CN101914469A - 一种外生菌根辅助细菌蜡状芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株外生菌根辅助细菌蜡状芽孢杆菌HB12，其分类命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号是CCTCC NO：M 209025，保藏日期：2009年2月18日。本发明的蜡状芽孢杆菌HB12为植物根际促生细菌，对黑树生长具有促进作用，能够促进外生菌根真菌美味牛肝菌的生长，其与美味牛肝菌双接种对黑松的促生效果优于两者单接种处理；蜡状芽孢杆菌HB12对松树苗木猝倒病病原丝核菌具有抑制作用；温室防治试验表明，蜡状芽孢杆菌HB12菌株能有效防治松树苗木猝倒病。
Description
技术领域
本发明属于微生物肥料领域，尤其涉及一种外生菌根辅助细菌蜡状芽孢杆菌及其在促进黑松生长和防治松苗猝倒病中的应用。
背景技术
植物根际促生细菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是对根际微生物区系中能够促进植物生长、防治病害、增加作物产量的细菌的统称。自从1978年Burr等人首先在马铃薯上报导PGPR以来，国内外已发现20多个种属PGPR。其中，假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、农杆菌属(Agrobacterium)、埃文氏菌属(Eriwinia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、巴斯德氏菌属(Pasteuria)、沙雷氏菌(Serratia)、肠杆菌(Enterobacter)等的作用最为突出。植物根际促生细菌和外生菌根真菌(Ectomycorrhizal Fungi，EMF)作为植物根圈微生物的重要组成类群，对植物的营养吸收、生长发育及土壤结构发挥着重要的作用。国内外已有大量的研究表明，菌根真菌与PGPR混合接种对宿主植物的生长和营养吸收具有积极意义(Linderman，1996；Jezabel et al，2004；王新荣等，1998)。
菌根辅助细菌(Mycorrhizal Helper Bacteria，MHB)作为一类的特殊的PGPR，与菌根真菌的作用关系十分密切，是菌根学研究的热点之一。MHB的概念是1994年由法国学者Garbaye提出的，具体是指可与菌根联结并对菌根的形成具有选择性促进作用的细菌。大量研究表明，MHB与菌根真菌双接种可显著促进菌根真菌孢子萌发和菌丝生长、提高菌根侵染率等，从而促进植物生长(Garbaye et al，1992；Duponnois et al，2003)。国外关于MHB与菌根真菌互作关系的研究已有几十年的历史，筛选出了大量的MHB，并对某些优良的MHB开展了比较深入的研究，但到目前为止，在我国还未见有关MHB的筛选研究以及MHB与菌根真菌互作的相关报道。
黑松(Pinus thunbergii)是我国南方人工林中最主要的造林树种之一，广泛应用于荒山造林、沿海防护林带的建设，且具有极强的观赏价值。黑松是典型的外生菌根树种，主要生长在沿海土壤瘠薄的立地上，其生长对外生菌根真菌(EMF)的依赖性很强，菌根技术的应用可以提高其在土壤贫瘠地区的生产力；而菌根辅助细菌(MHB)能通过促进菌根菌生长，从而达到更好的促进林木生长的目的。因此，研究MHB及其与菌根真菌互作对黑松的促生效果具有重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种促进黑松生长和外生菌根真菌生长的蜡状芽孢杆菌。
本发明还要解决的一个技术问题是提供上述外生菌根辅助细菌蜡状芽孢杆菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
外生菌根辅助细菌蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HB12，是一种从美味牛肝菌(Boletus edulis，Be)-黑松(Pinus thunbergii)菌根根际土壤中筛选获得的对黑松和美味牛肝菌(Be)生长具有促进作用的MHB菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M 209025，保藏日期：2009年2月18日。
CCTCC NO：M 209025菌株的菌学特性如下：
在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落圆形、较大，乳白色、边缘锯齿型、表面光滑、平铺和粘稠，菌体链杆状；革兰氏染色为阳性、3％KOH试验阴性；芽孢中生比菌体小。通过BIOLOG系统对HB12进行鉴定，该菌株在鉴定板培养16～24h时的读数相似值(SIM值)为0.629，大于0.50，符合BIOLOG系统关于理想结果的要求，与数据库比对结果的相似性(PROB)都为99％。利用该系统鉴定到了种，为蜡状芽孢杆菌/苏云金杆菌(Bacillus cereus/thuringiensis)。通过伴孢晶体染色试验，HB12菌株无伴孢晶体，因此，HB12菌株属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
测得16SrDNA大部分序列1409bp，具体如SEQ ID No：1所示。16SrDNA序列通过BLAST比对，在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与HB12菌株相似性最高的是蜡状芽孢杆菌，同源性达到100％。从进化树可以看出，HB12与蜡状芽孢杆菌的亲缘关系较近，这与BIOLOG鉴定及BLAST的比对结果相符。
CCTCC NO：M 209025菌株对黑松具有促生长的作用。
CCTCC NO：M 209025菌株对松树苗木猝倒病病原丝核菌(Rhizoctonia sp.)具有抑菌作用；温室防治试验表明，该菌株能有效防治松苗猝倒病。
并且上述CCTCC NO：M 209025菌株对美味牛肝菌(Be)具有促生作用，且其与美味牛肝菌(Be)互作对黑松的促生长作用显著高于各接种处理，表现出正交互作用。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
(1)外生菌根辅助细菌蜡状芽孢杆菌HB12为植物根际促生细菌，对黑树的生长具有促进作用，能够促进外生菌根真菌美味牛肝菌(Be)的生长，其与美味牛肝菌双接种对黑松的促生效果优于两者单接种处理。
(2)外生菌根辅助细菌蜡状芽孢杆菌HB12对松树苗木猝倒病病原丝核菌具抑制作用；温室防治试验表明，蜡状芽孢杆菌HB12菌株能有效防治松树苗木猝倒病。
附图说明
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)HB12，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；地址：武汉 武汉大学；邮编：430072；保藏号M 209025；保藏日期：2009年2月18日。
图1蜡状芽孢杆菌HB12菌体对美味牛肝菌(Be)菌丝生长的影响(×17)；
图2蜡状芽孢杆菌HB12菌株胞外代谢产物对美味牛肝菌(Be)菌丝生长的影响；
图3蜡状芽孢杆菌HB12与美味牛肝菌(Be)双接种对黑松的促生长作用；
图4蜡状芽孢杆菌HB12与苗木猝倒病病原丝核菌对峙培养结果。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：蜡状芽孢杆菌HB12对美味牛肝菌(Be)的促生作用
将待测细菌活化后，用接种环取少量接种于装有50mL TSA液体培养基的100mL三角瓶中，28℃，160r/min振荡培养72h。将菌悬液倒入灭菌的离心管中，4℃，5000r/min离心5min，倒去上清液，再用生理盐水润洗菌体两次，最后根据离心管内菌体的数量适量加入生理盐水，混匀后即为HB12菌株的菌体悬浊液(约含5×108cfu/mL)。同时，用无菌注射器吸取上清液，细菌过滤器(滤膜孔径为0.22μm，直径为0.25mm)过滤后即为HB12菌株的无菌滤液。
(1)蜡状芽孢杆菌HB12菌体悬液对美味牛肝菌(Be)的促生测定
采用干皿对抗法进行试验。将Be菌根真菌培养于ZPD培养基，在其生长最旺盛期间，用直径为7mm的打孔器在培养皿边缘打孔，取厚度(约5mm)基本一致的菌块作为材料。将菌根真菌菌块倒置放入灭菌的空培养皿中，每皿接种三块，三角状放置，再用无菌移液器吸取25μL HB12菌株菌体悬浊液，滴加于各个真菌菌块上，每个细菌菌株设六个重复，以滴加生理盐水的作为对照，置于25℃培养箱中培养。每隔6天添加25μl10mM的葡萄糖溶液，以防止菌块干燥。待菌块生长12～16d后，借助于装有测微尺的体式显微镜观测各个菌块的菌丝生长情况(表1；图1)，计算HB12菌株对菌根菌丝的平均促生长量。试验结果表明，HB12菌株对Be菌丝的生长具有促进作用，与对照相比增长了40.19％。
表1蜡状芽孢杆菌HB12菌株对美味牛肝菌(Be)菌丝生长的影响
注：不同小写字母表示在0.05水平上差异显著，下同。
(2)蜡状芽孢杆菌HB12胞外代谢产物对美味牛肝菌(Be)菌落生长的影响
将1mL无菌滤液与45℃，20mL ZPD固体培养基混合倒平板，以无菌水处理作为对照。将菌根真菌菌块接种于培养皿中央，每处理三个重复，置于25℃恒温培养。培养12～15d后观测其菌落半径(表2；图2)。试验结果表明，HB12菌株的胞外代谢产物对Be菌落的生长具有促进作用。在100μL、500μL、1000μL三个滤液体积的梯度中，以500μL的用量效果最佳，HB12在500μL用量时，Be菌落直径比对照增长了17.41％。
表2蜡状芽孢杆菌HB12菌株胞外代谢产物对美味牛肝菌(Be)菌落生长的影响
(3)蜡状芽孢杆菌HB12菌株胞外代谢产物对美味牛肝菌(Be)生物量的影响。
通过将HB12菌株胞外代谢产物与美味牛肝菌(Be)共培养，称量菌丝干重的方法来研究胞外代谢产物对菌根菌丝生长量的影响。具体方法如下：将菌根真菌培养一段时间后，用灭菌的打孔器打下菌饼(d＝7mm，￠＝5mm)，每50mLZPD液体培养基中加入菌饼3块，同时加入1mLHB12菌株胞外代谢产物，25℃，160r/min共同振荡培养12～15d，定性滤纸过滤，再置于60℃烘箱中烘至恒重，然后用电子天平进行称量。以TSA培养液为对照，每处理各3次重复。试验结果表明，HB12菌株的代谢产物能促进Be菌丝的生长量，与对照相比，菌丝生物量增长了28.8％。
表3蜡状芽孢杆菌HB12菌株胞外代谢产物对Be菌丝生物量的影响
实施例2：蜡状芽孢杆菌HB12与美味牛肝菌(Be)互作对黑松的促生作用。
芽苗的培育：黑松种子经60℃温水浸泡24h用以催芽，以0.5％高锰酸钾溶液浸泡，2h进行表面消毒，再用自来水冲洗1h后，播种于灭菌沙子中，置于25℃温室中培养，待其长到子叶期时进行芽苗截根移苗。
盆栽基质：基质土壤采自南京林业大学校园后山，土样过筛后经1.01×106Pa灭菌，90min，冷却后备用。
蜡状芽孢杆菌HB12菌体悬浊液的制备：将供试细菌活化后，用接种环取少量接种于装有50mL TSA液体培养基的100mL三角瓶中，28℃，160r/min振荡培养72h。将菌悬液倒入灭菌的离心管中，4℃，5000r/min离心5min，倒去上清液，润洗菌体两次，最后获得菌体悬浊液，并将各菌株接种液浓度调至5×108cfu/ml左右。
美味牛肝菌(Be)固体菌剂的制备：利用ZPD培养基平板培养Be菌根菌，将其作为母菌种备用。固体扩大培养基质为蛭石、玉米粉和麸皮，三者以8∶1∶1的比例充分混合，搅拌均匀，然后加入ZPD营养液(以手紧握有水渗出但不下滴为准)再次拌匀，取约400g基质装入培养袋中，将其压实，并用包装绳扎好袋口。培养基质经1.01×106Pa灭菌90min，冷却后，在无菌条件下将Be接种于固体培养基质，置于25℃恒温培养，待菌丝长满培养基质后即制备成外生菌根真菌的固体菌剂。
美味牛肝菌(Be)与蜡状芽孢杆菌HB12双接种的盆栽试验：采用芽苗截根法移栽黑松幼苗，基质土与固体菌剂比例为10∶1，细菌接种液的量为5mL/株，浓度约为107cfu/g。具体方法如下：首先，取适量无菌的盆栽基质装入培养杯中，然后在土层表面覆约20g的外生菌根菌剂；其次，将子叶期的黑松幼苗轻轻地从育苗盆中取出，并用清水将幼苗根部的沙子冲洗干净，用解剖刀将芽苗截去少量主根后移栽至培养杯中，使根系尽量包埋于菌剂中，压实土壤；第三，用无菌移液管吸取5ml的细菌菌体悬浊液，沿幼苗根系将其缓缓注入，然后再覆一层基质土，每个处理的盆栽基质土为200g；第四，浇水定根。以单接种细菌或外生菌根菌及不接菌三种处理作为对照，每处理10个重复。置于25℃温室培养，光照为12h/d，适时浇水，统一管理。待双接种处理的黑松苗生长10个月后，将其小心地从培养杯中取出，测量苗高、地径。以未接菌根菌的松苗作为对照，每处理3个以上重复。
试验结果表明(表4；图3)，单接种HB12菌株、单接种Be菌株，双接种HB12+Be都对黑松苗的生长起到了较明显的促进作用。与对照相比，单接种HB12、单接种Be和两者双接种处理黑松苗高分别增长了36.0％、24.5％和44.0％；黑松地径增长了22.9％、26.5％和27.7％。
表4蜡状芽孢杆菌HB12与美味牛肝菌(Be)互作对黑松苗木生长的影响
实施例3：蜡状芽孢杆菌HB12对丝核菌(Rhizoctonia sp.)平板抑菌作用
将用NA斜面活化的蜡状芽孢杆菌HB12菌株划线接种于PDA平板两侧，再将松树苗木猝倒病病原菌PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，点接于平板中间。28℃培养7天观察抑菌带的有无，并记录其宽度。从表5和图4可看出，HB12对病原菌丝核菌(Rhizoctonia sp.)具有拮抗作用。与对照相比，抑菌率达44.2％。
表5蜡状芽孢杆菌HB12对丝核菌(Rhizoctonia sp.)的抑制作用
实施例4：蜡状芽孢杆菌HB12对温室盆栽松苗猝倒病的防治
芽苗的培育：同实施例2；
接种方法：待黑松芽苗长至子叶期时进行移栽(每处理20个重复)，移栽基质土壤采自南京林业大学校园后山，与沙子、蛭石以2∶1∶1的比例充分混匀后经1.01×106Pa灭菌90min，冷却后即为培养基质。将松苗猝倒病病原菌丝核菌(Rhizoctonia sp.，编号Cs1)接种到PD培养基中振荡培养7d，采用无菌纱布过滤获得菌体，将其与培养基质充分混匀，即为带菌培养基质。先在育苗杯中放置1/2的无菌培养基质，再在每个育苗杯中施20g带菌培养基质；将黑松苗移栽到育苗杯中，蜡状芽孢杆菌HB12菌株接种方法同实施例2，设不接病原菌为对照(CK)，以校正发病率，每处理20个重复，7天后观察并统计松苗的发病和死亡情况。
试验结果表明(表6)，蜡状芽孢杆菌HB12提高了松苗抗猝倒病的能力，HB12+Cs1的猝倒病发病率为50％，死亡率为40％；而单接种病原菌Cs1的黑松其猝倒病发病率高达80％，死亡率为65％。
表6不同接种处理对黑松猝倒病发病率和死亡率的影响
Claims (4)
1.一种外生菌根辅助细菌蜡状芽孢杆菌HB12，其分类命名为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号是CCTCC No：M209025，保藏日期：2009年2月18日。
2.权利要求1所述的外生菌根辅助细菌蜡状芽孢杆菌在促进美味牛肝菌(Boletusedulis)生长中的应用。
3.权利要求1所述的外生菌根辅助细菌蜡状芽孢杆菌与美味牛肝菌互作在促进黑松生长中的应用。
4.权利要求1所述的外生菌根辅助细菌蜡状芽孢杆菌在防治由丝核菌(Rhizoctoniasp.)引起的松苗猝倒病中的应用。
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