CN101086000A

CN101086000A - 固定化酶催化合成egcg脂肪酸酯的方法

Info

Publication number: CN101086000A
Application number: CN 200710065416
Authority: CN
Inventors: 王芳; 马习东; 谭天伟; 邓利; 聂开立
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2007-04-13
Filing date: 2007-04-13
Publication date: 2007-12-12

Abstract

一种固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法属于酶催化领域。该方法采用以儿茶素EGCG单体和含2－18个碳原子的脂肪酸或脂肪酸乙烯酯为原料，按摩尔比为1∶1－10，与筛选的有机溶剂和固定化脂肪酶混合，酶的用量是EGCG质量的0.5－3倍，在30－50℃的条件下，反应36－200小时。取出催化剂，反应液经过滤、减压浓缩、脱溶剂干燥等步骤得到EGCG脂肪酸酯。本发明使用固定化脂肪酶，具有选择性好，反应温和的特点。反应转化率高，反应溶剂无毒性。得到的脂溶性EGCG脂肪酸酯组分明确，单取代产物含量高，抗氧化品质好，其分子结构维持儿茶素EGCG的结构特征，具有较好的稳定性。

Description

固定化酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法

技术领域

本发明涉及一种固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，特别是在非水相体系中用固定化微生物脂肪酶催化反应合成EGCG脂肪酸酯的方法，属于酶催化领域。

背景技术

绿茶中的茶多酚因具有极强的自由基清除能力和抗氧化活性，在食品、化妆品等工业中得到了广泛的应用，是一种不可多得的天然抗氧化剂。同时，茶多酚具有防癌抗癌、抗衰老、抗辐射、降血糖、血脂等重要的生理药理功能。茶多酚及其衍生物的开发利用在国内外引起了极大关注，多篇文献和发明专利公开了其作为抗氧化剂、抗癌、抗病毒药物的应用。茶多酚中大部分为儿茶素，其中以表没食子儿茶素-3-6-没食子酸酯(EGCG)的含量为最高。然而，茶多酚较差的脂溶性使其应用的范围受到限制。通过改性的方式改变其溶解性、增强稳定性可以有效提高其应用面。改性方式可归类为溶剂法、乳化法和分子修饰法。大量的研究和应用实践表明溶剂法和乳化法存在很多的缺陷，如溶剂挥发、溶剂安全、稳定性差的等。最直接有效的办法是分子修饰法，就是在这些化合物中增加如脂肪酸或甘油酯等的亲油部分，这样可以显著调节这些水溶性天然化合物的脂相溶解度，而且其产品也可以直接水解做进一步代谢，其生物生理活性不受影响，而且可以引入有效的营养成分(如多不饱和脂肪酸)。

国内外已经有化学法改性茶多酚儿茶素的研究。如《精细化工》，19(2)，2002，通过茶多酚与脂肪酰氯反应，制备了一系列含不同直链脂肪基团的脂溶性茶多酚。表明当脂肪链的碳原于数＞10时，脂溶性茶多酚在色拉油中的溶解度是茶多酚的2000倍以上。专利CN1197786A和CN1263083A报道的将水溶性茶多酚改性成脂溶性茶多酚，但由于反应过程中的强酸性环境，无法控制诸如“红粉”的缩合物生成，因而影响产品的抗氧化效果。专利CN1448395A报道采用碳酸氢钠、碳酸氢钾以及金属催化剂，降低反应温度等方式解决以上的问题。但化学合成普遍采用高温、强氧化剂、强活性化学催化剂和化学试剂，例如以上的方法使用的脂肪酸酰氯性质不稳定，制备条件严苛复杂。特别是对产品的质量不利，得率低，产物的结构复杂，反应的选择性不高，产物单体分离困难，生物生理活性可能丧失，甚至有毒害产品形成。

近20年来，非水相酶促合成有了长足的发展，酶不仅可以应用于水解，在非水相中也可以用于合成。酶法合成比化学法的专一性强，产物定向。而且酶的价格也随着生物技术的迅速发展而显著下降，使工业应用不仅从量产而且从经济方面都成为可能。

脂肪酶，是一类特殊的酰基水解酶，能在油-水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交换、内酯合成、多肽合成、高聚物合成及立体异构拆分等有机合成反应。根据脂肪酶的催化机理：第一步中，脂肪酶和酰基底物形成一个中间复合物；第二步，亲核试剂(醇、水、胺类等)进攻中间复合物的酰基碳，形成产物，同时作为催化剂的酶重新释放出来。

脂肪酶催化酯合成的研究多集中在直链醇和直链酸之间的反应，反应较易发生。而对于本专利的目标物EGCG来说，由于其独特的酚羟基结构和三个苯环结构的存在，在攻击中间复合物的过程中，很难形成酰基碳。酰基底物的选择是一个难点，要保证中间复合物有较强的反应活性。

另外EGCG具有极强的水溶性，在与脂溶性较强的油脂反应时，溶剂的选择也是一个难以平衡的矛盾。脂肪酶非水相催化选择的溶剂常用依据，即常选择的弱极性类溶剂不适合这一特定目标的反应。不同极性溶剂的选择影响着底物的传质。

酶的存在形式也影响着反应的发生和催化特性。由于游离酶对环境十分敏感，目前酶催化反应常使用固定化形式酶。但不同形式的固定化商业脂肪酶不仅影响着酶活力和底物的传质，最终影响着反应的发生和转化率的高低。

天然酚型或酸型生物活性化合物的酶促合成报道不多，对EGCG的酶促改性还未见文献报道。

发明内容

本发明克服了化学催化剂合成EGCG酯方法的缺点，提供了一种在非水相体系中用固定化微生物脂肪酶催化反应合成EGCG脂肪酸酯的方法。

本发明采用反应活性较高的脂肪酸乙烯酯作为酰基供体，解决了脂肪酶催化EGCG酚羟基反应困难的问题。本发明选择极性较强的溶剂作为反应介质，增大了底物的溶解度，利于反应物之间的传质，加快了反应的历程，且反应溶剂无毒性。本发明采用了新型的固定化脂肪酶，较之于多数的商业化脂肪酶更利于反应的转化，提高了反应转化率。该方法的选择性好，反应温和，产品基本上为单取代产物，产品质量好，分离纯化简单。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于，由以下步骤依次进行：

以天然儿茶素EGCG单体和含2-18个碳原子的脂肪酸或脂肪酸乙烯酯为原料，EGCG与脂肪酸或脂肪酸乙烯酯按摩尔比为1∶1~10，与有机溶剂和固定化脂肪酶混合，固定化脂肪酶的用量是EGCG质量的0.5-5倍，在30-50℃的条件下，反应36-200小时，取出固定化脂肪酶，反应液经过滤、减压浓缩、脱溶剂干燥得到EGCG脂肪酸酯；所述的固定化脂肪酶以硅藻土、树脂或纺织品膜为载体，载体上有酵母类脂肪酶。所得的EGCG脂肪酸酯产物为白色或棕黄色粉状的固体。

所述的脂肪酸和脂肪酸乙烯酯为乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕搁酸、硬脂酸、油酸、乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、肉豆蔻酸乙烯酯、棕搁酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯或油酸乙烯酯。

所述的酵母类脂肪酶为解酯假丝酵母脂肪酶或南极甲丝酵母脂肪酶。

所述的纺织品膜为绵、尼龙、丝绸、聚酯或纤维素的纺织布。

所述的反应媒体有机溶剂为乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、二甲氧基甲烷、二乙氧基甲烷、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丙基酮、甲基异丁基酮中的一种或其组合。

所述的反应介质有机溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃、丙酮等极性较强溶剂中的任一种。有机溶剂的加入量保证溶解EGCG单体即可，没有严格的要求。

本发明的EGCG脂肪酸酯组成为表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-4’-O-脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-3’(5’)-O-脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-5-O-脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-7-O-脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-4’，7-O-二脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-4’，5-O-二脂肪酸酯、表没食于儿茶素-3-O-没食子酸-3’(5’)，7-O-二脂肪酸酯、表没食于儿茶素-3-O-没食子酸-3’(5’)，5 O-二脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-5，7-O-二脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-3’(5’)，4’-O-二脂肪酸酯等化合物中的任一种或任意种以任意比例组合。主要组成成分为表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-4’-O-脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-3’(5’)-O-脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-5-O-脂肪酸酯、表没食子儿茶素-3-O-没食子酸-7-O-脂肪酸酯等几种单取代产物。

本发明的固定化脂肪酶的制备方法是用酵母类脂肪酶的水溶液按1000-30000单位/克活化载体与活化载体浸泡、混合、室温晾干，制得酶活为6000-8000IU/g的固定化脂肪酶。

本发明制备的EGCG乙酸酯，油脂过氧化值试验表明，EGCG乙酸酯应用于食用植物油中，其添加量为100-200ppm，抗氧因子高，其抗氧化活性比BHA、BHT更强(参见图1)。过氧化值按照GB/5538-2005/ISO 3960：2001的方法测定。

本发明可应用在包括医药、化妆品、食品以及饲料等领域，也适用于其他各种作为抗氧化剂添加使用的场合。本发明采用了新型的固定化脂肪酶，使用无毒性的反应溶剂，反应转化率高，固定化脂肪酶和反应溶剂都容易回收重复使用，有利于连续化生产。该反应的选择性好，产品单取代产物比率高(参见图4)。产品质量好，分离纯化简单。其分子结构测定结果显示仍维持儿茶素EGCG的结构特性(如图2，3)，具有较好的稳定性。

附图说明

图1：EGCG乙酸酯抗氧化效果与几种抗氧化剂的比较

图2：EGCG的¹H-NMR表征

图3：EGCG乙酸酯的¹H-NMR表征

图4：EGCG乙酸酯的LC-MS联用紫外和MS检测图

具体实施方式

实施例1

取EGCG单体1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml乙酸乙酯中，加入固定化脂肪酶0.5g，在温度30℃的条件下，摇床中(180r/min)，反应120小时，EGCG转化率为20％；取出固定化脂肪酶，反应液经过过滤、减压浓缩、脱溶剂干燥得到棕黄色粉状EGCG乙酸酯0.24g。

实施例2

取EGCG单体1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml乙酸乙酯中，加入固定化脂肪酶1g，在温度40℃的条件下，摇床中(180r/min)，反应约120小时，EGCG转化率为25％；取出固定化脂肪酶，反应液经过过滤、减压浓缩、脱溶剂干燥得到棕黄色粉状EGCG乙酸酯0.30g。

实施例3

取EGCG单体1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml四氢呋喃中，加入固定化脂肪酶2.0g，在温度40℃的条件下，摇床中(180r/min)，反应120小时，EGCG转化率为30％；取出固定化脂肪酶，反应液经过过滤、减压浓缩、脱溶剂干燥得到棕黄色粉状EGCG乙酸酯0.35g。

实施例4

取EGCG单体1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶2g，在温度40℃的条件下，摇床中(180r/min)，反应约120小时，EGCG转化率为35％；取出固定化脂肪酶，反应液经过过滤、减压浓缩、脱溶剂干燥得到棕黄色粉状EGCG乙酸酯0.41g。

实施例5

取EGCG单体1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.188g(2.18mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶3g，在温度40℃的条件下，摇床中(180r/min)，反应约90小时，EGCG转化率为35％；取出固定化脂肪酶，反应液经过过滤、减压浓缩、脱溶剂干燥得到棕黄色粉状EGCG乙酸酯0.41g。

实施例6

取EGCG单体1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯0.94g(10.9mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶3g，在温度40℃的条件下，摇床中(180r/min)，反应80小时，EGCG转化率为99％；取出固定化脂肪酶，反应液经过过滤、减压浓缩、脱溶剂干燥得到棕黄色粉状EGCG乙酸酯1.30g。

实施例7

取EGCG单体1.00g(2.18mmol)，乙酸乙烯酯1.88g(21.8mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶3g，在温度50℃的条件下，摇床中(180r/min)，反应36小时，EGCG转化率为99％；取出固定化脂肪酶，反应液经过过滤、减压浓缩、脱溶剂干燥得到棕黄色粉状EGCG乙酸酯1.38g。

实施例8

取EGCG单体1.00g(2.18mmol)，辛酸乙烯酯3.71g(21.8mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶2g，在温度50℃的条件下，摇床中(180r/min)，反应150小时，EGCG转化率为85％；取出固定化脂肪酶，反应液经过过滤、减压浓缩、脱溶剂干燥得到白色粉状EGCG辛酸酯1.18g。

实施例9

取EGCG单体1.00g(2.18mmol)，月桂酸乙烯酯4.93g(21.8mmol)，溶于10ml丙酮中，加入固定化脂肪酶2g，在温度50℃的条件下，摇床中(180r/min)，反应200小时，EGCG转化率为80％；取出固定化脂肪酶，反应液经过过滤、减压浓缩、脱溶剂干燥得到白色粉状EGCG月桂酸酯1.40g。

以上对本发明所提供的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims

1.一种固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于，由以下步骤组成：以儿茶素EGCG单体和含2-18个碳原子的脂肪酸或脂肪酸乙烯酯为原料，EGCG与脂肪酸或脂肪酸乙烯酯按摩尔比为1∶1～10，与有机溶剂和固定化脂肪酶混合，固定化脂肪酶的用量是EGCG质量的0.5-5倍，在30-50℃的条件下，反应36-200小时，取出固定化脂肪酶，反应液经过滤、减压浓缩、脱溶剂干燥得到EGCG脂肪酸酯；所述的固定化脂肪酶以硅藻土、树脂或纺织品膜为载体，载体上有酶活为6000-8000IU/g酵母类脂肪酶。

2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于：所述的脂肪酸为乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕搁酸、硬脂酸或油酸。

3.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于：所述的脂肪酸乙烯酯为乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、肉豆蔻酸乙烯酯、棕搁酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯或油酸乙烯酯。

4.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于：所述的酵母类脂肪酶为解酯假丝酵母脂肪酶或南极甲丝酵母脂肪酶。

5.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于：所述的纺织品膜为棉、尼龙、丝绸、聚酯或纤维素的纺织布。

6.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于：所述的有机溶剂为乙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、二甲氧基甲烷、二乙氧基甲烷、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丙基酮、甲基异丁基酮中的一种或其组合。

7.根据权利要求6所述的固定化脂肪酶催化合成EGCG脂肪酸酯的方法，其特征在于：所述的有机溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃、丙酮的任一种。