BR112015002185B1 - Método não terapêutico para controlar uma espécie alvo, e uso não médico de DNA de uma espécie obtida através de fragmentação aleatória de DNA total extraído ou por síntese de fragmentos aleatórios, a partir de DNA total - Google Patents

Método não terapêutico para controlar uma espécie alvo, e uso não médico de DNA de uma espécie obtida através de fragmentação aleatória de DNA total extraído ou por síntese de fragmentos aleatórios, a partir de DNA total Download PDF

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Abstract

resumo patente de invenção: "composição compreendendo ácidos nucleicos de sistemas biológicos parasíticos, patogênicos ou de ervas daninhas para inibição e/ou controle do crescimento de tais sistemas". a presente invenção refere-se a uma mistura de fragmentos de dna para a prevenção ou para o tratamento contra pelo menos uma espécie patogênica, parasítica ou de erva daninha de plantas ou do ambiente, onde o dito dna total consiste em fragmentos aleatórios do dna total da dita pelo menos espécie patogênica, parasítica ou de erva daninha, e/ou de pelo menos uma espécie filogeneticamente similar, contra a qual tal prevenção e tratamento são direcionados. além disso, a invenção refere-se a um processo e ao sistema relativo permitindo o aprimoramento da produção/crescimento de micro-organismos com altos rendimentos em biorreatores ou fotobiorreatores, ou de plantas em diferentes sistemas de cultura, caracterizado em que os ácidos nucleicos dos mesmos organismos produzidos pelo dito processo são removidos do meio de cultura e o dito meio de cultura, privado do dito ácido nucleico, é usado novamente no dito processo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO NÃO TERAPÊUTICO PARA CONTROLAR UMA ESPÉCIE ALVO, E USO NÃO MÉDICO DE DNA DE UMA ESPÉCIE OBTIDA ATRAVÉS DE FRAGMENTAÇÃO ALEATÓRIA DE DNA TOTAL EXTRAÍDO OU POR SÍNTESE DE FRAGMENTOS ALEATÓRIOS, A PARTIR DE DNA TOTAL.
[0001] A presente invenção se refere a composições de ácido nucleico de sistemas biológicos parasíticos, patológicos e infestantes para a inibição e/ou controle de tais sistemas e a um processo para o preparo destas. Além disso, a invenção se refere a um processo e ao sistema relacionado permitindo o aprimoramento da produção/crescimento de micro-organismos com alto rendimento em biorreatores e fotobiorreatores, ou plantas em vários sistemas de cultura, por separação dos ácidos nucleicos produzidos por tais organismos.
Descrição
Antecedentes da técnica [0002] Por muitos anos, a pesquisa para novos produtos inibidores de sistemas biológicos demanda um esforço científico, econômico e industrial enorme e inclui a detecção de princípios ativos de fontes naturais ou sintéticas por sucessivos testes biológicos e farmacológicos, tanto in vitro como in vivo, em adição a testes de aplicação clínica e de campo (Morgan et al. 2001 Health Policy, 100:4-17).
[0003] O uso de medicamentos (pesticidas, herbicidas e antibióticos) para a inibição de sistemas biológicos preocupa vários campos de aplicação, dentre os quais estão principalmente agricultura e medicina, e é finalizado no controle, inibição ou eliminação de organismos nocivos, sejam patológicos, parasíticos ou infestantes, e também no tratamento contra a formação de biopelículas microbianas.
[0004] Apesar da extensão e diversificação de tal faixa de aplica
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2/34 ção, o uso de medicamentos mostra problemas compartilhados como, por exemplo, (i) a especificidade da ação, (ii) a possível toxicidade para a espécie humana e outras espécies, (iii) a contaminação ambiental e (iv) o princípio das resistências nas populações dos organismos alvo. [0005] Geralmente, os medicamentos (pesticidas, herbicidas e antibióticos) consistem em moléculas orgânicas de tamanho pequeno e médio e mostram uma grande diversificação em termos de componentes químicos e de mecanismos de ação. Tais medicamentos foram detectados geralmente baseados em métodos de triagem aleatória, ou seja, estimativa da atividade e o potencial de uso de compostos químicos obtidos por síntese de maneira aleatória, iniciando de várias estruturas básicas resultantes de esqueletos que ocorrem naturalmente. De acordo com isto, no decorrer dos últimos 50 anos, um grande número de produtos, dentre os quais, mais recentemente, polinucleotídeos, também foram comercializados.
[0006] Um dos principais problemas relacionados aos princípios ativos atuais usados na agricultura e medicina é a especificidade de ação insuficiente destes para organismos parasíticos, patológicos e/ou infestantes e, consequentemente, efeitos colaterais e toxicidade no organismo hospedeiro. Por exemplo, casos de Paraquat associados ao princípio da doença de Parkinson são conhecidos, e os produtos provaram ser letais contra embriões humanos. Em adição aos problemas de toxicidade aguda, a exposição crônica a alguns produtos mostra um risco reconhecido para cancerogenicidade, para os quais as normas impostas demandam monitoramento ecotoxológico e uso de modalidades associadas a dinâmicas ambientais e persistência dos vários produtos.
[0007] Finalmente, não deve ser ignorado o problema de contaminação ambiental causado pelos medicamentos (pesticidas, herbicidas e antibióticos). As aplicações recentes dos regulamentos no campo
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3/34 ambiental reduziram drasticamente as autorizações do uso de fitomedicamentos e pesticidas e muitos produtos terão de ser abandonados no futuro próximo pela entrada em vigor de regulamentos mais restritivos. Por exemplo, brometo de metila, amplamente usado como fumigante para o controle de patógenos no solo, dentre os quais nematodos, foram proibidos devidos à inclusão deste dentre compostos considerados responsáveis pelo dano à camada de ozônio. Levando em consideração estes problemas, a maioria de princípios ativos mais modernos foi selecionada para uma rápida decomposição destes no solo ou em colheitas. Entretanto, esta possível vantagem em termos de contaminação ambiental pode limitar a eficiência ao decorrer do tempo dos princípios ativos usados.
[0008] Outro problema fundamental compartilhado para os produtos atualmente usados, tanto no campo agricultura e em aplicações terapêuticas no campo médico, é o aparecimento da resistência farmacológica após um período de tempo do início do tratamento.
[0009] Por exemplo, com referência à agricultura, nos EUA, no início dos anos sessenta, 2,4 D foi o primeiro herbicida, usado em ampla escala, através do qual o princípio da resistência em populações de Dacus carota foi relatado (Switzer, (1957), Proc. North Eastern Weed Cont. Conf., 11:315; Whitehead and Switzer, (1963), Can. J. Plant Sci., 43:255). Sucessivamente, no início da década de 70, numerosos casos de espécies infestantes resistentes a triazinas (Ryan, (1970), Weed Sci., 18:614; LeBaron and Gressel, Eds., Herbicide Resistance in Plants, Wiley, New York, 1982) foram relatados. O histórico tem crescido exponencialmente nas seguintes décadas junto com a difusão dos novos produtos para o combate químico e biológico e para o uso intensivo destes (Powles and Shaner, 2001. Herbicide resistance and world grains, CRC press, New York).
[0010] Vários mecanismos de princípio de resistência a infestação
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4/34 ao tratamento herbicida são conhecidos. Por exemplo, vários mecanismos relatados na literatura são: resistência como resultado da seleção de múltiplas cópias de genes alvo (Gaines et al. 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. 107(3): 1029-1034); mutação dos genes alvo (Wakelin et al. 2006. Weed Res. (Oxford), 46(5): 432-440); sequestro vacuolar (Ge et al. 2010. Pest Management Sci. 66:576); expressão das enzimas que metabolizam os herbicidas (Hidayat et al. 1997. Pest. Biochem. Physiol. 57(2): 137-146).
[0011] Atualmente, no campo agricultural, o aparecimento da resistência em mais de 200 espécies infestadoras foi detectado, selecionado acima de todos como um resultado do uso de princípios ativos e caracterizadas pelo mesmo mecanismo de ação. Na Itália, na planície de Po, casos de resistência a Atrazinas em populações de ervas infestantes são conhecidos, como, por exemplo, Solanum nigrum, Chenopodium album e Amaranthus cruentus, ou, em outras regiões, aqueles com resistência a inibidores enzimáticos em outras espécies infestantes diferentes (espécies de Lolium, Phalaris paradoxa, Papaver rhoeas, Sinapis arvensis, Echinocloa crus-galliums, Sorghum halepense, Cyperus difformis).
[0012] Também no campo médico, o desenvolvimento da resistência a medicamentos torna o uso destes inútil, constituindo um dos maiores problemas relacionados a terapias com antibióticos (Clatworthy et al. 2007. Nat. Chem. Biol. 3(9): 541-548). Embora enormes recursos humanos e econômicos a fim de descobrir novas moléculas e estudar os mecanismos de resistência tenham sido usados, o aparecimento da resistência a medicamentos provou ser mais rápido que a descoberta de novos medicamentos.
[0013] O problema de resistência a medicamentos tornou-se primário ao em escala mundial no campo de saúde, já que resulta em complicações clínicas para a terapia por antibióticos (aumento da du
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5/34 ração de doenças, aumento de complicações e possibilidade de epidemias) e demandas para custos adicionais no tratamento das infecções de bactérias resistentes a antibióticos (por meio do uso de medicamentos adicionais, prolongando, logo, a hospitalização). Um caso de resistência a antibiótico, mais e mais presente e perigoso para a saúde pública e representando uma das principais causas de infecção hospitalar, é a resistência a meticilina dos estafilococos e acima de tudo, das várias linhagens de Staphylococcus aureus. Estas bactérias, por meio do mecanismo de afinidade reduzida para o alvo, são capazes de expressar uma proteína modificada que não interage com antibióticos de beta-lactama. A União Européia enfrentou este problema apresentando uma Estratégia de Comunicação contra a Resistência Antimicrobiana onde um uso prudente de agentes antimicrobianos na medicina é recomendado a fim de conter o desenvolvimento de resistências.
[0014] A possibilidade de inibir a expressão de genes específicos resultou em grande interesse, já que a primeira publicação do trabalho de Zamecnik e Stephenson onde é mostrado que o uso de composições baseadas em oligonucleotódeos antisenso (ASO) poderia inibir a tradução da proteína viral (Zemecnik and Stephenson (1978) Proc. Natl. Acad. Ski. 75:285-288). Seguindo esta descoberta, os experimentos mais recentes em técnicas de combate a agentes parasíticos, patogênicos e infestantes investigaram adicionalmente o uso de várias moléculas de RNA e/ou DNA de tamanho pequeno (na ordem de várias dezenas de bases) se ligando seletivamente aos alvos mostrando sequências complementares como, por exemplo, mRNA, microRNA, ou RNA de mitocôndria, inibindo, logo, a tradução destas e, então, realizando uma atividade de controle para as espécies alvo.
[0015] Essas tecnologias modernas encontraram aplicações no combate contra espécies parasíticas (por exemplo, em WO
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2005/049841 A1), plantas infestantes (por exemplo, e.g. em WO 2011/11257 A1) e na terapia oncológica e antimicrobiana.
[0016] As abordagens atualmente usadas são múltiplas, dentre as quais está a modificação do RNA a fim de controlar o nível de um RNA mensageiro específico, limitando, logo a expressão do gene decodificando a mesma. Tal metodologia é caracterizada pela administração por meios de construções apropriadas de uma sequencia de RNA ou DNA voltada a um alvo específico, por exemplo, um gene ou partes deste. Os problemas associados ao uso de tais abordagens terapêuticas incluem a necessidade de caracterização para uma sequencia específica como o alvo de terapia. Existe também a dificuldade de se obter uma concentração mínima eficiente da construção no órgão alvo. A história recente da tecnologia antisenso, adicionalmente, revela que enquanto a identificação de RNAs específicos ligantes a ASOs é agora relativamente simples, a formulação destes em composições mostrando uma aplicação potencialmente eficiente para a inibição da expressão de genes específicos ainda é problemática. Vários estudos recentes foram direcionados ao problema mencionado anteriormente, propondo estruturas e composições mais estáveis e eficientes (por exemplo, em WO 2011/031520 A1). Como é bem-conhecido, estes tipos de técnicas mostram elevada sensibilidade em termos de especificidade do local de ação. Até agora, casos do princípio de resistência ao uso de ASOs no tratamento com herbicida e pesticida não foram relatados já que sua aplicação ainda não alcançou a etapa de comercialização e consequente disseminação dos produtos. Entretanto, levando em consideração a especificidade de ação particular dos ASOs, é realístico presumir que, como resultado do uso extensivo destes e de pressão seletiva consequente nas populações parasíticas e/ou patogênicas infestantes, a aplicação de tais ASOs resultará no princípio de resistências nas populações tratadas, tornando, logo, os tratamentos ineficien
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7/34 tes, da mesma maneira que ocorreu no passado para outros tipos de medicamento, caracterizado pela elevada especificidade de ação. [0017] No campo de culturas a granel em biorreatores e fotobiorreatores, logo, em sistemas controlados confinados, um dos grandes problemas ainda não resolvido na cultura a granel de microorganismos é o princípio do fenômeno de saturação da curva de crescimento para tais organismos (etapa estacionária), com consequente impossibilidade de exceder certas concentrações por unidade de volume. Uma curva de crescimento típico de tais micro-organismos (bactérias, bactérias fotossintéticas, leveduras, mircroalgas e algas azulesverdeadas) é caracterizada por uma etapa de latência inicial, uma sucessiva etapa exponencial e uma etapa em estado estacionário com saturação da curva de crescimento, seguido às vezes também de uma etapa de morte celular.
[0018] A impossibilidade de exceder o limiar da concentração máxima por unidade de volume que um micro-organismo pode alcançar durante a cultura em grande escala em reatores e sistemas de cultura a granel notadamente limita as potencialidades de exploração de tais organismos, não permitindo incrementos ulteriores na produção além do estado estacionário.
[0019] Várias motivações são propostas como causa do decréscimo da taxa de crescimento da célula dos micro-organismos em etapa de saturação, todos principalmente relacionados à limitação dos elementos nutritivos no meio, ou auto-limitação da radiação penetrante em cultura no caso de organismos fotossintéticos (fenômeno de autosombreamento). Vários estudos experimentais demonstraram que o fenômeno da saturação de curva de crescimento ocorre também na ausência de fatores limitantes aparentes e este fenômeno está associado com o acúmulo de substâncias inibidoras no meio de cultura.
[0020] Em luz ao exposto acima, é, logo, aparente a necessidade
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8/34 para novos métodos para a inibição de organismos nocivos ou para o aumento de rendimento nos processos de produção de microorganismos superando as desvantagens dos métodos da técnica anterior.
[0021] A invenção titular resulta de uma observação importante ocorrida durante estudos ecológicos no ciclo da substância orgânico no solo. Nestes estudos, foi observado que o DNA liberado pela decomposição de material orgânico acumulado no solo prova ser inibitório para a espécie de planta produzindo tal material orgânico, enquanto que tal DNA não inibe outras espécies pelo qual tal DNA pode, ao contrário, representar um recurso nutritivo.
[0022] No caso de ecossistemas florestais, este efeito inibidor de DNA extracelular específico apenas em espécies de plantas com DNA homólogo representa um mecanismo regulador da coexistência natural dentre várias espécies e favorece a biodiversidade de comunidades de plantas. De fato, quando uma única espécie, por qualquer razão, estiver sob condições apropriadas de aumentar sua dominância em outra espécie, ao longo do tempo, irá necessariamente acumular maiores resíduos da substância orgânica própria, cuja decomposição e consequente liberação de DNA produzirá um efeito inibidor na mesma espécie, reduzindo, logo, a habilidade competitiva e, logo, a dominância. A tão chamada fadiga do solo (também referida como doença do solo) na agricultura é baseada no mesmo fenômeno, ou seja, em perdas de produtividade de culturas monoespecíficas repetidas ao longo do tempo não resultando de problemas de natureza nutritiva, mas de acúmulo de resíduos de resíduos de planta das mesmas culturas. A observação de inibição específica de espécie devido ao acúmulo de DNA próprio, durante o ciclo da substância orgânica, explica o fenômeno mencionado acima de perda de produtividade e tal descoberta nunca foi relatada na literatura científica.
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9/34 [0023] Com base nesses estudos, um segundo importante resultado foi alcançado, consistindo na observação de que populações microbianas (por exemplo, bactérias, microalgas e fungos) produzem e secretam, durante seu crescimento, moléculas de DNA próprio na forma de fragmentos de diferentes tamanhos que, por acúmulo no substrato de crescimento da população, exercem um efeito inibitório no crescimento de tal população.
[0024] Sabe-se que uma população microbiana tipicamente cresce inicialmente de maneira exponencial e então entra em uma tãochamada etapa estacionária seguido, possivelmente, de uma etapa de morte. Vários fatores limitantes de crescimento de tais populações microbianas são conhecidos, dentre os quais, fundamentalmente, os limites nutritivos e/ou de acúmulo de substâncias tóxicas de natureza variada. Na literatura, é relatada a produção e secreção de DNA extracelular de vários organismos (Peters and Pretorius, 2011. Chemical Clinic Acta. 412:806-811), mas, até agora, não foi relatado que uma liberação de DNA extracelular durante o crescimento de uma população microbiana produz um efeito inibitório no crescimento de tal população de maneira absolutamente análoga que aquela observada para as plantas afetadas pelo acúmulo de DNA próprio no solo. As observações em que esta invenção é baseada revelam uma lei biológica geral em que a liberação de DNA próprio por um organismo prova ser reguladora do crescimento de tal organismo e dos organismos de mesma espécie na população. Este resultado leva a novos cenários de aplicação notáveis no campo agrofarmacêutico. Particularmente, o controle de quaisquer espécies nocivas se torna possível através da exposição ao próprio DNA total aleatoriamente fragmentado, com a finalidade de reproduzir o que é observado em ciclos naturais de decomposição da substância orgânica ou no fenômeno de secreção extracelular durante o crescimento das populações microbianas. Logo, é feita a hipótese de
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10/34 um possível uso para a aplicação de composições cujo princípio ativo consiste em DNA total e aleatoriamente fragmentado de uma espécie a ser controlada.
[0025] Os testes que são ilustrados abaixo demonstram a eficiência de tal método para qualquer espécie tratada. Estes experimentos reportados são facilmente replicáveis e não demandam qualquer conhecimento a priori do genoma da espécie a ser tratada em temos de sequenciamento e/ou detecção de genes alvo específicos. Para o preparo das composições inibidoras, apenas a extração do DNA total do material orgânico das espécies alvo (por exemplo, de folhas de plantas, micélios de fungos, biomassa microbiana) e fragmentação aleatória sucessiva de tal DNA extraído são suficientes. O procedimento de preparação da invenção simula o processo de decomposição natural da substância orgânica no solo e produz uma mistura de polinucleotídeos de tamanho variado compreendendo de dezenas a milhares de bases. Tais fragmentos, representando o DNA total da espécie a ser controlada, produzem um efeito altamente seletivo em organismos com DNA homólogo onde não ocorre o ato em um gene alvo único, e sim o contrário, no caso de vários tipos de nucleotídeos antisenso. Este aspecto potencialmente constitui uma vantagem notável porque elimina a possibilidade de aparecimento de resistências nas populações tratadas, porque para nenhum organismo é presumidamente possível desenvolver simultaneamente resistências para a inibição de todas as funções próprias. É conhecido, de fato, de acordo com a literatura científica, que a velocidade de princípio do fenômeno de resistência em populações de agentes parasíticos, patogênicos e infestantes é intimamente correlacionada com o número de genes responsável por tal resistência. Mais precisamente, quanto menor o número de genes necessários para o princípio da resistência, maior a velocidade de acordo com a qual esta resistência será positivamente selecionada dentro da
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11/34 população a ser controlada (Prather et al. the 2000. Herbicide resistance: definitions and management strategies. University of California, Division of Agricultures and Natural Resources, Oakland - Brent and Hollomon, 2007. Fungicide resistance in crop pathogens: how can it be managed? Croplife International, Brussel).
[0026] A invenção se refere então ao uso de composições para a inibição de espécies parasíticas, patogênicas e/ou infestantes onde, como princípio ativo, fragmentos aleatórios de DNA próprio total, idêntico ou similar ao mesmo genoma da espécie a ser inibida são usados. Além disso, a presente invenção se refere a uma composição compreendendo tais fragmentos aleatórios de DNA total.
[0027] Em adição a isto, os inventores da presente invenção desenvolveram um processo e o sistema relacionado para a produção/crescimento de micro-organismos em biorreatores ou fotobiorreatores ou plantas em sistemas para a cultura hidropônica, em substratos fora do solo, ou no solo, por meio de separação de ácidos nucleicos de tais micro-organismos ou plantas.
[0028] Na presente aplicação de patente abaixo, o termo nível de saturação significa o estágio estabelecido no decorrer do crescimento dos micro-orgnaismos, quando a concentração de ácidos nucleicos ou fragmentos destes no meio de cultura é tal que resulta em uma etapa de estado estacionário em relação ao curso de crescimento dos microorganismos, com saturação da curva de crescimento destes.
[0029] Da mesma maneira, o termo meio de exaustão significa um nível de cultura onde o nível de concentração de ácidos nucleicos e fragmentos destes alcançaram uma concentração resultando em um nível de saturação no decorrer do crescimento dos micro-organismos.
[0030] Quanto ao termo recuperação, significa a operação apropriada para remover ácidos nucleicos e fragmentos destes do meio de exaustão.
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12/34 [0031] Meio regenerado significa o meio obtido após a recuperação do meio de exaustão.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0032] A presente invenção é baseada na comprovação experimental de que a exposição de um organismo a extratos do DNA próprio total resulta em um efeito inibidor das funções de tal organismo, limitando, logo, o crescimento ou interferindo de maneira fundamental na fisiologia deste a nível celular.
[0033] Detalhadamente, o DNA total de um organismo parasítico, patogênico e/ou infestante extraído e administrado sem seleção de fragmentos específicos ou uso de construções específicas, pode ser usado como produto inibidor para o mesmo organismo ou outros organismos com genoma idêntico ou similar. A ação inibidora é exercida com o contato da espécie parasítica, patogênica e/ou infestante, dentro do substrato de crescimento deste ou a nível sistêmico, com DNA próprio total aleatoriamente fragmentado. Uma vez absorvido, tal DNA produz um efeito limitante no crescimento e um efeito inibidor generalizado nas várias funcionalidades do organismo, de maneira contrária do que ocorre no caso de aplicações de sequências de ácido nucleico específicas objetivando os efeitos de silenciamento o gene ou interferência de RNA. A adsorção e a atividade de inibição dependem do nível de concentração e fragmentação dos ácidos nucleicos aos quais o sistema está exposto. Um efeito maior é destacado dependendo do grau de fragmentação das moléculas usadas (por exemplo, após sonicação ou seguido de decomposição natural). Experimentos foram realizados usando vários comprimentos médios de fragmentos de DNA e o efeito inibidor provou ser mais eficiente para misturas de fragmentos com frequência de comprimento maiores de aproximadamente 200 bases.
[0034] Especificamente, a produção de fragmentos aleatórios de
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DNA total extraído de várias espécies de acordo com os experimentos ilustrativos foi realizada com várias abordagens a fim de demonstrar que a técnica de fragmentação não influencia na eficiência do efeito inibidor. Tal fragmentação pode ser realizada por meio de uma degradação natural (exposição a fatores ambientais), degradação artificial (por combustão, ou de maneira mecânica ou enzimática), ou por síntese (métodos para amplificação aleatória como DOP, ou seja, por PCR com oligonucleotídeos degenerados).
[0035] Os autores da presente invenção realizaram estudos em plantas, fungos, insetos, leveduras, algas e protozoários. Os resultados de tal experimento demonstraram inequivocamente a subsistência geral do efeito inibidor descrito em qualquer espécie tratada.
[0036] No caso de plantas, a presença em solução aquosa do DNA total de uma espécie, obtida por extração simples e aleatoriamente fragmentada, também a baixa concentração, em contato com as raízes da mesma espécie, rapidamente produz necrose de radical, clorose de folha, interrupção das atividades do meristema e, quando em contato com as sementes, supressão da habilidade de germinação. Pelo contrário, a exposição das raízes e/ou sementes de uma espécie a soluções de DNA total aleatoriamente fragmentado de uma espécie diferente não produz inibições notadas, também para exposições a alta concentração, ou seja, mostrando um efeito altamente específico por espécie. É, então, aparente que a presença de DNA total aleatoriamente fragmentado em um ambiente de crescimento pode realizar uma função de inibição seletiva em organismos com genoma idêntico ou similar não influenciando as outras espécies. É possível descobrir este efeito inibidor tanto quando o DNA total for fragmentado artificialmente e inserido no meio de crescimento do sistema biológico como quando o DNA é produzido e secretado por tal sistema biológico durante o crescimento deste.
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14/34 [0037] Isto, então, torna possível uma ação voltada apenas contra as espécies parasíticas, patogênicas e/ou infestantes, por tratamentos com formulações contendo DNA específico para esta espécie, com a enorme vantagem de que tais moléculas mostrarão o efeito inibidor apenas na espécie alvo, mas não na a ser protegida ou em outra espécie, também no caso de possíveis exposições repetidas.
[0038] O mesmo princípio observado pelos inventores da presente invenção podem ser favoravelmente empregados a fim de aumentar os rendimentos dos processos para produção de micro-organismos em biorreatores e fotobiorreatores, tanques para cultura hidropônica e sistemas de cultura fora do solo. De fato, os inventores da presente invenção, por meio de testes de laboratório usando biorreatores para o crescimento de algas, leveduras e bactérias, observaram um acúmulo de sobrenadante de fragmentos de DNA de vários tamanhos (aproximadamente 50-800 pb) pertencentes aos mesmos micro-organismos produzidos, durante as etapas de crescimento a concentrações crescentes. Foi observado que este acúmulo ocorre nas etapas de crescimento a concentrações crescentes e resultara em um efeito inibidor no crescimento de tal cultura nos biorreatores quando a etapa estacionária e a sucessiva etapa de morte são alcançadas (figuras 11A e 11B).
[0039] Os testes experimentais destacaram que um efeito inibidor próprio específico por espécie existe, já que culturas de uma dada espécie mostraram ser inibidas apenas pelos sobrenadantes das culturas da mesma espécie. Além disso, foi observado que a remoção do DNA do meio de cultura é apropriada para remover o efeito inibidor permitindo a restauração da etapa de crescimento e que maiores densidades de células nos biorreatores (figura 11C) e fotobiorreatores fossem alcançadas.
[0040] Analogamente, em tanques para culturas hidropônicas de plantas, na presença da produção decrescente em ausência de substi
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15/34 tuição completa da solução nutritiva circulante, foi observado um acúmulo no substrato de DNA das espécies cultivadas. Também nesse caso, a remoção do DNA acumulado do substrato de crescimento permitiu a restauração da produtividade.
[0041] Levando em consideração esses resultados experimentais, então, é possível desenvolver sistemas tecnológicos para a remoção de DNA ocorrendo em culturas celulares (biorreatores e fotobiorreatores), tanques de cultura hidropônica e em sistema de cultura fora do solo a fim de otimizar as produções.
[0042] É, então, um objetivo específico da presente invenção o uso de uma composição compreendendo ou consistindo em uma mistura de fragmentos de DNA totais onde tal DNA total é aleatoriamente fragmentado para a prevenção e tratamento contra pelo menos uma espécie patogênica, parasítica ou infestante, e/ou pelo menos uma espécie filogeneticamente similar, contra a qual tal prevenção e tratamento são direcionados. Como dito acima, a mistura de fragmentos de acordo com a presente invenção é obtida pela fragmentação do DNA total extraído de tais espécies patogênicas, parasíticas ou infestantes contra a qual tal prevenção e tratamento são direcionados, sem a realização de qualquer seleção de fragmentos, ou seja, usando todos os fragmentos obtidos do ácido nucleico. Então, de acordo com a presente invenção, um DNA inteiro aleatoriamente fragmentado, ou seja, sem a realização de sequências específicas e/ou especificamente dimensionadas, é usado. Fragmentos de tal DNA total são obtidos por meio de fragmentação aleatória do DNA total extraído, ou por meio de síntese de fragmentos aleatória iniciando do DNA total. A diferença substancial da técnica da presente invenção comparada às técnicas atuais de silenciamento de gene e interferência de RNA é que no estado atual da técnica as regiões específicas a serem usadas os ácidos nucleicos deve ser ativamente selecionada, enquanto que no caso da técnica da
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16/34 presente invenção nem conhecimento anterior nem seleção das sequências específicas a serem usadas são necessários. Tal DNA total pode ser extraído de tal pelo menos uma espécie patogênica, parasítica ou infestante ou artificialmente sintetizado. O ácido nucleico pode ser amplificado e/ou fragmentado por meio de procedimentos do tipo físico e/ou químico e os fragmentos obtidos possivelmente podem ser adicionalmente amplificados. Os métodos de produção dos fragmentos aleatórios do DNA total incluem, por exemplo, métodos químicos, bioquímicos e moleculares, técnicas de sonicação, tratamentos térmicos e procedimentos de pirólose. Por exemplo, seguindo a extração de DNA total de um resíduo de folha de Arabidopsis thaliana, a exposição das sementes da mesma espécie a tal extrato contendo DNA em forma não-fragmentada não mostra efeitos inibidores significantes. Diferentemente ao seguir uma sonicação, tratamentos do extrato usando um sonicador por imersão por três ou quatro ciclos de três minutos de duração a uma potência de 80% produz uma mistura de fragmentos aleatórios de vários tamanhos com atividade inibidora crescente, em função do grau de fragmentação alcançado na germinação de sementes de A. thaliana. As mesmas misturas de fragmentos aleatórios de DNA total extraído de A. thaliana não mostraram efeito inibidor nas outras espécies tratadas, como Lycopersicon aesculentum e Avena sativa (usados como bioteste de controle neste experimento). Resultados análogos foram observados quando o extrato de DNA total foi aleatoriamente fragmentado com os outros métodos físico-químicos citados acima. Finalmente, os mesmos resultados são obtidos expondo sementes de A. thaliana a misturas de fragmentos aleatórios do DNA total onde tais fragmentos foram obtidos por amplificação do DNA total usando DOP. A composição pode ser usada como biocida, herbicida, fungicida, inseticida, acaricida, nematicida, antiprotozoário, algicida, ou bactericida. A composição pode ser administrada a tal pelo menos
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17/34 uma espécie, patogênica, parasitica ou infestante por contato de superfície, administração citotrópica, ou administração sistêmica por meio de, por exemplo, injeção, ingestão ou inalação, ou adsorção. A composição pode ser formulada em uma forma, para tratamentos líquidos ou secos, selecionada do grupo consistindo em dispersão, por exemplo, na forma de um aerossol, suspensão, pós solúveis ou umectáveis, emulsões em água ou em outros solventes, grânulos dispersáveis, suspensões de microcápsulas, concentrados emulsionáveis, pastas fluidas, macro emulsões, dispersões em óleo, e iscas.
[0043] De acordo com uma modalidade particular, os fragmentos aleatórios de ácidos nucleicos podem ser projetados em vetores. A composição de acordo com a presente invenção pode incluir pesticidas adicionais selecionados do grupo consistindo em fungicidas, inseticidas, nematocidas, miticidas, atropocidas, bactericidas e algicidas.
[0044] A invenção se refere adicionalmente a um método para a prevenção ou tratamento contra pelo menos uma espécie patogênica, parasítica ou infestante das plantas ou do ambiente, tal método compreendendo ou consistindo nas seguintes etapas de: a) extração do DNA total de pelo menos um de tal espécie patogênica, parasítica ou infestante contra a qual tal prevenção e tratamento são direcionados;
b) produção de fragmentos aleatórios de tal DNA total a fim de se obter uma mistura de fragmentos aleatórios de DNA; e c) contato de tal mistura de fragmentos aleatórios com tal espécie patogênica, parasítica ou infestante.
[0045] Uma composição compreendendo ou consistindo em uma mistura de fragmentos aleatórios de DNA total para o uso na prevenção e tratamento contra pelo menos uma espécie patogênica, parasítica ou infestante humana ou de animal, onde tal DNA total é o DNA de pelo menos uma espécie patogênica, parasítica ou infestante, contra a qual tal prevenção e tratamento são direcionados, é um objetivo adici
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18/34 onal da presente invenção. Tais fragmentos aleatórios de DNA total podem ser obtidos por degradação do DNA total por meio de métodos químicos e/ou físicos, ou pela síntese de fragmentos aleatórios de tal DNA total. A composição de acordo com a presente invenção pode ser formulada para tratamentos líquidos ou secos, ou para dispersão aerossol, na forma de suspensões, pós umectáveis ou solúveis, emulsões em água ou outros solventes, grânulos dispersáveis, suspensões de microcápsulas, concentrados emulsionáveis, pastas fluidas e macro emulsões, dispersões em óleo, cremes, cápsulas e pastilhas. As rotas de administração incluem contato de superfície, tratamentos sistêmicos e citotrópicos, por injeção, absorção, ingestão e inalação, bem como qualquer rota de administração útil para a finalidade da aplicação. A composição de acordo com a presente invenção pode incluir misturas com outros compostos químicos agindo como agente espessante, agente umectante, agentes de suspensão, excipientes, agentes retificadores e solventes, agentes tensoativos, bem como quaisquer outras substâncias úteis para a finalidade da aplicação. Finalmente, a composição de acordo com a invenção pode incluir outros compostos farmacêuticos em formulações e misturas de meios não antagônicos, mas possivelmente sinérgicos com a atividade dos tratamentos. Em tais casos, a combinação dos compostos geralmente irá corresponder a razões de peso de cerca de 0% a 100%.
[0046] Também é um objetivo específico da presente invenção um processo para a produção com alto rendimento de micro-organismos em biorreatores ou fotobiorreatores, ou em sistemas de cultura de plantas tanto dentro como fora do solo, caracterizado em que os ácidos nucleicos dos mesmos organismos produzidos por tal processo são removidos do meio de cultura e o meio de cultura privado de tal ácido nucleico pode ser usado novamente em tal processo.
[0047] De acordo com o processo da invenção, os ácidos nuclei
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19/34 cos são removidos do meio de cultura ou do substrato de crescimento usando técnicas de separação selecionadas do grupo consistindo em: unidade de remoção externa, preferivelmente consistindo em um recipiente externo e um sistema para a geração de campos elétricos ou magnéticos ou eletromagnéticos e pelo menos um duto e pelo menos um meio de deslocamento para a extração de ácidos nucleicos concentrados do sistema precedente; unidade de remoção integrada, preferivelmente consistindo em um sistema de geração de campos elétricos, ou magnéticos, ou eletromagnéticos e pelo menos um duto e pelo menos um meio de deslocamento para a extração de ácidos nucleicos concentrados do sistema precedente, sendo tudo integrado dentro do mesmo biorreator; técnicas aplicáveis in situ e fora de unidades, preferivelmente técnicas de centrifugação; técnicas de filtração; tratamentos com DNAse e outras enzimas degradantes para ácidos nucleicos; tratamentos de calor; e tratamentos acidificantes.
[0048] Preferivelmente, de acordo com o processo da invenção, tais ácidos nucleicos são removidos do meio de cultura por meio de pelo menos uma unidade de remoção integrada ao biorreator ou fotobiorreator externa ou de sistemas para cultura hidropônica usando técnicas selecionadas do grupo consistindo em aplicação de campos elétricos estáticos, aplicação de campos magnéticos estáticos, aplicação de campos elétricos e/ou magnéticos dinâmicos, centrifugação, filtração, tratamento com DNAse, tratamento térmico, e tratamento acidificante.
[0049] Um sistema para a produção de micro-organismos compreendendo pelo menos um biorreator ou fotobiorreator ou sistema para cultura hidropônica, pelo menos uma unidade para remoção de ácido nucleico externa a tal pelo menos um biorreator ou fotobiorreator ou sistema para cultura hidropônica é um aspecto ulterior da presente invenção, tal unidade para remoção de ácido nucleico sendo conectada
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20/34 a tal pelo menos um biorreator ou fotobiorreator ou sistema para cultura hidropônica por meio de pelo menos um primeiro duto e pelo menos um meio de deslocamento para a retirada de meio de cultura contendo ácido nucleico, e pelo menos um segundo duto e pelo menos um segundo meio de deslocamento para a reintrodução em tal pelo menos um biorreator ou fotobiorreator ou sistema para cultura hidropônica, do meio de cultura do qual o ácido nucleico é removido; tal sistema compreendendo adicionalmente pelo menos um terceiro meio de deslocamento para a retirada do ácido nucleico separado. Preferivelmente, tal duto pode ser um tubo. Tal meio de deslocamento pode preferivelmente ser uma bomba.
[0050] A recuperação do meio de cultura é realizada tanto continuamente usando tratamentos para a remoção do DNA do meio de cultura durante a etapa de crescimento como a realização de um tratamento de meio de exaustão quando a etapa de saturação do crescimento celular ocorrer.
[0051] A recuperação do meio de cultura pode ser realizada in situ diretamente nos biorreatores ou fotobiorreatores usando tratamentos com enzimas ou outros compostos ativos para a degradação do DNA ocorrendo no sobrenadante das culturas celulares, ou usando técnicas para aplicação de campos elétricos, magnéticos ou eletromagnéticos. A recuperação usando estas técnicas prova ser viável ao tomar vantagem das características polares de moléculas de ácido nucleico destes separáveis por campos elétricos, ou usando técnicas para magnetização das moléculas de DNA por ligação das mesmas a moléculas magnéticas e aplicação de campos magnéticos para a separação destes. Alternativamente, a recuperação pode ser realizada usando um sistema de remoção colocado no lado de fora do biorreator (Figura 12) ou na cultura hidropônica (Figura 13A) com recirculação de meio regenerado ou um sistema de remoção integrado a um biorreator
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21/34 (Figura 12B) ou cultura hidropônica (Figura 13B).
[0052] As técnicas para remoção do DNA do meio de cultura podem ser: técnicas para aplicação de campos elétricos estáticos (Figura
14) ; técnicas para aplicação de campos magnéticos estáticos (Figura
15) ; técnicas para aplicação de campos elétricos e/ou magnéticos dinâmicos; centrifugação; técnicas de filtração; tratamento com DNAse; tratamentos térmicos; e tratamentos acidificantes.
[0053] Em uma modalidade preferida da invenção (Figura 12A), tal pelo menos um biorreator (1) pode ser conectado a tal pelo menos uma unidade de remoção externa (4) de tal maneira que o meio de cultura de exaustão é transferido para pelo menos tal unidade de remoção externa (4) por meio de pelo menos um primeiro duto (2) e pelo menos um primeiro meio de deslocamento (3) para a retirada do meio de cultura contendo ácido nucleico. Em tal unidade (4), a recuperação pode ser realizada usando uma das técnicas mencionadas anteriormente para a remoção de DNA do meio. Neste ponto, o ácido nucleico separado será coletado pela unidade de remoção (4), preferivelmente por meio de pelo menos um terceiro duto (5) e pelo menos um terceiro meio de deslocamento (6) para a remoção do ácido nucleico separado, enquanto o meio regenerado será reintroduzido em pelo menos um biorreator (1) por meio de pelo menos um segundo duto (7) e pelo menos um segundo meio de deslocamento (8).
[0054] Adicionalmente, a integração de equipamentos de fertirrigação em campos abertos ou de cultura protegida com sistemas para a remoção de ácidos nucleicos representa uma aplicação adicional da presente invenção. Um possível diagrama de tal aplicação é reportado na Figura 16 onde um tanque com uma solução contendo nuclease é integrado em um equipamento de fertirrigação.
[0055] O uso de fragmentos aleatórios de DNA total para o controle e inibição de espécies parasíticas, infestantes e/ou patogênicas na
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22/34 agricultura e medicina, quando comparado com técnicas e produtos existentes, resulta em vantagens significantes.
[0056] Uma primeira vantagem resulta da seletividade absoluta dos tratamentos com fragmentos aleatórios de DNA das espécies parasíticas, infestantes e/ou patogênicas, porque tais fragmentos aleatórios de DNA total não mostram efeitos em espécies diferentes das tratadas.
[0057] O uso de fragmentos aleatórios de DNA total das espécies parasíticas, infestantes e/ou patogênicas não induz o aparecimento da resistência nas populações de mesma espécie, porque o mecanismo de ação deste é diferente daquele dos produtos atualmente comercializados ou sob experimentação (compreendendo os métodos de interferência por RNA e ASO), como baseados em uma interferência múltipla e contemporânea com todo o genoma com todo o sistema de síntese de proteína e transcripcional, não permitindo, logo, o preparo de resistência e seleção específicas das populações resistentes.
[0058] Uma vantagem adicional resulta da ausência de toxicidade causada pelo uso de ácido nucleico, isto por serem metabólitos primários, de natureza ubiquitária, não resultando em contaminação ambiental. De fato, a administração de fragmentos de ácidos nucleicos nãoespecíficos não mostram toxicidade para espécies diferentes das tratadas.
[0059] A presente invenção fornece adicionalmente uma simplificação notável na pesquisa para novos medicamentos com consequente grande benefício econômico. De fato, a detecção de espécies parasíticas, infestantes e/ou patogênicas constitui a única condição necessária para o preparo de medicamentos específicos para o tratamento farmacológico. Pelo contrário, a atual pesquisa farmacológica para produtos baseados em técnicas como interferência por RNA ou o uso de oligonicleotídeos antisenso, requer não apenas conhecimento da
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23/34 sequência genômica total do organismo alvo, como também o conhecimento detalhado das funcionalidades do gene a fim de detectar possíveis sequencias específicas a serem alvo da atividade inibidora. [0060] Por outro lado, a pesquisa farmacológica tradicional é baseada em estudos de triagem aleatória de compostos sintéticos ou de moléculas naturalmente ocorrentes. Tais substâncias, uma vez detectadas e testadas para sua atividade, na maioria dos casos, são também caracterizadas por uma toxicidade geral para outros organismos e humanos. Praticamente, a aplicação de tais produtos geralmente é associada à preocupações de contaminação ambiental devido à toxicidade destes.
[0061] Uma vantagem adicional resulta da disponibilidade relativamente fácil e produção a granel do ácido nucleico cumprindo os requerimentos da patente titular. De fato, fragmentos aleatórios do DNA total do organismo alvo podem ser obtidos por abordagens e metodologias agora extremamente difundidas no campo biomolecular. As técnicas podem ser baseadas na extração do material genético dos organismos alvo, ou por meio de síntese.
[0062] Além disso, a estabilidade dos fragmentos de DNA pode garantir a persistência pelo tempo também sob condições ambientais não-favoráveis (por exemplo, no solo), resultando, então, em aplicações duráveis resultando em benefícios ambientais e econômicos. [0063] Uma vantagem adicional resulta do fato de que o DNA para os usos propostos pode ser obtido pela extração de material naturalmente ocorrente ou por síntese, baseado em técnicas de síntese e extração e também de amplificação, agora amplamente difundidas e estabelecidas em biologia molecular.
[0064] Exemplos significantes, mas não restritivos de técnicas de produção possíveis incluem a dissolução dos tecidos celulares, inativação das nucleases celulares e recuperação de ácidos nucleicos da
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24/34 solução contendo lisatos biológicos.
[0065] Ácidos nucleicos são adicionalmente sintetizáveis iniciando das moléculas molde ou do zero de acordo com diferentes abordagens.
[0066] As moléculas consideradas podem ser amplificadas, produzindo, logo, múltiplas cópias idênticas ou similares ao molde considerado, por exemplo, por técnicas de clonagem ou baseadas em PCR.
[0067] Variantes de PCR são úteis a fim de produzir o princípio ativo a ser usado garantindo amplificação aleatória dos fragmentos de ácido nucleico de uma amostra de molde. Por exemplo, uma abordagem como DNA Polimórfico Amplificado Aleatório (RAPD) é bastante apropriada para as necessidades, não necessitando, de maneira contrária ao PCR clássico, conhecimento da sequencia de molde de DNA inicial.
[0068] PCR por emulsão representa outro exemplo de abordagem apropriada inovadora, apropriada para assumir de maneira extremamente rápida a amplificação de vários fragmentos de DNA iniciando de uma amostra de DNA atomizada para se obter fragmentos de 300 800 nucleotídeos de comprimento, ou de amplicons obtidos por outras abordagens.
[0069] Além disso, em relação aos processos de produção de micro-organismos em biorreatores e fotobiorreatores e tanques para cultura hidropônica, a remoção do meio de cultura de exaustão e a ressuspensão das células no meio regenerado, a igual concentração celular por unidade de volume e sob as mesmas condições de contorno, permitem a restauração da etapa de crescimento de cultura.
[0070] Adicionalmente à vantagem do aumento de produção resultando da remoção do fator inibidor, uma vantagem notável adicional resulta da possibilidade de reuso do meio de exaustão, após regeneração deste, para outras culturas sucessivas, possivelmente não viável
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25/34 nos sistemas de produção atuais.
[0071] A presente invenção será agora descrita, de maneira ilustrativa, mas não-limitante, com referência particular ao exemplos de modalidades e figuras inclusas, onde:
[0072] A Figura 1 mostra uma visão conceitual do objetivo da invenção.
[0073] A Figura 2 mostra a inibição da germinação de sementes de Lepidium e Acanthus por exposição a DNA próprio a uma concentração ótima de 200 ppm.
[0074] A Figura 3 mostra a inibição das plantas Quercus ilex, Quercus pubescens, Hedera elix, Ampelodesma mauritanica, Festuca drimeja, Coronilla emerus, Medicago marina, Alnus cordata, Robinia pseudoacacia, e Pinus halepensis por exposição a DNA próprio.
[0075] A Figura 4 mostra a inibição de plantas Arabidopsis thaliana por exposição ao DNA próprio e de Lycopersicon esculentum.
[0076] A Figura 5 mostra o efeito inibidor na germinação de esporos e o crescimento de hifas de Aspergillus niger onde tal fungo é exposto ao DNA próprio ou a DNA de outra espécie (Trichoderma hartianum).
[0077] A Figura 6 mostra a inibição do inseto Sarcophaga carnaria por exposição a DNA próprio.
[0078] A Figura 7 mostra as metamorfoses completas, em porcentagem quando comparado ao controle não exposto, em larvas de moscas Sarcophaga carnaria expostas por 4 semanas a DNA homólogo a três concentrações diferentes, ou a DNA heterólogo extraído de um fungo (Penicillium chrysogenum) ou de uma bactéria (Bacillus subtilis).
[0079] A Figura 8 mostra as contagens de células viáveis nas culturas de bactéria Bacillus subtilis expostas por 24 horas ao DNA homólogo a três concentrações diferentes e no controle não exposto.
[0080] A Figura 9 mostra a germinação dos esporos no fungo Tri
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26/34 choderma harzianum, em porcentagem quando comparado ao controle não exposto, em culturas expostas a DNA homólogo a três concentrações diferentes, ou a DNA heterólogo extraído de outro fungo (Aspergillus niger), de um inseto (Sarcophaga carnaria) ou uma bactéria (Bacillus subtilis).
[0081] A Figura 10 mostra a dinâmica de crescimento da microalga Scenedesmus obliquus em duas culturas expostas a DNA homólogo a uma concentração diferente e no controle não exposto.
[0082] A Figura 11 mostra o acúmulo de DNA extracelular no substrato líquido de dois biorreatores diferentes.
[0083] A Figura 12 mostra: (a) o diagrama do sistema para a produção de micro-organismos no biorreator caracterizado de uma unidade externa para remoção de DNA; (b) o diagrama do sistema para a produção de micro-organismos no biorreator onde a remoção de DNA do meio de cultura ocorre por uma unidade de remoção integrada ao biorreator.
[0084] A Figura 13 mostra: (a) um tanque para cultura hidropônica caracterizado pela presença de uma unidade de remoção de DNA externa e recirculação do meio de cultura dentro do sistema hidropônico;
(b) um tanque para a cultura hidropônica onde a remoção do DNA do meio de cultura ocorre por meio da unidade de remoção integrada ao mesmo tanque.
[0085] A Figura 14 mostra um diagrama específico da unidade de remoção externa para o sistema representado na Figura 12, onde a separação de ácido nucleico ocorre pela aplicação de um campo elétrico.
[0086] A Figura 15 mostra um diagrama adicional da unidade de remoção para o sistema mostrado na Figura 12, onde a separação de ácido nucleico ocorre pela aplicação de um campo magnético.
[0087] A Figura 16 mostra um diagrama da cultura de planta onde
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27/34 o substrato é tratado com nuclease por integração com o sistema de fertirrigação.
[0088] Em todos os exemplos dos experimentos reportados, a composição de ácido nucleico usada em diferentes tratamentos foi preparada de acordo com o procedimento exposto na Figura 1. Em particular, o DNA total extraído com procedimentos padrão de material orgânico (folhas, micelos de fungos, biomassa microbiana) foi tratado por sonicação por pelo menos três ciclos de três minutos de duração na potência máxima com um sonicador por imersão até a obtenção da produção da composição de fragmentos aleatórios pertencentes à faixa de tamanho de 50 e 1000 bp. A verificação do nível de fragmentação é realizada pelos procedimentos padrão usando electroforese por agarose ou gel de poliacrilamida e técnicas de coloração, do tipo Sybrsafe e visualização por UV.
[0089] EXEMPLO 1: Inibição de plantas Acanthus mollis e Lepidium sativum por exposição aos DNAs próprios [0090] Um primeiro experimento foi realizado em plantas Acanthus mollis e Lepidium sativum, a última espécie sendo selecionada porque é particularmente sensível a toxinas. Os DNAs da acanthus, Acanthus mollis, e do agrião, Lepidium sativum, foram obtidos por extração direta das folhas das duas espécies e armazenadas em H2O destilada. Sucessivamente, 10 semente previamente esterilizadas de A. mollis ou
L. sativum em placas de Petri (de 9 cm de diâmetro) foram colocadas em uma folha de papel filtro estéril. As sementes de cada espécie foram tratadas separadamente com o DNA das duas espécies a concentrações de 2, 20 e 200 ppm enquanto H2O estéril foi adicionada ao controle. A germinação das duas espécies e o comprimento de raiz total foram quantificados após 7 dias de incubação a 24 °C por observação e medida das raízes. Cada tratamento foi repetido três vezes.
[0091] O tratamento das sementes das duas espécies com DNA
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28/34 extraído de plantas das duas espécies, aplicado separadamente, permitiu a estimativa do efeito do DNA no crescimento da raiz e a concentração de atividade ótima. Os resultados dos experimentos, reportados na Figura 2, mostram que tanto sementes de Lepidium e sementes de Acanthus são inibidas na geminação pela exposição a DNA próprio na concentração ótima de 200 ppm. Pelo contrário, a exposição de sementes ao DNA de outra espécie não mostrou efeitos observáveis na germinação de sementes.
[0092] EXEMPLO 2: Inibição de plantas Quercus ilex, Quercus pubescens, Hedera elix, Ampelodesma mauritanica, Festuca drimeja, Coronilla emerus, Medicago marina, Alnus cordata, Robinia pseudoacacia, e Pinus halepensis por exposição aos DNAs próprios [0093] Um segundo experimento referiu-se a análise da germinação e crescimento de raiz de 10 espécies de plantas de ambiente natural. Sementes com superfície esterilizada de plantas Quercus ilex, Quercus pubescens, Hedera elix, Ampelodesma mauritanica, Festuca drimeja, Coronilla emerus, Medicago marina, Alnus cordata, Robinia pseudoacacia, e Pinus halepensis, foram separadamente tratadas com os DNAs de todas as espécies aplicados na concentração de 500 ppm. A seguir, em placas de Petri (de 9 cm de diâmetro) foram colocadas 10 sementes de cada espécie em uma folha de papel filtro estéril. Os DNAs diferentes na concentração de 500 ppm foram adicionados às placas, enquanto que apenas H2O estéril foi adicionada ao contole. A germinação das sementes das espécies e o comprimento de raiz total foram quantificados após 7 dias de incubação a 24 °C por observação e medida das raízes. Cada tratamento foi repetido três vezes. Os resultados, reportados na Figura 3 (média dos testes realizados nas espécies diferentes reportadas acima), mostram a inibição da germinação resultando da exposição ao DNA próprio e a ausência de inibição na presença de DNA heterólogo.
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29/34 [0094] EXEMPLO 3: Inibição de plantas Arabidopsis thaliana, Lycopersicon esculentum, Lepidium sativum e Lens esculentum por exposição aos DNAs próprios [0095] Um terceiro experimento referiu-se a análise, novamente por testes de germinação e crescimento de raiz, da toxicidade em várias espécies de plantas por ácido nucleico extraído da mesma espécie. Os DNAs de Arabidopsis thaliana, Lycopersicon esculentum, Lepidium sativum e Lens esculentum foram obtidos por extração direta das plantas respectivas e armazenadas em H2O destilada. Sucessivamente, 10 sementes previamente esterilizadas de cada espécie foram colocadas em placas de Petri (de 9 cm de diâmetro) em uma folha de papel filtro estéril. As sementes de cada espécie foram tratadas separadamente com o DNA das quatro espécies a concentrações de 2, 20 e 200 ppm enquanto H2O estéril foi adicionada ao controle. Os experimentos foram realizados em salas de crescimento sob condições controladas e esterilidade completa. A germinação das quatro espécies e o comprimento radical total foram quantificados após 7 dias de incubação a 24 °C por observação e medida das raízes. Cada tratamento foi repetido três vezes. As quatro espécies mostraram um comportamento análogo, com um efeito inibidor notável na presença de DNA próprio e a ausência dos efeitos na presença de DNAs das outras espécies. O efeito inibidor provou ser positivamente correlacionado à concentração de DNA. Para propósitos exemplários, Arabidopsis thaliana na presença de DNA próprio e de Lycopersicon esculentum, são reportados. Resultados de inibição similares em Arabidopsis thaliana, quando sementes desta espécie são expostas ao DNA da mesma espécie obtido por amplificação de fragmentos do mesmo DNA usando técnicas de PCR, são observados.
[0096] EXEMPLO 4: Inibição de fungos Aspergillus niger e Trichoderma harzianum por exposição aos DNAs próprios
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30/34 [0097] Um quarto experimento foi realizado no fungo Aspergillus niger a fim de estimar o efeito de DNA próprio e do DNA isolado de outro fungo, ou seja, Trichoderma harzianum, no crescimento celular. Esporos de Aspergillus niger foram obtidos por culturas puras em laboratório em substrato tratado por ágar (PDA, ágar de dextrose de batata). Os esporos foram retirados sob condições de esterilidade e diluídos na concentração de 1 x 106 esporos/mL. O experimento de germinação foi realizado em substrato liquido (PDB a 10%) em placas de ELISA de 96 poços. O tratamento comparativo foi realizado com DNA de Trichoderma harzianum, usado como heterólogo, enquanto que o controle não foi tratado. DNAs extraídos de ambas as espécies foram aplicados a concentrações de 100 e 1000 ppm. A seguir, em cada poço, com um volume total de 100 pL, tais dois DNAs separadamente a diferentes concentrações, junto com 10 pL de substrato nutritivo líquido (PDB, broto de dextrose de batata), água estéril e esporos de A. niger foram adicionados. A germinação dos esporos e o comprimento do tubo germinador foram quantificados por leituras espectrofotométricas e por um microscópio óptico após 20 horas de incubação a 24 °C. Os resultados, reportados na Figura 5, mostram um efeito inibidor notável na germinação dos esporos e no crescimento de hifas de A. niger apenas quanto tal fungo foi exposto a DNA próprio.
[0098] EXEMPLO 5: Inibição do inseto Sarcophaga carnaria por exposição ao DNA próprio [0099] Um quinto experimento foi realizado no inseto Sarcophaga carnaria a fim de estimar o efeito de DNA próprio em seu ciclo de vida. Larvas da mosca Sarcophaga carnaria foram crescidas em cultura pura de laboratório na temperatura de 10 °C e alimentadas com carne moída. O experimento de toxicidade de DNA foi realizado em placas de plástico quadradas (de tamanho de 12 x 12 cm, altura de 2 cm). Os tratamentos comparativos foram realizados com DNAs de Bacillus sub
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31/34 tilis e Lepidium sativum, usados como DNA heterólogo. Como controle, apenas carne moída sem a adição de outros tratamentos foi usada. Os DNAs extraídos da mosca e das outras duas espécies foram adicionados à carne moída a concentrações de 2, 20 e 200 ppm, sob agitação de um agitador. A seguir o DNA foi adicionado em cada placa a várias concentrações, e agitado com 1 g de carne moída. As placas foram incubadas a 10°C no escuro por 21 dias. O desenvolvimento, sobrevivência e o tempo necessário para a formação das pupas foram monitorados a cada 3 dias pelos 21 dias de incubação. As larvas sob condições de controle, bem como aquelas tratadas com DNA heterólogo, mostraram um ciclo de vida normal. Pelo contrário, a exposição ao DNA próprio inibiu o ciclo de vida, causando a morte das larvas proporcionalmente à concentração de tratamento. As Figuras 6 e 7 reportam os resultados descritos acima.
[0100] EXEMPLO 6: Inibição do micro-organismo Bacillus subtilis por exposição ao DNA próprio [0101] Com a finalidade de demonstrar o possível uso do ácido nucleico como antibiótico, uma avaliação de toxicidade em Bacillus subtilis tratado com DNA próprio a várias concentrações foi realizada. O experimento foi realizado usando como substrato para crescimento 4 mL de LB (broto de Luria) inoculado com 10 pL de pé-cultura de Bacillus subtilis. O tratamento consistiu no preparo das culturas na presença de DNA de Bacillus subtilis nas concentrações finais de 4, 40 e 400 ppm. As culturas foram incubadas sob agitação a 35 °C por 24 horas com três repetições de tratamento. Após 24 horas de incubação, de cada tubo de ensaio, 0,5 mL foram retirados e serialmente diluídos em meio de LB, do qual 100 microlitros de meio de LB tratado com ágar foram colocados em placas de Petri. As placas foram incubadas a 28 °C até o aparecimento de colônias (CFU - unidades de formação de colônias). Os resultados reportados na Figura 8 mostram um de
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32/34 créscimo dependente de concentração notável de CFUs, em resposta ao tratamento.
[0102] EXEMPLO 7: Inibição do fungo Trichoderma harzianum por exposição ao DNA próprio [0103] Com a finalidade de demonstrar o possível uso do ácido nucleico como fungicida e a especificidade de ação deste, um experimento na germinação dos esporos no fungo Trichoderma harzianum foi realizado. Esporos de Trichoderma harzianum foram obtidos por culturas puras em laboratório em substrato tratado por ágar (PDA, ágar de dextrose de batata). Os esporos foram retirados sob condições de esterilidade e diluídos na concentração de 1 x 106 esporos/mL. O experimento de germinação foi realizado em substrato liquido (PDB a 10%) em placas de ELISA de 96 poços. O tratamento foi realizado com DNA homólogo ou heterólogo, ou seja, extraído da mesma espécie de Trichoderma, ou de uma espécie diferente de fungo (Aspergillus niger), de um inseto (Sarcophaga carnaria) ou de uma bactéria (Bacillus subtilis). O DNA extraído das diferentes espécies foi aplicado a concentrações de 8, 80 e 800 ppm. A seguir, em cada poço, com um volume total de 100 pL, o DNA separadamente a diferentes concentrações, junto com 10 pL de substrato nutritivo líquido (PDB, broto de dextrose de batata), água estéril e esporos de Trichoderma foram adicionados. A germinação dos esporos e o comprimento do tubo germinador foram quantificados por leituras espectrofotométricas e por um microscópio óptico após 20 horas de incubação a 24 °C.
[0104] A Figura 9 indica os resultados do experimento mostrando um efeito inibidor notável dependente da concentração na germinação dos esporos de Trichoderma apenas por DNA da mesma espécie de fungo. Pelo contrário, o tratamento com DNAs de várias espécies mostrou efeitos estimulantes na germinação (valores de porcentagem comparados ao controle não exposto maiores que 100%).
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33/34 [0105] EXEMPLO 8: Inibição da microalga Scenedesmus obliquus por exposição ao DNA próprio [0106] Com a finalidade de demonstrar o possível uso do ácido nucleico como algicida, um teste de crescimento da alga verde Scenedesmus obliquus sob condições de controle ótimas e a presença de DNA próprio foi realizado no substrato de cultura (CHU#10). Os tratamentos foram realizados em duas concentrações diferentes (50 e 500 ppm) com duas repetições. A Figura 10 mostra a dinâmica de crescimento das algas e mostram um efeito inibidor dependente de concentração notável do DNA homólogo quando comparado ao controle não exposto.
[0107] EXEMPLO 9: Inibição do protozoário Physarium polycephalum por exposição ao DNA próprio [0108] Com a finalidade de demonstrar o possível uso do ácido nucleico como um produto antiprotozoário, um experimento foi realizado no protozoário Physarium polycephalum. Como material experimental, o kit de cultura produzido de Carolina Biological Supply foi usado. As culturas iniciaram em placas de Petri com água-ágar a fim de favorecer o movimento do organismo. Como nutriente, flocos de aveia foram usados. Uma primeira cultura a granel foi realizada em 20 placas e biomassa de protozoário produzida após 15 dias foi coletada e usada para extração de DNA usando um kit Quiagen. O experimento sucessivo consistiu no preparo de três placas de Petri preenchidas com água-ágar ao qual duas porções dos flocos de aveia foram adicionadas, uma para o controle, umectadas com 5 mL de água destilada e a outra com adição de 5 mL de água com DNA do protozoário a uma concentração de 200 ppm. O experimento foi repetido outras duas vezes, com a variação de que o DNA adicionado foi de bactéria (Bacillus subtilis), e inseto (Sarcophaga carnaria). Os resultados dos experimentos mostraram a ausência de crescimento de Physarium polycephalum
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34/34 no substrato tratado com DNA do mesmo protozoário, enquanto que o organismo não mostrou diferenças de crescimento sob condições de controle ou presença de DNA heterólogo.
[0109] EXEMPLO 10: Estudo do processo de produção de leveduras, bactérias e algas em biorreatores e fotobiorreatores [0110] Considerando as demonstrações reportadas acima sobre o efeito inibidor em diferentes espécies quando expostas ao DNA próprio, análises de checagem foram realizadas na presença de DNA extracelular no substrato de crescimento em biorreatores e fotobiorreatores com culturas celulares a alta densidade quando condições de lentidão de crescimento, mesmo sob presença de substrato nutritivo ótima, ocorrem. O estudo envolveu a amostragem de líquido sobrenadante de diferentes culturas em biorreatores em etapas de crescimento exponencial, lentidão e estado estacionário. A análise referiu-se a culturas de leveduras Saccharomyces cerevisiae, de bactéria Bacillus subtilis e de microalgas Phaeodactylum tricornutum e Scenedesmus obliquus. Amostras de sobrenadantes da cultura celular obtidas por dois ciclos de centrifugação a 3000 rpm por 15 minutos foram analisadas a fim de separar possíveis resíduos de células e então sujeitas a eletroforese em gel após o tratamento com avaliação de Syber-Safe e de fluorescência. A Figura 11 mostra os resultados de algumas dessas análises do qual é aparente o acúmulo de DNA extracelular no substrato líquido dos biorreatores. Este acúmulo é claramente associado à lentidão do crescimento das culturas celulares diferentes e ao alcance da etapa de estado estacionário (Figuras 11A e 11B). A Figura 11C mostra claramente quando a remoção do DNA extracelular do meio de cultura por procedimentos físico-químicos e a introdução seguinte de substrato regenerado dentro do reator resultam na eliminação do efeito inibidor e uma restauração consequente do crescimento de cultura celular.

Claims (8)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método não terapêutico para controlar uma espécie alvo, caracterizado pelo fato de que compreende expor a referida espécie alvo a uma composição compreendendo DNA obtido por fragmentação aleatória de DNA total extraído ou por síntese de fragmentos aleatórios, a partir do DNA total, em que o dito DNA total é da referida espécie alvo ou a partir de uma espécie filogeneticamente semelhante, em que a espécie filogeneticamente semelhante é uma espécie da qual o DNA obtido por fragmentação aleatória do DNA total extraído ou por síntese aleatória de fragmentos a partir do DNA total é inibidor para a espéciealvo.
  2. 2. Método não terapêutico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a espécie a ser controlada é selecionada de espécies patogênicas, parasíticas ou infestantes.
  3. 3. Método não terapêutico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição é selecionada de um biocida, herbicida, fungicida, inseticida, acaricida, nematocida, antiprotozoário, algicida, ou bactericida.
  4. 4. Método não terapêutico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que, adicionalmente, compreende expor a espécie a ser controlada a compostos pesticidas selecionados do grupo que consiste em fungicidas, inseticidas, nematocidas, miticidas, artropocidas, bactericidas, ou algicidas.
  5. 5. Uso não médico de DNA de uma espécie obtida através de fragmentação aleatória de DNA total extraído ou por síntese de fragmentos aleatórios, a partir de DNA total, caracterizado pelo fato de que é para controlar as referidas espécies ou espécies filogeneticamente semelhantes, em que a espécie filogeneticamente semelhante é uma espécie inibida pelo referido DNA obtido por fragmentação aleatória do DNA total extraído ou por síntese aleatória
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    2/2 de fragmentos a partir do DNA total.
  6. 6. Uso não médico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o DNA é utilizado como um agente antipatogênico, anti-parasítico ou anti-infestante.
  7. 7. Uso não médico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o DNA é utilizado como um biocida, herbicida, fungicida, inseticida, acaricida, nematocida, antiprotozoário, algicida, ou bactericida.
  8. 8. Uso não médico, de acordo qualquer uma das reivindicações 5 a 6, caracterizado pelo fato de que, adicionalmente, compreende expor as espécies, a serem controladas, a compostos pesticidas selecionados do grupo que consiste em fungicidas, inseticidas, nematocidas, miticidas, artropocidas, bactericidas ou algicidas.
BR112015002185-9A 2012-08-02 2013-07-10 Método não terapêutico para controlar uma espécie alvo, e uso não médico de DNA de uma espécie obtida através de fragmentação aleatória de DNA total extraído ou por síntese de fragmentos aleatórios, a partir de DNA total BR112015002185B1 (pt)

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