CN101319240A - 一种将脂肪生物转化为抗坏血酸脂肪酸酯的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了一种从天然原料出发的，以生物催化方式进行的，相对廉价的，高产率的，环境友好的抗坏血酸脂肪酸酯合成工艺。该工艺在生物催化剂(如Novozym 435)的催化下，以乙醇为媒介，将脂肪与乙醇之间的脂肪醇解反应和抗坏血酸与脂肪酸乙酯之间的酯交换反应结合在一起，实现了脂肪向抗坏血酸脂肪酸酯的转化，彻底根除了现有化学生产工艺对环境的污染威胁，显著提高了产率和产物的纯度，并副产纯甘油。该工艺由下列方法组成：让脂肪跟乙醇在酶的催化下于55～60℃下进行反应，回收去除生成的甘油；随后添加抗坏血酸，让脂肪酸乙酯跟抗坏血酸在酶的催化下于55～60℃下进行反应，回收去除生成的乙醇，得到抗坏血酸脂肪酸酯。

Description

一种将脂肪生物转化为抗坏血酸脂肪酸酯的工艺

技术领域

本专利涉及一种将脂肪生物转化为抗坏血酸脂肪酸酯的工艺，属生物催化的有机合成技术领域。

背景技术

抗坏血酸脂肪酸酯，包括L-抗坏血酸-6-O-月桂酸酯、L-抗坏血酸-6-O-豆蔻酸酯、L-抗坏血酸-6-O-棕榈酸酯以及L-抗坏血酸-6-O-硬脂酸酯等，已知可作为有效的抗氧化剂用于坚果、炸薯片，蛋黄酱、人造奶油以及油炸小吃食品等高脂食品中。并且，这些酯的有些盐类可作为表面活性剂用于食品中。此外，作为维生素C的脂溶性形态，抗坏血酸脂肪酸酯因其脂溶性特征也引起了广泛的兴趣。因为它们可以轻易的穿过细胞膜和血脑屏障，具有许多维生素C所没有的特性，易于被细胞吸收，并累积在细胞内，可以到达维生素C本身所无法到达的组织和器官，保护机体的细胞膜等脂质部分不被氧化，因而具有良好的抗癌抗肿瘤、抗衰老等营养保健功能。Kageyama K等发现它们能强烈地抑制Ehrlich ascites癌细胞的DNA的合成，分解癌细胞的细胞膜的磷脂，是极好的抗癌物质^[1]。Naidu等人的研究表明，抗坏血酸脂肪酸酯可以抑制鼠神经胶质瘤(mouse glioma，C6)和人脑瘤细胞，即神经胶质瘤(glioma，U-373)和神经胶质母细胞瘤(glioblastoma，T98G)细胞和肾癌细胞的增殖。^[2-4]

关于抗坏血酸脂肪酸酯的合成，有化学合成^[5，6]和生物催化合成^[7-9]两类方法。其中的化学合成工艺已经实现了大规模工业化生产。目前市售的抗坏血酸脂肪酸酯类产品全部是用化学法合成的。但化学合成工艺存在着某些致命的缺陷。该工艺需采用浓硫酸为催化剂，不可避免地伴有副反应，产生某些机理和结构都很复杂的副产物和非自然的异构体，对抗坏血酸的转化率和产物的产率影响很大，分离提纯工艺复杂。此外，该工艺对设备的要求很高，对环境的污染也极为严重。

与化学合成工艺相比，抗坏血酸脂肪酸酯的生物催化合成工艺具有非常大的优越性，可以避免使用浓硫酸，使反应在温和的条件下进行，几乎无副反应发生，抗坏血酸的转化率和产品的纯度都可以大幅度提高。同时可以消除对环境的污染，实现绿色化工、环境友好生产。但迄今为止所研究的生物催化合成技术中，大多是以脂肪酸或脂肪酸的甲酯(乙酯)为原料的，而这些原料本身通常仍是以化学合成的方法制备的，其生产过程仍是会造成环境污染的，因而以脂肪酸或其甲酯(乙酯)为原料进行的生物催化法合成仍不是彻底的环境友好生产，不能根除对环境的威胁。

为了根除环境污染，实现彻底的环境友好生产，我们也进行了以天然来源的植物油脂、动物脂肪或鱼油等可食用天然原料为原料与抗坏血酸通过酯交换直接合成抗坏血酸脂肪酸酯的研究^[9]。结果表明，反应可以进行，但因缺乏足够的平衡移动推动力，平衡转化率不高。

参考文献：

[1]Kageyama K.Enhanced inhibition of DNAand release of membrane phosphor-lipids in tumor cells treatedwith a combination of acylated ascorbate and hyperthermia，Int.J.Hyperthermia，1991，7(1)：85-91.

[2]Naidu A K，Wiranowska M，Kori S H，Prockop L D，Kulkarni A P.Inhibition of human glioma cellproliferation and glutathione-S-transferase by ascorbyl esters and interferon.Anticancer Res 1993，13：1469～1471.

[3]Naidu A K，Wiranowska M，Kori S H，Prockop L D，Kulkarni A P.Inhibition of cell proliferation andglutathione-S-transferase by ascorbyl esters and interferon in mouse glioma.J Neuro-Oncol 1993，16：1～10.

[4]Makino Y，Sakagami H，Takeda M：Induction of cell death by ascorbic acid derivatives in human renalcarcinoma and glioblastoma cell lines.Anticancer Res 1999，19：3125～3132.

[5]US Patent 2350435

[6]US Patent 4151178

[7]Humeau.Synthesis of 6-O-Palmitoyl L-Ascorbic Acid Catalyzed by Candida Antartica Lipase.BiotechnologyLetters，1995，17(10)：1091～1094

[8]汤鲁宏，张浩.非水相脂肪酶催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的研究1[J].生物工程学报，2000，16(3)：363～366.

[9]袁红玲，汤鲁宏，陶文沂.以抗坏血酸和食用油脂为原料非水相酶促酯交换法合成抗坏血酸脂肪酸酯的研究.江南大学学报，2006，(已接受，待发表)

发明内容

本专利涉及一种环境友好的，从天然原料出发的，以生物催化的方式进行的，相对廉价的，高产率的合成抗坏血酸脂肪酸酯的工艺。更为独特的是，它涉及一种经过改进的工艺，这种工艺以乙醇为媒介，将脂肪醇解反应和脂肪酸乙酯与抗坏血酸之间的酯交换反应结合在一起，通过从反应混合物中不断的去除某一反应产物，使平衡反应向正反应方向移动，使反应趋于完成，显著提高了产率和产物的纯度。按照本专利进行操作，与此前的传统方法相比，能够彻底根除抗坏血酸脂肪酸酯的生产对环境的污染威胁，实现彻底的环境友好生产，并显著改善产率及产品的纯度。以上这些改进对于涉及环境污染以及抗坏血酸之类的昂贵反应物的化学合成而言是至关重要的。

棕榈酸、豆蔻酸、硬脂酸等脂肪酸的抗坏血酸酯已知可作为有效的抗氧化剂用于坚果、炸薯片，蛋黄酱、人造奶油以及油炸小吃食品等高脂食品中。并且，这些酯的有些盐类可作为表面活性剂用于食品中。

美国专利4151178描述了经过改良的，最佳的抗坏血酸-6-O-脂肪酸酯的化学合成方法。该方法由下列步骤构成：将脂肪酸溶于至少不低于96％的高浓度浓硫酸中，让过量的脂肪酸跟抗坏血酸混合后放置过夜(脂肪酸对抗坏血酸的摩尔比为大约1.35)，生成所期望的6-酯。重结晶的抗坏血酸-6-月桂酸酯，6-豆蔻酸酯，6-棕榈酸酯和6-硬脂酸酯，由于脂肪酸过量35％，抗坏血酸转化为相应的酯的转化率可以高达86％。但这种高转化率是以大剂量的使用浓度大于96％的高浓度硫酸为代价的，该专利要求将反应混合物中脂肪酸与抗坏血酸的摩尔数之和对硫酸的摩尔比控制在大约0.1到0.3之间，建议控制在0.15到0.17之间。

前已述及，上一方法在合成中使用如此高浓度的如此大量的浓硫酸，对环境造成了极大的威胁，也使得该合成过程不可避免的伴随有许多难以预料和解释的副反应，不得不运用繁复分离提纯工艺对产物进行纯化。并且所用原料为脂肪酸，而脂肪酸本身也是需要以脂肪为原料加工生产的。所有这些缺陷都是十分不利的和需要克服的。

因而，本发明的最重要的目的之一，就是要提供一种从天然原料出发的，不再使用浓硫酸的，完全绿色的，对环境不会造成任何不良影响的合成工艺，实现抗坏血酸脂肪酸酯的环境友好型生产。同时，通过避免副反应，并允许对未反应完的脂肪酸乙酯和抗坏血酸进行回收和循环使用，使抗坏血酸和脂肪的转化率都得到大幅提高，以此来降低反应物的成本。

作为一个顺带的结果，本发明的另一个目标是提供一种生产纯的甘油的工艺。

具体来说，首先，我们发现，酶促脂肪醇解反应混合物中所含的甘油在室温或更低一点的温度下，会跟脂肪酸乙酯的乙醇溶液分层，可以很方便地将反应中所产生的甘油从反应体系中分离除去。这一发现的重要意义在于，这允许酶促脂肪醇解反应不断地向正反应方向移动，使反应趋于完成。甘油的及时除去，连同乙醇的过量，共同提供了确保反应趋于完成的反应驱动力。

还发现，作为脂肪醇解反应的反应物的乙醇，在脂肪酸乙酯跟抗坏血酸进行酶促酯交换反应的过程中可以起到很好的溶剂的作用，对于增大抗坏血酸的初始反应浓度，提高初反应速度，使酶促酯交换反应尽快达到平衡是至关重要的。当反应达到平衡之后，作为反应产物的乙醇可以很方便的蒸馏脱除，以使酶促酯交换反应趋于完成。

采用该工艺，脂肪中所含的脂肪酸应当是4到22个碳原子的饱和(或不饱和或多不饱和)脂肪酸。依照所需要的产物类型的不同，适用的脂肪可以是富含月桂酸，棕榈酸，肉豆蔻酸和硬脂酸的，也可以是富含不饱和，甚或多不饱和脂肪酸的。关于抗坏血酸组分，抗坏血酸的任何异构体，如L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸，都可以使用。

反应应当在所选用生物催化剂的最适催化温度下进行。对于Novozym435而言，55℃到60℃在实践中被证明是有效的。我们还发现，低于55℃的温度再加上较长的反应时间，与温度较高，时间较短的方法相比可以给出更高的产率。本发明中脂肪醇解反应所需要的反应时间为2到48小时，抗坏血酸脂肪酸酯的合成达到基本完成的较佳时间段为大约4到16小时。

本发明中所提及的所有重要参数全部最优化后脂肪和抗坏血酸的转化率均可提高至接近100％。

本发明中所使用的抗坏血酸脂肪酸酯产品回收技术基本沿用传统方法。酯化反应完成后，对反应混合物进行冷却，物理分离，乙醚萃取和干燥。这些步骤(包括重结晶)给出了色谱纯产品的良好的产率。

具体实施方式

下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。

20g氢化棕榈油和1g Novozym435被添加到100g无水乙醇中构成混合物，随后在55℃下，在不断搅拌的条件下，反应48hr。反应结束后，将液体反应混合物与固体酶分开，并冷却至室温下静置分层，然后将冷却后的混合物移入分液漏斗中，分出1.8g甘油；上层脂肪酸乙酯的乙醇溶液重新倒入含有固体酶的反应容器中，然后添加13.2g L-抗坏血酸，构成新混合物，随后在55℃下，在不断搅拌的条件下，反应8hr。随后开启真空泵，对反应体系减压，以使乙醇蒸出，边蒸除乙醇边继续维持反应，直到不再有乙醇蒸出，继续维持反应4hr。反应结束后，将反应混合物连同固体酶一起冷却至室温，并用100ml石油醚洗涤3次，每次洗涤后过滤，回收固体酶和未反应完的L-抗坏血酸并在下一轮酯交换反应中循环使用，得到产品的石油醚溶液。溶液中添加500～600ml乙醚，结晶得到L-抗坏血酸脂肪酸酯25g。

结晶母液回收溶剂，残余物回收并在下一轮酯交换反应中循环使用。

Claims (10)

1.一种将脂肪生物转化为抗坏血酸脂肪酸酯的工艺。该工艺由下列步骤组成：

(1)制备一个混合物。该混合物由相应量的(i)脂肪，(ii)乙醇和(iii)生物催化剂组成；

(2)让混合物反应以生成脂肪酸乙酯和甘油；

(3)从反应混合物中分离去除所生成的甘油；

(4)向分离掉甘油之后的反应混合物中添加相应量的抗坏血酸，构成新的混合物；

(5)让新的混合物反应以生成抗坏血酸脂肪酸酯；

(6)回收抗坏血酸脂肪酸酯。

所宣称的乙醇相对于所宣称的脂肪摩尔过量；

所宣称的生物催化剂的用量为所宣称的脂肪的重量的大约0.05到0.1；

所宣称的抗坏血酸的用量大致相等于所宣称的脂肪中所含脂肪酸的摩尔数。

2.内容1中所宣称之脂肪为植物油脂、动物脂肪或鱼油等各种脂肪酸甘油三酯中选定的一个成员。

3.内容1中所宣称之乙醇为无水乙醇。

4.内容1中所宣称之生物催化剂为脂肪酶、酯酶、蛋白酶或任何对此反应体系具有催化活性的生物催化剂中选定的一个成员。

5.内容1中所宣称之抗坏血酸为抗坏血酸各种异构体中选定的一个成员，一般为L-抗坏血酸。

6.内容1中所宣称之混合物在脂肪酸乙酯的生成期间被保持在从20℃到80℃的温度下，最好是30℃到60℃之间。

7.内容1中所宣称之脂肪酸乙酯的生成反应可以进行从2小时到48小时的一个周期。

8.内容1中所宣称之新混合物在抗坏血酸脂肪酸酯的生成期间被保持在从20℃到80℃的温度下，最好是30℃到60℃之间。

9.内容1中所宣称之抗坏血酸脂肪酸酯的生成反应可以进行从4小时到16小时的一个周期。

10.一种将脂肪生物转化为抗坏血酸脂肪酸酯的工艺。该工艺由下列步骤组成：

制备一个混合物。该混合物由相应量的(i)脂肪，(ii)乙醇，和(iii)生物催化剂组成。

乙醇相对于脂肪摩尔过量；生物催化剂的用量为脂肪的重量的大约0.05到0.1。

让所宣称的混合物在从20℃到80℃的温度下反应从2小时到48小时的一段时间以生成脂肪酸乙脂和甘油；分离去除并回收所生成的甘油后，向脂肪酸乙酯中添加等摩尔量的抗坏血酸，构成新的混合物。让新的混合物在从20℃到80℃的温度下反应从4小时到16小时的一段时间以生成抗坏血酸脂

肪酸脂；回收抗坏血酸脂肪酸酯。