CN108588137B - 一种酶法合成egcg不饱和脂肪酸酯的方法 - Google Patents

一种酶法合成egcg不饱和脂肪酸酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶法合成EGCG不饱和脂肪酸酯的方法，属于食品添加剂生物合成领域。本发明的方法在氮气氛围下，采用离子液体作为反应介质，将EGCG与不饱和脂肪酸DHA、EPA在脂肪酶催化作用下40‑50℃反应6‑8h，分子筛除去副产物水，反应结束后，在体系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相经浓缩、真空干燥后得到脂溶性EGCG不饱和脂肪酸酯产品。相对于化学合成，本发明的方法条件温和、反应后催化剂和离子液体与产物容易分离，可实现循环使用。

Description

一种酶法合成EGCG不饱和脂肪酸酯的方法
技术领域
本发明涉及一种酶法合成EGCG不饱和脂肪酸酯的方法，属于食品添加剂生物合成领域。
背景技术
二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)均为人体必需的多不饱和脂肪酸，具有抑制血小板凝聚、调整血脂、降低血液粘度，升高血中的高密度脂蛋白、降低血中的低密度脂蛋白等功效；此外，DHA还具有促进脑细胞生长、发育、改善大脑机能，提高记忆力、增强视网膜反射能力以及防治老年性痴呆等功能。由于存在不饱和双键，DHA和EPA极易被氧化而失效。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶多酚中主要的成分，是一种强有力的抗氧化剂，在食品领域，EGCG已被证明可以保护多不饱和的海洋油脂以及鱼类和肉类中的脂质从而减少被氧化的风险。有研究表明配合EGCG使用，不饱和脂肪酸的降血脂疗效比单独使用的效果更好。因此，通过EGCG不饱和脂肪酸酯的合成，不仅可以达到相互保护、降低氧化水平，提高它们的化学稳定性，而且还可以通过新型的双功能分子达到彼此增强原有功效的双重目的。
目前合成EGCG不饱和脂肪酸酯主要有化学法和酶法。同化学法相比，酶法催化反应具有较高的选择性，这种选择性指的是酶催化一组底物中的某些成员发生反应的优先性，客观上表现为不同竞争性底物反应速度的差异。此外酶促反应还具有反应条件温和、副产物少、环境友好等优点。
传统的酶催化反应需要有水的参与，酶的催化活性随着水活度的变化呈钟形曲线，但对于有水生成的反应来说，不利于酶的催化反应进行。酶催化反应在有机介质中可以提高非极性的溶解度，加快反应速度，促使反应平衡向成酯的方向移动。但有机溶剂易挥发，有一定毒性，对环境造成污染，易导致酶变性或抑制酶的活性，在食品行业的应用受限。
发明内容
为解决现有技术存在的上述缺陷，本发明提供了一种在离子液体体系中进行酶促反应的方法。离子液体是一种新型的“绿色溶剂”，具有较强的极性和可调控性，可溶解多种有机物质，通过对阴阳离子进行适当的修饰可调节离子液体的极性、疏水性及溶解性能。绝大部分的酶都可以在离子液体中催化反应，甚至在几乎无水的情况下酶仍能保持很高的催化活性。同有机溶剂相比，离子液体作为反应溶剂，反应的速率和产率均较高，几乎无其他副产物，更不易使酶失活，可提高酶的催化活力和稳定性，增加酶的区域选择性。此外，离子液体易与产物分离，易于回收，可以连续重复使用，对酶不会产生影响，后续处理简单。以离子液体作为反应介质进行的酶催化反应相比于化学法具有显著的优势，符合绿色化学的要求，在食品领域有很大的应用前景。
本发明的第一个目的是提供一种酶法合成EGCG不饱和脂肪酸酯的方法，将EGCG与不饱和脂肪酸在离子液体体系中经脂肪酶酶促催化反应，合成脂溶性EGCG不饱和脂肪酸酯。
在本发明的一种实施方式中，所述离子液体是咪唑型离子液体，包括但不限于[Bmim]BF4、[Bmim]PF6、[Bmim]TF2N(Bmim：1-丁基-3-甲基咪唑)。
在本发明的一种实施方式中，所述不饱和脂肪酸包括但不限于DHA、EPA。
在本发明的一种实施方式中，EGCG与不饱和脂肪酸的摩尔比为1:1～2.5:1；脂肪酶的添加量为75-120U/g底物。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中的EGCG含量在80％以上。
在本发明的一种实施方式中，所述反应是在氮气氛围下进行，采用离子液体作为反应介质，将EGCG与不饱和脂肪酸在固定化脂肪酶催化作用下40-50℃反应6-8h，采用分子筛
Figure BDA0001670318750000021
除去副产物水；反应结束后，在体系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相经浓缩、真空干燥后得到脂溶性EGCG不饱和脂肪酸酯产品。
在本发明的一种实施方式中，所述浓缩是在50-60℃，0.1Mpa压强下进行减压浓缩。
在本发明的一种实施方式中，所述真空干燥是在40-50℃，0.1Mpa压强下真空干燥至水分含量低于5％。
本发明的有益效果：本发明与化学合成法相比，具有反应条件温和，反应介质环境友好且可反复使用，反应步骤简单可控，副产物少，产品分离相对简单，反应转化率达65.2％以上，转化率相对较高等优点，从而提供一种高效便捷，快速高产，对环境无害的EGCG不饱和脂肪酸酯合成方法。
具体实施方式
实施例1
在具塞反应瓶中加入DHA500mg和等摩尔浓度的85％含量的EGCG，再加入75U/g底物的脂肪酶Lipozyme RM IM，向反应瓶中充入氮气，上述反应在离子液体[Bmim]BF4体系中40℃反应8h，分子筛除去副产物水，反应结束后，在体系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相经浓缩、真空干燥后得到脂溶性EGCG不饱和脂肪酸酯产品，EGCG的转化率为73.5％。
实施例2
在氮气氛围下，向具塞反应瓶中加入DHA500mg和2倍摩尔浓度的88％含量的EGCG，再加入120U/g底物的脂肪酶Thermomyces lanuginosus(Lipozyme TLIM)，向反应瓶中充入氮气，上述反应在离子液体[Bmim]PF6体系中50℃反应6h，分子筛除去副产物水，反应结束后，在体系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相经浓缩、真空干燥后得到脂溶性EGCG不饱和脂肪酸酯产品，EGCG的转化率为69.2％。
实施例3
在氮气氛围下，向具塞反应瓶中加入EPA500mg和1.5倍摩尔浓度的90％含量的EGCG，再加入100U/g底物的脂肪酶Thermomyces lanuginosus(Lipozyme TLIM)，向反应瓶中充入氮气，上述反应在离子液体[Bmim]TF2N体系中50℃反应8h，分子筛除去副产物水，反应结束后，在体系中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相经浓缩、真空干燥后得到脂溶性EGCG不饱和脂肪酸酯产品，EGCG的转化率为65.2％。
实施例4
对实施例1制备的EGCG不饱和脂肪酸酯的LogP值进行测定，测定方法参照2017年公开的《光甘草定平衡溶解度和油水分配系数的测定》论文。正辛醇/水分配系数(LogP)也可以评价EGCG衍生物的脂溶性能。较高的LogP值表明该物质具有较高的亲脂性。经DHA和EPA修饰后EGCG衍生物的脂溶性得到很大提高。
表1不同EGCG不饱和脂肪酸酯的LogP值比较
Figure BDA0001670318750000031
对实施例1制备的EGCG不饱和脂肪酸酯对DPPH自由基的清楚效果进行测定，测定方法参照2015年公开的《咖啡酸体外抗氧化活性的研究》论文。EGCG衍生物的DPPH·自由基清除率与EGCG相比有所上升，可能由于DHA和EPA分子的引入，EGCG衍生物除保留了EGCG较强的清除自由基能力外，还增加了其抗氧化活性。
表2不同EGCG不饱和脂肪酸酯对DPPH自由基的清除作用
Figure BDA0001670318750000032
对比例1
具体实施方式同实施例1，区别在于，离子液体替换为[Omim]BF4，结果显示，EGCG的转化率为35.14％。
对比例2
具体实施方式同实施例1，区别在于，离子液体替换为[Emim]BF4，结果显示，EGCG的转化率为26.71％。
对比例3
具体实施方式同实施例1，区别在于，离子液体替换为[Bmim]HSO4，结果显示，EGCG在强酸性环境下不稳定被分解，该反应不适合在强酸性离子液体条件下进行。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种合成EGCG不饱和脂肪酸酯的方法，其特征在于，将EGCG与不饱和脂肪酸在离子液体体系中经脂肪酶酶促催化反应，合成脂溶性EGCG不饱和脂肪酸酯；所述离子液体是咪唑型离子液体，为[Bmim]BF4、[Bmim]PF6或[Bmim]TF2N；其中Bmim为1-丁基-3-甲基咪唑；所述不饱和脂肪酸为DHA或EPA，反应体系中的EGCG含量为85~90%；EGCG与不饱和脂肪酸的摩尔比为1:1~2:1，脂肪酶的添加量为75-120 U/g底物；所述脂肪酶为Lipozyme RM IM或Lipozyme TLIM；
所述方法具体包括：在氮气氛围下进行反应，采用离子液体作为反应介质，将EGCG与不饱和脂肪酸在固定化脂肪酶催化作用下40-50℃反应6-8h，去除副产物后进行萃取、浓缩、干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用分子筛3Å除去副产物水。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用乙酸乙酯进行萃取。
4.权利要求1~3任一项所述的方法在制备含EGCG不饱和脂肪酸酯的产品方面的应用。
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