CN105462952B - 一种从南极假丝酵母发酵上清液中固定脂肪酶b的方法 - Google Patents

一种从南极假丝酵母发酵上清液中固定脂肪酶b的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定南极假丝酵母发酵上清液中脂肪酶B的工艺方法。本发明使用较为廉价的载体，采用水相固定化方式，配合后处理工艺制备固定化南极假丝酵母脂肪酶B，提高了在水相吸附下的酶活回收率，在成本和使用效果方面进行平衡，对CALB的工业应用具有重要意义。

Description

一种从南极假丝酵母发酵上清液中固定脂肪酶B的方法
技术领域
本发明涉及一种固定南极假丝酵母发酵上清液中脂肪酶B的工艺方法，属于酶固定化领域。
背景技术
南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctic lipase B,CALB)来源于南极假丝酵母，是一种优良的脂肪酶，它对水溶性、非水溶性物质都有很强的催化活性，在有机合成、手性化合物拆分、医药中间体等领域得到广泛应用。
固定化脂肪酶与其液体酶制剂和粉末酶制剂相比，具有易于从反应体系分离、可装柱连续反应、稳定性高、易于控制等优势，适用范围十分广泛。酶的固定化方式分为共价结合、载体交联、吸附与包埋法，其中以吸附法最为简单实用，目前主流的CALB固定方法主要为吸附法。
吸附法分为水相吸附、有机相吸附、微水相吸附等，由于CALB的活性区域为疏水区域，因此有机相吸附能够保持活性区域外露，能够较好的保持脂肪酶活力，但成本较高，有机溶剂用量大，工艺较为复杂；水相吸附法工艺简单，成本较低，但会造成CALB活性中心的金属离子溶出，或在载体表面形成多层吸附而导致疏水区域叠加掩蔽，使CALB的酶活回收率降低。
目前诺维信公司生产的Novozyme 435是最为成功的CALB固定化商品酶，由重组米曲霉发酵获得的CALB固定于大孔丙烯酸树脂制备，催化效果优秀但价格昂贵，限制了其在酶催化工业中的应用。国内固定化脂肪酶价格较为低廉，但普遍具有催化活性较低、稳定性较差或难以规模化生产的缺点，难以占据市场优势。中国专利申请号201510199817.0公布了一种固定化碱性脂肪酶的制作方法。该方法利用甘氨酸作为助剂，使用吸附法进行固定化酶的制备。
本发明使用较为廉价的载体，采用水相固定化方式，配合后处理工艺制备固定化南极假丝酵母脂肪酶B，提高了在水相吸附下的酶活回收率，在成本和使用效果方面进行平衡，对CALB的工业应用具有重要意义。
现有技术通常用为微水相固定化，本发明为水相直接固定，原理不同，收益在于有机溶剂用量小，使用发酵液上清，酶仅需初步纯化；本发明固定化载体与现有技术不属于同一系列，收益在于固定化效率更高，降低综合成本；现有技术后处理不包含本发明的锌离子处理内容，且步骤、原理均不相同，本发明收益在于能够提供酶活性中心，解除酶的相互遮蔽作用，提高酶活收率；现有技术使用冷冻干燥进行处理，本发明使用沸腾干燥及真空干燥，收益在于设备要求低，能耗低；与现有技术相比，本发明已进行中试、生产级别放大，且容易工业化操作，收益在于与生产关联程度较高，易于放大规模。
发明内容
本发明所要解决的问题是：提供工艺流程简单，生产成本较低，易于工业化生产的一种固定南极假丝酵母发酵上清液中脂肪酶B的工艺方法，并通过适当的后处理方法提高固定化酶的活力和有机相中使用的稳定性。
本发明提供一种从南极假丝酵母发酵上清液中固定脂肪酶B的方法，，具体步骤如下：
1)发酵液预处理
所述方法中，南极假丝酵母发酵上清液中脂肪酶B的活力范围为2000～2400U/mL，降温预冷至15～20℃。
2)树脂的预处理
使用NKA-II大孔树脂作为预柱填料，按照树脂与发酵上清液体积比1:5～8，使用甲醇进行湿法装柱，装柱量0.7～0.8BV，预柱径高比1:5～10，使用2倍树脂体积甲醇作为流动相进行清洗，流速1～1.5BV/h，甲醇清洗后使用3倍柱体积的蒸馏水将甲醇洗出，流速1～1.5BV/h。
使用HPD600大孔树脂作为吸附柱填料，按照树脂与发酵上清液体积比1:8～15，使用甲醇进行湿法装柱，装柱量0.7～0.8BV，吸附柱径高比1:5～15，使用2倍树脂体积甲醇作为流动相进行清洗，流速1～1.5BV/h，甲醇清洗后使用3倍柱体积的蒸馏水将甲醇洗出，流速1～1.5BV/h。
3)吸附操作
吸附条件：使用预冷的发酵上清液，上样流速以吸附柱计为0.2～0.4BV/h，先后通过预柱和吸附柱。
终点判断：预柱出口处取样检测过柱液的总蛋白浓度，观察树脂颜色，蛋白浓度发生阶跃，树脂完全变色时预柱饱和，应切换至未使用的预柱，并对使用后的预柱进行再生。吸附柱出口处取样检测过柱液的脂肪酶B活力，当酶活力发生阶跃，树脂完全变色时判断为终点，切换至未使用的吸附柱，并对当前吸附柱进行后处理。
4)吸附柱的后处理
碱洗：使用蒸馏水配制NaOH稀溶液，使NaOH稀溶液的pH＝8.0～8.5，使用0.8～1.0BV的NaOH稀溶液，以1.0～1.5BV/h的流速冲洗已经至吸附终点的吸附柱。
锌离子缓冲液浸洗：使用pH＝6.0～6.5，浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲系，配制锌离子浓度为0.01mol/L的氯化锌溶液，使用1.0～1.2BV的上述含锌离子缓冲液将树脂从吸附柱中洗出，浸洗10～15min，过滤并收集树脂。
水洗：收集的树脂置于抽滤器中，用0.2～0.5倍树脂体积的蒸馏水进行漂洗，抽滤，收集树脂。
干燥：湿树脂在45℃下进行沸腾干燥，干燥时间30～75min，收集干燥树脂。
5)干燥树脂的有机相处理
配制十八烷与石油醚比例为1:100(v:v)的石油醚体系，使用1.0～1.5倍干燥树脂体积的上述石油醚与干燥树脂混合，搅拌30～45min，过滤收集树脂，30℃下进行真空干燥，干燥时间30～75min，收集干燥树脂，即得固定化南极假丝酵母脂肪酶B。
本发明的有益效果：
1、本发明利用NKA-II大孔树脂对蛋白质的吸附性以及其对脂肪酶B吸附能力极弱的特性对南极假丝酵母发酵上清液进行初步纯化，利用HPD600大孔树脂对杂蛋白吸附能力低但对脂肪酶B吸附能力高的特性进行脂肪酶B的固定，简化了酶的纯化步骤，降低处理成本。
2、本发明中制备固定化酶的方法，采用固定床的方式对酶进行吸附，易于判断终点，并可以通过色谱柱之间的切换进行连续操作，同时解决了水相固定条件下酶活收率低，母液中游离酶利用率低的问题。
3、本发明利用锌离子为脂肪酶B提供活性中心，利用含十八烷石油醚的疏水作用减弱了酶活性中心的排阻作用，提高了固定化酶的活力，增强了其在有机介质中的催化能力。
4、本发明中所制备的固定化脂肪酶粒径分布为0.3～1.25mm，便于从反应体系中分离。
5、本发明中所制备固定化脂肪酶稳定性良好，适合循环使用。
6、本发明中制备固定化酶的工艺流程简单，使用材料价格低廉，成本较低。
附图说明
图1：本发明的反应流程图
具体实施方式
以下实施例将对本发明做进一步的说明。
实施例1
南极假丝酵母发酵上清液中脂肪酶B的活力为2256U/mL，体积500L，使用带夹套搅拌罐降温预冷至20℃。
预柱直径30cm，高200cm(径高比1:6.67)，取NKA-II大孔树脂100L作为预柱填料(树脂与发酵上清液体积比为1:5)，加入50L甲醇浸泡，使用50L甲醇进行湿法装柱(装柱量0.71BV)，使用200L甲醇作为流动相进行清洗，流速150L/h(流速1.06BV/h)，甲醇清洗后使用300L蒸馏水将甲醇洗出，流速150L/h(流速1.06BV/h)。
吸附柱直径20cm，高200cm(径高比1:10)取HPD600大孔树脂50L作为吸附柱填料(树脂与发酵上清液体积比为1:10)，加入30L甲醇浸泡，使用20L甲醇进行湿法装柱(装柱量0.80BV)，使用100L甲醇作为流动相进行清洗，流速75L/h(流速1.19BV/h)，甲醇清洗后使用150L蒸馏水将甲醇洗出，流速75L/h(流速1.19BV/h)。
使用预冷的发酵上清液上样，上样流速20L/h(以吸附柱计为0.32BV/h)，先后通过预柱和吸附柱。
吸附开始每隔1h测定预柱出口处收集液的总蛋白含量。
吸附开始每隔2h测定吸附柱出口处液体的脂肪酶B活力，吸附时间超过12h时每15min对上述参数进行测定。
吸附前14h吸附柱出口处液体的脂肪酶B活力为5～15U/mL，吸附至14.5h时酶活力阶跃至1951U/mL，树脂已由白色变为浅黄绿色，此时已处理295L发酵上清液，判断为终点，停止上样。
预柱出口处的蛋白含量未发生阶跃，树脂未完全变色，可继续使用。
配制pH＝8.0的NaOH稀溶液60L(0.96BV)，以流速75L/h(流速1.19BV/h)冲洗吸附柱。
配制氯化锌浓度为0.01mol/L，pH＝6.5的0.1mol/L磷酸盐缓冲液65L(1.05BV)，使用40L此溶液以流速75L/h(流速1.19BV/h)冲洗吸附柱，之后用剩余25L溶液将柱内树脂洗出至滤筒，浸洗搅拌10min，抽去液体。
向滤筒中加入20L蒸馏水，漂洗一次，抽滤，收集树脂。
使用容积为2000L的沸腾干燥器，在45℃下干燥30min，收集干燥树脂。
配制十八烷与石油醚比例为1:100(v:v)的体系75L，投入干燥树脂，搅拌30min，过滤收集树脂。使用真空干燥器干燥树脂，在30℃下干燥75min，获得固定化南极假丝酵母脂肪酶B成品17kg。
将上述固定化脂肪酶成品用橄榄油水解方法进行测定(行业标准QB/T1803-1993)。结果表明制备的固定化脂肪酶活力为12100U/g，计算酶活收率为31.4％。
将测定后的固定化脂肪酶过滤从反应体系中滤出，使用真空冷冻干燥器干燥，再次进行酶活力的测定，重复9次，以初次测定酶活力为100％计，重复9次测得的酶活力均保持在90％以上。
配制维生素A醋酸酯质量浓度为0.005g/mL的石油醚溶液50mL，向体系中加入棕榈酸，使棕榈酸与维生素A醋酸酯物质的量之比为3:1，加入制备的固定化脂肪酶0.075g(维生素A醋酸酯质量的30％)，30℃下震荡反应6h，使用高效液相色谱检测反应体系中维生素A棕榈酸酯的浓度并计算转化率(转化率＝(反应后维生素A棕榈酸酯浓度/维生素A醋酸酯初始浓度)×100％)，反应后将固定化脂肪酶滤出并重新进行上述相同反应，记录转化率高于85％的反应次数，结果表明转化率在85％以上的反应次数为56次，说明上述固定化脂肪酶在石油醚相中有较高的使用寿命和活力。
实施例2
南极假丝酵母发酵上清液中脂肪酶B的活力为2328U/mL，体积5000L，使用带夹套搅拌罐降温预冷至15℃。
预柱按照实施例1中的规格及方法进行准备和预处理，共准备6根预柱，并联。
吸附柱直径30cm，高200cm(径高比1:6.67)，共准备6根，分别串联于预柱后，分别取HPD600大孔树脂105L作为吸附柱填料(树脂与发酵上清液总体积比为1:8)，加入50L甲醇浸泡，使用50L甲醇进行湿法装柱(装柱量0.74BV)，分别使用200L甲醇作为流动相进行清洗，流速150L/h(流速1.06BV/h)，甲醇清洗后分别使用300L蒸馏水将甲醇洗出，流速150L/h(流速1.06BV/h)。
使用预冷的发酵上清液上样，使各柱的上样流速为40～41L/h(以吸附柱计为0.28～0.29BV/h)，先后通过预柱和吸附柱。
吸附开始每隔1h测定各预柱出口处收集液的总蛋白含量。
吸附开始每隔2h测定各吸附柱出口处液体的脂肪酶B活力，吸附时间超过12h时每15min对上述参数进行测定。
吸附前15h各吸附柱出口处液体的脂肪酶B活力为3～20U/mL，吸附至15.5～16h时各吸附柱的酶活力分别阶跃至2057～2219U/mL，树脂已由白色变为浅黄绿色，酶活力发生阶跃的吸附柱停止上样，等待其他吸附柱完成吸附，此时已处理3850L发酵上清液，判断为终点。
各预柱出口处的蛋白含量未发生阶跃，树脂未完全变色，可继续使用。
配制pH＝8.0的NaOH稀溶液720L(占总吸附柱体积0.85BV)，分别以流速150L/h(流速1.06BV/h)分别冲洗吸附柱。
配制氯化锌浓度为0.01mol/L，pH＝6.5的0.1mol/L磷酸盐缓冲液950L(1.12BV)，分别使用100L此溶液以流速150L/h(流速1.06BV/h)冲洗吸附柱，之后用剩余350L溶液将所有吸附柱内树脂洗出至滤筒，浸洗搅拌15min，抽去液体。
向滤筒中加入300L蒸馏水，漂洗一次，抽滤，收集树脂。
使用容积为10000L的沸腾干燥器，在45℃下干燥30min，收集干燥树脂。
配制十八烷与石油醚比例为1:100(v:v)的体系700L，投入干燥树脂，搅拌30min，过滤收集树脂。使用真空干燥器干燥树脂，在30℃下干燥75min，获得固定化南极假丝酵母脂肪酶B成品211kg。
将上述固定化脂肪酶成品用橄榄油水解方法进行测定(行业标准QB/T1803-1993)。结果表明制备的固定化脂肪酶活力为11900U/g，计算酶活收率为28.0％。
将测定后的固定化脂肪酶过滤从反应体系中滤出，使用真空冷冻干燥器干燥，再次进行酶活力的测定，重复15次，以初次测定酶活力为100％计，重复前11次测得的酶活力均保持在90％以上。
按照实施例1中测定维生素A棕榈酸酯转化率的方法对本实施例2制备的固定化脂肪酶进行转化率测定，反应后将固定化脂肪酶滤出并重新进行上述相同反应，记录转化率高于85％的反应次数，结果表明转化率在85％以上的反应次数为60次，说明上述固定化脂肪酶在石油醚相中有较高的使用寿命和活力。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种从南极假丝酵母发酵上清液中固定脂肪酶B的方法，其特征在于，方法包括以下步骤：
1)发酵液预处理
将南极假丝酵母发酵上清液降温预冷至15～20℃；
2)树脂的预处理
使用NKA-II大孔树脂作为预柱填料，使用甲醇进行湿法装柱，使用甲醇作为流动相进行清洗，甲醇清洗后使用蒸馏水将甲醇洗出；
使用HPD600大孔树脂作为吸附柱填料，使用甲醇进行湿法装柱，使用甲醇作为流动相进行清洗，甲醇清洗后使用蒸馏水将甲醇洗出；
3)吸附操作
使用预冷的发酵上清液上样，先后通过预柱和吸附柱，通过预柱出口蛋白浓度变化判断预柱是否饱和，通过吸附柱出口脂肪酶B酶活力变化判断吸附终点；
4)吸附柱的后处理
先后使用稀NaOH，含有锌离子的磷酸缓冲液，上样清洗吸附柱，之后使用含有锌离子的磷酸缓冲液将树脂从吸附柱中洗出并浸洗，使用蒸馏水漂洗并收集树脂，对树脂进行沸腾干燥，获得干燥树脂；
5)干燥树脂的有机相处理
使用含有十八烷的石油醚浸泡搅拌干燥树脂，收集树脂进行真空干燥，即得固定化南极假丝酵母脂肪酶B。
2.如权利要求1所述的固定南极假丝酵母发酵上清液中脂肪酶B的工艺方法，其特征在于所述的树脂预处理方法中，预柱填料的树脂与发酵上清液体积比为1:5～8，装柱量为0.7～0.8BV，预柱径高比为1:5～10，使用2倍树脂体积甲醇作为清洗流动相，流速为1～1.5BV/h，甲醇清洗后使用3倍柱体积的蒸馏水将甲醇洗出，流速为1～1.5BV/h；
吸附柱填料的树脂与发酵上清液体积比为1:8～15，装柱量为0.7～0.8BV，吸附柱径高比1:5～15，使用2倍树脂体积甲醇作为流动相进行清洗，流速为1～1.5BV/h，甲醇清洗后使用3倍柱体积的蒸馏水将甲醇洗出，流速为1～1.5BV/h。
3.如权利要求1所述的固定南极假丝酵母发酵上清液中脂肪酶B的工艺方法，其特征在于所述的吸附操作中，上样流速以吸附柱计为0.2～0.4BV/h，预柱出口处取样检测过柱液的总蛋白浓度发生阶跃，树脂完全变色时预柱饱和，切换至未使用的预柱，再生预柱；吸附柱出口处脂肪酶B酶活力发生阶跃，酶活上升至上清酶活的85％以上，树脂完全变色时判断为终点，切换至未使用的吸附柱，并对当前吸附柱进行后处理。
4.如权利要求1所述的固定南极假丝酵母发酵上清液中脂肪酶B的工艺方法，其特征在于，所述的吸附柱后处理方法中，NaOH稀溶液由蒸馏水配制，pH＝8.0～8.5，使用量为0.8～1.0BV，冲洗流速为1.0～1.5BV/h；锌离子缓冲液使用浓度为0.1mol/L，pH＝6.0～6.5的磷酸缓冲系和氯化锌配制，使溶液中锌离子浓度为0.01mol/L，使用量为1.0～1.2BV，浸洗时间为10～15min；水洗使用的蒸馏水量应为树脂的0.2～0.5倍；沸腾干燥温度为45℃，干燥时间为30～75min。
5.如权利要求1所述的固定南极假丝酵母发酵上清液中脂肪酶B的工艺方法，其特征在于，所述的干燥树脂的有机相处理方法中，含有十八烷的石油醚中，十八烷与石油醚体积比为1:100，使用量为干燥树脂体积的1.0～1.5倍，混匀搅拌时间为30～45min，真空干燥温度为30℃，干燥时间为30～75min。
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