JPS60500817A - ヌクレオシド・ホスホルアミダイト中間体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヌクレオシド・ホスホルアミダイト中間体の製造方法技ｍ１分野 この発明は、ヌクレオシド・ホスホルアミダイト（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｐｈ ｏｓｐｈｏｒａ′’ｍ１ｄｉｔｅ）　中間体に関する。

背景技術 オリゴヌクレオチド合成における最近の主な技術革（１〜３） 新１ｄ、Ｌｅｉｓ”°′°′ら７　Ｋ１ｈ？Ｊｌす′酸塩結合性０導入であった 。この方法は、デオキシオリゴヌクレオチ（４〜８）　、（９〜１２） ド　、オリゴリボヌクレオチド　、および核酸類（１３〜１５） 化体　の合成に採用されてきた。一般に、その方法は適当な被保護°ヌクレオシ ド、メトキンジクロロホスフィンのような二官能性亜すイ酸塩化剤、および第２ の被保珈ヌクレオシドの反応を含む。テトラヒ、ドロフラン中のヨウ素、ルチジ ンおよび水を使用したおだやかな酸化が自然のヌクレオチド間の結合を生成する 。

酸化過程を変えることによって、セレノリン酸塩（１４）１、　（＋４） イミドリフ酸塩　およびチオリン酸塩（＋４．＋５）のようなリン類似体を生成 することができる。しかしながら。

この方法の１大な制約は２反応性の中間体（ヌクレオシド・ホスホモノクロリダ イトまたはモノテトラアゾリド）が不安定で加水分解および空気酸化する傾向に あることであった。この問題は１反応性の物質全使用面前に訓製するか、または 反応性亜すン酸塩ヲ−２０℃でヘキサン中の沈殿物として貯蔵することによって 回避された。

新しい類のヌクレオシド亜リン酸塩の合成が−この問題を解決するだめの試みと して提案された。（１６）こ上式におけるＸはリン酸塩保護基：Ｙばある種の第 二アミノ基：Ｚはヒドロキシ保護基：Ａは−Ｈ−−ＯＨおよび−０２からなる群 から選ぶ；そしてＢはプリンおよびピリミジン塩基からなる群から選ぶ。

さらに詳しくは、Ｙは飽和第二アミノ基−即ち第二アミノ基に二重結合が存在し ないものである。さらに詳しく言うならば、ＹばＮＲ１Ｒ２であって−Ｒ，およ びＲ２は別りにとるとそれぞれ炭素原子１０個まで全含むアルキル、アラルキル 、２シクロアルキルおよびシクロアルキルアルキルを表わし：Ｒ１とＲ２は一緒 にとると主知に炭素原子５個までを含むアルキレン連鎖を形成し、全体で１０個 までの炭素原子と前記連鎖の両末端原子価結合が♀累麿子に結合され、それにＲ １らが結合される窒素原子と共にとるときには、窒素。

酸素および硫黄からなる群から少なくとも１つの追加へテロ原子を含む飽和窒素 複素環を形成する。

ＮＲ，Ｒ２基を誘導することができるアミンは５ジメチルアミン、ジエチルアミ ン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、メチルプロビルアミン、メチルヘ キシルアミン、メチルシクロプロピルケミン、エチルシクロヘキシルアミン、メ チルベンジルアミン２メチルシクロヘキシルメチルアミン、プチルソクロヘキシ ルアミン、モルホリン、チオモルホリン、ピロリジン、ピペリジン、２，６−シ メチルビベリジノ、ピペラジンおよび類似の飽和単環式窒素複素環のような種々 の飽和第二アミンを含む。

前記の式においてＢで°表わされるリボヌクレオシドお工びテオキシヌクレオシ ド塩基は周知であって、プリン誘導体（例えば、アテニン、ハイボチサンチノお よびグアニン）、およびピリミジン誘導体（例えば。

ノドシン、ウラシルおよびチミン）を含む。

前記の式においてＺで表わされる保護基はトリチル。

メトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ジアルキル亜リン酸塩、ビバリルーイ ノブチルオキ７カルボニル、ｔ−ブチル・ジメチルシリル、および類似の保護基 を含む。

Ｘで表わされるリン酸塩保護基は一限定ではないが、約１０個までの炭素原子を 含むアルキル、アルケニル２アリール、アラルキル、およびシクロアルキルを含 む種々のヒドロカルピル基を含む。代表的なラジカルはメチル、ブチル、ヘキシ ル、フェネチル、ベンジル、シクロヘキシル、フェニル５ナフチル、アリルおよ びシクロブチルである。これらの中で、低級アルキル、特にメチルおよびエチル が望ましす。

こｎらの化合物は、反応性ではなく、かつ先行技術の化合物のように不安定でな いと報告された。これらの化合物は普通の条件下でヌクレオシドの保護されてい ない５′−○Ｈまたは５’−ＯＨと容易に反応することが注目さｎた。さらに− こ扛らのホスホルアミダイトは普通の研究呈の条件下で加水分解および空気酸化 に対して安定であって、乾燥、安定粉末として貯蔵できると言われた。

最近、アセトニトリル溶液におけるこれらヌクレオシド・ホスホルアミダイトの 安定性が間炉になってき（Ｉｓ、＋９） た　。さらに、これらのヌクレオシド・ホスホルアミダイトの入手は、それらの 単離が容易でなく時間がかかるので、困難であることが指摘されてきた（２０″ ２１ｔその上、そｔらの価格が高くて寄りつけないことが。

それらの使用金主に熟練した人に限定させているーこれらの欠点を緩和するため に一亜リン酸塩化学を用いたデオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）同意合成に対（２ ０，２１） する２、５の方法が提案された　。こ扛らの方法の主な特徴は、メトキシジクロ ロホスフィンまたはビス−（テトラゾリル）メトキシホスフィンのよりな二官能 性亜リン酸塩化剤で固体支持体を亜リン酸塩化することを含む。しかしながらＤ ＮＡ合成に対するこれらの方法は、少量の水分が連鎖伸長工程前または中に固体 支持体上に固定された極めて反応性のリン部分を加水分解するため、再現性の間 助が起る傾向にあると思われる。

他の問題は、吸湿性アミン塩酸塩の除去、およびデオキシヌクレオシド・ホスホ ルアミダイトの調製中に生成さｎた複素環リノグの有害な亜リン酸塩化を破壊す るのに必要な問題となる水性仕上げ（＋６）　、低温ヘキサン（−７０℃）中に おいて前記デオキシヌクレオシド・ホスホルアミダイトのトルエンまたは酢酸エ チル溶液の沈殿からなるｉしい単離工程（＋６）　、これらのデオキシヌクレオ シド・ホスホルアミダイトをアセトニトリル溶液に長期間保存することによって 生じる安定性の問題；および取扱いが困難で大気中の水分に極めて敏感であるク ロロ−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）メ（＋６） トキシホスフィン　、クロロ−（Ｎ、Ｎ−ジインプロ（２０，２１）　。

ロロホスフィン　、ヒス−（テトラゾリル）メトキシホスフィン（２′）のよう ｌ自燃性お工び／または反応性の亜すン酸−化剤の使用を含む。

従って、単純化された製造方法の提供が切望されている。

発明の開示 本発明により、自動化が容易にできると共に１手動の固相デオキシヌクレオチド （ＤＮＡ　）および／またはりボヌクレオチド（ＲＮＡ　）合成が望ましい場合 には、非化学者によって用いることが容易な単純化された方法が提供される。さ らに詳しくは１本発明は、対応する天然および非天然のヌクレオシドから元の位 置にデオキシヌクレオシドおよびリボヌクレオシド・ホスホルアミダイト中間体 を調製する便利な方法を包含する。この方法で調製されたヌクレオシド・ホスホ ルアミダイト中間体は適当な作用物質で活性化することができる。そして活性化 されたヌクレオシド・ホスホルアミダイト中間体は適当に保護されたヌクレオシ ドとの共役反応中に過剰に使用することができ、従って溶媒および周囲の環境か らの微量の水分に対する望ましい競争全保証する。

本発明の一笑施態様におけるヌクレオシド・ホスホルアミダイト中間体は１次式 で表わされる化学反応によって調製される： 本発明のもう１一つの実施態様におけるヌクレオシド・ホスホルアミダイト中間 体は次式で表わされる化学反応によって調製される。

上記化学反応式の両方において、Ｘはり／酸塩保護基；各Ｙは第二アミノ基；Ｚ はヒドロキシ保す基；弱酸は第二アミノ基の１伊のアミンのみを選択的にプロト ン化できるもの；各Ａは−Ｈ１−〇Ｈおよび−ＯＺからなる群から選択される； Ｂは天然および非天然プリンおよびピリミジン塩基からなる群から選択さｎる； Ｇは複素環塩素保護基；各りは−Ｈおよび−０２からなる群から選択される；Ｅ は−ＯＨおよび−ＯＺからなる群から選ぶ（但しくａ１両方のＡ　が同一で−Ｈ または−ＯＺであり５　Ｅが一〇Ｈのとき、およびｆｂ１両方のＡ　とＥが全て 同時に等しくないとき）；ｎはＯ〜２の数；　ｒ　、　Ｓ−およびｔはそ扛ぞれ Ｏまたはｌ（但し。

ｒ＋ｓ＋ｔ＝２　）；溶媒は（ａ）　Ｉ　、　ＩＦお工び■を可溶化し、（ｂ） 反応を進行さすことができるもの；そして■は反応性物質ｌのモル濃度に少なく とも等しいモル濃度で存在する（即ち、工の若干量は反応媒質中の水分または他 の汚染物質によって破壊さｎうる。そしてかく損失された部分はこの比には含ま れない）。

また１次式（式中のＸはメチルでるる）を有する新規の化合物も本発明の範囲内 に含まれる：発明ｔ−笑施するための最良の形態 Ｘは実質的に全てのリン酸塩保護基が可能、である。

（ｓ＋−３９） 多くのリン酸塩保幀基が当業者には仰られている　。

Ｘは炭素ｐ子１０個までを含むアルキル、ノ・ロアルキル、シアノアルキル、ア ルキルジアリールシリルアルキル、トリアルキルシリルアルキル、アリールスル ホニルアルキル、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルケニル、 ハロアルケニル、アリール、ハｏ　７１Ｊ−ル、アラルキル、ハロアラルキル、 ’／り。

アルキル、ハロシクロアルキル、有枝アルキル、および有枝ハロアルキルからな る群から選ぶことが望ましい。Ｘがメチルであることが最も望ましい。

Ｒ１とＲ２は、別々にとった場合には、炭素原子１０個までを含むアルキル、ハ ロアルキル、アルケニル。

アラルキル、ハロアラルキル、シクロアルキル、ハロシクロアルキル、シクロア ルキルアルキル、ハロシクロアルキルアルキル、シクロアルケニリル、ハロシク ロアルケニリルを表わす、ここで各ハロゲン置換は窒素原子から除去された少な くとも５個の炭素原子であり、各不飽和は窒素原子から除去された少なくともＣ １−Ｃｓ結合である（即ち、ハロゲン置換および／または不飽和はアミノ官能性 の塩基性度を余り低下させてはならない）　ｉ　Ｒ’、およびＲ２は、−緒にと ったときには、主鎖に炭素原子５個までを含むアルキレン、ハロアルキレン、ア ルケニレン、オヨヒハロアルケニレンからなる群から選んだ連鎖を形成する。そ して該連鎖の両末端原子価結合と共に全体で１０個までの炭素原子がＲ１お工び Ｒ７が結合される窒素原子に結合される。そして各ハロゲン置換原子は窒素原子 から除去された少なくとも５個の炭素原子であり、各不飽和は窒素原子から除去 された少なくとも０２〜Ｃ３結合であるｉＲｌおよびＲ３は、それらが結合され る窒素原子と共にとったときには、Ｎ、０およびＳからなる群から選んだ少なく とも１つ余分のへテロ原子を含む飽和窒素複素環を形成する。さらに望ましいの は、各Ｙはジメチルアミン−ジエチルアミン、ジインプロピルアミン、シフ゛チ ルアミン、メチルプロピルアミン、メチルヘキシルアミン、メチルシクロプロピ ルアミン。

エチルシクロヘキシルアミン、メチルベンジルアミン、メチルシクロヘキシルメ チルアミン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルホリン、チオモルホリン、ピロ リジン、ピペリジン、および２．６−シメチルビペリジンからなる群から選ぶこ とである。最適のＹはピロリジンである０ ２は実質的に全てのヒドロキシ保護基が可能である。

当業者には多くのヒドロキシ保珈基が知られている。

２はピキシル基（例えば、９−アリールキサンチン−９−イル）、トリアリール メチル基（例えばトリチル。

メトキシトリチル、トリメトキシトリチル、ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル、 ｐ−フルオロフェニル−１−ナフチルフェニルメチル、ｐ−アユシル−１−マフ チルフェニルメチル、ジー０−アユシル−１−ナフチルメチル、ジーＯ−アニシ ルフェニルメチル、およびｐ−）リルジフェニルメチル）、ジアルキルニリン酸 塩基。アルキルカルボニル基（例工ば、ベンソイル）。

トリアルキルシリアルギルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基− アルコキ７力ルボニル基（例えば、インブチルオキシカルボニル）、了り−ルス ルホニルアルコキシカルボニル基、’！’）−にチオアルキルオキシカルボニル 基、アラルキル基、アルキル基、アルケニル基、トリアルキルシリル基、ケタル 官能基（例えば、テトラヒドロピラニル、Ｉｌ−メトキシテトラヒドロプラン− ４−イル）、およびアセタール官能基からなる群から選ぶことが望ましい。

本発明に用いることができる種々のヌクレオシドは第１表に示すものを含む。

２′−Ａ−５’−Ａのときには、２’７Ａおよびうｒ−Ａは−ＯＨでないことが 望ましい。さらに望ましくは、ヌクレオシドは第１表のヌクレオシドう、５．１ ２およびｉｌｌによって表わさｎる式を有することである。

ヌクレオシドが２つの一０２置換基を含むときは、一方の２保拘基は他方を脱保 穫することなく脱保循できることが必須である。これは周知の方法で達せられる 。例えば、１つのＺがトリチルであって第２のＺがベンゾイル、トリアルキルシ リル、テトラヒドロピラニル、または他のケタルまたはアセタール官能基からな る群から選ぶ場合には、トリチルは弱酸またはルイス酸（例えば、臭化亜鉛）に よって他の保護基を除去することなく除去することができる。同様に、一方の保 護基がトリチルで、他方がベンゾイルである場合５ベンゾイル基は塩基性の条件 下でトリチル基を除去することなく除去することかでさる。同様に、一方の保護 基がトリチルで他方がトリアルキルシリルである場合、トリアルキルシリル基は フッ化物イオンで処理することによってトリチル基全除去することなく除去する ことができる。

Ｂは実雀的にいずれの天然または非天然リボヌクレオシドまたはデオキシヌクレ オシド塩基も可能である。

そのような塩基は限定ではないがプリン誘導体２例えばアデニン。ハイポキサン チンおよびグアニン、ピリミジン誘導体１例えばシトシン、ウラシルおよびチミ ン、並びにそれらの同族体および類似体を含む。

Ｇは実質的にいずれの複素環塩基保護基も可能である。当業者には多くの複素環 塩基保護基が知られている（２３−３３）。Ｇは複素環塩基に対応するアミノ、 イミド。

およびアミド保護基からなる群から選ぶことが望ましい。そのようなアミノ、イ ミド、お工びアミド保腹基は、限定ではないが、トリアリールメチル、トリアル キルシリルアルキル、アリールチオアルキル、アリールアルキル、シアノアルキ ル、フタロイル、アリール。

アリールオキシカルボニル、アルコキシカルボニル。

アリールカルボニル、アルキルカルボニル、およびＮ−ジアルキルアミノメチレ ンを含む。

数字ｎは複素環りζグ上の１個以上の反応性官能基が保積されるように選ぶ。こ の点の説明を第■表に示すＯ 第　π　表 チミン　ｌＯ〜１０ シストシン　１　０〜１１ グアニン　２　０〜２　１〜２ ハイポキサンチン　１　０〜１０ ウラシル　ｌ　Ｏ〜１１ ｒは１であることが望ましい。

弱酸は水中約２５℃において約７５〜約１１のｐＫを有することが望ましい、さ らに望ましくは約８〜約９、最適には約８２〜約ａ５のｐＫｆｒ有することが望 ましい。さらに１弱酸は、１．２．４−）リアゾール；１．２．５−）リアゾー ル；４，５−ジクロロイミダゾール：１１−ニトロイミダゾール；５−クロロト リアゾール；ベンゾ）　ＩＪアゾール；およびそｎらの混合物からなる群から選 ぶことが望ましい。さらに望ましくは１弱酸は４，５−ジクロロイミダゾール、 ベンゾトリアゾール、およびそれらの混合物からなる群から選ぶ。最適の弱酸は ４．５−ジクロロイミダゾールである。

溶媒はテトラメチル尿素、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド、１−メチル−２−ピ ロリジノン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジオキサン、テトラヒ ドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、クロロホルム。

１、う−ジメチルー２−イミダゾリジノン、Ｎ、Ｎ′−シンｆｋ　−Ｎ　、　Ｎ −プロピレン尿素、それらの同族体および類イＵ体、そｔらの混合体からなる群 から選ぶことが望ましい。さらに望ましくは、溶媒はテトラメチル尿素、ｌ　、 　５−ジメチル−２−イミダゾリジノン。

１−メチル−２−ピロリジノン、およびそｆらの混合体からなる群から選ぶ。さ らに、溶媒は無水（即ち。

０．０６％以下の水を含む）であることがＳｔしい。

その化学反応は便利な温度で行なうことができる。

この温度は反応混合体の凍結点から沸点までの範囲に及ぶ。化学反応は室温付近 での実施が望ましい。

化学反応の実施には便利な時間全採用することができろう例えば５反応時間は数 秒から１日以上にすることができる。しかしながら１反応はできるだけ速く（典 型的には約５〜１５分間、さらに望ましくは約１０分間）行なうことが望ましい 。

■は反応性物質Ｉニジも高モル濃度で存在することが望ましい。さらに望ましく は、ｍ：反応性官能基のモル比はＬ２：１である。

工と■の相対的モル濃度は重要ではないが、■のモル濃度は！のモル濃度の少な くとも２倍であることが望ましい。さらに望ましくは、πのモル濃度はｌのモル 濃度の約２〜５倍である。最適には、■のモル濃度　−はＩのモル濃度の約４倍 である。

反応物質は便利な順序で添加することができる。しかしながら０本発明の一工程 回転実施態様に関しては。

ｍを含む溶液に工を添加することが望ましい−この望ましい順序は１反応の経過 中における副産物の生成を少なくすると考えられる。

か〈生成さｎたヌクレオシド・ホスホルアミダイト中間体は、適当な剤２例えば ＩＨ−テトラゾールで活性化させることができる。そして過剰の被活性化ヌクレ オシド・ホスホルアミダイト中間体は周知の液体ま（１６，２２） たは固相法　における適当な被保護ヌクレオシドとの共役反応中に使用すること ができる。従ってこの方法は、溶媒並びに周囲環境からの極微量水分に対する望 ましい競走を保証する。

共役反応は固相法で実施することが望ましい。

次の実施例は５本発明の説明のためのものであって。

本発明の限定を意図するものではない。

ビス−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）メトキシホスフィンの調製１００　ｍｌの丸 底フラスコ中で一１５℃に冷却された０１モルのメトキシジクロロホスフィノに 一窒素雰囲気下でＮ、Ｎ−ジメチルアミノトリメチルシラノ（０２１モル）を約 ５０分かけて１滴ずつ添加した。次にその反応混合体を冷浴から取り出して、環 境温度で約１時間かくはんした。反応経過中に生成したクロロトリメチルシラン は減圧（水アスピレータ−）下で除去した。

残った物質は温度５８〜１１Ｏ℃、圧力ｉ５ｍａｙで蒸留した。濁った液体は中 位気孔率のガラス焼結漏斗を介してろ過した。物理的な特性は次のように固定さ れた： ｌＨＮＭＲ（ＣＤＩＪ３　）＝５．５ｐｐｍ（ａ、−０ＣＲ３，３Ｈ）ＪＰ−Ｈ −１５Ｈｚそのスペクトルは外部ＴＭＳレファレンスに関して記録された。５１ ＰＮＭＲ（ＣＤ（Ｊ３　）ニー１５８．１８ｐｐｍ（外部８５　％　Ｈ３Ｐｏ４ レファレンスに関シテ）。

透明液体の密度は２５℃において０９５６ＩＩ／ｌｌ１ｌ！であつた。

１００ｄの丸底フラスコ中で一１５℃に冷却された０１モルのメトキシジクロロ ホスフィンに、窒素雰囲気下でＮ−トリメチルシリＱピロリジン（０２１モル） を約５０分かけて１滴ずつ添加した。次にその反応混合体を冷浴から取り出して 、環境温度で約１時間がくはんした。その反応過程で生成されたクロロトリメチ ルシランは減圧（水アスピレータ−）下で除去した。

残留した物質は温度６６〜６８℃、圧力０．１６　ｓｍ　Ｈ１で蒸留した。濁っ た液体は中位気孔率のガラス焼結漏斗を介してろ過した。その収率は８２％であ った。物理的特性は次のようだ同定さ扛た： ｌＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　：　ｓ、ｉｔｐｐｍ　（ｄ　、　０ＣＨ３）Ｊ　ｐ −Ｈ＝１５Ｈｚ３．１ｐｐｍ（ｍ、　−Ｎ−ＣＨ，） １．８ｐｐｍ（ｍ、　−ＣＨ２−ＣＨ２）スペクトルは外部ＴＭＳレファレンス に関して記録された。

５ＬＰＮＭＲ（ＣＤＣ４）ニー１５１１．Ｏｌｐｐｍ（８５％Ｈ３Ｐ０．レファ レンスに関して）０ ２５℃における透明液体の密度はＬ　０５７　ｔｔ／”であ１００　ｍｌの無水 エチルエーテル中のメトキシジクロロホスフィン（１５ｇ、Ｏ，１１モル）に、 窒素雰囲気下、−１５℃において１００　ｍｌの無水エチルエーテル中のＮ、Ｎ −ジイソプロピルアミン（ｌＩ４．５　ｙ、　０．ｌｌＩＩモル）を約５０分か けて一滴ずつ添加した０次にそのけん濁液を冷浴から取り出して、環境温度にお いて約１時間かくはんした。次にアミン塩酸塩をろ過し７無水エーテル１００　 ＩＩＩｔで洗浄した。ろ液から過剰のニーチルは大気圧下で蒸留除去した。残っ た物質は、ろ過によって残留アミン塩酸塩から分離し、５９〜６１℃。

Ｑ、　２　［ＨＩにおいて分別沸とうを与えるために高真空下で蒸留した。その 収率は７９％であった。物理的特性は次のように同定された： ｌａ　ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）：　３うｐｐｍ（ｄ、−０ＣＨ３）ＪＰ−〇＝１４ Ｈ，ｚ。

５．４ｐｐｍ（ｍ、−Ｎ（ＣＨ）２） ＬＯｐｐｍ（ｄ、−ＣＨ（ＣＨｓ　）ｘ　）５１　ＮＭＲ（ＣＤＣ４）ニー１３ Ｌ８ｐｐｍ（外部の８５％Ｈ，ＰＯ，レファレンスに関して）０ ２６℃における透明液体の密度は０．９１１９　／　ｍｅであ■ ［［［、Ｂ＝１−チミニル ｄ　ｍ　ｔ　＝　シー　ｐ−アニシルフェニルメチル例２でｐｇ　ｔ、ｅビス− （ピロリジノ）メトキシホスフィン（Ｉａ：０．２５ｍｍｏｌ）ｉｏ、５ｍＪの 乾燥１−メチル−２−ピロリジノン中のゲー被保護デオキシヌクレオシド（ｍ　 ；　０．２８ｍｍｏｌ）およびヰ、５−ジクロロイミダゾール（］Ｉ　；　１． ００　ｍｍｏｌ）の、蓄液に注入した、うＩＰＮＭＲは一少量の対称的なジヌク レオシド・モノ亜リン酸塩Ｖ（−１５９，７ｐｐｍ　；　８．８％副産物）と共 にヌクレオシド　ホスホルイミダイ）■ａのはソ定量的収率オリゴマーの調製 ポリヌクレオチド合成への新規合成法全試験するために１次の実験を行った。乾 燥１−メチル−２−ピロリジノン（０，５ｍｌ　）中の５′−被保穫ヌクレオシ ドＩａ（１５５Ｍｇ、　０．２８ｍｍｏｌ）と４．５−ジクロロイミダゾール（ Ｉｔ　、　１５６１ｎｇ、　１．　ＯＯｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下、環 境湿度において５０μｌのビス−（ピロリジノ）メトキシホスフィン−（Ｉａ　 ；　０．２５ｍｍｏＬ）を添加した。約１０分後、ＬＨ−テトラゾールの０５Ｍ アセトニトリル溶液２５０μ！中にけん濁した１Ｌモルのジオキシチミジンで誘 導された固体支持体５０１１９に含む１４　ｍｌのガラスびんに７０μｌ　（２ ５ｍｍｏｌ）の貯蔵溶液を注入した。その反応混合体は室温で約５分間部とすし −ＴＨＦ：２．６−ルチシン：Ｈ，Ｏ（２：１：２）の溶液１．５　ｍｌで冷却 し、普通の方法に従って酸化した。標準の脱保護の後１反応生成物を高性能液体 クロマトグラフ法によって分析した。ｄ（ＴｐＴ）の高収率（〉９５％）と若干 量（〈５％）の未反応チオキシチミジンが観察された。ｄ（ＣｐＴ）、ｄ（Ａｐ Ｔ）およびｄ（Ｇ　Ｔ）も９５％以上の収率で生成さｎた。

これらの生成物は市販の本物の試料に厳密に同一であ例５に示した方法に従って １次のオリゴヌクレオチドをうまく調製した： ｄ（ＧＣＡＴＣ（）ＣＣＡ（）ＴＣＡＣＴＡＴＣ）ＧＣＧＴ）全体の収率は約５ ０％であった。これ（ｄ平均収率９９．４％が各工程で得られることを意味する （ｌｊ９８ｎｍの波長において７×１０の吸光度を用いてジメトキシトリチル陽 イオ・ンから分光的に潰１１定）、−その場でのヌクレオシド・ホスホルアミダ イトの調製に１式の化合物の選択的活性化を用いて、ここに開示した合成法は。

自動化さ扛た固相ＤＮＡおよびＲＮＡ合成用に優れた手段である。現存する方法 に比べて水沫の利点のいくつかは次の通りである。

デオキシヌクレオシド・ホスホルアミダイトの調製中に生成さｎる複素環リング の有害な亜リン酸塩化の破壊、および吸湿性アミン塩酸塩の除去に必要′す水性 仕上げの排除（１６）。

ヘキサン中における（−７０℃）デオキシヌクレオシド・ホスホルアミダイトの トルエンまたは酢酸エチル溶液の沈殿からなる困難な単離操作の排除（＋　６　 ）。

その場所で作ら；ｔｔｔデヌクレオシド・ホスホルアミダイトが一般に比較的短 期間で消費これるため、アセトニトリル溶液中にデオキシヌクレオシド・ホスホ ルアミダイトの長期放置によって生じる安定性の問題の排除。

取扱いが困難であり、大気中の水分に極めて敏感であるところのクロロ−（Ｎ、 Ｎ−ジメチルアミノ）メトキシホスフィン（１６）、クロロ（Ｎ、Ｎ−ジイソプ ロピホスフィ、（２０、２１）−ビス−（テトラゾリル）メトキシホスフィン（ ２１）のような自燃性お工び／または反応性の亜リン酸塩化剤の排除。

１式の化合物は、対応するクロロホスフィンに比較して大気中の水分に対して極 めて安定であるため、容易に調製されると共に取扱いが安全である。

従って、適当な活性化剤によってその場所で生成されたヌクレオシド・ホスホル アミダイト中間体の効率的な活性化を介した高結合収率と共に、１式の化合物の 選択的活性化を介した高収率でヌクレオシド・ホスホルアミダイト中間体に変換 される安定な被保眸ヌクレオシドの使用は、本発明の方法を自動化しやすぐする と共に、固相またに液相のＤＮＡおよび／またはＲＮ　Ａ、の手動合成が望捷し い場合には非化学者による使用をしやすくする。

当然のことなから−この開示に基いて、多くの他の改良および分枝が当業者には 示唆さするであろう。そｎらは本発明の範囲内に包含されるものである。

文　献 Ｐｏｚｎａｎ、Ｐｏ１ａｎｄ、０ｃｔｏｂｅｒ　１９７６、　ｐｐ、　１１１５ −１５５゜１９８０、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　ｐｒｅｓｓ、’　０ｘｆｏｒｄ、Ｅｎ ｇｌａｎｄ。

９、Ｄａｕｂ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、　９９．５５２６ −５５２８ａｎｄ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｔｈｅｒｅｉｎ、Ｓｅｅ　ａｌｓｏ ○ｇｉ、１ｖｉｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃａｎ、Ｊ、Ｃｈｅｍ、、　５Ｌ　２６ｇ６−２６９５（１９８０）。

１２．０ｇ１ｌｖｉｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、＋ 　２１．　１１１５９−１１１．Ｇ２（１９８０）。

１ｇ６２（１９８１）。

１７、Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎ。

１８、ＭｃＢｒｉｄｅ　ｅｔ、’ａ１．．　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ 、、２Ｌ　２１１５−２１１８６（１９８３）。

２０、Ｊａｙａｒａｍａｎ　ｅｔ　、ａｌ、、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ ｔ、、２３．５５７７−５５１！０（１９８２）。

Ｓｅｔｌｏｗ　ｅｔ、ａＬ、、Ｐｈｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、（１９８２ ）ｐｐ、１−１７゜７１１−７１１＋（１９８５）。

２９４９−２９５５（１９ｉ） ２９、Ｒａｐｐｏｐｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、、１ ｏｌｌ。

５７０２−５７ｉ（１９８２）。

４７ｇ９１７９２（１９ｇ２）。

１う５−２１５（１９７９’）。

５９、　Ｋｏｓｓｅｌ　ｅｔ　ａｌ。、　Ｆｏｒｔｓｃｈｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｏ ｒｇ、　Ｎａｔｕｒ、。

１５９９（１９８３）。

国際調査報告 １■可・

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　次式によって表わされる化学反応 上式におけるＸはリン酸塩保護基である：各Ｙは第二アミンの基である： Ｚはヒドロキシ保ｊ基である； 前記弱酸は前記第二アミノ基の１つのアミンだけを選択的に保誇することができ る； 各Ａは−Ｈ−−ＯＨ−および−○Ｚからなる群から選ぶ； Ｂは天然および非天然のプリンおよびピリミジン塩基からなる群から選ぶ； Ｇは複素環塩基保護基である； 各りは−Ｈおよび−ＯＺからなる群から選ぶ；Ｅは−○Ｈおよび−０，２から万 る群から選ぶ、但いａ）両方のＡｓが同一で、かつ−Ｈまたは−ｏｚ。 従ってＥが−○Ｈであるとき、および（ｂ）両方のＡｓが同一で、かつ−ＯＨ， 従ってＥが−ＯＺであるとき、。 ｎは０〜２の数である； ｒ、ｓお工びｔはそｎぞｎｏまたは１．但しｒ＋ｓ＋ｔ＝２； 前記溶媒は（ａｌ　Ｉ　−１［およびｍｆ可溶化し、（ｂ）前記反応を進行さザ ることかできる；そして■は反応性Ｉのモル濃度に少なくとも等しいモル濃度で 存在する。 ２、Ｉ［［が反応性Ｉよυ高モル濃度で存在し；■が１のモル濃度の少なくとも ２倍のモル濃度で存在することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の化学反応 。 う　■が■のモル濃度の約２〜約５倍のモル濃度で存在することを特徴とする請 求の範囲第２項に記載の化学反応。 ４　■゛反応性Ｉのモル比が約Ｌ２：１であり。 ■＝１のモル比が約４．１であること全特徴とする請求の範囲第う項に記載の化 学反応。 ５　前記弱酸が８２０中約２５℃において約７５〜約１１のｐＫｋ有することを 特徴とする請求の範囲第１頌に記載の化学反応。 ６　前記弱酸のｐＰξが約８〜約１０５であることを特徴とする請求の齢囲第５ 項に記載の化学反応。 ７　前記弱酸のｐＫが約８〜約９であることを特徴とする請求の範囲第６項に記 載の化学反応。 ８　前記弱酸のｐＫが約８２〜約８５であることを特徴とする請求の範囲第７項 に記載の化学反応。 Ｒ，とＲ２の各々は、別々にとったとき、炭素原子１０個までを含むアルキル、 ハロアルキル、アルグニル、ハロアルケニル、アラルキル、ハロアラルキル、シ クロアルキル、ハロシレロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロシクロアル キルアルキル。 シクロアルケニル、ハロシクロアルケニル、ヲ表わし、各ハロゲン置換は窒素原 子から除去された少なくともうつの炭素原子であり、各不飽和は窒素原子から除 去さ扛り少なくとも０２〜Ｃ３結合である：Ｒ，とＲ２は、−緒にとったとき、 主鎖に炭素原子５個までを含むアルキレン、ハロアルキレン２アルケニレン、お よびハロアルケニレン連鎖からなる群から選んだ連鎖を形成し、該連鎖の両末端 原子価結合と共に合計１０個までの炭素原子が−Ｒ，お工びＲ２に結合さ九る前 記窒素原子に結合さ扛、各ハロゲン置換原子は窒素原子から除去さｎた少なくと もう個の炭素原子であり、各不飽和は窒素原子から除去さ扛た少なくともＣ２〜 Ｃ１結合である；Ｒ＋　とＲ２は、結合される前記窒素原子と一緒にとったとき −Ｎ、○、およびＳつ・らなる群から選んだ少なくとも１個の追加へゾロ原子ケ 含む飽和窒素複素環を形成する； 前記弱酸はＨ２０中２５℃において約７５〜約１１のｐＫを有する。 前記溶媒はテトラメチル尿素、　Ｎ　、　Ｎ−ジメチルアセトアミド、１−メチ ル−２−ピロリジノン、Ｎ。 Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジオキサン、テ）７ヒドロフラン、酢酸エチル、ク ロロホルム、ｌ、う−ジメチル−２−イミダゾリジノン−Ｎ、Ｎ−ジメチルーＮ 、Ｎ’−プロピレン尿累、それらの同族体および類似体、およびそれらの混合体 からなる群から選ぶ： ■は反応性工より高いモル濃度で存在する；そして ■はＩのモル濃度の少なくとも２倍のモル濃度で存在することを特徴とする請求 の範囲第１項に記載の化学反応。 １０　各Ｙはジメチルアミン、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチ ルアミノ、メチルプロピルアミン、メチルヘキシルアミン、メチルシクロプロピ ルアミン、エチルシクロヘキシルアミン、メチルペンジルアミノーメチルシクロ ヘキシルメチルアミン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルホリン、チオモルホ リン、ピロリジン、ピペリジン、および２゜６−シメチルピペリジンからなる群 から選び：前記酸のｐＫが約８〜約１０５であシ；■がＩのモル濃度の約２〜約 ５倍のモル濃度で存在すること全特命とする請求の範囲第９項に記載の化学反応 ０ １１　前記弱酸のｐＫが約８〜約９であること全特徴とする請求の範囲第１０項 に記載の化学反応、１２　前記弱酸のｐＫが約８２〜約８５であることを特徴と する請求の範囲第１１頌に記載の化学反応。 ｌう　前記弱酸は１．２．ｌｌ−トリアゾール；１．２゜５−トリアゾール；キ 、５−ジクロロイミダゾール；４−°ニトロイミダゾール、う−クロロトリアゾ ール；ベンゾトリアゾール：およびそれらの混合体からなる群から選ぶことを特 徴とする請求の範囲第１２項に記載の化学反応。 １１１、前記弱酸はキ、５−ジクロロイミダゾール、ベンゾ）　ｌ）アゾールお よびこれらの混合体からなる群から選ぶことを特徴とする請求の範囲第１う頂に 記載の化学反応。 １５　前記弱酸が４．５−シクロロイミダゾールでアリ１前記溶媒がテトラメチ ル尿素、１，５−ジメチル−２−イミダゾリジノン、１−メチル−２−ピロリジ ノン、およびこれらの混合体からなる群から選び；■：反応性工のモル比が約１ ２：１であり；■：■のモル比がｒｌｌＩ：１であることを特徴とする請求の範 囲第６頌に記載の化学反応。 １６　次式によって表わされる化学反応。 Ｙ　（Ｉ）　（Ｉ［） （■）− 上式中における又はリン酸塩保護基である；＠Ｙは第二アミノ基である； Ｚはヒドロキシ保護基である； 前記弱酸は前記第二アミノ基の１個のアミンだけ全選択的に保護することができ る； 各Ａば−Ｈ−−ＯＨおよび−０２からなる群から選ぶ； Ｂは天然および非天然のプリンおよびピリミジン塩基からなる群から選ぶ； Ｇは複素環塩基保護基である： 各りは−Ｈおよび−ＯＺからなる群から選ぶ：Ｅは−ＯＨおよび−ＯＺからなる 群から選ぶ、但しくａ）両方のＡｓが同一で、−Ｈまたは○Ｚであり。 従ってＥが−ＯＨのとき、（ｂ）両方のＡＳが同一で。 −ＯＨであり、従ってＥが−Ｏ２であるとき；ｎは０〜２の数である： ｒ、ｓおよびｔはそれぞれＯまたはｌである。但しｒ→−ｓ　＋　ｔ　−２；前 記溶媒は（ａ）Ｉ−Ｉｆおよびｍ２可溶化し、（ｂ）前記反応を進行させること ができる：そして ■は反応性工のモル濃度に少なくとも等しいモル濃度で存在する。 １７、ＩＩＩが反応性■より窩いモル濃度で存在し；■が工のモル濃度の少なく とも２倍のモルｉ度で存在することを特徴とする請求の範囲第１６頌に記載の化 学反応。 １８　■がＩのモル濃度の約２〜約５倍のモル濃度で存在すること全特徴とする 請求の範囲第１７項に記載の化学反応。 １９　■６反応性工のモル比が約１２．１であり−ｎｉｌのモル比が約ｌ＋＝１ であること全特徴とする請求の範囲第１８項に記載の化学反応。 ２０　前記弱酸がＨ２０中約２う℃において約７５〜約１１のｐＫｋ有すること 全特徴とする請求の範囲第１６頂に記載の化学反応。 ２１　前記弱酸のｐＫが約８〜約１０５であることを特徴とする請求の範囲第２ ０項に記載の化学反応。 ２２　前記弱酸のｐＫが約８〜約９であることを特徴とする請求の範囲第２１項 に記載の化学反応。 ２う　前記弱酸のｐＫが約８２〜約８５であることを特徴とする請求の範囲第２ ２項に記載の化学反応。 Ｒ１とＲ２の各々は、別々にとったとき、炭素原子１０個までを含むアルキル、 ハロアルキル、アルケニル−ハロアルケニル−アラルキル、ハロアラルキル、シ クロアルキル、ハロシクロアルキル、シクロアルキルアル、キル、ハロシクロア ルキルアルキル。 シクロアルケニル、ハロノクロアルケニル、ｉ表。 し、各・・ロゲン置換は窒素原子から除去された少なくともうつの炭素原子であ り、各不飽和は窒素原子から除去された少なくとも０２〜Ｃ３結合である；Ｒ１ とＲ２は、−緒にとったとき一生鎖に炭素原子５個１で全含むアルキレン、／・ ロアルキレン、アルケニレン、およびハロアルケニレン連鎖からなる群から選ん だ連鎖を形成し２該連鎖の両末端原子価結合と共に合計１０個までの炭素原子が 、Ｒ１およびＲ２に結合される前記窒素原子に結合され、各ノ・ロゲン置換原子 は窒素原子から除去された少なくともう個の炭素原子であり２各不飽和は窒素原 子から除去された少なくとも０２〜Ｃ３結合である：Ｒ１とＲ２は、結合される 前記窒素原子と一緒にとったとき、Ｎ、０．およびＳからなる群から選んだ少な くとも１個の追加へテロ伸子を含む飽和窒素複素環全形成する： 前記弱酸はＨ２０中２５℃において約７５〜約１１のｐＫを有する； 前記溶媒はテトラメチル尿素、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド、１−メチル−２ −ピロリジノン、Ｎ。 Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジオキサン−テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ク ロロホルム、１．う−ルーＮ、Ｎ−プロピレン尿素、それらの同族体および類似 体、およびそれらの混合体からなる群から選ぶ： ■は反応性■より高いモル濃度で存在する。そして ■は工のモル濃度の少なくとも２倍のモル儂度で存在すること全特徴とする請求 の範囲第１６項に記載の化学反応。 ２５　各Ｙはジメチルアミン、ジエチルアミンージイソプロピルアミン５ジブチ ルアミン、メチルプロピルアミン、メチルヘキシルアミン、メチルシクロプロピ ルアミン、エチルンクロヘキシルアミン、メチルベンジルアミン、メチルシクロ ヘキシルメチルアミン５ブチルシクロヘキシルアミン、モルホリン、チ７オモル ホリン、ピロリジノ２ピペリジン、および２゜６−シメチルピペリジンからなる 群から選び：前記酸のｐＫが約８〜約１０５であり；■がＩのモル濃度の約２〜 約５倍のモル濃度で存在することを特徴とする請求の範囲第２１Ｉ項に記載の化 学反応。 ２６　前記弱酸のｐ’Ｋが約８〜約９であること全特命とする請求の範囲第２５ 項に記載の化学反応。 ２７　前記弱酸のｐＫが約８２〜約８５であることを特徴とする請求の範囲第２ ６項に記載の化学反応。 ２８　前記弱酸は１，２．１１−トリアノール；１，２゜ウートリアノ゛−ル； ４，５−ジクロロイミダゾール：稀−二トロイミダゾール：５−クロロトリアゾ ール；ペンツ゛トリアノ゛−ル；およびそれらの混合体からなる群から選ぶこと を特徴とする請求の範囲第２７項に記載の化学反応。 ２つ　前記弱酸は４，５−ジクロロイミダゾール、ベンゾトリアゾールおよびこ れらの混合体からなる群から選ぶことを特徴とする請求の範囲第２８項に記載の 化学反応。 ５０　前記弱酸が４，５−ジクロロイミダゾールであり：前記溶媒がテトラメチ ル尿素、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、１−メチル−２−ピロリジ ノン、およびこれらの混合体からなる群から選び；■：反応性■のモル比が約Ｌ ２：１であり；■：工のモル比が約４．ｌであることを特徴とする請求の範囲第 ２９項に記載の化学反応。 ５１　次式（式中の又はメチルである）を有する化合物。