CN116751277A - 利用毕赤酵母表达活性重组人il-17a蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供利用毕赤酵母表达活性重组人IL‑17A蛋白的方法。本发明表达体系的构建过程是以pPICZαA的α‑factor信号肽为指导，将IL‑17A目的基因置于AXO1甲醇启动子的正确阅读框架之后构建了pPICZαA‑IL17A载体，线性化载体之后转化进入表达毕赤酵母菌种GS115中进行表达，最终可以表达无标签的重组蛋白，经特定纯化工艺获得90％以上电泳纯度的重组蛋白，并验证具有高活性。

Description

利用毕赤酵母表达活性重组人IL-17A蛋白的方法

技术领域

本发明涉及活性重组蛋白制备技术领域，尤其涉及一种利用毕赤酵母表达活性重组人IL-17A蛋白的方法。

背景技术

白细胞介素-17A(IL-17A)，也称为CTLA-8，主要由T细胞的亚型Th17亚群(辅助性T淋巴细胞17亚群)细胞分泌产生是一种15～20kDa的糖基化细胞因子，在抗微生物和慢性炎症中发挥重要作用。成熟的人IL-17A与小鼠、大鼠IL-17A具有60％的氨基酸序列同一性。成熟的人IL-17A与IL17F形成二硫键连接的同二聚体以及二硫键结合的异二聚体。IL17A通过与IL17RC或IL17RD复合的跨膜IL17RA发挥其作用，IL17RA和IL17RC对异二聚体IL17A/F的反应性都是必需的。IL-17A促进对微生物感染的保护性粘膜和表皮炎症反应，它诱导趋化因子产生、中性粒细胞内流和抗菌肽的产生，IL17A/F同样诱导中性粒细胞迁移，但IL17F不诱导中性粒淋巴细胞迁移。IL-17A还可增强类风湿性滑膜成纤维细胞产生炎症介质，并有助于TNF-α诱导的休克；相反，它可以通过限制慢性炎症来防止结肠炎的进展。IL-17A促进自身反应性生发中心的形成，并加剧自身免疫实验模型的发病和进展。

目前,由于IL-17A存在二硫键和糖基化修饰，采用常规大肠杆菌系统表达的IL-17A的活性高低不一。

发明内容

基于此，有必要提供利用毕赤酵母表达活性重组人IL-17A蛋白的方法。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种重组人IL-17A蛋白，所述重组人IL-17A蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。优选地，所述重组人IL-17A蛋白不含标签序列，产品中的内毒素的含量不高于0.1EU/μg。

本发明还提供编码重组人IL-17A蛋白核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示。

本发明还可以提供重组质粒，包含重组人IL-17A蛋白的核苷酸序列。

优选地，所述重组质粒的构建方法包括如下步骤：扩增获得核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示的目的基因；将目的基因克隆到表达载体pPICZαA中并置于AXO1甲醇启动子的正确阅读框架之后，转化到DH5α中，涂于含博来霉素的LLB培养基中培养，测序；质粒抽提，得重组pPICZαA-IL17A质粒。

本发明还提供表达重组人IL-17A蛋白的毕赤酵母菌株，其构建方法包括如下步骤：Pme1单酶切重组pPICZαA-IL17A质粒，进行线性化处理，醇沉，获得线性化载体；将线性化载体电转入毕赤酵母菌株，筛选，获得高表达重组人IL-17A蛋白的阳性克隆菌株。本发明还提供重组人IL-17A蛋白的表达及纯化方法，包括如下步骤：将表达重组人IL-17A蛋白的毕赤酵母菌株采用BMMY培养基重悬，分多次加入甲醇直至终浓度为0.75％((v/v)，进行诱导发酵，离心，收集发酵液；向发酵液中加入活性炭吸附色素，去除活性炭颗粒，得粗产物液；对所述粗产物液进行亲和层析，透析浓缩，得重组人IL-17A蛋白产物。

本发明的表达重组人IL-17A蛋白的毕赤酵母菌株已于2023年1月4日保藏中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2023020，分类命名为Pichia pastoris IL 17A。

优选地，在采用BMGY培养基重悬的步骤之前，还包括：将表达重组人IL-17A蛋白的毕赤酵母菌株置于YPD平板上进行划线培养，挑选单菌落接种到BMGY培养基中进行菌体富集，离心后采用BMMY培养基重悬。

优选地，所述亲和层析采用分别含100mM、150mM、200mM、250mM的NaCl的缓冲液进行梯度洗脱。

优选地，重组人IL-17A蛋白的表达及纯化方法还包括验证所述重组人IL-17A蛋白活性的步骤：在Hela细胞培养过程中添加重组IL-17A蛋白诱导IL-6分泌，用Human IL-6ELISA Kit检测上清IL-6的表达。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明重组IL-17A蛋白表达体系的构建过程是以pPICZαA的α-factor信号肽为指导，将IL-17A目的区段置于AXO1甲醇启动子的正确阅读框架之后构建了pPICZαA-IL17A载体，线性化载体之后转化进入酵母菌种进行表达，最终可以表达无标签的重组IL-17A蛋白，并经特定纯化工艺获得90％以上电泳纯度的重组IL-17A蛋白，验证具有高活性。

附图说明

图1为pPICZαA-IL17A载体谱图。

图2为Dot blot检测高表达菌株的3s曝光结果图。

图3为酵母菌株基因组PCR核酸验证胶图。

图4为发酵液上清的SDS-PAGE蛋白电泳图。

图5为不同盐离子纯化蛋白后的SDS-PAGE胶图。

图6为Human IL-6ELISA Kit试剂盒检测不同浓度的重组人源IL-17A蛋白诱导Hela细胞IL6表达量的检测结果图。

具体实施方式

本发明利用毕赤酵母表达重组人IL-17A蛋白，并进行了蛋白纯化以及活性检测。重组蛋白IL17A是毕赤酵母表达合成的，该表达过程制备的重组人IL17A无任何标签及氨基酸残留。具体是以pPICZαA的α-factor信号肽为指导，将IL-17A目的基因置于AXO1甲醇启动子的正确阅读框架之后构建了pPICZαA-IL17A载体，线性化载体之后转化进入表达毕赤酵母菌种GS115中进行表达，最终构建了无标签的重组蛋白，该蛋白的氨基酸序列存在糖基化位点，最终表达的蛋白经SDS-PAGE跑胶为两条带；在后期的纯化中使用8‰的活性炭(30-90目)对发酵液进行色素去除，之后纯化过程使用离子交换获得了90％以上纯度(SDS-PAGE图)的重组蛋白；在通过在Hela细胞培养过程中添加重组IL-17A蛋白诱导IL-6分泌的能力进行测定，用HumanIL-6ELISAKit检测上清IL-6的表达验证活性。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例提供一种表达重组人IL-17A蛋白的毕赤酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：

S1，基因扩增与克隆构建：

在NCBI中检索获得IL-17A基因(Gene ID:3605)的编码序列，其收录号为NM_002190.2，该序列编码产生的氨基酸序列登录号为NP_002181.1，Uniprot ID为Q16552。

分别通过TMHMM和SMART网站对NP_002181.1对应的氨基酸序列进行蛋白跨膜区和胞外端的分析：IL-17A为分泌型蛋白，1-23位为该蛋白的信号肽。

其中，IL-17A蛋白第20-155位氨基酸的核苷酸序列如下：

ATAGTGAAGGCAGGAATCACAATCCCACGAAATCCAGGATGCCCA

AATTCTGAGGACAAGAACTTCCCCCGGACTGTGATGGTCAACCTGAAC

ATCCATAACCGGAATACCAATACCAATCCCAAAAGGTCCTCAGATTACT

ACAACCGATCCACCTCACCTTGGAATCTCCACCGCAATGAGGACCCTG

AGAGATATCCCTCTGTGATCTGGGAGGCAAAGTGCCGCCACTTGGGCT

GCATCAACGCTGATGGGAACGTGGACTACCACATGAACTCTGTCCCCA

TCCAGCAAGAGATCCTGGTCCTGCGCAGGGAGCCTCCACACTGCCCCA

ACTCCTTCCGGCTGGAGAAGATACTGGTGTCCGTGGGCTGCACCTGTG

TCACCCCGATTGTCCACCATGTGGCCTGA(SEQ ID NO:1)。

IL-17A蛋白的第20-155位氨基酸序列如下：

IVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYY NRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQ QEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA(SEQ IDNO:2)。

设计克隆载体构建引物序列：

IL17A-F：ATAGTGAAGGCAGGAATCACAATCC(SEQ ID NO:3)。

IL17A-R：TCAGGCCACATGGTGGACAATCG(SEQ ID NO:4)。

利用克隆引物IL-17A-F和IL-17A-R在人类基因组文库扩增了IL-17A蛋白的20-155位氨基酸的核苷酸序列，并将得到的正确条带克隆到克隆载体-Blunt(TransGen Biotech)上，转化到DH5α的大肠杆菌感受态细胞中挑选阳性克隆子进行基因测序，得/>-Blunt-IL-17A。

转化过程：取预冷的50μL DH5ɑ感受态细胞，加入10μL的-Blunt-IL-17A构建质粒，冰浴处理30min后，42℃热水浴90s(严格控制时间)，冰浴处理5min；再于超净台上，向转化体系中加入500μL无抗LB培养基，于37℃、220rmp摇床中复苏45min；再置于3000rmp条件下离心1min，收集菌体，留200μL菌液，用移液器吸打混匀后加入氨苄抗性的平板中，倒入4～6颗玻璃珠，轻晃平板将菌液涂布均匀，倒掉玻璃珠，将平板倒置放在37℃培养箱，过夜培养。

如图1所示，以表达载体构建引物G-IL17A-F和G-IL17A-R扩增测序正确的目的基因IL-17A，以EcoRⅠ和AgeⅠ双酶切表达载体pPICZαA(thermofisher)，将目的基因IL17A使用无缝克隆试剂盒2X MultiF Seamless Assembly Mix(货号：RK21020，武汉爱博泰克)将其克隆到表达载体pPICZαA上构建pPICZαA-IL17A载体(以pPICZαA的α-factor信号肽为指导，将IL-17A目的基因置于AXO1甲醇启动子的正确阅读框架之后)，转化到DH5α中，涂于含0.25‰博来霉素的LLB培养基(低盐LB培养基)中，以pPICZαA载体的上下游引物进行验证，将验证条带正确的载体进行测序，选择测序正确的载体。

其中，表达载体构建引物的序列如下：

G-IL17A-F：

GAAAAGAGAGGCTGAAGCTATAGTGAAGGCAGGAATCACAATCC(SEQ ID NO:5)。

G-IL17A-R：

GATTAGAATCTAGCAAGACCGGTTCAGGCCACATGGTGGACAATCG(SEQ ID NO:6)。

载体自组装体系如下表所示：

组份	加入量
		线性化载体：pPICZαA双酶切之后片段	2μL
线性化片段：目的基因IL17A的扩增片段	8μL
		2X MultiF Seamless Assembly Mix	10μL
ddH2O	to 20μL

S2，质粒抽提：

挑取上述平板挑取单菌落于10mL含0.25‰博来霉素的LLB培养基中培养过夜。第二天上午于12000rpm离心10min，按照无内毒素质粒小提中量试剂盒(货号：DP118-02，北京天根生化)的说明书抽提重组质粒，得到终浓度为1350ng/μL的无内毒素重组pPICZαA-IL17A质粒。

S3，酵母转化：

载体线性化处理：将质粒以对应的酶Pme1单酶切过夜线性化，线性化后进行纯化。反应体系如下表所示：

成分	体积
		目的质粒	20μg
10x缓冲液	5μL
		酶	2μL
ddH2O	To 50μL

醇沉：将线性化处理的质粒，PCR回收后50μL的量进行浓缩富集，具体操作如下：加入3M的NaAC溶液，添加量为总体积的1/10；加入总体积大概2.5倍(体积比)的无水乙醇混匀；此时加入无水乙醇后应有白色絮状不溶物析出，于13400xg、4℃条件下离心15min，将沉淀之上的溶液小心吸走，向其中添加1mL 70％的乙醇重悬沉淀；于13400xg、4℃离心15min，去上清留沉淀，干燥沉淀后，于13400xg、离心2min后向其中加入10μL无菌水重新溶解DNA，得醇沉后的线性化载体，-20℃储存，以备下一步电转。

酵母电转：先将毕赤酵母菌株GS115(thermofisher)的甘油菌活化，再将划线出现的单菌落接种到20mL的YPD培养基中，于30℃、200rpm过夜培养直到OD_600nm等于1.3～1.5，制作成感受态细胞。取80μL制作好的感受态细胞加入10μL醇沉后的线性化载体，混和均匀。然后将上述液体转移至事先准备在-20℃中的电转杯中冰水浴，电击后立刻向其中添加1mL冰水浴的山梨醇试剂，然后将其中的混合液转移到于一个无菌的的15mLEP管中；将15mL的EP管30℃复苏2-3h，于1500xg离心1min，离心操作保留菌体，留大概100μL重细胞涂在带有相应抗性的YPD平板上，30℃培养3-5天直至出现较大单菌落。其中，电转参数如下表所示：

S4，高表达阳性克隆子的筛选

(1)深孔板诱导

将YPD平板上生长出来的阳性克隆子利用24深孔板进行4mL的小试发酵，发酵过程中前期使用BMGY培养基对菌体进行富集生长48h，之后对24深孔板进行离心(1500xg，4℃，5min)分离菌液和上清，使用真空泵将BMGY培养基上清抽离，将菌液使用BMMY培养基进行重悬，之后每12h补加0.75％的甲醇进行诱导，在诱导84h之后对24深孔板进行离心(1500xg，4℃，5min)分离菌液和上清。

(2)Dot blot检测高表达菌株：

取上清选择特异性抗体进行Dot blot检测，特异性抗体包括特异性一抗(货号：A0688，武汉爱博泰克)和特异性二抗(货号：AS014，武汉爱博泰克)。

根据Dot blot的结果选择颜色深的阳性克隆子，颜色越深，表达量越高。具体包括如下步骤：

上样：将发酵上清吸取5μL吹打至已画好的膜上，放置于37℃培养箱中烘干。

封闭：将烘干的膜放入盛有3％脱脂牛奶(TBST配制)的容器中，室温封闭60～90min。

一抗孵育：封闭完成后，倒掉封闭液。加入用3％脱脂牛奶(TBST配制)1:7000稀释的一抗溶液，摇床上平缓摇动，室温孵育2h或4℃孵育过夜(4℃孵育后需室温再孵育15～30min)。一抗孵育完成后，倒掉一抗溶液；用TBST漂洗膜4次，每次5min。

二抗孵育：一抗孵育完成前，将对应一抗种属的酶标二抗1：5000稀释到实验需要的量(TBST稀释)。将清洗好的膜放入盛有二抗溶液的容器中，摇床上缓慢摇动，于室温孵育60～80min。二抗孵育完成后，倒掉二抗溶液；用TBST漂洗膜4次，每次5min。

曝光：用镊子将膜从TBST中取出，适当控干，置于凝胶托盘。用ECL SolutionⅠ和SolutionⅡ等体积混合，均匀加至膜上，完全覆盖。底物与膜反应约30s，置于化学发光成像系统仪。设置的曝光时间为3s、10s、30s、60s、120s。

其中，3s曝光结果如图2所示：筛选得到高表达阳性克隆菌株。

(3)基因组提取验证

将筛选的到高表达阳性克隆菌株使用天根生化科技提供的酵母基因组提取试剂盒(货号：DP307，北京天根生化)提取基因组，使用pPICZαA载体的验证引物去扩增目的基因条带，将扩增得到的正确条带进行测序，选择测序正确的毕赤酵母重组菌株GS115-pPICZαA-IL17A。

酵母菌株基因组PCR核酸验证胶图如图3所示，结果表明：图中的第2-6泳道为IL17A转化酵母菌株提取基因组进行PCR阳性验证。

本实施例获得的表达重组人IL-17A蛋白的毕赤酵母菌株GS115-pPICZαA-IL17A，已于2023年1月4日保藏中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2023020，分类命名为Pichia pastoris IL 17A。

实施例2

本实施例提供重组IL-17A蛋白的表达及纯化方法，包括如下步骤：

1)重组IL 17A蛋白的表达：

毕赤酵母重组菌株(实施例1制备)摇瓶发酵600mL进行发酵放大验证：将构建好的IL-17A重组蛋白表达菌株GS115-pPICZαA-IL17A在YPD平板上进行划线培养，培养2～3天至长出单菌落。挑取单菌落，接种至YPD培养基20mL中，于30℃、220rpm培养36h，以1％的接种量接种到600mL的BMGY培养基中进行菌体的富集，生长48h，于4℃、1500～3000g离心5～10min，离心后的全部菌体用600mL BMMY培养基重悬，在30℃、220rpm下发酵，从发酵开始后每隔12h添加甲醇至终浓度为0.75％(v/v)以继续诱导，诱导发酵84h，离心分离收取发酵液。

发酵液上清的SDS-PAGE蛋白电泳图如图4所示，结果表明：第一泳道为BSA，第二泳道为116的蛋白maker，第三泳道为目的蛋白，目的蛋白在酵母表达系统下表达为2条带。

2)重组IL 17A蛋白的纯化：

①色素去除

将离心得到的发酵液上清添加8‰的活性炭进行旋转孵育2h，之后对其进行离心去掉大部分活性炭，之后再使用0.22μm的膜进行抽滤，去除里面残留的活性炭颗粒。

②亲和层析

选用基质SP Sepharose FF。

孵育：置于旋转培养器上，于20rpm、4℃旋转孵育4h。

A.柱流穿：孵育结束后，将离心管配平离心，于4℃、1000rpm离心10min。将离心后的上清倒入新的离心管中，即为流穿。同时留约5mL的上清，用于悬浮基质，将悬浮后的基质转移至纯化柱管中，待流穿流完，收集流穿液(FT)。

B.洗杂与洗脱：

a.使用10倍柱体积的Binding Buffer加入到纯化柱管中，洗下基质上结合能力稍弱的杂蛋白，重力流，流完后用G250检测(取100μL G250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续加入1倍柱体积Binding Buffer洗脱，直到G250不变蓝，收集流出液，收集管需要插在冰上保持低温。

b.加入1mL Elution Buffer洗柱，洗下与基质结合的蛋白。重力流，流出液用1.5mL无内毒素的EP管收集，收集管需放置在冰盒上保持低温，流完后用G250检测(取100μLG250于96孔板中，加入10μL正在滴出的洗脱液)，如果G250变蓝，继续洗脱，直到G250不变蓝，结束Elution Buffer洗脱。重复上面的操作一直使用Elution Buffer A到D去洗脱，收集洗脱液。

c.将收集的流穿与洗脱液制样，一般为6×loading buffer制样，即20μL蛋白+5μL6×loading buffer，进行SDS-PAGE电泳。

其中，亲和层析过程中用到的缓冲液如下：

缓冲液名称	Tris/Hepes(mM)	NaCl(mM)
			脱盐缓冲液/Binding Buffer	20	50
Elution Buffer A	20	100
			Elution Buffer B	20	150
Elution Buffer C	20	200
			Elution Buffer D	20	250
Elution Buffer E	20	300
			Elution Buffer F	20	400
Elution Buffer G	20	500

不同盐离子洗脱后的组分的SDS-PAGE蛋白胶图如图5所示，结果表明：目的蛋白在NaCl浓度为250-300mM时被洗脱下来。

③透析换液浓缩：

将蛋白纯度>95％的纯化蛋白收集，进行换液浓缩：使用透析夹夹住透析袋其中一头的末端，将对应项目收集的纯化洗脱液用巴氏吸管转移到透析袋中，赶出透析袋中的气泡，用透析夹夹住透析袋的另一头，两头夹好后，用手轻轻捏住透析袋中间，将两头的透析夹放在桌上轻轻掂几下，检查是否漏液，若漏液则重新装。

A.收集离子交换层析纯化的样品透析至最终缓冲液(PBS,pH7.4)，一般10mL样品使用1L缓冲液进行透析，4℃透析2h，换液一次，再次透析2h。

B.换液之后用10kDa透析袋和PEG 20000将蛋白浓缩至≥1.0mg/mL。

C.浓缩之后100μL/管分装，于-80℃冻存。

(3)浓度以及内毒素的检测

使用BCA法对蛋白浓度进行测定其浓度为1.03mg/mL，使用鲎试剂对其进行内毒素的检测≤0.1EU/μg。

实施例3

本实施例提供重组IL-17A蛋白的活性检测，包括如下步骤：

用Hale完全培养基(90％DMEM+10％FBS)去培养Hale细胞(ATCC细胞库)。待细胞汇合度长至细胞培养皿底面积80％以上可以用于实验，待细胞长满之后对细胞进行离心计数，用Hale完全培养基调节细胞密度使其最终细胞密度为1*10⁵个/mL，并在96孔板中接种100μL细胞悬液，每孔1*10⁴个左右细胞。

用Hale完全培养基稀释重组人IL-17A蛋白储备液，最大浓度为10000ng/mL，10倍梯度稀释，稀释7个浓度梯度，对照孔(加完全培养基)。

将原Hela细胞培养的培养基弃掉，加入稀释好的稀释液到96孔板中，每孔100μL，对照组仅加入100μL的完全培养基，于37℃、5％ CO₂恒温培养箱培养48h，离心收取48h培养细胞上清液，使用Human IL-6ELISA Kit(爱博泰克)检测IL-6的表达。

结果如图6所示，测定重组蛋白IL-17A最低有效浓度的ED50为6.72～26.88ng/mL。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组人IL-17A蛋白，其特征在于，所述重组人IL-17A蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的重组人IL-17A蛋白，其特征在于，所述重组人IL-17A蛋白不含标签序列，产品中的内毒素的含量不高于0.1EU/μg。

3.一种编码权利要求1所述的重组人IL-17A蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一种重组质粒，其特征在于，包含权利要求3所述的重组人IL-17A蛋白的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的构建方法包括如下步骤：

扩增获得核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的目的基因；

将目的基因克隆到表达载体pPICZαA中并置于AXO1甲醇启动子的正确阅读框架之后，转化到DH5α中，涂于含博来霉素的LLB培养基中培养，测序；

质粒抽提，得重组pPICZαA-IL17A质粒。

6.一种表达重组人IL-17A蛋白的毕赤酵母菌株，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：

Pme1单酶切权利要求5所述的重组pPICZαA-IL17A质粒，进行线性化处理，醇沉，获得线性化载体；

将线性化载体电转入毕赤酵母菌株，筛选，获得高表达重组人IL-17A蛋白的阳性克隆菌株。

7.一种重组人IL-17A蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求6所述表达重组人IL-17A蛋白的毕赤酵母菌株采用BMGY培养基重悬，分多次加入甲醇直至终浓度为0.75％((v/v)，进行诱导发酵，离心，收集发酵液；

向发酵液中加入活性炭吸附色素，去除活性炭颗粒，得粗产物液；

对所述粗产物液进行亲和层析，透析浓缩，得重组人IL-17A蛋白产物。

8.根据权利要求7所述的重组人IL-17A蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，在采用BMGY培养基重悬的步骤之前，还包括：将权利要求6所述的表达重组人IL-17A蛋白的酵母菌株置于YPD平板上进行划线培养，挑选单菌落接种到BMGY培养基中进行菌体富集，离心后采用BMMY培养基重悬。

9.根据权利要求7所述的重组人IL-17A蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，所述亲和层析采用分别含100mM、150mM、200mM、250mM的NaCl的缓冲液进行梯度洗脱。

10.根据权利要求7至9任一项所述的重组人IL-17A蛋白的表达及纯化方法，其特征在于，还包括采用诱导细胞分泌IL-6的能力试验检测所述重组人IL-17A蛋白活性的步骤。