WO2010142055A2 - Composición para obtener fungicida y bactericida biológico - Google Patents

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Gustavo Adolfo Lobos Prats
Eduardo Patricio Donoso Cuevas
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom

Definitions

  • composition to obtain biological bactericidal fungicide Composition to obtain biological bactericidal fungicide.
  • the invention to be patented refers to a composition for obtaining a biological fungicide and bactericide, for the control of diseases in plants, composed of native strains of the biocontrollers Bacillus spp and Brevibacillus parabrevis in a concentration of 10 8 spores / gr., in a ratio of 1: 1: 1: 1, with broad spectrum action on phytopathogenic bacteria and late blight caused by Phytophthora infestans.
  • composition of the invention allows the control of bacterial and fungal diseases without the use of antibiotics or cupric compounds and due to its characteristics it does not present environmental restrictions and can be used in organic production.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) natural or chemical substances intended to obtain a bacteriostatic bactericide and / or a preservative; that composition being: a) A composition formulated on the basis of two or more Trichoderma strains, with the addition of any synthetic, organic or inorganic substance, including the preservatives and propellants of these substances, intended to give a bacteriostatic bactericidal characteristic, and / or any fungicidal substance in doses lower than those necessary to destroy the culture of Trichoderma, or fungicidal substances to which the selected Trichoderma species become immune, but strong enough to give said preparation a fungicidal nature, as well as the incorporation of substances of any origin and nature, and / or instigators of bacteriostatic bactericidal action (including penicillin as an impure extract of the propellant and / or commercial fungus, macrolides, neomacrolides, cyclosporine, and any other therapeutic family of fungal bacteriostatic bacter
  • a composition formulated on the basis of C s more live and active species of Trichoderma that due to their antagonistic nature must have a separate commercial presentation, but must be mixed at the moment in which they will be used immediately or within a period not exceeding 45 days after the application of the first species, all this with the objective of reaching a broader spectrum of action than that given by any species and of any possible origin in any phase of vegetative growth, which may or may not contain agents that give them the added properties as bacteriostatic bactericide .
  • Another patent of invention is ES No. 2 246 834 and refers broadly to the field of plant growth and development, particularly methods and compositions for improving plant disease growth and resistance.
  • the invention relates to the initiation and promotion of plant growth using a combination of multiple biological control strategies in the soil or in a plant growth medium without soil to control nematodes and leaf pathogens.
  • the invention also relates to a new composition of a plant growth medium comprising chitin and non-chitinolytic plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) that create a synergy in plant growth and disease resistance. Additionally, the invention relates to a new synergistic method of using either a seed treatment or the application of a composition of a soilless planting medium of a chitinous element and bacterial elements for the preparation and development of plants and transplants.
  • PGPR non-chitinolytic plant growth promoting rhizobacteria
  • composition comprising at least two strains of PGPR bacteria and a
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Chitinous compound chosen from chitin, chitin in flakes, chitosan and precursors thereof, in a range of 0.1% to 10.0% or a compound with an equivalent effect.
  • Plant growth promoter ribacteria comprise at least one bacterial strain that can induce systemic resistance in the plant to plant diseases.
  • the composition further comprises a chitinous: a compound that can have a control activity on the nematodes.
  • at least one of the bacterial strains of PGPR is not inolytic quit.
  • the chitinous compound is preferably an aminated organic compound or an aminated polysaccharide.
  • the present invention aims to provide a fungicidal and biological bactericidal composition, intended for the control of diseases in cultivated plants, such as bacterial cancer in carozos ⁇ Pseudomonas syringae pv. syringae); Bacterial tomato freckle (Pseudomonas syringae pv. Tomato); Bacterial spot of tomato (Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria), Bacterial blight of European Hazelnut (Xanthomonas campestris pv. Coralina) Black walnut plague ⁇ Xanthomonas juglandis); Bacterial tomato canker (Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis), Acid rot
  • composition has a wide range of disease control.
  • composition is shaped in similar proportions with bacterial strains, of the type Brevibacillus parabrevis strain No. 4; Bacillus subtilis strain No. 5; Bacillus cereus strain No. 0 6 and Bacillus cereus strain No. 7.
  • the present composition allows the control of bacterial and fungal diseases in cultivated plants, without the use of antibiotics or cupric compounds and they do not present environmental restrictions and can be used in organic production, which is not the case with fungicides that currently exist.
  • Table 1 shows a table with the incidence of acid rot in Vitis vin ⁇ fera L. cv. Syrah, in clusters treated with the composition of the invention the biocontroller (Nacillus Pro) Tl; Nacillus Pro + Chemical treatment (Switch + BC 1000) T2; Chemical treatment (Switch + BC 1000) T3; T4 witness. 2006 - 2007. Season Evaluation 04/11/07. Columns with the same letter do not differ statistically according to the Tukey test (p ⁇ 0.01). Table 1
  • Table 2 shows a table with the severity of acid rot in Vitis vin ⁇ fera L. cv. Syrah, in clusters treated with the biocontroller Nacillus Pro Tl; Nacillus Pro + Chemical treatment (Switch + BC 1000) T2; Chemical treatment (Switch + BC 1000) T3; T4 witness. 2006 - 2007. Season Evaluation 04/11/07. Columns with the same letter do not differ statistically according to the Tukey test (p ⁇ 0.01).
  • Table 3 shows the percentage of damage incidence in Abbate pear tree darts, under different Pseudomonas control operations.
  • Table 4 shows fruits per Abbate pear tree plant, under different Pseudomonas control procedures.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Table 5. shows the incidence as a percentage of damaged Abbate pear trees, under different Pseudomonas control procedures. Under the treatments Control: without applications, Chemical: applications of cupric products and antibiotics in commercial doses and Nacillus Pro treatment, at a dose of 150g / hl. Columns with the same letter do not differ statistically according to the Tukey test (p ⁇ 0.01).
  • a colony of the agar plate was taken with the sowing handle and a flask was inoculated with 200 ml of liquid CN culture medium, growing under constant agitation for 24 hrs. at 20 0 C
  • the plates with the pathogen and the BFE strains were placed at 4 0 C for two hours, after which, they were incubated at 25 0 C, observing the presence of inhibition halos up to 72 hrs. after inoculation.
  • the measurement consisted of the diameter of the inhibition halo formed by each strain, in each of the dilutions used, also being considered as an expression of inhibition on the pathogen.
  • DIAMETER OF INHIBITORY HALO AND ON GROWTH BY COMPETITION OF 4 BFE BEDS AND ITS MIXTURE, ON 6 PHYTO-PATHOGEN BACTERIA.
  • the tests were carried out independently in a plant culture chamber with an average temperature regime of 26 ° C day and 20 0 C night, with a light regime of 16 light hours and 8 hours of darkness. Every 3 days after the treatments were applied, observations were made to detect the presence of symptoms and signs, up to 40 days post inoculation.
  • control treatment consisted of inoculated plants without treatment, a treatment based on the available chemical alternative, which was also carried out with 4 applications at the aforementioned moments and with the recommended dose on its label and additionally plants were left, without inoculation and without application of treatments, to check the effectiveness of inoculation.
  • the measurements consisted of incidence (percentage of plants with presence of symptoms) and severity given by the percentage of the plant with symptoms of the disease, for Pseudomonas syringae pv. tomato, percentage of leaflets
  • vigor parameters were measured, such as height, aerial and root weight.
  • T2 Nacillus Pro 3 g / 1 4 applications.
  • T3 Chemical control, Streptoplus 4 applications 120 g / 100 1.
  • the treatment with the composition of the invention achieved a significant decrease in both the incidence and severity, differentiating itself, both from the inoculated control treatment, and from the chemical treatment, in terms of vigor parameters, Although I achieve a higher height and weights, than those of absolute control, it only differed statistically from inoculated control. Something similar was observed in the Clavibacter control trial, with an interesting effect on the severity variable, where treatment with Nacillus Pro achieved a level of severity, statistically similar to the control without inoculation. In Xanthomonas, Nacillus Pro, remains the best treatment, both for incidence and severity, with a behavior similar to that observed in Pseudomonas, in relation to vigor variables.
  • T2 Nacillus Pro 1.5 g / 1 5 applications, the first being in February, two applications in leaf stock (5 and 80%), one in the middle of winter (last week of July), one in the beginning of sprouting and the Last in full bloom.
  • T3 Chemical control: Consistent in Nordox 60g / 100 1 with 3 applications in leaf stock (5, 50 and 100%), two in winter and Streptoplus, in budding and flowering, at a dose of 60 g / 100 1.
  • the measurements consisted of measured incidence, as a percentage of budded yolks.
  • the trial was arranged in a randomized block design, consisting of four treatments, and three repetitions (three rows) of 50 plants each. 3.4.1.- Treatments
  • Tl Two application of Nacillus Pro. (3 Kg. / Ha.) Last week of January and first week of February tighten clusters and envero respectively; and a pre-harvest application third week of March.
  • T2 Switch application (1 Kg. / Ha.) Last week of January and first week of February tighten clusters and envero respectively and three pre-harvest applications of BC-1000 (20 Kg. / Ha.) Third and fourth week of March and first week of April.
  • T3 Two applications of Nacillus Pro (3 Kg. / Ha.) And Switch (1 Kg. / Ha.) Last week of January and first week of February, tighten clusters and envero respectively.
  • Table 4.2 confirms that the Nacillus Pro biocontroller not only decreases the occurrence of the disease in the vineyard, but also that the attack is weaker, since clearly the severity is lower with values of 0.43 in Tl; 0.67 in Q2; 1.23 in Q3; 1.40 in T4. Highly significant differences were observed between the proposed "Nacillus Pro" treatment and the chemical treatment used in the garden where the test was performed.
  • the Nacillus Pro product has a biocontroller effect on the agents that cause acid rot in Vitis vin ⁇ fera L. cv. Syrah
  • the use of these formulated microbial antagonists as biocontrol agents would allow the reduction in the use of chemical substances, and this would help to delay the risk
  • the present essay seeks to define the controlling action of the composition of the invention (Nacillus pro.) On flower blight in pear trees, caused by Pseudomonas syringae pv. syringae, for this two trials were conducted, in the city of Longavi.
  • T4 Biological Management: (4 Nacillus Pro).
  • Each treatment consisted of 5 repetitions, each consisting of 10 plants, in a randomized block design.
  • the percentage of damage was 8% in the control treatment, statistically differentiating, only from the treatments that included, the application of Nacillus Pro. So we have that while the chemical management, did not differ from the control, the application of Nacillus Pro , with or without antibiotics, I have a statistically lower level of damage than the control and only the treatment of Nacillus Pro, in isolation, differed from chemical management, which indicates a level of incompatibility of Nacillus Pro, with antibiotics.
  • a fungicidal and biological bactericidal composition intended for the control of diseases in cultivated plants, such as bacterial cancer in carozos (Pseudomonas syringae pv. Syringae); Bacterial tomato freckle (Pseudomonas syringae pv. Tomato); Bacterial tomato spot ⁇ Xanthomonas campestris pv. vesicatoria), Bacterial blight of the European Hazelnut (Xanthomonas campestris pv. coralina) Black walnut plague (Xanthomonas juglandis); Bacterial tomato canker (Clavibacter michiganensis subsp.
  • composition has a wide range of disease control.
  • the composition is made up of bacteria, Brevibacillus parabrevis strain No. 4; Bacillus subtilis strain No. 5; Bacillus cereus strain No. 6 and Bacillus cereus strain No. 7.
  • the composition comprises a weight ratio of the mixture of the strains from 0.01% to 30%.

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Abstract

Una composición para obtener un fungicida y bactericida biológico, sin el uso de antibióticos para el control de enfermedades en plantas, compuesta por cepas nativas, caracterizada por que dicha composición comprende cepas biocontroladores Bacillus spp y Brevibacillus parabrevis en una concentración de diez elevado a ocho esporas/gr., en una proporción de 1 : 1 : 1 : 1 para cada una de las cepas, con acción de amplio espectro sobre baterias fitopatógenas y tizón tardío.

Description

T I T U L O
Composición para obtener fungicida bactericida biológico.
MEMORIA DESCRIPTIVA
Antecedentes de la invención
La invención que se desea patentar se refiere a una composición para obtener un fungicida y bactericida biológica, para el control de enfermedades en plantas, compuesta por cepas nativas de los biocontroladores Bacillus spp y Brevibacillus parabrevis en una concentración de 108 esporas/gr., en una proporción de 1:1:1:1, con acción de amplio espectro sobre bacterias fitopatógenas y tizón tardío causado por Phytophthora infestans .
La composición de la invención, permite el control de enfermedades bacterianas y fúngicas sin el uso de antibióticos o compuestos cúpricos y por sus características no presenta restricciones ambientales y puede ser utilizado en producción orgánica.
En lo que se refiere al estado de la técnica podemos citar la patente de invención ES N° 2 307 870, la que describe una composición que comprende dos o más especies de trichoderma, naturales o genéticamente modificadas, mediante métodos radiactivos o de otra forma, cepas originales de especies y/o subespecies de Trichoderma, naturales o de laboratorio, a los que se añade un extracto hidroalcohólico total de una especie de Rubus, o algunos de sus componentes, en una mezcla con
1
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) sustancias naturales o químicas destinadas a obtener un bacteriostático bactericida y/o un conservante; siendo esa composición: a) Una composición formulada sobre la base de dos o más cepas de Trichoderma, con la adición de cualquier sustancia sintética, orgánica o inorgánica, incluyendo los conservantes y propulsores de estas sustancias, destinada a dar una característica bactericida bacteriostática, y/o cualquier sustancia fungicida en dosis menores que las necesarias para destruir el cultivo de Trichoderma, o sustancias fungicidas a las que las especies de Trichoderma seleccionadas se vuelven inmunes, pero suficientemente fuertes para dar a dicha preparación un carácter fungicida, así como la incorporación de sustancias de cualquier origen y naturaleza, y/o instigadores de la acción bactericida bacteriostática (incluyendo penicilina como extracto impuro del hongo propulsor y/o de origen comercial, macrólidos, neomacrólidos , ciclosporina , y cualquier otra familia terapéutica de bactericida bacteriostático fungicida. b. Una composición formulada sobre la base de dos o más especies vivas y activas de Trichoderma que debido a su carácter antagonista deben tener una presentación comercial separada, pero deben mezclarse en el momento en el que van a usarse de forma inmediata o en un plazo no mayor de 45 días después de la aplicación de la primera especie, todo esto con el objetivo de alcanzar un espectro de acción más amplio que el dado por cualquier especie y de cualquier origen posible en cualquier fase de crecimiento vegetativo, que podrían o no contener agentes que les dan las propiedades añadidas como bactericida bacteriostático.
Además, se refiere a una formulación de bactericida bacteriostático fungicida de amplio espectro con acción sobre hongos y/o bacterias que son
2 HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) responsables de enfermedades fúngicas y/o bacteriosis en seres humanos y/o animales, así como sobre bacteriosis y/u hongos que pueden infectar alimentos, evitando de ese modo su crecimiento, y/o en fase curativa sobre bacterias y/u hongos ya instalados, usada en fase preventiva y/o curativa, que consiste en una presentación comercial para repostería que permite introducir una o más cepas vivas de Trichoderma y/o un extracto de ellas, que tienen lactonas como principio activo en una concentración suficiente para permitir la inhibición del crecimiento fúngico (como ejemplo, penicillium y otros) sobre pan en particular y sobre masa en general, una vez cocinados, prolongando así su vida útil.
Otra patente de invención es la ES N° 2 246 834 y se refiere ampliamente al campo del crecimiento y el desarrollo de plantas, particularmente a procedimientos y composiciones para mejorar el crecimiento y la resistencia a enfermedades de plantas. La invención se refiere a la iniciación y la promoción del crecimiento de la planta usando una combinación de estrategias múltiples de control biológico en el suelo o en un medio de crecimiento de plantas sin suelo para controlar los nematodos y los patógenos foliares.
La invención también se refiere a una nueva composición de un medio de crecimiento de plantas que comprende quitina y rizobacterias no quitinolíticas promotoras del crecimiento de plantas (PGPR) que crean una sinergia en el crecimiento y la resistencia a enfermedades en la planta. Adicionalmente , la invención se refiere a un nuevo procedimiento sinérgico de uso de bien un tratamiento de la semilla o bien la aplicación de una composición de un medio de plantación sin suelo de un elemento quitinoso y de elementos bacterianos para la preparación y el desarrollo de plantas y transplantes.
Además se proporciona una composición que comprende al menos dos cepas de bacterias PGPR y un
3
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) compuesto quitinoso elegido entre quitina, quitina en copos, quitosana y precursores de los mismos, en un intervalo del 0,1% al 10,0% o un compuesto con un efecto equivalente. Las ri zobacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPR) comprenden al menos una cepa bacteriana que pueda inducir una resistencia sistémica en la planta ante enfermedades vegetales. La composición comprende además un quitinoso: un compuesto que puede tener una actividad de control sobre los nematodos . En una forma de realización preferible, al menos una de las cepas bacterianas de las PGPR no es quit inolitica . El compuesto quitinoso es preferiblemente un compuesto orgánico aminado o bien un polisacárido aminado.
La presente invención tiene como objetivo proporcionar una composición fungicida y bactericida biológico, destinada al control de enfermedades en plantas cultivadas, como cáncer bacterial en carozos {Pseudomonas syringae pv. syringae) ; Peca bacteriana del tomate (Pseudomonas syringae pv. tomato) ; Mancha bacteriana del tomate (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) , Tizón bacteriano del Avellano Europeo (Xanthomonas campestris pv. coralina) Peste negra del nogal {Xanthomonas juglandis) ; Cancro bacteriano del tomate (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) , Pudrición acida
{Acetobacter sp) ; Pudrición acuosa (Erwinia carotovora) y Tizón tardio (Phytophtora infestans) , pero la composición posee un rango amplio de control de enfermedades.
La composición está conformada en proporciones similares con cepas bacterianas, del tipo Brevibacillus parabrevis cepa N° 4; Bacillus subtilis cepa N° 5; Bacillus cereus cepa N0 6 y Bacillus cereus cepa N° 7.
La presente composición permite el control de enfermedades bacterianas y fúngicas en plantas cultivadas, sin el uso de antibióticos o compuestos cúpricos y no presentan restricciones ambientales y pueden ser utilizados en la producción orgánica, lo que no ocurre con los fungicidas existentes en la actualidad.
4
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Descripción de los cuadros
Para demostrar los resultados e incidencia obtenidos con el uso o aplicación en plantas cultivadas con la composición obtenida con las cepas bacterianas antes mencionadas, lo haremos en parte a los dibujos que forman parte integral de la invención, en donde:
El cuadro 1. muestra un cuadro con la incidencia de pudrición acida en Vitis vinífera L. cv. Syrah, en racimos tratados con la composición de la invención el biocontrolador (Nacillus Pro) Tl; Nacillus Pro + Tratamiento químico (Switch + BC 1000) T2; Tratamiento químico (Switch + BC 1000) T3; Testigo T4. Temporada 2006 - 2007. Evaluación 11/04/07. Columnas con igual letra no difieren estadísticamente según el test de Tukey (p< 0.01) . Cuadro 1
Figure imgf000006_0001
El cuadro 2. muestra un cuadro con la severidad de pudrición acida en Vitis vinífera L. cv. Syrah, en racimos tratados con el biocontrolador Nacillus Pro Tl; Nacillus Pro + Tratamiento químico (Switch + BC 1000) T2; Tratamiento químico (Switch + BC 1000) T3; Testigo T4. Temporada 2006 - 2007. Evaluación 11/04/07. Columnas con igual letra no difieren estadísticamente según el test de Tukey (p< 0.01).
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
Figure imgf000007_0001
El cuadro 3. muestra el Porcentaje de incidencia de daño en dardos de peral Abbate, bajo distintos manejos decontrol de Pseudomonas.
Figure imgf000007_0002
El cuadro 4. muestra frutos por planta de peral Abbate, bajo distintos manejos de control de Pseudomonas.
Figure imgf000007_0003
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) El cuadro 5. muestra la incidencia como porcentaje de árboles de peral Abbate dañados, bajo distintos manejos de control de Pseudomonas. Bajo los tratamientos Control: sin aplicaciones, Químico: aplicaciones de productos cúpricos y antibióticos en dosis comercial y tratamiento Nacillus Pro, a una dosis de 150g/hl. Columnas con igual letra no difieren estadísticamente según el test de Tukey (p< 0.01) .
Figure imgf000008_0001
DETERMINACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES MÍNIMAS INHIBITORIAS (CMI) DE LAS CEPAS CON CAPACIDAD INHIBITORIA
-. Para cada cepa de las BFE (Bacteria Formadora de endosporas, correspondientes a las cepas biocontroladoras) se inoculó un tubo con 6 mi de caldo nutritivo (CN) con una colonia obtenida desde un cultivo puro, dejándose crecer en agitación constante por 24 hrs . a 20 0C.
-. Para las bacterias fitopatógenas, se tomó con el asa de siembra una colonia de la placa de agar y se inoculó un matraz con 200 mi de medio de cultivo CN liquido, dejándose crecer en agitación constante por 24 hrs. a 20 0C
-. Sobre placas Petri con 30 mi de agar nutriente, se agregó un mi del cultivo de la bacteria patógena, la que fue esparcida homogéneamente sobre la placa. Después de 30 minutos se retiró el sobrante.
Una vez retirado el sobrante del patógeno, se procedió a realizar orificios en el agar con un sacabocado de 0,5 cm., en un número de 9 por placa Petrí . En cada uno de
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) éstos, se agregaron 50 μl del cultivo de las cepas de los biocontroladores a las siguientes concentración l*10P8p, l*10P7p, l*10P6p, l*10P5P, l*10P4p, l*10P3 py l*10P2p UFC/ml.
-. Las placas con el patógeno y las cepas de BFE., fueron puestas a 4 0C por dos horas, luego de lo cual, se pusieron a incubar a 25 0C, observándose la presencia de halos de inhibición hasta 72 hrs . después de la inoculación.
Para cada combinación bacteria patógena / cepa de BFE, se utilizaron tres repeticiones, incluyendo además placas control con solo la bacteria patógena y la cepa de Bs. De esta forma fueron seleccionadas aquellas cepas de BFE, que produjeron un halo de inhibición significativo alrededor del orificio donde fueron sembradas y cuya presencia fue consistente en las repeticiones realizadas.
La medición consistió en el diámetro del halo de inhibición formado por cada cepa, en cada una de las diluciones utilizadas, considerándose además como expresión de inhibición sobre el patógeno.
Los resultados se muestran en el cuadro 1, indicando las concentraciones minimas, a las que cada una de las cepas, muestra actividad inhibitoria, sobre los distintos patógenos. Siendo interesante notar, que las cepas mostraron concentraciones mínimas, similares para patógenos, del mismo genero, no existiendo diferencias, en la capacidad de control sobre patovares distintos e incluso especies distintas.
8
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) CUADRO N° 1
CONCENTRACIONES MÍNIMAS INHIBITORIAS (UFC/ML) , ALCANZADAS POR 4 CEPAS DE BFE SOBRE CUATRO BACTERIAS
FITOPATÓGENAS .
Figure imgf000010_0001
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) DETERMINACIÓN DE LA COMPATIBILIDAD ENTRE CEPAS NATIVAS DE BFE
PARA EL CONTROL DE ENFERMEDADES.
Utilizando la misma metodología que en el ensayo 1, se evalúo todas las mezclas de las 4 cepas de BFE por patógeno y fueron comparadas en su inhibición con las cepas individuales .
CUADRO N° 2
DIÁMETRO DE HALO INHIBITORIO, DE 4 CEPAS DE BFE Y SU MEZCLA, SOBRE 6 BACTERIAS FITOPATÓGENAS .
Figure imgf000011_0001
10
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD DE CONTROL DE LAS CEPAS DE BFE, EN BASE A COMPETENCIA.
En placas Petri con agar nutriente, se realizo la siembra del patógeno en estudio, en forma de lineas paralelas, las que eran de 5,5 cm. de longitud, en un numero de cuatro por placa. En forma perpendicular y en uno de los extremos de estas lineas, se realizo la siembra da las cepas de BFE también en forma de linea, luego de lo cual las placas fueron puestas a incubación a 26° C por 7 dias, luego de lo cual se procedió a medir tanto la inhibición del patógeno, como el nivel de crecimiento que las cepas de BFE , eran capaces de realizar sobre el patógeno, lo que se evaluó en forma del porcentaje de la linea de patógeno cubierta o inhibida por la cepa de BFE , para luego estos datos ser sometidos a un análisis de varianza y a ser significativo a una test de separación de medias. Se utilizaron 12 epeticiones por tratamiento.
11
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) CUADRO 3
DIÁMETRO DE HALO INHIBITORIO, Y SOBRE CRECIMIENTO POR COMPETENCIA DE 4 CEPAS DE BFE Y SU MEZCLA, SOBRE 6 BACTERIAS FITOPATÓGENAS .
Figure imgf000013_0001
12
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) EVALUACIÓN IN VIVO DE LA CAPACIDAD BIOCONTROLADORA CON LA COMPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN (NACILLUS PRO.) EN EL CONTROL DE ENFERMEDADES BACTERIANAS EN TOMATE
En bolsas de 400 mi de capacidad, conteniendo sustrato de perlita, tierra de hoja y arena (1:2:1), fueron transplantadas plantas de tomate var. María Italia con dos hojas verdaderas. Un mes después del transplante, un grupo de plantas fue inoculada con Clavibacter michiganense subsp. michiganense, otro con Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, y el tercero con Pseudomonas syringae pv. tomato, a una dosis de 60 ml/planta con una concentración de 10P6P bacterias/ml .
Cada grupo de plantas fue sometido a una inoculación manual. Los tratamientos fueron realizados con 2 aplicaciones previo a inoculación, en almacigo y luego en transplante y dos a los 5 y 10 días después de realizada la inoculación.
Los ensayos se realizaron en forma independiente en una cámara de cultivo de plantas con un régimen de temperaturas medias de 26°C día y 200C noche, con un régimen de luz de 16 horas luz y 8 horas de oscuridad. Cada 3 días después de aplicados los tratamientos, se realizaron observaciones para detectar la presencia de síntomas y signos, hasta los 40 días post inoculación.
El tratamiento control, consistió en plantas inoculadas sin tratamiento, un tratamiento en base a la alternativa química disponible, el que se realizo también con 4 aplicaciones en los momentos ya mencionados y con la dosis recomendada en su etiqueta y adicionalmente se dejaron plantas, sin inoculación y sin aplicación de los tratamientos, para comprobar la eficacia de la inoculación.
Las mediciones, consistieron en incidencia (porcentaje de plantas con presencia de síntomas) y severidad dadas por el porcentaje de la planta con síntomas de la enfermedad, para Pseudomonas syringae pv. tomato, porcentaje de folíolos
13
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) marchitos para Clavibacter michiganensis Subs .. michiganensis y porcentaje de área foliar con mancha bacteriana, para el caso de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria .
Adicionalmente se midieron parámetros de vigor, como altura, peso aéreo y de raices.
Los tratamientos para estos ensayos fueron dispuestos en un diseño completamente al azar, con 5 replicas de 10 plantas cada una por tratamiento.
TO: control Absoluto
Tl: Control con Inoculación
T2: Nacillus Pro 3 g/1 4 aplicaciones.
T3: control Químico, Streptoplus 4 aplicaciones 120 g/100 1.
RESULTADOS
Para el caso de P. syringae pv. tomato, el tratamiento con la composición de la invenció (Nacillus Pro) , logro una disminución significativa tanto de la incidencia, como de la severidad, diferenciándose, tanto del tratamiento control inoculado, como del tratamiento químico, en cuanto a los parámetros de vigor, pese a que logro una altura y pesos mayores, a los del control absoluto, solo se diferencio estadísticamente, del control inoculado. Algo similar se observo en el ensayo de control de Clavibacter, con un efecto interesante sobre la variable severidad, donde el tratamiento con Nacillus Pro, logro un nivel de severidad, estadísticamente similar al del control sin inoculación. En Xanthomonas, Nacillus Pro, sigue siendo el mejor tratamiento, tanto para incidencia como severidad, con un comportamiento similar al observado en Pseudomonas, en relación a las variables de vigor.
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HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) CUADRO 4
EFECTO DE NACILLUS PRO, SOBRE INCIDENCIA, SEVERIDAD Y PARÁMETROS DE VIGOR DE PLANTAS DE TOMATE, INOCULADAS ARTIFICIALMENTE CON P. SYRINGAE PV. TOMATO.
Figure imgf000016_0001
CUADRO N° 5
EFECTO DE NACILLUS PRO, SOBRE INCIDENCIA, SEVERIDAD Y PARÁMETROS DE VIGOR DE PLANTAS DE TOMATE, INOCULADAS ARTIFICIALMENTE CON C. MICHIGANENSIS SUBS.. MICHIGANENSIS.
Figure imgf000016_0002
15
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
Figure imgf000017_0001
CUADRO N° 6
EFECTO DE NACILLUS PRO, SOBRE INCIDENCIA, SEVERIDAD Y PARÁMETROS DE VIGOR DE PLANTAS DE TOMATE, INOCULADAS ARTIFICIALMENTE CON X. CAMPESTRES PV. VESICATORIA.
Figure imgf000017_0002
EVALUACIÓN IN VIVO DE LA CAPACIDAD BIOCONTROLADORA NACILLUS PRO. EN EL CONTROL DE ENFERMEDADES BACTERIANAS EN CEREZOS Y PERAL.
En bolsas de 4 litros de capacidad, conteniendo sustrato de perlita, tierra de hoja y arena (1:2:1), fueron transplantadas plantas de cerezo, variedad Bin y peral var. Abbate de un año de edad. Un mes después del transplante, un grupo de plantas fueron inoculadas con Pseudomonas syringae pv. syringae, a una dosis de 60 ml/planta con una concentración de 10P6P bacterias/ml . Asperjado previo a la caída de hojas. Los tratamientos consistieron en TO: control Absoluto sin inoculación y sin aplicaciones
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HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Tl: Control con Inoculación
T2: Nacillus Pro 1,5 g/1 5 aplicaciones, siendo la primera en febrero, dos aplicaciones en calda de hojas (5 y 80%) , una en pleno invierno (ultima semana de julio) , una en inicio de brotación y la ultima en plena flor.
T3: control Químico: Consistente en Nordox 60g/100 1 con 3 aplicaciones en calda de hojas (5, 50 y 100%), dos en pleno invierno y Streptoplus, en brotación y floración, a una dosis de 60 g/100 1.
Los ensayos se realizaron en la parcela experimental de Bio Insumos Nativa Ltda.
Las mediciones, consistieron en incidencia medida, como porcentaje de yemas atizonadas.
Los tratamientos para este ensayo fuero dispuestos en un diseño completamente al azar, con 5 replicas de 10 plantas cada una por tratamiento.
RESULTADOS .
En ambos frutales, el tratamiento con Nacillus Pro, logro disminuir en forma significativa la incidencia, de yemas atizonadas por el patógeno. Superando incluso al control químico estándar.
CUADRO N° 7
EFECTO DE NACILLUS PRO, SOBRE INCIDENCIA Y SEVERIDAD EN PLANTAS DE CEREZO Y PERALES INOCULADAS ARTIFICIALMENTE CON
P. SYRINGAE PV. SYRINGAE.
Figure imgf000018_0001
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HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
Figure imgf000019_0001
ENSAYO PUDRÍCION ACIDA 3.1.1 Ubicación del ensayo
Este ensayo se sitúo en la localidad de Santa Cruz perteneciente a la provincia de Colchagua, VI región Chile, en el predio San Francisco de propiedad de la empresa Viña MontGras . Su localización geográfica es 34° 33' 18.48'' Sur y 71° 23' 55.98" Oeste; altitud 153 metros. 3.2- Material Vegetal
La investigación se realizó durante la temporada agrícola 2006/2007, usando como material vegetal uva vinifera de la variedad Syrah. Esta fue plantada en el año 1997 estando formada en Lyra, distancia entre hilera 2.2 m. y distancia sobre hilera 2.0 m. Presenta un sistema de riego por goteo. 3.4.- Diseño Experimental
El ensayo estuvo dispuesto en un diseño de bloques al azar, constituido de cuatro tratamientos, y tres repeticiones (tres hileras) de 50 plantas cada uno. 3.4.1.- Tratamientos
Cuadro N° 8
Tratamientos evaluados en el control de pudrición acida en uva vinifera cv. Syrah temporada 2006/2007.
Figure imgf000019_0002
18
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
Figure imgf000020_0001
Tl: Dos aplicación de Nacillus Pro . (3 Kg. / ha.) última semana de Enero y primera semana de Febrero apriete de racimos y envero respectivamente; y una aplicación de precosecha tercera semana de Marzo.
T2 : Aplicación de Switch (1 Kg. / ha.) última semana de Enero y primera semana de Febrero apriete de racimos y envero respectivamente y tres aplicaciones de precosecha de BC- 1000 (20 Kg. / ha.) tercera y cuarta semana de Marzo y primera semana de Abril.
T3: Dos aplicación de Nacillus Pro (3 Kg. / ha.) y Switch (1 Kg. / ha.) última semana de Enero y primera semana de Febrero apriete de racimos y envero respectivamente. Una aplicación de precosecha de Nacillus Pro ®. (3 Kg. / ha.), tercera semana de Marzo y tres aplicaciones de precosecha de BC 1000 (20 Kg. / ha.) tercera y cuarta semana de Marzo y primera semana de Abril .
T4: Testigo. Sin aplicaciones.
3.5.- Recolección y análisis de muestras
La medición se realizó cinco dias antes de cosecha, se procedió a cosechar 50 plantas por repetición. Se midió incidencia, como porcentaje de frutos afectados, del total de frutos de cada repetición y severidad medida de acuerdo a una escala según, el número de bayas infectadas por racimo.
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HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) CUADRO 9
ESCALA UTILIZADA PARA MEDIR SEVERIDAD DE PUDRICIÓN ACIDA EN UVA VINÍFERA CV. SYRAH TEMPORADA 2006/2007.
Figure imgf000021_0001
4.1. -EVALUACION DE LA INCIDENCIA DE PUDRICIÓN ACIDA EN DIFERENTES TRATAMIENTOS APLICADOS EN EL HUERTO.
A partir de los resultados obtenidos en este ensayo fue posible determinar con que nivel de incidencia está presente la enfermedad, en el huerto pudiendo luego definir claramente cual tratamiento es el que actúa de mejor forma.
En base a los datos obtenidos en el ANDEVA, que arrojaron diferencias altamente significativas, se procedió a realizar la separación de medias, a través del método de Tukey (HSD) . En base a esto se determinó que los mejores tratamientos fueron Nacillus Pro y Nacillus Pro asociado a control quimico demostrando que la acción biocontroladora de esta bacteria es eficaz con porcentajes de incidencia 28.6% y 34.0% respectivamente. El tratamiento químico (tratamiento del huerto) por sí sólo no fue efectivo en la prevención y control de pudrición acida, debido a que, su porcentaje de incidencia fue 56.6%, mientras que el testigo fue de 70.6% siendo ambos estadísticamente similares.
20
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 4.2. -EVALUACION DE LA SEVERIDAD DE PUDRICIÓN ACIDA EN LOS DIFERENTES TRATAMIENTOS APLICADOS EN EL HUERTO.
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000022_0002
El cuadro 4.2 confirma que el biocontrolador Nacillus Pro no sólo disminuye la aparición de la enfermedad en el viñedo, sino que además, el ataque es más débil, ya que claramente la severidad es inferior con valores de 0.43 en el Tl; 0.67 en el T2; 1.23 en el T3; 1.40 en el T4. Se observó diferencias altamente significativas entre el tratamiento propuesto "Nacillus Pro " y el tratamiento químico utilizado en el huerto donde se realizó el ensayo.
De acuerdo a lo anterior, el producto Nacillus Pro, tiene un efecto biocontrolador sobre los agentes causantes de la pudrición acida en Vitis vinífera L. cv. Syrah. De esta forma el uso de estos formulados antagonistas microbianos como agentes biocontroladores, permitiría la reducción en el uso de sustancias químicas, y con esto se ayudaría a retardar el riesgo
21
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) de desarrollo de cepas resistentes de los patógenos en el campo
(Gullino et al, 1995) . Esta es una de las principales ventajas del control biológico de patógenos vegetales, que ha llevado al actual interés por parte de los científicos, en busca de nuevas alternativas en cuanto a microorganismos antagonistas.
ENSAYOS CONTROL DE PSEUDOMONAS SYRINGAE PV. SYRINGAE EN PERALES.
El presente ensayo busco, definir la acción controladora de la composición de la invención (Nacillus pro.) sobre tizón de flor en perales, causado por Pseudomonas syringae pv. syringae, para esto se realizaron dos ensayos, en la ciudad de Longavi .
METODOLOGÍA
Huerto de var. Abbate Fettel, con alta incidencia y severidad en temporadas anteriores.
Tratamientos :
• Tl: Control sin aplicaciones.
• T2 : Manejo del huerto (3 Streptoplus + 3 Citocur)
• T3: Manejo combinado (3 Streptoplus + 3 Nacillus)
• T4: Manejo Biológico: (4 Nacillus Pro) .
• Aplicaciones en 10, 25, 50 y 100% de floración. Dosis
• Estreptomicina 60 g/100 1 de P. C.
• Sulfato de cobre: 1.5 Kg./ 10001t agua/ ha.
• Nacillus Pro: 2.4 Kg/1200 It agua/ha.
Cada tratamiento consto de 5 repeticiones, cada una compuesta por 10 plantas, en un diseño de bloques al azar.
22 HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) RESULTADOS
Plantas con presencia de síntomas, como se ve en la figura 5, todos, los tratamientos, se diferenciaron del tratamiento control, siendo los tratamientos con la presencia con la composición de la invención Nacillus Pro, los que presentaron el menor nivel de daño. Siendo el tratamiento con solo Nacillus Pro, el que presento el menor porcentaje de árboles afectados, diferenciándose estadísticamente del manejo netamente químico.
El porcentaje de daño, fue de un 8% en el tratamiento control, diferenciándose estadísticamente, solo de los tratamientos que incluían, la aplicación de Nacillus Pro. Asi tenemos que mientras el manejo químico, no se diferencio del control, la aplicación de Nacillus Pro, con o sin antibióticos, presento un nivel de daño, estadísticamente inferior que el control y solo el tratamiento de Nacillus Pro, en forma aislada, se diferencio del manejo químico, lo que nos indica un nivel de incompatibilidad de Nacillus Pro, con antibióticos.
En cuanto al porcentaje de cuaja y frutos por árbol, los únicos tratamientos que se diferenciaron, del control, fueron los que incluyeron el producto Nacillus Pro, siendo el tratamiento con solo Nacillus Pro , superior al manejo químico ver figuras 3 y 4.
23 HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Descripción de la invención
Una composición fungicida y bactericida biológico, destinada al control de enfermedades en plantas cultivadas, como cáncer bacterial en carozos (Pseudomonas syringae pv. syringae) ; Peca bacteriana del tomate (Pseudomonas syringae pv. tomato) ; Mancha bacteriana del tomate {Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) , Tizón bacteriano del Avellano Europeo (Xanthomonas campestris pv. coralina) Peste negra del nogal (Xanthomonas juglandis) ; Cancro bacteriano del tomate (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) , Pudrición acida (Acetobacter sp) ; Pudrición acuosa (Erwinia carotovora) y Tizón tardio (Phytophtora infestans) , pero la composición posee un rango amplio de control de enfermedades. La composición está conformada con bacterias, Brevibacillus parabrevis cepa N° 4; Bacillus subtilis cepa N° 5; Bacillus cereus cepa N° 6 y Bacillus cereus cepa N° 7.
La composición comprende una relación en peso de la mezcla de las cepas de 0,01% al 30%.
Ejemplos de Realización.
Ejemplo 1.-
De 0,25% a 25% de Bacterias, Brevibacillus parabrevis cepa N° 4; de 0,25% a 25% p/p de Bacillus subtilis cepa N° 5; de 0,25% a 25% p/p Bacillus cereus cepa N° 6 y de 0,25% a 25% p/p Bacillus cereus cepa N° 7.
24
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Una composición para obtener un fungicida y bactericida biológico, sin el uso de antibióticos, para el control de enfermedades en plantas, compuesta por cepas nativas, CARACTERIZADA porque dicha composición comprende cepas biocontroladores Bacillus spp y Breviba cill us parabrevis en una concentración de 108 esporas/gr. , en una proporción de 1:1:1:1, para cada una de las cepas . , con acción de amplio espectro sobre bacterias fitopatógenas y tizón tardío.
2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADA porque la composición comprende la mezcla de cepas, Brevibacillus parabrevis cepa N° 4; Bacillus subtilis cepa N° 5; Bacillus cereus cepa N° 6 y Bacillus cereus cepa N° 7, cuyo acarreador es zeolita, cualquiera de los miembros de este grupo de minerales.
3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADA porque la relación en peso de las cepas es de 0,01% a 30%.
25 HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
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