CN117230054A - 固定化脂肪酶的制备方法及其制备upu型甘油酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶的固定技术领域，尤其涉及一种固定化脂肪酶的制备方法及其制备UPU型甘油酯的方法。固定化脂肪酶的制备方法，包括步骤：在去离子水中平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的pH值高于所述脂肪酶的pI值；将脂肪酶置入磷酸盐缓冲溶液中浸泡1~3小时，离心取上清液；将所述平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒和脂肪酶上清液分散在磷酸盐缓冲溶液中，在20~40℃下搅拌反应0.5~3h，取出聚丙烯酸酯树脂颗粒干燥，即得所述固定化脂肪酶。本发明提供的固定化脂肪酶的制备方法及其制备UPU型甘油酯的方法，固定化脂肪酶方法简单、UPU型甘油酯得率高。
Description
技术领域
本发明涉及酶的固定技术领域，尤其涉及一种固定化脂肪酶的制备方法及其制备UPU型甘油酯的方法。
背景技术
UPU型结构甘油酯( U不饱和脂肪酸， P饱和脂肪酸)因其独特的结构，在婴幼儿生长发育时期，起到为婴幼儿提供能量、促进脂肪酸吸收、改善便秘，防止矿物质钙流失等作用。鉴于乳脂中甘油三酯的独特组成和功效，目前中国市场上的婴幼儿配方乳脂在整体脂肪酸组成和含量上能够很好地模拟中国母乳的特点，但在甘油骨架的sn-1和sn-3位脂肪酸的种类和含量方面存在显著差异，亟待开展婴幼儿配方乳脂UPU绿色合成工艺理论与产业化研究。
母乳中含量较高的UPU主要是1，3－二油酸－ 2－棕榈酸甘油三酯(1，3－olein－2－palmitin triacylglycerols，OPO)、1－油酸－2－棕榈酸－3－亚油酸甘油三酯(1－olein－2－palmitin－3－linolein triacylglycerols，OPL)、1，3－二亚油酸－2－棕榈酸甘油三酯(1，3－linolein－2－palmitin triacylglycerols，LPL)，其他微量的UPU还包括OPPo (18∶1－16∶0－16∶1)、LPPo(18∶2－16∶0－16∶1)、OPDha(18∶1－16∶0－22∶6)、LPDha(18∶2－16∶0－ 22∶6)等［7－8 ］ 。其中，OPO是欧美国家母乳中含量高的甘油三酯，而中国母乳中含量最高的是OPL。临床试验表明，喂食母乳和含猪油的奶粉的婴儿，比喂食配方奶粉的婴儿表现出更高的脂肪、钙的吸收和更低的粪便硬度.对婴幼儿脂肪吸收、粪便硬度有益的是一类UPU的综合作用，包括OPL、LPL及其他微量UPU。2019年《国产婴幼儿配方乳粉提升行动方案》明确指出明要大力实施国产婴幼儿配方乳粉“品质提升、产业升级、品牌培育”。因此，为了满足国产婴幼儿配方奶粉所需，提升国民整体健康水平，UPU绿色合成工艺和产业化研究势在必行。
UPU型甘油酯合成方法一般可以分为酯化法、酸解法、转酯法等。近年来由于酶法制备功能性油脂的反应条件温和、催化效率高、环保等优点引起了广泛关注。目前国内外酶法制备富含 UPU结构脂的工艺主要以棕榈硬脂为原料，然后通过脂肪酶催化与油酸，亚油酸等不饱和脂肪酸酯化反应合成较高纯度UPU，但因酶制剂要选择针对性比较强的酶制剂，比例公开专利文献：CN112314709一种酶法合成中国母乳甘油三酯替代品的制备方法及用途，需要添加定向的脂肪酶，定向的脂肪酶价格贵，而且该专利文献中定向的脂肪酶没有被固定化，反应不能更充分且酶不能被重复利用；CN 111647593 A 专利文献公开了生物矿化型固定脂肪酶的制备方法及其在催化合成OPO中的应用，将脂肪酶利用生物矿化的方式固定，再分散在磷酸盐缓冲溶液中，加入氯化钙溶液，得到固定化脂肪酶；虽然可以改善脂肪酶的热稳定性和催化活性，但是生物矿化方法复杂，需要的纳米复合材料昂贵。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种固定化脂肪酶的制备方法及其制备UPU型甘油酯的方法，固定化脂肪酶方法简单、UPU型甘油酯得率高。
为实现上述目的，本发明所提供的一种固定化脂肪酶的制备方法及其制备UPU型甘油酯的方法采用如下技术方案：
一种固定化脂肪酶的制备方法， 包括步骤：在去离子水中平衡聚丙烯酸树脂颗粒的pH值高于脂肪酶的pI值1.5~2.5；将脂肪酶置入磷酸盐缓冲溶液中浸泡1~3小时，离心取上清液；将平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒加入到含有脂肪酶的上清液中，在20~40℃下搅拌反应0.5~3h，取出聚丙烯酸酯树脂颗粒干燥，即得固定化脂肪酶。
可选的，所述在去离子水中平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的Ph值高于所述脂肪酶的pI值是：用pH滴定仪、4~6%HCL的2BV缓冲液平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的Ph值。
可选的，所述在去离子水中平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的Ph值高于所述脂肪酶的pI值前，对所述聚丙烯酸树脂颗粒进行预处理：将所述聚丙烯酸树脂颗粒用95wt%乙醇浸泡4-12 h，冲洗无乙醇气味后，用2-5wt%盐酸溶液浸泡2-4h后水洗至中性，再用1-2wt%氢氧化钠浸泡2~4h后水洗至中性，抽滤去除水分后低温保存备用。
可选的，所述将所述平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒加入到含有脂肪酶的上清液中，所述平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒与所述含有脂肪酶的上清液的质量体积比1:8~1:4。
可选的，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值是5~9。
可选的，所述在20~40℃下搅拌反应0.5~3h中所述搅拌转速是70 - 80 rpm。
可选的，所述将脂肪酶置入磷酸盐缓冲溶液中浸泡中，所述脂肪酶与所述磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为1:10-1:20。
一种使用固定化脂肪酶制备UPU型甘油酯的方法， 将三棕榈酸甘油酯、不饱和脂肪酸和所述固定化脂肪酶混合均匀，在55~65℃下搅拌，反应3-5h，得到UPU型油脂；所述三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸的摩尔比为1：8-1:15，所述固定化脂肪酶的添加量是所述三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸总质量的5%-10%。
可选的，所述反应3-5h后，采用分子蒸馏脱脂肪酸得到UPU型油脂；所述分子蒸馏的条件是：冷凝水温度30°C，夹套温度60°C，分子蒸馏温度为200°C，进料速率为3 mL/min，刮板转速为240 r/min，绝对压力为1 MPa。
本发明使用聚丙烯酸树脂固定脂肪酶，相对于现有技术中使用生物矿化的方法固定脂肪酶，本发明原料简单易获得，固定方法简单易行；相对于使用定向酶制备UPU型甘油酯，本发明脂肪酶价格便宜。本发明固定化脂肪酶与现有诺维信脂肪酶NOVOZYM 435对比，傅里叶变换红外谱图显示本发明固定化脂肪酶上物质与诺维信脂肪酶NOVOZYM 435相当，对比树脂比表面积也相当，SEM扫描电镜显示脂肪酶均匀附着在树脂上，本发明固定化脂肪酶符合国家标准，但是本发明固定化脂肪酶成本却远远低于诺维信脂肪酶NOVOZYM 435。在制备UPU型甘油酯时，本发明固定化脂肪酶制备的UPU型甘油酯OPO含量略高，但是本发明固定化脂肪酶成本却远远低于诺维信脂肪酶NOVOZYM 435。
附图说明
图1是本发明实施例一制备的固定化脂肪酶的傅里叶变换红外谱图；
图2是现有技术商品诺维信脂肪酶NOVOZYM 435的傅里叶变换红外谱图；
图3 本发明实施例一制备的固定化脂肪酶的孔径与比表面积报告；
图4是现有技术商品配诺维信脂肪酶NOVOZYM 435的孔径与比表面积报告；
图5本发明实施例一制备的固定化脂肪酶的EDS（Energy DispersiveSpectrometer）能谱图及元素相对含量；
图6是现有技术商品配诺维信脂肪酶NOVOZYM 435的EDS能谱图及元素相对含量；
图7 本发明实施例一制备的固定化脂肪酶的SEM扫描电镜图片；
图8是现有技术商品配诺维信脂肪酶NOVOZYM 435的SEM扫描电镜图片；
图9是使用本发明实施例一制备的UPU型甘油酯高效液相色谱图；
图10是现有技术商品配诺维信脂肪酶NOVOZYM 435的高效液相色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试剂：聚丙烯酸酯阴离子树脂，脂肪酶选择的是：游离脂肪酶粉A03，酶活10万U/g；固定化缓冲液：使用与酶活性和稳定性相适应的缓冲液，本发明选择pH值范围在5~9的磷酸盐缓冲溶液。
一种固定化脂肪酶的制备方法，包括步骤：
步骤S1.预处理聚丙烯酸树脂颗粒；
选择粒径是0.5-1mm的聚丙烯酸树脂颗粒，先用95wt%乙醇浸泡4-12 h,期间搅拌数次，真空抽滤去除洗涤液，再用蒸馏水反复多次洗涤至无明显乙醇气味，用2-5wt%盐酸溶液浸泡2-4h后水洗至中性，再用1-2wt%氢氧化钠浸泡2~4h后水洗至中性，抽滤去除水分后低温保存备用。
步骤S2.在去离子水中平衡聚丙烯酸树脂颗粒的pH值，高于脂肪酶的pI值1.5~2.5；
用pH滴定仪（实验室规模）、4~6%HCL的2BV缓冲液平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的pH值。
步骤S3.将脂肪酶置入足量的缓冲液，浸泡1~3h，然后4000r/min离心10min，取上清液；
脂肪酶粉与缓冲液的质量体积比为1： 10-1：20，本发明所用脂肪酶具体是脂肪酶粉A03，酶来源：黑曲霉。
需要说明的是：步骤S1和S2与步骤S3不分先后顺序，可以先执行步骤S1和S2，再执行步骤S3，也可以先执行步骤S3，再执行步骤S1和S2。
步骤S4.固定化脂肪酶
将步骤S3离心得到的含脂肪酶的上清液倒入固定化容器中，加入步骤S2中平衡了pH值的聚丙烯酸树脂颗粒，在20~40℃下搅拌反应0.5~3h，搅拌转速在70 -80 rpm 。搅拌时使用固定化容器外置搅拌桨搅拌，不使用固定化容器内的磁力搅拌，以免破坏聚丙烯酸树脂结构。平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒与所述含有脂肪酶的上清液的质量体积比1:8~1:4，液体太少搅拌不动，液体太多造成浪费。
步骤S5.过滤固定化脂肪酶
过滤固定化脂肪酶，用去离子水洗涤，树脂与去离子水的质量体积比（w/v）1/10~1/3。
步骤S6.干燥固定化脂肪酶
干燥方式：在50-55℃烘干12-36小时，或为冷冻干燥(-40℃,6~12h)，或真空干燥(40~50°C、12~15h)，得到干燥固定化酶颗粒。然后在2°C - 8°C冷藏，备用。注意：避免冷冻固定化酶，因为这可能会使其损坏。
本发明还提供一种制备UPU型甘油酯的方法，具体如下：
将三棕榈酸甘油酯、不饱和脂肪酸、固定化脂肪酶酶混合均匀，在60℃下搅拌，反应3-5h，得到UPU型油脂；三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸的摩尔比为1：8-1:15；固定化酶的添加量为三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸总质量的5%-10%，反应结束后采用分子蒸馏脱脂肪酸，条件为冷凝水温度30°C，夹套温度60°C，分子蒸馏温度为200°C，进料速率为3 mL/min，刮板转速为240 r/min，绝对压力为1 MPa。本发明中不饱和脂肪酸选用油酸或亚油酸。
如下提供具体的实施例和对比例。
实施例一
选择粒径是0.5-1mm的聚丙烯酸树脂颗粒，先用95wt%乙醇浸泡8 h，期间搅拌数次，真空抽滤去除洗涤液，再用蒸馏水反复多次洗涤至无明显乙醇气味，用4wt%盐酸溶液浸泡3h后水洗至中性，再用1wt%氢氧化钠浸泡3h后水洗至中性，抽滤去除水分后低温保存备用。
用pH滴定仪（实验室规模）、4~6%HCL的2BV缓冲液平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的pH值，高于脂肪酶的pI值2。
将脂肪酶置入足量的磷酸盐缓冲溶液，浸泡3h，然后4000r/min离心10min，取上清液；脂肪酶粉与磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为1：15。
将含脂肪酶的上清液倒入固定化容器中，加入平衡了pH值的聚丙烯酸树脂颗粒，在30℃下搅拌反应2h，搅拌转速在75rpm 。搅拌时使用固定化容器外置搅拌桨搅拌，不使用固定化容器内的磁力搅拌，以免破坏聚丙烯酸树脂结构。平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒与所述含有脂肪酶的上清液的质量体积比1:6。
过滤固定化脂肪酶，用去离子水洗涤，树脂与去离子水的质量体积比（w/v）1/6。
干燥固定化脂肪酶：在50-55℃烘干12-36小时，得到干燥固定化酶颗粒。然后在2°C - 8°C冷藏，备用。
将本发明实施例一制备的固定化脂肪酶放入傅里叶变换红外光谱仪中，如图1，与现有技术商品诺维信脂肪酶NOVOZYM 435的傅里叶变换红外谱图对比，本发明固定化脂肪酶与诺维信脂肪酶NOVOZYM 435图谱类似，本发明固定化脂肪酶所含物质与诺维信脂肪酶NOVOZYM 435基本一致。
图2本发明对实施例一固定化脂肪酶孔径与比表面积进行了测定，图3所示；与现有技术商品配诺维信脂肪酶NOVOZYM 435的孔径与比表面积对比，图4所示；图上显示，两者孔径和比表面积基本一致。
图5和图6分别测定本发明实施例一制备的固定化脂肪酶的EDS能谱图及元素相对含量以及现有技术商品配诺维信脂肪酶NOVOZYM 435的EDS能谱图及元素相对含量，对比显示两者元素以及含量差别也不大。
图7和图8是本发明实施例一制备的固定化脂肪酶的SEM扫描电镜图片和现有技术商品配诺维信脂肪酶NOVOZYM 435的SEM扫描电镜图片，对比显示比较相似。
使用本发明实施例一制备的固定化脂肪酶制备UPU型甘油酯，具体如下：
将三棕榈酸甘油酯、不饱和脂肪酸（油酸）、固定化脂肪酶酶混合均匀，在60℃下搅拌，反应4h，得到UPU型油脂；三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸的摩尔比为1：10；固定化酶的添加量为三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸总质量的8%，反应结束后采用分子蒸馏脱脂肪酸，条件为冷凝水温度30°C，夹套温度60°C，分子蒸馏温度为200°C，进料速率为3 mL/min，刮板转速为240 r/min，绝对压力为1 MPa。
本实施例固定化脂肪酶制备购买的诺维信脂肪酶NOVOZYM 435。
制备的UPU型甘油酯进行高效液相色谱分析，液相图如图9所示，其中表征物质如表一所示：
表一
使用现有技术商品配诺维信脂肪酶NOVOZYM 435制备的UPU型甘油酯进行高效液相色谱分析，液相图如图10所示，其中表征物质如表二所示：
表二
本发明OPO含量为49.58%，对比略高于诺维信NOVOZYM 435反应制备的OPO含量47.72%。
从图1-图10对比可知，本发明制备的固定化脂肪酶各方面性能都达到了诺维信NOVOZYM 435的指标，制备的UPU型甘油酯中OPO的含量略高于现有商品，比其更优，但是本发明成本却远低于现有商品诺维信NOVOZYM 435。
实施例二
选择粒径是0.5-1mm的聚丙烯酸树脂颗粒，先用95wt%乙醇浸泡4 h，期间搅拌数次，真空抽滤去除洗涤液，再用蒸馏水反复多次洗涤至无明显乙醇气味，用2wt%盐酸溶液浸泡4h后水洗至中性，再用2wt%氢氧化钠浸泡2h后水洗至中性，抽滤去除水分后低温保存备用。
用pH滴定仪（实验室规模）、4~6%HCL的2BV缓冲液平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的pH值，高于脂肪酶的pI值1.5。
将脂肪酶置入足量的磷酸盐缓冲溶液，浸泡3h，然后4000r/min离心10min，取上清液；脂肪酶粉与磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为1：20。
将含脂肪酶的上清液倒入固定化容器中，加入平衡了pH值的聚丙烯酸树脂颗粒，在40℃下搅拌反应3h，搅拌转速在80 rpm 。搅拌时使用固定化容器外置搅拌桨搅拌，不使用固定化容器内的磁力搅拌，以免破坏聚丙烯酸树脂结构。平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒与所述含有脂肪酶的上清液的质量体积比1:4。
过滤固定化脂肪酶，用去离子水洗涤，树脂与去离子水的质量体积比（w/v）1/10。
干燥固定化脂肪酶：-40°C下冷冻干燥6~12h，得到干燥固定化酶颗粒。然后在2°C- 8°C冷藏，备用。
使用本发明实施例二制备的固定化脂肪酶制备UPU型甘油酯，具体如下：
将三棕榈酸甘油酯、不饱和脂肪酸（亚油酸）、固定化脂肪酶酶混合均匀，在60℃下搅拌，反应3h，得到UPU型油脂；三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸的摩尔比为1：8；固定化酶的添加量为三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸总质量的5%，反应结束后采用分子蒸馏脱脂肪酸，条件为冷凝水温度30°C，夹套温度60°C，分子蒸馏温度为200°C，进料速率为3 mL/min，刮板转速为240 r/min，绝对压力为1 MPa。
实施例三
选择粒径是0.5-1mm的聚丙烯酸树脂颗粒，先用95wt%乙醇浸泡12h，期间搅拌数次，真空抽滤去除洗涤液，再用蒸馏水反复多次洗涤至无明显乙醇气味，用5wt%盐酸溶液浸泡2h后水洗至中性，再用1.5wt%氢氧化钠浸泡4h后水洗至中性，抽滤去除水分后低温保存备用。
用pH滴定仪（实验室规模）、4~6%HCL的2BV缓冲液平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的pH值，高于脂肪酶的pI值2.5。
将脂肪酶置入足量的磷酸盐缓冲溶液，浸泡3h，然后4000r/min离心10min，取上清液；脂肪酶粉与磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为1：10。
将含脂肪酶的上清液倒入固定化容器中，加入平衡了pH值的聚丙烯酸树脂颗粒，在20℃下搅拌反应0.5h，搅拌转速在70 rpm 。搅拌时使用固定化容器外置搅拌桨搅拌，不使用固定化容器内的磁力搅拌，以免破坏聚丙烯酸树脂结构。平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒与所述含有脂肪酶的上清液的质量体积比1:8。
过滤固定化脂肪酶，用去离子水洗涤，树脂与去离子水的质量体积比（w/v）1/3。
干燥固定化脂肪酶：40°C ~50°C真空干燥12~15h，得到干燥固定化酶颗粒。然后在2°C - 8°C冷藏，备用。
使用本发明实施例三制备的固定化脂肪酶制备UPU型甘油酯，具体如下：
将三棕榈酸甘油酯、不饱和脂肪酸（油酸）、固定化脂肪酶酶混合均匀，在60℃下搅拌，反应5h，得到UPU型油脂；三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸的摩尔比为1：15；固定化酶的添加量为三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸总质量的10%，反应结束后采用分子蒸馏脱脂肪酸，条件为冷凝水温度30°C，夹套温度60°C，分子蒸馏温度为200°C，进料速率为3 mL/min，刮板转速为240 r/min，绝对压力为1 MPa。
实施例四
选择粒径是0.5-1mm的聚丙烯酸树脂颗粒，先用95wt%乙醇浸泡8h，期间搅拌数次，真空抽滤去除洗涤液，再用蒸馏水反复多次洗涤至无明显乙醇气味，用4wt%盐酸溶液浸泡3h后水洗至中性，再用2wt%氢氧化钠浸泡3h后水洗至中性，抽滤去除水分后低温保存备用。
用pH滴定仪（实验室规模）、4~6%HCL的2BV缓冲液平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的pH值，高于脂肪酶的pI值2。
将脂肪酶置入足量的磷酸盐缓冲溶液，浸泡3h，然后4000r/min离心10min，取上清液；脂肪酶粉与磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为1：12。
将含脂肪酶的上清液倒入固定化容器中，加入平衡了pH值的聚丙烯酸树脂颗粒，在25℃下搅拌反应3h，搅拌转速在78rpm 。搅拌时使用固定化容器外置搅拌桨搅拌，不使用固定化容器内的磁力搅拌，以免破坏聚丙烯酸树脂结构。平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒与所述含有脂肪酶的上清液的质量体积比1:5。
过滤固定化脂肪酶，用去离子水洗涤，树脂与去离子水的质量体积比（w/v）1/7。
干燥固定化脂肪酶：40°C ~50°C真空干燥12~15h，得到干燥固定化酶颗粒。然后在2°C - 8°C冷藏，备用。
使用本发明实施例四制备的固定化脂肪酶制备UPU型甘油酯，具体如下：
将三棕榈酸甘油酯、不饱和脂肪酸（亚油酸）、固定化脂肪酶酶混合均匀，在60℃下搅拌，反应4h，得到UPU型油脂；三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸的摩尔比为1：12；固定化酶的添加量为三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸总质量的8%，反应结束后采用分子蒸馏脱脂肪酸，条件为冷凝水温度30°C，夹套温度60°C，分子蒸馏温度为200°C，进料速率为3 mL/min，刮板转速为240 r/min，绝对压力为1 MPa。
实施例五
选择粒径是0.5-1mm的聚丙烯酸树脂颗粒，先用95wt%乙醇浸泡10h，期间搅拌数次，真空抽滤去除洗涤液，再用蒸馏水反复多次洗涤至无明显乙醇气味，用2wt%盐酸溶液浸泡4h后水洗至中性，再用1wt%氢氧化钠浸泡3h后水洗至中性，抽滤去除水分后低温保存备用。
用pH滴定仪（实验室规模）、4~6%HCL的2BV缓冲液平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的pH值，高于脂肪酶的pI值2。
将脂肪酶置入足量的磷酸盐缓冲溶液，浸泡3h，然后4000r/min离心10min，取上清液；脂肪酶粉与磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为1：16。
将含脂肪酶的上清液倒入固定化容器中，加入平衡了pH值的聚丙烯酸树脂颗粒，在35℃下搅拌反应1.5h，搅拌转速在72rpm 。搅拌时使用固定化容器外置搅拌桨搅拌，不使用固定化容器内的磁力搅拌，以免破坏聚丙烯酸树脂结构。平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒与所述含有脂肪酶的上清液的质量体积比1:7。
过滤固定化脂肪酶，用去离子水洗涤，树脂与去离子水的质量体积比（w/v）1/4。
干燥固定化脂肪酶：40°C ~50°C真空干燥12~15h，得到干燥固定化酶颗粒。然后在2°C - 8°C冷藏，备用。
使用本发明实施例五制备的固定化脂肪酶制备UPU型甘油酯，具体如下：
将三棕榈酸甘油酯、不饱和脂肪酸（亚油酸）、固定化脂肪酶酶混合均匀，在60℃下搅拌，反应4h，得到UPU型油脂；三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸的摩尔比为1：13；固定化酶的添加量为三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸总质量的6%，反应结束后采用分子蒸馏脱脂肪酸，条件为冷凝水温度30°C，夹套温度60°C，分子蒸馏温度为200°C，进料速率为3 mL/min，刮板转速为240 r/min，绝对压力为1 MPa。
实施例六
选择粒径是0.5-1mm的聚丙烯酸树脂颗粒，先用95wt%乙醇浸泡7h，期间搅拌数次，真空抽滤去除洗涤液，再用蒸馏水反复多次洗涤至无明显乙醇气味，用4wt%盐酸溶液浸泡3h后水洗至中性，再用2wt%氢氧化钠浸泡4h后水洗至中性，抽滤去除水分后低温保存备用。
用pH滴定仪（实验室规模）、4~6%HCL的2BV缓冲液平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的pH值，高于脂肪酶的pI值2。
将脂肪酶置入足量的磷酸盐缓冲溶液，浸泡3h，然后4000r/min离心10min，取上清液；脂肪酶粉与磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为1：11。
将含脂肪酶的上清液倒入固定化容器中，加入平衡了pH值的聚丙烯酸树脂颗粒，在38℃下搅拌反应3h，搅拌转速在80rpm 。搅拌时使用固定化容器外置搅拌桨搅拌，不使用固定化容器内的磁力搅拌，以免破坏聚丙烯酸树脂结构。平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒与所述含有脂肪酶的上清液的质量体积比1:5。
过滤固定化脂肪酶，用去离子水洗涤，树脂与去离子水的质量体积比（w/v）1/8。
干燥固定化脂肪酶：40°C ~50°C真空干燥12~15h，得到干燥固定化酶颗粒。然后在2°C - 8°C冷藏，备用。
使用本发明实施例六制备的固定化脂肪酶制备UPU型甘油酯，具体如下：
将三棕榈酸甘油酯、不饱和脂肪酸（亚油酸）、固定化脂肪酶酶混合均匀，在60℃下搅拌，反应5h，得到UPU型油脂；三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸的摩尔比为1：9；固定化酶的添加量为三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸总质量的8%，反应结束后采用分子蒸馏脱脂肪酸，条件为冷凝水温度30°C，夹套温度60°C，分子蒸馏温度为200°C，进料速率为3 mL/min，刮板转速为240 r/min，绝对压力为1 MPa。
对比例一
选择粒径是0.5-1mm的聚丙烯酸树脂颗粒，先用95wt%乙醇浸泡4 h，期间搅拌数次，真空抽滤去除洗涤液，再用蒸馏水反复多次洗涤至无明显乙醇气味，用2wt%盐酸溶液浸泡4h后水洗至中性，再用2wt%氢氧化钠浸泡2h后水洗至中性，抽滤去除水分后低温保存备用。
用pH滴定仪（实验室规模）、4~6%HCL的2BV缓冲液平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的pH值，高于脂肪酶的pI值3。
将脂肪酶置入足量的磷酸盐缓冲溶液，浸泡3.5h，然后4000r/min离心10min，取上清液；脂肪酶粉与磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为1：20。
将含脂肪酶的上清液倒入固定化容器中，加入平衡了pH值的聚丙烯酸树脂颗粒，在42℃下搅拌反应3.5h，搅拌转速在80 rpm 。搅拌时使用固定化容器外置搅拌桨搅拌，不使用固定化容器内的磁力搅拌，以免破坏聚丙烯酸树脂结构。平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒与所述含有脂肪酶的上清液的质量体积比1:4。
过滤固定化脂肪酶，用去离子水洗涤，树脂与去离子水的质量体积比（w/v）1/10。
干燥固定化脂肪酶：-40°C下冷冻干燥6~12h，得到干燥固定化酶颗粒。然后在2°C- 8°C冷藏，备用。
该对比例在实施例二的基础上，改变聚丙烯酸树脂颗粒的pH值高于脂肪酶的pI值，聚丙烯酸酯树脂颗粒在含有脂肪酶的上清液中42℃反应超过3h。由于聚丙烯酸树脂颗粒的pH值高于脂肪酶的pI值超过2，酶不能很好地固定在树脂上；且反应超过40度，可能会破坏酶的活性。
对比例二
改对比例在实施例二的基础上，改变聚丙烯酸树脂颗粒的pH值高于脂肪酶的pI值1，聚丙烯酸酯树脂颗粒在含有脂肪酶的上清液中18℃反应超过3.5h。
由于聚丙烯酸树脂颗粒的pH值仅高于pI值1，聚丙烯酸树脂颗粒与脂肪酶的pI值太接近，酶不能很好地固定在树脂上；且反应低于20度，酶的活性不能在完全发挥出来。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括步骤：在去离子水中平衡聚丙烯酸树脂颗粒的pH值高于脂肪酶的pI值1.5~2.5；将脂肪酶置入磷酸盐缓冲溶液中浸泡1~3小时，离心取上清液；将平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒加入到含有脂肪酶的上清液中，在20~40℃下搅拌反应0.5~3h，取出聚丙烯酸酯树脂颗粒干燥，即得固定化脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述在去离子水中平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的Ph值高于所述脂肪酶的pI值是：用pH滴定仪、4~6%HCL的2BV缓冲液平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的Ph值。
3.根据权利要求2所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述在去离子水中平衡所述聚丙烯酸树脂颗粒的Ph值高于所述脂肪酶的pI值前，对所述聚丙烯酸树脂颗粒进行预处理：将所述聚丙烯酸树脂颗粒用95wt%乙醇浸泡4-12 h，冲洗无乙醇气味后，用2-5wt%盐酸溶液浸泡2-4h后水洗至中性，再用1-2wt%氢氧化钠浸泡2~4h后水洗至中性，抽滤去除水分后低温保存备用。
4.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述将所述平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒加入到含有脂肪酶的上清液中，所述平衡pH后的聚丙烯酸酯树脂颗粒与所述含有脂肪酶的上清液的质量体积比1:8~1:4。
5.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值是5~9。
6.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述在20~40℃下搅拌反应0.5~3h中所述搅拌转速是70 - 80 rpm。
7.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述将脂肪酶置入磷酸盐缓冲溶液中浸泡中，所述脂肪酶与所述磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为1:10-1:20。
8.一种使用权利要求1-7任一项所述固定化脂肪酶制备UPU型甘油酯的方法，其特征在于，将三棕榈酸甘油酯、不饱和脂肪酸和所述固定化脂肪酶混合均匀，在55~65℃下搅拌，反应3-5h，得到UPU型油脂；所述三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸的摩尔比为1：8-1:15，所述固定化脂肪酶的添加量是所述三棕榈酸甘油酯和不饱和脂肪酸总质量的5%-10%。
9.根据权利要求8所述的使用固定化脂肪酶制备UPU型甘油酯的方法，其特征在于，所述反应3-5h后，采用分子蒸馏脱脂肪酸得到UPU型油脂；所述分子蒸馏的条件是：冷凝水温度30°C，夹套温度60°C，分子蒸馏温度为200°C，进料速率为3 mL/min，刮板转速为240 r/min，绝对压力为1 MPa。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WENJUAN LIANG ET AL.: "Preparation of a pH-sensitive polyacrylate amphiphilic copolymer and its application in cellulase immobilization", BIORESOUR TECHNOL ., vol. 116, pages 141 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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