CN104450668A

CN104450668A - 一种用于餐厨废油转化生物柴油的生物炭固定化酶及其制备方法

Info

Publication number: CN104450668A
Application number: CN201410749333.4A
Authority: CN
Inventors: 胡朝华; 万顺刚; 张又弛; 罗文邃
Original assignee: Ningbo Urban Environment Observation And Research Station-Nueors Chinese Academy Of Sciences; Institute of Urban Environment of CAS
Current assignee: Ningbo Urban Environment Observation And Research Station-Nueors Chinese Academy Of Sciences; Institute of Urban Environment of CAS
Priority date: 2014-12-10
Filing date: 2014-12-10
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明提供一种可用于高酸值餐厨废弃油脂转化生物柴油的壳聚糖修饰生物炭基固定化酶的制备方法。将花生壳等生物质在限氧条件下高温热裂解成多孔结构的生物炭，采用具有良好生物兼容性的壳聚糖进一步修饰生物炭的孔隙结构，通过壳聚糖大分子之间互相交联产生立体网状结构的基质材料，促进脂肪酶分子在基质载体上的固定，改善固定化酶的催化活性与稳定性。采用该方法制备的固定化脂肪酶催化活性得到充分提高，所制备的固定化酶可用于高酸值餐厨废油转化生物柴油的催化体系。

Description

一种用于餐厨废油转化生物柴油的生物炭固定化酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及酶固定化技术领域，尤其涉及一种可用于餐厨废油转化生物柴油的壳聚糖修饰生物炭固定化脂肪酶的制备方法。

背景技术

随着我国城市化进程不断推进，城市餐厨垃圾污染负荷日益增加，其中废弃油脂由于环境暴露和处置不当，对城市环境卫生和食品安全构成严重威胁。目前，餐厨垃圾的处理方式主要包括直接粉碎作为饲料或直接提取废油脂再利用、作为生活垃圾进行焚烧、填埋、好氧堆肥、厌氧消化等。其中，厌氧消化技术由于既可实现餐厨垃圾的减量化与无害化，又能实现高值化利用，因而受到了广泛关注。通过厌氧消化工艺，餐厨垃圾中有机废弃物转化为生物能源沼气，同时产生的沼液可用作肥料，而沼渣还可制备成去除重金属、有机污染物的生物炭/活性炭，这种 “以废治废”的资源化途径具有广阔的应用空间。但由于餐厨垃圾成分复杂，其中油脂类物质含量通常较高（水和油脂占总量的70~80%），高油脂含量为餐厨垃圾的后续处理与资源化利用带来诸多问题，如油脂发酵产生致癌物黄曲霉素、干扰微生物活动、堵塞厌氧反应器管路等。近年来，餐厨废油的环境卫生与资源/能源转化研究已成为公众、研究学者以及各级政府关注的焦点。一些城市餐厨废油被提炼成“地沟油”，经非法渠道重回到餐桌，带来严重的食品安全隐患。而另一方面，餐厨废油是放错位置的资源/能源。我国人口众多，餐厨废油产量丰富，将其回收再转化为生物柴油已被认为是一条充满应用前景的可再生能源发展途径。因此，餐厨垃圾的深度处理和高值化利用应综合考虑环境安全、废物资源化利用以及生物质能源的再生与可持续发展。

事实上，餐厨废油的主要成分是甘油三酯，这类废油脂在催化剂作用下可与短链醇通过转酯化和酯化反应合成脂肪酸短链酯，即生物柴油。目前，国内外利用餐厨废油催化制备生物柴油的途径主要包括酸碱催化法、超临界醇化法和生物酶法。其中，生物酶法催化制备生物柴油被公认为是一种环保节能的技术。生物酶法是以脂肪酶为催化剂，在非水溶液体系中催化动植物油脂（脂肪酸甘油三酯）与短链醇合成脂肪酸单烷基酯，这种催化合成方法具有原料预处理简单、醇用量少、能耗低、产物分离回收方便以及环境友好等优点。然而，游离的脂肪酶催化活性和使用寿命不足限制了其在催化制备生物柴油中的应用。许多策略如脂肪酶分子修饰和酶固定化技术已经被用于改善脂肪酶在非水溶液体系中的催化活性和稳定性。酶固定化技术由于能提高脂肪酶的催化稳定性和重复使用效率，明显降低酶催化工艺的成本，因而已成为制备生物柴油的关键技术之一。此外，生物炭是一种低成本、多功能的环保材料，已广泛用于环境污染物修复、退化土壤改良、以及温室气体减排等领域。目前有关生物炭载体用于固定化脂肪酶的研究，尤其是应用于城市餐厨废弃油脂转化生物柴油的相关技术或研究尚不多见。

发明内容

因此，针对以上内容，本发明提供一种壳聚糖修饰生物炭基固定化脂肪酶的制备方法，采用该方法进行处理的新型酶催化剂可用于高酸值餐厨废油转化生物柴油的催化工艺。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：一种壳聚糖修饰生物炭基固定脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：将花生壳等生物质在限氧条件下高温热裂解成多孔结构的生物炭，采用具有良好生物兼容性的壳聚糖溶液进一步修饰生物炭的孔隙结构，添加戊二醛溶液使壳聚糖大分子之间互相交联并合成立体网状结构的基质材料，促进脂肪酶分子在基质载体上的固定，改善固定化酶的催化活性与稳定性。采用该方法制备的固定化脂肪酶催化活性得到充分提高，可用于高酸值餐厨废油转化生物柴油的催化体系。

进一步的改进是：所述生物炭是在限氧或低氧条件下热裂解而成，热裂解温度范围400-850℃，所述生物炭为花生壳生物炭、菜籽壳生物炭、水稻壳生物炭以及秸秆生物炭中的任意一种。

进一步的改进是：按以下方法对脂肪酶进行固定：采用具有良好生物兼容性的壳聚糖溶液修饰生物炭的孔隙结构，添加戊二醛溶液使壳聚糖大分子之间互相交联并产生立体网状结构的基质材料，从而促进脂肪酶分子在基质载体上的固定；所述壳聚糖溶液浓度为0.5～5wt%，戊二醛溶液浓度为1～10wt%。

进一步的改进是：所述脂肪酶为伯克霍尔德菌脂肪酶、猪胰脂肪酶、假单胞菌脂肪酶、假丝酵母脂肪酶、根霉脂肪酶、曲霉脂肪酶中的任意一种。

上述制备方法的固定化脂肪酶也属于本发明的保护范围。

通过采用前述技术方案，本发明的有益效果是：本发明采用壳聚糖生物大分子修饰生物炭基质的孔隙结构，通过生物兼容性大分子的表面修饰过程有利于稳定脂肪酶分子的催化活性，进一步的，采用了戊二醛溶液使壳聚糖大分子之间互相交联并产生立体网状结构的基质材料，充分提高了固定化脂肪酶的稳定性与催化活性。

本发明具有以下特点：1)、以生物炭作为酶固定化基质，其生物质原料可再生、成本低廉，规模化应用过程简单、可操作性强；2)、采用生物兼容性壳聚糖分子修饰酶固定化基质，添加戊二醛溶液使壳聚糖大分子之间互相交联并合成立体网状结构的基质材料，有利于脂肪酶催化活性的稳定与反复再利用；3）、壳聚糖修饰生物炭基固定化脂肪酶明显提高了酶催化活性，可用于高酸值餐厨废油转化生物柴油的催化工艺，且易于回收再利用、应用成本低廉。

具体实施方式

以下将结合具体实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明。

本发明的实施例为：

一种壳聚糖修饰的生物炭固定化脂肪酶的制备方法，具体操作步骤如下：1）将花生壳等生物质浸于水中，去除灰尘、杂质后，置于80℃烘箱中干燥，粉碎过100目筛，装入带盖的坩埚并转移至马弗炉中，以10℃/min的升温速率加热到850℃，限氧热裂解4h ，冷却到室温后，再水洗-抽滤-干燥，所得产物即为生物炭基质。2）配置生物炭与脂肪酶溶液、壳聚糖溶液、以及戊二醛溶液的混合体系，该体系中壳聚糖大分子可对生物炭的孔隙结构进一步修饰，通过戊二醛使壳聚糖分子之间互相交联产生立体网状结构的基质材料，促进脂肪酶在修饰生物炭基质上固定并保持较高催化活性。脂肪酶溶于磷酸缓冲液（pH7, 50mmol/L），充分溶解后，离心去除杂质，收集酶上清液，用于酶固定化。用50ml的0.1mol/L盐酸配置成1%的的壳聚糖溶液，30℃下搅拌至完全溶解之后，将所配置的壳聚糖溶液与酶、生物炭混合，再加入1wt%的戊二醛溶液，25℃下恒温振荡，之后真空抽滤，并反复用磷酸缓冲液洗涤，收集沉淀物，-50℃冷冻干燥，即获得固定化脂肪酶。

测定固定化酶催化酯水解活性的操作步骤如下：

配置16.5mmol/L的棕榈酸对硝基苯酯的2-异丙醇溶液，取1ml所配置底物溶液于圆底烧瓶，与9ml的磷酸缓冲液、0.2ml的曲拉通x-100和10mg阿拉伯胶混匀，25-50℃下恒温预培养30min，投入脂肪酶，继续振荡培养。在选定时间分取一定量反应液，用预冷的去离子水稀释，离心后取上清液在410nm处比色分析，通过标准曲线算得样品中对硝基苯酚的浓度。脂肪酶催化酯水解活性单位定义为在上述条件下单位时间内催化释放1微摩尔对硝基苯酚所需的酶量。实验结果表明，与游离的脂肪酶相比，本发明所制备的壳聚糖修饰生物炭固定化脂肪酶显示较高的催化活性。

测定固定化酶催化制备生物柴油的操作步骤如下：

为了评估本发明所制备固定化酶在高酸值餐厨废弃油脂转化生物柴油催化工艺中的应用潜力，考察了固定化脂肪酶对典型游离脂肪酸（以油酸为例）酯化过程的催化效果。具体是，分别称取4克油酸与0.4克水于圆底烧瓶中混合，按醇油摩尔比2:1加入甲醇溶剂，按酶用量占油总量比例的5%加入所制备的固定化酶，在40℃下以200rpm的转速振荡反应，定期采集反应产物，经离心、加热去甲醇后，分取上层油相并用正己烷稀释，加入十六烷作为内标，通过GC-MS分析脂肪酸甲酯的产量。气相色谱柱的规格为30m×0.25mm×0.25μm（型号19091S -433），柱箱升温程序如下：初始温度50℃，保留2 min后以8℃/min升温到175℃，以4℃/min升温到215℃，再以20℃/min升温到270℃，保留3min；后运行温度280℃，后运行时间2min，最高柱箱温度设定为310℃，进样口温度250℃。载体为氦气，流速设定为1ml/min，每次进样量为1μl，进样采用不分流模式，分流出口吹扫流量20ml/min。质谱条件：EI 离子源，质量扫描范围40-600m/z 。生物柴油的转化率(T%)按以下公式计算，T%=(脂肪酸甲酯实际产量/脂肪酸甲酯理论产量) ×100。实验结果表明，壳聚糖修饰的生物炭固定化酶催化油酸制备生物柴油是可行的，生物柴油的最高转化效率在90%以上。

以上所记载，仅为利用本创作技术内容的实施例，任何熟悉本项技艺者运用本创作所做的修饰、变化，皆属本创作主张的专利范围，而不限于实施例所揭示者。

Claims

1.一种可用于餐厨废油转化生物柴油的壳聚糖修饰生物炭固定化脂肪酶及其制备方法，其特征在于，将花生壳等生物质在限氧条件下高温热裂解成多孔结构的生物炭，采用具有良好生物兼容性的壳聚糖进一步修饰生物炭的孔隙结构，通过壳聚糖大分子之间互相交联产生立体网状结构的基质材料，促进脂肪酶分子在基质载体上的固定，改善固定化酶的催化活性与稳定性，采用该方法制备的固定化脂肪酶催化活性得到充分提高，可用于高酸值餐厨废油转化生物柴油的催化体系。

2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述生物炭是在限氧或低氧条件下热裂解而成，热裂解温度范围400-850℃，所述生物炭为花生壳生物炭、菜籽壳生物炭、水稻壳生物炭以及秸秆生物炭中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，按以下方法对脂肪酶进行固定：采用具有良好生物兼容性的壳聚糖溶液修饰生物炭的孔隙结构，添加戊二醛溶液使壳聚糖大分子之间互相交联并产生立体网状结构的基质材料，从而促进脂肪酶分子在基质载体上的固定；所述壳聚糖溶液浓度为0.5～5wt%，戊二醛溶液浓度为1～10wt%。

4.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：所述脂肪酶为伯克霍尔德菌脂肪酶、猪胰脂肪酶、假单胞菌脂肪酶、假丝酵母脂肪酶、根霉脂肪酶、曲霉脂肪酶中的任意一种。