativo tal como, por exemplo, uma célula hospedeira recombinante ou uma planta transgênica.

[0076] O termo "nativo" se refere a uma sequência ou gene de codificação que está naturalmente presente no genoma de uma célula ou planta.

[0077] O termo "ocorre naturalmente " é aqui usado para descrever um objeto que pode ser encontrado na natureza como distinto de ser produzido artificialmente pelo homem. Por exemplo, a proteína ou sequência de nucleotídeos presente em um organismo (incluindo um vírus), a qual pode ser isolada a partir da origem na natureza e a qual não tenha sido intencionalmente modificada pelo homem no laboratório, é de ocorrência natural.

[0078] Uma "planta" é qualquer planta em qualquer estágio de desenvolvimento, particularmente, uma planta de semente.

[0079] Uma "célula de planta" é uma unidade estrutural e fisiológica de uma planta, compreendendo um protoplasto e uma parede celular. A célula vegetal pode estar na forma de uma célula única isolada ou uma célula cultivada, ou como uma parte de unidade mais organizada tal como, por exemplo, tecido vegetal, um órgão de planta, ou uma planta inteira.

[0080] "Material vegetal" se refere a folhas, caules, raízes, flores ou partes de flores, frutos, pólen, óvulos, zigotos, sementes, estacas, culturas de tecido ou células, ou qualquer outra parte ou produto de uma planta.

[0081] Um "órgão de planta" é uma parte distinta e visivelmente estruturada e diferenciada de uma planta como uma raiz, caule, folha, broto de flor ou embrião.

[0082] Uma "parte de planta" pode ser qualquer parte de uma planta e inclui uma célula vegetal, material vegetal, órgão de planta ou tecido vegetal.

[0083] "Tecido de planta", conforme usado no presente documento, significa um grupo de células de planta organizadas em uma unidade estrutural e funcional. Um tecido de uma planta em planta ou em cultura está incluído. Esse termo inclui, mas não se limita a, plantas inteiras, órgãos de planta, sementes de planta, cultura de tecido e quaisquer grupos de células de planta organizadas em unidades estruturais e/ou funcionais. O uso desse termo em conjunção com, ou na ausência de, qualquer tipo específico de tecido de planta conforme listado acima ou abrangido de outra forma por essa definição não se destina a ser exclusivo de qualquer outro tipo de tecido de planta.

[0084] Um "promotor" é uma sequência de DNA não traduzida a montante da região de codificação que contém o sítio de ligação para a RNA polimerase 11 e inicia a transcrição do DNA. A região promotora pode também incluir outros elementos que atuam como reguladores da expressão de gene.

[0085] "Elementos reguladores" referem-se a sequências envolvidas no controle da expressão de uma sequência de nucleotídeos. Elementos reguladores compreendem um promotor ligado de modo operacional a sequência de nucleotídeos de interesse e sinais de terminação. Tipicamente também englobam sequências requeridas para a tradução adequada da sequência de nucleotídeos.

[0086] Conforme usado no presente documento, "resistente" ou resistência significa uma variedade de soja transgênica que evita que a maioria dos nemátodos sobrevivam e/ou se reproduzam após a sua tentativa de infestação.

[0087] O termo "substancialmente idêntica," no contexto das duas sequências de ácido nucleico ou proteína, se refere a duas ou mais sequências ou subsequências que tem pelo menos 60%, preferencialmente 80%, mais preferencialmente 90%, ainda mais preferencialmente 95%, e o mais preferencialmente pelo menos 99% de identidade de resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, como medido usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por inspeção visual. Preferencialmente, a identidade substancial existe sobre uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 50 resíduos de comprimento, mais preferencialmente sobre uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos e mais preferencialmente as sequências são substancialmente idênticas sobre pelo menos cerca de 150 resíduos. Em uma modalidade especialmente preferida, as sequências são substancialmente idênticas ao longo de todo o comprimento das regiões de codificação. Ademais, as sequências de ácido nucleico ou proteínas substancialmente idênticas realizam substancialmente a mesma função.

[0088] Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência age como uma sequência de referência com as quais as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de referência e de teste são inseridas em um computador, se necessário as coordenadas de subsequência são designadas e os parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequência, então, calcula a identidade de sequência porcentual para a(s) sequência(s) de teste relativas à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa designados.

[0089] O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pela procura pelo método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção visual (ver geralmente, Ausubel et al., infra).

[0090] Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a percentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência é o algoritmo BLAST, o qual é descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). O software para realizar análises BLAST é disponível publicamente através do Centro Nacional para Informações de Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve identificar primeiro os pares de sequência de alta pontuação (HSPs) identificando pequenas palavras de comprimento W na sequência de consulta, o qual iguala ou satisfaz algum limite positivo de avaliação T quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência do banco de dados. T é referido como um limite de pontuação de palavra de proximidade (Altschul et al., 1990). Esses acessos de palavra de proximidade iniciais agem como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos que contêm os mesmos. Os acessos de palavra são, então, estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência para tão longe quanto a pontuação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas com o uso, para sequências de nucleotídeo, dos parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos compatíveis; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos incompatíveis; sempre < 0). Para sequências de aminoácido, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão que a palavra atinge em cada direção é interrompida quando a pontuação do alinhamento cumulativo cai em uma quantidade X do seu valor máximo alcançado, a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa, ou é quando se atinge a extremidade de uma das sequências. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para a sequência de nucleotídeos) utiliza como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expetativa (E) de 10, um corte de 100, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas as cadeias. Para as sequências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza como padrão um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver, Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

[0091] Adicionalmente ao calculo da identidade de sequência porcentual, o algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Uma medição de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de soma menor (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma compatibilidade entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos pode ocorrer por acaso. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de teste é considerada similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação da sequência de ácido nucleico de teste à sequência de ácido nucleico de referência é menos que cerca de 0,1, mais preferencialmente menos que cerca de 0,01 e mais preferencialmente menos que cerca de 0,001.

[0092] Outra indicação que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que as duas moléculas hibridizam uma com a outra sob condições rigorosas. A frase "hibridizar especificamente com" se refere a ligação, duplicação, ou hibridização de uma molécula somente a uma sequência de nucleotídeos específica sob condições rigorosas quando essa sequência está presente em uma mistura complexa (por exemplo, celular total) DNA ou RNA. "Liga-se substancialmente" se refere a uma hibridização complementar entre um ácido nucleico de sonda e um ácido nucléico alvo e adota incompatibilidades menores que podem ser acomodadas reduzindo-se a severidade dos meios de hibridização para alcançar a deteção desejada da sequência de ácido nucléico alvo.

[0093] "Condições de hibridização rigorosas" e " condições de lavagem de hibridação rigorosas" no contexto dos experimentos de hibridização de ácido nucleico tais como hibridizações Southern e Northern são dependentes de sequência, e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais. As sequências maiores hibridizam especificamente a temperaturas altas. Um guia extenso para a hibridação de ácidos nucleicos encontra-se em Tijssen (1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York. Geralmente, hibridização altamente rigorosa e condições de lavagem são selecionadas para serem cerca de 5 ºC menores que o ponto térmico de fusão (Tf) para a sequência específica a uma força iônica e pH definidos. Tipicamente, sob "condições rigorosas" uma sonda irá hibridizar a sua subsequência alvo, mas nenhumas outras sequências.

[0094] A molécula de ácido nucleico se diz ser o "complemento" de outra molécula de ácido nucleico caso exibam complementaridade completa. Conforme usado no presente documento, as moléculas são consideradas como exibindo "complementaridade completa" quando cada nucleótido de uma das moléculas é complementar a um nucleótido da outra. Duas moléculas são consideradas como sendo "minimamente complementares" se podem hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para permitir que permaneçam emparelhadas uma com outra pelo menos sob condições convencionais de "baixo rigor". De modo semelhante, as moléculas são considerados como sendo "complementares" caso possam hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para permitir que permaneçam emparelhadas uma com outra sob condições convencionais de "alto rigor". Condições convencionais de rigor são descritas por Sambrook, et al., Em: Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), e por Haymes, e outros. Em: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985), aqui incorporado integralmente como referência.

[0095] A Tf é a temperatura (sob resistência iônica e pH definidos) à qual 50% da sequência alvo hibridiza a uma sonda combinada perfeitamente. Condições muito rigorosas são selecionadas para serem iguais à Tf para uma sonda específica. Um exemplo de condições de hibridização rigorosas para hibridização de ácidos nucleicos complementares os quais têm mais de 100 resíduos complementares no filtro em um Southern ou northern blot é 50% formamida com 1 mg de heparina a 42ºC, com a hibridização sendo realizada durante a noite. Um exemplo das condições de lavagem altamente rigorosas é NaCl a 0,1 5M a 72 ºC durante 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem altamente rigorosas é uma lavagem a 0,2x SSC a 65 ºC durante 15 minutos (ver Sambrook, abaixo, para uma descrição de tampão SSC). Frequentemente, uma lavagem de alto rigor é precedida por uma lavagem de baixo rigor para remover o sinal de sonda de fundo. Uma lavagem de rigor médio exemplificativa para um duplex de, por exemplo, mais que 100 nucleotídeos, é 1x SSC a 45 ºC durante 15 minutos. Uma lavagem de baixo rigor exemplificativa para um duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 4-6x SSC a 40 ºC durante 15 minutos. Para sondas curtas (por exemplo, cerca de 10 até 50 nucleotídeos), as condições rigorosas tipicamente envolvem concentrações de sais menores que cerca de 1,0 M de íon Na, tipicamente concentração de cerca de 0,01 até 1,0 M de íon Na (ou outros sais) a pH 7,0 até 8,3, e a temperatura é tipicamente pelo menos cerca de 30ºC. Condições rigorosas podem também ser obtidas com a adição de agentes desestabilizantes tal como formamida. Em geral, uma razão de sinal para ruído de 2x (ou maior) que essa observada para uma sonda não relacionada no ensaio de hibridização particular indica a detecção de uma hibridização específica. Ácidos nucleicos que não hibridizam um com o outro sob condições rigorosas são ainda substancialmente idênticos se as proteínas que eles codificam forem substancialmente idênticas. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando a degenerescência máxima de códon permitida pelo código genético.

[0096] Os seguintes são exemplos de conjuntos de condições de hibridização/lavagem que podem ser usadas para clonar sequências homólogas de nucleotídeos que são substancialmente idênticos à sequência de nucleotídeos Vip3 de referência da presente invenção: uma sequência de nucleotídeos de referência preferencialmente hibridizam com a sequência de nucleotídeos de referência em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50°C com lavagem em 2X SSC, 0,1% SDS a 50 °C, mais desejavelmente em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7% , NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50°C com lavagem em 1X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais desejavelmente ainda em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50°C com lavagem em 0,5X SSC, 0,1% SDS a 50 °C, preferencialmente em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50°C com lavagem em 0,1X SSC, 0,1% SDS a 50°C, mais preferencialmente em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50°C com lavagem em 0,1X SSC, 0,1% SDS a 65°C.

[0097] Uma indicação adicional de que duas sequências de ácido nucleico ou proteínas são substancialmente idênticas é que a proteína codificada pelo primeiro ácido nucléico é reativa cruzada imunologicamente com ou se liga especificamente à proteína codificada pelo segundo ácido nucleico. Dessa forma, uma proteína é tipicamente substancialmente idêntica a uma segunda proteína, por exemplo, onde as duas proteínas deferem-se somente por substituições conservativas.

[0098] "Sintético" se refere a uma sequência de nucleotídeos compreendendo caracteres estruturais que não estão presentes na sequência natural. Por exemplo, uma sequência de codificação Vip3, encontrada naturalmente em Bacillus, que mais se assemelha ao conteúdo G+C e a distribuição de códon normal dos genes de dicot e/ou de monocot é considerada como sendo sintética.

[0099] "Transformação" é um processo para introduzir ácido nucleico heterólogo em uma célula ou organismo hospedeiros. Em particular, "transformação" significa a integração estável de uma molécula de DNA no genoma de um organismo de interesse.

[00100] "Transformado/ transgênico/recombinante" referem-se a um organismo hospedeiro como uma bactéria ou uma planta no qual uma molécula de ácido nucleico heterólogo foi introduzida. A molécula de ácido nucleico pode ser integrada estavelmente no genoma do hospedeiro ou a molécula de ácido nucleico pode também estar presente como uma molécula extracromossômica. Tal molécula extracromossômica pode ser autorreplicante. As plantas, tecidos ou células transformadas devem ser entendidos como abrangendo não somente o produto final de um processo de transformação, mas também a progênie transgênica do mesmo. Um hospedeiro "não transformado", "não transgênico" ou "não recombinante" se refere a um organismo do tipo selvagem, por exemplo, uma bactéria ou planta, que não contém a molécula de ácido nucleico heterólogo.

[00101] Uma "proteína Vip3" no contexto da invenção significa uma proteína inseticida vegetativa (VIP) que é um membro da classe Vip3 incluindo por exemplo sem limitação, Vip3Aa1, Vip3Aa2, Vip3Aa3, Vip3Aa19, Vip3Aa20, Vip3Af2, Vip3Ag1, e seus homólogos. Algumas características estruturais que identificam uma proteína como sendo da classe de proteínas Vip3 incluem, 1) um tamanho de cerca de 80 kDa; e 2) um sinal de secreção N-terminal altamente conservado que compreende a sequência de aminoácidos IYGFATGIKDI (SEQ ID NO: 17) o qual não é processado durante a secreção em Bacillus. Um "homólogo" ativo para nemátodo conforme usado no presente documento significa que a proteína ou polipeptídeo indicado é ativo contra nemátodos e tem uma relação definida para outros membros da classe de proteínas Vip3. Esta relação definida pode incluir mas não é limitada a, 1) proteínas que são pelo menos 70%, ou pelo menos 80% , ou pelo menos 90% idênticas ao nível de sequência a outro membro da classe de proteínas Vip3 enquanto também conservam a atividade nematicida, 2) proteínas que são de reação cruzada com anticorpos que imunologicamente reconhecem outro membro da classe de proteínas Vip3, 3) proteínas que são de reação cruzada com um receptor de nemátodo a outro membro da classe de proteínas Vip3 e conserva a atividade de nemátodo quando expressa em uma planta transgênica, e 4) proteínas que são pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90% idênticas ao nível de sequência a uma região de núcleo tóxico de um outro membro da classe de proteínas Vip3 enquanto também conserva a atividade nematicida. Exemplos não limitativos de membros da classe Vip3 incluindo os anteriormente mencionados e seus respetivos números de acesso do GenBank ou US ou número de publicação da patente são Vip3Aa1 (AAC37036), Vip3Aa2 (AAC37037), Vip3Aa3 (US 6137033), Vip3Aa4 (AAR81079), Vip3Aa5 (AAR81080), Vip3Aa6 (AAR81081), Vip3Aa7 (AAK95326), Vip3Aa8 (AAK97481), Vip3Aa9 (CAA76665), Vip3Aa10 (AAN60738), Vip3Aa11 (AAR36859), Vip3Aa12 (AAM22456), Vip3Aa13 (AAL69542), Vip3Aa14 (AAQ12340), Vip3Aa15 (AAP51131), Vip3Aa16 (AAW65132), Vip3Aa17 (US 6603063), Vip3Aa18 (AAX49395), Vip3Aa19 (DQ241674), Vip3Aa19 (DQ539887), Vip3Aa20 (DQ539888), Vip3Aa21 (ABD84410), Vip3Aa22 (AAY41427), Vip3Aa23 (AAY41428), Vip3Aa24 (BI 880913), Vip3Aa25 (EF608501), Vip3Aa26 (EU294496), Vip3Aa27 (EU332167), Vip3Aa28 (FJ494817), Vip3Aa29 (FJ626674), Vip3Aa30 (FJ626675), Vip3Aa31 (FJ626676), Vip3Aa32 (FJ626677), Vip3Aa33 (GU073128), Vip3Aa34 (GU073129), Vip3Aa35 (GU733921), Vip3Aa36 (GU951510), Vip3Aa37 (HM132041), Vip3Aa38 (HM117632), Vip3Aa39 (HM117631), Vip3Aa40 (HM132042), Vip3Aa41 (HM132043), Vip3Aa42 (HQ587048), Vip3Aa43 (HQ594534), Vip3Aa44 (HQ650163), Vip3Ab1 (AAR40284), Vip3Ab2 (AAY88247), Vip3Ac1 (Publicação do Pedido de US 20040128716), Vip3Ad1 (Publicação do Pedido de US 20040128716), Vip3Ad2 (CAI43276), Vip3Ae1 (CAI43277), Vip3Af1 (CAI43275), Vip3Af2 (ADN08753), Vip3Af3 (HM117634), Vip3Ag1 (ADN08758),Vip3Ag2 (FJ556803), Vip3Ag3 (HM117633), Vip3Ag4 (HQ414237), Vip3Ag5 (HQ542193), e Vip3Ah1 (DQ832323).

[00102] Conforme usado no presente documento, os nucleotídeos são indicados pelas suas bases pelas seguintes abreviaturas padrão: adenina (A), citosina (C), timina (T), e guanina (G). Os aminoácidos são igualmente indicados pelas seguintes abreviaturas padrão: alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisteína (Cys; C), glutamina (Gln; Q), ácido glutâmico (Glu; E), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; 1), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y), e valina (Val; V).

[00103] Os materiais e métodos da presente invenção são úteis para matar ou controlar nemátodos; retardar o crescimento ou a reprodução de nemátodos; reduzir as populações de nemátodos; e/ou reduzir ou retardar os danos das plantas causados pela infestação da praga de nemátodos. Em particular, a invenção provê métodos de controle de praga de nemátodos de plantas de cultivo tais como soja utilizando plantas de cultivo transgênicas expressando uma proteína Vip3.

[00104] A expressão em plantas ou partes de plantas transgênicas de as proteínas Vip3 da invenção resulta em composições que podem ser usadas para controlar pragas de nemátodos, por exemplo, sem limitação, Meloidogyne spp. (por exemplo, Meloidogyne incoginita e Meloidogyne javanica, Meloidogyne hapla, Meloidogyne arenari), Heterodera spp. (por exemplo, Heterodera glycines, Heterodera carotae, Heterodera schachtii, Heterodora avenae e Heterodora trifolii), Globodera spp. (por exemplo, Globodera rostochiensis), Radopholus spp. (por exemplo, Radopholus similes), Rotylenchulus spp., Pratylenchus spp. (por exemplo, Pratylenchus neglectans e Pratylenchus penetrans), Aphelenchoides spp., Helicotylenchus spp., Hoplolaimus spp., Paratrichodorus spp., Longidorus spp., Nacobbus spp., Subanguina spp. Belonlaimus spp., Criconemella spp., Criconemoides spp. Ditylenchus spp., Ditylenchus dipsaci, Dolichodorus spp., Hemicriconemoides spp., Hemicycliophora spp., Hirschmaniella spp., Hypsoperine spp., Macroposthonia spp., Melinius spp., Punctodera spp., Quinisulcius spp., Scutellonema spp., Xiphinema spp., e Tylenchorhynchus spp.

[00105] Em uma modalidade, a invenção engloba um método para controlar uma praga de nemátodos, compreendendo contatar a praga de nemátodos com uma proteína Vip3 compreendendo a SEQ ID NO: 19.

[00106] Em outra modalidade, os nemátodos são selecionados de entre o grupo consistindo de Criconemella, Ditylenchus, Globodera, Helicotylenchus, Heterodera, Longidorus, Meloidogyne, Paratrichodorus, Pratylenchus, Radolpholus, Rotelynchus, Rotylenchulus, Tylenchulus e Xiphinema. Ainda em outra modalidade, o nemátodo é um nemátodo que forma cistos. Ainda em outra modalidade, o nemátodo é do gênero Heterodera. Em uma outra modalidade, o nemátodo é Heterodera glycines.

[00107] Em outra modalidade, o passo de contato se realiza com uma planta ou parte de planta transformada com pelo menos uma molécula de ácido nucleico codificando a proteína Vip3. Ainda em outra modalidade, a planta ou parte de planta é uma planta ou parte de planta de soja. Ainda em outra modalidade, a parte da planta de soja é uma raiz de soja.

[00108] Em outra modalidade, a proteína Vip3 é uma proteína Vip3A. Ainda em outra modalidade, a proteína Vip3A compreende uma sequência de aminoácidos que é o produto da tradução de uma sequência de nucleotídeos cujo complemento hibridiza com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17 sob condições de alto rigor. Ainda em outra modalidade, as condições de alto rigor são dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C com lavagem em 0,1XSSC, 0,1% SDS a 65°C. Em uma outra modalidade, a proteína Vip3A é selecionada de entre o grupo consistindo de Vip3Aa1 (AAC37036), Vip3Aa2 (AAC37037), Vip3Aa3 (US 6137033), Vip3Aa4 (AAR81079), Vip3Aa5 (AAR81080), Vip3Aa6 (AAR81081), Vip3Aa7 (AAK95326), Vip3Aa8 (AAK97481), Vip3Aa9 (CAA76665), Vip3Aa10 (AAN60738), Vip3Aa11 (AAR36859), Vip3Aa12 (AAM22456), Vip3Aa13 (AAL69542), Vip3Aa14 (AAQ12340), Vip3Aa15 (AAP51131), Vip3Aa16 (AAW65132), Vip3Aa17 (US 6603063), Vip3Aa18 (AAX49395), Vip3Aa19 (DQ241674), Vip3Aa19 (DQ539887), Vip3Aa20 (DQ539888), Vip3Aa21 (ABD84410), Vip3Aa22 (AAY41427), Vip3Aa23 (AAY41428), Vip3Aa24 (BI 880913), Vip3Aa25 (EF608501), Vip3Aa26 (EU294496), Vip3Aa27 (EU332167), Vip3Aa28 (FJ494817), Vip3Aa29 (FJ626674), Vip3Aa30 (FJ626675), Vip3Aa31 (FJ626676), Vip3Aa32 (FJ626677), Vip3Aa33 (GU073128), Vip3Aa34 (GU073129), Vip3Aa35 (GU733921), Vip3Aa36 (GU951510), Vip3Aa37 (HM132041), Vip3Aa38 (HM117632), Vip3Aa39 (HM117631), Vip3Aa40 (HM132042), Vip3Aa41 (HM132043), Vip3Aa42 (HQ587048), Vip3Aa43 (HQ594534), Vip3Aa44 (HQ650163), Vip3Ab1 (AAR40284), Vip3Ab2 (AAY88247), Vip3Ac1 (Publicação do Pedido de US 20040128716), Vip3Ad1 (Publicação do Pedido de US 20040128716), Vip3Ad2 (CAI43276), Vip3Ae1 (CAI43277), Vip3Af1 (CAI43275), Vip3Af2 (ADN08753), Vip3Af3 (HM117634), Vip3Ag1 (ADN08758),Vip3Ag2 (FJ556803),Vip3Ag3 (HM117633), Vip3Ag4 (HQ414237), Vip3Ag5 (HQ542193), e Vip3Ah1 (DQ832323). Ainda em outra modalidade, a proteína Vip3A compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, ou um seu homólogo ativo para nemátodos possuindo, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16. Em outra modalidade, a proteína Vip3A compreende a SEQ ID NO: 1 ou uma homóloga ativa para nemátodos possuindo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.

[00109] Em uma modalidade, a invenção engloba a planta ou parte de planta que pode ser infestada por um nemátodo e a qual é protegida dos nemátodos ao ser transformada com pelo menos uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína Vip3. Em outra modalidade, a planta ou parte de planta é uma planta ou parte de planta de soja. Em outra modalidade, o nemátodo é do gênero Heterodera. Ainda em outra modalidade, o nemátodo é Heterodera glycines.

[00110] Em uma modalidade, a invenção engloba um método de controlar uma praga de nemátodos, compreendendo contatar a praga de nemátodos com uma planta ou parte de planta transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico heterólogo que dirige a expressão de uma proteína Vip3 na planta transgênica, em que a planta transgênica controla a praga de nemátodos em relação a uma planta do mesmo tipo que não expressa a proteína Vip3.

[00111] Em outra modalidade, os nemátodos são selecionados a partir do grupo consistindo de Criconemella, Ditylenchus, Globodera, Helicotylenchus, Heterodera, Longidorus, Meloidogyne, Paratrichodorus, Pratylenchus, Radolpholus, Rotelynchus, Rotylenchulus, Tylenchulus e Xiphinema. Ainda em outra modalidade, o nemátodo é um nemátodo que forma cistos. Ainda em outra modalidade, o nemátodo é do gênero Heterodera. Em uma outra modalidade, o nemátodo é Heterodera glycines.

[00112] Em outra modalidade, a planta ou parte de planta transgênica é selecionada de entre o grupo consistindo de alfafa, maçã, damasco, Arabidopsis, alcachofra, aspargo, abacate, banana, cevada, feijão, beterraba, amora, mirtilo, Brassica, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, colza, cenoura, mandioca, couve-flor, um cereal, aipo, cereja, frutas cítricas, clementina, café, milho, algodão, pepino, berinjela, escarola, eucalipto, figo, uva, toranja, amendoins, camapu, kiwi, alface, alho-poró, limão, lima, pinheiro, milho, manga, melão, paínço, cogumelo, noz de aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta ornamental ou flor ou árvore, papaia, salsa, ervilha, pêssego, amendoim, turfa, pimento, caqui, ananás, banana-da-terra, ameixa, romã, batata, abóbora, chicória, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, soja, feijão de soja, espinafre, morango, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, uma videira, melancia, trigo, inhame e abobrinha. Ainda em outra modalidade, a planta ou parte de planta transgênica é uma planta ou parte de planta de soja.

[00113] Em outra modalidade, a proteína Vip3 é uma proteína Vip3A. Ainda em outra modalidade, a proteína Vip3A compreende uma sequência de aminoácidos que é o produto da tradução de uma sequência de nucleotídeos cujo complemento hibridiza com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17 sob condições de alto rigor. Ainda em outra modalidade, as condições de alto rigor são dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C com lavagem em 0,1XSSC, 0,1% SDS a 65°C. Em uma outra modalidade, a proteína Vip3A é selecionada de entre o grupo consistindo de Vip3Aa1 (AAC37036), Vip3Aa2 (AAC37037), Vip3Aa3 (US 6137033), Vip3Aa4 (AAR81079), Vip3Aa5 (AAR81080), Vip3Aa6 (AAR81081), Vip3Aa7 (AAK95326), Vip3Aa8 (AAK97481), Vip3Aa9 (CAA76665), Vip3Aa10 (AAN60738), Vip3Aa11 (AAR36859), Vip3Aa12 (AAM22456), Vip3Aa13 (AAL69542), Vip3Aa14 (AAQ12340), Vip3Aa15 (AAP51131), Vip3Aa16 (AAW65132), Vip3Aa17 (US 6603063), Vip3Aa18 (AAX49395), Vip3Aa19 (DQ241674), Vip3Aa19 (DQ539887), Vip3Aa20 (DQ539888), Vip3Aa21 (ABD84410), Vip3Aa22 (AAY41427), Vip3Aa23 (AAY41428), Vip3Aa24 (BI 880913), Vip3Aa25 (EF608501), Vip3Aa26 (EU294496), Vip3Aa27 (EU332167), Vip3Aa28 (FJ494817), Vip3Aa29 (FJ626674), Vip3Aa30 (FJ626675), Vip3Aa31 (FJ626676), Vip3Aa32 (FJ626677), Vip3Aa33 (GU073128), Vip3Aa34 (GU073129), Vip3Aa35 (GU733921), Vip3Aa36 (GU951510), Vip3Aa37 (HM132041), Vip3Aa38 (HM117632), Vip3Aa39 (HM117631), Vip3Aa40 (HM132042), Vip3Aa41 (HM132043), Vip3Aa42 (HQ587048), Vip3Aa43 (HQ594534), Vip3Aa44 (HQ650163), Vip3Ab1 (AAR40284), Vip3Ab2 (AAY88247), Vip3Ac1 (Publicação do Pedido de US 20040128716), Vip3Ad1 (Publicação do Pedido de US 20040128716), Vip3Ad2 (CAI43276), Vip3Ae1 (CAI43277), Vip3Af1 (CAI43275), Vip3Af2 (ADN08753), Vip3Af3 (HM117634), Vip3Ag1 (ADN08758),Vip3Ag2 (FJ556803), Vip3Ag3 (HM117633), Vip3Ag4 (HQ414237), Vip3Ag5 (HQ542193), e Vip3Ah1 (DQ832323). Ainda em uma modalidade adicional, a proteína Vip3A compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, ou um seu homólogo ativo para nemátodos possuindo, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16. Em outra modalidade, a proteína Vip3A compreende a SEQ ID NO: 1 ou um homologo ativo para nemátodos possuindo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.

[00114] Em outra modalidade, a planta transgênica compreende ou expressa adicionalmente pelo menos um agente pesticida adicional selecionado do grupo consistindo de uma patatina, uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis, uma proteína nematicida de Bacillus thuringiensis, uma proteína inseticida de Xenorhabdus, uma proteína inseticida de Photorhabdus, uma proteína inseticida de Bacillus laterosporous, e uma proteína inseticida de Bacillus sphearicus. Ainda em outra modalidade, a proteína nematicida de Bacillus thuringiensis é selecionada de entre o grupo consistindo de um Cry1, Cry3, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry21, e Cry22.

[00115] Em uma modalidade, a invenção engloba um método para conferir resistência a nemátodos a uma planta ou parte de planta compreendendo inserir em uma planta ou parte de planta uma molécula de ácido nucleico heterólogo codificando uma proteína Vip3, em que a planta ou parte de planta expressa a proteína Vip3 com um nível de inibição de nemátodos de modo a conferir à planta ou parte de planta resistência a nemátodos em relação a o mesmo tipo de planta ou parte de planta não expressando a proteína Vip3.

[00116] Em outra modalidade, os nemátodos são selecionados a partir do grupo consistindo de Criconemella, Ditylenchus, Globodera, Helicotylenchus, Heterodera, Longidorus, Meloidogyne, Paratrichodorus, Pratylenchus, Radolpholus, Rotelynchus, Rotylenchulus, Tylenchulus e Xiphinema. Ainda em outra modalidade, o nemátodo é um nemátodo que forma cistos. Ainda em outra modalidade, o nemátodo é do gênero Heterodera. Em uma outra modalidade, o nemátodo é Heterodera glycines.

[00117] Em outra modalidade, a planta ou parte de planta é selecionada de entre o grupo consistindo de alfafa, maçã, damasco, Arabidopsis, alcachofra, aspargo, abacate, banana, cevada, feijão, beterraba, amora, mirtilo, Brassica, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, colza, cenoura, mandioca, couve-flor, um cereal, aipo, cereja, frutas cítricas, Clementina, café, milho, algodão, pepino, berinjela, escarola, eucalipto, figo, uva, toranja, amendoins, camapu, kiwi, alface, alho-poró, limão, lima, pinheiro, milho, manga, melão, paínço, cogumelo, noz de aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta ornamental ou flor ou árvore, papaia, salsa, ervilha, pêssego, amendoim, turfa, pimento, caqui, ananás, banana-da-terra, ameixa, romã, batata, abóbora, chicória, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, soja, feijão de soja, espinafre, morango, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, uma videira, melancia, trigo, inhame e abobrinha. Ainda em outra modalidade, a planta ou parte de planta é uma planta ou parte de planta de soja.

[00118] Em outra modalidade, a proteína Vip3 é uma proteína Vip3A. Ainda em outra modalidade, a proteína Vip3A compreende uma sequência de aminoácidos que é o produto da tradução de uma sequência de nucleotídeos cujo complemento hibridiza com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17 sob condições de alto rigor. Ainda em outra modalidade, as condições de alto rigor são dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C com lavagem em 0,1XSSC, 0,1% SDS a 65°C. Em uma outra modalidade, a proteína Vip3A é selecionada de entre o grupo consistindo de Vip3Aa1 (AAC37036), Vip3Aa2 (AAC37037), Vip3Aa3 (US 6137033), Vip3Aa4 (AAR81079), Vip3Aa5 (AAR81080), Vip3Aa6 (AAR81081), Vip3Aa7 (AAK95326), Vip3Aa8 (AAK97481), Vip3Aa9 (CAA76665), Vip3Aa10 (AAN60738), Vip3Aa11 (AAR36859), Vip3Aa12 (AAM22456), Vip3Aa13 (AAL69542), Vip3Aa14 (AAQ12340), Vip3Aa15 (AAP51131), Vip3Aa16 (AAW65132), Vip3Aa17 (US 6603063), Vip3Aa18 (AAX49395), Vip3Aa19 (DQ241674), Vip3Aa19 (DQ539887), Vip3Aa20 (DQ539888), Vip3Aa21 (ABD84410), Vip3Aa22 (AAY41427), Vip3Aa23 (AAY41428), Vip3Aa24 (BI 880913), Vip3Aa25 (EF608501), Vip3Aa26 (EU294496), Vip3Aa27 (EU332167), Vip3Aa28 (FJ494817), Vip3Aa29 (FJ626674), Vip3Aa30 (FJ626675), Vip3Aa31 (FJ626676), Vip3Aa32 (FJ626677), Vip3Aa33 (GU073128), Vip3Aa34 (GU073129), Vip3Aa35 (GU733921), Vip3Aa36 (GU951510), Vip3Aa37 (HM132041), Vip3Aa38 (HM117632), Vip3Aa39 (HM117631), Vip3Aa40 (HM132042), Vip3Aa41 (HM132043), Vip3Aa42 (HQ587048), Vip3Aa43 (HQ594534), Vip3Aa44 (HQ650163), Vip3Ab1 (AAR40284), Vip3Ab2 (AAY88247), Vip3Ac1 (Publicação do Pedido de US 20040128716), Vip3Ad1 (Publicação do Pedido de US 20040128716), Vip3Ad2 (CAI43276), Vip3Ae1 (CAI43277), Vip3Af1 (CAI43275), Vip3Af2 (ADN08753), Vip3Af3 (HM117634), Vip3Ag1 (ADN08758), Vip3Ag2 (FJ556803), Vip3Ag3 (HM117633), Vip3Ag4 (HQ414237), Vip3Ag5 (HQ542193), e Vip3Ah1 (DQ832323). Ainda em uma modalidade adicional, a proteína Vip3A compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, ou um seu homólogo ativo para nemátodos possuindo, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16. Em outra modalidade, a proteína Vip3A compreende a SEQ ID NO: 1 ou um homologo ativo para nemátodos possuindo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.

[00119] Em outra modalidade, a planta ou parte de planta transgênica compreende ou expressa adicionalmente pelo menos um agente pesticida adicional selecionado do grupo consistindo de uma patatina, uma proteína inseticida Bacillus thuringiensis, uma proteína nematicida de Bacillus thuringiensis, uma proteína inseticida de Xenorhabdus, uma proteína inseticida de Photorhabdus, uma proteína inseticida de Bacillus laterosporous, e uma proteína inseticida de Bacillus sphearicus. Ainda em outra modalidade, a proteína nematicida de Bacillus thuringiensis é selecionada de entre o grupo consistindo de um Cry1, Cry3, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry21, e Cry22.

[00120] Em uma modalidade, a invenção engloba um método de redução de uma infestação de nemátodos em uma planta compreendendo contatar o nemátodo com uma proteína Vip3, em que a infestação de nemátodos é reduzida em relação à infeção de nemátodos da planta não contatada com uma proteína Vip3. Em outra modalidade, o passo de contato compreende plantar uma semente transgênica capaz de produzir uma planta transgênica que expressa uma proteína Vip3, em que os nemátodos se alimentam na planta transgênica. Ainda em outra modalidade, a planta transgênica é soja (Glycine max). Ainda em outra modalidade, o nemátodo é nemátodo cístico de soja (Heterodera glycines).

[00121] Em uma modalidade, a invenção engloba o método de melhorar o rendimento de plantas em campos infestados com nemátodos, compreendendo expressar na planta uma proteína Vip3, em que o rendimento da planta é melhorado em relação ao rendimento de uma planta do mesmo tipo não expressando uma proteína Vip3.

[00122] Em outra modalidade, a invenção engloba um método de produção de uma planta de soja protegida contra a infestação de nemátodos compreendendo transformar uma célula da planta de soja com uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína Vip3 e regenerar uma planta de soja transformada a partir de uma célula da planta.

[00123] Em outra modalidade, a invenção engloba um método de produção de uma planta de soja protegida contra a infestação de nemátodos compreendendo cruzar uma primeira planta parental de soja com uma segunda planta parental de soja, em que as referidas primeira ou segunda planta de soja parentais compreendem uma molécula de ácido nucleico heterólogo codificando uma proteína Vip3, produzindo desse modo uma multiplicidade de plantas de progênie; e selecionando da multiplicidade das plantas da progênie, uma planta transgênica que é protegida contra a infestação de nemátodos.

[00124] Ainda em outra modalidade, a invenção engloba um método de prover um produtor com meios para controlar a praga de nemátodos compreendendo fornecer a semente a um produto, em que a semente compreende uma molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica uma proteína Vip3 e em que a semente é capaz de produzir uma planta que é resistente aos danos de nemátodos.

[00125] Em uma modalidade, a invenção engloba uma planta ou parte de planta de soja transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico heterólogo codificando uma proteína Vip3, em que a referida planta ou parte de planta transgênica tem resistência melhorada pelo menos um dos nemátodos patogênicos de plantas, em relação a uma planta ou parte de planta controle não expressando a Proteína Vip3. Em outra modalidade, a proteína Vip3 compreende a SEQ ID NO: 19. Ainda em outra modalidade, a proteína Vip3 é uma proteína Vip3A. Em uma outra modalidade, a proteína Vip3A possuindo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Ainda em outra modalidade, a proteína Vip3A compreende a SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, o nemátodo formador de cistos é um nemátodo cístico de soja (Heterodera glycines).

[00126] Em outra modalidade, a invenção engloba semente transgênica de uma planta transgênica da invenção, em que a semente transgênica compreende uma molécula de ácido nucleico heterólogo codificando uma proteína Vip3 da invenção.

[00127] Ainda em outra modalidade, a invenção engloba um método de controlar Heterodera glycines compreendendo fornecer uma planta ou parte de planta de soja transgênica compreendendo uma cassete de expressão possuindo a SEQ ID NO: 2 ligada de modo operacional a um promotor capaz de dirigir a expressão de uma proteína Vip3 codificada a níveis suficientes para inibir nemátodos, em que a proliferação de císticos de Heterodera glycines na referida planta ou parte de planta é reduzida em relação aos cistos de Heterodera glycines em uma planta ou parte de planta de soja não expressando a proteína Vip3. Em outra modalidade, o promotor é selecionado de entre o grupo consistindo de: a) um promotor constitutivo; b) um promotor específico de tecidos; e c) um promotor induzível. Ainda em outra modalidade, o promotor é um promotor de actina 2.

[00128] Em uma modalidade, a invenção engloba um método de aumento do vigor ou do rendimento em uma planta de soja transgênica exposta a uma população de nemátodos compreendendo introgressão de um evento de soja transgênica em uma planta de soja resultando em uma planta de soja transgênica, em que o evento de soja transgênica compreende uma molécula de ácido nucleico heterólogo codificando uma proteína Vip3 que após o evento de soja transgênica confere resistência aos nemátodos; e crescendo uma planta de soja transgênica ou a progênie desta em uma localização onde a infestação de nemátodos está a limitar o rendimento de uma planta de soja que não compreende a molécula de ácido nucleico heterólogo codificando a proteína Vip3, por meio da qual a planta de soja transgênica aumentou o vigor ou o rendimento em relação a planta de controle.

[00129] A invenção também engloba um método para melhorar o rendimento da soja compreendendo introduzir em uma planta de soja uma molécula de ácido nucleico capaz de dirigir a expressão de uma proteína Vip3; e cultivar uma multiplicidade de sementes transgênicas da planta do passo (a), resultando em uma multiplicidade de plantas transgênicas possuindo resistência aumentada a uma infestação de nemátodos, melhorando deste modo o rendimento da soja.

[00130] A invenção engloba ainda uma composição nematicida compreendendo uma proteína Vip3 e um veículo agricolamente aceitável.

[00131] Em outra modalidade, a proteína Vip3 compreende a SEQ ID NO: 19. Ainda em outra modalidade a proteína Vip3 é uma proteína Vip3A. Ainda em outra modalidade, a proteína Vip3A compreende uma sequência de aminoácidos que é o produto da tradução de uma sequência de nucleotídeos cujo complemento hibridiza com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17 sob condições de alto rigor. Ainda em outra modalidade, as condições de alto rigor são dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C com lavagem em 0,1XSSC, 0,1% SDS a 65°C. Em uma outra modalidade, a proteína Vip3A é selecionada de entre o grupo consistindo de Vip3Aa1 (AAC37036), Vip3Aa2 (AAC37037), Vip3Aa3 (US 6137033), Vip3Aa4 (AAR81079), Vip3Aa5 (AAR81080), Vip3Aa6 (AAR81081), Vip3Aa7 (AAK95326), Vip3Aa8 (AAK97481), Vip3Aa9 (CAA76665), Vip3Aa10 (AAN60738), Vip3Aa11 (AAR36859), Vip3Aa12 (AAM22456), Vip3Aa13 (AAL69542), Vip3Aa14 (AAQ12340), Vip3Aa15 (AAP51131), Vip3Aa16 (AAW65132), Vip3Aa17 (US 6603063), Vip3Aa18 (AAX49395), Vip3Aa19 (DQ241674), Vip3Aa19 (DQ539887), Vip3Aa20 (DQ539888), Vip3Aa21 (ABD84410), Vip3Aa22 (AAY41427), Vip3Aa23 (AAY41428), Vip3Aa24 (BI 880913), Vip3Aa25 (EF608501), Vip3Aa26 (EU294496), Vip3Aa27 (EU332167), Vip3Aa28 (FJ494817), Vip3Aa29 (FJ626674), Vip3Aa30 (FJ626675), Vip3Aa31 (FJ626676), Vip3Aa32 (FJ626677), Vip3Aa33 (GU073128), Vip3Aa34 (GU073129), Vip3Aa35 (GU733921), Vip3Aa36 (GU951510), Vip3Aa37 (HM132041), Vip3Aa38 (HM117632), Vip3Aa39 (HM117631), Vip3Aa40 (HM132042), Vip3Aa41 (HM132043), Vip3Aa42 (HQ587048), Vip3Aa43 (HQ594534), Vip3Aa44 (HQ650163), Vip3Ab1 (AAR40284), Vip3Ab2 (AAY88247), Vip3Ac1 (Publicação do Pedido de US 20040128716), Vip3Ad1 (Publicação do Pedido de US 20040128716), Vip3Ad2 (CAI43276), Vip3Ae1 (CAI43277), Vip3Af1 (CAI43275), Vip3Af2 (ADN08753), Vip3Af3 (HM117634), Vip3Ag1 (ADN08758), Vip3Ag2 (FJ556803),Vip3Ag3 (HM117633), Vip3Ag4 (HQ414237), Vip3Ag5 (HQ542193), e Vip3Ah1 (DQ832323). Ainda em uma modalidade adicional, a proteína Vip3A compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, ou um seu homólogo ativo para nemátodos possuindo, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16. Em outra modalidade, a proteína Vip3A compreende a SEQ ID NO: 1 ou um homologo ativo para nemátodos possuindo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.

[00132] Em outra modalidade, o veículo agricolamente aceitável é uma planta ou parte de planta transgênica. Ainda em outra modalidade, a planta ou parte de planta transgênica é uma planta ou parte de planta de soja.

[00133] Em uma modalidade, a invenção engloba um método de produção de plantas ou parte de plantas resistentes a nemátodos compreendendo a introdução de uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína Vip3 na planta ou parte de planta produzindo desse modo uma planta ou parte de planta transgênica, em que a molécula de ácido nucleico causa a expressão de uma proteína Vip3 em uma quantidade que torna a planta ou parte de planta transgênica resistente a nemátodos.

[00134] Ainda em outra modalidade, a invenção engloba um método de redução do desenvolvimento de nemátodos císticos em raízes de uma planta infetada por um nemátodo, compreendendo introduzir nas células da planta uma molécula de ácido nucleico capaz de direcionar a expressão de uma proteína Vip3, reduzindo desse modo o desenvolvimento de nemátodos císticos nas raízes da planta.

[00135] A invenção também engloba um método para controlar ou prevenir o crescimento de nemátodos compreendendo fornecer uma praga de nemátodos com material vegetal compreendendo uma molécula de ácido nucleico heterólogo capaz de direcionar a expressão de uma proteína Vip3, em que o material vegetal inibe a atividade biológica dos nemátodos. Em outra modalidade, a atividade biológica é uma capacidade para produzir cistos em raízes de plantas. Ainda em outra modalidade, o material vegetal é uma planta ou parte de planta de soja.

[00136] Em outra modalidade, a invenção engloba um método para suprimir o crescimento de uma população de nemátodos patogênicos de plantas em uma localização capaz de suportar o referido crescimento compreendendo o crescimento no local da população de plantas de soja transgênicas compreendendo uma molécula de ácido nucleico heterólogo capaz de dirigir a expressão de uma proteína Vip3, em que a população de nemátodos patogênicos de plantas é suprimida.

[00137] A presente invenção também engloba vetores recombinantes e cassetes de expressão compreendendo sequências de ácido nucleico Vip3 da invenção. Em esses vetores, as sequências de ácido nucleico são preferencialmente compreendidas em cassetes de expressão compreendendo elementos reguladores para expressão da sequência de nucleotídeos Vip3 em uma planta hospedeira transgênica capaz de expressar a sequência de nucleotídeos. Esses elementos reguladores usualmente compreendem sinais de promotor e de terminação e preferencialmente também compreende elementos permitindo eficiente translação de polipeptídeos codificados pelas sequências de ácido nucleico da presente invenção. Vetores compreendendo as sequências de ácido nucleico são usualmente capazes de replicar em particular as células hospedeiras, preferencialmente as moléculas extracromossômicas, e são portanto usadas para amplificar as sequências de ácido nucleico desta invenção nas células hospedeiras. Em uma modalidade, as células hospedeiras para esses vetores são microorganismos, tais como bactérias, em particular E. coli. Em outra modalidade, as células hospedeiras para esses vetores recombinantes são endófitas ou epífitas. Um exemplo de uma célula hospedeira para esses vetores é uma célula eucariótica, tal como uma célula vegetal. Essas células vegetais podem ser células de soja ou células de milho. Em outra modalidade, esses vetores são vetores virais e são usados para replicação da sequência de nucleótidos em particular células hospedeiras, por exemplo células de inseto ou células vegetais. Vetores recombinantes são também usadas para transformação da sequência de nucleotídeos desta invenção nas células hospedeiras transgênicas, em que as sequências de nucleotídeos são estavelmente integradas no DNA dessas células hospedeiras transgênicas. Em uma, essas células hospedeiras transgênicas são células procarióticas. Em outra modalidade, essas células hospedeiras transgênicas são células eucarióticas, tais como células de levedura, células de inseto, ou célula vegetais. Ainda em outra modalidade, as células hospedeiras transgênicas são células vegetais, tais como células de soja ou células de milho.

[00138] A presente invenção engloba ainda uma cassete de expressão compreendendo um promotor de actina ligada de modo operacional a uma sequência de codificação de Vip3 ligada de modo operacional a um terminador, em que a cassete de expressão funciona em uma planta transgênica para dirigir a expressão de uma proteína Vip3 a uma quantidade eficaz de controle de nemátodos. Em outra modalidade, o promotor de actina é um promotor de actina2 e o terminador é um terminador NOS. Ainda em outra modalidade, a sequência codificando Vip3 compreende uma sequência de nucleótidos cujo complemento hibridiza com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17 sob condições de alto rigor. Em uma outra modalidade, as condições de alto rigor são dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50°C com lavagem em 0,1XSSC, 0,1% SDS a 65°C. Em outra modalidade, a proteína Vip3 compreende a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16, ou um seu homólogo ativo para nemátodos possuindo, pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16. Em outra modalidade, a proteína Vip3A compreende a SEQ ID NO: 1 ou um homologo ativo para nemátodos possuindo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.

[00139] Em modalidades adicionais, a sequência de nucleotídeos Vip3 da invenção pode ser modificada pela incorporação de mutações aleatórias em uma técnica conhecida como recombinação in vitro ou arranjo combinatório de ADN para aumentar a atividade dos nemátodos. Por exemplo. Essa técnica é descrita em Stemmer e outros., Nature 370:389 a 391 (1994) e US 5,605,793, as quais são incorporadas no presente documento por referência. Milhões de cópias mutantes de uma sequência de nucleotídeos são produzidos com base na sequência de nucleotídeos original desta invenção e variantes com propriedades melhoradas, assim como são recuperados o aumento atividade nematicida, a estabilidade aumentada, ou especificidade ou gama diferente da praga de nemátodos alvo. O método engloba formar um polinucleotídio de cadeia dupla mutagenizado a partir de um polinucleotídio de cadeia dupla modelo compreendendo a sequência de nucleotídeos desta invenção, em que o modelo de polinucleotídio de cadeia dupla foi clivado em fragmentos de cadeia dupla aleatórios de um tamanho desejado, e compreende os passos de adição à população resultante fragmentos aleatórios de cadeia dupla uma ou mais oligonucleotídios de cadeia simples ou dupla, em que os referidos oligonucleotídios compreendem uma área de identidade e uma área de heterologia para o polinucleotídio de cadeia dupla modelo; desnaturação da mistura resultante de fragmentos aleatórios de cadeia dupla e oligonucleotídios em fragmentos de cadeia simples; incubação da população resultante de fragmentos de cadeia simples com uma polimerase sob condições que resultam no emparelhamento de referidos fragmentos de cadeia simples na referida área de identidade de modo a formar pares de fragmentos recombinados, as referidas áreas de identidade sendo suficiente para um membro de um par iniciar a replicação do outro, formando assim um polinucleotídio de cadeia dupla mutagenizado; e repetindo os segundo e terceiro passos durante pelo menos mais dois ciclos, em que a mistura resultante do segundo passo de um outro ciclo inclui o polinucleótido de cadeia dupla mutagenizado a partir do terceiro passo do ciclo anterior, e o outro ciclo forma um outro polinucleotídio de cadeia dupla mutagenizado. Em uma modalidade preferencial, a concentração de uma única espécie de fragmento aleatório de cadeia dupla na população de fragmentos aleatórios de filamento duplo é menor do que 1% em peso do DNA total. Em uma outra modalidade, a cadeia dupla mutagenizada modelo compreende pelo menos cerca de 100 espécies de polinucleotídios. Em outra modalidade preferencial, o tamanho dos fragmentos aleatórios de cadeia dupla é de cerca de 5 pb a 5 kb. Em outra modalidade, o quarto passo do método compreende repetir o segundo e o terceiro passos durante pelo menos 10 ciclos.

[00140] Em outra modalidade, pelo menos uma das sequências de nucleotídeos Vip3 da invenção é inserida em uma cassete de expressão apropriada, compreendendo um promotor e sinais de terminação.
A expressão da sequência de nucleotídeos é constitutiva, ou é usado um promotor induzível respondendo a vários tipos de estímulos para iniciar a transcrição. Em uma modalidade preferida, a célula na qual a toxina é expressa é um microorganismo, tal como um vírus, a bactérias, ou a fungo. Em uma modalidade preferida, um vírus, tal como a baculovírus, contém uma sequência de nucleotídeos da invenção no seu genoma e expressa grande quantidade da correspondente toxina inseticida após infeção de células eucarióticas apropriadas que são adequadas para a replicação de vírus e expressão da sequência de nucleotídeos. A toxina inseticida assim produzida é usada como um agente inseticida. Em alternativa, baculovirus modificados para incluir a sequência de nucleotídeos são usados para infetar insetos in vivo e matá-los tanto através da expressão de uma toxina inseticida ou através da combinação de infeção viral e expressão de uma toxina inseticida.

[00141] As células bacterianas são também hospedeiras para a expressão da sequência de nucleotídeos da invenção. Em uma modalidade preferencial, são usadas bactérias simbióticas não patogênicas, que são capazes de viver e se replicar no interior de tecidos vegetais, chamadas de endófitas, ou bactérias simbióticas não patogênicas, que são capazes de colonizar a filosfera ou a rizosfera, chamadas de epífitas. Tais bactérias incluem bactérias do gênero Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces e Xanthomonas. Fungos simbióticos, tais como Trichoderma e Gliocladium são também hospedeiros possíveis para expressão da sequência de nucleotídeos da invenção para o mesmo fim.

[00142] Técnicas para estas manipulações genéticas são específicas para os diferentes hospedeiros disponíveis e são conhecidas na arte. Por exemplo, os vetores de expressão pKK223-3 e pKK223-2 podem ser usados para expressar genes heterólogos em E. coli, tanto em fusão de transcrição ou tradução, atrás do promotor tac ou trc. Para a expressão de operons que codificam múltiplas ORFs, o procedimento mais simples é inserir o operon em um vetor como pKK223-3 em fusão de transcrição, permitindo que o sítio de ligação de ribossomo cognato dos genes heterólogos seja usado. Técnicas para sobre expressão em espécies gram-positivas tal como Bacillus são também conhecidas na arte e podem ser usadas no contexto desta invenção (Quax e outros Em:Industrial Microorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al., American Society for Microbiology, Washington (1993)). Sistemas alternativos para sobre expressão dependem por exemplo, nos vetores de levedura e incluem o uso de Pichia, Saccharomyces e Kluyveromyces (Sreekrishna, Em:Industrial microorganisms:basic and applied molecular genetics, Baltz, Hegeman, e Skatrud eds., American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology L2:173-177 (1994); van den Berg et al., Biotechnology 8:135-139 (1990)).

[00143] Em uma modalidade, pelo menos uma proteína Vip3 da invenção é expressa em um organismo superior, por exemplo, uma planta. Neste caso, as plantas transgênicas expressando quantidades eficazes das toxinas protegem-se a si mesmas da praga de nemátodos. Quando os nemátodos começam a alimentar-se nessa planta transgênica, podem também ingerir a toxina Vip3 expressa. Isso pode dissuadir os nemátodos de se alimentarem do tecido vegetal, pode prejudicar ou matar os nemátodos ou podem reduzir a capacidade dos nemátodos para se reproduzirem. Uma sequência de nucleotídeos da presente invenção é inserida em uma cassete de expressão, a qual é depois preferencialmente integrada estavelmente no genoma da planta. Plantas transformadas de acordo com a invenção podem ser monocotiledôneas ou dicotiledôneas e incluem, mas não são limitadas a, milho, trigo, cevada, centeio, batata doce, feijão, ervilha, chicória, alface, repolho, couve-flor, brócoli, nabo, rábano, espinafre, aspargo, cebola, alho, pimento, aipo, abobora-menina, abóbora, cânhamo, abobrinha, maçã, pera, marmelo, melão, ameixa, cereja, pêssego, nectarina, damasco, morango, uva, framboesa, amora, ananás, abacate, papaia, manga, banana, soja, tomate, sorgo, cana-de-açúcar, beterraba sacarina, girassol, colza, trevo, tabaco, cenoura, algodão, alfafa, arroz, batata, beringela, pepino, Arabidopsis, e plantas lenhosas tais como coníferas e árvores de folha caduca.

[00144] Uma vez que uma sequência de nucleotídeos desejada tenha sido transformada em uma espécie de plantas particulares, pode ser propagada nessas espécies ou movida para outras variedades da mesma espécie, particularmente incluindo variedades comerciais, usando técnicas de hibridização tradicionais.

[00145] A sequência de nucleotídeos da invenção é expressada nas plantas transgênicas, causando assim a biossíntese da toxina correspondente à toxina nas plantas transgênicas. Deste modo, são geradas plantas transgênicas com resistência aumentada a nemátodos. Para a sua expressão nas plantas transgênicas, as sequências de nucleotídeos da invenção podem requerer modificação e otimização. Apesar de, em muitos casos, os genes dos organismos microbianos poderem ser expressados nas plantas a níveis elevados sem modificação, a baixa expressão nas plantas transgênicas pode resultar pela sequência microbiana dos nucleotídeos possuindo códons que não são preferidos nas plantas. Sabe-se, na arte, que todos os organismos têm preferência específicas para o uso de códon, e os códons das sequências de nucleotídeos descritos nesta invenção podem ser mudados para se ajustarem às preferências das plantas, enquanto mantêm os aminoácidos codificados desse modo. Mais adicionalmente, a alta expressão em plantas é alcançada de forma mais satisfatória através de sequências de codificação que têm pelo menos cerca 35% de teor de GC, de preferência, mais que cerca de 45%, mais preferencialmente, mais que cerca de 50%, e com máxima preferência, mais que cerca de 60%. Embora as sequências de genes preferidas possa ser adequadamente expressa tanto em espécies de plantas monocotiledôneas como dicotiledôneas, as sequências podem ser modificadas para explicar as preferências específicas de códon e o conteúdo preferido em GC de monocotiledôneas ou dicotiledôneas dado que estas preferências têm demonstrado diferir (Murray e outros Nucl. Acids Res. 17:477-498 (1989)). Adicionalmente, a sequência de nucleotídeos são testados quanto à existência de locais de junção ilegítimos que pode causar mensagem de truncamento. Todas as alterações que devem ser feitas dentro da sequência de nucleotídeos tais como as descritas acima são feitas usando técnicas bem conhecidas de mutagênese dirigida ao sítio, PCR, e construção de gene sintético usando os métodos conhecidos na arte.

[00146] Em uma modalidade da invenção genes sintéticos são feitos de acordo com o procedimento descrito na US 5,625,136, aqui incorporada por referência. Nesse procedimento, são usados os códons preferidos de milho, isto é, é usado o único códon que codifica mais frequentemente aquele aminoácido em milho. O códon preferido de milho para um aminoácido particular pode ser derivado, por exemplo, partindo de sequências de genes conhecidos do milho. O uso de códons de milho por 28 genes de plantas de milho encontra-se em Murray e outros., Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989), a divulgação da qual é aqui incorporada como referência. Uma especificamente exemplificada sequência da invenção sintética feita com códons de milho otimizados é estabelecido em SEQ ID NO:2.

[00147] Dessa maneira, a sequência de nucleotídeos pode ser otimizada para a expressão em qualquer planta. Reconhece-se que toda ou qualquer parte da sequência de gene pode ser otimizada ou sintética. Ou seja, as sequências parcialmente otimizadas ou sintéticas também podem ser suadas.

[00148] Para iniciação eficaz de tradução, as sequências adjacentes à metionina de iniciação podem exigir modificação. Por exemplo, as mesmas podem ser modificadas pela inclusão de sequências conhecidas pode serem eficazes em plantas. Joshi sugeriu que consenso apropriado para plantas (NAR 15:6643-6653 (1987)) e Clonetech sugere um iniciador de tradução consensual adicional (catálogo 1993/1994, página 210). Estes consensos são adequados para utilização com a sequência de nucleotídeos desta invenção. As sequências são incorporados em construções compreendendo a sequência de nucleotídeos, até e incluindo a ATG (deixando o segundo aminoácido não modificado), ou em alternativa até e incluindo a subsequente GTC a ATG (com a possibilidade de modificar o segundo aminoácido do transgene).

[00149] Os genes da toxina Vip3 da invenção, como a sua sequência nativa ou como sequências sintéticas otimizadas como descrito acima, podem ser operacionalmente fundido a uma vários promotores para a expressão em plantas incluindo constitutiva, induzível, temporariamente regulada, regulada de modo desenvolvente, regulada quimicamente, preferida por tecido e promotores específicos de tecidos para preparar moléculas de DNA recombinante,isto é, genes quiméricos. A escolha do promotor irá variar dependendo dos requisitos espaciais e temporais para expressão. Assim, a expressão da sequência de nucleotídeos codificando as proteínas Vip3 da invenção pode ser atingida em folhas, em talos ou caules, em aurículas, em inflorescências (por exemplo picos, panículas, espigas, etc.), em raízes, e/ou plântulas, mas particularmente preferida para controle de nemátodos é a expressão em raízes. Em muitos casos, no entanto, proteção contra mais do que um tipo de pragas de nemátodos é procurada, e assim, é desejável a expressão em vários tecidos. Embora muito promotores de dicotiledôneas tenham mostrado ser operacionais em monocotiledôneas e vice versa, os promotores de dicotiledôneas idealmente são selecionados para expressão em dicotiledôneas, e os promotores de monocotiledôneas para expressão em monocotiledôneas. No entanto, não há restrição para a proveniência dos promotores selecionados; basta que eles sejam operacionais na condução de uma expressão da sequência de nucleotídeos da invenção na célula desejada.

[00150] Promotores constitutivos incluem por exemplo o promotor Actina 2 (An e outros (1996) Plant J 10(1):107-21). Adicionalmente, um promotor útil na presente invenção pode ser derivada de qualquer um dos vários genes de actina, que são expressos na maior parte dos tipos de células. As cassetes de expressão de promotor descritas por McElroy e outros (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)) pode ser modificado para a expressão do novo gene da toxina e e são particularmente adequados para uso em hospedeiras monocotiledóneas.

[00151] Ainda um outro promotor constitutivo é derivado de ubiquitina, que é um outro produto de gene conhecido por se acumular em muitos tipos de células. O promotor da ubiquitina foi clonado a partir de várias espécies para uso em planta transgênicas, por exemplo, girassol (Binet et al., 1991. Plant Science 79: 87-94), milho (Christensen et al., 1989. Plant Molec. Biol. 12: 619-632), e arabidopsis (Norris e outros1993. Plant Molec. Biol. 21:895-906). O promotor da ubiquitina do milho foi desenvolvido em sistemas de monocotiledóneas transgênicas e a sua sequência e vetores construídos para a transformação de monocotiledôneas e são divulgados na publicação da patente EP 0 342 926. O promotor da ubiquitina é adequado para a expressão do novo gene da toxina em plantas transgênicas, especialmente monocotiledôneas.

[00152] Promotores preferenciais de tecidos ou específicos de tecidos úteis para a expressão dos novos genes da toxina da invenção em plantas, particularmente milho, são os que dirigem a expressão em raiz, medula, folha ou pólen. Tais promotores são divulgados na WO 93/07278, aqui incorporados integralmente como referência. Outros promotores específicos de tecidos úteis na presente invenção incluem o promotor da rubisco do algodão divulgado em US 6,040,504; o promotor da sintase da sacarose do arroz divulgado na US 5,604,121; e o promotor do vírus do enrolamento da folha do cestro amarelo divulgado na WO 01/73087, todas aqui incorporadas por referência. Promotores quimicamente induzidos úteis para direcionar a expressão do novo gene da toxina em plantas são divulgados na US 5,614,395 aqui incorporada integralmente como referência.

[00153] A sequência de nucleotídeos da invenção pode também ser expressada sob a regulação de promotores que são regulados quimicamente. Isto permite que as toxinas Vip3 sejam sintetizadas somente quando as plantas de cultivo são tratadas com os produtos químicos indutores. Um exemplo de um promotor para a indução química é o promotor PR-1a pormenorizado na US 5,614,395, aqui incorporada como referência.

[00154] Uma outra categoria de promotores úteis na invenção é aquele que é induzível por ferida. Foram descritos inúmeros promotores que são expressos em sítios de ferimento e também em sítios de infeção fitopatogênica. Idealmente, um tal promotor só deve ser ativo localmente nos locais de infeção, e deste modo as toxinas inseticidas só se acumulam nas células que precisam de sintetizar as toxinas inseticidas para matar a praga de insetos invasora. Exemplos de promotores deste tipo incluem esses descritos por Stanford e outros Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu e outros Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann e outros Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek e outros Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), e Warner e outros Plant J. 3:191 a 201 (1993).

[00155] Padrões de expressão específica do tecido incluem os específicos de tecido verde, específicos da raiz, específicos da haste, e específicos da flor. Promotores adequados para a expressão em tecido verde incluem muitos que regulam genes envolvidos na fotossíntese e muitos deles foram clonados a partir tanto de monocotiledôneas e dicotiledôneas. Um promotor preferido é o promotor de milho PEPC a partir do gene da carboxilase de fosfoenol (Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12:579-589 (1989)). Um promotor preferido para a expressão específica de raiz é o descrito por de Framond (FEBS 290:103- 106 (1991); EP 0 452 269 da Ciba-Geigy). Um promotor específico de haste preferido é o descrito na US 5,625,136 (da Ciba-Geigy) e que conduz a expressão do gene trpA de milho.

[00156] Outras modalidades da invenção são plantas transgênicas expressando a sequência de nucleotídeos de um modo induzível por ferida ou de um modo induzível por nemátodos.

[00157] Adicionalmente à seleção de um promotor adequado, as construções para a expressão de uma toxina inseticida em plantas exigem um terminador de transcrição adequado para ser ligado a jusante da sequência de nucleotídeos heteróloga. Vários desses terminadores estão disponíveis e são conhecidos na arte (por exemplo tml de CaMV, E9 de rbcS). Qualquer terminador disponível conhecido por funcionar em plantas pode ser usado no contexto dessa invenção.

[00158] Inúmeras outras sequências podem ser incorporadas em cassetes de expressão descritas nesta invenção. Essas incluem sequências que mostraram intensificar a expressão como sequências de íntrons (por exemplo, de Adhl e bronzel) e sequências líder virais (por exemplo, de TMV, MCMV e AMV).

[00159] Pode ser útil visar a expressão da sequência de nucleotídeos da invenção para diferentes localizações celulares na planta. Em alguns casos, a localização no citossol pode ser desejável, enquanto que, em outros casos, a localização em alguma organela subcelular, pode ser preferencial. A localização subcelular de enzimas codificadas por transgene é feita usando técnicas bem conhecidas na arte. Normalmente, o DNA que codifica para o peptídeo alvo de um produto de gene conhecido direcionado para o organelo é manipulado e fundido a montante da sequência de nucleotídeos. Muitas dessas sequências alvo são conhecidas pelo cloroplasto e foi mostrado o seu funcionamento em construções heterólogas. A expressão da sequência de nucleotídeos da presente invenção é também direcionada para o retículo endoplasmático ou para os vacúolos das células hospedeiras. As técnicas para alcançar isso são bem conhecidas na técnica.

[00160] Numerosos vetores de transformação disponível para a transformação de planta são conhecidos por aqueles habilitados na técnica de transformação de planta e as moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser usadas em conjunção com qualquer um desses vetores. A seleção de vetor dependerá da técnica de transformação preferencial e da espécie de planta alvo para a transformação. Para determinadas espécies alvo, diferentes marcadores de seleção de antibiótico ou herbicida podem ser preferidas. Os marcadores de seleção usados por rotina na transformação incluem o gene nptII, que confere resistência à canamicina e antibióticos relacionados (Messing & Vierra., 1982. Gene 19: 259-268; e Bevan et al., 1983. Nature 304:184- 187), o gene bar, que confere resistência ao herbicida fosfinotricina (White et al., 1990. Nucl. Acids Res 18: 1062, e Spencer et al., 1990. Theor. Appl. Genet 79: 625-631), o gene hph, o qual confere resistência ao antibiótico higromicina (Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931), e o gene dhfr, o qual confere resistência ao metatrexato (Bourouis et al., 1983. EMBO J. 2(7): 1099-1104), o gene EPSPS, o qual confere resistência ao glifosato (US Nos. 4,940,935 e 5,188,642), e o gene manose-6-fosfato isomerase, o qual fornece a capacidade de metabolizar a manose (US Nos. 5,767,378 e 5,994,629). A escolha de marcador selecionável não é, no entanto, crítica para a invenção.

[00161] Em outra modalidade, a sequência de nucleotídeos da invenção é transformada direitamente no genoma do plastídio. Uma grande vantagem da transformação plastídio que é plastídios são geralmente capazes de expressar os genes bacterianos sem modificação substancial, e plastídios são capazes de expressar vários quadros de leitura abertos sob o controle de um único promotor. A tecnologia de transformação plastídios é extensivamente descrita nas US 5,451,513, US 5,545,817, e US 5,545,818, no Pedido PCT no. WO 95/16783, e em McBride e outros (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305. A técnica básica para a transformação de cloroplastos envolve as regiões de introdução de DNA de plastídio clonado flanqueando um marcador selecionável juntamente com o gene de interesse em um tecido alvo adequado, por exemplo, usando transformação biolística ou de protoplastos (por exemplo, transformação mediada por cloreto de cálcio ou PEG). As regiões de flanqueamento 1 a 1,5 kb, denominadas sequências de alvejamento, facilitam recombinação homóloga com o genoma de plastídio e, deste modo, permitem a substituição ou modificação de regiões específicas do plastoma. Inicialmente, as mutações pontuais no rRNA 16S de cloroplasto e genes rps12 que conferem resistência à espectinomicina e/ou estreptomicina são utilizados como marcadores selecionáveis para transformação (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., e Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526- 8530; Staub, J. M., e Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). Isso resultou em transformantes homoplásmicos estáveis a uma frequência de aproximadamente um por 100 bombardeamentos de folhas alvo. A presença de sítios de clonagem entre esses marcadores permitiu criação de um vetor de alvejamento de plastídio para introdução de genes estrangeiros (Staub, J.M., e Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601 a 606). Aumentos substanciais na frequência de transformação são obtidos por substituição de genes de resistência a antibióticos de r-proteína ou rRNA recessivo com um marcador de seleção dominante, o gene bacteriano aadA a enzima de destoxificação da espectinomicina aminoglicosido-3'-adeniltransferase (Svab, Z., e Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917). Anteriormente, esse marcador foi usado com sucesso para transformação de alta frequência do genoma de plastídio de alga verde Chlamydomonas reinhardtii (GoldschmidtClermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089). Outros marcadores selecionáveis úteis para transformação de plastídio conhecidos na técnica e abrangidos pelo escopo da invenção. Tipicamente, aproximadamente 15 a 20 ciclos de divisão de célula seguintes à transformação são necessários para alcançar um estado homoplastídico. A expressão de plastídio, na qual os genes são inseridos através de recombinação homóloga em todas dentre as diversas cópias do genoma de plastídio circular presente em cada célula de planta, tem a vantagem sobre o enorme número de cópias de genes expressos nucleares para permitir níveis de expressão que podem prontamente exceder 10% da proteína de planta solúvel total. Em uma modalidade preferida, a sequência de nucleotídeos da presente invenção é inserida em um vetor visando o plastídio e transformada no genoma do plastídio de uma planta hospedeira desejada. Plantas homoplásticas para genomas de plastídio contendo uma sequência de nucleotídeos da presente invenção são obtidas, e são preferencialmente capazes de alta expressão da sequência de nucleotídeos.

[00162] Será evidente para o habilitado na arte que as proteínas Vip3 da invenção podem ser usadas em combinação com outros agentes nematicidas tais como proteínas, produtos químicos, outros produtos naturais e afins. Exemplos não limitativos desses produtos químicos e produtos naturais incluem abamectina, nematicidas carbamato selecionados partindo de aldicarb, carbofurano, carbosulfano, oxamila, aldoxicarb, etoprop benomila, e alanicarb; nematicidas organofosforados selecionados partindo de fenamifos, fenamifos, fensulfotiona, terbufos, fostiazato, fosfocarb, diclofentiona, isamidofos, fostietano, isazofos, etoprofos, cadusafos, clorpirifos, heterofos, isamidofos, mecarfon, forato, tionazina, triazofos, diamidafos, e fosfamidona; brometo de metilo, iodeto de metilo, dissulfeto de carbono, 1,3-dicloropropeno, cloropicrina, citoquininas, dazomet, DCIP, dibrometo de etileno, GY-81, metam, isocianato de metila, composição de myrothecium verrucaria, e flupirazofos, benclotiaz, O-etil S-propil éster do ácido [2-cianoimino-3- etilimidazolidin-1-il]fosfonotióico.

[00163] Avermectinas e derivados de avermectinas para uso na invenção são conhecidas. Abamectina e as formulações de tratamento de sementes para controle de nemátodos que são particularmente úteis na invenção são divulgadas, por exemplo, na Pat. U.S. No. 6,875,727. Sais agroquimicamente compatíveis são, por exemplo, sais de adição de ácido de ácidos orgânicos e inorgânicos, em particular de ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido oxálico, ácido malônico, ácido toluenossulfônico ou ácido benzóico. Exemplos de formulações de compostos de avermectina que podem ser usados no método de acordo com a invenção, isto é, soluções, grânulos, pós, pós pulverizáveis, concentrados de emulsão, grânulos revestidos e concentrados para suspensão, foram descritos, por exemplo, na EP-A-580 553.

[00164] Os derivados de avermectina ou abamectina podem ser obtidos por meio de sínteses químicas convencionais. Por exemplo, podem ser usados em algumas modalidades de emamectina, a qual é 4''-De-oxi-4''-epi-N-metillamino avermectina B.sub.1b/B.sub.1a conhecida da Pat. U.S. No. 4,874,749. Sais agroquimicamente úteis de emamectina são adicionalmente descritos, por exemplo, na Pat. U.S. No. 5,288,710.

[00165] A quantidade de um nematicida presente (ou aderido) às sementes varia, por exemplo, de acordo com o tipo de plantação, e tipo de material de propagação de plantas. No entanto, a quantidade é tal que, pelo menos, um nematicida é uma quantidade eficaz para fornecer a desejada ação melhorada e pode ser determinada por experimentação de rotina e ensaios de campo. Na hipótese de o nematicida ser abamectina, a quantidade de ingrediente ativo abamectina presente no revestimento de sementes é em uma gama de desde 0,002 até 1,2 mg/semente, tipicamente pelo menos 0,1 mg/semente, frequentemente pelo menos 0,2 mg/semente. Frequentemente, a abamectina está presente a um nível de 0,3 mg ou mais por semente.

[00166] Parasitas bacterianos podem também ser usados como agentes antagonistas de biocontrole de nemátodos. Estes incluem, por exemplo, espécies de Pasteuria, por exemplo, P. penetrans, P. nishizawae, P. thornei, Candidatus Pasteuria usgae sp. nov., Myrothecium verrucaria, Candidatus Pasteuria sp. estirpe HG, e outras espécies. Estes parasitas podem conectar-se à cutícula dos nemátodos.

[00167] As toxinas nematicidas Vip3 da invenção podem ser usadas em combinação com as toxinas Bt Cry ou outros princípios pesticidas para aumentar a gama de pragas alvo. Essas toxinas Bt Cry incluem por exemplo Cry1, Cry 5, Cry6, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry21 e Cry22. Além disso, a utilização das toxinas Vip3 nematicida da invenção em combinação com as endotoxinas Bt δ ou outros princípios pesticidas de uma natureza distinta têm particular utilidade para a prevenção e/ou gestão da resistência a nemátodos.

EXEMPLOS

[00168] A invenção será adicionalmente descrita com referência aos exemplos detalhados a seguir. Esses exemplos são fornecidos para propósitos de ilustração apenas, e não se destinam a ser limitadores, a menos que seja especificado de outro modo. Técnicas de clonagem molecular e DNA recombinante padrão usadas aqui são bem conhecidas na técnica e são descritas por Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Inc. (1994); J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); e por T.J. Silhavy, M.L. Berman e L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).

Exemplo 1: Construção de cassetes de expressão

[00169] Uma sequência de codificação Vip3A (SEQ ID NO: 2) foi clonada em uma cassete de expressão act2:Vip3A:tNOS. A cassete de expressão com a sequência de codificação Vip3A foi então clonado em um vetor binário para criar o vetor pKS214 (SEQ ID NO: 18).

Exemplo 2: Expressão Vip3 em Raízes de Soja Transgênica

[00170] O vetor de expressão binário pKS214 contendo um gene Vip3A e um vetor vazio (sem a sequência de codificação Vip3A) foram transformados nas raízes de soja para testar a capacidade da pKS214 para reduzir nemátodos císticos da soja (SCN) a cistos como transgenes. A cultivar de soja Williams 82 foi usada como o germoplasma para a transformação de raízes pilosas. Sementes de soja foram germinadas em ágar a 1% contendo sacarose a 0,5% em placas de Petri a 27 °C durante 5 dias. Os cotilédones foram depois cortados das plântulas, e a superfície lesada foi inoculada com culturas de Agrobacterium rhizogenes carregando o vetor binário. Os cotilédones foram colocados em ágar a 1% durante 6 dias e depois transferidos para meio de seleção. Em cerca de duas semanas, os eventos de raízes pilosas transgênicas independentes induzidos a partir dos cotilédones foram colhidos e transferidos para meio de cultura, e cultivados no escuro a 27 °C. Narayanan e outros indicaram que os fenótipos de resistência SCN na planta completa foram preservados nas raízes transgênicas, por conseguinte o sistema de raízes pilosas transgênicas é útil para avaliar os genes candidatos de resistência SCN. Narayanan e outros (1999) Crop Science 39, 1680-1686.

[00171] Aproximadamente duas semanas depois da transferência para as placas de cultura, as raízes pilosas transformadas foram inoculadas com nemátodos císticos de soja do estágio J2 com superfície esterilizada (SCN J2) e as raízes foram crescidas no escuro a 27 °C, o que permitiu a formação de cistos nos eventos de raízes pilosas. Um mês após a inoculação dos nemátodos, os número de cistos foi determinado para ambas as raízes expressando Proteína Vip3 e as raízes expressando o vetor vazio (como um controle negativo).

[00172] O experimento foi repetido cinco (5) vezes. A Tabela 1 e a Figura 1 mostram o resumo da comparação do número médio de cistos. Teste de ANOVA indicaram que o número médio de cistos formados nas raízes de soja transgênica expressando a Proteína Vip3 é significativamente menor que nas raízes de soja transgênica compreendendo o vetor vazio de controle (p<0,05).

Exemplo 2: Produção de Soja Transgênica Expressando a Proteína Vip3

[00173] A transformação de soja para produzir plantas de soja transgênicas é realizada utilizando alvos imaturos de sementes de variedade Williams 82 através de transformação mediada por A. tumefaciens. Os materiais de explante e as receitas dos meios foram essencialmente como descrito em Hwang e outros (Publicação Internacional da PCT No. WO 08/112044) e Que e outros (Publicação Internacional da PCT No. WO 08/112267), como algumas variações como notado abaixo. Usando este método, os elementos genéticos dentro das regiões do limite à esquerda e à direita do plasmídeo de transformação são eficazmente transferidos e integrados no genoma da célula de planta, enquanto os elementos genéticos fora destas regiões do limite não são geralmente transferidos.

[00174] As vagens de soja maduras são colhidas das plantas cultivadas em estufa, esterilizadas com solução de lixívia diluída, e enxaguadas com água esterilizada. As sementes imaturas são em seguida retiradas das vagens e enxaguadas rapidamente com água esterilizada. Os explantes são preparados a partir de sementes imaturas esterilizadas conforme descrito em Hwang e outros (Publicação Internacional da PCT No. WO 08/112044) e infetadas com A. tumefaciens estirpe EHA101, albergando o vetor binário de transformação 18963 e deixada a incubar durante um adicional de 30 até 240 minutos. O excesso de suspensão de A. tumefaciens é removido por aspiração e os explantes são transferidos para placas contendo um meio de co-cultura não seletivo. Os explantes são co-cultivados com o A. tumefaciens restante a 23 °C durante 4 dias no escuro e depois transferido para meio de regeneração e recuperação suplementado com uma mistura de antibióticos consistindo em ticarcilina (75 mg/L), cefotaxima (75 mg/L) e vancomicina (75 mg/L) onde são incubados no escuro, durante sete dias

[00175] Os explantes são, em seguida, transferidos para meio de regeneração contendo higromicina B (3 a 6 mg/L) e uma mistura de antibióticos consistindo em ticarcilina (75 mg/L), cefotaxima (75 mg/L) e vancomicina (75 mg/L) para inibir e matar a A. tumefaciens. O alongamento do rebento e a regeneração é realizada em meios de alongamento contendo 2–4 mg/L de higromicina B. O gene higromicina fosfor-transferase (HPT) foi usado como um marcador selecionável durante o processo de transformação. Plântulas regeneradas são transplantadas no solo conforme descrito (Publicação Internacional da PCT No. WO 08/112267) e quanto à presença de sequências promotoras HPT e CMP usando análise de PCR TaqMan. Ingham e outros (2001) Biotech 31, 132-140. Este rastreio permite a seleção de eventos transgênicos que carregam o T-ADN e estão isentos de ADN do vetor. Plantas positivas em relação ao gene HPT e sequências CMP e negativas para o gene espectinomicina (spec) são transferidas para a estufa para análise de expressão de miRNA e configuração de sementes.

[00176] Quando as raízes têm cerca de 2–3 polegadas, são então transferidas para potes de 1 galão usando solo Fafard #3 e 30 gramas de Osmocote Plus 15–9–12 incorporado. São regadas abundantemente e colocadas no cubículo sob iluminação florescente ajustada para um dia de 16 horas. As temperaturas são 85 °F (29,4 °C) durante o dia e 70 °F (21 °C) à noite. As plantas são regadas uma vez por dia.

[00177] As plantas permanecem no cubículo até a amostragem secundária Taqman ter sido realizada, tipicamente 1-2 semanas. As plantas são então colocadas em um sistema automático de irrigação por gotejamento e regadas duas vezes por dia. É colocada uma gaiola sobre a planta, e esta pode ser podada muito ligeiramente, se necessário. A iluminação é uma combinação de equipamentos de iodetos metálicos e vapor de sódio com lâmpadas de 400 e 1000 watts com um período de 10 horas de dia. A parede exterior é escurecida para conter a luz que iria alargar a duração do dia. As temperaturas são estabelecidas a 79°F (26°C) durante o dia e 70°F (21°C) durante a noite.

A umidade é a ambiente.

[00178] As plantas são mantidas desta forma até as vagens atingirem a maturidade, aproximadamente 100 dias, com base na data da seleção Taqman. As vagens são então colhidas, colocadas em um saco de papel, secas ao ar durante 2 dias e, em seguida, secas à máquina a 80 °F (27 °C) durante mais 2 dias. As vagens são descascadas e as sementes da T1 são colhidas e armazenadas a 4 °C até serem adicionalmente testadas.

Exemplo 3: Análise de Plantas de Soja Transgênicas

[00179] As plantas de soja foram transformadas com um dos três vetores binários, 1) vetor 19993 compreendendo uma cassete de expressão com um promotor actina 2 de Arabidopsis ligado de modo operacional a uma sequência de codificação Vip3A o qual está ligado de modo operacional a um terminador da nopalina sintetase (prAct2:Vip3A:tNOS); ou 2) vetor 20048 compreendendo uma cassete de expressão com um promotor de Medicago truncatula Mt51186 ligado de modo operacional a uma sequência de codificação Vip3A a qual está ligada de modo operacional a um terminador da nopalina sintetase (prMt51186:Vip3A:tNOS); ou 3) um vetor compreendendo uma cassete de expressão com um promotor de vírus cestrum ligado de modo operacional a uma sequência de codificação de Vip3A a qual está ligada de modo operacional um terminador da nopalina sintetase (cmp:Vip3A:tNOS). As plantas T1 de soja transgênicas e as plantas controle são inoculadas com nemátodos cistiscos da soja do estágio J2 (SCN J2). Resumidamente, plântulas com 1-3 semanas de idade da geração T1 de soja transgênica que são ou homozigóticas (Hom) ou heterozigóticas (Het) em relação ao gene Vip3 ou segregantes nulos (isto é não compreendem um gene Vip3; Nulo) foram cultivadas em bolsas de germinação e inoculadas com uma suspensão de nemátodos císticos do estágio J2 da soja ao nível de 750 J2 por planta. Aproximadamente um mês após a inoculação de nemátodos, o número de cistos é determinada para as plantas transgênicas compreendendo a cassete de expressão Vip3 e para os segregantes nulos dos mesmos parentais T0.

[00180] Os resultados apresentados na Tabela 2 demonstram que soja T1 transgênica expressando a Proteína Vip3 reduziu número de cistos SCN em relação ao segregante nulo (controle negativo). As plantas transformadas compreendendo a cassete de expressão cmp:Vip3A:nos não têm um número de cistos reduzido em relação ao segregante nulo.

[00181] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nessa memória descritiva são indicativos do nível de conhecimento dos especialistas na técnica à qual essa invenção é pertinente. Todas as publicações e pedidos de patente são incorporados no presente documento por citação ao mesmo ponto como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado como referência.

[00182] Deve ficar entendido que os exemplos e modalidades descritas no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz das mesmas serão sugeridas para pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas no espírito e no alcance desse pedido e no escopo das reivindicações anexas.

Claims (11)

1. Método para controle de uma praga de nemátodos, caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato a praga de nemátodos com uma proteína Vip3 compreendendo SEQ ID NO: 1.
2. Método para controlar uma praga de nemátodos, caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato a praga de nemátodos com uma planta ou parte de planta transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico heteróloga, que dirige a expressão de uma proteína Vip3 na planta ou parte da planta transgênica, sendo que a referida molécula de ácido nucleico heteróloga compreende SEQ ID NO: 2, sendo que a proteína Vip3 compreende SEQ ID NO: 1, e sendo que a planta ou parte de planta transgênica controla a praga de nemátodos em relação a uma planta ou parte de planta do mesmo tipo que não expressa a proteína Vip3.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o nemátodo é selecionado do grupo consistindo em Criconemella, Ditylenchus, Globodera, Helicotylenchus, Heterodera, Longidorus, Meloidogyne, Paratrichodorus, Pratylenchus, Radolpholus, Rotelynchus, Rotylenchulus, Tylenchulus e Xiphinema.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o nemátodo é um nemátodo que forma cistos.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o nemátodo é do gênero Heterodera, opcionalmente, Heterodera glycines.
6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica é selecionada do grupo consistindo em alfafa, maçã, damasco, Arabidopsis, alcachofra, aspargo, abacate, banana, cevada, feijão, beterraba, amora, mirtilo, Brassica, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, colza, cenoura, mandioca, couve-flor, um cereal, aipo, cereja, frutas cítricas, Clementina, café, milho, algodão, pepino, berinjela, escarola, eucalipto, figo, uva, toranja amendoins, camapu, kiwi, alface, alhoporó, limão, lima, pinheiro, milho, manga, melão, paínço, cogumelo, noz de aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta ornamental ou flor ou árvore, papaia, salsa, ervilha, pêssego, amendoim, turfa, pimento, caqui, ananás, banana-da-terra, ameixa, romã, batata, abóbora, chicória, rábano, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, soja, feijão de soja, espinafre, morango, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, tangerina, chá, tabaco, tomate, uma videira, melancia, trigo, inhame e abobrinha.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica é soja.
8. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica compreende ou expressa ainda, pelo menos, um agente pesticida adicional selecionado do grupo consistindo em uma patatina, uma lectina, uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis, uma proteína nematicida de Bacillus thuringiensis, uma proteína inseticida de Xenorhabdus, uma proteína inseticida de Photorhabdus, uma proteína inseticida de Bacillus laterosporous, uma proteína inseticida de Bacillus sphearicus, e um RNAi que tem como alvo um nemátodo.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a proteína nematicida de Bacillus thuringiensis é selecionada do grupo consistindo em uma Cry1, Cry3, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry21 e Cry22.
10. Método para produzir uma planta de soja protegida contra infestação de nemátodos, caracterizado pelo fato de que compreende:

    • (A) transformar uma célula de planta de soja com uma molécula de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO: 2, que codifica uma proteína Vip3 compreendendo SEQ ID NO: 1; e
    • (B) regenerar uma planta de soja transformada a partir de uma célula da planta de soja.
11. Método para produzir uma planta de soja protegida contra a infestação de nemátodos, caracterizado pelo fato de que compreende:

    • (A) cruzar uma primeira planta parental de soja com uma segunda planta parental de soja, em que a referida primeira ou segunda planta parental de soja compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga compreendendo SEQ ID NO: 2, que codifica uma proteína Vip3 compreendendo SEQ ID NO: 1, produzindo desse modo uma multiplicidade de plantas descendentes; e
    • (B) selecionar a partir de uma pluralidade de plantas descendentes, uma planta transgênica que está protegida contra a infestação de nemátodos.