CN108795796A - 含解淀粉芽孢杆菌的低温降解秸秆微生物复合菌剂及应用 - Google Patents

含解淀粉芽孢杆菌的低温降解秸秆微生物复合菌剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种含解淀粉芽孢杆菌的低温降解秸秆微生物复合菌剂，所述复合菌剂由6株菌株构成，在室外温度1℃‑6℃的环境下使玉米秸秆腐熟天数提高了2‑3天，特别适合北方地区。本发明的复合菌剂具有较强的刺激代谢产物的生产能力，可分泌植物生长激素，促进植物生长；可分泌植酸酶和有机酸，降解土壤中植酸及矿质磷；可以产生多种抑菌相关的代谢产物，对真菌和细菌都具有强烈的抑制作用。复合微生物在土壤中产生协同作用，彼此互补，有效地改良土壤结构，提高土壤肥力，增加产量。

Description

含解淀粉芽孢杆菌的低温降解秸秆微生物复合菌剂及应用
技术领域
本发明涉及一种微生物领域，具体涉及一种含解淀粉芽孢杆菌的低温降解秸秆微生物复合菌剂及其应用。
背景技术
玉米秸秆是供作饲料为主的粮、经、饲兼用作物，玉米秸秆也是工、农业生产的重要生产资源。作为一种，玉米秸秆含有丰富的营养和可利用的化学成分，可用作畜牧业饲料的原料。大量研究表明，秸秆还田能够有效增加土壤有机质含量，改良土壤，培肥地力，对于缓解中国土壤氮、磷、钾肥比例失调的矛盾具有十分重要的意义。但由于中国人口多耕地少，耕地复种指数高，倒茬时间短，加之秸秆碳氮比值高，给秸秆还田带来困难，且效果较差。因此通过秸秆处理将其制成有机肥，是一项能源环保双赢的技术。
秸秆的资源化处理包括有物理法、化学法和生物法，而前两类方法处理成本高，且易造成二次污染，因此目前大多采用微生物处理法。微生物处理法就是把秸秆通过添加特定的秸秆分解菌剂，在田间常温的条件下，加速秸秆的腐解和转化。秸秆资源通过微生物分泌的细胞壁降解相关酶的分解成葡萄糖、木糖、纤维二糖、可溶性的寡糖，是大多数生物优先利用的碳源营养物质而被直接高效地转化利用。环境中的微生物具有增殖速度快、功能丰富多样、适应性强等特点，应用微生物学方法腐解处理秸秆具有许多其他物理化学方法不可替代的优点，应用前景广阔。因此，从自然界筛选到具有高效秸秆降解能力的菌株十分重要。目前，秸秆降解微生物的研究主要集中在细菌和真菌上，由于北方的气温长期很低，秸秆在短期内不易腐解，导致秸秆资源长期没有得到合理的开发。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含解淀粉芽孢杆菌的低温降解秸秆微生物复合菌剂，通过低温驯化6株菌株，按一定配比混合而成，尤其适合北方低温天气，对腐熟秸秆效果优异。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种含解淀粉芽孢杆菌的低温降解秸秆微生物复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂含有 6株菌株并按一定质量比混合，产纤维素酶类芽孢杆菌20％、产木聚糖酶链格孢菌10％、产漆酶疣孢漆斑菌20％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10％、解淀粉芽孢杆菌30％，
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)CGMCC 1.15312；
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria humicola)CGMCC 3.2917；
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)GIM 1.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella tengchongensis)
CCTCC AA 208050 Laceyella；
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC 1.281；
所述菌株均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和广东省微生物保藏中心(GIM)购买得到。
所述产漆酶疣孢漆斑菌为(Myrothecium verrucaria)突变菌株T2901，是本实验室从长白山采集土壤样品中分离筛选并突变得到的，其已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期是2017年7月5日，保藏号是CCTCCNO:M2017413。
一种解淀粉芽孢杆菌的低温下有效降解秸秆的复合菌剂，是通过以下技术路线实现：富集培养各菌株、低温降解纤维素复合菌系的筛选及驯化、复合菌剂的混合、复合菌剂对秸秆的降解。
更具体地，将产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、解淀粉芽孢杆菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/mL，将菌液按照以下质量比混合：产纤维素酶类芽孢杆菌20％、产木聚糖酶链格孢菌10％、产漆酶疣孢漆斑菌20％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10％、解淀粉芽孢杆菌30％，进行充分搅拌混合获得混合菌液。
上述复合菌在降解秸秆中的应用。
本发明获得的有益效果：
本发明提供的一种含解淀粉芽孢杆菌的低温降解秸秆微生物复合菌剂，所述复合菌剂由 6株菌株构成，在室外温度1℃-6℃的环境下使玉米秸秆腐熟天数提高了2-3天，特别适合北方地区。将本发明的复合菌剂与玉米秸秆混合腐熟还田对种植土豆效果较好，与对照组相比土豆叶片浓绿，收货期提前10天，产量增加624kg每亩，病虫害发生率降低5.3％。本发明的复合菌剂以及大量的含解淀粉芽孢杆菌的添加，具有较强的刺激代谢产物的生产能力，可分泌植物生长激素，促进植物生长；可分泌植酸酶和有机酸，降解土壤中植酸及矿质磷；可以产生多种抑菌相关的代谢产物，对真菌和细菌都具有强烈的抑制作用。复合微生物在土壤中产生协同作用，彼此互补，有效地改良土壤结构，提高土壤肥力、保持土壤水分和营养，降低土壤pH值和含盐量，促进作物吸收氮、磷、钾等大量必须元素以及中微量元素，显著提高土豆的抗病性，同时能促进土豆生长，增加产量。
实施例1疣孢漆斑菌的诱变筛选
(1)形态鉴定及筛选
采集长白山自然保护区林区土壤，常规方法在PDA培养基上培养，菌株菌丝起初呈现白色絮状，向外周发散生长，菌落近似不规则圆形，在平板上生长5d后有分生孢子座出现，分生孢子最初呈现墨绿色，培养8d后，分生孢子颜色继续加深，并出现胶點团；培养10d后，菌落呈同心轮纹状，分生孢子胶點团呈现黑色，菌落背面出现淡褐色发射状褶皱。
用打孔器打取直径为1cm的菌块，接种到苯胺蓝选择培养基上，于需氧培养箱中30℃条件下培养10d，观察苯胺蓝褪色情况，挑选褪色速率快，能力强的菌株为候选菌株。
同时为了定向性筛选降解木质素的菌株，设计培养基以木质素为唯一碳源的液体发酵培养基，通过单一碳源的限定，测定木质素的去除率，选择在木质素培养基中涨势良好，且对木质素有一定去除能力的菌株进行后续玉米秸秆的预处理试验。
(2)菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子分类
在确定性状稳定后将菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，鉴定结果此种菌株为疣孢漆斑菌T2901。
(3)菌株的诱变及筛选
突变株的制备主要采用的是常压室温等离子体诱变(ARTP)法，用疣孢漆斑菌T2901 制备孢子悬浊液。而后进行稀释，调整孢子浓度为107/mL，取10μL稀释好的菌悬液滴于 ARTP的载片上，进行诱变，用ARTP诱变育种系统4mm射距照射，最佳诱变时间为75s。
将稀释的菌悬液均匀涂布到愈创木酚选择性培养基(愈创木酚浓度为0.4％加入PDA培养基中)上，于需氧培养箱中30℃条件下培养10d，观察变色圈情况，挑选变色圈的大的菌株为候选菌株。正向突变株T2901漆酶活力较野生型菌株提升约50％，经多次传代培养，菌株T2901可稳定遗传。
实施例2菌株的低温驯化
(1)富集培养菌株
将菌株接种到盛有150mL PDA培养基的三角瓶中，加入大小均为长度5cm，宽度2cm的滤纸片，30℃恒温震荡培养1h混匀，并将上清液做10-1-10-9稀释，各取1mL稀释液接种在滤纸为唯一碳源的PDA培养基里，28℃静止富集培养4代。筛选出滤纸断裂时间短、溃烂程度高的材料。PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L
天然玉米秸秆粉摇床培养：称取菌种来源样品5g加入以天然玉米秸秆粉为唯一碳源的100mL玉米秸秆粉培养基(将PDA培养基中滤纸用玉米秸秆粉替代中，28℃150rpm培养，15d吸取5mL培养液转入新的玉米秸秆粉富集培养基，富集培养4代。
(2)低温降解纤维素复合菌系的初筛及驯化
采用滤纸崩解法，上述富集培养物接种到滤纸条培养基中驯化低温纤维素分解菌系，初始培养温度为28℃，在该温度下继代培养4代，选择滤纸溃烂程度高的、断裂时间短，pH接近中性的培养物继续传代。每继代培养一次培养温度降低2℃，直至培养温度降低至4℃，通过观察滤纸的断裂情况判断培养物的纤维素分解能力，传代的同时挑选出降解能力保持较好的培养物，在驯化过程中，在4℃温度条件下连续培养8代，滤纸条断裂时间一致时停止低温驯化。
经过初步的低温驯化，结果在4℃条件下，得到的6株菌生长较好，说明其能够在低温条件正常生长。
该6株菌株为：产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、解淀粉芽孢杆菌，
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)CGMCC 1.15312；
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria humicola)CGMCC 3.2917；
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)GIM 1.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella tengchongensis)CCTCC AA208050 Laceyella；
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC 1.281；
所述菌株均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和广东省微生物保藏中心(GIM)购买得到。
所述产漆酶疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)突变菌株T2901，是本实验室从长白山采集土壤样品中分离筛选并突变得到的，其已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年7月5日，保藏号是CCTCC NO:M2017413。
实施例3复合菌剂的制备
将产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、解淀粉芽孢杆菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/ml。
将菌液按照以下质量比混合：产纤维素酶类芽孢杆菌20％、产木聚糖酶链格孢菌10％、产漆酶疣孢漆斑菌20％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10％、解淀粉芽孢杆菌30％，进行充分搅拌混合获得混合菌液。
实施例4秸秆的降解
实验地点选在吉林省吉林农大试验田中，昼夜温度为1℃-6℃，将玉米秸秆收获后将秸秆铺于实验田中，添加本发明复合菌剂，实验田按照每亩施用1.6kg实施例1制备的菌剂，对照组则不用秸秆发酵复合菌剂，然后灌水，观察秸秆腐熟,变化情况：
表1不同处理的秸秆腐熟情况
结果表明，与未添加复合菌剂相比，复合菌剂能将秸秆降解腐熟时间提前到8-9天，即使在1℃到6℃的低温天气也能使秸秆有效腐熟，十分适合北方天气。
实施例5复合菌处理玉米秸秆后还田种土豆
实验地点选在吉林省吉林农大试验田中，将玉米秸秆粉粹至2-3cm，秸秆与复合菌剂按质量比800：1混合，堆肥6天得到微生物有机肥，作为基肥一次性施入，施用量1200kg/亩，栽种土豆苗后，加入常规氮磷化肥作为追肥，每次追肥10kg/亩，整个植物生长期和土豆成熟期追肥5次，对照组与实验组加入等量的玉米秸秆，并用加等量的常规氮磷化肥作追肥。每隔4天对棚内的室温、叶子和果实生长情况进行数据测试记录，结果如表2：
表2
试验结果表明，将本产品与常规化肥混合施入土壤后，植物叶片浓绿，收货期提前10 天，产量增加624kg每亩，病虫害发生率降低5.3％。本发明的复合菌剂以及大量的含解淀粉芽孢杆菌的添加，具有较强的刺激代谢产物的生产能力，可分泌植物生长激素，促进植物生长；可分泌植酸酶和有机酸，降解土壤中植酸及矿质磷；可以产生多种抑菌相关的代谢产物，对真菌和细菌都具有强烈的抑制作用。复合微生物在土壤中产生协同作用，彼此互补，有效地改良土壤结构，提高土壤肥力、保持土壤水分和营养，降低土壤pH值和含盐量，促进作物吸收氮、磷、钾等大量必须元素以及中微量元素，显著提高土豆的抗病性，同时能促进土豆生长，增加产量。

Claims (2)

1.一种含解淀粉芽孢杆菌的低温降解秸秆微生物复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂含有6株菌株将菌液按照以下质量比混合，产纤维素酶类芽孢杆菌20%、产木聚糖酶链格孢菌10%、产漆酶疣孢漆斑菌20%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10%、解淀粉芽孢杆菌30%。
2.如权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于：
所述产纤维素酶类芽孢杆菌（Bacillus cellulosilyticus） CGMCC 1.15312；
所述产木聚糖酶链格孢菌（Alternaria humicola ）CGMCC 3.2917；
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌（Bacillus mucilaginosus Krassilnikov）GIM1.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌（Laceyella tengchongensis ）
CCTCC AA 208050 Laceyella；
所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）CGMCC 1.281 ；
所述产漆酶疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）突变菌株T2901，保藏号是CCTCCNO:M2017413。
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