IT202100021392A1 - Improved inhibitory DNA compositions and use thereof, in particular integrated with metabolic treatment to enhance inhibitory effects. - Google Patents

Improved inhibitory DNA compositions and use thereof, in particular integrated with metabolic treatment to enhance inhibitory effects. Download PDF

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IT202100021392A1
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Description

Composizioni di DNA inibitorie migliorate e relativo uso, in particolare integrate con un trattamento metabolico per potenziare gli effetti inibitori
La presente invenzione riguarda composizioni di DNA inibitorie migliorate e relativo uso, in particolare integrate con un trattamento metabolico per potenziare gli effetti inibitori.
In particolare, la presente invenzione riguarda composizioni adatte per inibire una specie target o una cellula cancerosa target di una specie, metodi e usi delle composizioni, in cui le composizioni comprendono sequenze di DNA secrete dalle cellule di una specie identica o filogeneticamante simile alla specie target o da una cellula cancerosa affetta dallo stesso cancro della cellula cancerosa target di una specie. Le composizioni secondo la presente invenzione possono essere vantaggiosamente usate in qualsiasi campo in cui l?inibizione di una specie o di una cellula cancerosa ? vantaggiosa, per esempio nella medicina umana e/o veterinaria o nell?agricoltura per il controllo di parassiti o malattie.
? noto che il controllo di specie dannose e della proliferazione cellulare ? stato affrontato mediante approcci diversi, incluso l?uso di antimicrobici, fagi e composti chemioterapici. Questi trattamenti presentano effetti collaterali dannosi quali tossicit? generale e resistenza sia in ceppi microbici sia in cellule cancerose.
In entrambi i campi del controllo di specie dannose e della terapia contro il cancro, uno dei principali obbiettivi ? la riduzione dei dosaggi efficaci dei diversi agenti attivi o composti terapeutici per ottenere il controllo desiderato con una limitazione degli effetti collaterali come gli effetti di tossicit?.
Per ci? che riguarda il controllo di specie dannose, ? stato recentemente riscontrato che DNA extracellulare frammentato produce un effetto inibitorio su una specie da cui il DNA ? derivato e su una specie filogeneticamante simile avente un genoma simile ( WO2014/020624). In altre parole, i risultati hanno dimostrato che l?effetto inibitorio di frammenti di self-DNA ? specie-specifico.
In particolare, frammenti di DNA auto-inibitori vengono ottenuti mediante una frammentazione casuale di DNA totale isolato dalla specie da inibire (o da una specie filogeneticamente simile) o mediante una sintesi di frammenti di DNA casuale a partire dal DNA totale della specie (o da una specie filogeneticamente simile).
L?effetto inibitorio di frammenti di DNA autoinibitori ? stato dimostrato in diversi organismi viventi che appartengono a diversi regni, inclusi piante, alghe, batteri, funghi, protozoi, insetti.
Secondo queste conoscenze, ogni specie dannosa pu? essere vantaggiosamente controllata mediante il suo stesso DNA. Infatti, diversi esperimenti hanno dimostrato che aumentare le concentrazioni di self-DNA influiva negativamente su ogni specie testata mentre il DNA eterologo non aveva alcuna influenza su di essa. L?inibizione osservata su una specie pu? essere prodotta mediante frammenti casuali del suo stesso DNA genomico con un?inibizione dipendente dal dosaggio. Sono stati riportati effetti significativi per diverse specie a concentrazioni di DNA nel substrato in crescita o nel cibo della specie target solitamente superiori a 100 ppm.
Pi? recentemente, questa scoperta ? stata confermata da altri autori che riportano effetti significativi a livelli di concentrazione di self-DNA simili con un?inibizione crescente della crescita e dello sviluppo di radici su piante di fagioli a concentrazioni di 50, 100, 150 e 200 ppm (Duran-Flores e Heil, 2018).
? altres? noto che self-DNA frammentato pu? essere rilasciato da specie ospiti diverse dalla specie target, come descritto nella domanda di brevetto WO2020167128.
Alla luce di quanto sopra, risulta pertanto evidente la necessit? di fornire nuovi prodotti e metodi per il controllo di specie dannose e la proliferazione cellulare, che superino gli svantaggi di prodotti e metodi noti e/o presentino efficacia potenziata.
La presenza di DNA libero circolante nell?ambiante ? una conoscenza stabilita (si veda la review di Nagler, 2018). L?origine di tale DNA ambientale pu? essere correlata sia a lisi cellulare e al conseguente rilascio di contenuti genomici sia a processi attivi di secrezione da parte di cellule viventi. La secrezione di acidi nucleici da parte di cellule viventi ? stata ampiamente riportata nella letteratura scientifica (Blesa e Berenguer, 2015; Draghi e Turner, 2006; Kalluri e LeBleu, 2016; Thierry et al., 2016). Il tasso di secrezione ? stato correlato al tasso di proliferazione dei tessuti secretori (Blesa e Berenguer, 2015). ? stato anche riportato che la produzione di esosomi contenenti frammenti di DNA aumenta in cellule senescenti (Lehmann et al.,2008).
Inoltre, vi sono molte prove nella letteratura scientifica di DNA libero circolante nel sangue in relazione al cancro. La presenza di piccole quantit? di DNA da cellule tumorali nel DNA libero da cellule (cfDNA) circolante nel plasma o siero di pazienti con un cancro ? stata dimostrata per la prima volta pi? di 30 anni fa (van der Vaart e Pretorius, 2007).
Sebbene il meccanismo di secrezione e rilascio del DNA da cellule viventi rimane da chiarire, sono state avanzate diverse ipotesi in merito a possibili funzioni:
- segnalazione da cellula a cellula (
2015; Monticolo et al., 2020);
- trasferimento genico orizzontale (
2015; 2006);
- trasformazione oncogena ( 2016).
Recentemente, (
2017) hanno dimostrato che l?inibizione della secrezione di esosomi in cellule umane ha dato come risultato un accumulo di DNA nucleare nel citoplasma provocando una risposta immunitaria innata e la produzione di ROS. Gli autori hanno concluso che la secrezione di esosomi pu? fungere da meccanismo di difesa per un accumulo di DNA citoplasmatico dannoso.
Secondo la presente invenzione, ? stato ora trovato che il self-DNA secreto dalle cellule di una specie (o dalle cellule di una specie filogeneticamente simile) mostra effetti inibitori potenziati su detta specie rispetto al self-DNA totale della stessa specie (o di una specie filogeneticamente simile).
? noto che una cellula pu? rilasciare self-DNA extracellulare sia mediante secrezione sia mediante rottura o lisi della cellula. Con il termine self-DNA totale si intende, nella presente, il DNA genomico compreso in una cellula di una specie che pu? essere estratto dalla cellula o il DNA extracellulare totale comprendente il DNA rilasciato mediante rottura o lisi della cellula e DNA secreto. Pertanto, il self-DNA secreto ? un sottogruppo del self-DNA totale, vale a dire, il self-DNA secreto ? DNA attivamente secreto da una cellula vivente. In particolare, il self-DNA secreto ? costituito da una miscela di sequenze di DNA con sequenze diverse.
Secondo la presente invenzione, ? stato trovato che l?inibizione nota di una specie da parte di self-DNA totale, self-DNA genomico o self-DNA extracellulare, pu? essere significativamente potenziata usando solo self-DNA secreto.
I risultati sperimentali mostrano che il self-DNA secreto pu? esercitare un?inibizione pi? specifica rispetto al self-DNA totale.
Pi? in particolare, self-DNA secreto derivato da una specie da inibire (o da una specie filogeneticamente simile) o mediante sintesi ha dimostrato effetti inibitori potenziati rispetto a frammenti di self-DNA ottenuti mediante una frammentazione casuale di self-DNA totale isolato dalla specie da inibire (o da una specie filogeneticamente simile) o mediante una sintesi di frammenti di DNA casuale a partire dal DNA totale della specie (o da una specie filogeneticamente simile).
Gli esempi di seguito dimostrano che il self-DNA secreto ? in grado di inibire una specie ad un dosaggio significativamente inferiore rispetto al self-DNA totale. Non si verifica nessuna inibizione quando le cellule sono trattate con secretomi prodotti da cellule di una specie diversa. Questi risultati sono stati ottenuti su cellule batteriche, di lievito e umane.
Inoltre, secondo la presente invenzione, ? stato sorprendentemente trovato che, in una specie, gli effetti inibitori di self-DNA secreto sono specifici contro una cellula che esprime le stesse funzioni (vale a dire, gli stessi pathway genetici/metabolismo) delle cellule da cui il self-DNA ? secreto.
Gli esempi dimostrano che il secretoma di cellule cresciute in diverse condizioni fisiologiche ? diverso. Frammenti di DNA estratti dai surnatanti di cellule di lievito cresciute con metabolismo respiratorio o fermentativo sono stati sequenziati. I risultati hanno rivelato che sono stati secreti diversi sottogruppi del DNA genomico totale.
Come menzionato sopra, l?effetto inibitorio del self-DNA secreto ? pi? che specie-specifico poich? ? superiore per cellule che esprimono le stesse funzioni (vale a dire, pathway genetici/metabolismo) delle cellule il cui secretoma ? stato ottenuto.
Infatti, secondo gli esempi, cellule di lievito fermentative mostrano livelli superiori di inibizione quando sono esposte al secretoma estratto da cellule di lievito che esprimono un metabolismo fermentativo simile, mentre si osserva un effetto inibitorio inferiore se le stesse cellule sono trattate con un secretoma estratto da cellule di lievito che esprimono solo un metabolismo respiratorio. Questi risultati sono stati ottenuti con cellule batteriche, di lievito e umane.
Questa scoperta pu? essere vantaggiosamente applicata a cellule tumorali di una specie per cui i risultati sono stati particolarmente sorprendenti.
Secondo la presente invenzione, ? stato innanzitutto testato l?effetto inibitorio di DNA estratto da linee cellulari tumorali contro la stessa linea cellulare (ES-2) e contro una linea cellulare umana sana (HaCat). Quindi, ? stato testato l?effetto inibitorio del terreno di crescita contenente solo il secretoma della linea cellulare tumorale, senza DNA rilasciato mediante rottura o lisi delle cellule, sulle stesse cellule e sulla linea cellulare sana.
I risultati dimostrano che l?effetto inibitorio di self-DNA secreto su cellule tumorali ? superiore rispetto all?effetto inibitorio di self-DNA totale estratto.
Non si osserva alcun effetto inibitorio usando self-DNA estratto o secreto da una linea cellulare diversa.
Pertanto, secondo la presente invenzione, ? stato trovato che il self-DNA secreto pu? essere vantaggiosamente usato al fine di inibire o controllare un organismo target di una specie o una popolazione di cellule cancerose target di un organismo o di una specie. L?inibizione o il controllo di un organismo target di una specie si ottiene usando self-DNA secreto dalle cellule della stessa specie (o di una specie filogeneticamente simile) dell?organismo. L?inibizione o il controllo di una popolazione di cellule cancerose di un organismo di una specie si ottiene usando self-DNA secreto da una cellula cancerosa affetta dallo stesso cancro della cellula cancerosa target di una specie che ? a sua volta identica alla specie della cellula target. Self-DNA secreto dalla cellula cancerosa pu? essere ottenuto dallo stesso soggetto da trattare o da un soggetto diverso della stessa specie, per esempio da una linea cellulare cancerosa.
Inoltre, secondo la presente invenzione, ? stato riscontrato che gli effetti inibitori del self-DNA secreto su una specie target o su una popolazione di cellule cancerose target di una specie vengono migliorate mediante la combinazione con un diverso trattamento, come un trattamento che inibisce le specie target o la cellula cancerosa target o un trattamento metabolico, mostrando una specificit? rafforzata dell?effetto inibitorio. Ci? ? stato dimostrato nelle seguenti prove di concetto (POC, Proof of Concept) di trattamenti combinati:
- Trattamento con fago/self-DNA su specie batteriche resistenti;
- Trattamento con impulso di glucosio/self-DNA su cellule sia di lievito sia tumorali;
- Trattamento con chemioterapia/self-DNA su cellule tumorali resistenti a cisplatino.
I risultati sperimentali dimostrano che la combinazione di self-DNA con un trattamento con fagi nei batteri ? in grado di potenziare gli effetti inibitori rispetto all?uso di fagi da soli.
Inoltre, ? stato riscontrato che la combinazione di esposizione a self-DNA secreto e a livelli di glucosio elevati induce una mortalit? cellulare specifica in cellule sia di lievito sia tumorali.
In particolare, cellule di lievito cresciute in un bioreattore iniziano a morire quando inibite dall?accumulo di DNA secreto e sono, al tempo stesso, esposte a concentrazioni di zucchero elevate. Risultati simili sono stati ottenuti altres? con linee cellulari tumorali. Infatti, ? stato dimostrato che l?esposizione combinata di cellule tumorali al loro stesso secretoma e a impulsi di glucosio (vale a dire, una somministrazione improvvisa di glucosio concentrato al terreno di coltura) induce un effetto apoptotico.
Quest?ultimo risultato possiede una potenziale rilevanza terapeutica considerando l?elevata specificit? dell?effetto inibitorio del secretoma e l?incapacit? di cellule cancerose di modulare il tasso di assorbimento di glucosio (a differenza delle cellule sane). Pertanto, una terapia per il cancro che comprende l?esposizione di cellule cancerose a DNA secreto dalle cellule cancerose e a concentrazioni elevate di zucchero pu? fornire un mezzo efficace per prendere di mira specificatamente cellule cancerose in vivo.
L?efficacia della combinazione di DNA secreto dalle cellule cancerose e concentrazioni elevate di zucchero ? altres? confermata da simulazioni modello. Le simulazioni modello dimostrano l?effetto dell?esposizione combinata a inibitori della crescita e a diversi livelli di insulina su linee cellulari tumorali e sane. Un trattamento per il cancro integrato con self-secretoma seguito da un incremento di glucosio ha dato come risultato una totale remissione del cancro dovuta all?induzione di morte cellulare indotta da zucchero (SICD, Sugar Induced Cell Death) in cellule tumorali mediante l?inibizione della loro crescita specifica.
La morte cellulare indotta da zucchero (SICD) ? un fenomeno osservato in cellule di lievito, dove si riporta la morte improvvisa di popolazioni di lievito in fase stazionaria dopo un?esposizione a glucosio ( 2003). Recentemente, de Alteriis et al. (2018) hanno fornito un presunto meccanismo per tale fenomeno evidenziando le similarit? metaboliche tra cellule di lievito e cancerose correlate al disequilibrio di livelli intracellulari di ATP associato alle dinamiche di assorbimento di glucosio e al pathway di glicolisi. In relazione a ci?, ? altres? rilevante considerare che la maggior parte delle cellule cancerose presenta mutazioni che aumentano l?assorbimento di glucosio rispetto a cellule sane ( 2016; 2008).
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un metodo non terapeutico per inibire una specie target, detto metodo comprendendo o essendo consistente nell?esporre detta specie target a sequenze di DNA secrete dalle cellule di una specie di partenza (source species) o ad una composizione comprendente dette sequenze di DNA, in cui
detta specie di partenza ? selezionata tra una specie che ? la stessa specie della specie target o una specie filogeneticamente simile alla specie target.
Secondo la presente invenzione, il termine ?specie? si riferisce a un concetto astratto e una specie come tale non pu? essere inibita. I riferimenti ad una specie devono dunque essere intesi indicare individui od organismi della specie, come una pluralit? di individui od organismi della specie, vale a dire, una popolazione.
Il termine ?specie target? si riferisce a specie infestanti, patogene, parassite. Il termine comprende altres? specie che sono cresciute con un metabolismo specifico, per esempio metabolismo aerobico o anaerobico, o cresciute in presenza di una fonte di carbonio specifica o in presenza di nutrienti specifici, come per esempio azoto, fosforo.
Un elenco di specie target viene descritto ulteriormente pi? avanti.
Il termine ?specie di partenza? si riferisce ad una specie da cui sono derivate le sequenze di DNA secrete. Ci? significa che le sequenze di DNA secrete possono essere effettivamente secrete dalle cellule di detta specie di partenza o possono essere sintetizzate con la stessa sequenza di quelle effettivamente secrete dalle cellule di detta specie.
Come menzionato sopra la specie di partenza pu? essere selezionata tra una specie che ? la stessa specie della specie target o una specie filogeneticamente simile alla specie target.
Il termine specie di partenza comprende altres? specie che sono cresciute con lo stesso metabolismo specifico della specie target, per esempio metabolismo aerobico o anaerobico, o cresciute in presenza della stessa fonte di carbonio specifica della specie target o in presenza degli stessi nutrienti specifici della specie target, come per esempio azoto, fosforo.
Pertanto, sequenze di DNA secrete secondo la presente invenzione non sono solo specie-specifiche, ma all?interno della stessa specie, le sequenze di DNA secrete sono in grado di inibire pi? efficacemente la specie target (rispetto al self-DNA genomico totale o alle sequenze di DNA secrete dalle cellule della specie cresciuta con un metabolismo diverso) quando dette sequenze di DNA sono secrete dalle cellule della specie di partenza che viene cresciuta con lo stesso metabolismo specifico della specie target.
Il termine ?specie filogeneticamente simile? si riferisce a una specie avente un genoma simile. L?esperto comprender? che specie che sono strettamente correlate filogeneticamente hanno un genoma pi? simile rispetto a specie che sono filogeneticamente distanti. Filogeneticamente simili significa dunque avere una relazione filogeneticamente stretta. La similarit? filogenetica pu? dunque essere determinata in base a relazioni filogenetiche note. Dunque, secondo alcune forme di realizzazione preferite le specie filogeneticamente simili sono specie all?interno dello stesso ordine tassonomico. All?interno di un determinato ordine, le specie filogeneticamente simili provengono preferibilmente da uno stesso gruppo monofiletico (clade), come da una stessa famiglia, una stessa sottofamiglia, una stessa trib?, una stessa sottotrib?, uno stesso genere. Si preferisce massimamente che le specie filogeneticamente simili provengano dalla stessa famiglia tassonomica, come una stessa sottofamiglia, una stessa trib?, una stessa sottotrib?, uno stesso genere. Inoltre, sono prontamente disponibili tecniche per determinare la similarit? genomica (o parentela). La similarit? genomica pu? per esempio essere determinata determinando la cinetica di rinaturazione/riassociazione di frammenti di DNA a singolo filamento (ssDNA) dei genomi da entrambe le specie. In alternativa, o in aggiunta, si pu? investigare la denaturazione (fusione) di frammenti di DNA a doppio filamento (dsDNA) rinaturati da miscele di frammenti di ssDNA dei genomi da entrambe le specie. Quest?ultima tecnica consente di definire la temperatura di fusione Tm, vale a dire, la temperatura alla quale met? dei filamenti di DNA sono nello stato ssDNA e del T50H correlato. Approcci che implicano la cinetica di rinaturazione/denaturazione e la valutazione dei profili di fusione sono stati introdotti nei primi anni 70? (si veda de Ley et al. Eur J Biochem. gennaio 1970;12(1):133-42) per determinare la parentela di batteri, ma questi approcci che implicano analisi di profili di temperatura di fusione sono stati altres? usati per determinare la parentela di specie eucariote (si veda, per esempio, Sibley e Ahlquist, J Mol Evol (1984) 20:2-15).
Come ? ulteriormente noto, dalla pubblicazione di WO2014/020624, la similarit? filogenetica delle specie pu? essere determinata in base a se i frammenti di DNA inibitori provenienti da una specie sono inibitori altres? per un?altra specie. Pertanto, una specie filogeneticamente simile ? dunque una specie il cui DNA ottenuto mediante una frammentazione casuale di DNA totale estratto o mediante sintesi casuale di frammenti a partire da DNA totale ? inibente per la specie target. Risulter? chiaro all?esperto che in base a questa definizione funzionale la filogenetica pu? essere determinata con test simili a quelli presentati in WO2014/020624 e negli esperimenti ad esso allegati. All?interno dello stesso ordine tassonomico, una specie di partenza sar? altres? filogeneticamente simile ad una specie target, poich? il DNA ottenuto dalla specie di partenza mediante frammentazione casuale di DNA totale estratto o mediante sintesi casuale di frammenti a partire da DNA totale ? inibente per la specie target.
Analogamente, una specie filogeneticamente simile ? dunque una specie le cui sequenze di DNA secrete sono inibenti per la specie target.
Il termine ?sequenze di DNA secrete dalle cellule di una specie di partenza? si riferisce a una miscela di sequenze di DNA secrete, che possono essere naturali o sintetiche. La miscela di sequenze di DNA secrete ? un sottogruppo specifico del DNA genomico totale, detta miscela non comprendendo sequenze di DNA ottenute mediante estrazione o mediante rottura o lisi di cellule della specie di partenza.
Come menzionato sopra, il termine ?sequenze di DNA? si riferisce a una miscela di diverse sequenze di DNA secrete, mentre non comprende una sequenza di DNA singola.
Con il termine ?sequenze di DNA secrete? si intende sequenze di DNA effettivamente secrete da cellule viventi della specie di partenza o sequenze di DNA sintetiche con la stessa sequenza di quelle effettivamente secrete dalle cellule o dai tessuti della specie di partenza.
Come comprender? l?esperto, il termine ?inibizione? nel contesto dell?inibizione di una specie target si riferisce all?interferenza con, al rallentamento o perfino all?arresto dello sviluppo di individui della specie target e/o della popolazione della specie target. Si pu? prevedere che l?effetto inibente di sequenze di DNA secrete inibitorie (self-DNA secreto) funzioni interferendo con la fisiologia della specie target a livello cellulare. Il self-DNA secreto dovrebbe essere inteso indicare DNA secreto di una specie o di una specie filogeneticamante simile.
Il termine ?esporre? una specie target significa che sequenze di DNA secrete vengono somministrate ad una specie target mediante qualsiasi mezzo adatto, come contatto superficiale, somministrazione citotropica, somministrazione sistemica, ad esempioper mezzo di iniezione, ingestione o inalazione, o assorbimento. Sequenze di DNA secrete possono essere usate in una composizione che pu? essere formulata in una forma, per trattamenti secchi o liquidi, selezionata dal gruppo costituito da dispersione, per esempio sotto forma di aerosol, sospensione, polveri umettabili o solubili, emulsioni in acqua o altri solventi, granuli disperdibili, sospensioni di microcapsule, concentrati emulsionabili, paste fluide, macro emulsioni, dispersioni oleose, esche. Si possono usare sistemi di solvente comprendenti acqua o sistemi di solvente eutettico profondo (DES) come sistemi di solvente eutettico profondo naturale (NADES).
La determinazione degli intervalli di concentrazione in cui sequenze di DNA secrete dell?invenzione sono inibitorie per la specie target rientra nell?ambito delle conoscenze dell?esperto. L?esperto comprender? che la concentrazione necessaria pu? dipendere da fattori quali la potenza del DNA nella composizione per inibire la specie target o la cellula target, il livello di inibizione desiderato, se viene applicato o meno un biocida aggiuntivo e/o la via di applicazione alla specie target. Per molte applicazioni, concentrazioni adatte possono essere nell?intervallo di 1-1500 ppm, come 2-1300 ppm, 2-1000 ppm, 5-1000 ppm, 10-1000 ppm, 50-1000 ppm, 100-1000 ppm, 200-1000 ppm, 500-1000 ppm. Per altre applicazioni si possono desiderare concentrazioni pi? elevate.
Secondo una forma di realizzazione del metodo non terapeutico della presente invenzione, dette sequenze di DNA secrete dalle cellule di una specie di partenza possono essere rilasciate da un veicolante. Detto veicolante pu? essere una specie ospite che differisce dalla specie di partenza, per esempio una specie selezionata tra una specie microbica, come una specie batterica, o una specie dagli Ascomiceti, o una specie dagli Archea, o una microalga, un organismo multicellulare, come una pianta multicellulare, o una specie di elminti, un microrganismo del terreno, un microrganismo di stato GRAS, un agente di biocontrollo microbico.
Una specie ospite nel contesto della presente invenzione ?, in generale, una specie che differisce dalla specie di partenza, preferibilmente una specie filogeneticamente diversa, avente sequenze di DNA della specie di partenza intracellularmente incorporate. Specie filogeneticamente diverse (distanti) secondo alcune forme di realizzazione sono specie da diversi ordini tassonomici, come da diverse classi, diversi tipi, diversi regni, o diversi domini. Secondo alcune forme di realizzazione specie filogeneticamente diverse sono specie da famiglie diverse, come da ordini diversi, classi diverse, tipi diversi, regni diversi, o domini diversi. La specie ospite pu? essere selezionata da qualsiasi specie in grado di accettare e replicare DNA estraneo della specie di partenza. Per esempio, la specie ospite pu? essere Arthrospira platensis che pu? essere usata in forma essiccata o liofilizzata o in soluzione acquosa. Per esempio, viene usata nell?agricoltura insieme all?irrigazione.
Secondo una forma di realizzazione del metodo non terapeutico della presente invenzione, quando la specie target ? un batterio, detta composizione comprendente le sequenze di DNA secrete dalle cellule di una specie di partenza pu? comprendere ulteriormente un fago efficace contro detto batterio. Per esempio, secondo la presente invenzione, il batterio pu? essere una Klebsiella, come Klebsiella pneumoniae.
La presente invenzione riguarda altres? sequenze di DNA o una composizione comprendente dette sequenze di DNA per l?uso nel trattamento terapeutico di una malattia o una condizione di un organismo animale o di un organismo umano, detta malattia o condizione essendo causata da una specie patogena, infestante o parassita o essendo una malattia cancerosa,
in cui dette sequenze di DNA sono il principio attivo che inibisce detta specie patogena, infestante o parassita, la specie target, o una cellula cancerosa di detta malattia cancerosa, la cellula target,
dette sequenze di DNA essendo sequenze di DNA secrete da:
le cellule di una specie di partenza selezionata tra una specie che ? la stessa specie della specie target o una specie filogeneticamente simile alla specie target, quando la malattia o condizione ? causata da una specie patogena, infestante o parassita; o
una cellula cancerosa di partenza (source cancer cell) della stessa malattia cancerosa da trattare, detta cellula cancerosa di partenza essendo selezionata tra
la cellula target dello stesso organismo animale o organismo umano da trattare, o
una cellula cancerosa di un organismo animale o umano diverso dall?organismo animale o umano da trattare. Secondo la presente invenzione con il termine ?animale diverso? si intende un animale della stessa specie. Pertanto, la cellula cancerosa di partenza pu? essere, per esempio, una cellula cancerosa di un paziente o una cellula cancerosa di una linea cellulare cresciuta in condizioni controllate. In altre parole, secondo la presente invenzione, il DNA secreto da usare nella terapia contro il cancro pu? essere DNA secreto da colture cellulari da biopsie di tessuti cancerosi del paziente o DNA secreto da colture di tumori dello stesso tipo presenti nelle banche tissutali. Il cancro da trattare pu? essere, per esempio, cancro ai polmoni e bronchiale, cancro al colon e rettale, cancro al seno, cancro pancreatico, cancro alla prostata, leucemia, linfoma Non-Hodgkin, cancro al fegato e al dotto biliare intraepatico, cancro ovarico, cancro esofageo, cancro al cervello inclusi gliomi, carcinomi e melanomi.
Secondo una forma di realizzazione dell?invenzione riferita a sequenze di DNA o una composizione come definito sopra per l?uso come definito sopra, dette sequenze di DNA possono essere rilasciate da un veicolante. Detto veicolante pu? essere una specie ospite che differisce dalla specie di partenza o da un animale o una cellula umana, per esempio la specie ospite ? una specie selezionata tra una specie microbica, come una specie batterica, o una specie dagli Ascomiceti, o una specie dagli Archea, o una microalga, un organismo multicellulare, come una pianta multicellulare, o una specie di elminti, un microrganismo del terreno, un microrganismo di stato GRAS, un agente di biocontrollo microbico. In particolare, la specie ospite pu? essere Arthrospira platensis, preferibilmente quando le sequenze di DNA sono secrete da una cellula cancerosa di partenza. Per esempio, l?assorbimento naturale di DNA secreto dalle cellule della specie di partenza o dalla cellula cancerosa di partenza pu? essere indotto incubando la specie ospite, come A. platensis, una specie appartenente ai cianobatteri, con le sequenze di DNA secrete dalle cellule di detta specie di partenza o dalla cellula cancerosa di partenza. Uno schema del trattamento ? rappresentato in figura 20B.
Arthrospira platensis comprendente il DNA secreto pu? essere usata secondo la presente invenzione in forma essiccata o liofilizzata, come pillole, in soluzione acquosa o in forma viva.
Secondo la presente invenzione, la composizione come definito sopra, per l?uso come definito sopra, pu? comprendere inoltre un ulteriore principio attivo (o un farmaco) adatto per trattare la malattia o condizione, come un principio attivo anticancro, per esempio cisplatino.
Secondo una forma di realizzazione, quando la specie target ? un batterio, la composizione come definita sopra, per l?uso secondo ci? di cui sopra, pu? comprendere ulteriormente un fago efficace contro detto batterio.
La presente invenzione riguarda altres? una combinazione di sequenze di DNA con uno o pi? altri principi attivi adatti per trattare una malattia o condizione, detti uno o pi? altri principi attivi essendo diversi da dette sequenze di DNA, detta combinazione essendo per l?uso separato o sequenziale nel trattamento terapeutico di una malattia o condizione di un organismo animale o umano, detta malattia o condizione essendo causata da una specie patogena, infestante o parassita o essendo una malattia cancerosa,
in cui dette sequenze di DNA sono il principio attivo che inibisce detta specie patogena, infestante o parassita, la specie target, o una cellula cancerosa di detta malattia cancerosa, la cellula target,
dette sequenze di DNA essendo sequenze di DNA secrete da:
le cellule di una specie di partenza selezionata tra una specie che ? la stessa specie della specie target o una specie filogeneticamente simile alla specie target, quando la malattia o condizione ? causata da una specie patogena, infestante o parassita; o
una cellula cancerosa di partenza della stessa malattia cancerosa da trattare, detta cellula cancerosa di partenza essendo selezionata tra
la cellula target dello stesso organismo animale o organismo umano da trattare, o
una cellula cancerosa di un organismo animale o umano diverso dall?organismo animale o umano da trattare. Come menzionato sopra, con il termine ?animale diverso? si intende un animale della stessa specie. Pertanto, la cellula cancerosa di partenza pu? essere, per esempio, una cellula cancerosa di un paziente o una cellula cancerosa di una linea cellulare cresciuta in condizioni controllate.
Secondo la presente invenzione, il termine ?uso separato? ? inteso indicare la somministrazione, nello stesso momento, dei due composti della combinazione secondo l?invenzione in forme farmaceutiche distinte. Il termine ?uso sequenziale? ? inteso indicare la somministrazione successiva dei due composti della combinazione secondo l?invenzione, ciascuno in una forma farmaceutica distinta.
Secondo una forma di realizzazione della combinazione della presente invenzione, per l?uso come definito sopra, dette sequenze di DNA possono essere rilasciate da un veicolante. Detto veicolante pu? essere una specie ospite che differisce dalla specie di partenza o da un animale o una cellula umana, per esempio la specie ospite ? una specie selezionata tra una specie microbica, come una specie batterica, o una specie dagli Ascomiceti, o una specie dagli Archea, o una microalga, un organismo multicellulare, come una pianta multicellulare, o una specie di elminti, un microrganismo del terreno, un microrganismo di stato GRAS, un agente di biocontrollo microbico. Per esempio, la specie ospite pu? essere Arthrospira platensis, preferibilmente quando le sequenze di DNA sono secrete da una cellula cancerosa di partenza. Come menzionato sopra, per esempio, l?assorbimento naturale di DNA secreto dalle cellule della specie di partenza o dalla cellula cancerosa di partenza pu? essere indotto incubando la specie ospite, come A. platensis, una specie appartenente ai cianobatteri, con le sequenze di DNA secrete dalle cellule di detta specie di partenza o dalla cellula cancerosa di partenza.
Secondo un?ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, detto uno o pi? altri principi attivi possono essere selezionati tra un principio attivo anticancro, glucosio e/o insulina. In particolare, successivamente o contemporaneamente alla somministrazione delle sequenze di DNA secrete, insulina e glucosio possono essere sequenzialmente somministrati almeno una volta al fine di indurre almeno un picco ipoglicemico seguito da almeno un picco iperglicemico. Tale trattamento con glucosio verr? eseguito attraverso la somministrazione di trattamenti con insulina regolata con una conseguente fleboclisi di glucosio in soluzione fisiologica. Tale flebo intravenosa di zucchero, che induce una condizione iperglicemica controllata e limitata nel tempo dopo l?abbassamento del contenuto di glucosio dovuto al pretrattamento mediante insulina. Il trattamento ? concepito come una fase di ?digiuno? seguita da un rapido assorbimento di glucosio dal flusso sanguigno. Al tempo stesso, a causa dell?inibizione di crescita differenziale indotta dal secretoma, le cellule cancerose dovrebbero essere indotte a entrare in apoptosi.
Secondo una forma di realizzazione della combinazione della presente invenzione, per l?uso secondo ci? di cui sopra, quando la specie target ? un batterio, detto uno o pi? altri principi attivi possono essere un fago efficace contro detto batterio.
La presente invenzione riguarda altres? una composizione per inibire una specie target o per inibire una cellula cancerosa target di un organismo animale o un organismo umano da trattare (contro il cancro), detta composizione comprendendo o essendo consistente in sequenze di DNA secrete dalle cellule di una specie di partenza o da una cellula cancerosa di partenza, in cui
detta specie di partenza ? selezionata tra una specie che ? la stessa specie della specie target o una specie filogeneticamente simile alla specie target, detta cellula cancerosa di partenza essendo selezionata tra la cellula target dello stesso organismo animale o organismo umano da trattare, o una cellula cancerosa di un organismo animale o umano diverso dall?organismo animale o umano da trattare, e dette sequenze di DNA sono rilasciate da un veicolante.
Detto veicolante pu? essere una specie ospite che differisce dalla specie di partenza, per esempio una specie selezionata tra una specie microbica, come una specie batterica, o una specie dagli Ascomiceti, o una specie dagli Archea, o una microalga, un organismo multicellulare, come una pianta multicellulare, o una specie di elminti, un microrganismo del terreno, un microrganismo di stato GRAS, un agente di biocontrollo microbico. Per esempio, la specie ospite pu? essere Arthrospira platensis, preferibilmente quando le sequenze di DNA sono secrete da una cellula cancerosa di partenza.
Secondo la presente invenzione, quando la specie target ? un batterio, detta composizione comprende ulteriormente un fago efficace contro detto batterio.
La presente invenzione comprende inoltre una composizione per inibire un batterio, la specie target, detta composizione comprendendo o essendo consistente in sequenze di DNA secrete dalle cellule di una specie di partenza e un fago efficace contro detto batterio, in cui detta specie di partenza ? selezionata tra lo stesso batterio della specie target o un batterio filogeneticamente simile alla specie target.
Per esempio, secondo la presente invenzione, il batterio pu? essere una Klebsiella, come Klebsiella pneumoniae.
Le composizioni secondo la presente invenzione possono essere composizioni farmaceutiche comprendenti eccipienti e/o adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
In base a ci? di cui sopra, secondo la presente invenzione, la specie target pu? essere sia un organismo unicellulare sia un organismo multicellulare. La specie target pu? essere una specie selezionata tra piante, funghi, insetti, lieviti, batteri, archei, alghe, nematodi, acari, e protisti, preferibilmente una specie che pu? causare danni alla salute e/o economici e/o ambientali. Tale specie target pu? per esempio essere una specie associata a una malattia, come una specie patogena, una specie parassita, o una specie che funge da vettore di malattie, o pu? essere una specie infestante, o pu? essere una specie associata al deterioramento di prodotti, come di prodotti alimentari e/o di prodotti cosmetici e/o di prodotti farmaceutici e/o di altri prodotti che comprendono materia organica. La specie associata a una malattia pu? causare e/o facilitare la diffusione di una malattia ad un animale, in particolare ad un essere umano e/o un animale di allevamento, o ad una pianta, in particolare a una coltura. Una specie infestante pu? essere qualsiasi specie, come una specie di insetti, o una specie di animali superiori, o una specie di piante, i cui individui sono presenti in un posto o sito (l?area target) in numero maggiore di ci? che ? desiderato. Le specie infestanti causano almeno fastidio e possono (potenzialmente) causare danno o far male. Una specie infestante secondo alcune forme di realizzazione pu? dunque essere considerata un parassita. Come comprender? l?esperto, le specie biologiche possono causare il deterioramento di prodotti in molti modi. Spesso la sola presenza di individui di una specie ? indesiderata, come in prodotti alimentari, in particolare quando la specie pu? produrre aromi sgradevoli e/o tossine. Inoltre, la conversione della materia organica presente in un prodotto pu? portare ad una qualit? ridotta del prodotto, come mediante un prodotto non conforme alle specifiche di prodotto e/o mediante una (parziale) perdita di funzione di prodotto. Risulter? chiaro all?esperto che i termini ?specie associata a una malattia?, ?specie patogena?, ?specie parassita?, ?specie che funge da vettore di malattie?, ?specie infestante? e ?specie associata al deterioramento di prodotti? non si escludono reciprocamente e che vi ? un grado di sovrapposizione tra due o pi? di questi termini. I termini sono usati solamente per identificare domini dove l?inibizione di una specie target pu? essere vantaggiosa e dove la presente invenzione viene preferibilmente impiegata.
Quando la specie target ? selezionata come una specie patogena, pu? essere selezionata tra Acinetobacter baumannii, o Actinomyces israelii, o Actinomyces gerencseriae, o Propionibacterium propionicus, o Trypanosoma brucei, o Entamoeba histolytica, o specie di Anaplasma, o specie di Angiostrongylus, o specie di Anisakis, o Bacillus anthracis, o Arcanobacterium haemolyticum, o Ascaris lumbricoides, o specie di Aspergillus, o specie della famiglia Astroviridae, o specie di Babesia, o Bacillus cereus, o specie di Bacteroides, o Balantidium coli, o Bartonella, o specie di Baylisascaris, o Piedraia hortae, o specie di Blastocystis, o Blastomyces dermatitidis, o Clostridium botulinum, o specie di Brucella, o Yersinia Pestis, o Burkholderia cepacia, o altre specie di Burkholderia, o Mycobacterium ulcerans, o famiglia dei Caliciviridae, o specie di Campylobacter, o Candida albicans, o altre specie di Candida, o Capillaria philippinensis, o Capillaria aerophila, o Bartonella bacilliformis, o Bartonella henselae, o Streptococcus spp. di gruppo A, o Staphylococcus spp., o Trypanosoma cruzi, o Haemophilus ducreyi, o Chlamydia trachomatis, o Chlamydophila pneumoniae, o Vibrio cholerae, o Fonsecaea pedrosoi, o Batrachochytrium dendrabatidis, o Clonorchis sinensis, o Clostridium difficile, o Coccidioides immitis e Coccidioides posadasii, o Cryptococcus neoformans, o specie di Cryptosporidium, o Ancylostoma braziliense, o Cyclospora cayetanensis, o Taenia solium, o alghe verdi, o Desmodesmus armatus, o Dientamoeba fragilis, o Corynebacterium diphtheriae, o Diphyllobothrium, o Dracunculus medinensis, o specie di Echinococcus, o specie di Ehrlichia, o Enterobius vermicularis, o specie di Enterococcus, o, o Rickettsia prowazekii, o Fasciola hepatica, o Fasciola gigantica, o Fasciolopsis buski, o PRNP, o la superfamiglia Filarioidea, o Clostridium perfringens, o molteplici, o sepcie di Fusobacterium, o Clostridium perfringens, o altre specie di Clostridium, o Geotrichum candidum, o Giardia lamblia, o Burkholderia mallei, o Gnathostoma spinigerum, o Gnathostoma hispidum, o Neisseria gonorrhoeae, o Klebsiella granulomatis, o Streptococcus pyogenes, o Streptococcus agalactiae, o Haemophilus influenzae, o influenza Helicobacter pylori, o Escherichia coli O157:H7, O111 e O104:H4, o specie dalla famiglia Bunyaviridae, o Histoplasma capsulatum, o Ancylostoma duodenale e Necator americanus, o Ehrlichia ewingii, o Anaplasma phagocytophilum, o Ehrlichia chaffeensis, o Hymenolepis nana ed Hymenolepis diminuta, o la famiglia Orthomyxoviridae, o Isospora belli, o Kingella kingae, o Legionella pneumophila, o Legionella pneumophila, o specie di Leishmania, o Mycobacterium leprae, o Mycobacterium lepromatosis, o specie di Leptospira, o Listeria monocytogenes, o Borrelia burgdorferi, o Borrelia garinii, o Borrelia afzelii, o Wuchereria bancrofti, o Brugia malayi, o specie di Plasmodium, o Burkholderia pseudomallei, o Neisseria meningitidis, o Metagonimus yokagawai, o Microsporidia phylum, o Rickettsia typhi, o Mycoplasma pneumoniae, o Mycoplasma genitalium, o Actinomycetoma spp., o Eumycetoma spp., o Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae, o Nocardia asteroids, o altre specie di Nocardia, o Onchocerca volvulus, o Opisthorchis viverrini, o Opisthorchis felineus, o Paracoccidioides brasiliensis, o Paragonimus westermani, o altre specie di Paragonimus, o specie di Pasteurella, o Pediculus humanus capitis, o Pediculus humanus corporis, o Pthirus pubis, o Bordetella pertussis, o Yersinia pestis, o Streptococcus pneumoniae, o Pneumocystis jirovecii, o specie di Prevotella, o Naegleria fowleri, o Chlamydophila psittaci, o Coxiella burnetii, o Borrelia hermsii, Borrelia recurrentis, o altre specie di Borrelia, o Rhinosporidium seeberi, o specie di Rickettsia, o Rickettsia akari, o Rickettsia rickettsii, o specie di Salmonella, o Sarcoptes scabiei, o specie di Streptococcus di gruppo A, o specie di Schistosoma, o specie di Shigella, o Variola maggiore, o Variola minore, o Sporothrix schenckii, o specie di Staphylococcus, o Strongyloides
stercoralis, o Treponema pallidum, o specie di Taenia, o Clostridium tetani, o specie di Trichophyton, o Trichophyton tonsurans, o Epidermophyton floccosum, o Trichophyton rubrum, o mentagrofiti di Trichophyton, o Trichophyton rubrum, o Hortaea werneckii, o specie di Malassezia, o Toxocara canis, o Toxocara cati, o Toxoplasma gondii, o Chlamydia trachomatis, o Trichinella spiralis, o Trichomonas vaginalis, o Trichuris trichiura, o Mycobacterium tuberculosis, o Francisella tularensis, o Salmonella enterica, o serovar typhi, o Rickettsia, o Ureaplasma urealyticum, o Coccidioides immitis, o Coccidioides posadasii, o Vibrio vulnificus, o Vibrio parahaemolyticus, o Trichosporon beigelii, o Yersinia pseudotuberculosis, o Yersinia enterocolitica, o Zeaspora fungus, o Mucorales, o Entomophthorales. Dovrebbe essere inteso che l?inibizione di specie patogene target non deve essere nel o sul corpo di un animale (incluso un essere umano). Invece, l?inibizione pu? altres? essere all?esterno del contesto del corpo di un animale. Per esempio, per inibire le specie target in una coltura (in vitro). Si preferisce la selezione di specie target patogene da specie target patogene topiche e/o topiche, in particolare specie target patogene topiche dall?elenco presentato appena sopra. L?esperto comprender? che il termine topico, nel contesto della medicina umana o veterinaria, significa appartenente ad una particolare superficie del corpo, in particolare alla cute o alle membrane mucose (mucosa). Le specie target patogene topiche dovrebbero dunque essere considerate essere associate alla cute e/o alle unghie e/o alle membrane mucose, incluse le membrane mucose dell?occhio, della bocca, della vagina, del tratto urinario, del tratto gastrointestinale, delle vie aeree, inclusi i polmoni. Il termine topico non ? dunque limitato alla superficie esterna del corpo di un animale, ma include riferimenti alle superfici interne, come i polmoni e il tratto gastrointestinale.
Le specie target patogene topiche sono, pi? preferibilmente, patogeni cutanei e/o patogeni ungueali e/o sono patogeni mucosali. Nel contesto della presente invenzione
la selezione di specie target patogene tra archei, batteri, funghi (inclusi lieviti) e protisti ? ulteriormente preferita, in particolare di archei, batteri, funghi (inclusi lieviti) e protisti dall?elenco presentato sopra. Quando la specie target ? selezionata come specie parassita, pu? essere selezionata tra Acanthamoeba spp. o Balamuthia mandrillaris o Babesia B. divergens o B. bigemina o B. equi o B. microfti o B. duncani o Balantidium coli o Blastocystis spp. o Cryptosporidium spp. o Cyclospora cayetanensis o Dientamoeba fragilis o Entamoeba histolytica o Giardia lamblia o Isospora belli o Leishmania spp. o Naegleria fowleri o Plasmodium falciparum o Plasmodium vivax o Plasmodium ovale curtisi o Plasmodium ovale Wallikeri o Plasmodium malariae o Plasmodium knowlesi o Rhinosporidium seeberi o Sarcocystis bovihominis, Sarcocystis suihominis o Toxoplasma gondii o Trichomonas vaginalis o Trypanosoma brucei o Trypanosoma cruzi o Cestoda o Taenia multiceps o Diphyllobothrium latum o Echinococcus granulosus o Echinococcus multilocularis o E. vogeli o E. oligarthrus o Hymenolepis nana o Hymenolepis diminuta o Taenia saginata o Taenia solium o Bertiella mucronata o Bertiella studeri o Spirometra o Erinaceieuropaei o Schistosoma haematobium o Schistosoma japonicum o Schistosoma mekongi o Echinostoma echinatum o Trichobilharzia regenti o Schistosomatidae o Ancylostoma duodenale o Necator americanus o Angiostrongylus costaricensis o Anisakis o Ascaris sp. o Ascaris lumbricoides o Baylisascaris procyonis o Brugia malayi o Brugia timori o Dioctophyme renale o Dracunculus medinensis o Enterobius vermicularis o Enterobius gregorii o Gnathostoma spinigerum o Gnathostoma hispidum o Halicephalobus gingivalis o Loa loa filaria o Mansonella o Streptocerca o Onchocerca volvulus o Strongyloides stercoralis o Thelazia californiensis o Thelazia callipaeda o Toxocara canis o Toxocara cati o Trichinella spiralis.
Analogamente a quanto osservato in relazione alle specie target patogene, dovrebbe essere inteso che l?inibizione di specie target parassite non deve essere nel o sul corpo di un animale (incluso un essere umano). Invece, l?inibizione pu? altres? essere all?esterno del contesto del corpo di un animale. Per esempio, per inibire le specie target in una coltura. La selezione di specie target parassite da parassiti cutanei e/o parassiti gastrointestinali e/o parassiti mucosali ? preferita, in particolare selezionati dall?elenco presentato sopra. La selezione di specie target parassite da protisti o nematodi ? preferita, in particolare protisti e nematodi dall?elenco presentato sopra. Secondo alcune forme di realizzazione, la specie target pu? essere selezionata tra una specie patogena per una pianta, come un patogeno vegetale selezionato tra funghi o Oomycetes o batteri o protisti o Fusarium spp. o Thielaviopsis spp. o Verticillium spp. o Magnaporthe spp. o Magnaporthe grisea o Sclerotinia spp. o Sclerotinia sclerotiorum o Phytophtora spp. o Pythium spp. o Plasmodiophora spp. o Spongospora spp. o bacilli fitopatogeni o Erwinia spp. o Agrobacterium spp. o Burkholderia spp. o Proteobacteria o Xanthomonas spp. o Pseudomonas spp. o Phytoplasma spp. o Spiroplasma spp..
Quando la specie target ? selezionata come specie infestante, pu? essere selezionata da un parassita agricolo, come un parassita agricolo artropode come una specie selezionata tra Acalymma o Acyrthosiphon kondoi o Acyrthosiphon gossypii o Acyrthosiphon pisum o Spodoptera exempta o ape africanizzata o Agromyzidae o Agrotis ipsilon o Agrotis munda o Agrotis orthogonia o Agrotis porphyricollis o Akkaia taiwana o Aleurocanthus woglumi o Aleyrodes proletella o Alphitobius diaperinus o Alsophila aescularia o Altica chalybea o Anasa tristis o Anisoplia austriaca o Anthonomus pomorum o Anthonomus signatus o Aonidiella aurantii o Aonidiella citrina o Aonidiella orientalis o Apamea apamiformis o Apamea niveivenosa o afide o Aphis gossypii o Aphis nasturtii o mosca delle mele o formica argentina o Euxoa auxiliaris o verme dell?esercito autunnale o Arotrophora arcuatalis o mosca bianca della cenere o Astegopteryx bambusae o Astegopteryx insularis o Astegopteryx minuta o Asterolecanium o Asterolecanium coffeae o Atherigona reversura o Athous haemorrhoidalis o Aulacophora o Aulacorthum solani o locusta australiana o Bactericera cockerelli o Bactrocera o Bactrocera correcta o Bagrada hilaris o Knulliana o notturna della barbabietola o afide nero della fava o Blepharidopterus chlorionis o falena di Bogong o antonomo del cotone o elotide del cotone o Brevicoryne brassicae o locusta bruna o cimice asiatica o Nilaparvata lugens o nottua del cavolo o cavolaia o Callosobruchus maculatus o mosca della carota o Cerataphis brasiliensis o Ceratitis aliena o Ceratitis andranotobaka o Ceratitis capitata o Ceratitis flexuosa o Ceratitis grahami o Ceratitis ovalis o Ceratitis penicillata o Ceratitis rosa o Ceratoglyphina bambusae o Ceratopemphigus zehntneri o Ceratovacuna lanigera o criocera del frumento o Chaetosiphon tetrarhodum o Chlorops pumilionis o tarlo asiatico o Coccus hesperidum o Coccus viridis o tignola del melo o coleottero del chicco di caff? o Colias eurytheme o dorifora della patata o Frankliniella schultzei Trybom o tribolio confuso delle farine o elotide del cotone o Crambus o scarabeo del cetriolo o Curculio elephas o Curculio nucum o Curculio occidentis o agrotide o Cyclocephala borealis o Dargida diffusa o Dasineura brassicae o Coccotrypes dactyliperda o Delia (mosca) o Delia antiqua o Delia floralis o Delia platura o Delia radicum o Dermestes ater o Dermolepida albohirtum o locusta del deserto o Diabrotica o Diabrotica balteata o Diabrotica speciosa o tignola del cavolo o Diaphania indica o Diaphania nitidalis o Diaphorina citri o Diaprepes abbreviatus o Diatraea saccharalis o cavalletta differenziale o Diparopsis castanea o Dociostaurus maroccanus o Drosophila suzukii o Dryocosmus kuriphilus o Dysaphis crataegi o Dysmicoccus brevipes o Earias perhuegeli o Epicauta vittata o Epilachna o Epitrix cucumeris o Epitrix tuberis o Erionota thrax o Eriosoma lanigerum o Eriosomatinae o Euleia heraclei o Eumetopina flavipes o piralide del mais o Eurydema oleracea o Eurygaster integriceps o Ferrisia virgata o cimice dei boschi o Frankliniella tritici o Galleria mellonella o Euxoa nigricans o Geoica lucifuga o Homalodisca vitripennis o mosca bianca delle serre o Greenidea artocarpi o Greenidea formosana o Greenideoida ceyloniae o Gryllotalpa orientalis o Gryllotalpa vinae o Lymantria dispar negli Stati Uniti o Helicoverpa armigera o Helicoverpa gelotopoeon o Helicoverpa punctigera o Helicoverpa zea o Heliothis virescens o Henosepilachna o Henosepilachna vigintioctomaculata o Henosepilachna vigintioctopunctata o cecidomia distruttrice del grano o Heteronychus arator o Hyalopterus pruni o Hysteroneura setariae o Icerya purchasi o Ipuka dispersum o Jacobiasca formosana o Kaltenbachiella elsholtriae o Kaltenbachiella japonica o dermeste dei cereali o Lampides boeticus o minatore delle foglie o Lema daturaphila o Lepidiota consobrina o Lepidosaphes beckii o Lepidosaphes ulmi o Leptocybe invasa o Leptoglossus zonatus o Leptopterna dolabrata o Achorea grisella o Leucoptera (falena) o Leucoptera caffeina o Epiphyas postvittana o controversia della Epiphyas postvittana o Lipaphis erysimi o Liriomyza huidobrensis o Lissorhoptrus oryzophilus o Listronotus bonariensis o Urbanus proteus o Lygus o Lygus hesperus o Macrodactylus subspinosus o Macrosiphoniella pseudoartemisiae o Macrosiphoniella sanborni o Macrosiphum euphorbiae o calandra del mais o Manduca sexta o Matsumuraja capitophoroides o Mayetiola hordei o cocciniglia o Megacopta cribraria o Melanaphis sacchari o Melittobia australica o Metcalfa pruinosa o Epilachna varivestis o Micromyzus judenkoi o Micromyzus kalimpongensis o Micromyzus niger o falena o tignola del porro o Mythimna unipuncta o Myzus ascalonicus o Myzus boehmeriae o Myzus cerasi o Myzus obtusirostris o Myzus ornatus o Myzus persicae o Nematus o Nematus leucotrochus o Nematus ribesii o Nematus spiraeae o Neomyzus circumflexus o Neotoxoptera oliveri o Nezara viridula o processionaria della quercia o Oebalus pugnax o mosca dell?olivo o Ophiomyia simplex o Opisina arenosella o Opomyza o Opomyza florum o Opomyzidae o Orseolia oryzae o Oryzaephilus mercator o Oscinella frit o Ostrinia furnacalis o Oxycarenus hyalinipennis o Papilio demodocus o Paracoccus marginatus o Paratachardina pseudolobata o Paropsisterna selmani o Patanga succincta o Pemphigus betae o Pentalonia nigronervosa o Pentatomoidea o Peridroma saucia o Phorodon humuli o Phthorimaea operculella o Phyllophaga o Phyllotreta nemorum o Phylloxeridae o Phylloxeroidea o Phytomyza horticola o Pieris brassicae o larva rossa del cotone o Planococcus citri o Platynota idaeusalis o Conotrachelus nenuphar o Prionus californicus o Pristiphora o Pseudoregma bambucicola o Pseudotheraptus wayi o Psylliodes chrysocephala o Ptinus fur o Pyralis farinalis o Raphidopalpa foveicollis o formica di fuoco o locusta rossa o Rhagoletis cerasi o Rhagoletis indifferens o Rhagoletis mendax o Rhodobium porosum o Rhopalosiphoninus latysiphon o Rhopalosiphum maidis o Rhopalosiphum padi o Rhopalosiphum rufiabdominale o Rhyacionia frustrana o Rhynchophorus ferrugineus o Rhynchophorus palmarum o Rhynchophorus vulneratus o Rhyzopertha o falena del riso o afide russo del grano o Saissetia oleae o cocciniglia di San Jos? o cocciniglia o Schistocerca americana o Schizaphis graminum o Schizaphis hypersiphonata o Schizaphis minuta o Schizaphis rotundiventris o Schoutedenia lutea o Sciaridae o Scirtothrips dorsalis o Scutelleridae o Scutiphora pedicellata o minatrice serpentina delle foglie o Xestia c-nigrum o Shivaphis celti o mosca bianca del tabacco o Sinomegoura citricola o Sipha flava o Sitobion avenae o Sitobion lambersi o Sitobion leelamaniae o Sitobion miscanthi o Sitobion pauliani o Sitobion phyllanthi o Sitobion wikstroemiae o Sitona lepidus o Sitona lineatus o piccolo coleottero degli alveari o Diatraea grandiosella o afide
della soia o Spodoptera cilium o Spodoptera litura o Diabrotica undecimpunctata o Lycorma delicatula o Melittia cucurbitae o piralide o Stenotus binotatus o Strauzia longipennis o Phyllotreta striolata o sunn o Physomerus grossipes o Synanthedon exitiosa o cimice varia o Tecia solanivora o Tetranychus urticae o altri Tretranychus spp., Tetraneura nigriabdominalis o Tetraneura yezoensis o Thrips o Thrips angusticeps o Thrips palmi o Thrips simplex o Thrips tabaci o Thysanoplusia orichalcea o Tinocallis kahawaluokalani o Toxoptera aurantii o Toxoptera citricida o Toxoptera odinae o Trichobaris trinotata o Trioza erytreae o nottua dei seminati o Tuta absoluta o Uroleucon minutum o coleottero dei tappeti o Vesiculaphis caricis o Virachola isocrates o tarma della cera o diabrotica del mais o tripide occidentale dei fiori o mosca del frumento o curculionide del grano o mosca bianca o falena invernale o Xylotrechus quadripes o Zygogramma exclamationis. Secondo alcune forme di realizzazione, la selezione di una specie target dall?ordine Lepidoptera ? preferita, in particolare selezionata dalla famiglia Tortricidae, come dal genere Choristoneura, in particolare Choristoneura orae, Choristoneura fumiferana o Choristoneura freemani, o selezionata dalla famiglia Noctuidae, come il genere Spodoptera, in particolare Spodoptera frugiperda, Spodoptera litura, Spodoptera litoralis, Spodoptera cilium o Spodoptera ornithogalli, o selezionata dalla famiglia Pyralidae, come dal genere Plodia o Ephestia, o selezionata da altre specie da quest?ordine menzionate nell?elenco appena sopra. Una specie di parassiti agricoli pu? altres? essere selezionata tra una specie di fitofago terrestre gasteropode.
Una specie di parassiti pu? essere ulteriormente selezionata da un vettore di malattie, come un vettore di malattie selezionato tra artropodi. Il vettore di malattie pu? essere implicato nella diffusione di una malattia animale, inclusa una malattia umana, o pu? veicolare una malattia vegetale. Vettori di malattie che veicolano malattie animali possono essere selezionati tra artropodi che si nutrono di sangue (ematofagi) o che si nutrono di emolinfa, preferibilmente un artropode, per esempio selezionato dalla famiglia Culicidae, come dal genere Aedes, o dalla famiglia Ceratopogonidae, come dal genere Culicoides, o dalla famiglia Tabanidae, o dalla famiglia Simuliidae, come dal genere Austrosimulium, o dalla famiglia Glossinidae, come dal genere Glossina, o dalla famiglia Triatominae, come Triatoma infestans o Rhodnius prolixus, o dalle Siphonoptera, come dalle Publicidae, o dai Phthiraptera, come dal genere Pediculus, o dalla famiglia Ixodidae, o dalla famiglia Argasidae. Vettori artropodi implicati nella diffusione di malattie vegetali possono essere selezionati tra Acyrthosiphon pisum o Agromyzidae o Anastrepha grandis o Anastrepha obliqua o Anthomyiidae o afidi o scolitidi o Circulifer tenellus o Brevicoryne brassicae o Cacopsylla melanoneura o Cacopsylla ulmi o Ceratitis podocarpi o Chaetosiphon fragaefolii o Cicadulina o Cicadulina mbila o Orosius orientalis o Cryptococcus fagisuga o Curculionidae o Diabrotica balteata o Empoasca decedens o Eumetopina flavipes o Euscelis plebejus o Frankliniella tritici o Gryllotalpa orientalis o Haplaxius crudus o Hyalesthes obsoletus o Hylastes ater o crisomelide o cicalina o Lipaphis erysimi o Macrosteles quadrilineatus o cocciniglia o mosca del melone o Molytinae o Pegomya hyoscyami o Pissodes o Pissodes strobi o Pissodini o omottero o Pseudococcus maritimus o Pseudococcus viburni o Psylla pyri o Psyllidae o Rabdophaga clavifex o Rhynchophorus palmarum o Scaphoideus titanus o Scirtothrips dorsalis o mosca bianca del tabacco o Tephritidae o Thripidae o Thrips palmi o Tomicus piniperda o Toxoptera citricida o membracidi o Triozidae o tripide occidentale dei fiori o Xyleborus glabratus.
Secondo alcune forme di realizzazione preferite una specie di parassiti ? selezionata come una specie di nematode parassita per le piante, in particolare selezionata dal genere Meloidogyne, come M. arenaria, M. incognita, M. javanica, o M. hapla, o selezionata dal genere Hetrodera, come Heterodera glycines, o Heterodera avenae e H. filipjevi, o selezionata dal genere Globodera, come Globodera pallida, o G. rostochiensis, o selezionata dal genere Pratylenchus, come P. penetrans, P. thornei, P. neglectus, P. zeae, P. vulnus o P. coffeae, o selezionata dal genere Radopholus, come Radopholus similis.
Secondo alcune forme di realizzazione, la specie infestante pu? essere selezionata tra specie di erbe infestanti. Specie di erbe infestanti che sono considerate specie target nella presente invenzione sono, per esempio, specie di erbe infestanti dalle Alismataceae o Apiaceae o Asteraceae o Amaranthaceae o Cactaceae o Caryophyllaceae o Chenopodiaceae o Caulerpaceae o Commelinaceae o Poaceae o Portulacaceae o Euphorbiaceae o Fabaceae (Leguminosae) o Rubiaceae o Hydrocharitaceae o Azollaceae o Salviniaceae o Iridaceae o Liliaceae o Pontederiaceae o Melastomataceae o Myrtaceae o Polygonaceae o Lygodiaceae o Rosaceae o Acanthaceae o Orobanchaceae o Scrophulariaceae o Convolvulaceae o Cuscutaceae o Solanaceae o Sparganiaceae.
Specie di erbe infestanti specifiche considerate come specie infestanti possono essere selezionate tra Sagittaria sagittifolia Linnaeus o Heracleum mantegazzianum Sommier & Levier o Ageratina adenophora (Spreng.) King & H.E. Robins. o Ageratina riparia (Regel) King & H.E. Robins. o Arctotheca calendula (L.) Levyns o Carthamus oxyacanthus M. Bieberstein o Crupina vulgaris Cass. o Inula britannica L. o Mikania cordata (Burm. f.) B.L. Robins. o Mikania micrantha Kunth o Onopordum acaulon L. o Onopordum illyricum L. o Senecio inaequidens DC. o Senecio madagascariensis Poir. o Tridax procumbens L. o Alternanthera sessilis (L.) R. Br. ex DC. o Opuntia aurantiaca Lindley o Drymaria arenarioides Humboldt & Bonpland o Salsola vermiculata L. o Caulerpa taxifolia (Vahl) C. Agardth o Commelina benghalensis L. o Avena sterilis Linnaeus o Chrysopogon aciculatus (Retz.) Trin. o Digitaria abyssinica (A. Rich) Stapf o Digitaria velutina (Forsk.) Beauv. o Imperata brasiliensis Trinius o Imperata cylindrica (L.) Beauv. o Ischaemum rugosum Salisbury o Leptochloa chinensis (L.) Nees o Nassella trichotoma Hackel ex Arech. o Oryza longistaminata A. Chev. & Roehr. o Oryza punctata Kotzchy ex Steud. o Oryza rufipogon Griffiths o Paspalum scrobiculatum Linnaeus o Pennisetum clandestinum Hochst. ex Chiov. o Pennisetum macrourum Trinius o Pennisetum pedicellatum Trinius o Pennisetum polystachion (Linnaeus) Schultes o Rottboellia cochinchinensis (Lour.) W.D. Clayton o Saccharum spontaneum L. o Setaria pumila ssp. pallidefusca (Schumacher) B.K. Simon o Urochloa panicoides Beauvois o Euphorbia terracina L. o Acacia nilotica (L.) Willd. ex Delile o Galega officinalis L. o Mimosa diplotricha C. Wright ex Sauvalle o 15 Mimosa pigra L. o Prosopis alpataco R. A. Philippi o Prosopis argentina Burkart o Prosopis articulata S. Watson o Prosopis burkartii Mu?oz o Prosopis caldenia Burkart o Prosopis calingastana Burkart o Prosopis campestris Griesbach o Prosopis castellanosii Burkart o Prosopis denudans Bentham o Prosopis elata (Burkart) Burkart o Prosopis farcta (Banks & Soland.) J.F. Macbr. o Prosopis ferox Griesbach o Prosopis fiebrigii Harms o Prosopis hassleri Harms ex Hassler o Prosopis humilis Gillies ex Hooker & Arnott o Prosopis kuntzei Harms ex Hassler o Prosopis pallida (Humb. & Bonpl. ex Willd.) Kunth o Prosopis palmeri S. Watson o Prosopis reptans Benth. o Prosopis rojasiana Burkart o Prosopis ruizlealii Burkart o Prosopis ruscifolia Griesbach o Prosopis sericantha Gillies ex Hook. & Arn. o Prosopis strombulifera (Lamarck) Bentham o Prosopis torquata (Cavan. ex Lagasca y Segura) DC. o Spermacoce alata Aubl. o Hydrilla verticillata (L. f.) Royle o Lagarosiphon major (Ridley) Moss o Ottelia alismoides (Linnaeus) Pers. o Azolla pinnata R. Brown o Salvinia auriculata Aublet o Salvinia biloba Raddi o Salvinia herzogii de la Sota o Salvinia molesta D. S. Mitchell o Moraea collina Thunb. o Moraea flaccida (Sweet) Steud. o Moraea miniata Andrews o Moraea ochroleuca (Salisb.) Drapiez o Moraea pallida (Baker) Goldblatt o Asphodelus fistulosus Linnaeus o Eichhornia azurea (Swartz) Kunth o Monochoria hastata (L.) Solms o Monochoria vaginalis (Burm. f.) K. Presl ex Kunth o Melastoma malabathricum L. o Melaleuca quinquenervia (Cav.) Blake o Emex australis Steinhall o Emex spinosa (Linnaeus) Campdera o Lygodium flexuosum (L.) Sw. (1801) (Mobot) o Lygodium microphyllum (Cav.) R. Br. o Rubus fruticosus L. o Rubus moluccanus L. o Hygrophila polysperma (Roxb.) T.
Anders. o Aeginetia spp. L. o Alectra spp. Thunb. o Orobanche spp. (nonnative) L. o Limnophila sessiliflora (Vahl) Blume o Striga spp. Lour. o Ipomoea aquatica Forssk. o Cuscuta spp. L. o Lycium ferocissimum Miers o Solanum tampicense Dunal o Solanum torvum Sw. o Solanum viarum Dunal o Sparganium erectum L.
Specie che causano il deterioramento di prodotti che possono essere selezionate come specie target possono essere selezionate tra microrganismi di deterioramento, come selezionate tra batteri, come batteri bastoncellari Gram-negativi, ad esempio Pseudomonas spp., Shewanella spp., sporiogeni Grampositivi, ad esempio Bacillus spp., Clostridium spp., batteri di acido lattico e altri batteri Gram-positivi, ad esempio Brochothrix spp, Micrococcus spp., o Enterobacteriaceae, funghi, come Zigomiceti, dal genere Penicillium, o dal genere Aspergillus o lieviti come Zygosaccharomyces spp, Saccharomyces spp., Candida spp., Dekkera (Brettanomyces) spp.. In alternativa, le specie target che causano il deterioramento di prodotti possono essere selezionate tra le Astigmata, come selezionate tra le Glycyphagidae, o le Carpoglyphidae.
La presente invenzione sar? ora descritta, a scopo illustrativo ma non limitativo, facendo in particolare riferimento ad alcuni esempi illustrativi e alle figure dei disegni allegati, in cui:
La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica della scoperta di un prodotto inibitorio cellulaspecifico prodotto dal secretoma della stessa popolazione cellulare.
La Figura 2 mostra la crescita di due ceppi di P. aeruginosa. A) Controllo di P. aeruginosa PAO1 rispetto all?esposizione a self-DNA genomico frammentato. B) Controllo di P. aeruginosa ?mutS) rispetto all?esposizione a self-DNA genomico frammentato e nonself-DNA (salmone). I trattamenti con DNA erano a una concentrazione di 100 ng/?L. Le barre verticali rappresentano deviazioni standard di tre replicati.
La Figura 3 mostra le curve di crescita di S. aureus in presenza di self-DNA genomico ed eterologo (non-self ? P. aeruginosa) a 50 ng/?l. Le barre verticali rappresentano deviazioni standard di tre replicati.
La Figura 4 mostra la crescita di P. aeruginosa PAO1 esposto a self-DNA secreto alla concentrazione di 6 ng/?L (barre bianche: controllo; barre nere: self-DNA estratto dai surnatanti di una coltivazione precedente dello stesso ceppo).
La Figura 5 mostra la crescita di S. aureus esposto a self-DNA secreto alla concentrazione di 6 ng/?L (self-DNA estratto dai surnatanti di una coltivazione precedente dello stesso ceppo).
La Figura 6 mostra le curve di crescita di S. hominise e l?effetto del dosaggio in presenza di self-DNA genomico ed eterologo (non-self ? Malassezia) sia a 10 sia a 100 ng/?l.
La Figura 7 mostra l?effetto di self-DNA genomico su Klebsiella pneumoniae e l?effetto sinergico quando combinato con un trattamento con fagi. Gli esperimenti sono stati eseguiti con due gruppi di concentrazioni di DNA (20 e 200 ppm).
La Figura 8 mostra un confronto tra l?effetto inibitorio esercitato da self-DNA secreto (barre nere) e self-DNA genomico (barre bianche) sulla crescita di Saccharomyces cerevisiae a 24 h.
La Figura 9 mostra l?inibizione della crescita in Saccharomyces cerevisiae mediante un terreno esausto contenente self-DNA secreto (self secretoma) rispetto a un controllo, terreno esausto di HAP (secretoma rimosso) e DNA eterologo (nonself DNA).
La Figura 10 mostra esempi di una mappatura del genoma di S. cerevisiae di frammenti di DNA recuperati da surnatanti respiratori e fermentativi.
La Figura 11 mostra l?inibizione della crescita mediante secretomi respiratori e fermentativi sull?organismo modello S. cerevisiae, che cresce su glucosio (cellule fermentative, 7 h di incubazione) o su glicerolo (cellule respiratorie, 48 h di incubazione). Il DNA eterologo non produce alcuna inibizione della crescita indipendentemente dallo stato metabolico delle cellule target. I dati sono valori medi di O.D.590 valutata durante la crescita ed espressa come percentuale di controllo non trattato (=100).
La Figura 12 mostra la morte cellulare aumentata in cellule di lievito in un bioreattore quando inibite dall?accumulo di DNA secreto ed esposte a concentrazioni di zucchero elevate.
La Figura 13 mostra l?effetto inibitorio differenziale di DNA tumorale su cellule tumorali (ES-2) vs. cellule sane (HaCat).
La Figura 14 mostra l?effetto inibitorio differenziale di secretoma tumorale su cellule tumorali vs. cellule sane.
La Figura 15 mostra la morte di cellule HK-2 (%) in condizioni di controllo (linea nera) ed esposte a 1 ng/ml di self-DNA genomico (linea punteggiata) o nonself-DNA dalla linea cellulare PCCL3 (linea tratteggiata).
La Figura 16 mostra l?effetto di DNA extracellulare e incremento di glucosio su linee cellulari umane (HaCat, ES-2 e MDA-MB-231). L?incremento di glucosio (triangolo) ? stato dato 24 h dopo l?esposizione a DNA (freccia verticale).
La Figura 17 mostra l?effetto di DNA extracellulare e incremento di glucosio su linee cellulari umane (HaCat, ES-2 e MDA-MB-231). L?incremento di glucosio (triangolo) ? stato dato 48 h dopo l?esposizione a DNA (freccia verticale).
La Figura 18 mostra l?effetto di DNA extracellulare e cisplatino su diverse linee cellulari umane (HaCat, ES-2 e MDA-MB-231). I simboli a fulmine rappresentano trattamenti con cisplatino.
La Figura 19 mostra una rappresentazione schematica del modello di Dinamica di sistema semplificato delle interazioni tra popolazioni di cellule sane e cancerose in un corpo umano. Si veda il testo per i dettagli.
La Figura 20 (A) mostra una rappresentazione schematica di una terapia combinata mediante trattamento con secretoma da tessuti cancerosi con applicazione di impulso di glucosio per indurre apoptosi selettiva di cellule cancerose. (B) spiegazione grafica della somministrazione di DNA secreto di un cancro specifico trasportato da microalghe usate come integratore alimentare e veicolante naturale del DNA target.
La Figura 21 mostra una simulazione teorica di un modello che descrive le relazioni tra diversi livelli di assunzione di calorie, progressione di un cancro e aspettativa di vita.
La Figura 22 mostra una simulazione teorica di un modello della progressione di un cancro con diversi trattamenti. A) Cancro mortale non trattato. B) Cancro trattato con self-secretoma risultando in una progressione pi? lenta e un aumento dell?aspettativa di vita. C) Trattamento contro il cancro integrato con self-secretoma seguito da un incremento di glucosio dando come risultato una totale remissione del cancro dovuta all?induzione di morte cellulare indotta da zucchero (SICD, Sugar Induced Cell Death) in cellule tumorali mediante l?inibizione della loro crescita specifica.
ESEMPI
ESEMPI 1-3: ESPERIMENTI SUI BATTERI
Tutti i ceppi usati nell?esempio 1 sono stati recuperati dalla libreria di ceppi del Laboratorio di genomica microbica del ?Dipartimento di Biologia cellulare, computazionale e integrativa? dell?Universit? di Trento. I batteri usati negli esempi 2-3 sono stati coltivati da BioEra Life Sciences Pvt. Ltd., India (Articolo 170 bis CPI).
I seguenti esperimenti mostrano la diminuzione del dosaggio di self-DNA secreto rispetto a self-DNA genomico, la specificit? del self-DNA secreto, e l?effetto potenziato ottenuto mediante la combinazione del trattamento con un fago e trattamento con self-DNA.
ESEMPIO 1: Effetto inibitorio di self-DNA genomico o self-DNA secreto su P.aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis
METODI
Ceppi di Pseudomonos aeruginosa (PAO1 e il suo mutante ipermutabile PAO1-?mutS) e Staphylococcus aureus (USA300) sono stati posti in coltura in un terreno TSB in un volume di 200 ?L in una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti e la crescita ? stata monitorata mediante la determinazione di OD600 ogni 15 minuti usando un lettore di piastre Infinite M200 (Tecan, M?nnedorf, Svizzera) a 37? con agitazione orbitale a 180 rpm. I trattamenti sono stati eseguiti mediante l?aggiunta al terreno di self-DNA genomico o self-DNA secreto. Per confronto, DNA eterologo commerciale da salmone ? stato usato nel caso di esperimenti con P.auruginosa, mentre nel caso di esperimenti con S.aureus il DNA eterologo usato era il DNA genomico da P.aeruginosa.
DNA genomico ? stato estratto da cellule pellettizzate usando il kit DNeasy Blood and Tissue ( Germania), seguendo le istruzioni del produttore e includendo una fase di digestione con un cocktail di RNAsi ( Stati Uniti). Per S. aureus l?estrazione includeva un?incubazione con lisostafina (
Germania) durante la fase di lisi cellulare. Il DNA secreto ? stato ottenuto da surnatanti della specie batterica sottoposta a coltura in TSB usando un kit commerciale standard per l?estrazione di cfDNA (cell-free DNA, DNA privo di cellule) da plasma , Somerset, NJ, USA). Per raggiungere le concentrazioni elevate e i volumi necessari, diverse estrazioni sono state raggruppate e concentrate usando un concentratore di DNA CentriVap DNA (Labconco).
La concentrazione di DNA ? stata misurata usando Qubit ( MA, USA), la purezza ? stata valutata attraverso la valutazione dei rapporti 260/280 e 260/230 usando uno spettrometro Nanodrop ND-1000 ( MA, Stati Uniti) e le integrit? sono state valutate sull?1% di gel di agarosio.
Il DNA genomico estratto ? stato sonicato usando un sonicatore Bioruptor? ( Liege, Belgio). Il protocollo di sonicazione includeva 30/30 secondi acceso/spento per 30 cicli, ottenendo una dimensione media di frammento di 200 bp che variava tra 50 e 1000 bp).
RISULTATI
Effetto inibitorio del self-DNA genomico su P.aeruginosa
? stato testato l?effetto inibitorio del DNA genomico in P. aeruginosa. Sono stati usati due ceppi, PAO1 e il suo mutante ipermutabile PAO1-?mutS. ? stato osservato un effetto inibitorio significativo ad una concentrazione di 100 ng/?L in entrambi i ceppi selezionati (figura 2).
Nel caso del ceppo PAO1, (figura 2A) i punti temporali selezionati di crescita corrispondevano approssimativamente alle quattro fasi della curva di crescita (fase lag, esponenziale precoce, esponenziale tardiva e plateau). L?inibizione era pi? chiaramente visibile in corrispondenza della fase esponenziale intermedia e tardiva. L?altro ceppo PAO1-?mutS (figura 2B) ha mostrato di essere inibito alla stessa concentrazione di self-DNA genomico come riscontrato nel wild-type (100 ng/?L). Non ? stata osservata alcuna differenza significativa con il controllo con l?esposizione a DNA eterologo alla stessa concentrazione.
Effetto inibitorio del self-DNA genomico su Staphylococcus aureus
L?esperimento di esposizione a self-DNA genomico ha dimostrato un?inibizione significativa ad una concentrazione di 50 ng/?L durante la fase di crescita esponenziale iniziale, seguita da una fase lag della durata di 15 ore e un recupero che porta alla stessa densit? cellulare del controllo dopo 36 ore (figura 3).
Effetto inibitorio del self-DNA secreto su P.aeruginosa
L?esposizione a self-DNA secreto ha dimostrato un effetto inibitorio rilevabile ad una concentrazione inferiore (6 ng/ul) rispetto a quello osservato con DNA genomico (100 ng/ul) per P.aeruginosa) (figura 4).
Effetto inibitorio del self-DNA secreto su S.aureus
L?esposizione a self-DNA secreto ha dimostrato un effetto inibitorio rilevabile ad una concentrazione inferiore (6 ng/ul) rispetto a quello osservato con DNA genomico (50 ng/ul) per S.aureus) (figura 5).
ESEMPIO 2: Effetto inibitorio del self-DNA genomico su Staphylococcus hominis
METODI
Gli esperimenti sono stati eseguiti in 3 replicati a due concentrazioni diverse di DNA sonicato da S. hominis e Malassezia come trattamento con DNA eterologo a due concentrazioni di 10 e 100 ng/ul. Il DNA ? stato sonicato e la qualit? e i livelli di frammentazione sono stati controllati usando l?1% di gel di Agarosio. Brodo nutriente di LB fino alla fase log intermedia per impostare i replicati dell?esperimento. Da una coltura fatta crescere per tutta la notte ? stata inoculata un?aliquota di 0,1 ml in modo asettico a vari replicati dell?esperimento. Dopo l?aggiunta, le provette di coltura sono state incubate a 37 ?C. Sono stati prelevati campioni ogni ora da ciascun replicato e controllati mediante OD a 600 nm fino a che non ? stata raggiunta la fase stazionaria.
RISULTATI
Effetto inibitorio del self-DNA genomico su Staphylococcus hominis
L?esperimento di esposizione a self-DNA genomico ha dimostrato un?inibizione di crescita significativa ad una concentrazione di 100 ng/?L. Ad una concentrazione inferiore (10 ng/?L) l?inibizione ? visibile solo durante la fase di crescita esponenziale iniziale, seguita da un recupero che porta alla stessa densit? cellulare del controllo dopo 36 ore (figura 6).
ESEMPIO 3: Effetto inibitorio del self-DNA genomico su Klebsiella combinato con un trattamento con fagi
Un gruppo di esperimenti ? stato eseguito per dimostrare che l?effetto inibitorio specie-specifico di self-DNA in specie batteriche pu? essere potenziato in combinazione con trattamenti con fagi specifici e/o usando DNA secreto della specie target al posto del suo intero DNA genomico.
METODI
Gli esperimenti sono stati eseguiti in 3 replicati di trattamenti con Self-DNA sonicato da Klebsiella pneumoniae (ATCC 33495 - https://www.atcc.org/) e Nonself-DNA eterologo da una pianta (Arabidopsis thaliana) e una diversa specie batterica (Escherichia coli). I trattamenti sono stati eseguiti a due concentrazioni diverse di 20 e 200 ng/?l. Il DNA ? stato sonicato e la qualit? e i livelli di frammentazione sono stati controllati usando l?1% di gel di Agarosio con una dimensione di frammento variabile tra 200 e 1000bp. Brodo nutriente di LB fino alla fase log intermedia per impostare i replicati dell?esperimento. Da una coltura fatta crescere per tutta la notte ? stata inoculata un?aliquota di 0,1 ml in modo asettico ai vari replicati dell?esperimento. Dopo l?aggiunta, le provette di coltura sono state incubate a 37 ?C. I fagi sono stati precedentemente isolati da K. pneumoniae e lisati di fago sono stati aggiunti al terreno diluito 1:4. Sono stati prelevati campioni ogni ora da ciascun replicato e controllati mediante OD a 600 nm fino a che non ? stata raggiunta la fase stazionaria.
RISULTATI
L?inibizione del self-DNA mostra un effetto sinergico molto forte quando combinata con un trattamento con fagi. Il trattamento combinato ? significativamente pi? inibitorio di sia il fago sia self-DNA da soli (figura 7).
ESEMPI 4-7: ESPERIMENTI SUL LIEVITO
I seguenti esperimenti dimostrano la diminuzione del dosaggio di self-DNA secreto rispetto a self-DNA genomico, la specificit? del self-DNA secreto e l?effetto potenziato della combinazione del trattamento con glucosio e dei trattamenti con self-DNA.
ESEMPIO 4: Effetto inibitorio di self-DNA secreto e self-DNA genomico sulla crescita di S. cerevisiae METODI
Ceppo
Il ceppo di lievito usato in tutti gli esperimenti era S. cerevisiae CEN.PK2-1C (MATa ura3-52 his3-D1 leu2-3,112 trp1-289 MAL2-8c SUC2), acquistato presso la collezione EUROSCARF (www.unifrankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf).
Estrazione del DNA
Il DNA genomico di S. cerevisiae ? stato estratto da cellule di lievito raccolte dopo 24 h di coltivazione in un terreno YPD, mediante un kit commerciale di DNA genomico (Quiagen, Valencia, CA) seguendo le istruzioni del produttore.
Il DNA secreto di S. cerevisiae ? stato estratto da un terreno esausto raccolto al termine delle colture in fed-batch aerobiche di S. cerevisiae eseguite in un bioreattore agitato da 2,0 L (Bioflo110, New Brunswick Scientific) seguendo due tipi di strategie di alimentazione di glucosio: esponenziale o a diminuzione logistica, cos? che la popolazione crescente di lievito nel bioreattore ha mostrato un metabolismo fermentativo o respiratorio, rispettivamente, come discusso approfonditamente in un lavoro precedentemente pubblicato (Mazzoleni et. al, 2015). La soluzione di alimentazione, contenente il 50% di glucosio p/v e sali, elementi in tracce, acido glutammico e vitamine, ? stata pompata nel reattore ad una velocit? di alimentazione specifica che era esponenzialmente aumentata durante il ciclo (alimentazione esponenziale) o logisticamente diminuita seguendo la curva di crescita del lievito cos? che non si ? accumulato glucosio nel recipiente in quest?ultima procedura di alimentazione. Per semplicit?, di seguito nella presente i due terreni esausti sono stati denominati, rispettivamente, fermentativo (F) e respiratorio (R).
I terreni esausti sono stati recuperati dal bioreattore e filtrati (filtri Millipore di 0,22 ?m) e usati per l?estrazione di DNA. Il terreno esausto F ? stato distillato a 37 ?C sotto pressione, cos? l?etanolo residuo ? stato ridotto allo 0,03% v/v. L?etanolo ? stato determinato mediante un kit enzimatico per etanolo (Megazyme Intern.) Non era presente etanolo nel terreno esausto R.
Quindi, l?estrazione di DNA dal terreno esausto ? stata eseguita secondo Anker et al., (1975) con alcune modifiche. Il terreno filtrato (80 ml) ? stato fatto evaporare a secchezza sotto vuoto per ottenere 1,26 g in peso secco. Il materiale essiccato ? stato sospeso in 10 ml di tampone CTAB pre-riscaldato (2% di cetil trimetilammonio bromuro, 1,4 M di NaCl, 20 mM di EDTA, 100 mM di TrisHCl, pH 8,0) e incubato per 45 min a 40 ?C. Un volume uguale di fenolo:cloroformio:isoamil alcol (25:24:1) ? stato addizionato alla soluzione di CTAB e vortexato per 5 min. Dopo una centrifugazione per 10 min (5000 rpm), la fase acquosa ? stata raccolta e il trattamento con fenolo: cloroformio: isoamil alcol ? stato ripetuto un?altra volta. La fase acquosa ? stata raccolta, fatta evaporare a secchezza sotto vuoto e l?estratto essiccato ? stato sospeso nuovamente in 3 ml di H2O (priva di DNasi/RNasi). La soluzione ? stata quindi caricata su HAP (grado di DNA di idrossiapatite: Bio-Gel HTP) che ? stato precedentemente adattato in una soluzione tampone di fosfato (PBS, Na2HPO4 e NaH2PO4, pH 6,8) 0,005 M pre-riscaldata a 60 ?C. Il campione ? stato miscelato delicatamente e incubato a temperatura ambiante per 10 min. Il surnatante ottenuto dalla centrifuga (5000 rpm, 5 min) ? stato scartato e il campione contenete il DNA a singolo filamento ? stato eluito con PBS 0,12 M, mentre il DNA a doppio filamento ? stato eluito con PBS 0,48 M. Il DNA ? stato quantificato, e il terreno esausto dopo un trattamento con HAP ? stato usato per test d?inibizione.
Amplificazione diretta di DNA da terreno esausto Entrambi i terreni esausti (F e R) sono stati direttamente soggetti ad amplificazione usando un kit Replig (Quiagen, Valencia, CA). Quindi, il prodotto di amplificazione ? stato sottoposto a sonicazione puntando ad ottenere frammenti di DNA da usare in esperimenti inibitori sulla crescita di lievito. La sonicazione ? stata eseguita con un Bandelin Sonopulse (Bandelin, Berlino, Germania) al 90% di potenza con un impulso di 0,9-s per 12 min. La verifica delle dimensioni di banda sonicata (dimensione media 200 bp) ? stata eseguita sul 3% di gel di agarosio MetaPhorTM (Lonza Scientific, Allendale, NJ, USA) usando Sybr? Safe (Invitrogen).
Aliquote dei prodotti di amplificazione ottenuti con Replig sono state altres? usate per il sequenziamento. Procedure di bioinformatica standard sono state usate per l?analisi dei dati.
Quantificazione di DNA
Il DNA derivante da procedure di estrazione o ottenuto mediante amplificazione ? stato quantificato mediante un fluorimetro Qubit 3.0, usando kit di saggi per dsDNA e ssDNA Qubit (Life Technology, Carlsbad, California, USA). La qualit? dei campioni ? stata valutata mediante uno spettrofotometro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA).
Test di inibizione
I test inibitori sulla crescita di S. cerevisiae in assenza di DNA genomico, self-DNA secreto, o terreno esausto sono stati eseguiti in beute da agitazione da 25 ml contenenti 5 ml di un terreno minerale integrato con casamminoacidi, uracile, istidina, leucina, triptofano come gi? riportato (Mazzoleni et al, 2015), e contenenti il 2% p/v di glucosio o il 6% v/v di glicerolo come fonti di carbonio per consentire alle cellule di lievito di crescere, rispettivamente, in condizioni fermentative o respiratorie. Una diversa concentrazione di DNA genomico o self-DNA secreto o aliquote di un terreno esausto F o R (75% v/v di concentrazione finale) sono stati addizionati al terreno. Le colture sono state inoculate con un?aliquota adeguata di una pre-coltura di lievito, per dare un?O.D.590 iniziale di 0,1 e incubate a 28 ?C, 200 rpm.
Come eterologo (no-self DNA), ? stato usato un DNA di sperma di pesce commerciale (Roche Diagnostics, Paesi Bassi).
La crescita del lievito ? stata monitorata determinando la densit? cellulare come densit? ottica a 590 nm (O.D.590). La vitalit? cellulare ? stata determinata mediante conta vitale su piastra su piastre di agar YPD (estratto di lievito 1%, bactopeptone 2%, destrosio 2% p/v) incubate a 30 ?C per 48 h. La vitalit? ? stata espressa come unit? formanti colonia (CFU) ml<-1>. I dati sono valori medi di O.D.590 valutata durante la crescita ed espressa come percentuale di controllo non trattato (=100).
RISULTATI
Effetto inibitorio di self-DNA secreto e self-DNA genomico sulla crescita di S. cerevisiae
L?effetto inibitorio di self-DNA secreto (ottenuto mediante amplificazione Replig dal terreno esausto) sulla crescita di S. cerevisiae ? stato valutato sulla crescita di lievito dopo 24 h di incubazione e confrontato con i risultati ottenuti con self-DNA genomico.
In figura 8 viene chiaramente mostrato che il DNA secreto ha inibito la crescita del lievito gi? a 4,5 ug/ml, ottenendo il 35% del valore di controllo a 8 ug/ml, mentre non ? stata osservata alcuna inibizione nel caso di self-DNA genomico testato alle stesse concentrazioni. Il self-DNA genomico, tuttavia, ha dato come risultato l?inibizione della crescita di lievito a uno e perfino due ordini di grandezza superiori: a 45 e 450 ug/ml, la percentuale del controllo di crescita era 28 e 16, rispettivamente (dati non mostrati).
Effetto inibitorio del self-DNA secreto sulla crescita di S. cerevisiae
L?estrazione di DNA dal terreno esausto in seguito alla procedura descritta nei Metodi, ci ha consentito di quantificare la quantit? di self-DNA che si accumula durante la coltivazione nel bioreattore, e dovuta a una secrezione attiva di lievito, poich? la lisi cellulare era assolutamente trascurabile. La quantit? di self-DNA secreto (secretoma) era 1,2 ug/ml del terreno esausto.
Quando il terreno esausto contenente 1,2 ug/ml di DNA, ? stato addizionato a colture di lievito fresche, ? stata osservata una chiara inibizione della crescita di lievito (figura 9): rispetto al controllo, la velocit? di crescita era diminuita, ed ? stata osservata una velocit? di fase lag diauxica molto lunga. Dopo la fase lag, la crescita ? ripresa, e la densit? cellulare finale ottenuta era la stessa del controllo.
Al contrario, il terreno esausto, una volta che il DNA ? stato estratto mediante idrossiapatite (terreno esausto HAP), non inibiva pi? la crescita del lievito (figura 9).
Considerando che il terreno esausto ? stato addizionato al 75% v/v del volume di coltura totale per i test di inibizione, la concentrazione di DNA inibente efficace (secretoma) era 0,90 ug/ml.
ESEMPIO 5: Differenze di secretoma tra popolazioni cellulari di S. cerevisiae cresciute in condizioni metaboliche diverse (respirazione vs fermentazione) La Tabella 1 mostra le differenze tra frammenti di DNA secreti da S. cerevisiae in metabolismo respiratorio e fermentativo.
Tabella 1
Respiratorio 12,032 10,932
Nella Tabella 1 i frammenti di DNA recuperati dai surnatanti di colture di S. cerevisiae in condizioni fermentative o respiratorie hanno dimostrato una grande differenza in termini di numero totale di contig ottenuti mediante l?analisi bioinformatica. Inoltre, il numero di sequenze specifiche recuperate mediante ciascun terreno di crescita nelle due condizioni metaboliche rappresentava il 51 e il 91% del numero totale delle sequenze recuperate nel caso, rispettivamente, di condizioni fermentative e respiratorie. In altre parole, il metabolismo pi? basico e semplice di fermentazione corrisponde a una quantit? inferiore di frammenti secreti nel terreno di crescita, mentre ? stata riscontrata una quantit? drammaticamente superiore di frammenti secreti nei surnatanti di cellule che esibiscono il pi? complesso metabolismo respiratorio. ? molto importante osservare che i due gruppi di frammenti secreti includevano solo 1049 frammenti di DNA condivisi in comune tra le due condizioni metaboliche, mentre la maggior parte dei frammenti accumulati ? risultata essere specifica per le condizioni di crescita. La Figura 10 mostra esempi di sequenze secrete mappate versus il database genomico di lievito di riferimento dando come risultato l?essere corrispondenti a regioni specifiche su cromosomi diversi. Sono chiare ad un primo sguardo le diverse posizioni delle sequenze secrete nelle condizioni fermentativa e respiratoria. In modo interessante, le regioni mappate che si sovrappongono nel caso dell?esempio sul cromosoma XII corrispondono ad un gene ribosomiale che si prevede essere ovviamente attivo in entrambe le condizioni metaboliche (figura 10).
ESEMPIO 6: Effetto inibitorio specifico del self-DNA sulla crescita di cellule fermentative e respiratorie di S. cerevisiae.
Per valutare l?effetto di secretomi fermentativi o respiratori (il terreno esausto contenente self-DNA secreto raccolto al termine del ciclo di fed-batch quando la cellula ha mostrato un metabolismo fermentativo o respiratorio), i test di inibizione sono stati eseguiti in presenza di ciascun secretoma su colture cellulari di lievito che crescono su glucosio o su glicerolo come fonti di carbonio. Di fatto, usando glucosio come fonte di carbonio, la crescita di lievito ? stata principalmente sostenuta da un metabolismo fermentativo nella prima fase esponenziale, mentre la crescita di lievito su glicerolo ? stata esclusivamente respiratoria.
In figura 11 vengono riportate le prove dell?inibizione della crescita da parte di due secretomi diversi (fermentativo e respiratorio) su S. cerevisiae. L?effetto inibitorio ? differenzialmente superiore quando il trattamento viene eseguito con il secretoma prodotto mediante cellule di lievito che esprimono lo stesso metabolismo (fermentativo vs. respiratorio).
ESEMPIO 7: Morte cellulare aumentata in cellule di lievito inibite esposte ad alimentazione continua di glucosio.
Quando si applica un?alimentazione di glucosio esponenzialmente crescente ad una popolazione di S. cerevisiae in fase di crescita in un bioreattore (si veda METODI dell?esempio 4), la massa cellulare ? aumentata seguendo la velocit? di alimentazione impostata, e ottiene un valore massimo di densit? cellulare (figura 12).
Durante le fasi precoci dell?alimentazione, la massa cellulare ? aumentata seguendo la velocit? di alimentazione impostata, e non ? stato individuato glucosio residuo nel terreno di coltura. Successivamente, a causa dell?accumulo di self-DNA secreto nel terreno di coltura che esercita un effetto inibitorio, la velocit? di crescita diminuisce e il glucosio nel terreno aumenta (figura 12). In parallelo, si osserva una diminuzione significativa della vitalit? cellulare (figura 12 a).
Al contrario, quando si applica un?alimentazione di glucosio che diminuisce in modo logistico ad una popolazione di S. cerevisiae in fase di crescita nel bioreattore (si veda METODI dell?esempio 4), non si accumula glucosio nel terreno di coltura e non si osserva alcuna diminuzione della vitalit? cellulare per tutto il ciclo sebbene la densit? cellulare finale raggiunga gli stessi livelli del ciclo di alimentazione esponenziale (figura 12).
ESEMPI 8-12: ESPERIMENTI SU LINEE CELLULARI UMANE I seguenti esperimenti dimostrano la diminuzione del dosaggio di self-DNA secreto rispetto al self-DNA genomico, la specificit? del self-DNA secreto e l?effetto potenziato ottenuto combinando il trattamento con glucosio e trattamenti con self-DNA.
ESEMPIO 8: Effetto inibitorio diel DNA tumorale su cellule tumorali vs. cellule sane.
METODI
Coltura cellulare
Per questo studio sono state selezionate due linee cellulari diverse: una linea cellulare di cheratinociti immortalizzati (HaCaT ATCC? PCS-200-011?) e una linea cellulare di carcinoma ovarico a cellule chiare (ES-2 ATCC? CRL-1978?). Tutte le linee cellulari sono state ottenute dalla American Type Cell Collection (ATCC). Le cellule sono state mantenute a 37 ?C in un?atmosfera umidificata con il 5% di CO2 e poste in coltura in un terreno di Dulbecco modificato (DMEM; 41965?039, Gibco, Thermo Fisher Scientific) integrato con il 10% di siero di bovino fetale (FBS; S0615, Merck), l?1% di antibiotico antimicotico (AA; P06-07300, PAN Biotech) e 50 ?g/ml di gentamicina (15750-060, Gibco, Thermo Fisher Scientific). Per ciascuna analisi, le cellule sono state staccate con lo 0,05% di tripsina?acido etilenediamminatetraacetico (EDTA; 25300-054, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) a temperatura ambiente (RT) per approssimativamente 5 min.
Isolamento del materiale genomico
Per l?estrazione di DNA, le cellule sono state piastrate in beute T-175 e fatte arrivare a ~80% di confluenza in DMEM integrato. Le cellule sono state staccate dalla beuta e raccolte. L?estrazione del DNA ? stata eseguita usando un kit di purificazione di DNA genomico (CL-250, Citomed), secondo le raccomandazioni del produttore. DNA di salmone ? stato ottenuto commercialmente (acido deossiribonucleico, a filamento singolo da testicoli di salmone, D7656, Sigma-Aldrich, Merck).
Tutto il materiale di DNA usato in questo lavoro ? stato precedentemente clivato mediante sonicazione per 15 secondi (1 secondo acceso; 1 secondo spento). Il DNA ? stato conservato (-20 ?C) fino a ulteriore utilizzo.
Valutazione di proliferazione cellulare
Per un?analisi sulla proliferazione cellulare, 5?104 cellule/pozzetto (1?105 cellule/ml) di ciascuna linea cellulare sono state piantate in piastre a 24 pozzetti (500 ?l/pozzetto) in DMEM integrato e lasciate aderire per 24 h. Le cellule sono state sincronizzate sotto digiuno (starvation) (terreno di coltura con l?1% di FBS) per 24 h a 37 ?C e il 5% di CO2, ed esposte alle condizioni in analisi: 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ?g/ml, 10 ?g/ml di self-DNA/DNA eterologo, o il 10%, 50% o 100% di terreno esausto. Ogni 24 h, le cellule sono state staccate come descritto (? stato altres? raccolto il surnatante) e le cellule sono state centrifugate per 5 minuti a 155 g. Il surnatante ? stato scartato e le cellule sono state contate mediante colorazione con Trypan Blue Stain allo 0,4% (15250061, , Thermo Fisher Scientific) per identificare le cellule con una membrana cellulare compromessa, indicante dunque morte cellulare, usando una camera di conta cellulare di Neubauer migliorata.
RISULTATI
? stato studiato l?effetto di DNA tumorale extracellulare (linea cellulare ES-2) sulla proliferazione delle stesse cellule tumorali e di cellule sane (linea cellulare HaCat). Una risposta differenziale con una tendenza a una diminuzione della proliferazione cellulare ? l?esposizione a self-DNA, che ? pi? evidente dopo 48 ore di trattamento rispetto al controllo ( La Figura 13, riquadro superiore).
ESEMPIO 9: Effetto inibitorio del secretoma tumorale su cellule tumorali vs. cellule sane.
METODI
Coltura cellulare
Per questo studio sono state selezionate due linee cellulari diverse: una linea cellulare di cheratinociti immortalizzati (HaCaT ATCC? PCS-200-011?) e una linea cellulare di carcinoma ovarico a cellule chiare (ES-2 ATCC? CRL-1978?). Tutte le linee cellulari sono state ottenute dalla American Type Cell Collection (ATCC). Le cellule sono state mantenute a 37 ?C in un?atmosfera umidificata con il 5% di CO2 e poste in coltura in un terreno di Dulbecco modificato (DMEM; 41965?039, Gibco, Thermo Fisher Scientific) integrato con il 10% di siero di bovino fetale (FBS; S0615, Merck), l?1% di antibiotico antimicotico (AA; P06-07300, PAN Biotech) e 50 ?g/ml di gentamicina (15750-060, Gibco, Thermo Fisher Scientific). Per ciascuna analisi, le cellule sono state staccate con lo 0,05% di tripsina?acido etilenediamminatetraacetico (EDTA; 25300-054, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) a temperatura ambiente (RT) per approssimativamente 5 min.
Valutazione di proliferazione cellulare
Per un?analisi sulla proliferazione cellulare, 5?104 cellule/pozzetto (1?105 cellule/ml) di ciascuna linea cellulare sono state piantate in piastre a 24 pozzetti (500 ?l/pozzetto) in DMEM integrato e lasciate aderire per 24 h. Le cellule sono state sincronizzate sotto digiuno (starvation) (terreno di coltura con l?1% di FBS) per 24 h a 37 ?C e il 5% di CO2, ed esposte alle condizioni in analisi: 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ?g/ml, 10 ?g/ml di self-DNA/DNA eterologo, o il 10%, 50% o 100% di terreno esaurito. Ogni 24 h, le cellule sono state staccate come descritto (? stato altres? raccolto il surnatante) e le cellule sono state centrifugate per 5 minuti a 155 g. Il surnatante ? stato scartato e cellule sono state contate mediante colorazione con Trypan Blue Stain allo 0,4% (15250061, Gibco?, Thermo Fisher Scientific) per identificare le cellule con una membrana cellulare compromessa, indicante dunque morte cellulare, usando una camera di conta cellulare di Neubauer migliorata.
Effetto del terreno esausto
L?effetto inibitorio di DNA secreto ? stato valutato addizionando terreni esausti miscelati (rapporto 1:1) con un terreno di coltura standard come nella valutazione della proliferazione cellulare. I terreni esausti sono stati raccolti dopo aver mantenuto le cellule in coltura per 24 h.
RISULTATI
Qui ? stato valutato l?effetto di un terreno esausto di linee cellulari ES-2 sulla stessa linea cellulare e su una linea cellulare sana (HaCat). In questo esperimento, l?esposizione ad un terreno esausto contenente il DNA secreto di cellule ES-2, ha chiaramente dimostrato lo specifico effetto inibitorio sulla stessa linea cellulare ES-2 mentre lo stesso terreno esausto ? stimolatorio sulla linea cellulare HaCat ( La Figura 14).
ESEMPIO 10: Effetto di self-DNA e nonself-DNA sulla morte cellulare in linee cellulari diverse.
METODI
Coltura cellulare ed estrazione di DNA/cromatina: Sono state usate due linee cellulari: HK2 - una linea cellulare tubolare prossimale derivata da rene normale (cellule immortalizzate mediante trasduzione con geni E6/E7 di papilloma virus umano 16 (HPV-16)); PCCL3 - una linea cellulare di follicoli tiroidei di ratto (Rattus norvegicus). Queste linee cellulari sono state mantenute e sottoposte a coltura in DMEM F-12, DMEM o terreno di Coon F-12, rispettivamente. Terreno di coltura integrato con l?1% di penicillina/streptomicina, 50 ?g/ml di gentamicina e il 5% di siero bovino fetale (FBS).
Per estrarre le cellule di DNA sono state piastrate in T-175cm2 e portate a ~80% di confluenza con un terreno di coltura integrato con l?1% di FBS. Le cellule adese sono state lavate con PBS (1x) e raschiate dalla beuta a T. L?estrazione del DNA ? stata eseguita usando le raccomandazioni del produttore (Citogene). Il DNA ? stato clivato mediante sonicazione per 15 secondi (1 sec. ACCESO; 1 sec. SPENTO). La cromatina ? stata estratta da cellule dopo il fissaggio di proteine con formaldeide (37%) e glicina (125 mM). Le cellule adese sono state lavate con PBS (1x) e raschiate. Cellule di pellet sono state lisate mediante sonicazione, eseguendo 32 cicli di 10 secondi ciascuno (1 sec. ACCESSO; 1 sec. SPENTO). La frammentazione del DNA e della cromatina ? stata confermata mediante elettroforesi in un gel di agarosio al 2%.
Le cellule sono state incubate con concentrazioni crescenti di DNA/cromatina: 1 ng/ml > 10 ng/ml > 100 ng/ml > 1 ?g/ml > 10 ?g/ml preparate in un terreno di coltura.
I saggi sono stati eseguiti in una piastra a 24 pozzetti 5x104 cellule/pozzetto e il terreno ? stato integrato con l?1% di FBS. Le cellule sono state lasciate riposare per 24 h prima dell?esposizione a DNA/cromatina.
Citometria a flusso - morte cellulare
L?analisi della morte cellulare ? stata eseguita usando una colorazione con annexina V (FITC) e propidio ioduro (PI). Sono stati raccolti i surnatanti e le cellule adese di ciascun pozzetto. Le cellule sono state lavate con PBS (1x) con lo 0,5% di BSA e incubate con annexina V. Le cellule sono state lavate nuovamente per rimuovere annexina non legata e preparate per un?analisi di citometria a flusso. PI ? stato addizionato prima dell?acquisizione dei dati. L?analisi dei dati ? stata eseguita usando FlowJo vX 0.7.
RISULTATI
L?insieme completo di dati dei risultati a diversi dosaggi ? riportato nella
La Tabella 2 e nella Tabella 3. ? stata osservata un?induzione significativa di morte cellulare dopo 16 h di esposizione a self-DNA (HK-2) al dosaggio di 1 ng/ml ( La Figura 15).
La Tabella 2 mostra la morte di cellule HK-2 dopo l?esposizione a self-DNA.
La Tabella 3 mostra la morte di cellule HK-2 dopo l?esposizione a nonself-DNA dalla linea cellulare PCCL3.
ESEMPIO 11: Effetto del digiuno (starvation)e dell?incremento di glucosio su linee cellulari umane.
METODI
Coltura cellulare
Per questo studio sono state selezionate tre linee cellulari diverse: una linea cellulare di cheratinociti immortalizzati (HaCaT ATCC? PCS-200-011?) e una linea cellulare di carcinoma ovarico a cellule chiare (ES-2 ATCC? CRL-1978?) e una linea cellulare di cancro al seno umana epiteliale (MDA-MD-231 ATCC? HTB-26?). Tutte le linee cellulari sono state ottenute dalla American Type Cell Collection (ATCC).
Le cellule sono state mantenute a 37 ?C in un?atmosfera umidificata con il 5% di CO2 e poste in coltura in un terreno di Dulbecco modificato (DMEM; 41965?039, Gibco, Thermo Fisher Scientific) integrato con il 10% di siero di bovino fetale (FBS; S0615, Merck), l?1% di antibiotico antimicotico (AA; P06-07300, PAN Biotech) e 50 ?g/ml di gentamicina (15750-060, Gibco, Thermo Fisher Scientific). Per ciascuna analisi, le cellule sono state staccate con lo 0,05% di tripsina?acido etilenediamminatetraacetico (EDTA; 25300-054, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) a temperatura ambiente (RT) per approssimativamente 5 min.
Isolamento del materiale genomico
Per l?estrazione di DNA, le cellule sono state piastrate in beute T-175 e fatte arrivare a ~80% di confluenza in DMEM integrato. Le cellule sono state staccate dalla beuta e raccolte. L?estrazione del DNA ? stata eseguita usando un kit di purificazione di DNA genomico (CL-250, Citomed), secondo le raccomandazioni del produttore. DNA di salmone ? stato ottenuto commercialmente (acido deossiribonucleico, a filamento singolo da testicoli di salmone, D7656, Sigma-Aldrich, Merck).
Tutto il materiale di DNA usato in questo lavoro ? stato precedente clivato mediante sonicazione per 15 secondi (1 secondo acceso; 1 secondo spento). Il DNA ? stato conservato (-20 ?C) fino a ulteriore utilizzo.
Saggio di incremento di glucosio
Le cellule (5?104 cellule/pozzetto, 1?105 cellule/ml) sono state piantate in piastre a 24 pozzetti (500 ?l/pozzetto) in DMEM integrato e lasciate aderire per 24 h. Il terreno ? stato quindi rimosso e sostituito da DMEM non integrato senza D-glucosio e senza L-glutammina (F0405, Biochrom, Merck). Le condizioni (self-DNA e DNA eterologo) sono state quindi aggiunte alle cellule. D-glucosio ? stato addizionato dopo un adattamento cellulare di 24 h o 48 h ed ? stata eseguita un?analisi 1 h, 24 h o 48 h dopo il trattamento con D-glucosio. Un?analisi della proliferazione cellulare e della morte cellulare ? stata valutata come decritto sopra.
RISULTATI
Nessun effetto del trattamento con self-DNA era evidente nella linea cellulare HaCat, anche quando accompagnato da un incremento di glucosio dopo 24 h ( La Figura 16). Le stesse cellule esposte a DNA eterologo hanno mostrato una reazione positiva all?incremento di glucosio dopo 24 h. Un effetto lievemente positivo dell?incremento di glucosio dopo 48 h ? stato osservato in cellule HaCat quando esposte sia a self-DNA sia a DNA eterologo ( La Figura 17).
Nel caso di ES-2 l?esposizione a self-DNA mostra un evidente effetto negativo che viene parzialmente recuperato dall?incremento di glucosio dopo 24 h con un declino totale dopo 72 h ( La Figura 16). Quando l?incremento di glucosio ? stato fornito dopo 48 h non ? stato osservato alcun recupero con un declino totale della popolazione dopo 72 h ( La Figura 17). In entrambi i casi, il trattamento con DNA eterologo non ha prodotto una riduzione significativa della popolazione cellulare dopo 72 h ( La Figura 16 e La Figura 17).
Cellule MDA-MB-231 hanno dimostrato elevata resistenza a trattamenti sia con DNA sia con glucosio, indipendentemente dal momento dell?incremento di glucosio ( La Figura 16 e La Figura 17).
Questi risultati indicano inoltre che self-DNA esercita un effetto differenziale in cellule non cancerose e cancerose, apparentemente danneggiando o aumentando la sensibilit? di cellule cancerose verso l?incremento di glucosio dopo un periodo di digiuno nel caso di cellule ES-2.
ESEMPIO 12: Effetto di self-DNA/DNA eterologo e incremento di glucosio in risposta a cisplatino in linee cellulari umane.
METODI
Coltura cellulare
Per questo studio sono state selezionate tre linee cellulari diverse: una linea cellulare di cheratinociti immortalizzati (HaCaT ATCC? PCS-200-011?) e una linea cellulare di carcinoma ovarico a cellule chiare (ES-2 ATCC? CRL-1978?) e una linea cellulare di cancro al seno umana epiteliale (MDA-MD-231 ATCC? HTB-26?). Tutte le linee cellulari sono state ottenute dalla American Type Cell Collection (ATCC).
Le cellule sono state mantenute a 37 ?C in un?atmosfera umidificata con il 5% di CO2 e poste in coltura in un terreno di Dulbecco modificato (DMEM; 41965?039, Gibco, Thermo Fisher Scientific) integrato con il 10% di siero di bovino fetale (FBS; S0615, Merck), l?1% di antibiotico antimicotico (AA; P06-07300, PAN Biotech) e 50 ?g/ml di gentamicina (15750-060, Gibco, Thermo Fisher Scientific). Per ciascuna analisi, le cellule sono state staccate con lo 0,05% di tripsina?acido etilenediamminatetraacetico (EDTA; 25300-054, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) a temperatura ambiente (RT) per approssimativamente 5 min.
Isolamento del materiale genomico
Per l?estrazione di DNA, le cellule sono state piastrate in beute T-175 e fatte arrivare a ~80% di confluenza in DMEM integrato. Le cellule sono state staccate dalla beuta e raccolte. L?estrazione del DNA ? stata eseguita usando un kit di purificazione di DNA genomico (CL-250, Citomed), secondo le raccomandazioni del produttore. DNA di salmone ? stato ottenuto commercialmente (acido deossiribonucleico, a filamento singolo da testicoli di salmone, D7656, Sigma-Aldrich, Merck).
Tutto il materiale di DNA usato in questo lavoro ? stato precedente clivato mediante sonicazione per 15 secondi (1 secondo acceso; 1 secondo spento). Il DNA ? stato conservato (-20 ?C) fino a ulteriore utilizzo.
Effetto di self-DNA / DNA eterologo e incremento di glucosio in risposta a cisplatino
Le cellule sono state lasciate adattare per 24 h in glucosio privo di DMEM, FBS e glutammina, e quindi esposte ai seguenti trattamenti: 1 ng/ml di self-DNA; 1 ng/ml di DNA di salmone; 1 ng/ml di self-DNA 5 mM di glucosio; 1ng/ml di DNA di salmone 5 mM di glucosio. Dopodich?, le cellule sono state trattate con 0,025 mg/ml di cisplatino (corrispondente al dosaggio clinico in pazienti con il cancro) e la proliferazione cellulare e la morte cellulare sono state analizzate. La morte cellulare ? stata valutata mediante colorazione con trypan blue e conta e identificazione tramite microscopia. Questa colorazione non ? in grado di distinguere tra cellule necrotiche e apoptotiche.
RISULTATI
Infine, ? stato studiato l?effetto di self-DNA e DNA eterologo sulla risposta di diverse linee cellulari trattate con cisplatino. Il cisplatino ? un farmaco chemioterapico ben noto che ? stato dimostrato essere efficace come trattamento per numerosi cancri umani. La sua modalit? di azione ? stata collegata alla sua capacit? di reticolarsi con le basi di purina sul DNA, interferendo con i meccanismi di riparazione del DNA, causando danni al DNA, e inducendo successivamente apoptosi in cellule cancerose.
Le cellule HaCaT, quando trattate con cisplatino, hanno mostrato una diminuzione complessiva della proliferazione, che ? spiegata dai livelli aumentati di morte cellulare ( La Figura ). N? self-DNA n? DNA di salmone sembrano esercitare un effetto protettivo in cellule HaCaT. Diversamente, nel caso di cellule ES-2 self-DNA e DNA eterologo sembrano entrambi promuovere un effetto protettivo verso cisplatino, presentando valori di morte cellulare sostanzialmente inferiori rispetto al controllo.
? stato dimostrato che le cellule MDA-MB-231 sono apparentemente resistenti a self-DNA e DNA eterologo con/senza glucosio ( La Figura 16 e La Figura ). Inoltre, ? noto che questa linea cellulare ? altamente resistente a cisplatino, il che ? stato confermato dagli esperimenti ( La Figura ). Tuttavia, in modo interessante, il trattamento con self-DNA ha aumentato fortemente la sensibilit? di cellule MDA-MB-231 a cisplatino, il che pu? essere uno strumento utile per questo tipo di trattamento contro il cancro.
Nel complesso, questi risultati indicano un?interazione interessante tra DNA extracellulare e farmaci chemioterapici (in questo caso cisplatino).
ESEMPIO 13: MODELLO TERAPEUTICO PER TUMORI CHE COMBINA INIBIZIONE MEDIANTE DNA SECRETO E SICD MEDIANTE INCREMENTO DI GLUCOSIO
Negli esperimenti presentati ? stato dimostrato che linee cellulari diverse rispondevano in modo differente a secretomi self o nonself. Inoltre, la combinazione di inibizione della crescita con secretoma canceroso e incremento di glucosio ha prodotto risultati positivi in alcune delle linee cellulari testate, supportando l?idea di un uso mirato di self-DNA e induzione di morte cellulare indotta da zucchero (SICD - si veda l?esempio delle cellule ES-2 che vengono sensibilizzate in presenza di glucosio).
Inoltre, risultati simili sono stati ottenuti con una combinazione di inibizione di secretoma e farmaci chemioterapici tradizionali (cisplatino) come nel caso di MDA-MB-231 che mostrano una sensibilit? molto elevata per cisplatino solo quando soggette a digiuno e in presenza di self-DNA. ? importante osservare che le cellule MDA-MB-231 sono indicate come resistenti ad un trattamento con cisplatino.
METODI
Sviluppo del modello
Un modello matematico semplificato di sviluppo del cancro ? stato implementato secondo l?approccio della Dinamica di sistema (System Dynamics). Il sistema di equazioni differenziali ordinarie rappresenta la dinamica di crescita di: i) la popolazione cellulare di un organismo sano ii) una popolazione di cellule cancerose. Entrambe le popolazioni cellulari crescono in relazione alla disponibilit? di nutrienti (vale a dire, all?apporto calorico) e le cellule cancerose esercitano un effetto negativo sull?organismo ospite che pu? portare alla morte se al di sopra di una soglia impostata (riflettendo la perdita della funzionalit? minima necessaria degli organi colpiti). Senza l?insorgenza di un cancro, la massa corporea raggiunge un equilibrio costante che dipende dell?apporto calorico. Si possono applicare due trattamenti: inibizione specifica sulla crescita di un cancro mediante amplificazione del suo secretoma e induzione di morte cellulare indotta da zucchero (SICD) mediante somministrazione di un incremento di glucosio (si veda la figura 19).
RISULTATI
In base ai risultati presentati, ? stato definito il modello concettuale rappresentato in La Figura 20. L?estrazione di DNA circolante secreto dalle cellule tumorali pu? essere amplificata e usata come prodotto inibitorio specifico per la proliferazione di un cancro con un effetto ridotto sulle cellule sane. Quando il trattamento ? accoppiato ad un impulso di glucosio induce apoptosi in cellule cancerose, portando possibilmente a remissione in base al tipo di cancro specifico. Il trattamento con glucosio somministrato negli esperimenti in vitro presentati su cellule tumorali (Esempi 11 e 12) si pu? tradurre in organismi interi attraverso la somministrazione di trattamenti con insulina regolati con una conseguente fleboclisi di glucosio in soluzione fisiologica. Tale flebo di zucchero, che induce una condizione iperglicemica controllata e limitata nel tempo seguir? all?abbassamento del contenuto di glucosio dovuto al pre-trattamento mediante insulina. Il trattamento ? concepito come una fase di ?digiuno? seguita da un rapido assorbimento di glucosio dal flusso sanguigno. ? possibile prevedere che cellule cancerose con veicolanti potenziati per il trasporto di glucosio riportino fluttuazioni maggiori di assorbimento di glucosio rispetto a cellule sane con un?omeostasi pi? controllata nel loro metabolismo. Al tempo stesso, a causa dell?inibizione di crescita differenziale indotta dal secretoma, le cellule cancerose dovrebbero essere pu? sensibili a morte cellulare indotta da zucchero come dimostrato negli esperimenti riportati. Al fine di potenziare l?effetto ed evitare livelli glicemici possibilmente pericolosi nel paziente, il trattamento con insulina deve essere accoppiato a nutrizione artificiale con glucosio mantenendo dunque costanti i livelli di glucosio inducendone al contempo l?assorbimento potenziato nelle cellule cancerose.
Per dimostrare questo concetto, ? stato eseguito un gruppo di esperimenti in silico che simulano i seguenti scenari: 1) la comparsa di un cancro maligno e il suo effetto sull?ospite in base all?apporto calorico medio nella dieta ( La Figura 21); 2) effetto di un trattamento d?inibizione con secretoma canceroso sulla progressione del cancro e sull?aspettativa di vita ( La Figura 22A,B); remissione del cancro in seguito al trattamento combinato con secretoma canceroso e incremento di glucosio ( La Figura 22C).

Claims (21)

RIVENDICAZIONI
1) Metodo non terapeutico per inibire una specie target, detto metodo comprendendo o essendo consistente nell?esporre detta specie target a sequenze di DNA secrete dalle cellule di una specie di partenza o ad una composizione comprendente dette sequenze di DNA, in cui
detta specie di partenza ? selezionata tra una specie che ? la stessa specie della specie target o una specie filogeneticamente simile alla specie target.
2) Metodo non terapeutico secondo la rivendicazione 1, in cui dette sequenze di DNA secrete dalle cellule di una specie di partenza sono rilasciate da un veicolante.
3) Metodo non terapeutico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, in cui detto veicolante ? una specie ospite che differisce dalla specie di partenza, per esempio una specie selezionata tra una specie microbica, come una specie batterica, o una specie dagli Ascomiceti, o una specie dagli Archea, o una microalga, un organismo multicellulare, come una pianta multicellulare, o una specie di elminti, un microrganismo del terreno, un microrganismo di stato GRAS, un agente di biocontrollo microbico.
4) Metodo non terapeutico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui quando la specie target ? un batterio, detta composizione comprendente le sequenze di DNA secrete dalle cellule di una specie di partenza comprende ulteriormente un fago efficace contro detto batterio.
5) Sequenze di DNA o composizione comprendente dette sequenze di DNA per l?uso nel trattamento terapeutico di una malattia o una condizione di un organismo animale o di un organismo umano, detta malattia o condizione essendo causata da una specie patogena, infestante o parassita o essendo una malattia cancerosa,
in cui dette sequenze di DNA sono il principio attivo che inibisce detta specie patogena, infestante o parassita, la specie target, o una cellula cancerosa di detta malattia cancerosa, la cellula target,
dette sequenze di DNA essendo sequenze di DNA secrete da:
le cellule di una specie di partenza selezionata tra una specie che ? la stessa specie della specie target o una specie filogeneticamente simile alla specie target, quando la malattia o condizione ? causata da una specie patogena, infestante o parassita; o
una cellula cancerosa di partenza della stessa malattia cancerosa da trattare, detta cellula cancerosa di partenza essendo selezionata tra
la cellula target dello stesso organismo animale o organismo umano da trattare, o
una cellula cancerosa di un organismo animale o umano diverso dall?organismo animale o umano da trattare.
6) Sequenze di DNA o composizione come definite nella rivendicazione 5, per l?uso secondo la rivendicazione 5, in cui dette sequenze di DNA sono rilasciate da un veicolante.
7) Sequenze di DNA o composizione come definite in una qualsiasi delle rivendicazioni 5-6, per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5-6, in cui detto veicolante ? una specie ospite che differisce dalla specie di partenza o da una cellula animale o umana, per esempio la specie ospite ? una specie selezionata tra una specie microbica, come una specie batterica, o una specie dagli Ascomiceti, o una specie dagli Archea, o una microalga, un organismo multicellulare, come una pianta multicellulare, o una specie di elminti, un microrganismo del terreno, un microrganismo di stato GRAS, un agente di biocontrollo microbico.
8) Sequenze di DNA o composizione come definite in una qualsiasi delle rivendicazioni 5-7, per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5-7, in cui la specie ospite ? Arthrospira platensis, preferibilmente quando le sequenze di DNA sono secrete da una cellula cancerosa di partenza.
9) Composizione come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 5-8, per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5-8, detta composizione comprendendo ulteriormente un ulteriore principio attivo adatto per trattare la malattia o condizione, come un principio attivo anticancro, per esempio cisplatino.
10) Composizione come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 5-9, per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5-9, in cui quando la specie target ? un batterio, la composizione comprende ulteriormente un fago efficace contro detto batterio.
11) Combinazione di sequenze di DNA con uno o pi? altri principi attivi adatti per trattare una malattia o condizione, detti uno o pi? altri principi attivi essendo diversi da dette sequenze di DNA, detta combinazione essendo per l?uso separato o sequenziale nel trattamento terapeutico di una malattia o condizione di un organismo animale o umano, detta malattia o condizione essendo causata da una specie patogena, infestante o parassita o essendo una malattia cancerosa,
in cui dette sequenze di DNA sono il principio attivo che inibisce detta specie patogena, infestante o parassita, la specie target, o una cellula cancerosa di detta malattia cancerosa, la cellula target,
dette sequenze di DNA essendo sequenze di DNA secrete da:
le cellule di una specie di partenza selezionata tra una specie che ? la stessa specie della specie target o una specie filogeneticamente simile alla specie target, quando la malattia o condizione ? causata da una specie patogena, infestante o parassita; o
una cellula cancerosa di partenza della stessa malattia cancerosa da trattare, detta cellula cancerosa di partenza essendo selezionata tra
la cellula target dello stesso organismo animale o organismo umano da trattare, o
una cellula cancerosa di un organismo animale o umano diverso dall?organismo animale o umano da trattare.
12) Combinazione secondo la rivendicazione 11, per l?uso secondo la rivendicazione 11, in cui dette sequenze di DNA sono rilasciate da un veicolante.
13) Combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-12, per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-12, in cui detto veicolante ? una specie ospite che differisce dalla specie di partenza o dalla cellula animale o umana, per esempio la specie ospite ? una specie selezionata tra una specie microbica, come una specie batterica, o una specie dagli Ascomiceti, o una specie dagli Archea, o una microalga, un organismo multicellulare, come una pianta multicellulare, o una specie di elminti, un microrganismo del terreno, un microrganismo di stato GRAS, un agente di biocontrollo microbico.
14) Combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-13, per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-13, in cui la specie ospite ? Arthrospira platensis, preferibilmente quando le sequenze di DNA sono secrete da una cellula cancerosa di partenza.
15) Combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-14, per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-14, in cui detti uno o pi? altri principi attivi sono selezionati tra un principio attivo anticancro, glucosio e/o insulina.
16) Combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-15, per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-15, in cui successivamente o contemporaneamente alla somministrazione delle sequenze di DNA secrete, insulina e glucosio vengono sequenzialmente somministrati almeno una volta al fine di indurre almeno un picco ipoglicemico seguito da almeno un picco iperglicemico.
17) Combinazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-16, per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11-16, in cui, quando la specie target ? un batterio, detti uno o pi? altri principi attivi sono un fago efficace contro detto batterio.
18) Composizione per inibire una specie target o per inibire una cellula cancerosa target di un organismo animale o un organismo umano da trattare, detta composizione comprendendo o essendo consistente in sequenze di DNA secrete dalle cellule di una specie di partenza o da una cellula cancerosa di partenza, in cui
detta specie di partenza ? selezionata da una specie che ? la stessa specie della specie target o una specie filogeneticamente simile alla specie target, detta cellula cancerosa di partenza essendo selezionata tra la cellula target dello stesso organismo animale o organismo umano da trattare, o una cellula cancerosa di un organismo animale o umano diverso dall?organismo animale o umano da trattare, e dette sequenze di DNA sono rilasciate da un veicolante.
19) Composizione secondo la rivendicazione 18, in cui detto veicolante ? una specie ospite che differisce dalla specie di partenza, per esempio una specie selezionata tra una specie microbica, come una specie batterica, o una specie dagli Ascomiceti, o una specie dagli Archea, o una microalga, un organismo multicellulare, come una pianta multicellulare, o una specie di elminti, un microrganismo del terreno, un microrganismo di stato GRAS, un agente di biocontrollo microbico.
20) Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 18-19, in cui, quando la specie target ? un batterio, detta composizione comprende ulteriormente un fago efficace contro detto batterio.
21) Composizione per inibire un batterio, la specie target, detta composizione comprendendo o essendo consistente in sequenze di DNA secrete dalle cellule di una specie di partenza e un fago efficace contro detto batterio, in cui detta specie di partenza ? selezionata tra lo stesso batterio della specie target o un batterio filogeneticamente simile alla specie target.
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