CN101215595B - 利用微生物从虾壳中提取虾青素、蛋白质以及甲壳素的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用微生物从虾壳中提取虾青素、蛋白质以及甲壳素的方法，是利用革兰氏阴性杆菌邻单胞杆菌(Plesiomonas)在37℃的条件下进行降解发酵，降解物经离心分离，液体经浓缩、干燥得蛋白粉；固体用溶剂浸泡，再经离心，液体经除去溶剂得虾青素；沉淀中下层为粗品甲壳素；沉淀中上层为菌体以及少量蛋白，用作生物肥料。与现有技术相比本发明所具有的突出优点为：综合利用好：应用微生物降解提取虾壳中的虾青素，回收蛋白质和粗品甲壳素，菌体以及少量蛋白可作为生物肥料，使虾壳资源充分利用，达到“吃干榨尽”的地步。同时发明的污染低、成本低、效果好。
Description
技术领域
本发明涉及微生物从海洋动物提取虾青素、蛋白质、壳质多糖的技术领域。
背景技术
虾青素是一种酮式非维生素A原的类胡萝卜素，分子式C40H52O4。由于分子中存在较长的共轭双键，极易捕获电子，是单线态氧的淬灭剂，具有清除自由基的能力和超级抗氧化活性，效果可为普通维生素E的500倍[1]。其生物活性主要表现在预防动脉硬化、抗癌活性、增强免疫、维护中枢神经系统健康等方面。可作为人类高级营养保健及医药产品和水产、畜禽的饲料添加剂，尤其是水产养殖业始终是虾青素最大的市场。在商业化的鱼类和甲壳动物(如鲑鱼、虾、蟹、虹鳟鱼等)养殖厂，通常在饲料中添加虾青素，以保证鱼苗的成活率及提高产品的市场价值[2]。
虾青素是类胡萝卜素合成的终点，由β-胡萝卜素转变为虾青素需加上两个酮基和两个羟基，因此化学合成困难，生产成本高。同天然虾青素比，动物体对化学合成虾青素吸收能力弱。同时化学合成法生产的虾青素是多种构型的混合物，出于安全性考虑，在食品，饲料，医药及化妆品上的应用都有很大限制，如美国食品及药物管理局(FDA)已经禁止使用化学合成的虾青素[3]。我国也已禁止人工合成的虾青素用于鸡、鸭等家禽的饲养[4]。
虾青素广泛存在于生物界中，特别是水生动物如虾、蟹及鱼中，含量丰富。目前，全世界每年有几百万吨的虾壳作为甲壳素生产的原料
我国沿海水产资源丰富，甲壳类加工尤其是虾仁加工企业的下脚料中含有大量虾青素，但回收利用较少。目前，我国主要用这些下脚料来生产甲壳素。脱色废水中的虾青素增加了废水的色度。而蛋白质经碱处理后作为废水排放，造成环境污染，且浪费了蛋白质和虾青素等重要资源。以往对于虾壳中虾青素的提取，主要采用酸碱处理，并用大量有毒溶剂提取。其成本高，效率底，对环境污染严重。而目前在甲壳素，壳多糖及寡糖的生产中使用的脱色工艺仍以这种方式为主[5]。
由于传统方法的种种弊端，使用生物手段提取色素的方法正逐步引起人们的重视。国内已有大量学者尝试使用不同酶处理虾壳，取得了很好的效果[6]。
而国外也已经有学者使用了乳酸菌用来发酵虾壳，提取虾青素[7]。与酶法相比，除了成本相对低廉以外使用微生物发酵还有：(1)使体系中氢离子增多，从而增强了体系的还原性，抑制了虾青素的氧化；(2)酸的脱钙化作用，促进了虾青素与钙的解离；(3)发酵过程产生各种酶(主要是蛋白酶)促进了蛋白质等的水解，从而提高了虾青素的提取率等优点。但是从报道的情况看， 普遍存在发酵时间较长、产酸速度慢的问题，且所作研究尚处于实验阶段。特别是尚未见到用虾壳既提取出虾青素、又能提取其蛋白粉、还能为甲壳素提供粗品原料的综合利用的工艺技术报道。
参考文献：
[1]彭小兰虾青素的生理功能及其生产与应用研究[J].当代畜牧.2005年第11期.
[2]李浩明，高蓝虾青素的结构、功能与应用[J].精细化工2003年1月.第20卷第1期.
[3]滕长英，张立，秦松，屈慧鸽虾青素的应用及生产来源[J]安徽农业科学2007.35(8)：2298-2299.
[4]中华人民共和国农业部关于虾青素(加丽素红)作为着色剂不能用于家禽饲料添加剂2004年318号公告.
[5]姜启兴，夏文水.甲壳类加工下脚料中虾青素的提取研究[J].食品科技.2003.12[6]朱艺峰鱼饲料着色剂--甲壳类下脚料类胡萝卜素的提取技术[J].海洋湖沼通报.2000.2
[7]Armenta L R，Guerrero L I，Huerta S.Astaxanthin extraction from shrimp wasteby lactic fermentation an denzymatic hydrolysis of the carotenoprotein complex[J].JFood Chem，2002，67(3)：1002-1006.
发明内容
本发明立意是：如果能在甲壳素生产之前提取出虾青素，不但为企业获得更大的经济效益，而且有利于提高甲壳素的质量，减少废水的色度，对废水治理具有积极作用。
针对现有技术存在的缺陷，本发明旨在提供一种简易而有效的从虾壳中提取虾青素的方法。不仅如此，而且能充分利用资源提取其中的蛋白质、以及剩余物成为制取壳聚糖精品的原料，从而综合利用虾壳资源。
研究表明，革兰氏阴性杆菌邻单胞杆菌(Plesiomonas)在37℃的条件下可以快速的分解虾壳，且在此过程中可以利用虾壳为唯一营养来源，不需外加营养物质。虾青素在虾壳中主要与蛋白质结合，使其提取较为困难。一旦虾壳中的蛋白质被分解利用，虾青素就处于游离或半游离状态，提取也就比较容易了。同时没有被微生物完全消耗的蛋白质，还可以做为一种副产品加以回收，剩余的残渣可作为甲壳素的生产原料。
本发明的技术方案是：虾壳粉碎后水煮灭菌，接种革兰氏阴性杆菌邻单胞杆菌菌种进行降解发酵，降解物离心，液体经浓缩、干燥得蛋白粉；固体用溶剂浸泡，再经离心，液体经除去溶剂即得虾青素；沉淀中下层为粗品甲壳素；沉淀中上层为菌体以及少量蛋白，用作生物肥料。
本发明得具体工艺为：
一.原料处理
虾壳在使用前须经过初步的清洗除去灰尘杂物，经过粗略的粉碎之后即可加入质量比为1∶1～3的水进行预煮灭菌。加水量由虾壳的干燥状态决定。灭菌可以采用巴氏杀菌。有条件的可以用蒸汽灭菌，条件为121℃，20～30min。
二.发酵设备灭菌及菌种的活化
发酵设备在使用之前要彻底的清洗，并灭菌。
菌种在接入发酵之前，应从保存斜面上先接入活化培养基，培养基成分为灭菌后的虾壳和无菌水。在37℃下，活化26～32h。以10～20％的接种量，接入到灭好菌的虾壳料中。
三.降解发酵
降解过程中要保持通氧或振荡，否则影响降解效率。以振荡为例，装液量不应超过40％，振荡频率为170r/min。降解时间为36～40h。
四.蛋白粉、甲壳素粗品及虾青素的制备：
降解后的混合液体呈白色或粉色，经3000～4000r/min的离心之后可以分离出透明的黄色液体，以及红色虾壳降解物和白色菌体沉淀。
(1)蛋白粉的制备：
液体部分通过过滤灭菌或121℃，20min的蒸汽灭菌后，高温浓缩，并喷雾干燥，可得到含钙丰富的虾壳蛋白粉。可以用于饲料或微生物培养。
(2).甲壳素粗品与生物肥料的制备：
上述离心的沉淀用95％的乙醇，或石油醚∶乙醇＝1∶5的混合溶剂，用与原料虾壳1∶1的质量比进行浸泡。1～3h后离心分离，分为沉淀部分和液体部分，液体部分待提取虾青素。沉淀部分分为上、下两层：下层为甲壳素粗品，上层为菌体以及少量蛋白。通过40目筛网清洗，洗出物中为菌体以及少量蛋白，烘干后可作为生物肥料，筛网上留下的部分烘干可作为生产甲壳素素的原料-即甲壳素粗品。由于在降解过程中，虾壳中的大量蛋白质被除去，色素也在随后的提取工艺中被提出。用所剩粗品甲壳素来进一步加工甲壳素或壳多糖以及寡糖时，废水中的蛋白残留少，色度底，出品率高。
(3).虾青素的提取：
在(2)步骤中离心分离的液体部分为虾青素的有机溶液，将该有机溶液减压蒸馏除有机溶剂(回收可再利用)。以真空度100kp下45～55℃的条件减压蒸馏为好。完毕后收集得粉红或橘红色虾青素，具体颜色与原料和虾青素浓度有关。虾青素产量根据原料不同为50～120μg/g。
与现有技术相比，本发明所具有的突出优点为：
一.综合利用好：应用微生物降解提取虾壳中的虾青素，在生产虾青素的同时，又能回收蛋白质，剩余虾壳残渣为粗品甲壳素，菌体以及少量蛋白可作为生物肥料，使虾壳资源充分利用，达到“吃干榨尽”的地步。另外所产粗品甲壳素作为提取甲壳素的原料，可以提高了甲壳素的产出率，降低了污染排放。
二.污染低，与传统的提取虾青素的方法相比。微生物降法省去了碱洗和酸洗的步骤。减少了强酸、强碱废水的排放，降低了对环境的污染。提取时采用毒性较低的乙醇或乙醇与石油醚的混合溶剂，较已往采用氯仿、丙酮等有毒溶剂更为安全。
三.成本低，微生物降解对于设备的要求较为简单，减少了设备成本。同时所用微生物可以利用虾壳为唯一营养来源，不须要外加其它培养基，与酶法相比，减少了降解成本。生物处理替代了酸洗和碱洗，省去了酸碱的使用，降低了原料成本。减少了处理排放的费用。
四.效果好，研究表明使用微生物降解处理后，虾壳中的虾青素的提取率要高于直接用酸碱处理。同时使用生物降解法对于虾青素的破坏要小于酸碱处理。
附图说明
附图为三种提取虾青素的方法对提取物中类胡萝卜素含量的对比图。其中纵坐标的Y代表提取物中类胡萝卜素含量，单位是μg/ml；横坐标X代表提取方法，其中的1为盐酸丙酮法2.为微生物降解法3.为油溶法。
具体实施方式：
实例1：
将10g原料虾壳粗粉碎至0.5-1.0cm后，以1∶2的质量比加水。121℃蒸汽灭菌20min。将活化26h的液态菌种以15％的比例接种，37℃下降解36h。3800r/min离心10min。上清液于121℃，20min蒸汽灭菌。100℃浓缩10min后，在105℃下烘干，得蛋白粉0.7g。使用乙醇∶石油醚＝1∶5的有机溶剂10ml从下层沉淀提取虾青素，1h后含有虾青素的有机溶液在真空度100kp下45-55℃减压浓缩，得虾青素0.58mg，有机溶剂回收。在40目的筛子上清洗降解后的虾壳和菌体沉淀，洗出物自然晒干后得生物肥料2g。剩余虾壳残渣烘干，作为生产甲壳素的原料。
实例2：
原料，加水比同实例1。采用巴氏灭菌60℃，30min。其它操作同实例1。得虾青素0.60mg，蛋白粉0.73g，生物肥料2.5g。
实例3：
原料、加水及灭菌条件同实例1。菌种活化32h，10％接种。降解时间40h，提取溶剂采用95％乙醇，其他操作同实例1。得虾青素0.53mg，蛋白粉0.77g，生物肥料2.4g。
实例4：
降解工艺同实例1，降解结束后以4000r/min离心分离。上清液121℃，20min灭菌。100℃，15min浓缩后，75℃烘干。虾青素的提取同实例1。得虾青素0.54mg，蛋白粉0.8g，生物肥料2g。
实例5：
原料10g，以1∶1的质量比加水，降解工艺同实例1。降解结束后以4000r/min离心分离。上清液115℃，15min灭菌。100℃，10min浓缩后，75℃烘干。虾青素在95％乙醇中浸泡3h后提取。其他操作同实例1。得虾青素0.52g，蛋白粉0.91g生物肥料1.8g。
实例6：本发明与两种提取虾青素的传统方法的提取效果比较
使用同一批次，相同质量的虾壳，分别采用盐酸酸化丙酮法、本发明的使用微生物降解法与加热油溶法三种方法提取虾青素的结果进行对比。结果如附图所示：与盐酸酸化丙酮提取和加热油溶的方式相比，本发明的使用微生物降解发酵处理的提取效率较高。
Claims (5)
1.一种利用微生物从虾壳中提取虾青素、蛋白质以及甲壳素的方法，其特征在于是将革兰氏阴性杆菌邻单胞杆菌(Plesiomonas)接入到虾壳料中，在37℃的条件下进行降解发酵，降解物经离心分离，液体经浓缩、干燥得蛋白粉；固体用溶剂浸泡，再经离心，液体经除去溶剂得虾青素；沉淀部分分为上、下两层：下层为甲壳素粗品，上层为菌体以及少量蛋白，用作生物肥料；
所述溶剂为95％的乙醇或石油醚∶乙醇＝1∶5的混合溶剂。
2.如权利要求1所述利用微生物从虾壳中提取虾青素、蛋白质以及甲壳素的方法，其特征在于工艺步骤为：
一.原料处理
虾壳在经清洗、粉碎后加入质量比为1∶1～3的水进行121℃下20～30min蒸汽灭菌；
二.菌种的活化
菌种在接入发酵之前，应从保存斜面上接入活化培养基，在37℃下，活化26～32h；
三.降解发酵
以10～20％的接种量，接入到灭好菌的虾壳料中，降解过程中要保持振荡，振荡频率为170r/min；降解时间为36～40h；
四.蛋白粉、甲壳素粗品及虾青素的制备：
降解物经3000～4000r/min的离心后分离出透明的黄色液体，以及红色虾壳降解物和白色菌体沉淀；
(1)蛋白粉的制备：
液体部分通过过滤灭菌或121℃，20min的蒸汽灭菌后、浓缩，并喷雾干燥，可得到含钙丰富的虾壳蛋白粉；
(2).甲壳素粗品与生物肥料的制备：
上述离心的沉淀用溶剂进行浸泡，溶剂用量为与原料虾壳1∶1的质量比，浸泡1～3h；经离心分离，液体部分待提取虾青素；沉淀部分分为上、下两层：下层为甲壳素粗品，上层为菌体以及少量蛋白；通过40目筛网清洗，洗出物中为菌体以及少量蛋白，烘干后可作为生物肥料；筛网上留下的部分烘干可作为生产甲壳素素的原料-即甲壳素粗品；
所述浸泡沉淀的溶剂为95％的乙醇或石油醚∶乙醇＝1∶5的混合溶剂；
(3).虾青素的提取：
在(2)步骤中离心分离的液体部分减压蒸馏除有机溶剂，得粉红或橘红色虾青素。
3.如权利要求2所述利用微生物从虾壳中提取虾青素、蛋白质以及甲壳素的方法，其特征在于其工艺步骤二的菌种的活化中培养基成分为灭菌后的虾壳和无菌水。
4.如权利要求2所述利用微生物从虾壳中提取虾青素、蛋白质以及甲壳素的方法，其特征在于其工艺步骤三的降解发酵中保持通氧。
5.如权利要求2所述利用微生物从虾壳中提取虾青素、蛋白质以及甲壳素的方法，其特征在于其工艺步骤四的虾青素的提取中所述液体部分减压蒸馏除有机溶剂，其真空度为：100kp下45～55℃。
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