CN115029281A - 一种耐高温纤维素降解菌剂的制备方法及其在堆肥中应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种耐高温纤维素降解菌剂的制备方法及其在堆肥中应用。本发明以超高温(>80℃)堆肥后腐化期产品为原料，筛选和制备耐高温纤维素降解菌剂。具体地，本发明中，采用选择性培养基培养经超高温堆肥的腐熟堆肥产物，所述超高温是指堆肥温度大于80℃，并持续5天以上。采用本发明制备得到的菌剂，在堆肥过程中，能使厨余垃圾等有机固体废弃物快速升温，3天升至70℃以上，较对照处理进入高温期时间提前5天，有效提高了堆肥效率；在堆肥28天后，可以显著提高堆肥腐熟度，显著促进有机质的降解转化。

Description

一种耐高温纤维素降解菌剂的制备方法及其在堆肥中应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种耐高温纤维素降解菌剂的制备方法及其在堆肥中应用。
背景技术
好氧堆肥技术是实现有机固体废弃物无害化和肥料化利用的有效方式。然而传统好氧堆肥存在腐熟周期长、二次污染、产品品质较差等问题，严重限制了该技术的发展与推广。超高温堆肥技术可加速物料有机质降解，提升堆肥温度，缩短堆肥周期，提高堆肥腐熟度。目前超高温堆肥构建方式主要分为三种：堆肥前期添加腐熟物料、堆肥前期直接添加超嗜热菌剂、堆肥前期进行高温预处理，每一种方式之间优缺点各不相同，其中添加超嗜热菌剂方法具有操作简单、耗能低、效果稳定等优点，但是人工筛选和培养的嗜热菌有限。
农作物秸秆作为农业固体废弃物的重要组成部分，含有大量的纤维素(35％～50％)、半纤维素(10％～30％)和木质素(10％～36％)，这些木质纤维素在堆肥过程中分解速度十分缓慢，可能导致堆肥效率低、堆肥产品质量不佳，进一步影响作物生长。因此，纤维素降解速率是影响堆肥效率的关键。已有研究报道，纤维素的分解主要发生在堆肥高温期，高温对于纤维素的降解有促进作用，主要是由于高温可作为预处理加速破坏秸秆纤维素的结晶度，使其结构疏松，加快纤维素的降解速率。通过添加嗜热菌剂可使堆肥达到超高温，并且外源微生物可能加速堆肥中纤维素的降解。因此，高温纤维素降解菌将有利于堆肥温度的提升、缩短堆肥周期、促进纤维素的降解以及提高堆肥产品的腐熟度。但是耐高温纤维素降解菌较为缺乏，需要进一步在富含纤维素的高温体系中进行筛选。
因此，如何提高有机废弃物好氧堆肥过程中纤维素等有机质的降解率，进而缩短堆肥周期是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐高温纤维素降解菌剂的制备方法及其在堆肥中的应用。
第一方面，本发明提供一种耐高温纤维素降解菌剂的制备方法，采用选择性培养基培养超高温堆肥体系后熟化期的产物，获得所述菌剂；所述超高温堆肥体系是指堆肥温度大于80℃，并持续5天以上。
在本发明提供的制备方法中，所述超高温堆肥的原料包括有机物料和辅料；优选地，所述有机物料包括畜禽粪便、厨余垃圾，所述辅料包括农作物秸秆、园林剪枝、稻壳、锯末。
更具体地，本发明中超高温堆肥体系应为大仓工程试验，初始含水率为60％～70％，碳氮比为15～25，在0.2～0.6L·kg-1DM·min-1的强制通风下，所述超高温堆肥体系后熟化期的产物，为超高温堆肥体系发酵10～30天得到超高温堆肥产品。
现有技术中纤维素降解菌剂及菌剂制备原料的缺点在于：1)使用常规堆肥原料或常规好氧堆肥产品(产物)作为菌剂制备原料，制备的菌剂通常不具有耐高温的特点；2)由于纤维素的降解主要集中在腐熟期，采用(超)高温堆肥的高温期堆肥产品作为菌剂制备原料，存在纤维素降解菌种不丰富或活性较低的问题；3)从极端环境(温泉、火山口等)制备的高温菌剂在堆肥的复杂体系中具有适应性差等问题。
本发明以超高温堆肥后熟化阶段的产物作为筛选原料，由此获得的菌剂同时具有耐高温、纤维素降解率高和适应性强等特点。
本发明提供的制备方法中，所述选择培养基为滤纸富集培养基，采用滤纸富集培养基对超高温堆肥体系后熟化期产物进行三次及以上的传代培养，获得所述耐高温纤维素降解菌剂。
在本发明所提供的制备方法中，所述滤纸富集培养基的配方包括：蛋白胨、酵母粉、NaCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、滤纸和微晶纤维素。
在本发明所提供的制备方法中，可以选择进一步采用羧甲基纤维素钠固体培养基在50～80℃下纯化所述菌剂中的菌株；所述羧甲基纤维素钠固体培养基的配方包括：羧甲基纤维素钠、酵母粉、(NH4)2SO4、K2HPO4·3H2O、NaCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O和琼脂。
在本发明所提供的制备方法中，可以选择进一步通过拮抗试验选择菌剂中无拮抗作用的菌株，复配得到耐高温纤维素降解菌剂。
根据本领域技术人员的理解，本发明请求保护，上述的制备方法在耐高温纤维素降解菌株筛选和菌剂制备过程的应用。
第二方面，本发明请求保护一种由上述制备方法得到的菌剂。
本发明还请求保护，上述的制备方法或上述的菌剂，在提高堆肥温度和有机质降解率、提高堆肥中厚壁菌门含量中的应用。
第三方面，本发明提供一种耐高温纤维素降解菌剂在好氧堆肥中的应用方法，采用上述的菌剂应用于富含纤维素的物料进行好氧堆肥。
在本发明提供的方法中，以质量计，菌剂的添加量为堆肥原料的2％-5％；所述堆肥原料包括有机物料和辅料；所述有机物料包括畜禽粪便、厨余垃圾，所述辅料包括农作物秸秆、园林剪枝、稻壳、锯末。
更具体地，本发明提供的菌剂应用方法包括：菌剂添加至堆肥初期，菌液添加量为湿重比2％～5％，分多次加入堆体，与有机物料均匀混合，混合物料含水率为60％～70％，碳氮比为15～25，好氧堆肥通风速率为0.2L·kg-1DM·min-1。
本发明的有益效果在于：
(1)通过本发明所提供的制备方法获得耐高温纤维素降解菌剂，所得到的菌剂具有较好的纤维素降解效果；
(2)添加本发明所提供的高温纤维素降解菌剂，能使堆体快速升温，3天升至70℃以上，较对照处理快5天；在堆肥28天后，可以显著提高堆肥腐熟度，添加菌剂处理(103.58％)的种子发芽指数显著高于对照处理(47.55％)；
(3)在堆肥过程中，添加本发明提供的纤维素高温降解菌剂可以显著促进有机质的降解转化，添加菌剂组有机质的降解率(19.63％)显著高于对照处理(13.79％)。
附图说明
图1为本发明菌株的秸秆降解率和菌落直径比。
图2为本发明菌株的纤维素酶活。
图3为猪粪、厨余垃圾与玉米秸秆好氧堆肥过程中的温度变化。
图4为猪粪、厨余垃圾与玉米秸秆好氧堆肥过程中的种子发芽指数。
图5为猪粪、厨余垃圾与玉米秸秆好氧堆肥过程中的有机质含量。
图6为猪粪、厨余垃圾与玉米秸秆好氧堆肥过程中门水平(a)和属水平(b)的微生物群落结构变化。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1用于菌剂制备的原料
本实施例提供一种用于菌剂制备的原料，如下：
本实施例在南宫堆肥厂进行大仓工程试验，以厨余垃圾和园林剪枝为堆肥原料(按4:1混合)，原始含水率为65％，碳氮比为22，通风速率约为0.1m3/(m3·min)，整个堆肥周期设置为25天，其中第1至10天为高温发酵阶段在发酵仓内进行，第10至25天为后熟化阶段，物料转移至后熟化区，堆肥过程最高温度超过80℃，并持续5天，获得用于菌剂制备的原料。
实施例2菌剂制备方法
本实施例提供菌剂制备方法，步骤如下：
以实施例1得到的超高温堆肥体系后熟化阶段堆肥产品(产物)作为原料，在50℃下进行耐高温纤维素降解菌剂的制备，具体步骤如下。
取2g(超)高温堆肥样品(实施例1所得)于100mL无菌水中，在170r·min-1摇床中振荡1h后静置30min。吸取10mL上清液加入到含有90mL滤纸富集培养基中，置于50、60、70℃下100r·min-1振荡培养，观察滤纸富集培养基降解情况，根据滤纸降解时间取10％(v/v)转接至新的滤纸富集培养基中培养，其中滤纸富集培养基的组成为：蛋白胨1g，酵母粉1g，NaCl0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O 0.025g，MnSO4·4H2O0.025g，微晶纤维素10g，滤纸条，水1000mL。
采用滤纸培养基作为选择培养基，连续富集驯化3次，获得可用于高温堆肥消化纤维素的耐高温纤维素降解菌剂。
实施例3菌剂效果验证
对实施例2筛选得到的耐高温纤维素降解菌剂进行验证，将得到的菌剂用无菌水梯度稀释后，取适当稀释倍数的均具100μL涂布于羧甲基纤维素钠固体培养基上，每个稀释度三个重复，置于相对应温度培养箱中培养2d，待生长旺盛后用1mg·mL-1刚果红染色剂染色20min后，将染液弃去，加入1mol·L-1氯化钠溶液，洗涤1～2min，保留降解圈较大的纤维素降解菌，得到菌剂中起主要作用的菌株。其中CMC-Na培养基的组成为：羧甲基纤维素钠10.0g，酵母粉1.0g，(NH4)2SO4 2.5g，K2HPO4·3H2O 0.25g，NaCl 0.1g，MgSO4·7H2O 0.125g，FeSO4·7H2O 0.025g，MnSO4·4H2O 0.025g，琼脂10g，水1 000mL。
在较大降解圈中获得纤维素降解菌，进一步通过平板划线法纯化共获得5株纯菌，见表1。Pseudoxanthomonas taiwanensis strain(GWⅠ)、Bacillus licheniformis strain(GWⅡ)、Bacillus haynesii strain(GWIII)、Chelatococcus composti strain(GWIV)和Streptomyces thermodiastaticus strain(GWV)。
表1高温50℃下纤维素降解菌株鉴定结果
Figure BDA0003738126170000061
将菌剂中的菌株进行纤维素降解性能鉴定，测定其纤维素降解率和纤维素酶活。并且，通过拮抗实验表明菌剂中菌株两两之间没有拮抗作用。本发明可以通过LB培养基将实施例2所得菌剂中的菌株进行扩增至最大生物量，制备得到一种耐高温纤维素降解菌剂。其中LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，水1 000mL。
菌株降解性能鉴定：水稻秸秆的相对降解率测定方法为接种10％(v/v)过夜培养的初筛菌株，在富集培养基中培养6～8h至对数期备用(OD600＝0.5～0.6)。接种1％(v/v)对数期菌液150mL产酶培养基(±3.00g水稻秸秆条)，分别置于50℃，150r·min-1恒温培养7d后，获得不同降解程度的秸秆残渣，根据公式计算降解率。纤维素降解圈的测定：在CMC-刚果红培养基平板中心接种10μL菌悬液，分别置于对应筛选温度恒温培养48h，测定水解圈直径(D)和菌落直径(d)，计算水解圈直径与菌落直径比(D/d)。纤维素酶活的测定使用DNS比色法。
图1表明，将本实施例五株菌的菌液加入以秸秆为唯一碳源培养基中，经过一个星期的时间，五株菌的秸秆降解率分别为12.40％、15.49％、14.81％、14.94％和14.24％；菌落直径比大表示菌株水解羧甲基纤维素的能力强，且五株菌的比值均大于1，表明其具有较强的纤维素降解能力。
图2表明，五株菌的纤维素酶活，包括全酶活、外切酶、内切酶和葡萄糖苷酶。这五株菌表现出相同的酶活规律，其产生外切酶酶活最低，但整体上体现这五株菌能够产生大量纤维素降解酶，具有较好的纤维素降解效果。
从图1和图2均可以看出从厨余垃圾与园林废弃物堆肥产品中所筛选出来的纤维素高温降解菌株具有较高的纤维素降解能力。
实施例4菌剂堆肥应用
本实施例提供，采用实施例2得到的菌剂进行堆肥降解纤维素的应用。
效果验证试验中所用的厨余垃圾取自北京市大工村转运站，猪粪取自畜禽分中心昌平试验基地，玉米秸秆取自中国农业大学上庄试验站，经前处理风干并机械粉碎至1～5cm。试验共设2个处理(对照处理和添加菌剂处理)，通过玉米秸秆的添加调节初始物料至不同的碳氮比为20左右，通过添加水调节初始物料至不同的含水率60％，通风速率为0.2m3·h-1。目的是研究添加高温纤维素降解菌剂，对堆肥温度和腐熟度的影响。原料初始性状如表2所示。
表2初始物料物理化学性质
Figure BDA0003738126170000071
注：含水率和密度以湿基计算；TC和TN均为干基含量。
所有处理在60L的密闭堆肥发酵装置中进行好氧堆肥。试验共28天，堆肥过程中每隔7天进行一次人工翻堆取样。在实验开始、结束以及每次翻堆后采集固定样品约200g，分2部分保存。一部分为新鲜样品保存于-20℃，用于测定含水率和种子发芽率指数和微生物群落结构；另一部分自然风干，粉粹后过0.5mm筛，用于测定有机质含量。
各个指标测定方法：发芽率指数测定方法参考文献；微生物群落结构送至美吉公司测定；有机质含量采用马弗炉灼烧法，在550℃灼烧6h至恒重；堆肥温度由Testo温度自动记录仪连续监测。
图3表明，从堆肥过程中的温度可以看出，添加纤维素降解菌剂可以在堆肥初期显著提高堆体的温度，有利于堆体中有机物质的转换，加速堆肥的腐熟进程，且纤维素高温降解菌剂可以促进堆体中纤维素的降解，提高堆体中纤维素的降解率。
图4表明，在堆肥28天以后，堆体的种子发芽指数呈现上升趋势，最终添加菌剂处理(103.58％)的种子发芽指数高于对照处理(47.55％)，表明添加纤维素高温降解菌剂可以显著提高堆肥的腐熟度。
图5表明，在堆肥过程中，有机质含量呈现降低趋势，添加高温纤维素降解菌剂有机质的降解率(19.63％)显著高于对照处理(13.79％)，表明添加纤维素高温降解菌剂可以显著促进有机质的代谢。
图6表明，高温纤维素降解菌剂的添加会对堆肥过程的微生物群落结构产生冲击，对微生物群落结构具有重塑作用。由于菌剂组的温度更高，因此在第7天菌剂组中厚壁菌门含量较对照组更高。在菌剂组显著增高了thermoactinomycetaceeae的丰度，可代谢产生多种耐高温酶系(如α-淀粉酶、丝氨酸蛋白酶、脂肪酶等)，这也解释了菌剂组较高有机质降解率的原因。
从图3、图4和图5均可以看出，通过添加高温纤维素降解菌剂可以促进堆体快速升温，加快有机物质的降解，并且可以提高堆体的腐熟度；图6中可以看出，添加本发明提供的高温纤维素降解菌剂会对堆肥微生物群落结构产生重塑作用，对堆肥过程有机质降解、腐熟度等产生正面影响。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种耐高温纤维素降解菌剂的制备方法，其特征在于，采用选择性培养基培养超高温堆肥体系后熟化期的产物，获得所述菌剂；所述超高温是指堆肥温度大于80℃，并持续5天以上。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超高温堆肥体系为工厂化堆肥，堆肥原料为有机物料和辅料，超高温堆肥体系初始含水率为60％～70％，碳氮比为15～25，通风速率为0.2～0.6L·kg-1DM·min-1，堆肥周期为10～30天；
所述有机物料为畜禽粪便或厨余垃圾；所述辅料为农作物秸秆、园林剪枝、稻壳、锯末。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述选择培养基为滤纸富集培养基，采用滤纸富集培养基对超高温堆肥体系后熟化期产物进行三次及以上的传代培养，获得所述耐高温纤维素降解菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述滤纸富集培养基的配方包括：蛋白胨、酵母粉、NaCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、滤纸和微晶纤维素。
5.权利要求1～4任一所述的制备方法在耐高温纤维素降解菌筛选或耐高温纤维素降解菌剂制备中的应用。
6.一种菌剂，其特征在于，由权利要求1～4任一项所述制备方法制备得到。
7.权利要求1～4任一项所述的制备方法或权利要求6所述的菌剂，在提高堆肥温度和有机质降解率、提高堆肥中厚壁菌门含量中的应用。
8.一种降解纤维素物料的方法，其特征在于，将权利要求6所述的菌剂应用到含有纤维素的物料进行好氧堆肥。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，以质量计，菌剂的添加量为堆肥原料的2％-5％；所述堆肥原料包括有机物料和辅料；所述有机物料包括畜禽粪便、厨余垃圾，所述辅料包括农作物秸秆、园林剪枝、稻壳、锯末。
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