MX2012002697A - Anticuerpos anti receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan anticuerpos para GITR de humano, como también usos de los mismos, por ejemplo en el tratamiento de trastornos proliferativos e inmunes.

Description

ANTICUERPOS ANTI RECEPTOR DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL INDUCIDO POR GLUCOCORTICOIDES CAMPO DE LA INVENCIÓN En términos generales, la presente invención se refiere a anticuerpos específicos para el receptor de TNF inducido por glucocorticoide (GITR), y usos de los mismos. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos humanizados que reconocen el GITR humano y modulan su actividad, particularmente en trastornos inmunes y proliferativos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoide (GITR), un miembro de la superfamilia de TNFR, es expresada en muchos componentes del sistema inmune innato y adaptativo (véase por ejemplo Hanabuchi et al. (2006) Blood 107:3617-3623; y Nocentim y Riccardi (2005), Eur. J. Immunol. 2005. 35: 1016-1022). Su expresión en la membrana se incrementa después de la activación de células T (Hanabuchi, supra; y Nocentini y Riccardi, supra); su activación coactiva los linfocitos T efectores y modula la actividad regulatoria de las células T (Treg) (véase por ejemplo McHugh, et al. (2002) Immunity 2002, 16:311-323; Shimizu, et al. (2002) Nat. Immunol. 3: 135-142; Ronchetti, et al (2004) Eur. J. Immunol. 34:613-622; y Tone, er a/. (2003) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100: 15059-15064.

El GITR es activado por el ligando de GITR (GITRL), que es expresado principalmente sobre APC, y se ha sugerido que suministra señales por medio de su dominio citoplásmico, aunque se requieren más estudios para definir la señalización bioquímica (Nocentini, supra; Ronchetti, supra; Suvas, et al. (2005) J. Virol. 79: 11935-1 1942; y Shin, et al. (2002) Cytokine 19: 187-192).

La activación de GITR aumenta la resistencia a los tumores e infecciones virales, está implicada en procesos autoinmunes/inflamatorios y regula la extravasación de leucocitos (Nocentini supra; Cuzzocrea, et al. (2004) J. Leukoc. Biol. 76:933-940; Shevach er al. (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:613-618; Cuzzocrea, et al. (2006) J. Immunol. 177:631-641 ; y Cuzzocrea et al. (2007) FASEB J. 21 :117-129).

Existe la necesidad de métodos y composiciones mejoradas para el tratamiento de los trastornos inmunes y proliferativos, por ejemplo tumores y cáncer, mediante el uso de agentes que modulen la actividad de GITR.

Preferiblemente, los agonistas de este tipo tendrían una afinidad alta por la molécula objetivo, y serían capaces de estimular la señalización de GITR a dosis relativamente bajas. Preferiblemente, tales métodos y composiciones serían altamente específicos para GITR y no alterarían la actividad de otros receptores. Preferiblemente, tales métodos y composiciones utilizarían agonistas adecuados para modificar el suministro de cargas útiles citotóxicas a las células objetivo, pero también adecuados para usos no citotóxicos.

Preferiblemente, dichos métodos y composiciones utilizarían anticuerpos modificados para limitar su antigenicidad cuando se administren a un sujeto en necesidad del mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra el efecto sinérgico del tratamiento combinado con DTA-1 (específico para GITR; véase Shimizu, et al. (2002) Nature Immunol. 3: 135-142) e irradiación local. "CR" significa regresión completa.

La figura 2 muestra los módulos de GITR determinados por medio del método descrito por Naismith y Sprang (1998), Trends Biochem. Sci. 23:74-79. Los residuos en negrita indican el epítope conformacional de tipo DTA-1 determinado como se indica más abajo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención cubre estas necesidades y otras más suministrando agonistas de GITR, por ejemplo anticuerpos anti-GITR humanizados.

En un aspecto, la invención provee compuestos de unión, tales como anticuerpos o fragmentos de los mismos, que incluyen anticuerpos recombinantes humanizados o quiméricos que se unen a la GITR humana, que comprenden un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que tienen por lo menos una o más CDRs seleccionadas del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 56-88, y un dominio variable de cadena pesada que tiene por lo menos una o más CDRs seleccionadas del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 23-55.

En otras modalidades, el compuesto de unión de la presente invención comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, o los fragmentos de unión de antígeno de los mismos, descritos en los dos párrafos precedentes.

En algunas modalidades, el compuesto de unión comprende una región de armazón, en donde toda la secuencia de aminoácidos de la región de armazón, o sustancialmente toda, es una secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina humana.

En algunas modalidades, el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 12-22, o una variante de las mismas. En algunas modalidades, el dominio variable de cadena pesada comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 1-11. En una modalidad adicional, el compuesto de unión comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, o los fragmentos de unión de antígeno de los mismos, descritos en este párrafo.

En otras modalidades, el compuesto de unión de la presente invención comprende un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que consiste esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 91 , 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111 , y/o un dominio variable de cadena pesada, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, que consiste esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110.

En una modalidad, la invención se refiere a anticuerpos que son capaces de bloquear la unión de un compuesto de unión de la presente invención a la GITR humana en una prueba de bloqueo cruzado. En varias modalidades, el anticuerpo es capaz de bloquear la unión de GITR humana a un anticuerpo que comprende las secuencias de CDR de los anticuerpos 36E5, 3D6, 61G6, 6H6, 61 F6, 1D8, 17F10, 35D8, 49A1 , 9E5, o 31 H6, que se describen en la presente. En otra modalidad, la invención se refiere a compuestos de unión que son capaces de bloquear la actividad mediada por GITR, tales actividades incluyen, sin limitación, la prueba de coestimulación de proliferación de células T CD4+ intactas.

En algunas modalidades, el compuesto de unión de la presente invención también comprende una región constante de cadena pesada, en donde la región constante de cadena pesada comprende una región constante de cadena pesada humana ?1 , ?2, ?3, o ?4, o una variante de las mismas. En varias modalidades, la región constante de cadena ligera comprende una región constante de cadena ligera humana lambda o kappa.

En varias modalidades, los compuestos de unión de la presente invención son anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, humanizados o completamente humanos, o fragmentos de los mismos. La presente invención también contempla que el fragmento de unión de antígeno es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, y un dianticuerpo.

La presente invención abarca un método de intensificación de la respuesta inmune en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto en necesidad del mismo un anticuerpo (o un fragmento de unión de antígeno del mismo) específico para GITR, en una cantidad eficaz para estimular la señalización de GITR. En algunas modalidades, el anticuerpo específico para GITR es el anticuerpo humanizado o quimérico. En modalidades adicionales, la respuesta inmune es una respuesta antiinfecciosa o antiviral. En algunas modalidades, el anticuerpo de GITR o fragmento de unión de antígeno del mismo se administra conjuntamente con un anticuerpo de TGFp o con radiación local.

La presente invención abarca un ácido nucleico aislado que codifica la secuencia de polipéptido de una modalidad de anticuerpo del compuesto de unión de la presente invención. El ácido nucleico puede estar en un vector de expresión enlazado operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula hospedera transfectada con el vector. También se abarca una célula hospedera que comprende del vector, y un método de producción de un polipéptido, que comprende cultivar la célula hospedera bajo condiciones en las que se expresa la secuencia de ácido nucleico, produciendo así el polipéptido, y recuperar el polipéptido de la célula hospedera o medio.

La presente invención provee un anticuerpo, o fragmento de unión de antígeno del mismo, producido por un hibridoma depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), en donde el hibridoma se selecciona del grupo que consiste en PTA-9889, PTA-9890, PTA-9891 , PTA-9892, PTA-9893, PTA-10286, PTA-10287, PTA-10288, PTA-10289, PTA-10290 y PTA- 10291.

La presente invención abarca un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno que se une a la proteína GITR humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión de antígeno reconoce un epítope que abarca el módulo 3 y el módulo 4 de la proteína GITR humana (SEO. ID NO: 89). En algunas modalidades el epítope comprende Gly57, Arg65, His67, Lys80, Phe81, Ser82 y Gln86. En otras modalidades el anticuerpo bloquea cruzadamente por lo menos uno de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos producidos por los hibridomas seleccionados del grupo que consiste en PTA-9889, PTA-9890, PTA-9891 , PTA-9892, PTA-9893, PTA-10286, PTA-10287, PTA-10288, PTA-10289, PTA-10290 y PTA-10291.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se usa aquí, inclusive en las reivindicaciones anexas, las formas singulares de palabras tales como "un", "una", y "el", "la", incluyen sus referencias plurales correspondientes a menos que el contexto indique claramente otra cosa. El cuadro 15 que se da más abajo provee una lista de los identificadores de secuencia usados en esta solicitud. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan como referencia en su totalidad como si cada publicación, registro de base de datos (por ejemplo secuencias de Genbank o registros de GeneID), solicitud de patente o patente fuera incorporada específica e individualmente como referencia. La mención de estas referencias no es una admisión de que sea técnica anterior pertinente, ni constituye una admisión del contenido o fecha de tales publicaciones o documentos. 1. Definiciones Los términos "GITR", "proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoide", "familia de receptores TNFR inducibles por activación", "AITR", "miembro 18 de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral", y "TNFSF18" son muy conocidos. Las secuencias de nucleótidos y polipéptido de GITR de humano y ratón se describen en WO 98/06842. También están disponibles depósitos en GenBank® de la secuencia de aminoácidos de GITR humana (Q9Y5U5), y secuencias de ácido nucleico y aminoácido de GITR de ratón (AF109216).

"Actividad proliferativa" abarca una actividad que promueve, que es necesaria para, o que está asociada específicamente con, por ejemplo, la división celular normal, así como también cáncer, tumores, displasia, transformación celular, metástasis y angiogénesis.

"Administración" y "tratamiento", como se aplica a un animal, humano, sujeto experimental, célula, tejido, órgano, o fluido biológico, se refiere al contacto de un agente o composición exógena farmacéutica, terapéutica, o diagnóstica, con el animal, humano, sujeto, célula, tejido, órgano, o fluido biológico. "Administración" y "tratamiento" se pueden referir, por ejemplo, a métodos terapéuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, de investigación y experimentales. El tratamiento de una célula abarca el contacto de un reactivo con la célula, y también el contacto de un reactivo con un fluido, en donde el fluido está en contacto con la célula. "Administración" y "tratamiento" también significan tratamientos in vitro y ex vivo, por ejemplo de una célula, con un reactivo, diagnóstico, composición de unión, o con otra célula. El "tratamiento", como se aplica a un humano, veterinario o sujeto de investigación, se refiere a un tratamiento terapéutico, profiláctico o preventivo, y a aplicaciones de investigación y diagnósticas. "Tratamiento", como se aplica a un humano, veterinario o sujeto de investigación, célula, tejido, u órgano, abarca el contacto de un agente con un sujeto animal, una célula, tejido, compartimiento fisiológico o fluido fisiológico. El "tratamiento de una célula" también abarca situaciones en donde el agente hace contaco con GITR, por ejemplo en fase de fluido o en fase coloidal, pero también en situaciones en donde el agonista o antagonista no hace contacto con la célula o el receptor.

Como se usa aquí, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo que exhibe la actividad biológica deseada. De esta manera, se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos completamente humanos, etcétera, siempre que exhiban la actividad biológica deseada.

Como se usan aquí, los términos "fragmento de unión de GITR", "fragmento de unión del mismo" o "fragmento de unión de antígeno del mismo", abarcan un fragmento o un derivado de un anticuerpo que todavía retiene sustancialmente su actividad biológica de inducción de la señalización de GITR, referida en la presente como "actividad inductora de GITR". El término "fragmento de anticuerpo" o fragmento de unión de GITR se refiere a una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región de unión de antígeno o variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv'; dianticuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena, por ejemplo sc-Fv; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. Típicamente, un fragmento de unión o derivado retiene por lo menos 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% (o más) de su actividad agonista de GITR, aunque será útil cualquier fragmento de unión con afinidad suficiente para ejercer el efecto biológico deseado. También se entiende que un fragmento de unión de GITR puede incluir variantes que tienen sustituciones conservativas de aminoácidos que no alteran sustancialmente su actividad biológica.

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por las posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un solo epítope antigénico. En contraste, las preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales) incluyen normalmente una multitud de anticuerpos dirigidos contra (o específicos para) diferentes epítopes. El calificativo "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y se considera que no se requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para ser utilizados de acuerdo con la invención se pueden hacer mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al. (1975), Nature 256:495, o se pueden hacer mediante métodos de ADN recombinante (véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de colecciones de anticuerpo de fago utilizando por ejemplo las técnicas descritas por Clackson et al. (1991 ), Nature 352:624-628, y Marks et al. (1991 ), J. Mol. Biol. 222:581-597.

Los anticuerpos monoclonales de la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en las cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de las cadenas es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes de los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como también fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada; véase la patente de EE. UU. No. 4,816,567; Morrison et al. (1984), Proc. Nati. Acad. Sci USA 81:6851-6855.

Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene solo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones VH están unidas covalentemente con un enlazador de péptido para crear un anticuerpo de dominio divalente. Las dos regiones VH de un anticuerpo de dominio divalente pueden hacer blanco en los mismos antígenos o en antígenos diferentes.

Un "anticuerpo divalente" comprende dos sitios de unión de antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Sin embargo, los anticuerpos divalentes pueden ser biespecíficos (véase más abajo).

Como se usa aquí, el término anticuerpo "Fv de una sola cadena" o "scFv" se refiere a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. Generalmente el polipéptido Fv comprende también un polipéptido enlazador entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión sobre sFv véase Pluckthun (1994) "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds, Springer-Verlag, Nueva York, p. 269-315.

Los anticuerpos monoclonales de la presente también incluyen anticuerpos camelizados de un solo dominio; véase por ejemplo Muyldermans et al. (2001 ), Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann ef al. (1999), J. Immunol. Methods 231 :25; WO 94/04678; WO 94/25591 ; patente de EE. UU. No. 6,005,079). En una modalidad, la presente invención provee anticuerpos de un dominio que comprenden dos dominios VH con modificaciones para formar anticuerpos de un solo dominio.

Como se usa aquí, el término "dianticuerpos" se refiere a fragmentos pequeños de anticuerpo con dos sitios de unión de antígeno, dichos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) unido a un dominio variable de cadena ligera (VJ en la misma cadena de polipéptido (VH-VL O VL-VH). Utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de unión de antígeno. Los dianticuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en EP 404,097; WO 93/11 161 ; y Holliger et al. (1993), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448. Para una revisión sobre las variantes de anticuerpo construidas por ingeniería véase en general Holliger y Hudson (2005), Nat. Biotechnol. 23:1 126-1 136.

Como se usa aquí, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos no humanas (por ejemplo, murinas) y también anticuerpos humanos. Tales anticuerpos contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo lo de por lo menos un dominio variable, y típicamente dos, en los cuales todos o sustancialmente todos los lazos hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Los prefijos "hum", "hu" o "h", se añaden a designaciones de clon de anticuerpo cuando sea necesario para distinguir los anticuerpos humanizados de los anticuerpos de roedor progenitores. Las formas humanizadas de anticuerpos de roedor comprenderán generalmente las mismas secuencias CDR de los anticuerpos de roedor progenitores, aunque se pueden incluir algunas sustituciones de aminoácido para aumentar la afinidad, aumentar la estabilidad del anticuerpo humanizado, o para otros fines.

Los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos con regiones Fe modificadas (o bloqueadas) para proveer funciones efectoras alteradas; véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 5,624,821 ; WO 2003/086310; WO 2005/120571 ; WO 2006/0057702; Presta (2006), Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656. Tal modificación se puede usar para intensificar o suprimir varias reacciones del sistema inmune, con posibles efectos benéficos en el diagnóstico y la terapia. Las alteraciones de la región Fe incluyen cambios de aminoácido (sustituciones, supresiones e inserciones), glicosilación o desglicosilación, y adición de múltiples Fe. Los cambios de Fe también pueden alterar la vida media de los anticuerpos terapéuticos, y una vida media más larga resultaría en administración menos frecuente, con la concomitante mayor conveniencia y menor uso de material; véase Presta (2005), J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 en 734-35.

Los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos con regiones Fe intactas que proveen funciones efectoras completas, por ejemplo anticuerpos del isotipo lgG1 , que inducen citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) en una célula objetivo.

Los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos conjugados con cargas útiles citotóxicas, tales como agentes citotóxicos o radionúclidos. Tales conjugados de anticuerpo se pueden usar en inmunoterapia para alcanzar y destruir selectivamente células que expresan ciertos antígenos sobre su superficie. Los agentes citotóxicos ejemplares incluyen ricina, alcaloide de la vinca, metotrexate, exotoxina de Pseudomonas, saporina, toxina de la difteria, cisplatino, doxorrubicina, toxina abrina, gelonina y proteína antiviral de fitolaca. Los radionúclidos ejemplares para usarse en inmunoterapia con los anticuerpos de la presente invención incluyen 125l, 131l, 90Y, 67Cu, 211At, 177Lu, 143Pr y 213Bi; véase por ejemplo la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 2006/0014225.

El término "anticuerpo completamente humano" se refiere a un anticuerpo que comprende únicamente secuencias de proteína inmunoglobulina humana. Un anticuerpo completamente humano puede contener cadenas de carbohidrato de murino si se produce en un ratón, en una célula de ratón, o en hibridoma derivado de una célula de ratón. Similarmente, "anticuerpo de ratón" o "anticuerpo de rata" se refieren a un anticuerpo que comprende únicamente secuencias de inmunoglobulina de ratón o rata, respectivamente. Un anticuerpo completamente humano se puede generar en un ser humano, en un animal transgénico que tiene secuencias de línea germinal de inmunoglobulina humana, por despliegue de fago, o por medio de otros métodos de biología molecular.

Como se usa aquí, el término "región hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión con el antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácido de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo los residuos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) y 89-97 (CDRL3) en el dominio variable de cadena ligera, y los residuos 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) y 95-102 (CDRH3) en el dominio variable de cadena pesada (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland), y/o los residuos de un "lazo hipervariable" (esto es, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera, y 26-32 (H1 ), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada (Chothia y Lesk (1987), J. Mol. Biol. 196:901-917). Como se usa aquí, el término residuos de "armazón" o "FR" se refiere a los residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable definida aquí como residuos de CDR. La numeración de residuos anterior se refiere al sistema de numeración de Kabat y no necesariamente corresponde en detalle a la numeración de secuencia del Listado de Secuencias anexo.

"Compuesto de unión" se refiere a una molécula, molécula pequeña, macromolécula, polipéptido, anticuerpo o fragmento o análogo del mismo, o receptor soluble, capaz de unirse a un objetivo. El "compuesto de unión" también se puede referir a un complejo de moléculas, por ejemplo, un complejo no covalente, a una molécula ionizada, y a una molécula modificada covalentemente o no covalentemente, por ejemplo, modificada por fosforilación, acilación, entrelazamiento, ciclizacion, o corte limitado, que es capaz de unirse a un objetivo. Cuando se utiliza con respecto a los anticuerpos, el término "compuesto de unión" se refiere tanto a los anticuerpos como a los fragmentos de unión de antígeno de los mismos. La "unión" se refiere a una asociación de la composición de unión con un objetivo, en donde la asociación reduce el movimiento Browniano normal de la composición de unión, en casos en donde la composición de unión puede ser disuelta o suspendida en solución. La "composición de unión" se refiere a una molécula, por ejemplo un compuesto de unión, en combinación con un estabilizador, excipiente, sal, amortiguador, disolvente, o aditivo, capaz de unirse a un objetivo.

"Variantes modificadas conservativamente" o "sustitución conservativa" se refiere a las sustituciones de aminoácidos conocidas para el experto en la materia y frecuentemente se pueden hacer incluso en regiones esenciales de polipéptido sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Tales sustituciones ejemplares se hacen preferiblemente de acuerdo con lo que se indica en el cuadro 1 siguiente: CUADRO 1 Sustituciones conservativas de aminoácido ejemplares Los expertos en esta materia reconocerán que, en general, las sustituciones de un solo aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido pueden no alterar sustancialmente su actividad biológica; véase por ejemplo Watson et al. (1987), "Molecular Biology of the Gene", The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4a edición).

La frase "consiste esencialmente en", o variaciones tales como "que consiste esencialmente en", como se usa en toda la especificación y las reivindicaciones, indica la inclusión de cualquier elemento o grupo de elementos citados, y la inclusión opcional de otros elementos de naturaleza similar o diferente que los elementos citados, y materialmente no cambia las propiedades básicas o novedosas del régimen de dosificación, método o composición especificados. Como un ejemplo no limitativo, un compuesto de unión que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos citada, también puede incluir uno o más aminoácidos, incluyendo sustituciones de uno o más residuos de aminoácido, que materialmente no afectan las propiedades del compuesto de unión.

Una "cantidad eficaz" abarca una cantidad suficiente para aliviar o prevenir un síntoma o signo de la afección. La cantidad eficaz también significa una cantidad suficiente para permitir o facilitar el diagnóstico. Una cantidad eficaz para un paciente o sujeto veterinario particular puede variar dependiendo de factores tales como la afección tratada, la salud general del paciente, la vía de administración y la dosis, y la severidad de los efectos secundarios; véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 5,888,530. Una cantidad eficaz puede ser la dosis máxima o el protocolo de administración que evita efectos secundarios o efectos tóxicos significativos. El efecto resultará en un mejoramiento de una medida o parámetro diagnóstico de por lo menos 5%, usualmente por lo menos 10%, usualmente por lo menos 20%, más usualmente por lo menos 30%, de preferencia por lo menos 40%, de preferencia por lo menos 50%, de preferencia por lo menos 60%, idealmente por lo menos 70%, más idealmente por lo menos 80%, y muy idealmente por lo menos 90%, en donde 100% se define como el parámetro diagnóstico mostrado por un sujeto normal; véase por ejemplo Maynard et al. ( 996), "A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice", Interpharm Press, Boca Ratón, Florida; Dent (2001) "Good Laboratory and Good Clinical Practice", Urch Publ., Londres, Reino Unido.

"Afección inmune" o "trastorno inmune" abarca por ejemplo inflamación patológica, un trastorno inflamatorio, y un trastorno o enfermedad autoinmune. "La afección inmune" también se refiere a infecciones, infecciones persistentes y afecciones proliferativas, tales como cáncer, tumores y angiogénesis, incluyendo infecciones, tumores y cáncer que resisten la erradicación por el sistema inmune. Una "afección cancerosa" incluye, por ejemplo, cáncer, células cancerosas, tumores, angiogénesis y afecciones precancerosas tales como displasia.

El término trastorno inmune significa una enfermedad en la cual un componente del sistema inmune de un mamífero causa, media o contribuye de otra manera a una morbilidad en el mamífero. También se incluyen enfermedades en las cuales la estimulación o intervención de la respuesta inmune tiene un efecto curativo sobre el avance de la enfermedad. Dentro de este término se incluyen las enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias mediadas por el sistema inmune, enfermedades inflamatorias no mediadas por el sistema inmune, enfermedades infecciosas y enfermedades de inmunodeficiencia. Los ejemplos de enfermedades relacionadas con el sistema inmune e inflamatorias, algunas de las cuales son inmunes o mediadas por células T, que se pueden tratar de acuerdo con la invención, incluyen el lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espondiloartropatías, esclerosis sistémica (esclerodermia), miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis), síndrome de Sjogren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturna paroxística), trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitopénico idiopático, trombocitopenia mediada por el sistema inmune), tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica), diabetes mellitus, enfermedad renal mediada por el sistema inmune (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial), enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso central y periférico, tales como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barre, y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E, y otros virus no hepatotrópicos), hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosante, enfermedades inflamatorias y fibróticas del pulmón, tales como enfermedad inflamatoria del intestino (colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn), enteropatía de sensibilidad al gluten, enfermedad de Whipple, enfermedades de la piel autoinmunes o mediadas por el sistema inmune, que incluyen enfermedades bulosas de la piel, eritema multiforme y dermatitis de contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a los alimentos y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neumonías eosinofílicas, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis de hipersensibilidad, enfermedades asociadas con trasplantes que incluyen rechazo de injerto y enfermedad de injerto contra hospedero. Las enfermedades infecciosas incluyen SIDA (infección de VIH), hepatitis A, B, C, D y E, infecciones bacterianas, infecciones fúngicas, infecciones por protozoarios e infecciones por parásitos.

Los términos "cáncer", "tumor", "canceroso" y "maligno" se refieren o describen una condición fisiológica en los mamíferos que se caracteriza normalmente por crecimiento celular descontrolado. Los ejemplos del cáncer incluyen, sin limitación, carcinoma que incluye adenocarcinoma, linfoma, blastoma, melanoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales tipos de cáncer incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer gastrointestinal, linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, cáncer pancreático, glioblastoma, glioma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer del hígado como carcinoma hepático y hepatoma, cáncer de la vejiga, cáncer de la mama, cáncer del colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, mieloma (tal como mieloma múltiple), carcinoma de glándula salival, cáncer del riñon como carcinoma de célula renal y tumores de Wilms, carcinoma de células básales, melanoma, cáncer de la próstata, cáncer vulvar, cáncer de la tiroides, cáncer testicular, cáncer esofágico, y varios tipos de cáncer de la cabeza y el cuello.

Conforme las células cancerosas crecen y se multiplican, forman una masa de tejido canceroso, que es un tumor, que invade y destruye los tejidos adyacentes normales. Los tumores malignos son cáncer. Los tumores malignos usualmente se pueden extirpar pero pueden regresar. Las células de los tumores malignos pueden invadir y dañar los tejidos y órganos vecinos. También, las células de cáncer pueden desprenderse de un tumor maligno y entrar a la corriente sanguínea o el sistema linfático, que es la manera en que las células de cáncer se diseminan del tumor primario (esto es, el cáncer original) para formar tumores nuevos en otros órganos. La diseminación del cáncer en el cuerpo se denomina metástasis ("What You Need to Know About Cáncer- an Overview", Publicación NIH No. 00-1566; enlistado el 26 de septiembre de 2000, actualizado el 16 de septiembre de 2002 (2002)).

Como se usa aquí, el término "tumor sólido" se refiere a un crecimiento o masa anormal de tejido que usualmente no contiene quistes ni áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos (no cancerosos) o malignos (cancerosos). Los diferentes tipos de tumores sólidos se denominan por el tipo de células que los forman. Los ejemplos de tumores sólidos son sarcomas, carcinomas y linfomas. Las leucemias (cáncer de la sangre) generalmente no forman tumores sólidos (National Cáncer Institute, "Dictionary of Cáncer Terms").

Como se usa aquí, el término "cáncer primario" se refiere al tumor original o el primer tumor. El cáncer puede empezar en cualquier órgano o tejido del cuerpo. Usualmente se denomina por la parte del cuerpo o el tipo de célula en el cual se origina ("Metastatic Cáncer: Questions and Answers", "Cáncer Facts" 6.20, National Cáncer Institute, revisado el 1 de septiembre de 2004 (2004)).

Como se usa aquí, el término "carcinoma in situ" se refiere a células cancerosas que están contenidas todavía dentro del tejido en donde empezaron a crecer, y todavía no se han convertido en invasivas ni se han extendido a otras partes del cuerpo.

Como se usa aquí, el término "carcinoma" se refiere al cáncer de las células epiteliales, que son células que cubren la superficie del cuerpo, producen hormonas y constituyen glándulas. Los ejemplos de carcinomas son el cáncer de piel, pulmón, colon, estómago, mama, próstata y glándula tiroides.

Como se usa aquí, el término "molécula de ácido nucleico aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que está identificada y separada de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con el cual se asocia comúnmente en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislado es diferente de la forma o situación en la cual se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aislado se distinguen de la molécula de ácido nucleico que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que comúnmente expresan el anticuerpo, en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de las células naturales.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN implicadas en la expresión de una secuencia codificadora enlazada operativamente de un organismo hospedero particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión de ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, e incrementadores.

Un ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando se pone en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un ADN para presecuencia o guía secretoria se enlaza operativamente al ADN para un polipéptido si es expresado como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o incrementador está enlazado operativamente a una secuencia codificadora si afecta la trascripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosoma está enlazado operativamente a una secuencia codificadora si se coloca a fin de facilitar la traducción. Generalmente, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN enlazadas son contiguas, y en el caso de una guía secretoria, las secuencias son contiguas y están en el marco de lectura. Sin embargo, los incrementadores no tienen que ser contiguos. El enlace es realizado por ligación en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan oligonucleótidos adaptadores o enlazadores sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Como se usan aquí, las expresiones "célula", "línea de células", y "cultivo de células", se usan intercambiablemente y todas incluyen la progenie. De esta manera, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y cultivos derivados de la misma, sin importar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede ser no precisamente idéntica en su contenido de ADN debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie muíante que tiene la misma función o actividad biológica seleccionada en la célula originalmente transformada. Cuando se consideran distintas designaciones, estas se aclararán del contexto.

Como se usa aquí, la "reacción en cadena de polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o técnica con la cual se amplifican cantidades diminutas de una pieza específica de ácido nucleico, ARN y/o ADN, como se describe por ejemplo en la patente de EE. UU. No. 4,683,195. Generalmente es necesario tener disponible la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá, de tal manera que se puedan diseñar oligonucleótidos iniciadores; las secuencias de estos iniciadores serán idénticas o similares a cadenas opuestas del molde que se quiere amplificar. Los nucleótidos 5' terminales de los dos iniciadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. Se puede utilizar PCR para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas de ADN genómico total, y ADNc transcrito de ARN celular total, secuencias de bacteriófago o plásmido, etcétera; véase en general Mullís et al. (1987), Coló Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51 :263; Erlích, ed. (1989) "PCR Technology" (Stockton Press, N.Y.). Como se usa aquí, la PCR se considera un ejemplo, pero no el único, de un método de reacción de polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de prueba de ácido nucleico, que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como iniciador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar una pieza específica de ácido nucleico.

Como se usa aquí, el término "secuencia de línea germinal" se refiere a una secuencia de secuencias de ADN de inmunoglobulina no rearregladas, que incluyen secuencias de línea germinal de roedor (por ejemplo de ratón) y humano. Se puede usar cualquier fuente adecuada de ADN de inmunoglobulina no rearreglada. Las secuencias de línea germinal humanas se pueden obtener, por ejemplo, de las bases de datos de línea germinal JOINSOLVER® en el sitio Web del National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del United States National Institutes of Health. Las secuencias de línea germinal de ratón se pueden obtener, por ejemplo, como se describe en Giudicelli et al. (2005), Nucleic Acids Res. 33:D256-D261.

Para examinar la magnitud del incremento de la actividad de GITR, por ejemplo, muestras o pruebas que comprenden una proteína, gen, célula u organismo dado, son tratadas con un agente activador o inhibidor potencial y se comparan con muestras de control sin el agente. A las muestras de control, esto es, no tratadas con el agente, se les asigna un valor de actividad relativa de 100%. La inhibición se alcanza cuando el valor de la actividad con respecto al control es de aproximadamente 90% o menos, típicamente 85% o menos, típicamente 80% o menos, más típicamente 75% o menos, generalmente 70% o menos, más generalmente 65% o menos, muy generalmente 60% o menos, típicamente 55% o menos, usualmente 50% o menos, más usualmente 45% o menos, más usualmente 40% o menos, de preferencia 35% o menos, de preferencia 30% o menos, de preferencia 25% o menos, y muy de preferencia menos de 20%. La activación se logra cuando el valor de la actividad con respecto al control es de aproximadamente 110%, generalmente por lo menos 120%, más generalmente por lo menos 140%, más generalmente por lo menos 160%, frecuentemente por lo menos 180%, más frecuentemente por lo menos 2 veces más alto, más a menudo por lo menos 2.5 veces más alto, usualmente por lo menos 5 veces más alto, más usualmente por lo menos 10 veces más alto, preferiblemente por lo menos 20 veces más alto, muy preferiblemente por lo menos 40 veces más alto, y muy de preferencia más de 40 veces más alto.

Los puntos finales en la activación o inhibición se pueden monitorear de la siguiente manera. La activación, inhibición y respuesta al tratamiento, por ejemplo de una célula, fluido fisiológico, tejido, órgano, y sujeto animal o humano, pueden ser monitoreadas por un punto final. El punto final puede comprender una cantidad o porcentaje predeterminado, por ejemplo de un indicio de inflamación, oncogenicidad, o desgranulación o secreción celular, tal como la liberación de una citocina, oxígeno tóxico, o una proteasa. El punto final puede comprender, por ejemplo, una cantidad predeterminada de flujo o transporte iónico; migración celular; adhesión celular; proliferación celular; potencial de metástasis; diferenciación celular; y cambio de fenotipo; por ejemplo, cambio en la expresión de un gen relacionado con inflamación, apoptosis, transformación, ciclo celular o metástasis (véase por ejemplo Knight (2000), Ann. Clin. Lab. Sci. 30: 145-158; Hood y Cheresh (2002), Nature Rev. Cáncer 2:91-100; Timme et al. (2003), Curr. Drug Targets 4:251 -261 ; Robbins e Itzkowitz (2002), Med. Clin. North Am. 86:1467-1495; Grady y Markowitz (2002), Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauer et al. (2001), Glia 36:235-243; Stanimirovic y Satoh (2000), Brain Pathol. 10:1 13-126).

Un punto final de inhibición generalmente es 75% del control o menos, preferiblemente 50% del control o menos, muy preferiblemente 25% del control o menos, y muy de preferencia 10% del control o menos. Generalmente, un punto final de activación es de por lo menos 150% del control, preferiblemente por lo menos dos veces del control, más preferiblemente por lo menos cuatro veces del control, y muy de preferencia por lo menos 10 veces del control.

"Molécula pequeña" se define como una molécula con un peso molecular menor de 10 kDa, típicamente menor de 2 kDa, preferiblemente menor de 1 kDa. Las moléculas pequeñas incluyen, sin limitación, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas, moléculas orgánicas que contienen un componente inorgánico, moléculas que comprenden un átomo radioactivo, moléculas sintéticas, peptidomiméticos, y miméticos de anticuerpo. Como un agente terapéutico, una molécula pequeña puede ser más permeable a las células, menos susceptible a la degradación, y menos apta para provocar una respuesta inmune, que las moléculas grandes. Las moléculas pequeñas, tales como peptidomiméticos de anticuerpos y citocinas, y también toxinas de molécula pequeña, son conocidas en el campo; véase por ejemplo Casset et al. (2003), Biochem. Biophys. Res. Commun. 307: 198-205; Muyldermans (2001 ), J. Biotechnol. 74:277-302; Li (2000), Nal Biotechnol. 18:1251-1256; Apostolopoulos et al. (2002), Curr. Med. Chem. 9:411-420; Monfardini et al. (2002), Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Domínguez et al. (1999), Nat. Struct. Biol. 6:652-656; Sato y Soné (2003), Biochem. J. 371 :603-608; patente de EE. UU. No. 6,326,482.

Que se une "específicamente" o "selectivamente", al referirse a un ligando/receptor, anticuerpo/antígeno u otro par de unión, indica una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. De esta manera, bajo las condiciones designadas, un ligando específico se une a un receptor particular y no se une en grado significativo a otras proteínas presentes en la muestra. Como se usa aquí, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia dada (en este caso GITR), si se une a polipéptidos que comprenden la secuencia de GITR, pero no se une a proteínas que carecen de la secuencia GITR. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende GITR se puede unir a una forma marcada con FLAG® de GITR, pero no se unirá a otras proteínas marcadas con FLAG®.

El anticuerpo, o composición de unión derivada del sitio de unión de antígeno de un anticuerpo del método contemplado, se une a su antígeno con una afinidad que es por lo menos dos veces mayor, preferiblemente diez veces mayor, preferiblemente por lo menos 20 veces mayor, y de preferencia por lo menos 100 veces mayor que la afinidad por los antígenos no relacionados. En una modalidad preferida, el anticuerpo tendrá una afinidad que es mayor de aproximadamente 109 litros/mol, determinada por ejemplo mediante un análisis de Scatchard, Munsen et al. (1980), Analyt. Biochem. 107:220-239.

La "infección viral crónica" e "infección viral persistente", como se usa aquí, significa una infección viral de humanos y otros animales que es capaz de infectar a un hospedero y reproducirse dentro de las células del hospedero durante un periodo prolongado -usualmente de semanas, meses o años, sin llegar a ser fatal. Entre los virus que producen infecciones crónicas y que pueden ser tratados de acuerdo con la presente invención están los virus del papiloma humano (VPH), virus del herpes simple y otros virus de herpes, los virus de la hepatitis B y C (VHB y VHC), así como también otros virus de hepatitis, el virus de sarampión, todos los cuales puede producir enfermedades clínicas importantes, y el VIH. La infección prolongada puede llevar finalmente a una enfermedad que, por ejemplo en el caso del cáncer del hígado por virus de hepatitis C, puede ser fatal para el paciente. Otras infecciones virales crónicas que pueden ser tratadas de acuerdo con la presente invención incluyen él virus de Epstein Barr (EBV), así como también otros virus como los que pueden estar asociados con tumores, o en el caso de animales, varias enfermedades virales veterinarias, por ejemplo los de animales domésticos o animales de granja importantes en la agricultura.

El término "actividad antiviral" se refiere a la inhibición de la transmisión viral a células no infectadas, inhibición de la replicacion de un virus, prevención de que el virus se establezca por sí solo en un hospedero, o mejoramiento o alivio de los síntomas de la enfermedad causada por la infección viral. Estos efectos pueden ponerse de manifiesto por una reducción de la carga viral o una disminución en la mortalidad y/o morbilidad, cuyas pruebas se describen mas abajo. Un agente o fármaco antiviral tiene actividad antiviral y es útil para el tratamiento de infecciones virales persistentes o crónicas, solo o como parte de una terapia de combinación de múltiples fármacos.

II. Generalidades La presente invención provee anticuerpos anti-GITR construidos por ingeniería, y usos de los mismos para tratar trastornos inmunes, en particular la respuesta deteriorada a las enfermedades infecciosas (que incluyen las infecciones virales) y el cáncer.

La GITR, también conocida como TNFRSF18, es un receptor que pertenece a la superfamilia de TNR-R. Hasta la fecha no están disponibles las estructuras de cristal de GITR de humano o ratón; sin embargo, se puede establecer una arquitectura modular de la molécula basándose en los estudios descritos, por ejemplo, por Naismith y Sprang (1998), Trends Biochem. Sci. 23:74-79. La figura 2 ilustra que la GITR humana se puede dividir en 6 módulos. De los estudios siguientes, algunos anticuerpos que tiene actividad agonista pueden tener epítopes conformacionales que abracan los módulos 3 y 4.

III. Generación de anticuerpos específicos de GITR Se puede usar cualquier método adecuado para generar anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, un receptor se puede inmunizar con GITR o un fragmento de la misma. Se puede usar cualquier método adecuado de inmunización. Tales métodos pueden incluir adyuvantes, otros inmunoestimuladores, inmunizaciones de refuerzo repetidas, y el uso de una o más rutas inmunización. Se puede usar cualquier fuente adecuada de GITR como el inmunogeno para la generación del anticuerpo no humano de las composiciones y métodos aquí descritos. Tales formas incluyen, sin limitación, proteína completa, péptidos, y epítopes generados por medios recombinantes, sintéticos, químicos o de degradación enzimática conocidos. En modalidades preferidas, el inmunógeno comprende la porción extracelular de GITR.

Se puede usar cualquier forma del antígeno para generar el anticuerpo que sea suficiente para generar un anticuerpo biológicamente activo. De esta manera, el antígeno de evocación puede ser un solo epítope, múltiples epítopes, o la proteína completa sola o en combinación con uno o más agentes intensificadores de inmunogenicidad conocidos. El antígeno de evocación puede ser una proteína de longitud completa aislada, una proteína de superficie celular (por ejemplo inmunizando con células transfectadas con al menos una porción del antígeno), o una proteína soluble (por ejemplo inmunizando solo con la porción de dominio extracelular de la proteína). El antígeno se puede producir en una célula modificada genéticamente. El ADN que codifica el antígeno puede ser genómico o no genómico (por ejemplo, ADNc), y codifica por lo menos una porción del dominio extracelular. Como se usa aquí, el término "porción" se refiere al número mínimo de aminoácidos o ácidos nucleicos, según sea apropiado, para constituir un epítope inmunogénico del antígeno de interés. Se puede utilizar cualquier vector genético adecuado para la transformación de las células de interés, incluyendo sin limitación vectores adenovirales, plásmidos y vectores no virales tales como lípidos catiónicos.

Se puede usar cualquier método adecuado para evocar un anticuerpo con las propiedades biológicas deseadas para incrementar la señalización de GITR. Es deseable preparar anticuerpos monoclonales (mAbs) de varios hospederos mamíferos, tales como ratones, ratas, otros roedores, humanos y otros primates, etcétera. La descripción de las técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales se puede encontrar por ejemplo en Stites et al. (eds.) "Basic And Clinical Immunology" (4a ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, California, y las referencias ahí citadas; Harlow y Lañe (1988), "Antibodies: A Laboratory Manual" CSH Press; Goding (1986), "Monoclonal Antibodies: Principies And Practice" (2a ed.) Academic Press, Nueva York, NY. De esta manera, se pueden obtener anticuerpos monoclonales mediante una variedad de técnicas que son familiares para los investigadores expertos en la materia. Típicamente, células de bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado son inmortalizadas, comúnmente por fusión con una célula de mieloma; véase Kohler y Milstein (1976), Eur. J. Immunol. 6:511-519. Métodos alternativos de inmortalización incluyen transformación con el virus de Epstein Barr, oncogenes o retrovirus, u otros métodos conocidos; véase por ejemplo Doyle et al. (eds., 1994 y suplementos periódicos), "Cell And Tissue Culture: Laboratory Procedures", John Wiley and Sons, Nueva York, NY. Las colonias que se originan de células inmortalizadas individuales son examinadas y seleccionadas por la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad por el antígeno deseadas, y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por dichas células se puede incrementar mediante varias técnicas que incluyen inyección en la cavidad peritoneal de un hospedero vertebrado. Alternativamente, se pueden aislar secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de antígeno del mismo examinando una colección de ADN de células B humanas, por ejemplo de acuerdo con el protocolo general descrito por Huse et al. (1989), Science 246:1275-1281.

Otras técnicas adecuadas incluyen la selección de colecciones de anticuerpo en vectores de fago o vectores similares; véase por ejemplo, Huse ef al. supra; y Ward et al. (1989), Nature 341 :544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden usar con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos serán marcados enlazándolos, covalentemente o no covalentemente, con una sustancia que provee una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación y se reportan extensamente en la literatura tanto científica como de patentes. Las marcas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas, etcétera. Las patentes que enseñan el uso de tales marcas incluyen las patentes de EE. UU. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4.366,241. También, se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes; véase Cabilly, patente de EE. UU. No. 4,816,567; y Queen ef al. (1989), Frac. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033; o se pueden hacer en ratones transgénicos, véase Méndez et al. (1997), Nature Genetics 15:146-156; véanse también las tecnologías de Abgenix y Medarex.

Alternativamente, se pueden producir anticuerpos monoclonales por enriquecimiento de poblaciones clónales de células B aisladas de los bazos de animales (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, etc.), inmunizados con GITR humana (véase, por ejemplo, WO2008045140, US5627052 y US20030186327).

Los anticuerpos o composiciones de unión contra fragmentos predeterminados de GITR se pueden desarrollar por inmunización de animales con conjugados de polipéptido, fragmentos, péptidos o epitopes con proteínas portadoras. Los anticuerpos monoclonales se preparan de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se pueden examinar y seleccionar por su unión a GITR normal o defectuosa. Estos anticuerpos monoclonales usualmente se unirán con una Kd de por lo menos aproximadamente 1 µ?, más usualmente por lo menos aproximadamente 300 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, o más, usualmente determinada por medio de ELISA o Biacore. Los anticuerpos no humanos adecuados también se pueden identificar usando las pruebas biológicas que se describen más abajo en los ejemplos 5 y 6.

Los hibridomas que corresponden a los clones 36E5, 3D6, 61 G6, 6H6 y 61 F6 se depositaron conforme al Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo ("ATCC") como PTA-9890, PTA-9889, PTA-9891 , PTA-9892 y PTA-9893, respectivamente, el 25 de marzo de 2009.

Los hibridomas que corresponden a los clones 1 D8, 17F10, 35D8, 49A1 , 9E5, y 31 H6 se depositaron conforme al Tratado de Budapest en la ATCC el 21 de agosto de 2009, como PTA-10286, PTA-10287, PTA-10288, PTA-10289, PTA-10290 y PTA-10291.

IV. Humanización de anticuerpos específicos de GITR Se puede usar cualquier anticuerpo no humano adecuado como una fuente de la región hipervariable. Las fuentes de anticuerpos no humanos incluyen, sin limitación, murinas (por ejemplo Mus musculus), de rata (por ejemplo Rattus norvegicus), lagomorfos (incluyendo conejos), bovinos y primates. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales residuos de la región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos Fv de la región de armazón (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para retinar más la actividad biológica deseada del anticuerpo. Para más detalles véase Jones et al. (1986), Nature 321 :522-525; Reichmann et al. (1988), Nature 332:323-329; y Presta (1992), Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.

Se han descrito métodos para construir anticuerpos por ingeniería recombinante, por ejemplo en Boss et al. (patente de EE. UU. No. 4,816,397), Cabilly et al. (patente de EE. UU. No. 4,816,567), Law et al. (publicación de la solicitud de patente europea No. 438310), y Winter (publicación de la solicitud de patente europea No. 239400).

Las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-GITR humanizado se preparan introduciendo cambios de nucleótidos adecuados en el ADN del anticuerpo anti-GITR humanizado, o mediante síntesis de péptido. Tales variantes incluyen, por ejemplo, supresiones o inserciones, o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos mostradas para el anticuerpo anti-GITR humanizado. Se hace cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución, para llegar a la construcción final, con la condición de que la construcción final tenga las características deseadas. Los cambios de aminoácido también pueden alterar procesos posteriores a la traducción del anticuerpo anti-GITR humanizado, por ejemplo cambiar el número o posición de sitios de glicosilación.

Un método útil para identificar algunos residuos o regiones del polipéptido del anticuerpo anti-GITR humanizado que son sitios preferidos para mutagénesis, se denomina "mutagénesis de exploración de alanina", como lo describen Cunningham y Wells (1989), Science 244: 1081-1085. Aquí, un residuo o grupos de residuos objetivo son identificados (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu), y reemplazados por aminoácidos neutros o cargados negativamente (muy preferiblemente alanina o polialanina), para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno GITR. Después, los residuos de aminoácido que muestran sensibilidad funcional a las sustituciones son refinados introduciendo variantes adicionales u otras variantes en o para los sitios de sustitución. De esta manera, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácido es predeterminado, no se requiere predeterminar la naturaleza de la mutación per se. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, la exploración de Ala o la mutagénesis aleatoria se realizan en el codón o región objetivo, y las variantes expresadas del anticuerpo anti-GITR humanizado se seleccionan por la actividad deseada.

Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de extremos amino y/o carboxilo que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como también inserciones intrasecuencia de un solo residuo de aminoácido o múltiples residuos de aminoácido. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen el anticuerpo anti-GITR humanizado con un residuo metionilo N-terminal, o el anticuerpo fusionado con una cola de epítope. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti-GITR humanizado incluyen la fusión del extremo N o C del anticuerpo anti-GITR humanizado con una enzima o un polipéptido que aumenta la vida media del anticuerpo en el suero.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen por lo menos un residuo de aminoácido de la molécula de anticuerpo anti-GITR humanizado cambiado por un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para mutagénesis de sustitución incluyen los lazos hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR.

Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. "Alterar" significa suprimir una o más porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de anticuerpos típicamente es N-enlazada u O-enlazada. La glicosilación N-enlazada se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La glicosilación O-enlazada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se efectúa convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos para que contenga una o más de las secuencias de tripéptido anteriormente descritas (para sitios de glicosilación N-enlazados). La alteración también se puede hacer mediante la adición o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación O-enlazados).

Otro tipo de variante de aminoácido es la sustitución de residuos para proveer mayor estabilidad química al anticuerpo humanizado final. Por ejemplo, un residuo de asparagina (N) se puede cambiar para reducir el potencial de formación de isoaspartato en cualquier secuencia NG dentro de una CDR de roedor. Un problema similar puede ocurrir en una secuencia DG: Reissner y Aswad (2003), Cell. Mol. Life Sci. 60:1281. La formación de isoaspartato puede debilitar o anular completamente la unión de un anticuerpo a su antígeno objetivo: Presta (2005), J. Allergy Clin. Immunol. 1 16:731 a 734. En una modalidad, la asparagina se cambia a glutamina (Q). Además, los residuos de metionina en las CDRs de roedor se pueden cambiar para reducir la posibilidad de que el azufre de la metionina se oxide, lo que podría reducir la afinidad de unión del antígeno y también contribuir a la heterogeneidad molecular en la preparación final del anticuerpo: ídem. En una modalidad, la metionina se cambia a alanina (A). Los anticuerpos con tales sustituciones son examinados subsiguientemente para asegurar que las sustituciones no disminuyan la afinidad de unión de GITR a valores inaceptables.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácido del anticuerpo humanizado específico de GITR se preparan mediante una variedad de métodos conocidos. Estos métodos incluyen, sin limitación, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes naturales de secuencia de aminoácidos), o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida al sitio), mutagénesis de PCR, y mutagénesis de cásete de una variante preparada previamente o una versión no variante del anticuerpo anti-GITR humanizado.

Ordinariamente, las variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-GITR humanizado tendrán una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 75% de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de aminoácido originales de anticuerpo humanizado de la cadena pesada o ligera, preferiblemente por lo menos 80%, preferiblemente por lo menos 85%, preferiblemente por lo menos 90%, y de preferencia por lo menos 95%, 98% o 99%. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define aquí como el porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos de anti-GITR humanizado, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. No se debe construir ninguna de las extensiones, supresiones o inserciones N-terminales, C-terminales o internas en la secuencia del anticuerpo que afecte la identidad u homología de la secuencia.

El anticuerpo humanizado se puede seleccionar de cualquier clase de inmunoglobulinas, que incluyen IgM, IgG, IgD, IgA e IgE. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Se puede usar cualquier isotipo de IgG, incluyendo IgGi, lgG2, lgG3, e lgG4. También se contemplan variantes de los isotipos de IgG. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo. La optimización de las secuencias de dominio constante necesarias para generar la actividad biológica deseada se logra fácilmente examinando los anticuerpos en pruebas biológicas que se describen en los ejemplos.

Similarmente, se puede usar cualquier clase de cadena ligera en las composiciones y métodos de la presente. Específicamente, en las presentes composiciones y métodos son útiles los isotipos kappa, lambda, o variantes de los mismos.

Se puede utilizar cualquier porción adecuada de las secuencias CDR del anticuerpo no humano. Las secuencias CDR se pueden mutar por sustitución, inserción o eliminación de por lo menos un residuo, del tal manera que la secuencia CDR sea distinta de la secuencia utilizada de anticuerpo humano y no humano. Se contempla que dichas mutaciones serían mínimas.

Normalmente por lo menos 75% de los residuos de anticuerpo humanizado corresponderán a los residuos de CDR no humanos, más frecuentemente 90%, y de preferencia más de 95%.

Se puede utilizar cualquier porción adecuada de las secuencias FR del anticuerpo humano. Las secuencias FR se pueden mutar por sustitución, inserción o eliminación de por lo menos un residuo, de tal manera que la secuencia FR sea distinta de la secuencia utilizada de anticuerpo humano y no humano. Se contempla que tales mutaciones serían mínimas. Normalmente por lo menos 75% de los residuos de anticuerpo humanizado corresponderán a los residuos FR humanos, frecuentemente más de 90%, y muy de preferencia más de 95%, 98% o 99%.

Los residuos de CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición estándar de secuencias de Kabat: Kabat et al. (1987) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda Maryland. Las SEQ ID NOs: 1-1 1 muestran las secuencias de dominio variable de cadena pesada de varios anticuerpos anti-GITR humana de roedor, y las SEQ ID NOs: 12-22 representan las secuencias de dominio variable de cadena ligera.

CUADRO 2 Secuencias y dominios de cadena pesada CUADRO 3 Secuencias y dominios de cadena ligera En una modalidad, las CDRs incluyen variantes de cualquier CDR de secuencia individual descrita en la presente (SEQ ID NOs: 23-88), en la cual la variante comprende 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más sustituciones conservativas de aminoácido con respecto a la secuencia descrita, como se determina usando los datos del cuadro 1.

También se contemplan anticuerpos quiméricos. Como se indicó arriba, los anticuerpos quiméricos típicos comprenden una porción de la cadena pesada o ligera igual u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular, o que pertenece a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de las cadenas es igual u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como también fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 4,816,567; y Morrison et al. (1984), Proc. Nati. Acad. Sci. USA: 81 : 6851-6855.

Los anticuerpos biespecíficos también son útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se usa aquí, el término "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo, típicamente un anticuerpo monoclonal, que tiene especificidades de unión para por lo menos dos epítopes antigénicos diferentes. En una modalidad, los epítopes son del mismo antígeno. En otra modalidad, los epítopes son de dos antígenos diferentes. Los métodos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos biespecíficos por vía recombinante usando la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina; véase por ejemplo Milstein et al. (1983), Nature 305: 537-39. Alternativamente, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar usando enlace químico; véase por ejemplo Brennan et al. (1985), Science 229:81. Los anticuerpos biespecíficos incluyen fragmentos de anticuerpo biespecíficos; véase por ejemplo Holliger et al. (1993), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48; Gruber et al. (1994), J. Immunol. 152:5368.

En otras modalidades, se pueden añadir diferentes dominios constantes en regiones VL y VH humanizadas derivadas de las CDRs aquí provistas. Por ejemplo, si un uso particular deseado de un anticuerpo (o fragmento) de la presente invención fuera requerir funciones efectoras alteradas, se puede usar un dominio constante de cadena pesada diferente de lgG1. Aunque los anticuerpos lgG1 proveen una vida media prolongada y funciones efectoras, tales como activación del complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, tales actividades pueden no ser deseables en todos los usos del anticuerpo. En tales casos se puede usar un dominio constante de lgG4 o lgG2, por ejemplo.

Las formas progenitoras y construidas por ingeniería de los anticuerpos de la presente invención también se pueden conjugar con una porción química. La porción química puede ser, entre otras, un polímero, un radionúclido o un factor citotóxico. Preferiblemente, la porción química es un polímero que aumenta la vida media de la molécula de anticuerpo en el cuerpo de un sujeto. Los polímeros adecuados incluyen, sin limitación, polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, PEG con un peso molecular de 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa), dextrano y monometoxipolietilenglicol (mPEG). Lee et al. (1999) {Bioconj. Chem. 10:973-981) describen anticuerpos de una sola cadena conjugados con PEG. Wen et al., (2001) (Bioconj. Chem. 12:545-553) describen la conjugación de anticuerpos con PEG que está unido a un quelatador de radiometal (ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA)).

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo o las proteínas solubles GITR o fragmentos de las mismas de la invención, también se pueden conjugar con marcas tales como "Te, 90Y, 111ln, 32P, 14C, 125l, 3H, 131l, 1 1C ) 150| 13N j 18F j 35S_ 51 ^ 57?() ? 226Ra 60CO ) 59^ 152^ 67C U ) 217^ 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr y 56Fe.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo o las proteínas solubles GITR o fragmentos de las mismas de la invención, también se pueden conjugar con marcas fluorescentes o marcas quimioluminiscentes, que incluyen fluoróforos tales como quelatos de tierras raras, fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, isotiocianato, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftalaldehído, fluorescamina, 52Eu, dansilo, umbeliferona, luciferina, marca luminal, marca isoluminal, una marca de éster de acridinio aromático, una marca de imidazol, una marca de sal de acridinio, una marca de éster de oxalato, una marca de aequorin, 2,3-dihidroftalazindionas, biotina/avidina, marcas de espín y radicales libres estables.

Se puede utilizar cualquier método conocido para conjugar las moléculas de anticuerpo o moléculas de proteína de la invención con las diversas porciones, incluyendo los métodos descritos por Hunter et al. (1962) Nature 144:945; David et al. (1974) Biochemistry 13:1014; Pain et al. (1981), J. Immunol. Meth. 40:219; y Nygren, J. (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407. Los métodos para conjugar anticuerpos y proteínas son convencionales y muy conocidos.

V. Actividad biológica de los anticuerpos anti-GITR humanizados Los anticuerpos que tienen las características aquí identificadas como deseables en un anticuerpo anti-GITR humanizado se pueden examinar para determinar su actividad biológica inhibidora in vitro o la afinidad de unión adecuada. Los anticuerpos agonistas se pueden distinguir de los anticuerpos antagonistas usando la prueba biológica provista en el ejemplo 5. Los anticuerpos que exhiben actividad agonista no bloquearán la actividad de GITR, en vez de eso estimularán la respuesta mediada normalmente por la señalización de GITR.

Para examinar los anticuerpos que se unen al epítope en la GITR humana enlazada por un anticuerpo de interés (por ejemplo los que bloquean la unión de GITR), se puede hacer una prueba rutinaria de bloqueo cruzado como la que se describe en "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow and David Lañe (1988). Los anticuerpos que se unen al mismo epítope probablemente se bloquean cruzadamente en dichas pruebas, pero no necesariamente todos los anticuerpos bloqueados cruzadamente se unirán precisamente en el mismo epítope, puesto que el bloqueo cruzado puede originarse del impedimento estérico de la unión del anticuerpo por anticuerpos que se unen en epítopes traslapados, o incluso epítopes vecinos no traslapados.

Alternativamente, se puede hacer un mapeo del epítope, por ejemplo como lo describen Champe et al. (1995), J. Biol. Chem. 270: 1388-1394, para determinar si el anticuerpo se une a un epítope de interés. También se puede usar la "mutagénesis de exploración de alanina", descrita por Cunningham y Wells (1989), Science 244:1081-1085, o alguna otra forma de mutagénesis de punto de residuos de aminoácido en la GITR humana, para determinar el epítope funcional para un anticuerpo anti-GITR de la presente invención. Sin embargo, los estudios de mutagénesis también pueden revelar residuos de aminoácido que son cruciales para la estructura tridimensional general de GITR, pero que no están involucrados directamente en los contactos anticuerpo-antigeno, y por lo tanto pueden ser necesarios otros métodos para confirmar un epítope funcional determinado usando este método.

El epítope enlazado por un anticuerpo específico también puede ser determinado evaluando la unión del anticuerpo a péptidos que comprenden fragmentos de GITR humana (SEQ ID NO: 41). Se puede sintetizar una serie de péptidos traslapados que abarcan la secuencia de GITR y examinarse para determinar su unión, por ejemplo en una ELISA directa, una ELISA competitiva (en donde se evalúa la capacidad del péptido para impedir la unión de un anticuerpo a GITR enlazada a un pocilio de una placa de microtitulación), o sobre un chip. Tales métodos de examen de péptido pueden no ser capaces de detectar algunos epítopes funcionales discontinuos, esto es, epítopes funcionales que incluyen residuos de aminoácido que no son contiguos a lo largo de la secuencia primaria de la cadena del polipéptido GITR.

El epítope enlazado por los anticuerpos de la presente invención también se puede determinar mediante métodos estructurales tales como determinación de estructura de cristal por rayos X (por ejemplo, WO2005/044853), modelación molecular y espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), incluyendo determinación por RMN de las relaciones de intercambio H-D de hidrógenos de amida lábiles en GITR, cuando están libres y cuando están enlazados en un complejo con un anticuerpo de interés (Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31 :11335-1 1347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32:6884-6891 ).

Con respecto a la cristalografía de rayos X, la cristalización se puede efectuar usando cualquiera de los métodos conocidos (por ejemplo, Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23), que incluyen por microlote (por ejemplo, Chayen (1997) Structure 5: 1269-1274), difusión de vapor de gota colgante (por ejemplo, McPherson (1976), J. Biol. Chem. 251 :6300-6303), sembrado y diálisis. Es deseable utilizar una preparación de proteína que tiene una concentración de por lo menos aproximadamente 1 mg/ml, de preferencia aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. La cristalización se logra mejor en una solución precipitante que contiene polietilenglicol 1000-20,000 (PEG; peso molecular promedio que varía de aproximadamente 1000 Da a aproximadamente 20,000 Da), de preferencia de aproximadamente 5000 Da a aproximadamente 7000 Da, de preferencia aproximadamente 6000 Da, con concentraciones que varían de aproximadamente 10% a aproximadamente 30% (?? ). También puede ser deseable incluir un agente estabilizador de proteína, por ejemplo glicerol, a una concentración que varía de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 20%. También puede ser deseable una sal adecuada como cloruro de sodio, cloruro de litio o citrato de sodio en la solución precipitante, preferiblemente en una concentración que varía de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1000 mM. El precipitante se hace amortiguador a un pH preferible de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 5.0, de preferencia aproximadamente 4.0. Los amortiguadores específicos útiles en la solución precipitante pueden variar y son muy conocidos: Scopes, "Protein Purification: Principies and Practice", tercera ed., (1994) Springer-Verlag, Nueva York. Los ejemplos útiles de amortiguadores incluyen, sin limitación, HEPES, Tris, MES y acetato. Los cristales se pueden desarrollar en una amplia gama de temperaturas, que incluyen 2 °C, 4 °C, 8 °C y 26 °C.

Los cristales anticuerpo:antígeno se pueden estudiar usando técnicas muy conocidas de difracción de rayos X, que se pueden refinar usando software de computadora como X-PLOR (Yale University, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.; véase por ejemplo Blundell y Johnson (1985), Meth. Enzymol. 1 14 y 115; H. W. Wyckoff et al. eds., Academic Press; publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 2004/0014194), y BUSTER (Bricogne (1993), Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997), Meth. Enzymol. 276A:361-423, Cárter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000), Acta Cryst. D56:1313-1323).

Anticuerpos adicionales que se unen al mismo epítope como un anticuerpo de la presente invención, se pueden obtener, por ejemplo, examinando anticuerpos desarrollados contra GITR para determinar su unión al epítope, o mediante inmunización de un animal con un péptido que comprende un fragmento de GITR humana que comprende la secuencia del epítope. Sería de esperarse que los anticuerpos que se unen al mismo epítope funcional exhiban actividades biológicas similares, tales como bloquear la unión del receptor, y dichas actividades se pueden confirmar mediante pruebas funcionales de los anticuerpos.

Las afinidades del anticuerpo se pueden determinar usando un análisis estándar. Los anticuerpos humanizados preferidos son los que se unen a la GITR humana con un valor de Kd no mayor de aproximadamente 1x10"7; de preferencia no mayor de aproximadamente 1x10"8; de preferencia no mayor de aproximadamente 1x10"9; y muy de preferencia no mayor de 1x10"10, o incluso 1x10"11 M.

Los anticuerpos y fragmentos de los mismos que son útiles en las presentes composiciones y métodos son anticuerpos y fragmentos biológicamente activos. Como se usa aquí, el término "biológicamente activo" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es capaz de unirse al epítope antigénico deseado y ejerce un efecto biológico directamente o indirectamente. Como se usa aquí, el término "específico" se refiere a la unión selectiva del anticuerpo al epítope del antígeno objetivo. Los anticuerpos se pueden analizar para determinar la especificidad de unión comparando la unión a GITR con la unión a un antígeno o mezcla de antígenos irrelevantes bajo un grupo dado de condiciones. Si el anticuerpo se une a GITR por lo menos 10 veces más, y preferiblemente 50 veces más, que al antígeno o mezcla de antígenos ¡rrelevantes, entonces se considera específico. Un anticuerpo que "se une específicamente" a GITR no se une a las proteínas que no comprenden las secuencias derivadas de GITR; esto es, "especificidad", como se usa aquí, se refiere a la especificidad de GITR, y no cualquier otra secuencia que pueda estar presente en la proteína en cuestión. Por ejemplo, como se usa aquí, un anticuerpo que "se une específicamente" a un polipéptido que comprende GITR típicamente se unirá a FLAG®-GITR, que es una proteína de fusión que comprende GITR y una marca de péptido FLAG®, pero no se unirá a la marca de péptido FLAG® sola o cuando está fusionada con una proteína diferente de GITR.

Los compuestos de unión específicos de GITR de la invención, tales como anticuerpos agonistas específicos de GITR, pueden intensificar la actividad biológica de cualquier manera que incluye, sin limitación, aumentar la respuesta inmune a una infección microbiana.

VI. Composiciones farmacéuticas Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles que incluyen un anticuerpo de GITR, el análogo de citocina o muteína, el anticuerpo para el mismo, o el ácido nucleico del mismo, se mezcla con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable; véase por ejemplo "Remington's Pharmaceutical Sciences" y la Farmacopea de EE. UU: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania (1984).

Las formulaciones de agentes terapéuticos y diagnósticos se pueden preparar mezclándolos con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables, por ejemplo en forma de polvos liofilizados, suspensiones, soluciones o suspensiones acuosas (véase por ejemplo Hardman et al. (2001 ) "Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics", McGraw-Hill, Nueva York, NY; Gennaro (2000), "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott, Williams y Wilkins, Nueva York, NY; Avis et al. (eds.) (1993), "Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications", Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990), "Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets", Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990), "Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems", Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000), "Excipient Toxicity and Safety", Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY).

La toxicidad y la eficacia terapéutica de las composiciones de anticuerpo, administradas solas o en combinación con un agente inmunosupresor, pueden ser determinadas por medio de procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos de células o en animales experimentales, por ejemplo para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de las dosis entre el efecto tóxico y el terapéutico es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación de DL50 a DE50. Se prefieren los anticuerpos que exhiben índices terapéuticos altos. Los datos obtenidos de estas pruebas de cultivo de células y estudios en animales se pueden usar para formular una escala de dosificación para ser utilizada en humanos. Las dosis de dichos compuestos están preferiblemente dentro de la escala de las concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. Las dosis pueden variar dentro de esta escala dependiendo de la forma farmacéutica y la vía de administración utilizadas.

El modo de administración no es particularmente Importante.

Las vías de administración adecuadas pueden ser, por ejemplo, administración oral, rectal, transmucosal o intestinal; suministro parenteral que incluye inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, y también inyección intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o infraocular. La administración del anticuerpo usado en la composición farmacéutica o para practicar el método de la presente invención, se puede efectuar en una variedad de formas convencionales tales como ingestión oral, inhalación, aplicación tópica o cutánea, inyección subcutánea, intraperitoneal, parenteral, intraarterial o intravenosa.

Alternativamente, el anticuerpo se puede suministrar de forma local en lugar de sistémica, por ejemplo mediante la Inyección directa del anticuerpo en una articulación artrítica o una lesión inducida por patógeno caracterizada por inmunopatología, frecuentemente en una formulación de depósito o liberación sostenida. Además, el anticuerpo se puede administrar en un sistema de suministro dirigido de fármaco, por ejemplo en un liposoma recubierto con un anticuerpo especifico de tejido, dirigiéndolo por ejemplo a una articulación artrítica o lesión inducida por patógeno caracterizada por inmunopatología. Los liposomas serán dirigidos al tejido afectado, en donde serán tomados selectivamente.

La selección de un régimen de administración para un agente terapéutico depende de varios factores que incluyen la velocidad de recambio del agente en el suero o tejido, la gravedad de los síntomas, la inmunogenicidad de la entidad, y la accesibilidad de las células objetivo en la matriz biológica. Preferiblemente, un régimen de administración maximiza la cantidad de agente terapéutico suministrado al paciente consistentemente con un grado aceptable de efectos secundarios. Por consiguiente, la cantidad suministrada de agente biológico depende en parte de la entidad particular y la severidad de la afección tratada. Se tienen disponibles guías para seleccionar dosis adecuadas de anticuerpos, citocinas, y moléculas pequeñas; véase por ejemplo Wawrzynczak (1996), "Antibody Therapy", Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, Reino Unido; Kresina (ed.) (1991 ), "Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis", Marcel Dekker, Nueva York, NY; Bach (ed.) (1993), "Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases", Marcel Dekker, Nueva York, NY; Baert et al. (2003), New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al. (1999), New Engl. J. Med. 341 : 1966-1973; Slamon et al. (2001), New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000), New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003), New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000), New Engl. J. Med. 343:1594-1602.

El clínico determina la dosis adecuada, por ejemplo, usando parámetros o factores conocidos o supuestos que afectan el tratamiento o que se predice que afectan el tratamiento. Generalmente la dosis se empieza con una cantidad un poco menor de la dosis óptima y posteriormente se aumenta en pequeños incrementos hasta obtener el efecto deseado u óptimo con respecto a cualquier efecto secundario negativo. Las medidas diagnósticas importantes incluyen las de los síntomas, por ejemplo, la inflamación o la cantidad de citocinas inflamatorias producidas. Preferiblemente, un producto biológico que se desea utilizar se deriva sustancialmente de la misma especie que el animal objetivo de tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo humanizado para el tratamiento de sujetos humanos), minimizando así cualquier respuesta inmune al reactivo.

Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y citocinas pueden ser provistos por infusión continua, o por dosis a intervalos de por ejemplo un día, una semana, 1-7 veces por semana, cada semana, cada dos semanas, cada mes, cada dos meses, etc. Las dosis pueden ser provistas por vía intravenosa, subcutánea, tópica, oral, nasal, rectal, intramuscular, intracerebral, intraespinal, o por inhalación. Un protocolo de administración de dosis preferido es el que incluye la dosis máxima o la frecuencia de dosis que evita efectos secundarios indeseables significativos. Por lo general, una dosis total semanal es de por lo menos 0.05 pg/kg, 0.2 pg/kg, 0.5 pg/kg, 1 pg/kg, 10 pg/kg, 100 pg/kg, 0.2 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, o 50 mg/kg de peso corporal, o más; véase, por ejemplo, Yang ef al. (2003), New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold et al. (2002), New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu et al. (1999), J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451 -456; Portielji et al. (2003), Cáncer Immunol. Immunother. 52:133-144. La dosis deseada de un agente terapéutico de molécula pequeña, por ejemplo un peptidomimético, producto natural, o compuesto químico orgánico, es aproximadamente la misma que para un anticuerpo o polipéptido, en una base de moles/kg.

Como se usa aquí, "inhibir" o "tratar" o "tratamiento" incluye un aplazamiento del desarrollo de los síntomas asociados con la enfermedad autoinmune o inmunopatología inducida por patógeno, o una reducción de la severidad de dichos síntomas que se desarrollan o que se espera se desarrollen. Los términos también incluyen aliviar los síntomas inmunopatológicos relacionados con autoinmunidad descontrolada o no deseada o inducida por patógeno, prevenir síntomas adicionales y aliviar o prevenir las causas subyacentes de dichos síntomas. De esta manera, los términos denotan que se ha conferido un resultado benéfico a un sujeto vertebrado con una enfermedad o síntoma inmunopatológico autoinmune o inducido por patógeno, o con el potencial de desarrollar dicha enfermedad o síntoma.

Como se usa aquí, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto de unión específico de GITR, por ejemplo un anticuerpo, que cuando se administra sola o en combinación con un agente terapéutico adicional a una célula, tejido o sujeto, es efectiva para prevenir o aliviar la enfermedad autoinmune o enfermedad o afección asociada con inmunopatología inducida por patógeno, o el avance de la enfermedad. Una dosis terapéuticamente eficaz también se refiere a aquella cantidad del compuesto suficiente para aliviar los síntomas, por ejemplo, tratamiento, sanación, prevención o alivio de la afección relevante, o un incremento en la velocidad de tratamiento, sanación, prevención o alivio de dichas afecciones. Cuando se aplica a un individuo el ingrediente activo solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica en una combinación, la dosis terapéuticamente eficaz se refiere a las cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, administradas en combinación, en serie, o simultáneamente. Típicamente, una cantidad eficaz de agente terapéutico reducirá los síntomas en por lo menos 10%; usualmente por lo menos 20%; de preferencia por lo menos 30%; de preferencia por lo menos 40%; y muy de preferencia por lo menos 50%.

Son muy conocidos los métodos de coadministración o tratamiento con un segundo agente terapéutico, por ejemplo una citocina, anticuerpo, esteroide, agente quimioterapéutico, antibiótico, o radiación; véase por ejemplo Hardman et al. (eds.) (2001), "Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics", 10a ed., McGraw-Hill, Nueva York, NY; Poole y Peterson (eds.) (2001), "Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach", Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania; Chabner y Longo (eds.) (2001 ), "Cáncer Chemotherapy and Biotherapy", Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, Pensilvania.

Los agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida CYTOXAN®; alquisulfonatos como busulfan, iprosulfan y piposulfan; aziridinas como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (que incluye el análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (que incluye sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoflcina 8); dolastatina; duocarmicina (que incluye los análogos sintéticos KW-2189 y CB 1-TMI); eleuterobin; pancratistatin; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos como los antibióticos de enediino (por ejemplo caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma II y caliqueamicina omega II (véase, por ejemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, que incluye dinemicina A; bisfosfonatos tales como clodronato; esperamicina; así como también neocarzinostatin cromóforo y cromóforos antibióticos relacionados de cromoproteína enediina), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (que incluyen morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxi-doxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; y antimetabolitos tales como metotrexate y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico como denopterin, metotrexate, pteropterina, trimetrexate; análogos de purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedores de ácido fólico como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxate; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; eliptinio acétate; una epotilona; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides como maitancina y ansamitocinas; mitoguazona, mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oregon); razoxana; rizoxin; sizofuran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridin A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipe-broman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, péptido, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™, formulación de paclitaxel en nanoparticulas construida por ingeniería con albúmina, libre de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y doxetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; gemeitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; tenipósido; edatrexate; daunomicina; aminopterina; capecitabina XELODA®; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides como ácido retinoico; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

También se incluyen agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre los tumores, tales como antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERMs), que incluyen por ejemplo tamoxifeno (que incluyen el tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona, y torimifeno FARESTON; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como por ejemplo 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, y anastrozol ARIMIDEX®; y antiandrógenos como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; así como también troxacitabina (un análogo de nucleósido citocina 1 ,3-dioxolano); oligonucleótidos de antisentido, particularmente los que inhiben la expresión de los genes en las rutas de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tales como por ejemplo PKC-alfa, Ralf y H-Ras; ribozimas como el inhibidor de la expresión de VEGF (por ejemplo ribozima ANGIOZYME®) y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas como las vacunas de terapia génica, por ejemplo la vacuna ALLOVECTIN®, la vacuna LEUVECTIN® y la vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rlL-2; el inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

En particular, el factor de crecimiento transformante (TGF)-P presenta un arreglo de efectos pleiotrópicos en las funciones celulares tales como proliferación, homeostasis, angiogénesis y cicatrización de heridas. La regulación aberrante de la función de (TGF)- contribuye al avance del cáncer. La mayoría de los tipos de cáncer se caracteriza por una producción excesiva del factor ß de crecimiento transformante por parte de los tumores, lo que puede promover el crecimiento del tumor y mediar la transición epitelial a mesenquémica. El (TGF)- también tiene una función pivotante dentro del sistema inmune. Manteniendo tolerancia mediante la regulación de la proliferación, diferenciación y supervivencia de los linfocitos. Se ha observado que (TGF)- es un elemento supresor importante al intensificar la función de Treg y apagar la inmunidad del tumor. Se contempla la administración de inhibidores de (TGFJ-ß en conjunto con agonistas de GITR, por ejemplo anticuerpos.

También se contempla la coadministración con terapias antivirales. Los antivirales incluyen cualquier fármaco que destruye los virus. Los antivirales pueden incluir interferones que funcionan para inhibir la replicación del virus, inhibidores de proteasa e inhibidores de transcriptasa inversa, o los agentes contenidos en la combinación de la terapia antiretroviral altamente activa (HAART) para el VIH.

Los sujetos veterinarios, experimentales o de investigación típicos incluyen monos, perros, gatos, ratas, ratones, conejos, conejillos de indias, caballos y humanos.

VII. Producción del anticuerpo En una modalidad, para la producción recombinante de los anticuerpos de la presente invención, los ácidos nucleicos que codifican las dos cadenas se aislan y se insertan en uno o más vectores replicables para clonación (amplificación del ADN) o para expresión posterior. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aisla fácilmente y su secuencia se determina usando los procedimientos convencionales (por ejemplo usando sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Los componentes de vector incluyen generalmente, sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento incrementador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. En una modalidad, las cadenas tanto ligeras como pesadas de un anticuerpo anti-GITR humanizado de la presente invención son expresadas del mismo vector, por ejemplo un plásmido o un vector adenoviral.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir mediante cualquier método conocido. En una modalidad, los anticuerpos se expresan en células en cultivo de mamífero o insecto, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñon embrionario humano (HEK) 293, células NSO de mieloma de ratón, células de riñon de hámster crío (BHK), células de ovario de Spodoptera frugiperda (Sf9). En una modalidad, los anticuerpos secretados de las células CHO se recuperan y purifican mediante métodos cromatográficos estándares, tales como cromatografía de proteína A, intercambio de cationes, intercambio de aniones, interacción hidrofóbica e hidroxiapatita. Los anticuerpos resultantes se concentran y se guardan en acetato de sodio 20 mM, pH 5.5.

En otra modalidad, los anticuerpos de la presente invención se producen en levadura de acuerdo con los métodos descritos en WO2005/040395. Brevemente, vectores que codifican las cadenas individuales ligeras o pesadas de un anticuerpo de interés se introducen en diferentes células haploides de levadura, por ejemplo tipos diferentes de apareamiento de la levadura Pichia pastons; opcionalmente dichas células haploides de levadura son auxótrofos complementarios. Las células haploides transformadas de levadura se pueden aparear o fusionar entonces para dar una célula de levadura diploide capaz de producir las cadenas tanto pesada como ligera. Entonces la cepa diploide es capaz de secretar el anticuerpo completamente ensamblado y biológicamente activo. El grado de expresión relativa de las dos cadenas se puede optimizar, por ejemplo usando vectores con diferentes números de copias, usando promotores transcripcionales de diferentes fuerzas, o induciendo la expresión de promotores inducibles que impulsan la transcripción de los genes que codifican una o las dos cadenas.

En una modalidad, las cadenas pesadas y ligeras respectivas de una pluralidad de anticuerpos anti-GITR diferentes (los anticuerpos "originales") se introducen en células haploides de levadura para crear una colección de cepas de levadura haploides de un tipo de apareamiento que expresan una pluralidad de cadenas ligeras, y una colección de cepas de levadura haploides de un tipo de apareamiento diferente que expresan una pluralidad de cadenas pesadas. Estas colecciones de cepas haploides se pueden aparear (o fusionar como esferoplastos) para producir una serie de células de levadura diploides que expresan una colección combinatoria de anticuerpos comprendida de las diversas permutaciones posibles de cadenas ligeras y pesadas. La colección combinatoria de anticuerpos se puede examinar entonces para determinar si alguno de los anticuerpos tiene propiedades que son superiores (por ejemplo afinidad más alta por GITR) a los anticuerpos originales; véase por ejemplo WO2005/040395.

En otra modalidad, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos de dominio humano en los cuales unas porciones de un dominio variable de anticuerpo están enlazadas en un polipéptido de peso molecular aproximado de 13 kDa; véase por ejemplo, la publicación de patente de EE.UU. No. 2004/0110941. Tales agentes de un solo dominio de peso molecular bajo proveen muchas ventajas en cuanto a su facilidad de síntesis, estabilidad y vía de administración.

VIII. Usos La presente invención provee métodos para usar anticuerpos anti-GITR y fragmentos de los mismos para el tratamiento y diagnóstico de trastornos y afecciones proliferativas o inflamatorias.

La presente invención provee métodos para diagnosticar la presencia de una infección microbiana o cáncer, analizando el grado de expresión de GITR en células, tejidos o fluidos corporales de prueba, en comparación con la expresión de GITR en células, tejidos o fluidos corporales de control, preferiblemente del mismo tipo. Como se muestra aquí, un incremento en el grado de expresión de GITR, por ejemplo en el paciente en comparación con el control, está asociado con la presencia de cáncer.

Típicamente, para una prueba diagnóstica cuantitativa, un resultado positivo que indica que el paciente probado tiene cáncer o una enfermedad infecciosa, es aquella la cual las células, tejidos o fluidos corporales tienen un grado de expresión de GITR por lo menos dos veces más alto, cinco veces más alto, diez veces más alto, quince veces más alto, veinte veces más alto, veinticinco veces más alto.

Las técnicas de prueba que se pueden usar para determinar el grado de expresión de un gen y una proteína, tal como GITR, de la presente invención, en una muestra derivada de un hospedero, son muy conocidas para los expertos en la materia. Dichos métodos de prueba incluyen radioinmunoensayos, pruebas de PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR), pruebas de PCR cuantitativas en tiempo real, pruebas inmunohistoquímicas, pruebas de hibridación in situ, pruebas de unión competitiva, análisis Western blot, pruebas ELISA, y pruebas de citometría de flujo, por ejemplo análisis de FACS de dos colores para determinación del fenotipo 2 en comparación con M1 de macrófagos asociados con tumor (Mantovani et a.l (2002) Trends in Immunology 23:549-555).

Una prueba ELISA inicialmente comprende preparar los anticuerpos de la presente invención, específicos para GITR, preferiblemente 36E5, 3D6, 61G6, 6H6, 61 F6.1 D8, 17F10, 35D8, 49A1 , 9E5 y 31 H6 (colectivamente, "anticuerpos GITR"). Además, generalmente se prepara un anticuerpo reportero que se une específicamente a GITR. El anticuerpo reportero se une a un reactivo detectable, tal como un reactivo radioactivo, fluorescente o enzimático, por ejemplo la enzima peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina.

Para efectuar la ELISA, por lo menos uno de los anticuerpos GITR anteriormente descritos se incuba en un soporte sólido, por ejemplo una placa de poliestireno, que se une al anticuerpo. Cualquier sitio de unión de proteína libre de la placa se cubre entonces incubándola con una proteína no específica, tal como albúmina de suero bovino. Después, la muestra por analizar se incuba en la placa; durante este tiempo la GITR se une al anticuerpo específico de GITR fijado en la placa de poliestireno. La muestra no unida se quita lavando con amortiguador. Se pone en la placa un anticuerpo reportero dirigido específicamente a GITR y enlazado a peroxidasa de rábano, dando como resultado la unión del anticuerpo reportero a cualquier anticuerpo monoclonal enlazado a GITR. Después, el anticuerpo reportero no fijado se quita lavando. Después se añaden a la placa los reactivos para la actividad de peroxidasa, que incluyen un substrato colorimétrico. La peroxidasa inmovilizada, enlazada a los anticuerpos GITR, produce un producto de reacción de color. La cantidad de color desarrollado en un periodo dado es proporcional a la cantidad de proteína GITR presente en la muestra. Normalmente se obtienen resultados cuantitativos por referencia a una curva patrón.

Se puede usar una prueba de competencia en donde anticuerpos específicos para GITR se fijan en un soporte sólido, y GITR marcada y una muestra derivada del hospedero se pasan sobre el soporte sólido, y la cantidad de marca detectada unida al soporte sólido se puede correlacionar con una cantidad de GITR en la muestra.

Las pruebas anteriores se pueden efectuar en muestras derivadas de una variedad de células, fluidos corporales y/o extractos de tejido, tales como homogenatos o tejido solubilizado obtenido de un paciente. Los extractos de tejido se obtienen rutinariamente de biopsias de tejido y material de autopsia. Los fluidos corporales útiles en la presente invención incluyen sangre, orina, saliva o cualquier otra secreción corporal, o un derivado de las mismas. El término "sangre" incluye sangre completa, plasma, suero o cualquier derivado de la sangre.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar para tratar infecciones virales. La infección de VIH se caracteriza por defectos en la generación y mantenimiento de células de memoria central. Las células de memoria central CD8+ tienen una vida media más corta y son menos abundantes en los individuos infectados con VIH que en los controles. También, la frecuencia de células T CD4+ y CD8+ específicas para VIH disminuye rápidamente después del inicio de una terapia antirretroviral altamente activa (HAART). La coestimulación sobre CD4+ por anti-GITR puede proveer un mecanismo para aumentar la respuesta de CD8+ de memoria y contribuir a la eliminación del virus. Se ha encontrado que el tratamiento de ratones infectados persistentemente con el virus de Friend con un anticuerpo anti-GITR para aliviar la supresión por Tregs mejora significativamente la producción de IFN-? por las células T CD8+, y permite una reducción significativa de la carga viral (Dittmer et al., (2004) Immunity 20: 293-303).

Otra característica de la infección de VIH es la apoptosis masiva de células T CD4+ que empieza tempranamente en la infección de VIH. La supresión apoptótica progresiva de las células T CD4 contribuye a debilitar las respuestas inmunes celulares específicas de VIH y al desarrollo del SIDA. Se ha mostrado que la coestimulación de GITR incrementa la secreción de citocina específica de antígeno en murinos, protegiendo las células T de la apoptosis. Lahey et al. (2007) J Infecí Dis. 196: 43-49 demostraron que el tratamiento anti-GITR de células T CD4+ específicas de VIH incrementa su expresión de citocina y las protege de la apoptosis.

Para infecciones que se originan por causas virales, los anticuerpos de la invención se pueden combinar mediante su aplicación simultánea con, antes, o subsiguientemente a, la aplicación de la terapia estándar, para el tratamiento de infecciones virales. Estas terapias estándares pueden variar dependiendo del tipo de virus, aunque en la mayoría de todos los casos puede ser eficaz la administración de suero humano que contiene anticuerpos (por ejemplo IgA, IgG) específicos para el virus.

La infección de influenza produce fiebre, tos, mialgia, cefalea y malestar, que frecuentemente ocurren en epidemias estacionales. La influenza también está asociada con varios trastornos postinfecciosos tales como encefalitis, miopericarditis, síndrome de Goodpasture, y síndrome de Reye. La infección de influenza también suprime las defensas antibacterianas normales del pulmón, de tal manera que la recuperación del paciente de la influenza tiene un mayor riesgo de desarrollar neumonía bacteriana.

Las proteínas de superficie viral de la influenza muestran una notable variación antigénica que se origina de la mutación y recombinación.

De esta manera, los linfocitos T citolíticos son el vehículo primario del hospedero para la eliminación del virus después de la infección. La influenza se clasifica en tres tipos principales: A, B y C. La influenza A es única ya que infecta tanto humanos como muchos otros animales (por ejemplo cerdos, caballos, aves y focas), y es la causa principal de la influenza pandémica. También, cuando una célula es infectada por dos cepas diferentes de influenza A, los genomas de ARN segmentados de dos tipos de virus progenitores se mezclan durante la replicación para crear un replicante híbrido dando como resultado cepas epidémicas nuevas. La influenza B no se replica en los animales y de esta manera tiene menos variación genética, y la influenza C tiene solo un solo serotipo.

La mayoría de las terapias convencionales son paliativas de los síntomas que resultan de la infección, mientras que la respuesta inmune del hospedero realmente elimina la enfermedad. Sin embargo, algunas cepas (por ejemplo la influenza A) pueden causar enfermedad más seria y muerte. La influenza A se puede tratar tanto clínicamente como profilácticamente mediante la administración de los inhibidores de amina cíclica, amantadina y rimantadina, que inhiben la replicación viral. Sin embargo, la utilidad clínica de estos fármacos es limitada debido a la incidencia relativamente alta de reacciones adversas, su estrecho espectro antiviral (solo la influenza A), y la tendencia del virus a hacerse resistente. La administración de anticuerpo IgG de suero a las proteínas de superficie principales de la influenza, hemaglutinina y neuraminidasa, puede prevenir la infección pulmonar, mientras que se requiere IgA mucosal para prevenir la infección del aparato respiratorio superior y la tráquea. El tratamiento actual más eficaz para la influenza es la vacunación con virus desactivado con formalina o ß-propiolactona.

Después de una incubación de 9-11 días, los hospederos infectados con el virus de sarampión desarrollan fiebre, tos, coriza y conjuntivitis. En el transcurso de 1-2 días, se desarrolla salpullido eritematoso maculopapular, que rápidamente se extiende por todo el cuerpo. Como la infección también suprime la inmunidad celular, el hospedero está en un riesgo mayor de desarrollar superinfecciones bacterianas que incluyen otitis media, neumonía y encefalomielitis postinfecciosa. La infección aguda se asocia con morbilidad y mortalidad significativas, especialmente en adolescentes mal nutridos.

El tratamiento del sarampión incluye la administración pasiva de IgG humana recolectada, que puede prevenir la infección en sujetos no inmunes, incluso si se da hasta una semana después de la exposición.

Sin embargo, la inmunización previa con el virus vivo atenuado es el tratamiento más eficaz y previene la enfermedad en más de 95% de los inmunizados. Como hay un serotipo de este virus, normalmente una sola inmunización o infección protege contra infección subsiguiente durante toda la vida .

En una pequeña proporción de hospederos infectados, el sarampión se puede desarrollar en SSPE, que es un trastorno neurológico progresivo crónico que resulta de una infección persistente del sistema nervioso central. El SSPE es causado por variantes clónales del virus de sarampión con defectos que alteran el ensamble y brote del virión. Para estos pacientes sería deseable la reactivación de las células T con los anticuerpos de la invención, a fin de facilitar la eliminación viral.

El virus de la hepatitis B (V-HB) es el patógeno de la sangre conocido más infeccioso. Es una causa principal de hepatitis aguda y crónica y carcinoma hepático, así como también infección crónica durante toda la vida. Después de la infección, el virus se replica en los hepatocitos, que luego también arrojan el antígeno de superficie HBsAg. La detección de los niveles excesivos de HBsAg en el suero se usa como un método estándar para diagnosticar la infección de hepatitis B. Una infección aguda se puede resolver o se puede desarrollar a una infección persistente crónica.

Los tratamientos actuales para el VHB crónico incluyen a-interferón, que aumenta la expresión del antígeno de leucocito humano de clase I (HLA) sobre la superficie de los hepatocitos, facilitando así su reconocimiento por parte de los linfocitos T citotóxicos. Adicionalmente, los análogos de nucleósido ganciclovir, famciclovir y lamivudina también han mostrado cierta eficacia en el tratamiento de la infección de VHB en pruebas clínicas. Tratamientos adicionales para VHB incluyen a-interferón pegilado, adenfovir, entecavir y telbivudina. Aunque la inmunidad pasiva puede ser conferida por medio de la administración parenteral de anticuerpos anti-HBsAg de suero, la vacunación con HBsAg desactivado o recombinante también confiere resistencia a la infección. Los anticuerpos de la invención se pueden combinar con tratamientos convencionales para infecciones de hepatitis B para obtener una ventaja terapéutica.

La infección por virus de hepatitis C (V-HC) puede producir una forma crónica de hepatitis que da como resultado cirrosis. Aunque los síntomas son similares a las infecciones originadas de hepatitis B, a diferencia del VHB, los hospederos infectados pueden ser asintomáticos durante 10-20 años. El tratamiento para la infección de VHC incluye la administración de una combinación de a-interferón y ribavirina. Una terapia potencial prometedora para la infección de VHC es el inhibidor de proteasa telaprevir (VX-960). Los tratamientos adicionales incluyen anticuerpo anti-PD-1 (MDX-1106, Medarex), bavituximab (un anticuerpo que se une al fosofolípido aniónico fosfatidilserina de manera dependiente de B2-glicoproteína 1 , Peregrine Pharmaceuticals), anticuerpos de la proteína de envoltura viral E2 anti-VPH (por ejemplo, ATL 6865-Ab68+Ab65, XTL Pharmaceuticals) y Civacir® (inmunoglobulina humana policlonal anti-VHC). Los anticuerpos de la invención se pueden combinar con uno o más de estos tratamientos para la infección de hepatitis C para obtener una ventaja terapéutica.

El alcance amplio de esta invención se entiende mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos que no tienen la intención de limitar la invención a las modalidades específicas. Las modalidades específicas descritas en la presente se ofrecen únicamente a manera de ejemplo, y la invención se limita por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance completo de los equivalentes a los que tienen derecho dichas reivindicaciones.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Métodos generales Se describen métodos estándares de biología molecular: Maniatis et al. (1982), "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook y Russell (2001), "Molecular Cloning", 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993), "Recombinant DNA", Vol. 217, Academic Press, San Diego, California). Métodos estándares también aparecen en Ausbel et al. (2001 ), "Current Protocols in Molecular Biology", Vols. 1 -4, John Wiley and Sons, Inc. Nueva York, NY, que describen la clonación en células bacterianas y la mutagénesis de ADN (volumen 1), la clonación en células de mamífero y levadura (volumen 2), glicoconjugados y expresión de proteína (volumen 3), y bioinformática (volumen 4).

Los métodos de purificación de proteína que incluyen inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación y cristalización, se describen en Coligan et al. (2000), "Current Protocols in Protein Science", Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York. El análisis químico, modificación química, modificación posterior a traducción, producción de proteínas de fusión, glicosilación de proteínas, se describen por ejemplo en Coligan et al. (2000), "Current Protocols in Protein Science", Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Ausubel et al. (2001 ), "Current Protocols in Molecular Biology", Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, NY, p. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001 ), "Products for Life Science Research", San Luis, Missouri, p. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001 ), "BioDirectory", Piscataway, Nueva Jersey, p. 384-391. La producción, purificación y fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales se describen en Coligan et al. (2001), "Current Protocols in Immunology", Vol. 1 , John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Harlow y Lañe (1999) "Using Antibodies", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow y Lañe, supra (1998). Se tienen disponibles técnicas estándares para caracterizar interacciones ligando/receptor; por ejemplo, véase Coligan et al. (2001 ), "Current Protocols in Immunology", Vol. 4, John Wiley, Inc., Nueva York.

Se tienen disponibles métodos de citometría de flujo, incluyendo clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS®); véase por ejemplo Owens ef al. (1994), "Flow Cytometry Principies for Clinical Laboratory Practice", John Wiley and Sons, Hoboken, Nueva Jersey; Givan (2001), "Flow Cytometry", 2a ed.; Wiley-Liss, Hoboken, Nueva Jersey; Shapiro (2003), "Practical Flow Cytometry", John Wiley and Sons, Hoboken, Nueva Jersey. Se tienen disponibles reactivos fluorescentes adecuados para modificar ácidos nucleicos, incluyendo iniciadores y sondas de ácido nucleico, polipéptidos y anticuerpos, para usarse por ejemplo como reactivos diagnósticos: Catálogo de Molecular Probes (2003), Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon; catálogo de Sigma-Aldrich (2003), San Luis, Missouri.

Los métodos estándares de histología del sistema inmune se describen por ejemplo en Muller-Harmelink (ed.) (1986), "Human Thymus: Histopathology and Pathology", Springer Verlag, Nueva York, NY; Hiatt et al. (2000), "Color Atlas of Histology", Lippincott, Williams and Wilkins, Filadelfia, Pensilvania; Louis et al. (2002), "Basic Histology: Text and Atlas", McGraw-Hill, Nueva York, NY.

Se tienen disponibles paquetes de software y bases de datos para determinar por ejemplo fragmentos antigénicos, secuencias guías, pliegue de proteína, dominios funcionales, sitios de glicosilación, y alineaciones de secuencia; véase por ejemplo GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, Maryland); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, California); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne et al. (2000), Bioinformatics 16:741-742; Menne eí al. (2000), Bioinformatics Applications Note 16:741 ; Wren et al. (2002), Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181 ; von Heijne (1983), Eur. J. Biochem. 133:17-21 ; von Heijne (1986), Nucleic Acids Res. 14:4683-4690.

EJEMPLO 2 Humanización de los anticuerpos anti-GITR de humano La humanización de anticuerpos se describe en general, por ejemplo, en las publicaciones de la solicitud de patente PCT WO 2005/047324 y WO 2005/047326.

Brevemente, la secuencia de aminoácidos del dominio VH no humano (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 1-11 ) se compara con un grupo de cinco secuencias de aminoácidos VH de línea germinal de humano; un representante de los subgrupos IGHV1 e IGHV4 y tres representes del subgrupo IGHV3. Los subgrupos VH se enlistan en M.-P. Lefranc (2001), "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Heavy (IGH) Genes", Experimental and Clinical Immunogenetics 18:100-1 16. Las secuencias de armazón de la secuencia de línea germinal humana con la coincidencia más cercana se usan para construir un dominio VH humanizado.

Los anticuerpos anti-huGITR de roedor aquí descritos son todos de la subclase kappa de VL. Las secuencias de aminoácidos del dominio VL no humano (por ejemplo, las SEQ ID NOs: 12-22) se comparan con un grupo de cuatro secuencias de aminoácidos VL kappa de línea germinal de humano. El grupo de cuatro está comprendido de un representante de cada uno de los cuatro subgrupos VL humanos establecidos enlistados en V. Barbie y M.-P. Lefranc (1998) "The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segments", Experimental and Clinical Immunogenetics 15: 171-183; y M.-P. Lefranc (2001) "Nomenclature of the Human Immunoglobulin Kappa (IGK) Genes", Experimental and Clinical Immunogenetics 18:161-174. Los cuatro subgrupos también corresponden a los cuatro subgrupos enlistados en Kabat et al. (1991 -5a ed.) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Publicación NIH No. 91-3242 del U.S. Department of Health and Human Services, p. 103-130. Las secuencias de armazón de la secuencia de línea germinal humana con la coincidencia más cercana se usan para construir un dominio VL humanizado.

Una vez que se han determinado las secuencias de aminoácidos objetivo de las cadenas variables pesada y ligera, se pueden generar plásmidos que codifican el anticuerpo humanizado de longitud completa. Las secuencias de plásmido se pueden alterar usando la mutagénesis de Kunkel (véase, por ejemplo, Kunkel T A. (1985), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82:488-492), para cambiar la secuencia de ADN a las secuencias de anticuerpo humanizado objetivo. Simultáneamente se puede optimizar el codón para proveer una expresión potencialmente óptima.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden humanizar usando un método que identifica una secuencia de línea germinal aceptora para un anticuerpo humanizado, y comprende los pasos de: a) identificar un anticuerpo no humano que tiene la actividad biológica deseada; b) determinar la secuencia de aminoácidos de los dominios VH y \A_ de un anticuerpo no humano; y c) comparar la secuencia de anticuerpo no humano con un grupo de secuencias de línea germinal humanas, en donde la comparación comprende los subpasos de: 1) asignar los números de residuo de las secuencias V no humanas de acuerdo con Kabat, supra; 2) delinear las regiones de CDR y FR en la secuencia de acuerdo con Kabat, supra; 3) asignar una calificación numérica predeterminada a la posición de residuo específica para la cual son idénticas las secuencias de línea germinal de anticuerpo humano y no humano; y 4) totalizar todas las calificaciones de residuo para generar una calificación total de cada secuencia de línea germinal humana; y d) identificar la secuencia de línea germinal humana con la calificación total de residuo más alta como la secuencia de línea germinal aceptora. En una modalidad, el método también comprende los subpasos de: 5) asignar una calificación numérica de 1 para cada posición de residuo de FR para la cual son idénticas las secuencias de línea germinal de anticuerpo humano y no humano y que no fueron calificadas en el subpaso (3), para las secuencias de línea germinal con calificaciones totales de residuo idénticas después del subpaso (4); 6) totalizar todas las calificaciones de residuo para generar una calificación total para cada secuencia de línea germinal humana. En una modalidad específica, el anticuerpo no humano es específico para GITR e inhibe la actividad biológica de GITR. También se provee aquí un anticuerpo generado mediante el método anterior.

En una modalidad, el anticuerpo GITR se humaniza utilizando el siguiente método. En primer lugar, los dominios VL y VH no humanos del anticuerpo GITR se clonan y se determina su secuencia, y se determina la secuencia de aminoácidos. Después, la secuencia VH no humana se compara con un grupo de tres secuencias de aminoácidos VH de línea germinal humana. Los tres grupos contienen un representante de cada subgrupo IGHV1 , IGHV3 e IGHV4. Los subgrupos VH se enlistan en M. -P. Lefranc, Exp. Clin. Immunogenetics, 18:100-1 16 (2001 ). Específicamente, la comparación con las tres secuencias de línea germinal empiezan con la asignación de números de residuo a la secuencia VH no humana de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat; véase Kabat et al., Publicación NIH No. 91-3242 del U.S. Department of Health and Human Services (5a ed., 1991 ). La secuencia VH no humana se alinea entonces con cada una de las tres secuencias de línea germinal humana. Puesto que los genes V solo comprenden los residuos VH 1-94, solo estos residuos son considerados en la alineación. Después, se desalinean las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y armazón (FR) en la secuencia. La CDR y FR se desalinean de acuerdo con la combinación de las definiciones provistas por Kabat eí al., Publicación NIH No. 91-3242 del U.S. Department of Health and Human Services (5a ed., 1991), y C. Chothia y A.M. Lesk, J. Mol. Biol, 196:901-917 (1987). Por lo tanto, la definición usada de CDR es: residuos 26-35 para CDR1 , residuos 50-65 para CDR2, y residuos 95-102 para CDR3 del dominio VH. El siguiente paso incluye asignar una calificación numérica en una posición de residuo identificada en donde las secuencias humanas y no humanas son idénticas. Un ejemplo de esta calificación se muestra en el cuadro 4 siguiente.

CUADRO 4 * Nótese que afecta la conformación de CDR Chothia er a/., Nature 342:877-883 (1989).

Después de que se les asigna una calificación numérica a las posiciones de residuos, se totalizan todas las calificaciones de residuo. La secuencia de línea germinal aceptora es aquella con la calificación total más alta. Cuando dos o más secuencias de línea germinal tienen calificaciones idénticas, entonces añadir 1 al total, para cada posición en donde las secuencias no humanas y humanas son IDÉNTICAS para los siguientes residuos de FR: 1 -23, 25, 36, 38-47, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 77 y 79-93 (max 60). Las calificaciones de residuo se totalizan nuevamente, y la secuencia de línea germinal aceptora es aquella con la calificación total más alta. Si dos o más secuencias de línea germinal todavía tienen calificaciones idénticas, entonces cualquiera se puede usar como la secuencia de línea germinal aceptora.

Si la secuencia VL es un miembro de la subclase kappa de VL, la secuencia VL no humana del anticuerpo específico de GITR se compara con un grupo de cuatro secuencias de aminoácidos VL kappa de línea germinal humana. Las cuatro secuencias están comprendidas de un representante de cada uno de los cuatro subgrupos VL humanos establecidos enlistados en V. Barbie y M.- P. Lefranc, Exp. Clin. Immunogenetics 15:171-183 (1998), y M.-P. Lefranc, Exp. Clin. Immunogenetics 18:161-174 (2001). Las cuatro secuencias también corresponden a los cuatro subgrupos enlistados en Kabat et al., Publicación NIH No. 91-3242 del U.S. Department of Health and Human Services, p. 103-130 (5a ed., 1991). La comparación de la secuencia no humana con las cuatro secuencias de línea germinal empieza con la asignación de números de residuo a los residuos de la secuencia VL no humana de acuerdo con Kabat et al., Publicación NIH No. 91-3242 del U.S. Department of Health and Human Services (5a ed., 1991 ). Las secuencias VL no humanas se alinean entonces con cada una de las cuatro secuencias de línea germinal humana. Puesto que los genes V solo comprenden los residuos V|_ 1-95, solo estos residuos son considerados en la alineación. Después, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y de armazón (FR) se desalinean en la secuencia. La CDR y la FR se desalinean de acuerdo con la combinación de las definiciones provistas por Kabat et al., Publicación NIH No. 91-3242 del U.S. Department of Health and Human Services (5a ed. 1991), y C. Chothia y A.M. Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987). Por lo tanto, la definición de CDR usada es: residuos 24-34 para CDR1 , residuos 50-56 para CDR2, y residuos 89-97 para CDR3 del dominio VL. El siguiente paso implica asignar una calificación numérica en posiciones de residuo identificadas en donde las secuencias humanas y no humanas son idénticas. Un ejemplo de esta calificación se muestra abajo en el cuadro 5.

CUADRO 5 * Nótese que afecta la conformación de CDR en C. Chothia et al., Nature 342:877-883, (1989).

Después de que se asigna una calificación numérica a las posiciones de residuo, se totalizan todas las calificaciones de residuo. La secuencia de línea germinal aceptora es aquella con la calificación total más alta. Cuando dos o más secuencias de línea germinal tienen calificaciones idénticas, entonces añadir 1 al total, para cada posición en donde las secuencias no humanas y humanas sean IDÉNTICAS para los siguientes residuos de FR: 1-3, 5-23, 35-42, 44-49, 57, 59-88 (max 67). Las calificaciones de residuos se totalizan nuevamente y la secuencia de línea germinal aceptora es aquella con la calificación total más alta. Si dos o más secuencias de línea germinal todavía tienen calificaciones idénticas, cualquiera se puede usar como secuencia de línea germinal aceptora.

Los anticuerpos monoclonales progenitores anteriores se humanizaron usando este método. Los SEQ ID NOs: 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 y 10 son las secuencias de polipéptidos de cadenas pesadas variables, y los SEQ ID NOs: 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109 y 11 1 son las secuencias de las cadenas ligeras variables.

EJEMPLO 3 Determinación de la constante de disociación en el equilibrio (Kd) para los anticuerpos anti-GITR humanos usando la tecnología KinExA Las constantes de disociación en el equilibrio (K<j) para los anticuerpos anti-GITR humanos se determinan usando el instrumento KinExA 3000, Sapidyne Instruments Inc., Boise Idaho, EE. UU. El KinExA utiliza el principio del método de Prueba de Exclusión Cinética basado en la medición de la concentración de anticuerpo no unido en complejo en una mezcla de anticuerpo, antígeno y complejo anticuerpo-antígeno. La concentración del anticuerpo libre se mide exponiendo la mezcla a un antígeno inmovilizado en fase sólida durante un periodo muy breve. En la práctica, esto se logra haciendo fluir la mezcla antígeno-anticuerpo en fase de solución a través de partículas recubiertas con antígeno atrapadas en una celda de flujo. Los datos generados por el instrumento se analizan usando el software especial. Las constantes de equilibrio se calculan usando una teoría matemática basada en las siguientes suposiciones. 1. La unión sigue la ecuación de unión reversible para el equilibrio: kon [Ab] [Ag] = Koff[AbAg] 2. El anticuerpo y el antígeno se unen 1 :1 y el anticuerpo total es igual al complejo antígeno-anticuerpo más el anticuerpo libre. 3. La señal del instrumento está relacionada linealmente con la concentración del anticuerpo libre.

Las partículas de PMMA (Sapidyne, Cat No. 440198) se recubren con GITR biotinilada (o un fragmento de la misma, tal como el dominio extracelular), de acuerdo con el "Protocolo para recubrir partículas de PMMA con ligandos biotinilados que tienen brazos enlazadores cortos o inexistentes" de Sapidyne. Se usa "EZ-link TFP PEO-biotina (Pierce, Cat. No. 21219) para la biotinilación de GITR, según las recomendaciones del fabricante (boletín No. 0874 de Pierce).

EJEMPLO 4 Determinación de la constante de disociación en el equilibrio (Kn) para anticuerpos anti-GITR de humano humanizados usando la tecnología BIAcore Las determinaciones de BIAcore se hacen esencialmente como se describe en el ejemplo 4 de la solicitud copendiente de patente de EE. UU. asignada comúnmente No. 1 1/51 1 ,635 (presentada el 29 de agosto de 2006). Brevemente, unos socios de unión se inmovilizan en un chip sensor BIAcore CM5 usando el procedimiento estándar de acoplamiento de amina. Las constantes cinéticas para las diversas interacciones se determinan usando el software BIAevaluation 3.1. La Kd se determina usando las constantes calculadas de velocidad de disociación y asociación.

Los anticuerpos de GITR 36E5, 3D6, 61 G6, 6H6, 61 F6.1 D8, 17F10, 35D8, 49A1 , 9E5 y 31 H6 tuvieron los siguientes valores de CUADRO 6 Mediciones de afinidad de los anticuerpos GITR EJEMPLO 5 Bioensayos para la evaluación de la activación de los anticuerpos anti- GITR La capacidad de un anticuerpo monoclonal para incrementar biológicamente la actividad de GITR se evaluó por medio del efecto sobre la proliferación de células T intactas (véase por ejemplo Ito et al. (2006) PNAS 103(35): 13138-43. Células T CD4+ intactas se aislaron de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) por medio de centrifugación de Ficoll, seguido por el uso de un kit de aislamiento de células T CD4 intactas de STEMCELL Technologies.

En placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocilios un total de 2xl04 de células T CD4 intactas recién purificadas se cultivaron conjuntamente con células L que expresan CD32 irradiadas, en presencia de un anticuerpo anti-hGITR o el isotipo de control, que previamente se había recubierto con anti-CD3.

Los cuadros 7A y 7B muestran el efecto de dosis variables de anticuerpos anti-GITR sobre la proliferación de células T CD4+ intactas (KM4-R63 es un anticuerpo de control de isotipo).

CUADRO 7A Conc. 36ES.A5 JLS.306 61G6.B6 6H6.C3 61F6.B9 KM4.R63 Ab (ng/ml) Media SD Media SD Media SD Media SD Media SD Media SD 10000 83784 5854 96205 9562 135047 7362 91873 4218 93373 4099 29662 7817 2500 71843 7556 109291 21713 115725 9792 107347 6049 96296 1233 27007 4572 625 82075 6760 111455 5596 75125 5258 120374 10489 105194 5043 25503 4699 156 97139 11937 108929 5934 45588 6309 122653 7164 107643 8700 27496 4019 39.1 90331 6422 124377 26014 40075 2611 103621 211 1 107473 2179 25650 197 9.8 78688 11867 79317 2260 34335 3038 59965 4439 96267 10551 24722 3890 2.4 47467 9197 43088 1264 28872 2754 35629 3144 61257 3294 24851 1945 0.61 31043 6389 33847 1985 32642 3155 30245 12806 37587 1858 29232 7135 0.15 26240 8161 30774 7303 35642 4447 33443 8983 31955 2689 26627 1010 0.04 27502 4280 33342 3656 30969 1537 38543 8259 34931 5787 31039 3042 CUADRO 7B Conc. 1D8.BS 35D8.B10 49A1.B1 9E5.C1 31H6.B7 17F10.B1 Ab media SD media SD media SD media SD media SD media SD (ng/ml) 1000.0 -- - 97278 3127 78031 5394 83553 6596 87531 1051 89358 12570 416.7 - ¦- 89761 9163 86306 3807 79685 7730 86915 2652 85702 9724 173.6 90962 3417 96241 3423 93594 4229 84579 5929 96935 4442 87519 7556 72.3 102810 3353 92371 5048 96126 5395 85291 16030 98595 7374 83511 5009 30.1 112003 5405 95258 8152 95517 6187 83407 5503 94683 7610 86986 2717 12.6 115163 6429 86232 5329 86001 1893 85659 5087 90531 3957 90231 2079 5.2 98161 5423 71405 10471 72192 1776 77653 5524 79605 7438 77786 5065 2.2 78492 1831 59817 745 61053 239 69187 7450 67645 1972 73420 12592 0.9 64788 773 50713 2257 54096 2816 60922 7139 56972 4470 61950 4598 0.4 60794 5069 52287 5015 54348 1018 60105 6687 58490 582 58704 7820 EJEMPLO 6 Tratamiento de tumores con TGF-ß y anticuerpos GITR Estudios previos revelaron que la expresión génica de tumores 4T1 tuvo incrementos de ARNm de TGF-ß. Se formuló la hipótesis de que la coestimulación inmune por el agonista anti-GITR en combinación con la eliminación de la supresión inmune por inhibición de la señalización de TGF-ß induciría una eficacia antitumoral sinérgica.

Para probar esta hipótesis, 1.5 x 105 células de tumor 4T1 se implantaron por vía subcutánea en el costado derecho de ratones Balb/C. Cuatro o siete días después de la implantación del tumor, se inyectó un anticuerpo de neutralización para TGF-ß murina (1 D11 ; Bioexpress) a 100 g /200 µ?, por vía subcutánea en el cuello, y se repitió cada tres días para un total de 7 dosis. El anticuerpo agonista anti-GITR de ratón, DTA-1 , se inyectó los días 7, 14 y 21 , a 500 g /200 µ?. El volumen de tumor se midió cada tres días. Como se muestra abajo en el cuadro 8, DT-1 o anti-TGF-ß solos tuvieron poco efecto por sí solos. El tratamiento combinado indujo un efecto sinérgico en los días iniciales del tratamiento anti-TGF-ß (el día 4 o día 7 después de la implantación del tumor). Los valores son el volumen del tumor (mm3).

CUADRO 8 Eficacia antitumoral con anti-mGITR v/o anti-TGF-ß EJEMPLO 7 Tratamiento combinado anticuerpo-radiación de tumores CT26 Células de tumor CT26 (3 x 105) se implantaron por vía subcutánea en los costados izquierdos de ratones Balb/c. A tumores que crecieron a 300 mm3 se les aplicó irradiación local (10 Gy), observándose después que DTA-1 solo no tiene eficacia de destrucción de tumor. Un día después de la irradiación se inyectó DTA-1 (500 ug) por vía subcutánea en el área del cuello y se repitió cada semana para un total de 3 dosis. El volumen de tumor se midió cada dos a cinco días. En el grupo de 10 ratones sometidos a tratamiento combinado de irradiación local y DTA-1 , 5 ratones rechazaron completamente los tumores y sobrevivieron hasta 3 meses. El DTA-1 o la irradiación solos no presentan rechazo de tumor (véase por ejemplo la figura 1 ).

EJEMPLO 8 Mapeo de epítope de anticuerpos GITR Como se indicó arriba, el DTA-1 es un anticuerpo agonista desarrollado contra GITR de ratón (véase por ejemplo Shimizu, et al. supra). Se ha mostrado que DTA-1 tiene una potente actividad antitumoral en modelos de ratón de cáncer (véase por ejemplo Cohén, et al. (2006) Cáncer Res. 66:4904-4912; Ramírez- Montagut, et al. (2006) J. Immunol. 176:6434- 6442; Zhou, et al. (2007) J. Immunol. 179:7365-7375; y Ko, et al. (2005) J. Exp. Med. 202:885-891 ).

Para determinar si los anticuerpos anteriormente descritos se unen a un epítope similar a DTA-1 sobre la proteína GITR humana, el epítope de DTA-1 se mapeó primero sobre la proteína GITR de ratón. Sin una estructura de cristal disponible de GITR humana o de ratón, el epítope de DTS-1 se determinó usando las técnicas estándares de mutagénesis dirigida al sito (véase por ejemplo Kunkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. 82:488-492) y los principios generales de modularidad de la familia de receptores de TNF (véase por ejemplo Naismith y Sprang, supra).

Una vez que se determinó el epítope de GITR de ratón reconocido por DTA-1 , los residuos correspondientes sobre GITR de humano se cambiaron a los residuos de ratón confiriendo así unión de DTA-1 a GITR de humano. A partir de esto se determinó el epítope similar a DTA-1 sobre la GITR de humano que abarca los módulos 3 y 4 (véase la figura 2), y el epítope de GITR de humano (SEQ ID NO: 89) reconocido por los dos anticuerpos anteriormente identificados comprendió Gly57, Arg65, His67, Lys80, 86 Pheei, Se y GIn EJEMPLO 9 Tratamiento de infecciones virales con anticuerpos anti-GITR La infección de VIH se caracteriza por defectos en la generación y mantenimiento de células de memoria centrales. Las células de memoria centrales CD8+ tienen una vida media más corta y son menos abundantes en las personas infectadas con VIH que en los controles. También, la frecuencia de células T CD4+ y CD8+ específicas de VIH disminuye rápidamente después de iniciar una terapia antirretroviral altamente activa (HAART). La coestimulación sobre CD4+ por anti-GITR puede proveer un mecanismo para aumentar la respuesta de CD8+ de memoria y contribuir a la eliminación del virus. Se ha mostrado que el tratamiento de ratones infectados persistentemente con el virus de Friend con un anticuerpo anti-GITR para aliviar la supresión por Tregs, mejoró significativamente la producción de IFN-? por las células T CD8+ y permitió una reducción significativa de la carga viral (Dittmer er a/., (2004) Immunity 20: 293-303).

Otra característica de la infección de VIH es la apoptosis masiva de células T CD4+, que empieza tempranamente en la infección de VIH. La supresión apoptótica progresiva de células T CD4 contribuye a debilitar las respuestas inmunes celulares específicas de VIH y al desarrollo de SIDA. Se ha mostrado que la coestimulación de GITR incrementa la secreción de citocina específica de antígeno en murinos protegiendo a las células T de la apoptosis. Lahey et al. (2007) J Infect Dis. 196. 43-49) demostraron que el tratamiento anti-GITR de células T CD4+ específicas de VIH incrementa su expresión de citocina y las protege de la apoptosis.

Para infecciones que resultan de causas virales, los anticuerpos de la invención se pueden combinar por aplicación simultánea con, antes, o subsiguientemente a, la aplicación de terapias estándares para el tratamiento de infecciones virales. Estas terapias estándares varían dependiendo del tipo de virus, aunque en la mayoría de todos los casos puede ser eficaz la administración de suero humano que contiene anticuerpos específicos para el virus (por ejemplo IgA, IgG).

La infección de influenza produce fiebre, tos, mialgia, cefalea y malestar, que frecuentemente ocurre en las epidemias estacionales. La influenza también está asociada con varios trastornos postinfecciosos tales como la encefalitis, miopericarditis, síndrome de Goodpasture y síndrome de Reye. La infección de influenza también suprime las defensas antibacterianas pulmonares normales, de tal manera que el paciente que se recupera de la influenza tiene un mayor riesgo de desarrollar neumonía bacteriana.

Las proteínas de superficie viral de la influenza muestran una notable variación antigénica que se origina de la mutación y recombinación. De esta manera, los linfocitos T citolíticos son el vehículo primario del hospedero para la eliminación del virus después de la infección. La influenza se clasifica en tres tipos principales: A, B y C. La influenza A es única ya que infecta tanto humanos como muchos otros animales (por ejemplo cerdos, caballos, aves y focas), y es la causa principal de la influenza pandémica. También, cuando una célula es infectada por dos cepas diferentes de influenza A, los genomas de ARN segmentados de dos tipos de virus progenitores se mezclan durante la replicación para crear un replicante híbrido dando como resultado cepas epidémicas nuevas. La influenza B no se replica en los animales y de esta manera tiene menos variación genética, y la influenza C tiene solo un solo serotipo.

La mayoría de las terapias convencionales son paliativas de los síntomas que resultan de la infección, mientras que la respuesta inmune del hospedero realmente elimina la enfermedad. Sin embargo, algunas cepas (por ejemplo la influenza A) pueden causar enfermedad más seria y muerte. La influenza A se puede tratar tanto clínicamente como profilácticamente mediante la administración de los inhibidores de amina cíclica, amantadina y rimantadina, que inhiben la replicación viral. Sin embargo, la utilidad clínica de estos fármacos es limitada debido a la incidencia relativamente alta de reacciones adversas, su estrecho espectro antiviral (solo la influenza A), y la tendencia del virus a hacerse resistente. La administración de anticuerpo IgG de suero a las proteínas de superficie principales de la influenza, hemaglutinina y neuraminidasa, puede prevenir la infección pulmonar, mientras que se requiere IgA mucosal para prevenir la infección del aparato respiratorio superior y la tráquea. El tratamiento actual más eficaz para la influenza es la vacunación con virus desactivado con formalina o ß-propiolactona.

Después de una incubación de 9-11 días, los hospederos infectados con el virus de sarampión desarrollan fiebre, tos, coriza y conjuntivitis. En el transcurso de 1-2 días, se desarrolla salpullido eritematoso maculopapular, que rápidamente se extiende por todo el cuerpo. Como la infección también suprime la inmunidad celular, el hospedero está en un riesgo mayor de desarrollar superinfecciones bacterianas que incluyen otitis media, neumonía y encefalomielitis postinfecciosa. La infección aguda se asocia con morbilidad y mortalidad significativas, especialmente en adolescentes mal nutridos.

El tratamiento del sarampión incluye la administración pasiva de IgG humana recolectada, que puede prevenir la infección en sujetos no inmunes, incluso si se da hasta una semana después de la exposición.

Sin embargo, la inmunización previa con el virus vivo atenuado es el tratamiento más eficaz y previene la enfermedad en más de 95% de los inmunizados. Como hay un serotipo de este virus, normalmente una sola inmunización o infección protege contra infección subsiguiente de por vida .

En una pequeña proporción de hospederos infectados, el sarampión se puede desarrollar en SSPE, que es un trastorno neurológico progresivo crónico que resulta de una infección persistente del sistema nervioso central. El SSPE es causado por variantes clónales del virus de sarampión con defectos que alteran el ensamble y brote del virión. Para estos pacientes sería deseable la reactivación de las células T con los anticuerpos de la invención, a fin de facilitar la eliminación viral.

El virus de la hepatitis B (V-HB) es el patógeno de la sangre conocido más infeccioso. Es una causa principal de hepatitis aguda y crónica y carcinoma hepático, así como también infección crónica durante toda la vida. Después de la infección, el virus se replica en los hepatocitos, que luego también arrojan el antígeno de superficie HBsAg. La detección de los niveles excesivos de HBsAg en el suero se usa como un método estándar para diagnosticar la infección de hepatitis B. Una infección aguda se puede resolver o se puede desarrollar a una infección persistente crónica.

Los tratamientos actuales para el VHB crónico incluyen a-interferón, que aumenta la expresión del antígeno de leucocito humano de clase I (HLA) sobre la superficie de los hepatocitos, facilitando así su reconocimiento por parte de los linfocitos T citotóxicos. Adicionalmente, los análogos de nucleósido ganciclovir, famciclovir y lamivudina también han mostrado cierta eficacia en el tratamiento de la infección de VHB en pruebas clínicas. Tratamientos adicionales para VHB incluyen a-interferón pegilado, adenfovir, entecavir y telbivudina. Aunque la inmunidad pasiva puede ser conferida por medio de la administración parenteral de anticuerpos anti-HBsAg de suero, la vacunación con HBsAg desactivado o recombinante también confiere resistencia a la infección. Los anticuerpos anti-GITR de la invención se pueden combinar con los tratamientos convencionales para infecciones de hepatitis B para obtener una ventaja terapéutica.

La infección de virus de hepatitis C (V-HC) puede producir una forma crónica de hepatitis que da como resultado cirrosis. Aunque los síntomas son similares a las infecciones originadas de hepatitis B, a diferencia del VHB, los hospederos infectados pueden ser asintomáticos durante 10-20 años. El tratamiento para la infección de VHC incluye la administración de una combinación de a-interferón y ribavirina. Una terapia potencial prometedora para la infección de VHC es el inhibidor de proteasa telaprevir (VX-960). Los tratamientos adicionales incluyen anticuerpo anti-PD-1 (MDX-1106, Medarex), bavituximab (un anticuerpo que se une al fosofolípido aniónico fosfatidilserina de manera dependiente de B2-glicoproteína 1 , Peregrine Pharmaceuticals), anticuerpos de la proteína de envoltura viral E2 anti-VPH (por ejemplo, ATL 6865-Ab68+Ab65, XTL Pharmaceuticals) y Civacir® (inmunoglobulina humana policlonal anti-VHC). Los anticuerpos anti-GITR de la invención se pueden combinar con uno o más de estos tratamientos para la infección de hepatitis C para obtener una ventaja terapéutica.

El cuadro 9 provee una breve descripción de las secuencias del listado de secuencias.

CUADRO 9 CUADRO 9 (Continuación) CUADRO 9 (Continuación) CUADRO 9 (Continuación) CUADRO 9 (Continuación)

Claims (22)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto de unión que se une a la GITR humana, que comprende: (a) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo, o fragmento de unión de antígeno del mismo, que tiene tres secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 56-88; y (b) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo, o fragmento de unión de antígeno del mismo, que tiene tres secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 23-55.

2.- El compuesto de unión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las CDRs comprenden: (a) por lo menos una CDRL1 del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 56-66; por lo menos una CDRL2 del grupo que consiste en los SEQ ID NOs. 67-77; y por lo menos una CDRL3 del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 78-88; y (b) por lo menos una CDRH1 del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 23-33; por lo menos una CDRH2 del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 34-44; y por lo menos una CDRH3 del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 45-55.

3.- El compuesto de unión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque: (a) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada se selecciona del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 y 110; y (b) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera se selecciona del grupo que consiste en los SEQ ID NOs: 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109 y 111.

4.- El compuesto de unión de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque: (a) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 90, y la secuencia del dominio variable de cadena ligera es el SEQ ID NO: 91; (b) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 92, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 93; (c) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 94, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 95; (d) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 96, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 97; (e) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 98, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 99; (f) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 100, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 101 ; (g) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 102, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 103; (h) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 104, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 105; (i) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 106, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 107; (j) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 108, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 109; o (k) la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 110, y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 111.

5. - Un anticuerpo que es capaz de bloquear la unión del compuesto de unión que se reclama en la reivindicación 4 a la GITR humana en una prueba de bloqueo cruzado.

6. - Un ácido nucleico aislado que codifica por lo menos uno de: el dominio variable de cadena ligera o el dominio variable de cadena pesada del compuesto de unión que se reclama en la reivindicación 4.

7. - Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico que se reclama en la reivindicación 6, enlazado operativamente a secuencias de control que son reconocidas por una célula hospedera cuando la célula hospedera es transfectada con el vector.

8.- Una célula hospedera que comprende el vector de expresión que se reclama en la reivindicación 7.

9.- Un método de producción de un polipéptido, que comprende: cultivar la célula hospedera que se reclama en la reivindicación 8 en un medio de cultivo, bajo condiciones en donde se expresa la secuencia de ácido nucleico, produciendo así polipéptidos que comprenden los dominios variables de cadena ligera y pesada; y recuperar los polipéptidos de la célula hospedera o el medio de cultivo.

10. - El compuesto de unión de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende una región constante de cadena pesada que comprende una región constante de cadena pesada de ?1 humana, o una variante de la misma, en donde la variante de la región constante comprende hasta 20 sustituciones de aminoácido modificadas conservativamente.

11. - El compuesto de unión de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende una región constante de cadena pesada que comprende una región constante de cadena pesada de ?4 humana, o una variante de la misma, en donde la variante de la región constante comprende hasta 20 sustituciones de aminoácido modificadas conservativamente.

12. - El compuesto de unión de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, y un dianticuerpo.

13. - El uso del anticuerpo específico para GITR que se reclama en la reivindicación 5, o un fragmento de unión de antígeno del mismo, para preparar un medicamento para intensificar una respuesta inmune en un sujeto humano, en donde el medicamento está adaptado para intensificar la actividad biológica de GITR.

14. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde el anticuerpo de GITR o fragmento de unión de antígeno del mismo está adaptado para ser coadministrable con un anticuerpo anti-TGF .

15. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde el anticuerpo de GITR o fragmento de unión de antígeno del mismo está adaptado para ser coadministrable con radiación local.

16.- El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde la respuesta inmune es contra un trastorno proliferativo.

17. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde la respuesta inmune es contra una infección viral.

18. - Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de unión que se reclama en la reivindicación 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. - Un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo, producido por un hibridoma depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), en donde el hibridoma se selecciona del grupo que consiste en PTA-9889, PTA-9890, PTA-9891 , PTA-9892, PTA-9893, PTA-10286, PTA-10287, PTA-10288, PTA-10289, PTA-10290 y PTA-10291.

20. - Un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo que se une a la proteína GITR humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión de antígeno reconoce un epítope que abarca el módulo 3 y el módulo 4 de la proteína GITR humana (SEQ ID NO: 89).

21. - El anticuerpo o fragmento de unión de antígeno de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el epítope comprende Gly57, Arg65, His67, Lys80, Phe81, Ser82 y Gln86.

22. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque bloquea cruzadamente por lo menos uno de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo producidos por los híbridomas seleccionados del grupo que consiste en PTA-9889, PTA-9890, PTA-9891 , PTA-9892, PTA-9893, PTA-10286, PTA-10287, PTA-10288, PTA-10289, PTA-10290 y PTA-10291.