JP6647042B2 - 寄生性、病原性又は雑草生物系の核酸を含む、前記系の増殖を阻害及び／又は制御するための組成物 - Google Patents

Description

本発明は、寄生性、病原性及びはびこる（infesting）生物系を阻害及び／又は制御するための前記系の核酸組成物、並びにこの調製方法に関する。さらに本発明は、バイオリアクター若しくは光バイオリアクターにおける高収量での微生物の製造／増殖、又は様々な培養系における植物の製造／増殖の改善を、前記生物により生成された核酸の分離により可能にする方法及び関連システムに関する。

長年にわたり、生物系を阻害する新製品の研究には、莫大な科学的、経済的及び工業的努力が必要とされており、実地試験及び臨床応用試験に加えて、天然供給源からの又は合成的な様式による有効成分の検出やインビトロ及びインビボの両方での一連の生物学的及び薬理学的試験が含まれる（Ｍｏｒｇａｎら ２０１１． Ｈｅａｌｔｈ Ｐｏｌｉｃｙ、１００：４〜１７頁）。

生物系を阻害するための薬剤使用（駆除剤、除草剤、抗生剤）は、様々な適用分野（その中でも、主に農業及び医薬の適用分野が存在する）に関しており、これにより病原性、寄生性、又ははびこる特性(infesting)であろうとなかろうと、有害生物の制御、阻害又は排除、及び同様に微生物のバイオフィルムの形成に対する処置が完遂される。

このように適用範囲が幅広く多様であるにもかかわらず、薬剤を使用することにより、（ｉ）作用の特異性、（ｉｉ）ヒト及び他の種に対する潜在的毒性、（ｉｉｉ）環境汚染、及び（ｉｖ）標的生物の個体群における耐性の発生のような共有問題が提起される。

一般的に薬剤（駆除剤、除草剤、抗生剤）は、小型及び中型の有機分子からなり、化学成分及び作用機構の両方に関して大きな多様性を示す。このような薬剤は、「ランダムスクリーニング」、すなわち天然の骨格からもたらされる様々な基本構造から出発するランダムな様式で合成して得られた化学化合物の活性及び使用可能性を推定する方法に基づいて一般的に検出されてきた。結果的に、この５０年の間に、非常に多くの製品が市販され、より最近ではポリヌクレオチドも市販された。

農業及び医薬において使用される現在の有効成分に関する主な問題の１つは、寄生生物、病原生物及び／又ははびこる生物(infesting organisms)に対する十分でない作用特異性、並びにその結果として、宿主生物における副作用及び毒性である。例えばパーキンソン病の発症に関連したパラコートの事例が知られており、製品はヒト胚に致死的であることが実証されている。急性毒性の問題に加えて、幾つかの製品への慢性的な曝露は発癌性に関する認識されたリスクを示す。これに対し、強制的規範は、生態毒性モニタリングを要求し、様々な製品の環境動力学及び環境持続性に関連した手法が用いられる。

最後に、薬剤（駆除剤、除草剤、抗生剤）により引き起こされる環境汚染の問題を無視するべきではない。環境分野における規制の最近の適用は、植物性薬剤（ｐｈｙｔｏｄｒｕｇ）及び駆除剤の使用に対する承認を大幅に減少させており、多くの製品が近い将来、より制限的な規制の施行に向けて放棄されなければならないであろう。例えば、土壌中の病原菌（その中には線虫がいる）の制御に燻蒸剤として広範に使用される臭化メチルは、オゾン層へのダメージに関与すると考えられる化合物に含まれるため禁止されている。

これらの問題を考慮して、より近代的な有効成分の大多数は、土壌又は作物中での迅速な分解に関して選択された。しかし、この環境汚染に関して見込みのある利点により、使用される有効成分の有効性が時間と共に制限される可能性がある。

農業分野及び医学分野での治療的適用の両方において現在使用されている製品に関して、別の根本的な共有問題は、治療の開始から一定期間後の薬理学的耐性の出現である。

例えば、６０年代初めの米国における農業に関して、２，４ Ｄは広範に使用された最初の除草剤であったが、ダウカス・キャロッタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）の個体群における耐性の発生が報告された（Ｓｗｉｔｚｅｒ、（１９５７）、Ｐｒｏｃ． Ｎｏｒｔｈ Ｅａｓｔｅｒｎ Ｗｅｅｄ Ｃｏｎｔ． Ｃｏｎｆ．、１１：３１５頁； Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ及びＳｗｉｔｚｅｒ、（１９６３）、Ｃａｎ． Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、４３：２５５頁）。７０年代初めから始まって次々に、トリアジンに対して耐性のはびこる種(infesting species)の多数の事例（Ｒｙａｎ，（１９７０）、Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．、１８：６１４； ＬｅＢａｒｏｎ及びＧｒｅｓｓｅｌ、Ｅｄｓ．、Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２）が報告された。その記録は次いでその後の数十年間に、化学的及び生物学的に対抗するための新製品の普及並びにこの製品の集約的使用と共に指数関数的に伸びた（Ｐｏｗｌｅｓ及びＳｈａｎｅｒ、２００１． Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｗｏｒｌｄ ｇｒａｉｎｓ、ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。

除草剤処理に対するはびこる種耐性(infesting resistance)の様々な発生機構が知られている。例えば、文献に報告されている様々な機構は、標的遺伝子の多重コピーの選択結果としての耐性（Ｇａｉｎｅｓら ２０１０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １０７（３）： １０２９〜１０３４頁）； 標的遺伝子の変異（Ｗａｋｅｌｉｎら ２００６． Ｗｅｅｄ Ｒｅｓ．（Ｏｘｆｏｒｄ）、４６（５）： ４３２〜４４０頁）； 液胞隔離（Ｇｅら ２０１０． Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｃｉ． ６６：５７６頁）；除草剤を代謝する酵素の発現（Ｈｉｄａｙａｔら １９９７． Ｐｅｓｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５７（２）： １３７〜１４６頁）である。

農業分野では現在、とりわけ同じ作用機構を特徴とする有効成分を使用した結果選択された、２００を超えるはびこる種(infesting species)における耐性の出現が検出された。イタリアではポー平野でのイヌホオズキ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）、シロザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）及びアマランサス・クルエンタス（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃｒｕｅｎｔｕｓ）のような草にはびこる個体群(population of infesting)におけるアトラジンに対する耐性の事例、又は、他の地域では種々の他の外部寄生種（ドクムギ（Ｌｏｌｉｕｍ）属種、ファラリス・パラドキサ（Ｐｈａｌａｒｉｓ ｐａｒａｄｏｘａ）、ヒナゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｒｈｏｅａｓ）、シナピス・アルベンシス（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｒｖｅｎｓｉｓ）、エキノコラ・クルスガリウムス（Ｅｃｈｉｎｏｃｌｏａ ｃｒｕｓｇａｌｌｉｕｍｓ）、セイバンモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｅ）、タマガヤツリ（Ｃｙｐｅｒｕｓ ｄｉｆｆｏｒｍｉｓ））における酵素的阻害剤に対する耐性を有する事例が知られている。

医学分野でも、薬剤に対する耐性の発生は、この薬剤の使用を無用にし、抗生物質療法に関する最大の問題の１つを構成している（Ｃｌａｔｗｏｒｔｈｙら ２００７． Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３（９）： ５４１〜５４８頁）。新たな分子を発見し耐性機構を研究するために、膨大な人的経済的資源が使用されたが、薬剤に対する耐性の出現は新薬の発見より速いことが判明した。

薬剤耐性の問題は、抗生物質療法に対する臨床上の厄介な問題（疾病期間の増加、合併症の増加、疫病の可能性）をもたらし、抗生物質耐性菌からの感染を治療するのに追加の費用を必要とする（さらなる薬剤の使用、故に入院の長期化により）ことから、健康分野における主要な世知（ｗｏｒｌｄ−ｗｉｓｅ）になった。公衆衛生にとってますます多く見られ、危険であり、院内感染の主な原因の１つとなっている抗生物質耐性の事例は、ブドウ球菌、及びとりわけ黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の様々な株のメチシリン耐性である。これらの細菌は、標的に対する親和性低下の機構によって、ベータラクタム抗生物質と相互作用しない修飾タンパク質を発現することができる。欧州連合は、耐性の発生を封じ込めるために薬物療法における抗菌剤の慎重な使用が推奨される「抗菌剤耐性に対する共同体戦略（Ｃｏｍｍｕｎｉｔａｒｉａｎ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」を示し、この問題に立ち向かっている。

アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に基づく組成物の使用がウイルスタンパク質翻訳を阻害し得ることが示されているＺａｍｅｃｎｉｋ及びＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎ論文の最初の発表以来、特定の遺伝子の発現を阻害する可能性は、大きな関心をもたらした。（Ｚｅｍｅｃｎｉｋ及びＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎ（１９７８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｋｉ． ７５：２８５〜２８８頁）。この発見の後、寄生性、病原性及びはびこる病原体(infesting agents)と戦う手法での最新の実験は、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はミトコンドリアＲＮＡのような、相補配列を示す標的に選択的に結合し、故にこの翻訳を阻害し、したがって標的種に対する制御活性を遂行する様々なＲＮＡ及び／又はＤＮＡ小型分子（様々な数十塩基のオーダー）の使用についてさらに調べた。

これらの最新の方法論は、寄生種（例えばＷＯ ２００５／０４９８４１ Ａ１）、はびこる植物（infesting plants）（例えばＷＯ ２０１１／１１２５７ Ａ１）への対抗、並びに抗菌剤療法及び腫瘍療法に適用を見出した。

現在使用されているアプローチは複数あり、その中には特定のＲＮＡメッセンジャーのレベルを制御し、故に該メッセンジャーをコードする遺伝子の発現を制限するためのＲＮＡの修飾がある。このような方法論は、特定の標的、例えば遺伝子又はこの部分を狙ったＲＮＡ又はＤＮＡ配列の適切な構築物を用いる投与を特徴とする。このような治療アプローチの使用に関連した問題には、治療標的としての特定の配列を特徴付ける必要があることが挙げられる。標的器官における構築物の有効最小濃度を得る難しさもある。さらに、アンチセンス技術の近況は、特定のＲＮＡを結合するＡＳＯの同定は今や比較的簡単であるが、特定の遺伝子の発現を阻害するための有効な適用可能性を示す組成物にこれを製剤化することは、依然として問題があることを明らかにしている。様々な最近の研究が前述の問題に対処し、より安定及び有効な構造及び組成物を提案している（例えばＷＯ ２０１１／０３１５２０ Ａ１）。よく知られているように、このタイプの手法は作用部位の特異性に関して上昇した選択性を示す。除草剤及び駆除剤処理におけるＡＳＯの適用が商業化及びこの後の製品の普及の段階にまだ達してしないことから、現在まで除草剤及び駆除剤処理におけるＡＳＯの使用に対する耐性の発生の事例は報告されていない。しかし、ＡＳＯの特定の作用特異性を考慮すると、この広範な使用並びにはびこる(infesting)、寄生性及び／又は病原性個体群に対するこの後の選択圧の結果、前記ＡＳＯの適用は、作用の特異性の上昇を特徴とする他の薬剤タイプについて過去に生じたのと同じように、処理された個体群において耐性の発生をもたらし、故に処理を無効にするであろうと推測することは現実的である。

バイオリアクター及び光バイオリアクター、したがって密閉され制御されたシステムでのバルク培養の分野において、微生物のバルク培養におけるまだ解決されていない重大な問題の１つが、前記生物の増殖曲線の飽和現象の発生（静止期）であり、この後、容積単位に関する特定の濃度を超えることができないことである。

このような微生物（細菌、光合成細菌、酵母、微細藻類及び藍藻類）の典型的な増殖曲線は、開始の潜伏期、次の対数期、及び増殖曲線が飽和する定常期を特徴とし、時としてこの後に細胞の死滅期が続くこともある。

微生物がリアクター及びバルク培養システムでの大規模培養中に達し得る、容積単位に関する最大濃度の閾値を超えられないことは、このような生物を活用する可能性を著しく制限し、静止期を超えた製造の潜在的増大をできないようにする。

飽和期における微生物の細胞増殖率の低下の原因として様々な動機付けが提案されており、全ては主に培地中の栄養要素の限界、又は光合成生物の場合、培養透過性放射（ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ）の自己限界（自己被陰（ｓｅｌｆ−ｓｈａｄｉｎｇ）現象）に関連している。様々な実験的研究が、増殖曲線飽和の現象は明らかな制限要因の非存在下でも同様に生じること、及びこの現象は培養培地への阻害物質の蓄積と関連していることを示した。

したがって、上記露呈されたことを踏まえると、先行技術方法の欠点を克服する、有害生物の阻害又は微生物の製造方法における収量の増加のための新たな方法の必要性は明らかである。

表題の発明は、土壌中の有機物質の循環に関する生態学的研究中に生じた重要な観察に由来する。これらの研究において、土壌蓄積有機材料の分解により放出されたＤＮＡは、植物種が前記有機材料を産生するのを阻害しているが、一方、前記ＤＮＡは、前記ＤＮＡが逆に栄養資源となり得る他の種を阻害しないとの検証が観察された。

森林の生態系の場合、相同なＤＮＡを有する植物種のみに対する特異的細胞外ＤＮＡのこの阻害効果は、様々な種の間の自然共生の調節機構となり、植物群落の生物多様性に有利に働く。事実、単一種が何らかの理由で他の種に対して自らの優位性を増大させるのに適した条件下にあるとき、やがて必然的に、自己の有機物質のより大きな残渣が蓄積し、この分解及び結果的なＤＮＡ放出が単一種に阻害効果をもたらし、故に競合能力、したがって優位性を低下させるであろう。同じ現象に基づくのが、農業におけるいわゆる「土壌の疲労」（又は「忌地」と呼ばれる）、すなわち、栄養的性質の問題でなく反復単一種栽培の植物残渣の蓄積に起因する、反復単一種栽培の生産性の将来的な喪失である。有機物質の循環中の自己ＤＮＡの蓄積による種特異的阻害の観察は、生産性の喪失の前述の現象を説明するが、前記知見が科学的文献で報告されたことはなかった。

これらの研究に基づき、微生物個体群（例えば細菌、微細藻類及び真菌）は、増殖中に自己ＤＮＡ分子を種々のサイズの断片の形態で産生及び分泌し、該断片は個体群増殖基質への蓄積により、前記個体群の増殖に対して阻害効果を発揮するという観察から成る第２の重要な結果が得られた。

微生物個体群は典型的には、最初に指数関数的に増殖し、次いでいわゆる静止期に入り、この後場合により死滅期に入ることが知られている。このような微生物個体群の様々な増殖制限要因が知られており、その中には基本的に、栄養限界及び／又は様々な性質の毒性物質の蓄積がある。文献に様々な生物からの細胞外ＤＮＡの産生及び分泌が報告されている（Ｐｅｔｅｒｓ及びＰｒｅｔｏｒｉｕｓ、２０１１． Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｌｉｎｉｃ Ａｃｔａ． ４１２：８０６〜８１１頁）が、微生物個体群の増殖中の細胞外ＤＮＡ放出が、土壌への自己ＤＮＡの蓄積により影響される植物について観察されたのと完全に同じ形で、前記個体群の増殖に対して阻害効果をもたらすことは現在まで報告されていない。本発明が基づく観察は、生物による自己ＤＮＡの放出が、前記生物及び同じ種個体群生物の増殖を調節していることを証明する一般的な生物学的法則を明らかにする。この結果は、農医薬分野に新たな注目すべき適用シナリオをもたらす。特に、任意の有害種の制御は、有機物質の分解の自然循環中、又は微生物個体群の増殖中の細胞外分泌現象中に観察されるものを再現するように、自己の全ＤＮＡ、ランダム断片化ＤＮＡに曝露することにより可能になる。故に有効成分が、制御される種の全ＤＮＡ及びランダム断片化ＤＮＡから成る組成物の可能性のある用途が仮定される。

以下に例証される試験は、任意の処理種に対するこのような方法の有効性を示すものである。報告されている試験は容易に再現可能な実験であり、特定の標的遺伝子の配列決定及び／又は検出に関して、処理される種のゲノムのいずれの演繹的知識も必要としない。阻害組成物を調製するには、標的種の有機材料由来（例えば植物の葉、真菌菌糸体、微生物バイオマス由来）の全ＤＮＡの抽出、及び前記抽出ＤＮＡの連続的ランダム断片化のみで十分である。本発明の設定手順は土壌中の有機物質の自然分解プロセスを真似ており、何万個の塩基から成る様々なサイズのポリヌクレオチドの混合物をもたらす。制御される種の全ＤＮＡに相当するこのような断片は、相同なＤＮＡを有する生物に対して高度に選択的な効果をもたらす一方、単一の標的遺伝子には作用しなく、高度に選択的な効果は逆に、様々なタイプのアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合に生じる。この側面は、処理個体群における耐性の出現の可能性を排除するため注目すべき利点となる可能性がある。なぜなら生物が、全ての自己機能の阻害に対する耐性を同時に発生することは恐らくできないためである。事実、寄生性、病原性及びはびこる(infesting)病原体の個体群における耐性現象の発生速度は、このような耐性に関与する遺伝子の数に密接に相関することが科学的文献により知られている。より正確には、耐性発生に必要な遺伝子の数が低ければ低いほど、制御される個体群の内部でこの耐性が積極的に選択される速度は高まる（Ｐｒａｔｈｅｒら ２０００． 除草剤耐性：定義及び管理戦略（Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ： ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．） Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｏａｋｌａｎｄ−Ｂｒｅｎｔ及びＨｏｌｌｏｍｏｎ、２００７． 作物病原菌における殺菌剤耐性：いかに管理し得るか？（Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃｒｏｐ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ： ｈｏｗ ｃａｎ ｉｔ ｂｅ ｍａｎａｇｅｄ？） Ｃｒｏｐｌｉｆｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｂｒｕｓｓｅｌ）。

本発明はしたがって、阻害される種の同じゲノムと同一又は類似の全自己ＤＮＡのランダム断片が有効成分のように使用される、寄生種、病原種及び／又ははびこる種(infesting species)を阻害するための組成物の使用に関する。さらに本発明は、全ＤＮＡの前記ランダム断片を含む組成物に関する。

さらに、本発明の発明者らは、バイオリアクター若しくは光バイオリアクターにおける微生物の製造／増殖、又は水耕栽培系、土壌外若しくは土壌中の基質における植物の製造／増殖のための、前記微生物又は植物の核酸の分離による方法及び関連システムを開発した。

本特許出願において、以下、用語「飽和レベル」は、培養培地における核酸又はこの断片の濃度が、微生物の増殖の過程に関して、この増殖曲線が飽和した状態の定常期をもたらすような微生物の増殖の過程において確立された段階を意味する。

同様に、用語「エキゾースト培地（ｅｘｈａｕｓｔ ｍｅｄｉｕｍ）」は、核酸及びこの断片の濃度レベルが、微生物の増殖過程での飽和レベルをもたらす濃度に達した培養培地を意味する。

用語「再生（ｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）」に関して、これは、核酸及びこの断片をエキゾースト培地から除去するのに適した操作を意味する。

「再生培地（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）」は、エキゾースト培地の再生後に得られた培地を意味する。

本発明は、全自己ＤＮＡの抽出物への生物の曝露が、前記生物の機能に対して阻害効果をもたらし、故に増殖を制限し、又は細胞レベルで基本的にこの生理機能を妨げるという実験的証拠に基づく。

詳細には、特定の断片の何らかの選択をすることなく、又は特定の構築物を使用することなく抽出及び投与された寄生生物、病原生物及び／又は外部寄生生物の全ＤＮＡが、該生物又は同一若しくは類似のゲノムを有する他の生物に対する阻害生成物として使用され得る。阻害作用は、寄生種、病原種及び／又は外部寄生種が、この増殖基質内で又は全身レベルで、ランダムに断片化された全自己ＤＮＡと接触される場合に発揮される。吸収されると、このようなＤＮＡは、「遺伝子サイレンシング」又は「ＲＮＡ干渉」効果を目的として特異的核酸配列を適用する場合に生じる以外に、増殖に対する制限効果及び生物の様々な機能性に対する一般化阻害効果をもたらす。吸着及び阻害活性は、該系が曝露される核酸の濃度レベル及び断片化レベルに依存する。より高い効果は、使用分子の断片化程度（例えば超音波処理後又は自然分解後の）に依存することが指摘されている。実験は、ＤＮＡ断片の様々な平均長を用いて実施され、阻害効果は、約２００塩基のより長い長さ頻度を有する断片混合物に関してより有効であることが判明している。

具体的には、例示的実験により様々な種から抽出された全ＤＮＡのランダム断片の製造は、断片化法が阻害効果の有効性に影響を与えないことを実証するために、様々なアプローチで実施された。前記断片化は、自然分解（環境因子への曝露）、人工的分解（燃焼、酵素的又は機械的方法により）を用いて、又は合成（ＤＯＰ（すなわち変性オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによる）のようなランダム増幅方法）により実施することができる。

本発明の著者らは、植物、真菌、昆虫、酵母、藻類及び原虫について研究を実施した。このような実験の結果は、任意の処理種に対する記載された阻害効果の一般的存在を明白に示した。

植物の場合、単純な抽出により得られ、ランダムに断片化され、また低濃度の、同じ種の根と接触している水溶液中の１つの種の全ＤＮＡの存在は、徹底的な壊死、葉の白化、分裂組織活性の中断を急速にもたらし、種子と接触している場合は、発芽力の抑制を急速にもたらす。反対に、種々の種のランダムに断片化された全ＤＮＡの溶液に１つの種の根及び／又は種子が曝露されると、高濃度での曝露についても顕著な阻害をもたらさず、すなわち高い種特異的効果を示す。したがって、増殖環境におけるランダムに断片化された全ＤＮＡの存在が、他の種に影響を与えることなく、同一又は類似のゲノムを有する生物において選択的阻害機能を果たし得ることは明らかである。全ＤＮＡが人工的に断片化され、生物系の増殖培地に挿入される場合、及びＤＮＡが前記生物系によりこの増殖中に産生され、分泌される場合の両方でこの阻害効果を発見することができる。

これはしたがって、寄生種、病原種及び／又は外部寄生種に特異的なＤＮＡを含有する製剤で処理することにより、この種に対してのみ標的とされる作用を可能にし、起こり得る反復曝露の場合にも、前記分子は標的種に対してのみ阻害効果を示すが、保護されるべき種又は他の種に対しては阻害効果を示さないという大きな利点を有する。

本発明の発明者らにより観察された同じ原理は、バイオリアクター及び光バイオリアクター、水耕栽培用タンク、並びに土壌外の培養系における微生物の製造方法の収量を増加させるために有利に使用することができる。事実、本発明の発明者らは、藻類、酵母及び細菌の増殖用バイオリアクターを用いる実験室試験により、漸増濃度で増殖期中に、同じ製造微生物に属する様々なサイズのＤＮＡ断片（約５０〜８００ｂｐ）の上清蓄積を観察した。この蓄積は漸増濃度で増殖期に生じ、これは、バイオリアクター中で定常期及び次の死滅期に達したとき、前記培養物の増殖に対して阻害効果をもたらすことが観察された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。

実験的試験は、所与の種の培養液が同じ種の培養液の上清によってのみ阻害されることを示すことから、自己阻害種特異的効果が存在することを指摘した。さらに、培養培地からのＤＮＡの除去は阻害効果を除去するのに適しており、増殖期を復元し、バイオリアクター（図１１Ｃ）及び光バイオリアクター中でより高い細胞密度に到達できるようにすることが観察された。

同様に、循環栄養溶液の完全交換がない製造減少の存在下、植物の水耕栽培用タンクにおいて、培養種のＤＮＡの基質への蓄積が観察された。この場合もまた、増殖基質から蓄積されたＤＮＡの除去は、生産性を回復することを可能にした。

したがって、これらの実験結果を考慮すると、製造を最適化するために、細胞培養液（バイオリアクター及び光バイオリアクター）、水耕栽培タンク及び土壌外の培養系に生じるＤＮＡを除去するための技術システムを開発することが可能である。

したがって本発明の具体的な目的は、全ＤＮＡ断片の混合物を含む又は全ＤＮＡ断片の混合物から成る組成物の使用であり、前記全ＤＮＡは、植物又は環境の少なくとも１つの病原種、寄生種又は外部寄生種に対する予防及び治療のためにランダムに断片化され、前記全ＤＮＡは、前記予防及び治療が対象とされる前記病原種、寄生種若しくは外部寄生種、及び／又は少なくとも１つの系統的に類似の種の全ＤＮＡである。上記に述べられているように、本発明による断片混合物は、断片の任意選択を実施することなく、すなわち核酸から得られた全ての断片を用いて、前記予防及び治療が対象とされる前記病原種、寄生種又は外部寄生種から抽出された全ＤＮＡの断片化により得られる。したがって本発明により、ランダムに断片化されたＤＮＡ全体（すなわち、特定の配列及び／又は特定のサイズの配列の任意選択を実施することなく）が使用される。前記全ＤＮＡの断片は、抽出された全ＤＮＡのランダム断片化により、又は全ＤＮＡから開始するランダム断片合成により得られる。「遺伝子サイレンシング」及び「ＲＮＡ干渉」の現在の手法と比較した本発明の手法の実質的な差は、現在の技術水準では、使用される核酸の特定の領域が積極的に選択されなければならないのに対し、本発明又は事前知識の手法の場合はいずれも、使用される特定の配列の選択が必要でないことである。前記全ＤＮＡは、前記少なくとも１つの病原種、寄生種若しくは外部寄生種から抽出され得、又は人工的に合成され得る。核酸は、化学的及び／又は物理的タイプの手順により増幅及び／又は断片化することができ、得られた断片は、場合によりさらに増幅され得る。全ＤＮＡのランダム断片の製造方法には、例えば、化学的、生化学的及び分子的方法、超音波処理法、熱処理、並びに熱分解処置が挙げられる。例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来の葉組織から全ＤＮＡを抽出した後、同じ種由来の種子を断片化されていない形態でＤＮＡを含有するこのような抽出物に曝露させると、有意な阻害効果を示さない。これとは別に、８０％出力で３分間にわたる３又は４サイクルの浸漬超音波処理器を用いて抽出物を超音波処理した後、得られた断片化程度に応じてシロイヌナズナ種子の発芽に対する阻害活性が増加する様々なサイズのランダム断片の混合物が生じる。シロイヌナズナから抽出された全ＤＮＡのランダム断片の同じ混合物は、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ａｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）及びエンバク（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）（この実験で対照バイオテストとして使用された）のような他の処理種に対して阻害効果を示さなかった。全ＤＮＡの抽出物が他の上記の化学的−物理的方法でランダムに断片化された場合、類似の結果が観察された。最後に、同じ結果は、全ＤＮＡのランダム断片がＤＯＰを用いる全ＤＮＡの増幅により得られた、前記断片の混合物にシロイヌナズナの種子を曝露すると得られた。組成物は、殺生物剤、除草剤、殺真菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、抗原虫剤、殺藻剤、殺菌剤として使用することができる。組成物は、表面接触、細胞親和性投与、全身投与（例えば、注射、摂取若しくは吸入、又は吸着による）により、前記少なくとも１つの病原種、寄生種又は外部寄生種に投与することができる。組成物は、分散液（例えばエアロゾルの形態の）、懸濁液、水和剤又は可溶性粉末、水中エマルジョン又は他の溶媒、分散性顆粒、マイクロカプセルの懸濁液、乳剤、流体ペースト、マクロエマルジョン、油分散液、ベイトから成る群において選択される乾燥処理又は液体処理のための形態で製剤化することができる。特定の実施形態によれば、核酸ランダム断片はベクターで改変することができる。本発明による組成物は、殺真菌剤、殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、殺節足動物剤（ａｒｔｒｏｐｏｃｉｄｅ）、殺菌剤、殺藻剤から成る群から選択される駆除剤をさらに含んでもよい。

本発明はさらに、植物又は環境の少なくとも１つの病原種、寄生種又は外部寄生種に対する予防又は治療のための方法であって、ａ）前記予防及び治療が対象とされる少なくとも１つの前記病原種、寄生種又は外部寄生種の全ＤＮＡの抽出、ｂ）ＤＮＡランダム断片の混合物を得るための前記全ＤＮＡのランダム断片の製造、並びにｃ）前記ランダム断片の混合物と前記病原種、寄生種又は外部寄生種との接触を含む又はから成る前記方法に関する。

ヒト又は動物の少なくとも１つの病原種、寄生種又は外部寄生種に対する予防及び治療において使用するための全ＤＮＡランダム断片の混合物を含む又はから成る組成物であって、前記全ＤＮＡが、前記予防及び治療が対象とされる前記少なくとも１つの病原種、寄生種又は外部寄生種のＤＮＡである上記組成物が、本発明のさらなる目的である。前記全ＤＮＡランダム断片は、化学的及び／若しくは物理的方法による全ＤＮＡの分解により、又は前記全ＤＮＡのランダム断片の合成により得ることができる。本発明による組成物は、懸濁液、水和剤又は可溶性粉末、水中エマルジョン又は他の溶媒、分散性顆粒、マイクロカプセルの懸濁液、乳剤、流体ペースト及びマクロエマルジョン、油分散液、クリーム、カプセル及び錠剤の形態で、乾燥若しくは液体処理、又はエアロゾル分散液用に製剤化することができる。投与経路には、注射、吸収、摂取及び吸入による接触治療又は表面治療、全身治療及び細胞親和性治療、並びに適用目的に有用な任意の他の投与経路が挙げられる。本発明による組成物は、粘着付与剤、湿潤剤、懸濁化剤、賦形剤、改質剤及び溶媒、界面活性剤として作用する他の化学化合物、並びに適用目的に有用な他の物質との混合物を含んでもよい。最後に、本発明による組成物は、製剤及び、拮抗的ではないが場合により相乗的な媒体と治療活性との混合物中に他の医薬化合物を含んでもよい。このような場合、化合物の組み合わせは一般的に、重量比約０％から１００％に対応することになる。

バイオリアクター又は光バイオリアクターにおける微生物の高収量製造のための、又は土壌内及び土壌外の両方での植物の培養系のための方法も、本発明の具体的な目的である。該方法は、前記方法により製造された同じ生物由来の核酸が培養培地から除去され、前記核酸が取り除かれた培養培地が前記方法において再び使用され得ることを特徴とする。

本発明の方法によれば、核酸は、外付け容器、及び電場、磁場、又は電磁場の生成システム、及び少なくとも１つのダクト、及び前述のシステムから濃縮された核酸を抽出するための少なくとも１つの排出手段から好ましくは成る外付け除去ユニット；全部が同じバイオリアクター内に統合されている、電場、磁場、又は電磁場の生成システム、及び少なくとも１つのダクト、及び前述のシステムから濃縮された核酸を抽出するための少なくとも１つの排出手段から好ましくは成る統合除去ユニット；ユニットの原位置及び外部で適用可能な手法、好ましくは遠心分離法；濾過法；ＤＮＡｓｅ及び核酸の他の分解酵素による処理；熱処理；酸性化処理から成る群から選択される分離法を用いて、培養培地又は増殖基質から除去される。

好ましくは、本発明の方法によれば、前記核酸は、静電場の印加、静磁場の印加、動磁場及び／又は動電場の印加、遠心分離、濾過、ＤＮＡｓｅによる処理、熱処理、酸性化処理から成る群から選択される手法を用いて、少なくとも１つの外付け統合除去ユニット若しくはバイオリアクター統合除去ユニット若しくは光バイオリアクター統合除去ユニット、又は水耕栽培システムにより培養培地から除去される。

少なくとも１つのバイオリアクター若しくは光バイオリアクター又は水耕栽培システム、前記少なくとも１つのバイオリアクター若しくは光バイオリアクター又は水耕栽培システムに外付けの少なくとも１つの核酸除去ユニットを含む微生物の製造システムが、本発明の隠された態様である。前記核酸除去ユニットは、核酸を含有する培養培地を除去するための少なくとも１つの第１ダクト、及び少なくとも１つの第１排出手段、並びに核酸が除去されている培養培地を、前記少なくとも１つのバイオリアクター若しくは光バイオリアクター又は水耕栽培システムに再導入するための少なくとも１つの第２ダクト、及び少なくとも１つの第２排出手段により、前記少なくとも１つのバイオリアクター若しくは光バイオリアクター又は水耕栽培システムに接続されており、前記システムはさらに、分離された核酸を除去するための少なくとも１つの第３排出手段を含む。好ましくは前記ダクトはチューブであってもよい。前記排出手段は、好ましくはポンプであってもよい。

培養培地の再生利用は、増殖期中に培養培地からＤＮＡを除去するための処理を連続して用いること、及び細胞増殖の飽和期が現れるときのエキゾースト培地の処理を実施することにより実現可能である。

培養培地の再生利用は、酵素若しくは、細胞培養液の上清で生じるＤＮＡの分解に活性な他の化合物による処理を用いて、又は電場、磁場若しくは電磁場の印加法を用いて、バイオリアクター又は光バイオリアクターにおいて「その場で」直接実施することができる。これらの手法を用いる再生利用は、核酸分子の極性特性（したがって電場により分離可能）を利用して、又はＤＮＡ分子を磁性分子に結合し、これを分離するために磁場を印加してＤＮＡ分子を磁化する手法を用いて、実行可能であることが判明している。或いは、再生利用は、再生培地が再循環するバイオリアクター（図１２Ａ）若しくは水耕栽培（図１３Ａ）の外側に置かれた除去システム、又はバイオリアクター統合（図１２Ｂ）若しくは水耕栽培統合（図１３Ｂ）除去システムを用いて実施されてもよい。

培養培地からＤＮＡを除去するための手法は、静電場の印加法（図１４）；静磁場の印加法（図１５）；動磁場及び／又は動電場の印加法；遠心分離；濾過法；ＤＮＡｓｅによる処理；熱処理；酸性化処理であってもよい。

本発明の好ましい実施形態において（図１２Ａ）、前記少なくとも１つのバイオリアクター（１）は、核酸を含有する培養培地を除去するための少なくとも１つの第１ダクト（２）、及び少なくとも１つの第１排出手段（３）により、エキゾースト培養培地が少なくとも前記１つの除去ユニット（４）に移されるような方法で、前記少なくとも１つの外付け除去ユニット（４）に接続され得る。このようなユニット（４）において、再生利用は、培地からのＤＮＡ除去のための前述の手法の１つを用いて実施することができる。この時点で、分離された核酸は、好ましくは分離された核酸を除去するための少なくとも１つの第３ダクト（５）及び少なくとも１つの第３排出手段（６）により、除去ユニット（４）により回収されることになるのに対し、再生培地は、少なくとも１つの第２ダクト（７）及び少なくとも１つの第２排出培地（８）により、前記少なくとも１つのバイオリアクター（１）に再導入されることになる。

さらに、露地又は保護培養における施肥潅漑装置と核酸の除去システムとの統合は、本発明のさらなる適用である。このような適用の考えられる略図は、ヌクレアーゼを含有する溶液を備えたタンクが施肥潅漑装置に統合されている図１６に報告されている。

農業及び医薬において寄生種、外部寄生種及び／又は病原種を制御及び阻害するための全ＤＮＡランダム断片の使用は、既存の手法及び製品と比較して重大な利点をもたらす。

第１の利点は、寄生種、外部寄生種及び／又は病原種の全ＤＮＡランダム断片による処置の完全な選択性に起因する。なぜなら、前記全ＤＮＡランダム断片は、処置された種と異なる種に対して効果を示さないためである。

寄生種、外部寄生種及び／又は病原種の全ＤＮＡランダム断片の使用は、この作用機構が、翻訳系及びタンパク質合成系全体によるゲノム全体への多重及び同時干渉に基づいており、故に特定の耐性及び耐性個体群の選択を起こさせないため、現在市販されている又は実験中の製品（ＲＮＡ干渉及びＡＳＯの方法を含む）のものと異なることから、同じ種個体群における耐性の出現を誘導しない。

さらなる利点は、一次代謝産物で自然に遍在し環境汚染をもたらさない核酸の使用に起因する毒性の欠如からもたらされる。事実、非特異的核酸断片の投与は、処理種以外の種に対する毒性を示さない。

本発明はさらに、新薬研究の著しい簡素化を提供し、結果的に多大な経済的利益をもたらす。事実、寄生種、病原種及び外部寄生種の検出が、薬物治療のための特定の薬剤の調製に必要な唯一の条件となっている。反対に、ＲＮＡ干渉又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用のような手法に基づく製品に関する現在の薬理学的研究は、阻害活性が標的にされる可能性のある特定の配列を検出するために、標的生物の全ゲノム配列の知識だけでなく、遺伝子機能の詳細な知識も必要とする。

一方、伝統的な薬理学的研究は、合成化合物又は天然分子の「ランダムスクリーニング」研究に基づく。このような物質はこの活性について検出及び試験されると、大多数の場合、他の生物及びヒトに対する一般的毒性によっても特徴付けされる。実際には、このような製品の適用は、この毒性による環境汚染の懸念にしばしば関連している。

さらなる利点は、表題特許の要件を満たす核酸の比較的容易な可用性及び大量生産に起因する。事実、標的生物の全ＤＮＡのランダム断片は、生体分子分野において現在非常に普及されているアプローチ及び方法論により得ることができる。該手法は、標的生物からの遺伝子材料の抽出に基づいていてもよく、又は合成によっていてもよい。

さらに、ＤＮＡ断片の安定性は、不利な環境条件下（例えば土壌中）でも経時的持続性を確保し、したがって、環境的及び経済的利益の両方をもたらす耐久性のある適用をもたらす。

さらなる利点は、提案された使用のためのＤＮＡが、天然材料からの抽出、又は合成法及び抽出法に基づく合成、並びに分子生物学において同様に現在広く普及及び確立されている増幅により得ることができるという事実に起因する。可能性のある製造法の重要だが制限的でない例は、細胞組織の溶解、細胞ヌクレアーゼの不活化、及び生物学的溶解物を含有する溶液からの核酸の回収を含む。

核酸は、種々のアプローチによりテンプレート分子又はデノボから開始してさらに合成することができる。

検討される分子は増幅することができ、故に例えばクローニング又はＰＣＲベースの手法により、検討されるテンプレートに同一又は類似の多重コピーを製造することができる。

ＰＣＲバリアントは、使用される有効成分を生成するために有用であり、テンプレート試料由来の核酸断片のランダム増幅を確保する。例えば、ランダム増幅多型ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）（ＲＡＰＤ）のようなアプローチは、伝統的なＰＣＲ、開始ＤＮＡテンプレート配列の知識以外に必要としない本発明者らの目的に極めて適している。

エマルジョンＰＣＲは、３００〜８００ヌクレオチド長断片を得るように微粒化されたゲノムＤＮＡ試料、又は他のアプローチにより得られたアンプリコンから開始する様々なＤＮＡ断片の増幅を、非常に迅速な方法で確保するのに適した革新的アプローチの別の例である。

さらに、バイオリアクター及び光バイオリアクター並びに水耕栽培用タンクにおける微生物の製造方法に関して、エキゾースト培養培地の除去及び「再生」培地への細胞の再懸濁は、容積単位に関して等しい細胞濃度、及び同じ輪郭条件（ｃｏｎｔｏｕｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で、培養増殖期の復元を可能にする。

阻害要因の除去に起因する製造の増加の利点に加えて、さらなる注目すべき利点は、エキゾースト培地をこの再生後に他の連続培養のために再利用する可能性、現在の製造システムでは実行不可能な可能性に起因する。

以下、本発明を、具体化している例及び添付された図面を特に参照して、例示的に、例示的であるが制限的でない様式で、記載する。

本発明の目的の概念図を示す図である。 ２００ｐｐｍの最適濃度での自己ＤＮＡへの曝露によるマメグンバイナズナ属（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ）及びアカンサス属（Ａｃａｎｔｈｕｓ）の種子の発芽の阻害を示す図である。 自己ＤＮＡへの曝露によるクエルクス・イレックス（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｉｌｅｘ）、クエルクス・プベスケンス（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、ヘデラ・ヘリックス（Ｈｅｄｅｒａ ｅｌｉｘ）、アンペロデスマ・モーリタニカ（Ａｍｐｅｌｏｄｅｓｍａ ｍａｕｒｉｔａｎｉｃａ）、フェスツカ・ドリメジャ（Ｆｅｓｔｕｃａ ｄｒｉｍｅｊａ）、コロニラ・エメルス（Ｃｏｒｏｎｉｌｌａ ｅｍｅｒｕｓ）、メディカゴ・マリナ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｍａｒｉｎａ）、アルヌス・コルダタ（Ａｌｎｕｓ ｃｏｒｄａｔａ）、ニセアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、アレッポマツ（Ｐｉｎｕｓ ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ）植物の阻害を示す図である。 自己ＤＮＡ及びトマトＤＮＡへの曝露によるシロイヌナズナ植物の阻害を示す図である。 クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）が自己ＤＮＡ又は他の真菌種ＤＮＡ（トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｔｉａｎｕｍ））に曝露される場合の、前記真菌の胞子発芽及び菌糸増殖に対する阻害効果を示す図である。 自己ＤＮＡへの曝露によるサルコファガ・カルナリア（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ ｃａｒｎａｒｉａ）昆虫の阻害を示す図である。 ３つの異なる濃度の相同なＤＮＡに４週間曝露されたサルコファガ・カルナリア双翅目の幼虫、又は真菌（ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））若しくは細菌（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））抽出された非相同ＤＮＡにおける完全変態を、非曝露対照と比較したパーセンテージで示す図である。 ３つの異なる濃度の相同なＤＮＡに２４時間曝露された培養液中の枯草菌細菌、及び非曝露対照における生存細胞数を示す図である。 ３つの異なる濃度の相同なＤＮＡ、又は他の真菌（クロコウジカビ）、昆虫（サルコファガ・カルナリア）若しくは細菌（枯草菌）から抽出された非相同ＤＮＡに曝露された培養液中のトリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）真菌における胞子の発芽を、非曝露対照と比較したパーセンテージで示す図である。 異なる濃度の相同なＤＮＡに曝露された２つの培養液中のセネデスムス・オブリクス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ）微細藻類、及び非曝露対照における成長動態を示す図である。 ２つの異なるバイオリアクターの液体基質への細胞外ＤＮＡの蓄積を示す図である。 （ａ）ＤＮＡ除去のための外付けユニットから特徴付けられるバイオリアクターにおける微生物の製造システムの略図；（ｂ）培養培地からのＤＮＡの除去がバイオリアクター統合除去ユニットにより生じる、バイオリアクターにおける微生物の製造システムの略図を示す図である。 （ａ）外付け除去ＤＮＡユニットの存在及び水耕システム内の培養培地の再循環から特徴付けられる水耕栽培用タンク；（ｂ）培養培地からのＤＮＡの除去が、同じタンクに統合された除去ユニットにより生じる水耕栽培用タンクを示す図である。 核酸の分離が電場の印加により生じる、図１２に示されたシステムに関する外付け除去ユニットの具体的な略図を示す図である。 核酸の分離が磁場の印加により生じる、図１２に示されたシステムに関する除去ユニットのさらなる略図を示す図である。 基質が施肥潅漑システムとの統合によりヌクレアーゼで処理される、植物栽培の略図を示す図である。

報告された実験の全ての例において、種々の処理で使用された核酸組成物は、図１に概説された手順に従って調製された。特に、標準的手順で有機材料（葉、真菌菌糸体、微生物バイオマス）から抽出された全ＤＮＡは、５０から１０００ｂｐサイズ範囲にあるランダム断片の組成物の製造を得るまで、浸漬超音波処理器を用いて最大出力で３分間にわたる少なくとも３サイクルの超音波処理により処理された。断片化レベルの検証は、アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル電気泳動及び染色法（Ｓｙｂｒセーフタイプ及びＵＶ可視化）を用いて標準的手順により実施される。

（例１）自己ＤＮＡへの曝露によるハアザミ（Ａｃａｎｔｈｕｓ ｍｏｌｌｉｓ）及びコショウソウ（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）植物の阻害
最初の実験は、ハアザミ及びコショウソウ植物で実施し、後者の種は毒素に特に感受性であるため選択した。アカンサス（ハアザミ）及びオランダガラシ（コショウソウ）のＤＮＡは２つの種の葉からの直接抽出により得、蒸留水中で保存した。引き続いて、ペトリ皿（直径９ｃｍ）中のハアザミ又はコショウソウの以前に滅菌した種子１０個を１枚の滅菌濾紙に置く。各種の種子を２、２０及び２００ｐｐｍの濃度で２つの種のＤＮＡにより別々に処理する一方、滅菌水を対照に添加した。２つの種の発芽及び総根長を、２４℃、７日間のインキュベーション後に根の観察及び測定により定量化した。各処理は３回繰り返した。

２つの種の植物から抽出されたＤＮＡによる２つの種の種子の処理は、別々に適用され、根の成長に対するＤＮＡの効果及び最適活性濃度の推定を可能にした。図２に報告された実験の結果は、マメグンバイナズナ属の種子及びアカンサス属の種子は両方とも、２００ｐｐｍの最適濃度での自己ＤＮＡへの曝露により発芽において阻害されることを示している。反対に、他の種由来のＤＮＡへの種子の曝露は、種子発芽に対する顕著な効果を示さない。

（例２）自己ＤＮＡへの曝露によるクエルクス・イレックス、クエルクス・プベスケンス、ヘデラ・ヘリックス、アンペロデスマ・モーリタニカ、フェスツカ・ドリメジャ、コロニラ・エメルス、メディカゴ・マリナ、アルヌス・コルダタ、ニセアカシア、アレッポマツ植物の阻害
第２の実験は、１０種の天然の環境植物の発芽及び根の成長の分析に関する。クエルクス・イレックス、クエルクス・プベスケンス、ヘデラ・ヘリックス、アンペロデスマ・モーリタニカ、フェスツカ・ドリメジャ、コロニラ・エメルス、メディカゴ・マリナ、アルヌス・コルダタ、ニセアカシア、アレッポマツ植物の表面滅菌種子を、５００ｐｐｍの濃度で適用した全ての種のＤＮＡで別々に処理した。簡潔には、ペトリ皿（直径９ｃｍ）中で各種の種子１０個を１枚の滅菌濾紙上に置く。５００ｐｐｍの濃度で種々のＤＮＡを皿に添加したのに対し、滅菌水のみを対照に添加した。該種の種子の発芽及び総根長を、２４℃、７日間のインキュベーション後に根の観察及び測定により定量化した。各処理は３回繰り返した。図３に報告された結果（上記に報告された種々の種において実施した試験の平均）は、自己ＤＮＡへの曝露に起因する発芽の阻害、及び非相同ＤＮＡの存在下の阻害の欠如を示す図である。

（例３）自己ＤＮＡへの曝露によるシロイヌナズナ、トマト、コショウソウ及びレンズマメ（Ｌｅｎｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）植物の阻害
第３の実験は、同じ種から抽出された核酸による様々な植物種に対する毒性の、やはり発芽及び根の成長試験による評価に関する。シロイヌナズナ、トマト、コショウソウ及びレンズマメのＤＮＡを、それぞれの植物からの直接抽出により得、蒸留水中で保存した。引き続いて、各種の以前に滅菌した種子１０個をペトリ皿（直径９ｃｍ）中で滅菌濾紙からの１枚に置く。各植物の種子を２、２０及び２００ｐｐｍの濃度で４つの種のＤＮＡにより別々に処理する一方、滅菌水を対照に添加した。実験は、制御条件下及び完全無菌下で生育室で実施した。４つの種の発芽及び総根長を、２４℃、７日間のインキュベーション後に根の観察及び測定により定量化した。各処理は３回繰り返した。４つの種は類似の挙動を示し、自己ＤＮＡの存在下では注目すべき阻害効果を、他の種のＤＮＡの存在下では効果の欠如を示した。阻害効果は、ＤＮＡ濃度に正に相関することが判明した。例示目的のために、自己ＤＮＡ及びトマトＤＮＡの存在下でのシロイヌナズナをそれぞれ報告する。シロイヌナズナにおける類似の阻害結果は、この種の種子が、ＰＣＲ法を用いて同じＤＮＡの断片の増幅により得られた同じ種のＤＮＡに曝露される場合に観察される。

（例４）自己ＤＮＡへの曝露によるクロコウジカビ及びトリコデルマ・ハルジアナム真菌の阻害
第４の実験は、細胞増殖に対する、自己ＤＮＡ及び他の真菌、すなわちトリコデルマ・ハルジアナムから単離されたＤＮＡの効果を推定するために、クロコウジカビ真菌で実施した。クロコウジカビの胞子を、寒天処理基質（ＰＤＡ、ポテトデキストロース寒天）における実験室での純粋培養により得る。胞子を無菌条件下で除去し、１×１０^６胞子／ｍｌの濃度で希釈した。発芽実験は、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート中の液体基質（ＰＤＢ １０％）で実施した。比較処理を、非相同なものとして使用したトリコデルマ・ハルジアナムのＤＮＡを用いて実施したのに対し、対照は処理しなかった。両方の種から抽出されたＤＮＡは、１００及び１０００ｐｐｍの濃度で適用した。簡潔には、１００μｌの総容積を有する各ウェルに、別々に異なる濃度の前記２つのＤＮＡを、１０μｌの液体栄養基質（ＰＤＢ、ポテトデキストロースブロス）、滅菌水及びクロコウジカビ胞子と共に添加した。胞子の発芽及び胚芽管の長さを、２４℃、２０時間のインキュベーション後に、分光光度読み取り及び光学顕微鏡により定量化した。図５に報告された結果は、クロコウジカビの胞子の発芽及び菌糸増殖に対する注目すべき阻害効果を、このような真菌が自己ＤＮＡに曝露された場合にのみ示している。

（例５）自己ＤＮＡへの曝露によるサルコファガ・カルナリア昆虫の阻害
第５の実験は、生活環に対する自己ＤＮＡの効果を推定するためにサルコファガ・カルナリア昆虫で実施した。サルコファガ・カルナリア双翅目の幼虫を、１０℃の温度で実験室純粋培養で成長させ、ひき肉を給餌した。ＤＮＡ毒性の実験は、正方形のプラスチックプレート（サイズ１２×１２ｃｍ、高さ２ｃｍ）中で実施した。比較処理を、非相同ＤＮＡとして使用した枯草菌及びコショウソウのＤＮＡを用いて実施した。対照として、他の処理を加えないひき肉のみを使用した。双翅目及び他の２つの種抽出ＤＮＡを、ミキサー撹拌下、２、２０及び２００ｐｐｍの濃度でひき肉に添加した。簡潔には、ＤＮＡを各プレートに１ｇのひき肉と共に撹拌して様々な濃度で添加した。プレートを暗所で２１日間、１０℃でインキュベートした。発育、生存及び蛹の形成に要した時間を、２１日間のインキュベーションにわたり３日ごとにモニターする。対照条件下の幼虫、及び非相同ＤＮＡで処理した幼虫は、正常な生活環を示した。反対に、自己ＤＮＡへの曝露は、生活環を阻害し、処理濃度に比例して幼虫の死をもたらした。図６及び７は、上記の結果を報告するものである。

（例６）自己ＤＮＡへの曝露による枯草菌微生物の阻害
抗生剤としての核酸の使用可能性を実証するために、様々な濃度で自己ＤＮＡにより処理した枯草菌に対する毒性の評価を実施した。実験は、１０μｌの枯草菌前培養液を植菌した４ｍｌのＬＢ（ルリアブロス）を増殖基質として用いて行った。処理は、４、４０、及び４００ｐｐｍの最終濃度の枯草菌ＤＮＡの存在下での培養液の調製から構成された。培養液を３５℃、２４時間、撹拌下でインキュベートし、処理を３回繰り返した。２４時間のインキュベーション後、各試験管から０．５ｍｌを除去し、ＬＢ培地に連続希釈し、これから１００マイクロリットルの寒天処理ＬＢ培地をペトリ皿に播種した。プレートを、コロニーの出現（ＣＦＵ−コロニー形成単位）まで２８℃でインキュベートした。図８に報告された結果は、処理への反応としてＣＦＵの注目すべき濃度依存的減少を示している。

（例７）自己ＤＮＡへの曝露によるトリコデルマ・ハルジアナム真菌の阻害
殺真菌剤としての核酸の使用可能性及びこの作用特異性を実証するために、トリコデルマ・ハルジアナム真菌における胞子の発芽に関する実験を実施した。トリコデルマ・ハルジアナムの胞子は、寒天処理基質（ＰＤＡ、ポテトデキストロース寒天）における純粋実験室培養により得た。胞子を無菌条件下で除去し、１×１０^６胞子／ｍｌの濃度で希釈した。発芽実験は、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート中の液体基質（ＰＤＢ １０％）で実施した。処理は、トリコデルマ属の同じ種、又は真菌（クロコウジカビ）の種々の種、昆虫（サルコファガ・カルナリア）、又は細菌（枯草菌）から抽出された相同又は非相同ＤＮＡで実施した。種々の種から抽出されたＤＮＡを、８、８０及び８００ｐｐｍの濃度で適用した。簡潔には、１００μｌの総容積を有する各ウェルに、別々に異なる濃度のＤＮＡを、１０μｌの液体栄養基質（ＰＤＢ、ポテトデキストロースブロス）、滅菌水及びトリコデルマ胞子と共に添加した。胞子の発芽及び胚芽管の長さを、２４℃、２０時間のインキュベーション後に、分光光度読み取り及び光学顕微鏡により定量化した。

図９は、トリコデルマ胞子の発芽に対する注目すべき濃度依存的阻害効果を、同じ真菌種のＤＮＡによってのみ示す実験の結果を示している。反対に、様々な種のＤＮＡによる処理は、発芽に対する刺激効果を示す（１００％より高い非曝露対照と比較したパーセンテージ値）。

（例８）自己ＤＮＡへの曝露によるセネデスムス・オブリクス微細藻類の阻害
殺藻剤製品としてのＤＮＡ使用可能性を実証するために、最適対照条件及び自己ＤＮＡ存在下、セネデスムス・オブリクス緑藻の増殖試験を培養基質（ＣＨＵ＃１０）で実施した。処理は、２つの異なる濃度（５０及び５００ｐｐｍ）で実施し、２回繰り返した。図１０は、藻の増殖動態を示し、非曝露対照と比較した相同なＤＮＡの注目すべき濃度依存的阻害効果を示している。

（例９）自己ＤＮＡへの曝露によるモジホコリ（Ｐｈｙｓａｒｉｕｍ ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）原虫の阻害
抗原虫剤製品としてのＤＮＡ使用可能性を実証するために、実験をモジホコリ原虫で実施した。実験材料として、「Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ」から製造された培養キットを使用した。生物の運動に有利に働くように、培養はウォーター寒天を含むペトリ皿で開始した。養分として、オートムギフレークを使用した。最初のバルク培養は２０個のプレートで実施し、１５日後に製造された原生動物バイオマスを回収し、Ｑｕｉａｇｅｎキットを用いるＤＮＡ抽出のために使用した。連続実験は、ウォーター寒天を充填した３枚のペトリ皿の調製、この２枚への少量のオートムギフレークの添加（対照用の一方は５ｍｌの蒸留水で湿らせ、他方は濃度２００ｐｐｍの原虫のＤＮＡを含む水５ｍｌを添加）から成った。実験を、添加したＤＮＡが細菌（枯草菌）及び昆虫（サルコファガ・カルナリア）由来である変形形態でもう２回繰り返した。実験結果は、同じ原虫のＤＮＡで処理した基質におけるモジホコリの増殖の欠如を示したのに対し、該生物は、対照条件下又は非相同ＤＮＡ存在下で増殖の差を示さなかった。

（例１０）バイオリアクター及び光バイオリアクターにおける酵母、細菌及び藻類の製造方法試験
自己ＤＮＡに曝露された場合の種々の種に対する阻害効果について上記に報告された実証試験を考慮して、最適栄養基質存在下でも増殖減速状態が生じる場合の、高密度の細胞培養液を有するバイオリアクター及び光バイオリアクターにおける増殖基質中の細胞外ＤＮＡ存在に関して、成品分析を実施した。試験は、指数増殖期、減速期及び定常期におけるバイオリアクター中の種々の培養液の液体上清のサンプリングを伴った。分析は、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母、枯草菌細菌及びフェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）及びセネデスムス・オブリクス微細藻類の培養液に関した。３０００ｒｐｍで１５分間、２サイクルの遠心分離により得られた細胞培養上清の試料を、見込まれる細胞残渣を分離するために分析し、次いでＳｙｂｅｒ−Ｓａｆｅによる処理後のゲル電気泳動、及び蛍光評価に供した。図１１は、幾つかのこれらの分析の結果を示しており、このことからバイオリアクターの液体基質への細胞外ＤＮＡの蓄積は明白である。この蓄積は、種々の細胞培養液の増殖の減速、及び定常期の到達に明らかに関連するものである（図１１Ａ及び１１Ｂ）。図１１Ｃは、化学的物理的手順による培養培地からの細胞外ＤＮＡの除去と、これに続くリアクターへの再生基質の導入が、阻害効果の排除、及び結果的な細胞培養増殖の復元をもたらすことを明らかに示している。

Claims (10)

1. 植物、真菌、昆虫、ダニ、線虫、藻類／微細藻類、原虫、及び細菌からなる群から選択される標的種を阻害する非治療的方法であって、
   抽出された全ＤＮＡのランダム断片化によって、あるいは全ＤＮＡから開始するランダム断片合成によって得られるＤＮＡを含む組成物を、該標的種に曝露することを含み、
   該全ＤＮＡが、該標的種のものか、系統的類似種由来のものであり、
   ここで、系統的類似種は、抽出された全ＤＮＡのランダム断片化によって、あるいは全ＤＮＡから開始するランダム断片合成によって得られる、そのＤＮＡが標的種を阻害する種であり、
   前記ＤＮＡは、５０から１０００ｂｐサイズ範囲にあるＤＮＡを含む、
   上記方法。
2. 前記阻害される種が、病原種、寄生種若しくははびこる種（infesting species）から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記組成物が、除草剤、殺真菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、抗原虫剤、殺藻剤又は殺菌剤組成物から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 殺真菌剤、殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、殺節足動物剤、殺菌剤、殺藻剤から成る群から選択される駆除剤化合物を制御される種に曝露することをさらに含む、
   請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 病原種、寄生種若しくははびこる種（infesting species）から選択される標的種に対する治療処置における使用のための、
   抽出された全ＤＮＡのランダム断片化によって、あるいは全ＤＮＡから開始するランダム断片合成によって得られるＤＮＡを含む組成物であって、
   該全ＤＮＡが、該標的種のものか、系統的類似種由来のものであり、
   ここで、系統的類似種は、抽出された全ＤＮＡのランダム断片化によって、あるいは全ＤＮＡから開始するランダム断片合成によって得られる、そのＤＮＡが標的種を阻害する種であり、
   該使用において、抽出された全ＤＮＡのランダム断片化によって、あるいは全ＤＮＡから開始するランダム断片合成によって得られるＤＮＡが該標的種を阻害する製品として使用され、
   前記ＤＮＡは、５０から１０００ｂｐサイズ範囲にあるＤＮＡを含む、
   上記組成物。
6. さらに殺真菌剤、殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、殺節足動物剤、又は殺菌剤から成る群から選択される駆除剤化合物を含む、請求項５に記載の組成物。
7. 植物、真菌、昆虫、ダニ、線虫、藻類／微細藻類、原虫、及び細菌からなる群から選択される標的種の阻害用薬剤の製造における、抽出された全ＤＮＡのランダム断片化によって、あるいは全ＤＮＡから開始するランダム断片合成によって得られるＤＮＡの使用であって、
   ここで、抽出された全ＤＮＡのランダム断片化によって、あるいは全ＤＮＡから開始するランダム断片合成によって得られる該ＤＮＡが、該標的種のものか、系統的類似種由来のものであり、そして
   系統的類似種は、抽出された全ＤＮＡのランダム断片化によって、あるいは全ＤＮＡから開始するランダム断片合成によって得られる、そのＤＮＡが標的種を阻害する種であり、
   該使用において、抽出された全ＤＮＡのランダム断片化によって、あるいは全ＤＮＡから開始するランダム断片合成によって得られるＤＮＡが該標的種の阻害剤として使用され、
   前記ＤＮＡは、５０から１０００ｂｐサイズ範囲にあるＤＮＡを含む、
   上記使用。
8. 薬剤が、抗病原、抗寄生若しくは抗はびこる種用薬剤（anti-infesting agent）として使用される、請求項７に記載の使用。
9. 薬剤が、除草剤、殺真菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、抗原虫剤、殺藻剤又は殺菌剤として使用される、請求項７に記載の使用。
10. 薬剤が殺真菌剤、殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、殺節足動物剤、殺菌剤、殺藻剤から成る群から選択される駆除剤化合物を更に含む、請求項７から９のいずれか一項に記載の使用。