WO2024030013A1 - Composiciones mejoradoras del suelo a base de subproductos de crustáceos y proceso para obtener dichas composiciones - Google Patents
Composiciones mejoradoras del suelo a base de subproductos de crustáceos y proceso para obtener dichas composiciones Download PDFInfo
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Classifications
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
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- A01G24/20—Growth substrates; Culture media; Apparatus or methods therefor based on or containing natural organic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
- C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
- C05F11/00—Other organic fertilisers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
- C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
- C05F17/00—Preparation of fertilisers characterised by biological or biochemical treatment steps, e.g. composting or fermentation
- C05F17/20—Preparation of fertilisers characterised by biological or biochemical treatment steps, e.g. composting or fermentation using specific microorganisms or substances, e.g. enzymes, for activating or stimulating the treatment
Definitions
- Biofertilizers and biostimulants can be used together to improve plant growth and health. While biofertilizers provide essential nutrients for plants, biostimulants help improve nutrient absorption and strengthen the plant's immune system.
- Chitin is a linear ⁇ -1,4-linked polymer of N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) that is abundant in the shells of crabs, shrimp, and lobsters.
- chitin oligomers mainly depend on the molecular weight and chain length. Although most natural polysaccharides are neutral or acidic, chitin is basic. Chitin is the main component of the cuticles of most insects and of the peritrophic membranes that protect the insect intestines. Pathogenic bacteria that infect the intestines of crustaceans, for example, have to first pass this chitin-rich barrier. At the same time, chitin is present in the insects' tracheal tubes, on the top of their skin and in their muscles, along with proteins and other components.
- Chitin is hydrolyzed by two types of enzymes, namely chitinase (CE3.2.1.14) and beta-N-acetyl hexosaminidase (CE3.2.1.52).
- chitinase CE3.2.1.14
- beta-N-acetyl hexosaminidase CE3.2.1.52
- Many bacteria of the genus Bacillus such as B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. circulans and B. thuringiensis, degrade chitin to meet their nutrient requisition demand.
- the chitin degradation system of B. circulans WL-12 has been well studied and includes three chitinases (BcC hiA1, BcChiC1, and BcC hiD1). Chitinases from B.
- subtilis a well-known microorganism for industrial protein production and biocontrol.
- Three chitinases with different molecular weights (20.6, 48, and 31 kDa) were purified from different B. subtilis strains.
- a chitinase gene was cloned from B. subtilis and expressed in Escherichia coli.
- the enzymatic activities of these chitinases against insoluble substrates such as ⁇ -chitin and ⁇ -chitin have not been investigated.
- a novel chitinase from B. subtilis (BsChi) was expressed in E. coli and biochemically characterized.
- BsChi was found to be potent in the degradation of crab shells and outperformed the known SmChiA from Serratia marcescens and a commercial preparation of chitinase from Streptomyces griseus.
- SmChiA from Serratia marcescens
- some research related to shellfish decomposition has been carried out. To this end, new products have been obtained to recycle waste using the enzyme chitinase with chemical or biological methods.
- Said invention selects Lactobacillus bulgaricus and Bacillus subtilis, for their strong ability to produce acids and enzymes to treat shrimp waste, eliminate proteins and calcium carbonate from shrimp shells to prepare chitin.
- document CN110093387 published on August 6, 2019, provides a method to prepare chitosan oligosaccharides by synergistically degrading the chitin present in the shells of shrimp and crabs using microorganisms of the genus Bacillus and Paecilomyces and fermenting the shells obtaining chitosan soluble in water, chitosan oligosaccharides of different molecular weights and glucosamine, effectively improving the conversion of chitin to chitosan oligosaccharides.
- the invention does not require a strong base or hydrochloric acid, does not pollute the environment, has mild production conditions, low energy consumption, and is in line with energy saving and emissions reduction.
- Bacillus subtilis is capable of producing chitinase and describes means for its application.
- Bacillus is obtained subtilis (CGMCC No.9166) by plasma mutagenesis, causing it to have higher chitinase and protease enzyme activity and can be used as a leavening agent, probiotics and preservative, and can be widely applied to enzyme preparations and food industries.
- the conditions known in the state of the art to test the chitinase activity of the Bacillus subtilis Pla119 strain are the following: a temperature of 35 °C, shaker rotation speed of 180 r/min, inoculum size of the 4%, initial pH of 7.0 and fermentation time of 48 h.
- a temperature of 35 °C 35 °C
- shaker rotation speed 180 r/min
- inoculum size 4%
- initial pH of 7.0 initial pH of 7.0
- fermentation time 48 h.
- the chitinase activity of Bacillus subtilis PLa119 was 2.59 ⁇ 0.05 U/mL and the protease activity was 146 ⁇ 0.07 U/mL.
- a process for obtaining a chitin-based soil improving composition; This process involves the fermentation of crustacean waste with bacteria of the genus Bacillus ssp.
- the process comprises the steps of: - mixing the crustacean by-products with water; - add an antifoam agent; - add a carbon source; - mix the ingredients until you obtain a homogeneous mixture; - sterilize the homogeneous mixture; - add an inoculum of bacteria of the genus Bacillus ssp; previously grown in Greenfort® culture medium.
- FIGURES are a flow diagram with the main stages of the process to obtain a soil-improving biostimulant composition.
- Figures 2A and 2B illustrate the activation of B. subitilis cells with Luria broth and Greenfort® culture medium.
- Figure 3A illustrates the development of a strawberry plant without the chitin-based soil amendment composition.
- Figure 3B illustrates the development of a strawberry plant with the presence of the chitin-based soil improving composition.
- Figure 4A illustrates the development of a potato plant without the chitin-based soil amendment composition.
- Figure 4B illustrates the development of a potato plant with the presence of the chitin-based soil improving composition.
- Figure 5 shows the increase in the yield of Centauro cucumber using the chitin-based soil improving composition compared to a control that uses a technological package previously known to farmers.
- Figure 6A illustrates the development of a strawberry crop without the chitin-based soil improving composition.
- Figure 6B illustrates the development of a crop of strawberry plants with the presence of the chitin-based soil improving composition.
- DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present disclosure refers to soil improving compositions based on crustacean byproducts and processes to obtain the same.
- the process comprises the steps of Figure 1. Specifically, the process follows the following steps: - mixing the crustacean by-products with water; - add an antifoam agent; - add a carbon source; - mix the ingredients for a sufficient time to obtain a homogeneous mixture; - sterilize the homogeneous mixture to obtain a sterile mixture and promote the bioavailability of the different active ingredients through the pressure and temperature conditions; as well as to allow the elimination of possible interfering microorganisms in the process, - let the sterile mixture cool and add an inoculum of bacteria of the genus Bacillus ssp; previously grown in Greenfort® culture medium.
- the crustacean by-products are crustacean waste comprising shells from crabs, shrimp, lobsters and/or a mixture thereof. Even more preferably the waste is shrimp shells.
- the antifoaming agents can be oils, polydimethylsiloxanes and/or certain alcohols, stearates, glycols and/or combinations thereof.
- Preferred carbon sources in one embodiment of the present invention comprise sugar cane, sucrose, molasses, glucose, starch, lactose, fructose, corn syrup and/or combinations thereof.
- the fermentation is carried out in a bioreactor.
- bioreactors suitable for the process of the present invention include but are not limited to stirred tank bioreactors, fixed bed bioreactors, bubble column bioreactors, fluidized bed bioreactors to mention a few.
- Greenfort® culture medium is made from water, yeast(s); inorganic salts selected from the group comprising sodium chloride, potassium chloride, nitrates, nitrites, calcium carbonate, magnesium carbonate; peptones and polysaccharides; and an additional ingredient selected from: - Vegetable proteins such as those from soybeans, peas; malt; etc; - Free amino acids or forming protein complexes; - Natural linear or branched polymers - Linear or branched chain starches and - A source of fiber from fruits, legumes and cereals such as barley and oats; vegetables such as onion, carrot, turnip, broccoli, etc. said additional ingredient being present alone or in any combination with one or more of the other previously defined ingredients.
- sterilization refers to a set of temperature and pressure conditions that are maintained for a certain time. Specifically, for the present invention sterilization is carried out at a temperature of 121 ° C and a pressure of 103.421 kPa (15 psi) for at least 30 minutes. Another preferred embodiment of sterilization is carried out at a temperature of 121°C and a pressure of 103.421 kPa (15 psi) for at least 60 minutes.
- the expression “bacteria of the genus Bacillus” covers all those bacteria that share the macroscopic and microscopic morphology characteristics of said genus as has been widely described in the state of the art.
- Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens
- Bacillus cereus Bacillus circulans
- Bacillus thuringiensis Bacillus anthracis
- Bacillus sphaericus among others.
- the bacteria is Bacillus subtilis.
- incubate or “incubation” for the purposes of this document refers to a set of temperature and aeration conditions in a bioreactor; Specifically, the temperature in the incubation stage is 37 ⁇ 1 °C with continuous stirring and aeration of at least 125 L/min for a period of 110-120 hours.
- the term “separate” or “separation” refers to a unit operation that includes the separation of the solid phase and the liquid phase by filtration, decantation, ultrafiltration or combinations thereof.
- drying or “drying” for the purposes of this document refers to the drying of the solid phase at a temperature of 80 ⁇ 5 °C for a certain time or until reaching a degree of humidity no greater than 7%.
- grinding refers to a unit operation that includes the crushing of a material until it reaches a granulometry that passes through a No. 60 sieve.
- a grinding step is carried out after the final drying of the solids obtained from the process of EXAMPLES Example 1.
- Obtaining soil improving composition Preparation of samples
- the selected raw material is waste from the shrimp industry.
- the shrimp shell must be previously dried, without meat, without tail or head and ground to a minimum mesh number of 60, it must not contain stones, pieces of wood or other materials outside the shrimp exoskeleton.
- Activation of microbial cells An isolated strain of Bacillus subtilis is used as inoculum.
- the inoculum is activated by making a 10% dilution in 2.5% Luria Bertani (LB) broth (10 g/L Tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g/L Yeast Extract) plus 1% source of chitin, and incubated at 37° C for 1 day.
- the cell growth of microorganisms is estimated by optical density measured at 600 nm. See figures 2A and 2B.
- Activation is completed at an optical density of approximately 2.
- the concentration of microorganisms after activation is approximately 1.9 to 3.0% (w/v).
- the bacteria are cultured no more than 5 times at specific time intervals to optimize enzyme production.
- Fermentation control 100 kg of already pulverized shrimp shells are mixed with 400 kg of water, 10 kg of an antifoaming agent and 25 kg of sugar cane inside a bioreactor. After all ingredients are well mixed, the entire mixture is brought to 121 degrees Celsius, 103.421 kPa (15 psi) for a minimum of 1 hour for sterilization. The bioreactor is allowed to cool and then 40 kg of the inoculum (0.8 kg of bacteria) are activated at an optical density (OD) of 2.0. The mixture is incubated at 37°C with continuous shaking and aeration at a minimum of 125 L/min for 120 h.
- the fermentation product consists of a liquid and solid phase, the liquid hydrolysates are separated by filtration and the solids are collected. The solid phase materials are dried at 80° C without leaving more than 7% moisture, thus constituting a soil improving composition comprising chitin. All other fractions are discarded from the process.
- Example 2
- Example 1 Use of the improving composition in agricultural crop soils
- the composition obtained in Example 1 has great stability in the interaction with the environment as it is composed of macromolecules. Therefore, it maintains flexible compatibility with the different compounds, pH and temperatures used when applying it to the soil of agricultural crops.
- the particle size of the final product ie approximately 70+- 5 microns is also relevant since the final product is not soluble in water and therefore must remain in suspension to be able to be used in any type and equipment of fertigation. 6 kilograms per hectare are applied in addition to the normal technological package used by each farmer, without requiring any prior activation or preparation of the soil or product for its application. Results with positive effects were observed in different types of productive crops, mainly in vegetables and berries.
- the main improvements observed are increased yield, improved quality, nematicidal activity, increased soil moisture retention, improved number of flowers, improved fruit ripening time, increased fruit shelf life. , increase in beneficial microorganisms and reduction of pathogenic microorganisms in the soil.
- a synergy has also been observed in which the composition of the invention enhances the benefits of the biological products already used by farmers and the biological agents already present in the crop soil, having a positive impact on the regeneration of agricultural soils.
- 2.1 Strawberry I 6 kg/hectare of the were used in strawberry fields, which increased the yield by 32% as can be seen in Figures 3A and 3B.
- Potato 8 kg/hectare of the improving composition were used in potato fields located in Nuevo León, Mexico, increasing yield by 12%.
- FIGS 4A and 4B illustrate the results obtained.
- FIG. 5 illustrates the results obtained when applying the soil improving composition in fields in central Mexico, where it is observed that there was a statistically significant increase of 12% in the harvested yield of centaur cucumber compared to the control that used a package technology previously known to producers.
- 2.5 Strawberry II 6 kg/hectare of the improving composition was used in strawberry fields, which increased the yield by 24%.
- Figures 6A and 6B illustrate that the number of flowers, the number of fruits, the shelf life of the fruits, and the number of beneficial bacteria and fungi in the soil also increased.
- 2.6 Blackberry The improving composition was used in western Mexico, with a dose of 6 kg per hectare for the cultivation of blackberry in open fields.
- Comparative treatment between the treated surface and the control surface is not Anaerobic bacteria: Fusarium fungus that had the vo na 5 lodell sampled at the end of the cycle [1.7 times more
Abstract
Se describe un proceso para obtener una composición mejoradora del suelo a partir de la fermentación de exoesqueletos de crustáceos para su uso como bioestimulante, así como la composición resultante de dicho proceso.
Description
COMPOSICIONES MEJORADORAS DEL SUELO A BASE DE SUBPRODUCTOS DE CRUSTÁCEOS Y PROCESO PARA OBTENER DICHAS COMPOSICIONES SOLICITUD RELACIONADA La presente solicitud reclama prioridad sobre la Solicitud de Patente Provisional US No. 63/394,141 presentada el 01 de agosto de 2022, cuyo contenido se incorpora en el presente documento en su totalidad como referencia para todos los propósitos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los suelos improductivos y los factores relacionados con la gestión de nutrientes, que abarcan la estructura del suelo, el suministro de nutrientes, la materia orgánica y la escasez de microorganismos beneficiosos, plantean un reto importante a la hora de lograr un alto rendimiento de los cultivos. El desequilibrio entre fertilizantes inorgánicos y nutrientes orgánicos puede dificultar el crecimiento de las plantas y limitar la productividad agrícola. Para abordar este problema, se requiere una solución integral. Los agricultores necesitan una composición eficaz que no sólo mejore el rendimiento de los cultivos, sino que también revitalice los suelos improductivos. Esta solución debería promover el crecimiento de microorganismos beneficiosos, mejorar la biodisponibilidad de los nutrientes del suelo, potenciar el drenaje y aumentar la capacidad de retención de agua. Además, reducir la dependencia de productos agroquímicos excesivos es esencial para mantener un ecosistema sostenible y ecológicamente equilibrado.
Los biofertilizantes y los bioestimulantes pueden utilizarse conjuntamente para mejorar el crecimiento y la salud de las plantas. que los biofertilizantes aportan nutrientes esenciales para las plantas, los bioestimulantes ayudan a mejorar la absorción de nutrientes y refuerzan el sistema inmunitario de la planta. Los inventores de la presente solicitud desarrollaron un proceso para la obtención de un bioestimulantes a base de quitina que mostró tener ese potencial de brindar una solución integral al problema técnico de mejorar el rendimiento en una variedad de cultivos y la degradación biológica del suelo mediante el aumento de microorganismos beneficiosos en el suelo y la estimulación de los cultivos. Utilizando además como base desechos de crustáceos que de no ser aprovechados y modificados biotecnológicamente mediante el proceso de la presente invención simplemente hubiesen representado desechos orgánicos o en el mejor de los casos, material de composta que no aporta una solución técnica hacia suelos improductivos. La quitina es un polímero lineal β-1,4-ligado de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) que abunda en los caparazones de cangrejos, camarones y langostas. En todo el mundo se producen anualmente entre seis y ocho millones de toneladas de estos residuos quitinosos, la mayoría de los cuales se vierten al mar o en vertederos. Las propiedades funcionales y las actividades fisiológicas de los oligómeros de quitina dependen principalmente del peso molecular y de la longitud de la cadena. Aunque la mayoría de los polisacáridos naturales son neutros o ácidos, la quitina es básica. La quitina es el principal componente de las cutículas de la mayoría de los insectos y de las membranas peritróficas que protegen los intestinos de los insectos. Las bacterias patógenas que infectan los intestinos de los crustáceos, por ejemplo, tienen que pasar primero esta barrera rica en quitina. Al mismo tiempo, la quitina está presente
en los tubos traqueales de los insectos, en la parte superior de su piel y en los músculos, junto con proteínas y otros componentes. La quitina es hidrolizada por dos tipos de enzimas, a saber, la quitinasa (C.E.3.2.1.14) y la beta-N-acetil hexosaminidasa (C.E.3.2.1.52). Muchas bacterias del género Bacillus, como B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. circulans y B. thuringiensis, degradan la quitina para satisfacer su demanda de requisición de nutrientes. Por ejemplo, el sistema de degradación de quitina de B. circulans WL-12, un patógeno humano, ha sido bien estudiado e incluye tres quitinasas (BcC hiA1, BcChiC1 y BcC hiD1). También se han investigado las quitinasas de B. subtilis, un microorganismo muy conocido para la producción industrial de proteínas y el biocontrol. Se purificaron tres quitinasas con diferentes pesos moleculares (20.6, 48 y 31 kDa) a partir de diferentes cepas de B. subtilis. En otro informe, se clonó un gen de quitinasa de B. subtilis y se expresó en Escherichia coli. Sin embargo, no se han investigado las actividades enzimáticas de estas quitinasas frente a sustratos insolubles como la α-quitina y la β-quitina. Una nueva quitinasa de B. subtilis (BsChi) se expresó en E. coli y se caracterizó bioquímicamente. La BsChi resultó ser potente en la degradación de caparazones de cangrejo y superó a la conocida SmChiA de Serratia marcescens y a un preparado comercial de quitinasa de Streptomyces griseus. A continuación, se introdujo un sistema de dos componentes que incluía BsChi y OfHex1 del insecto Ostrinia furnacalis para producir GlcNAc a partir de caparazones de cangrejo. En los últimos años, se han llevado a cabo algunas investigaciones relacionadas con la descomposición de los mariscos. Con este fin, se han obtenido nuevos productos para reciclar los residuos utilizando la enzima quitinasa con métodos químicos o biológicos. En particular, la contaminación surgida en el fondo del mar y los océanos como resultado de la muerte de los mariscos se previene mediante el uso de microorganismos (por ejemplo Vibrio furnis) que tienen
la enzima quitinasa, que descompone la quitina. Además, la enzima quitinasa tiene una amplia gama de aplicaciones en la industria la industria de piensos, la industria cosmética, la medicina y la producción de fertilizantes. El documento CN 103130914 publicado el 5 de junio de 2013, describe un método para preparar quitina y proteína compuesta en polvo por fermentación microbiana compuesta de restos de camarón. El producto preparado en dicho documento contiene micoproteína microbiana y productos de degradación de proteína vegetal y proteína animal, es rico en nutrición y tiene actividad funcional. Su mayor ventaja es el uso de restos de camarón, que no descarga ningún contaminante, y obtiene productos de quitina y proteína compuesta en polvo con alto valor añadido. Dicha invención selecciona Lactobacillus bulgaricus y Bacillus subtilis, por su fuerte capacidad para producir ácidos y enzimas para tratar los residuos de camarón, elimina las proteínas y el carbonato de calcio de las cáscaras de camarón para preparar la quitina. Por otra parte, el documento CN110093387 publicado el 6 de agosto de 2019, proporciona un método para preparar oligosacáridos de quitosano degradando sinérgicamente la quitina presente en los caparazones de camarones y cangrejos utilizando microorganismos del género Bacillus y Paecilomyces y fermentando los caparazones obteniendo quitosano soluble en agua, oligosacáridos de quitosano de diferentes pesos moleculares y glucosamina, mejorando eficazmente la conversión de quitina a oligosacáridos de quitosano. La invención no requiere de una base fuerte ni de ácido clorhídrico, no contamina el medio ambiente, tiene condiciones de producción suaves, bajo consumo de energía, y está en línea con el ahorro de energía y reducción de emisiones. También el documento CN104357361 del 18 de febrero de 2015, describe que Bacillus subtilis es capaz de producir quitinasa y describe medios para su aplicación. Se obtiene Bacillus
subtilis (CGMCC No.9166) mediante mutagénesis plasmática, provocando que tenga una mayor actividad de la enzima quitinasa y proteasa y se puede utilizar como agente leudante, probióticos y conservador, y se puede aplicar ampliamente a las preparaciones enzimáticas y a las industrias alimentarias. En términos generales, las condiciones conocidas en el estado de la técnica para probar la actividad quitinasa de la cepa Bacillus subtilis Pla119 son las siguientes: una temperatura de 35 °C, velocidad de rotación del agitador de 180 r/min, tamaño del inóculo del 4%, pH inicial de 7,0 y tiempo de fermentación de 48 h. Se tiene reportados productos en el estado de la técnica en los cuales actividad de la quitinasa de Bacillus subtilis PLa119 fue de 2.59 ± 0.05 U/mL y la actividad de la proteasa fue de 146 ± 0.07 U/mL. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto de la presente divulgación se proporciona un proceso para obtener una composición mejoradora del suelo a base de quitina; dicho proceso involucra la fermentación de residuos de crustáceos con bacterias del género Bacillus ssp. En una modalidad de la invención el proceso comprende las etapas de: - mezclar los subproductos de los crustáceos con agua; - agregar un agente antiespumante; - agregar una fuente de carbono; - mezclar los ingredientes hasta obtener una mezcla homogénea; - esterilizar la mezcla homogénea; - añadir un inóculo de bacterias del género Bacillus ssp; previamente crecido en medio de cultivo Greenfort®. - incubar la mezcla con agitación continua y aireación por un tiempo determinado; - esterilizar la mezcla incubada;
- separar la fase sólida y desechar el resto; - secar los sólidos obtenidos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un diagrama de flujo con las etapas principales del proceso para obtener una composición bioestimulante mejoradora del suelo. Las Figuras 2A y 2B ilustran la activación de células de B. subitilis con caldo Luria y con medio de cultivo Greenfort®. La Figura 3A ilustra el desarrollo de una planta de fresa sin la composición mejoradora del suelo a base de quitina. La Figura 3B ilustra el desarrollo de una planta de fresa con presencia de la composición mejoradora del suelo a base de quitina. La Figura 4A ilustra el desarrollo de una planta de papa sin la composición mejoradora del suelo a base de quitina. La Figura 4B ilustra el desarrollo de una planta de papa con presencia de la composición mejoradora del suelo a base de quitina. La Figura 5 muestra el incremento en el rendimiento de pepino Centauro utilizando la composición mejoradora del suelo a base de quitina en comparación con un control que utiliza un paquete tecnológico previamente conocido por los agricultores. La Figura 6A ilustra el desarrollo de un cultivo de fresa sin la composición mejoradora del suelo a base de quitina. La Figura 6B ilustra el desarrollo de un cultivo de plantas de fresa con presencia de la composición mejoradora del suelo a base de quitina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente divulgación se refiere a composiciones mejoradoras del suelo a base de subproductos de crustáceos y procesos para obtener las mismas. En algunas modalidades, el uso de dichas composiciones mejoradoras del suelo da como resultado un rendimiento incrementado en cultivos. En una modalidad preferida de la invención, el proceso comprende las etapas de la Figura 1. Específicamente, el proceso sigue los siguientes pasos: - mezclar los subproductos de los crustáceos con agua; - agregar un agente antiespumante; - agregar una fuente de carbono; - mezclar los ingredientes durante un tiempo suficiente para obtener una mezcla homogénea; - esterilizar la mezcla homogénea para obtener una mezcla estéril y favorecer mediante las condiciones de presión y temperatura la biodisponibilidad de los diferentes activos; así como para permitir la eliminación de posible microorganismos interferentes en el proceso, - dejar enfriar la mezcla estéril y añadir un inóculo de bacterias del género Bacillus ssp; previamente crecido en medio de cultivo Greenfort®. - incubar la mezcla con agitación continua y aireación por un tiempo determinado; - esterilizar por segunda vez la mezcla incubada para inactivar las bacterias utilizadas en el proceso; - separar las fases líquida y sólida resultantes, recogiendo los sólidos y desechando el resto; - secar los sólidos obtenidos. En una modalidad preferida de la invención los subproductos de crustáceos son desechos de crustáceos que comprenden caparazones de cangrejos, camarones, langostas y/o una mezcla de los mismos. De manera aún más preferida los desechos son caparazones de camarones.
En otra modalidad preferida de la invención, los agentes antiespumantes pueden ser aceites, polidimetilsiloxanos y/o ciertos alcoholes, estearatos, glicoles y/o combinaciones de los mismos. Las fuentes de carbono preferidas en una modalidad de la presente invención comprenden caña de azúcar, sacarosa, melaza, glucosa, almidón, lactosa, fructosa, jarabe de maíz y/o combinaciones de las mismas. En una modalidad preferida del proceso de la invención, la fermentación se lleva a cabo en un biorreactor. Ejemplos de biorreactores adecuados para el proceso de la presente invención incluyen pero no se limitan a biorreactores de tanque agitado, biorreactores de lecho fijo, biorreactores de columna de burbujas, biorreactores de lecho fluidizado por mencionar algunos. El medio de cultivo Greenfort® está hecho a base de agua, levadura(s); sales inorgánicas seleccionadas del grupo que comprende cloruro de sodio, cloruro de potasio, nitratos, nitritos, carbonato de calcio, carbonato de magnesio; peptonas y polisacáridos; y un ingrediente adicional seleccionado de: - Proteínas vegetales tales como aquellas provenientes de la soya, chicharo; malta; etc; - Aminoácidos libres o formando complejos proteicos; - Polímeros naturales lineales o ramificados - Almidones de cadena lineal o ramificada y - Una fuente de fibra proveniente de frutas, legumbres y cereales tales como la cebada y la avena; vegetales tales como cebolla, zanahoria, nabo, brócoli, etc. dicho ingrediente adicional estando presente solo o en cualquier combinación con uno o mas de los otros ingredientes previamente definidos.
Definiciones El término “esterilizar” o se refiere a un conjunto de condiciones de temperatura y presión que se mantienen por un tiempo determinado. En específico, para la presente invención la esterilización se lleva a cabo a una temperatura de 121 °C y una presión de 103.421 kPa (15 psi) durante al menos 30 minutos. Otra modalidad preferida de esterilización se lleva a cabo a una temperatura de 121 °C y una presión de 103.421 kPa (15 psi) durante al menos 60 minutos. La expresión “bacterias del género Bacillus” abarca todas aquellas bacterias que compartan las características de morfología macroscópica y microscópica propias de dicho género tal como se ha descrito ampliamente en el estado de la técnica. El experto en la materia podrá reconocer aquellos microorganismos que encajen en dicha descripción, que incluyen pero no se limitan a Bacillus spp, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis y Bacillus sphaericus entre otros. De manera particularmente preferida, la bacteria es Bacillus subtilis. El término “incubar” o “incubación” para los fines de este documento se refieren a un conjunto de condiciones de temperatura y aireación en un biorreactor; específicamente, la temperatura en la etapa de incubación es de 37± 1 °C con agitación continua y una aireación de mínimo 125 L/min durante un periodo de 110-120 horas. El término “separar” o “separación” se refiere a una operación unitaria que incluye la separación de la fase sólida y la fase líquida mediante filtración, decantación, ultrafiltración o combinaciones de las mismas. El término “secar” o “secado” para los motivos del presente documento se refiere al secado de la fase sólida a una temperatura de 80 ± 5 °C durante un tiempo determinado o hasta alcanzar un grado de humedad no mayor a 7%. El término “molienda” o “molido” se refiere a una operación unitaria que comprende la trituración de un material hasta llegar a una granulometría que atraviesa un tamiz No.60.
En una modalidad opcional de la invención, se realiza una etapa de molienda posterior al secado final de los sólidos obtenidos del proceso de EJEMPLOS Ejemplo 1. Obtención de composición mejoradora del suelo Preparación de las muestras La materia prima seleccionada son desechos de la industria camaronera. El caparazón del camarón debe estar previamente desecado, sin carne, sin cola ni cabeza y molido hasta alcanzar un mínimo de número de malla de 60, no debe contener piedras, trozos de madera u otros materiales fuera del exoesqueleto del camarón. Activación de células microbianas Se utiliza como inóculo una cepa de Bacillus subtilis aislada. El inóculo se activa realizando una dilución al 10% en caldo Luria Bertani (LB) al 2.5% (10 g/L de Triptona, 10 g/L de NaCl, 5 g/L de Extracto de Levadura) más 1% de fuente de quitina, y se incuba a 37° C durante 1 día. El crecimiento celular de los microorganismos se estima por densidad óptica medida a 600 nm. Ver figuras 2A y 2B. La activación se completa a una densidad óptica de aproximadamente 2. La concentración de microorganismos después de la activación es de aproximadamente 1.9 a 3.0% (p/v). La bacteria no se cultiva más de 5 veces a intervalos de tiempo específicos para optimizar la producción de enzimas.
Control de la fermentación 100 Kg de cáscaras de camarón ya pulverizadas se mezclan con 400 Kg de agua, 10 Kg de un agente antiespumante y 25 Kg de caña de azúcar dentro de un biorreactor. Después de que todos los ingredientes estén bien mezclados, toda la mezcla se lleva a 121 grados Celsius, 103.421 kPa (15 psi) durante un mínimo de 1 hora para su esterilización. Se deja enfriar el biorreactor y, a continuación, se activan 40 kg del inóculo (0.8 Kg de bacterias) a una densidad óptica (DO) de 2.0. La mezcla se incuba a 37° C con agitación continua y aireación a un mínimo de 125 L/min durante 120 h. Inactivación bacteriana Tras las 120 horas de fermentación, toda la mezcla se lleva a 121 grados Celsius, 103.421 kPa (15 psi) durante un mínimo de 30 min para su esterilización con el fin de inactivar las bacterias utilizadas en el proceso y con ello permitir que el producto final no contenga microorganismos activos que afecten la vida de anaquel y que al mismo tiempo permitan cumplir con las regulaciones sanitarias de manera más sencilla y eficiente. Condiciones de separación El producto de la fermentación consiste en una fase líquida y sólida, los hidrolizados líquidos se separan por filtración y los sólidos se recogen. Los materiales de la fase sólida se secan a 80° C sin dejar más de un 7% de humedad, constituyendo así una composición mejoradora del suelo que comprende quitina. Todas las demás fracciones se descartan del proceso.
Ejemplo 2. Uso de la composición mejoradora en suelos de cultivos agrícolas La composición obtenida en el Ejemplo 1 posee una gran estabilidad en la interacción con el medio ambiente al estar compuesto por macromoléculas. Por lo tanto, mantiene una compatibilidad flexible con los diferentes compuestos, pH y temperaturas utilizados a la hora de aplicarlo al suelo de los cultivos agrícolas. El tamaño de partícula del producto final; i.e. aproximadamente de 70+- 5 micras es relevante también toda vez que el producto final no es soluble en agua y por lo tanto debe permanecer en suspensión para poder ser utilizarlo en cualquier tipo y equipo de fertirrigación. Se aplican 6 kilogramos por hectárea además del paquete tecnológico normal utilizado por cada agricultor, sin ser necesaria ninguna activación o preparación previa del suelo o del producto para su aplicación. Se observaron resultados con efectos positivos en diferentes tipos de cultivos productivos, principalmente en hortalizas y frutos rojos. Las principales mejoras observadas son aumento del rendimiento, mejora de la calidad, actividad nematicida, aumento de la retención de humedad en el suelo, mejora del número de flores, mejora del tiempo de maduración de los frutos, aumento de la vida útil de los frutos, aumento de microorganismos beneficiosos y reducción de microorganismos patógenos en el suelo. También se ha observado una sinergia en la que la composición de la invención potencia los beneficios de los productos biológicos ya utilizados por los agricultores y los agentes biológicos ya presentes en el suelo de cultivo, teniendo un impacto positivo en la regeneración de los suelos agrícolas.
2.1 Fresa I Se utilizaron 6 kg/hectárea de la en campos de fresas, lo que aumentó el rendimiento en un 32% tal como se puede ver en las Figuras 3A y 3B. 2.2 Papa Se utilizaron 8 kg/hectárea de la composición mejoradora en campos de papa ubicados en Nuevo León, México incrementando el rendimiento en un 12%. Las Figuras 4A y 4B ilustran los resultados obtenidos. 2.3 Tomate En el noreste de México, en un cultivo de tomate saladette, se observaron beneficios de restauración del rendimiento cosechado en zonas poco productivas en invernadero de malla sombra con la aplicación de la composición mejoradora de suelo. Hubo un incremento de 162% del peso cosechado en la zona con suelo deteriorado, casi homogeneizando la producción sobre el control como se aprecia en la siguiente Tabla. Tabla 1. Comparación entre el rendimiento obtenido con y sin aplicación de la composición mejoradora. Cosecha Zona 1 Cosecha Zona 2
Ciclo de cosecha real 15.33 kg/m2 19.50 kg/m2
. epno La Figura 5 ilustra los resultados obtenidos al aplicar la composición mejoradora del suelo en campos del centro de México, donde se observa que hubo un aumento estadísticamente significativo del 12% en el rendimiento cosechado de pepino centauro en comparación con el control que utilizan un paquete tecnológico previamente conocido por los productores. 2.5 Fresa II Se utilizaron 6 kg/hectárea de la composición mejoradora en campos de fresas, lo que aumentó el rendimiento en un 24%. En las Figuras 6A y 6B se ilustra que también aumentaron el número de flores, el número de frutos, la vida útil de los frutos y el número de bacterias y hongos beneficiosos del suelo. 2.6 Zarzamora La composición mejoradora se utilizó en el occidente de México, con una dosis de 6 kg por hectárea para el cultivo de zarzamora en campo abierto. Se tomaron muestras aleatorias de suelo al inicio de la siembra y al momento de la cosecha, en el área tratada y en el área control, y se enviaron a análisis microbiológicos con laboratorios de terceros. En la Tabla 2 se observa como hay una mejora en la cantidad de UFC/gramo de microorganismos benéficos del suelo, como fijadores de nitrógeno, solubilizadores de fósforo, bacilos, trichoderma, entre otros. Por
otra parte, en la zona tratada, se observó una mejora del 35% en la reducción de Fusarium, el único fitopatógeno que se encontraba en el en un principio. Tabla 2. Beneficios observados por el uso de la composición mejoradora en Zarmzamora. Tratamiento comparativo entre la superficie tratada y la superficie control n o lo e
Bacterias anaerobias: hongo Fusarium que tenía el vo n a 5 l o d e l l
muestreado al final del ciclo
[1,7 veces más
Aunque la invención se ha descrito y ejemplificado en detalle suficiente para ser realizada y usada por los expertos en la técnica, varias alternativas, modificaciones y mejoras resultarán obvias sin alejarse del alcance de la invención. Los ejemplos provistos en la presente memoria son representativos de las realizaciones preferidas, son ejemplificativos y no pretenden ser limitativos del alcance de la invención. Las personas con experiencia en la técnica idearán modificaciones a la misma y otros usos. Esas modificaciones están abarcadas dentro del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones.
Claims
1. Un método para obtener una composición mejoradora del suelo, el método caracterizado porque comprende: - mezclar subproductos de crustáceos con agua; - agregar un agente antiespumante; - agregar una fuente de carbono; - mezclar los ingredientes durante un tiempo suficiente para obtener una mezcla homogénea; - esterilizar la mezcla homogénea para obtener una mezcla estéril; - dejar enfriar la mezcla estéril y añadir un inóculo de bacterias del género Bacillus; - incubar la mezcla con agitación continua y aireación por un tiempo determinado; - esterilizar por segunda vez la mezcla incubada para inactivar las bacterias utilizadas en el proceso; - separar las fases líquida y sólida resultantes, recogiendo los sólidos y desechando el resto; - secar los sólidos obtenidos.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque los subproductos de crustáceos comprenden caparazones de camarón.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque la bacteria del género Bacillus consiste en Bacillus subtilis.
4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque las fuentes de carbono se seleccionan del grupo que comprende caña de azúcar, sacarosa, melaza, glucosa, almidón, lactosa, fructosa, jarabe de maíz y/o combinaciones de las mismas.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque los agentes antiespumantes se seleccionan del grupo que comprende aceites,
polidimetilsiloxanos y/o siliconas, ciertos alcoholes, estearatos, glicoles y/o combinaciones de los mismos.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la etapa de incubar se lleva a cabo a 37± 1 °C con agitación continua y una aireación de mínimo 125 L/min durante un periodo de 110-120 horas.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la etapa de secado comprende secado a 80 ± 5 °C hasta alcanzar un grado de humedad no mayor a 7%.
8. Una composición mejoradora del suelo obtenida mediante el proceso de las reivindicaciones 1-7.
9. El uso de una composición mejoradora del suelo de conformidad con la reivindicación 8, para incrementar la cantidad de microorganismos benéficos en el suelo.
10. El uso de una composición mejoradora del suelo de conformidad con la reivindicación 8, para incrementar el rendimiento de cultivos.
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