CN107815445A

CN107815445A - 一种干粉型固定化脂肪酶及其生产工艺

Info

Publication number: CN107815445A
Application number: CN201610818949.1A
Authority: CN
Inventors: 田振华; 罗煜; 丁时诚; 瞿旭东
Original assignee: Shanghai Yi Ke Lai Biological Medicine Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Yi Kelai Biotechnology (Chongqing) Co., Ltd.
Priority date: 2016-09-12
Filing date: 2016-09-12
Publication date: 2018-03-20
Anticipated expiration: 2036-09-12
Also published as: CN107815445B

Abstract

本发明提供了一种干粉型固定化脂肪酶及其生产工艺，具体地本发明提供了一种干粉型固定化猪肝酯酶，所述干粉型固定化猪肝脂肪酶包括猪肝脂肪酶和固定化载体树脂；其中，所述猪肝脂肪酶吸附于所述固定化载体树脂上；并且，所述干粉型固定化猪肝酯酶的含水量(重量)为40％～50％，本发明还提供了所述干粉型固定化猪肝酯酶的制备方法。本发明的固定化猪肝酯酶在有机相中能够表现出极高的催化活性，而且稳定性好，能够多次重复使用。

Description

一种干粉型固定化脂肪酶及其生产工艺

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种干粉型固定化脂肪酶及其生产工艺。

背景技术

脂肪酶是一种广泛应用于医药化工领域的酶，可以用于手性酸，手性胺和手性醇类医药中间体的拆分。猪肝酯酶是从猪肝中发现的脂肪酶，降压药Aliskerin的生产就是用猪肝脂肪酶进行拆分得到手性酸；在手性二酸，二醇，二胺的拆分中也有优异表现。

固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。比如，以Novo 435为代表的固定化南极假丝酵母脂肪酶CalB可以在有机相中使用，与游离酶相比，具有如下优势：第一、底物的投料浓度高；第二、容易与底物和产物分开，简化了提纯工艺和产物的收率；第三、可以制备流化床实现连续反应，提高了使用效率，降低了人工成本；第四、固定化酶的稳定性有所提高，储存方便。

目前，本领域中仍然缺乏能够在有机相中使用的固定化猪肝酯酶。因此，本领域技术人员致力于开发能够在有机相中使用的，使用方便、催化活性高、稳定性强、可重复使用的固定化猪肝酯酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干粉型固定化脂肪酶及其生产工艺。

本发明的第一方面，提供了一种干粉型固定化猪肝酯酶，所述干粉型固定化猪肝脂肪酶包括猪肝脂肪酶和固定化载体树脂；其中，所述猪肝脂肪酶吸附于所述固定化载体树脂上；并且，所述干粉型固定化猪肝酯酶的含水量(重量)为40％～50％。

在另一优选例中，所述干粉型固定化猪肝酯酶的含水量(重量)为43％～47％，优选为45％。

在另一优选例中，所述干粉型固定化猪肝酯酶的酶活为600U/g～1000U/g；优选地为700U/g～900U/g。

在另一优选例中，所述固定化载体树脂为大孔吸附树脂。

在另一优选例中，所述大孔吸附树脂为Lifetech^TMECR1030M。

本发明的第二方面，提供了一种制备干粉型固定化猪肝酯酶的方法，所述方法包括步骤：

(1)制备酶液

将猪肝酯酶溶于缓冲液中得所述酶液；

(2)固定化反应

向所述酶液中加入固定化载体树脂，进行固定化反应；

(3)干燥

对步骤(2)中固定化反应后的树脂进行过滤，然后进行干燥，干燥至水分含量(重量)为40％～50％，即得所述干粉型固定化猪肝酯酶。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为50mmol/L，pH为6～8(优选为7.5)。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述酶液比活为50U/ml～200U/ml。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述固定化载体树脂和酶液的比例为15～25g树脂(含水量约70％)：100ml酶液，优选为20g树脂：100ml酶液。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，固定化反应的温度为5～20℃，优选为10～18℃；最优选为16℃。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，固定化反应搅拌转速为100～200转/分钟(优选为120转/分钟)，搅拌时间为12～20h(优选为16h)。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，搅拌完成后，静置3～5h；优选地静置4h。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述固定化载体树脂为大孔吸附树脂。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为ECR1030M树脂。

在另一优选例中，所述步骤(3)中，过滤后对树脂进行洗涤，首先用自来水进行洗涤，然后用磷酸盐缓冲液进行洗涤。

在另一优选例中，所述步骤(3)中，干燥过程中的温度≤50℃，优选地≤40℃。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了实施例1固定化酶残余酶活和套用次数的关系。

图2显示了实施例2固定化酶残余酶活和套用次数的关系。

图3显示了实施例3固定化酶残余酶活和套用次数的关系。

图4显示了实施例4固定化酶残余酶活和套用次数的关系。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种能够在有机相中使用的干粉型固定化猪肝酯酶，该干粉型固定化猪肝酯酶通过固定化载体树脂固定猪肝酯酶获得，实验结果表明，当控制固定化猪肝酯酶含水量在40％～50％之间时，该固定化猪肝酯酶在有机相中能够表现出极高的催化活性，而且稳定性好，能够多次重复使用。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

猪肝酯酶催化反应

猪肝酯酶催化反应底物是脂溶性较强的酯类，水溶性较差。而酶是水溶性的，其进行催化反应也需要一定的水参与反应，固定化的过程中也是在水相中进行的。本发明人在研究中发现，固定化酶含水量高会造成酶的脱落，有机相中使用会结块，造成传质效率降低，反应速度慢等问题；而固定化酶含水量较低，又会导致酶活的显著下降，因此需要控制固定化酶的含水量高，使其在有机相中能均匀分散，从而高效催化产物的生成。

衡量固定化酶的指标主要有比酶活和酶的挂载效率。不同种类的酶，需要不同的载体进行固定。本发明人经过大量筛选，获得了适宜对猪肝酯酶进行固定化的固定化载体树脂。并且经过大量的研究，得到了一个最优的固定化工艺。

因此，本发明涉及一种干粉型固定化脂肪酶及其生产工艺，包括固定化工艺和固定化之后的干燥工艺。按比例加入一定量的脂肪酶和固定化酶载体树脂，在一定的反应条件下进行固定化反应，固定化反应结束后收集树脂，即得到固定化酶。固定化酶再经过常温沸腾床干燥处理，将水分含量降到45％，即得到所需的干粉型固定化酶。这种干粉型固定化酶能够适用于催化全有机相反应体系中的生物催化反应。

在本发明的一个优选的实施方式中，本发明提供了一种能够适用于催化全有机相反应体系中的干粉型固定化猪肝酯酶生产工艺。

优选地，本发明采用如下技术方案：

(1)将适量均质液放入反应釜，按一定比例加入猪肝脂肪酶和固定化载体树脂，在一定的搅拌转速和温度下开始固定化反应；

优选地，搅拌转速在约100-200转/分钟之间。

优选地，反应温度控制在16℃为宜。

优选地，固定化时间在16h为宜。

优选地，固定化反应后需要静置，静置时间优选为4h。

(2)静置完成后，将固定化反应液用滤布过滤收集树脂，洗涤干净后即得到含水的固定化酶。

优选地，所用滤布目数为500目。

优选地，树脂洗涤时先用自来水冲洗干净，然后用磷酸盐缓冲液洗涤2-3次。

优选地，所用磷酸盐缓冲液浓度为50mmol/L，pH为7.5。

(3)含水固定化酶经过初步脱水处理之后，放入沸腾床进行常温干燥处理，将水分含量降到45％，即得到所需的干粉型固定化酶。

优选地，初步脱水采用真空抽滤，脱水后水分含量以不超过70％为宜。

优选地，沸腾床进风温度为20℃-40℃之间的常温，出风温度不宜超过30℃。

优选地，为了提高沸腾床的干燥效率，装料量不宜超过1/3，同时需要摸索装料量与干燥时间对水分含量的影响，以确定最佳组合。

优选地，干燥后固定化酶水分含量在约45％左右，获得的固定化酶能连续催化达到15批次以上。

本发明的主要优点在于：

(1)首次披露了一种适用于有机相催化的干粉型固定化猪肝酯酶，该固定化猪肝酯酶使用方便、催化活性高、稳定性强、可重复使用；

(2)提供了一种制备干粉型固定化猪肝酯酶的方法。

(3)本发明制备的干粉型固定化猪肝酯酶无需冷藏，保存和运输比较方便。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1

将猪肝脂肪酶(猪肝酯酶，购自Sigma,15kU/g)溶于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5,酶液比酶活是100u/mL)，按20g树脂/100mL酶液的比例加入Lifetech^TMECR1030M树脂(也称ECR1030M树脂，购自Purolite公司，含水量约70％，下同)，进行固定化反应。固定化条件为16℃，120转/分钟，搅拌16h，静置4h。收集固定化酶，分别用自来水和50mmol/L，pH 7.5的磷酸盐缓冲液洗涤去除树脂表面杂质以及吸附较弱的酶。真空抽滤后分别取样测水分和酶活，测得水分含量为69％，测得酶活为500u/g，酶活收率100％。将得到的含水型固定化酶进一步用沸腾床干燥，沸腾床进风口温度为40℃，出风口温度为25℃，干燥时间15min，得到10.9g固定化酶，水分含量为43％，酶活为712u/g，酶活总收率77％。

酶活测定以对硝基苯酚乙酸酯为底物(10mM)，以pH7.5的50mM磷酸钠为缓冲液，每mL反应液中加入10μL酶液或10mg固定化酶，室温反应5min，检测波长为410nm，测定时间t分钟内吸光度的变化量计为ΔA，摩尔吸光系数为12.36×10³M^-1cm^-1，对应于对硝基苯酚的生成量。每分钟催化1μmol对硝基苯酚的生成的酶定义为1活力单位。酶活计算公式为：

用固定化猪肝酶催化环己二胺的去对称化：环己二胺1g，固定化猪肝酶1g，乙酸乙酯10mL，37度反应4小时，转化率45％。中止反应，过滤收集固定化酶，测定酶活后重新投入到新的反应中，套用15批次。本实施例中制备的固定化猪肝酯酶反复使用15批次的检测结果如图1所示，从图中可以看出，重复使用15批次后，相对酶活性仍然保持在90％以上(以首次催化的酶活为100％)，说明本发明的固定化酶稳定性极好。

实施例2

将猪肝脂肪酶(购自Sigma,15kU/g)溶于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7,酶液比酶活是100u/mL)，按15g树脂/100mL的比例加入Lifetech^TMECR1030M树脂，进行固定化反应。固定化条件为10℃，150转/分钟，搅拌20h，静置4h。收集固定化酶，分别用自来水和50mmol/L，pH7.5的磷酸盐缓冲液洗涤去除树脂表面杂质以及吸附较弱的酶。真空抽滤后分别取样测水分和酶活，测得水分含量为69％，测得酶活为550u/g，酶活收率82.5％。将得到的含水型固定化酶用沸腾床干燥，沸腾床进风口温度为35℃，出风口温度为25℃，干燥时间20min，得到8.5g固定化酶，水分含量为45％，酶活为850u/g，酶活总收率72％。

采用实施例1中的方法，本实施例中制备的固定化猪肝酯酶反复使用15批次的检测结果如图2所示，从图中可以看出，重复使用15批次后，相对酶活性仍然保持在90％以上(以首次催化的酶活为100％)，说明本发明的固定化酶稳定性极好。

实施例3

将猪肝脂肪酶(购自Sigma,15kU/g)溶于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5，酶液比酶活是100u/mL)，按18g树脂/100mL比例加入Lifetech^TMECR1030M树脂，进行固定化反应。固定化条件为15℃，100转/分钟，搅拌20h，静置5h。收集固定化酶，分别用自来水和50mmol/L，pH7.5的磷酸盐缓冲液洗涤去除树脂表面杂质以及吸附较弱的酶。真空抽滤后得到18.5g湿固定化酶，水分含量为69％，酶活为530u/g，酶活收率95.4％。将得到的含水型固定化酶用沸腾床干燥，沸腾床进风口温度为40℃，出风口温度为25℃，干燥时间15min，测得水分含量为45％，酶活为780u/g，酶活总收率81.3％。

采用实施例1中的方法，本实施例中制备的固定化猪肝酯酶反复使用15批次的检测结果如图3所示，从图中可以看出，重复使用15批次后，相对酶活性仍然保持在93％以上(以首次催化的酶活为100％)，说明本发明的固定化酶稳定性极好。

实施例4

将猪肝脂肪酶(购自Sigma,15kU/g)溶于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5,酶液比酶活是100u/mL)，按22g树脂/100mL的比例加入Lifetech^TMECR1030M树脂，进行固定化反应。固定化条件为20℃，120转/分钟，搅拌16h，静置5h。收集固定化酶，分别用自来水和50mmol/L，pH7.5的磷酸盐缓冲液洗涤去除树脂表面杂质以及吸附较弱的酶。真空抽滤后得到22.3g固定化酶，水分含量为69％，测得酶活为419u/g。将得到的含水型固定化酶用沸腾床干燥，沸腾床进风口温度为40℃，出风口温度为24℃，干燥时间15min，得到16.1g脱水型固定化酶，水分含量为47％，酶活为600u/g，酶活收率96％。

采用实施例1中的方法，本实施例中制备的固定化猪肝酯酶反复使用15批次的检测结果如图4所示，从图中可以看出，重复使用15批次后，相对酶活性仍然保持在93％以上(以首次催化的酶活为100％)，说明本发明的固定化酶稳定性极好。

对比例1

将猪肝脂肪酶(购自Sigma,15kU/g)溶于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5，酶液比酶活是100u/mL)，按6g树脂/100mL的比例加入Lifetech^TMECR1030M树脂，进行固定化反应。固定化条件为16℃，120转/分钟，搅拌16h，静置1h。收集固定化酶，分别用自来水和50mmol/L，pH7.5的磷酸盐缓冲液洗涤去除树脂表面杂质以及吸附较弱的酶。真空抽滤后得到6.5g含水型固定化酶，水分含量为69％，测得酶活为600u/g，酶活收率39％。将得到的含水型固定化酶用沸腾床干燥，沸腾床进风口温度为40℃，出风口温度为25℃，干燥时间15min，得到3.7g脱水型固定化酶，测得水分含量为45％，酶活为880u/g，酶活收率32.6％。

对比例2

制备方法同实施例1，不同之处在于，最终将固定化猪肝酯酶干燥至含水量为35％，经检测酶活为酶活仅为450u/g，酶活收率56％。与实施例1相比，酶活降低了36.8％，酶活收率降低了34.1％。说明固定化酶中含水量过低，会导致酶催化活性的显著降低。

对比例3

制备方法同实施例1，不同之处在于，不进行干燥步骤，所获得的固定化猪肝酯酶含水量为68％，在有机相反应中结块严重，反应速度慢，重复使用5次后，相对酶活性降至60％，说明含水量过高会导致固定化酶的稳定性显著变差。

对比例4

使用离子交换树脂(型号Lifetech^TMECR1504)进行固定，制备方法同实施例1，最终将固定化猪肝酯酶干燥至含水量为45％，得到11.3g脱水型固定化酶，酶活为390u/g，酶活收率44％。与实施例1相比，酶活只有实施例1的45％，酶活收率降低了28％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种干粉型固定化猪肝酯酶，其特征在于，所述干粉型固定化猪肝脂肪酶包括猪肝脂肪酶和固定化载体树脂；其中，所述猪肝脂肪酶吸附于所述固定化载体树脂上；并且，所述干粉型固定化猪肝酯酶的含水量(重量)为40％～50％。

2.如权利要求1所述的干粉型固定化猪肝酯酶，其特征在于，所述干粉型固定化猪肝酯酶的含水量(重量)为43％～47％，优选为45％。

3.如权利要求1所述的干粉型固定化猪肝酯酶，其特征在于，所述干粉型固定化猪肝酯酶的酶活为600U/g～1000U/g；优选地为700U/g～900U/g。

4.如权利要求1所述的干粉型固定化猪肝酯酶，其特征在于，所述固定化载体树脂为大孔吸附树脂。

5.一种制备干粉型固定化猪肝酯酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)制备酶液

将猪肝酯酶溶于缓冲液中得所述酶液；

(2)固定化反应

向所述酶液中加入固定化载体树脂，进行固定化反应；

(3)干燥

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶液比活为50U/ml～200U/ml。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述固定化载体树脂和酶液的比例为15～25g树脂：100ml酶液，优选为20g树脂：100ml酶液。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，固定化反应的温度为5～20℃，优选为10～18℃；最优选为16℃。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，干燥过程中的温度≤50℃，优选地≤40℃。