CN102154177B - 一种拮抗油茶病害的菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种拮抗油茶病害的菌株及其应用，尤其是拮抗油茶炭疽病的菌株，属植物保护技术领域。该菌株为短短芽孢杆菌Z26，Bacillus brevis Z26，保藏号CCTCC M 2011013。其经平板对峙试验初筛及液体发酵液复筛所得，同时能有效防治油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶半边疯、柑橘炭疽病、柑橘根腐病、芦荟根腐病等多种植物病害，尤其能够有效抑制油茶炭疽病菌的生长，防效高；且环境安全性好，具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物保护领域，尤其涉及一种防治油茶主要病害的生防菌株，具体地说尤其涉及一株高效防治油茶炭疽病的短短芽孢杆菌Z26及应用。
背景技术
油茶(Camellia oleifera)是我国特有的食用油料树种，亦是世界四大木本油料树种之一，已有2000多年的利用和栽培历史。它适应性广，抗逆性强，适种于广大的红壤丘陵低地区。主要生长在南方，以湖南、江西、广西为主，其中湖南省是国内最大的油茶产地和最大的茶油消费区。
油茶全身都是宝，具有很高的经济价值。据统计，油茶面积在10万亩以上的县有130个，30万亩以上的县有56个，50万亩以上的县有19个。年产茶油1.3～1.5亿公斤，是二亿多人口的主要食用油来源。目前全国有油茶林400万公顷，占全国木本食用油料面积的80％以上，常年产油15万吨。目前，油茶的病害种类繁多，其危害程度也愈发严重。每年因病害而造成的经济损失难以估计，其中油茶炭疽病是一种常见的油茶病害。
油茶炭疽病是由胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)侵染引起的一种毁灭性病害，是我国油茶产区的主要病害之一，发生普遍，引起严重落果、落蕾、落叶、枝枯，甚至整株衰亡。病害落果率通常在20％左右，严重时40％以上。据浙江省的资料，由于油茶炭疽病，严重病区发病率高达80％，病树的平均存果率比无病树降低了63.3％。
当前对油茶炭疽病的防治主要通过种植抗性品种和化学防治来控制，但有害生物抗性问题日益严重，且化学农药残留造成严重的危害，如造成残毒、污染环境，对人体健康、生态环境造成了很大的威胁，不利于油茶产业生产的可持续发展。因此寻找一种经济、安全、有效的防治措施是当务之急。生物防治以其安全、高效及无污染等特点已经成为植物病害防治的重要途径，其中拮抗细菌在植物病害生物防治中起到非常重要的作用，其主要优势在于：1)种类和数量众多，在植物叶际、叶内大量存在；2)对病原菌的作用方式多种多样，包括竞争、拮抗、寄生、诱导植物抗性的产生等；3)繁殖速度快；4)许多细菌在植物的叶内或叶际定殖力强；5)细菌大多能够人工培养，易于操作，便于生产应用；6)有些细菌不仅能够防治病害而且可以增加作物产量。
从油茶林地分离筛选获得对油茶炭疽病菌具有拮抗作用的生防菌株，对油茶炭疽病的防治具有重要的意义，但目前相关技术仍旧很薄弱甚至空白，至今20多年能有效防治油茶炭疽病病的拮抗细菌少见报道，也少有防治油茶炭疽病的生物农药的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的空白，提供一种高效防治油茶主要病害，尤其是油茶炭疽病的短短芽孢杆菌Z26，炭疽病的短短芽孢杆菌Z26是一种从油茶林地内分离筛选获得对油茶炭疽病菌具有高效拮抗作用的生防细菌菌株，对油茶炭疽病的防治具有重要意义。
本发明另一个目的是提供所述高效防治油茶主要病害，尤其是炭疽病的短短芽孢杆菌Z26在防治炭疽病等灾害方面的多种应用。
本发明的技术方案是提供一种拮抗油茶病害的菌株，所述的菌株为短短芽孢杆菌Z26(Bacillus brevis Z26)，已于2011年1月10日在中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏号CCTCC M 2011013。在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落平、光滑、黄灰色或浅黄色、无可溶性色素，菌体杆状，0.7～0.9μm×3～5μm，革兰氏染色阳性，在膨大孢囊内含椭圆形芽孢。
所述的菌株应用于防治油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶半边疯、柑橘根腐病或柑橘炭疽病或芦荟根腐病病原菌；尤其是用于防治油茶炭疽病。
所述菌株应用于抑制或致畸油茶炭疽病病菌菌丝；或者应用于抑制油茶炭疽病病菌菌丝分生孢子的萌发。
所述的菌株还可以应用于制备防治油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶半边疯、柑橘根腐病、柑橘炭疽病或芦荟根腐病病原菌的制剂；尤其是制备防治油茶炭疽病的制剂。
本发明的有益效果是：
(1)短短芽孢杆菌Z26对油茶炭疽病菌抑制作用强，对多种病原真菌具有拮抗作用，具有拮抗细菌在植物病害生物防治中所起到的非常重要的作用，例如种类和数量众多；对病原菌的作用方式多种多样；繁殖速度快等优点，尤其是对油茶炭疽病的防治具有重要意义。
(2)该菌株培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1为短短芽孢杆菌Z26菌落形态；
图2为10×100倍显微镜下观察短短芽孢杆菌Z26的菌体及芽孢形态；
图3为短短芽孢杆菌Z26菌株对油茶炭疽病菌的平板对峙拮抗作用；
图4为短短芽孢杆菌Z26对油茶炭疽病孢子的致畸作用；
图5为短短芽孢杆菌Z26菌株对油茶炭疽病菌等6种病害的平板对峙拮抗作用；
具体实施方式
本发明提供短短芽孢杆菌Z26新菌株，其展现出对油茶炭疽病具有较强的拮抗活性。
本发明的新菌株分离自油茶林地。
本发明的短短芽孢杆菌Z26显示出以下形态和生化特征：在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落平、光滑、黄灰色或浅黄色、无可溶性色素，菌体杆状，0.7～0.9μm×3～5μm，革兰氏染色阳性，在膨大孢囊内含椭圆形芽孢。
菌株的生化反应过氧化氢酶、葡萄糖发酵、需氧性测定呈阳性，V-P、甲基红反应阴性，其生长能水解淀粉、明胶。
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，而非限制本发明。
实施例1细菌的分离
采集油茶林地土样，铲去表层土5cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的自封袋中。在实验室内将10g土样加入装有90ml生理盐水的250ml三角瓶中，充分摇匀，吸取上清液1ml，转移至装有9ml生理盐水的无菌试管中，依次等比稀释至10-7稀释度，并按10-7-10-3稀释度的顺序分别吸取0.1ml在事先准备好的牛肉膏蛋白胨培养基上进行平板涂布，每个稀释度重复3次，涂抹均匀后放入培养箱中30℃培养，48h后记录菌量，并根据菌落形态、颜色和大小选取，在平板上进行纯化保存，共分离5个批次。
实施例2拮抗细菌的筛选
初筛：采用对峙培养法。筛选病原真菌的拮抗细菌。将打好直径为6mm的油茶炭疽病菌菌饼放于平板中央，然后用接菌环蘸取待测细菌的悬浮液等距离(距平板中央3cm)点接2～3种细菌，放于培养箱中25℃黑暗培养，4d后观察记录抑菌带的有无及大小，共重复3次。选出抑菌带宽度大于等于4mm的10个菌株进行复筛，依次为Z5、Z12、Z17、Z20、Z26、Z30、Z31、Z47、Z52、Z66进行复筛(见表1)。
表1分离细菌对油茶炭疽病菌的抑菌作用
复筛：采用发酵法。将初步筛选出的10株菌分别在NA培养基上培养2d后，用接菌环移取一环置入装有150mlNB培养液的三角瓶中(250ml)，在28℃、150rpm的摇床上振荡培养48h。培养液用0.22μm细菌过滤器过滤得到培养滤液，将滤液与约50℃PDA培养基按1∶19混匀倒入培养皿，冷却后在平板中央放入d＝6mm的炭疽菌菌饼，5d后测量病菌菌落直径，以无菌水为对照，Z26菌株发酵液的抑菌效果最明显，抑制率达到83.4％。见表2。
表2各初筛菌株发酵液对油茶炭疽病菌的抑制作用
通过菌落形态观察及生理生化反应，Z26显示出以下形态和生化特征：在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落平、光滑、黄灰色或浅黄色、无可溶性色素，菌体杆状，0.7～0.9μm×3～5μm，革兰氏染色阳性，在膨大孢囊内含椭圆形芽孢。菌株的生化反应过氧化氢酶、葡萄糖发酵、需氧性测定呈阳性，V-P、甲基红反应阴性，其生长能水解淀粉、明胶。因此鉴定Z26为短短芽孢杆菌。图1：短短芽孢杆菌Z26菌落形态；图2：10×100倍显微镜下观察短短芽孢杆菌Z26的菌体及芽孢形态。
实施例3短短芽孢杆菌Z26对油茶炭疽病菌丝的抑制作用
将直径为6mm的油茶炭疽病菌菌饼放于马铃薯蔗糖培养基PDA平板中央，然后等距离3cm点接短短芽孢杆菌Z26，三次重复，25～28℃培养，5天后测定抑菌带的直径。由图可见短短芽孢杆菌Z26对油茶炭疽病菌抑菌作用强，其中图3：短短芽孢杆菌Z26对油茶炭疽病菌抑菌作用。
实施例4短短芽孢杆菌Z26对油茶炭疽病菌丝的致畸作用
将玻璃纸剪成5mm×25mm的长条状，121℃高压灭菌，用镊子将其铺放于菌株Z26和病原菌之间。28℃恒温培养5～7天，待菌株Z26和病原菌菌丝之间出现明显的抑菌带后，将玻璃纸小心取下，置于10×40倍显微镜下观察菌丝的形态变化，以不接菌株Z26的病原菌为对照。观察到菌丝前期膨大突出，后期明显变细，形态不均匀，菌丝有断裂、破碎的现象。见图4，其中1：正常菌丝的病原菌菌丝(10×100)；2：前期菌丝膨大突出(10×100)。
实施例5短短芽孢杆菌Z26对油茶炭疽病菌丝分生孢子萌发的抑制作用
采用载玻片悬滴法。将油茶炭疽菌病菌在PDA平板上(22℃)培养箱中培养7d后，用移菌环挑取孢子堆转移到盛有灭菌水的试管中，振荡摇匀后配成孢子悬浮液(5×108个/ml)，备用。取100μl孢子悬浮液，同100μL发酵原液和被稀释10倍、100倍的发酵液及100μL发酵滤液分别混合(将斜面上生长的菌种Z26用接种环接入150ml NB液体培养基中，28℃，150r/min，振荡培养48h即为发酵原液，稀释后即为发酵液，离心后所得上清液即为发酵滤液)，滴加到凹玻片上，以滴加无菌水为对照。每处理重复3次，置于28℃培养箱中培养，48h以后镜检孢子萌发情况，计算孢子萌发率。由表3结果可知，短短芽孢杆菌Z26的发酵原液对炭疽病菌分生孢子的萌发和芽管的生长都有着明显的抑制作用，其中对孢子萌发的抑制率达到94.3％，发酵液被稀释后抑制效果逐渐降低。Z26发酵滤液对孢子萌发的抑制效果也十分明显，使孢子萌发率降低了88.7％，结果表明，菌株在发酵培养过程中可能产生了对炭疽病菌有抑制作用的代谢产物。
表3菌株培养液对炭疽病菌分生孢子萌发的影响
实施例6短短芽孢杆菌Z26对不同病原菌的抑制作用
以油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶半边疯、柑橘炭疽病、柑橘根腐病、芦荟根腐病6种植物病原就为目标菌，用对峙生长法测试对供试病原菌的拮抗作用。结果表明，Z26对供试的6种病原菌均具有拮抗作用，对各病原菌的抑菌圈半径均在10mm以上。
表4Z26对供试病原菌的抑菌效果
Claims (5)
1.一种拮抗油茶病害的菌株，其特征在于，所述的菌株为短短芽孢杆菌Z26(Brevibacillus brevis Z26)，保藏号CCTCC M 2011013。
2.权利要求1所述的菌株的应用方法，其特征在于，应用于防治油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶半边疯、柑橘根腐病、柑橘炭疽病或芦荟根腐病病原菌。
3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，将所述菌株应用于抑制或致畸油茶炭疽病病菌菌丝。
4.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，将所述菌株应用于抑制油茶炭疽病病菌菌丝分生孢子的萌发。
5.权利要求1所述的菌株应用于制备防治油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶半边疯、柑橘根腐病、柑橘炭疽病或芦荟根腐病病原菌的制剂。
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