HU221002B1 - Új lézerfestékek, eljárás azok előállítására és alkalmazására - Google Patents
Új lézerfestékek, eljárás azok előállítására és alkalmazására Download PDFInfo
- Publication number
- HU221002B1 HU221002B1 HU9801027A HUP9801027A HU221002B1 HU 221002 B1 HU221002 B1 HU 221002B1 HU 9801027 A HU9801027 A HU 9801027A HU P9801027 A HUP9801027 A HU P9801027A HU 221002 B1 HU221002 B1 HU 221002B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cgx
- product
- biomolecules
- mixture
- phosphonate
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 5
- 239000000976 ink Substances 0.000 title 1
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- JVSFQJZRHXAUGT-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylpropanoyl chloride Chemical compound CC(C)(C)C(Cl)=O JVSFQJZRHXAUGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 3
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims description 3
- HENZRBYHAMWFGX-UHFFFAOYSA-N carbonic acid;ethanamine Chemical compound CC[NH3+].OC([O-])=O HENZRBYHAMWFGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 abstract description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000000990 laser dye Substances 0.000 abstract description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 13
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 9
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 8
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- -1 3-hydroxypropyloxy group Chemical group 0.000 description 6
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 6
- 238000004679 31P NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000005731 phosphitylation reaction Methods 0.000 description 5
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 3-[chloro-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(Cl)OCCC#N QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N (+)-propylene glycol Chemical compound C[C@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 1,3-propanediol Substances OCCCO YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NSPMIYGKQJPBQR-UHFFFAOYSA-N 4H-1,2,4-triazole Chemical compound C=1N=CNN=1 NSPMIYGKQJPBQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QGJOPFRUJISHPQ-UHFFFAOYSA-N Carbon disulfide Chemical compound S=C=S QGJOPFRUJISHPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical compound OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 229920000166 polytrimethylene carbonate Polymers 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 2
- DSXAZYNMJFDPHQ-QJPTWQEYSA-N [(2r,3s,5r)-2-(hydroxymethyl)-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-3-yl] 4-oxopentanoate Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OC(=O)CCC(=O)C)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 DSXAZYNMJFDPHQ-QJPTWQEYSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- LPIQUOYDBNQMRZ-UHFFFAOYSA-N cyclopentene Chemical compound C1CC=CC1 LPIQUOYDBNQMRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001394 phosphorus-31 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 125000004193 piperazinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- SYOANZBNGDEJFH-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydro-1h-triazole Chemical compound C1NNN=C1 SYOANZBNGDEJFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FINYOTLDIHYWPR-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxy-n,n-di(propan-2-yl)phosphonamidous acid Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(O)OCCC#N FINYOTLDIHYWPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004604 Blowing Agent Substances 0.000 description 1
- QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N Chloramine Chemical compound ClN QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229910010082 LiAlH Inorganic materials 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical class [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- YQVISGXICTVSDQ-UHFFFAOYSA-O [c-]1nn[nH]n1.CC(C)[NH2+]C(C)C Chemical compound [c-]1nn[nH]n1.CC(C)[NH2+]C(C)C YQVISGXICTVSDQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940059260 amidate Drugs 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000005915 ammonolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012801 analytical assay Methods 0.000 description 1
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- DQTRYXANLKJLPK-UHFFFAOYSA-N chlorophosphonous acid Chemical compound OP(O)Cl DQTRYXANLKJLPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- DAKIDYQCFJQMDF-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;pyridine Chemical compound ClCCl.C1=CC=NC=C1 DAKIDYQCFJQMDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 150000002081 enamines Chemical class 0.000 description 1
- OZECFIJVSAYAPH-UHFFFAOYSA-N ethyl-di(propan-2-yl)azanium;chloride Chemical compound Cl.CCN(C(C)C)C(C)C OZECFIJVSAYAPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPUKDXXFDDZOKR-LLVKDONJSA-N etomidate Chemical compound CCOC(=O)C1=CN=CN1[C@H](C)C1=CC=CC=C1 NPUKDXXFDDZOKR-LLVKDONJSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N hydrogen carbonate;triethylazanium Chemical compound OC(O)=O.CCN(CC)CC AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N pentamethylene Natural products C1CCCC1 RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000008039 phosphoramides Chemical class 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- RFIOZSIHFNEKFF-UHFFFAOYSA-N piperazine-1-carboxylic acid Chemical group OC(=O)N1CCNCC1 RFIOZSIHFNEKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N propane-1,1-diol Chemical compound CCC(O)O ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Jelen találmány azon a felismerésen alapul, melyet egy olyan, kapcsolódási hellyel rendelkező, konjugált lézerfesték gyártását célzó kutatás során tettünk, amely alkalmas kis- és nagyméretű, lehetőleg OH-csoporttal vagy N-terminálissal rendelkező monomer vagy oligomer biomolekulák megjelölésére. A régebbi, radioaktív jelölést alkalmazó módszerek igen munka- és időigényesek voltak.
Jelen szabadalmi bejelentésben egy új, tökéletesített módszert mutatunk be a biomolekulák közel infravörös fluoreszcens jelölésére: a DNS-szál jelölését említve gyakorlati példaként.
A gélelektroforézis, a kapilláriselektroforézis és más analitikai vizsgálat a célvegyületek, illetve a vegyületekIR-144 r
hez kapcsolódó részek nagy érzékenységű, a kereskedelemben kapható lézerdiódákkal igen alacsony molekuláris koncentrációszinten történő kimutatásán alapszik. Úgy találtuk, hogy IR-közeli jellemzői miatt az IR-144 jelű vegyület megfelelő kiindulási vegyület további vizsgálódásainkhoz. Az IR-144-amidit előállítását célzó reprodukciós kutatási munkánk során megállapítottuk, hogy a Patonay és munkatársai [1. Shealy D. B., Lohrmann R., Ruth J. R., Narayanan N., Sutter S. L., Casay; G. A.,
Evans L., Patonay G.: Applied Spectroscopy 49 (12) 1815-1820 (1995)] cikkében leírt eljárás elvégzése után a termék elemzési adatai nem egyeznek meg a szerzők által leírt IR-144-propanol-származék adataival.
A reakcióegyenletet az alábbi (1. ábrán) mutatjuk be :
Úgy találtuk, hogy vízmentes körülmények között az IR-144 enamin szerkezete nukleofilszubsztitúcióval átalakul. A karboetoxi-piperazin-csoportot helyettesítve új CGX-0093901 szerkezetű vegyületet (1) kapunk, melynek szerkezetét a hagyományos spektroszkópiai vizsgálatokkal ellenőriztük (H-, C13-NMR.MS).
HU 221 002 Bl
IR-144
CGX-0093901
2. ábra
Úgy találtuk, hogy a CGX-0093901 (1) spektrális jellemzői összhangban vannak kémiai felépítésével. Az abszorbancia maximum eltolódása megfelel a festékek konjugált „én” szerkezetéhez kapcsolódó heteroatom cseréjének (N>0). Molekuláris modellezési számításainkkal is jól egybeesett ez a tény.
A helyettesítési reakció mechanizmusát szintén alátámasztottuk egy olyan kísérlettel, amelyben a 2. ábrán látható reakciót víz jelenlétében végeztünk el. A reakció fő terméke olyan keton volt, melyből teljesen eltűnt a piperazingyűrű. Tehát a víz mint nukleofil, a teljes piperazinstruktúrát helyettesítette a molekulában.
A szintézis stratégiáját megváltoztatva, olyan kémiai kapcsolóágensekkel ellátott lézerfestékeket kívántunk előállítani, amelyek vizsgálataink szerint alkalmasak lehetnek oligonukleotidák OH- és NH-terminálisának jelölésére: CGX-0093902 (2) - CGX-0093903 (4).
Az irodalomban leírt eljárás megismétlése
Az irodalomban ismertetett eljárás alapján [Shealy D. B., Lohrmann R., Ruth J. R., Narayanan N., Sutter
S. L., Casay; G. A., Evans L., Patonay G.: Applied Spectroscopy 49 (12), 1815-1820 (1995)] először a köztes 3-OH-propil analóg intermediert készítettük el. Kiderült, hogy az 1,3-propán-diol víztartalma jelentősen befolyásolja a végeredményt az előzőekben említett vizes nukleofil szubsztitúció mint mellékreakció miatt. A víztartalomnak sikeres kísérlet esetén lehetőleg 200 ppm alatt kell lennie.
Az irodalomban leírt reakció méretének jelentős növelése miatt szükségünk volt gyakorlatiasabb szintézismódszer kidolgozására. A reakcióelegy teljes mennyiségének csökkentése érdekében, a vízzel végzett feldolgozási munka után a reakciót az eredeti előíráshoz képest tízszer töményebb oldatban végeztük el. Másfelől pedig a vízzel végzett munka során ötszörös mennyiségű NaCl-oldatot használtunk, így sokkal jobban ki tudtuk csapni a képződött propán-diol-terméket, mint az eredeti kísérletben tették. Bár ily módon a nyersterméket közel kvantitatív hozamban izoláltuk, az még mindig tartalmazott a vékonyréteg-kromatográfiás mérések sze3
HU 221 002 Bl rint körülbelül 20%-nyi reakcióba nem lépett IR-144et. A komponensek sikeres elkülönítéséhez legalább a minta súlyához képest 1500-szoros mennyiségű szilikagél szükséges. Noha a tiszta, zöld termék maximális abszorpciója (1) (Xmax=780 nm) megfelelt a leírásban is- 5 mertetett értéknek, az IR, MS, Ή- és 13C-NMR-spektrumok kétségen kívül bizonyították, hogy az IR-144ből eltűnt a piperazin-karbonsav-rész. Mindegyik spektrum szerint a 3-hidroxi-propil-oxi-csoport közvetlenül kapcsolódik a ciklopenténhez, így szubsztituálja az 10
IR-144 piperazincsoportját és megfelel a 3. ábrán látható szerkezetnek.
Ez élesen szembenáll azzal a leírt szerkezettel, amelyet putatív, egyszerű transzészteresítési reakció révén kapnánk, és amit Patonay és társai fenti cikkükben mint kapott szerkezetet megadnak. Úgy módosítottuk a szintézis stratégiáját, hogy az új CGX-0093901 (1) (3. ábra) hidroxi-propil-csoportján található reaktív csoportot a leírásban ismertetett elgondolásnak megfelelően alakítottuk ki.
IR-144
1. ) 1,3-propán-diol,
Et3N telített vizes NaC oldat
2. ) SiOj kromatográfia
CGX-0093902
CGX-0093910
3. ábra
HU 221 002 Bl
Kísérletek a CGX-0093901 (1) amidit elkészítésére: CGX-0093902 (2) készítése Számos kísérletet végeztünk a tiszta 2-cianoetilΝ,Ν-diizopropil-foszforamidit-származék derivatíva (2) előállítására. A leggyakrabban használt módszert (vagyis foszfitiláció 2-cianoetil-N,N,N’,N’-tetraizopropil-foszforodiamidittel száraz CH2Cl2-ben) nem alkalmazhattuk, mivel az (1) nem oldódik CH2Cl2-ben és egyéb semleges, aprotikus oldószerekben.
Bár ígéretes reakció elvégezhető védett nukleoziddal, megpróbáltuk ezt a reakciót (l)-gyel DMF-ben végrehajtani, melyben az (1) remekül oldódik, azonban a keverékben még egy nap elteltével sem találtunk új terméket. Valószínűsíthető, hogy a DMF, amelyet szárítással nem lehet eltávolítani, erősen befolyásolja az Rr értékeket és teljesen elnyomja az (1) és a termék(ek) közti Rrkülönbséget. Nem sikerült számos fúttatóelegy egyikében sem követnünk a reakciót a DMF zavaró hatása miatt. A DMF nélkül viszont a reakció nem képes végbemenni.
Később rájöttünk, hogy az (1) igen jól oldódik piridinben, azonban a közeg bázikussága miatt itt a foszfitilációt csak a jóval érzékenyebb 2-cianoetil-N,N-diizopropil-klorofoszforamidit felhasználásával lehet végezni. Ilyen körülmények között katalizátorként EtNiPr2-t használva a reakció sikeresnek tűnt. A reakció 2 óra alatt lezajlott, ezután sor került a poláris komponensek eltávolítására NaHCO3 vizes oldatának felhasználásával. A két fázis teljes elkülönítéséhez két napra volt szükség. A szerves fázistól elkülönített szilárd nyersterméket 31P-NMR-spektroszkópiával analizáltuk.
Feltéve, hogy az összes foszfortartalmú összetevő a szerves fázisban maradt, a spektrum a keverékben a kívánt P-amiditból (2), jelentős mennyiséget (36%) jelzett. Továbbá 11% oxidálódott terméket (3) és a reagens hidrolízistermékéből 53%-ot mutatott.
Figyelembe véve, hogy a reagens másfélszeres moláris feleslegben volt, megállapítható, hogy az (1) 54%a alakult át a céltermékké (2), míg további 16,5% oxidálódott (3) termékké, és 30% vagy nem lépett reakcióba, vagy pedig a vizes keverékben töltött hosszú feldolgozási idő alatt defoszforizálódott.
Tiszta (2) előállításához megkíséreltük a nyersterméket normálnyomású Si02-oszlopkromatográfíával tisztítani, eluensként CHCl3-MeOH-piridin keveréket használva. A tisztított tennék 31P-NMR-spektruma szerint az oszlopon megtörtént a teljes defoszforizáció, amely valószínűleg az eluensek magas MeOH-tartalmának és a (2)-nek az oszloppal történő viszonylag hosszú idejű (~3-4 órányi) érintkezésének tudható be. Ez utóbbi problémát esetleg meg lehetett volna oldani HPLC alkalmazásával, azonban sajnálatos módon nem állt rendelkezésünkre a HPLC-készülékhez csatlakoztatható közeli IR-ben mérő (600-800 nm) detektor.
Erőfeszítéseink ellenére a másik problémát, vagyis az eluensek magas MeOH-tartalmát sem sikerült megoldani. Sajnos a festékmolekula erősen poláris jellege miatt a MeOH-t nem lehet semmilyen más oldószerrel helyettesíteni, amely alkalmas lett volna egyidejűleg hatékony elúcióra és a főtermék megfelelő mértékű elválasztására.
Végül megkíséreltük a tiszta (2)-t kromatográfiás tisztítás nélkül előállítani. Ebben a kísérletben még nagyobb mennyiségű klorofoszfit-felesleget kellett felhasználnunk, ami lépcsőzetes hidrolízist és/vagy oxidációt eredményezett. Miután a reakció teljes lejátszódását vékonyréteg-kromatográfiával ellenőriztük, a keverékhez frissen desztillált diizopropil-étert adtunk, hogy a terméket kicsapással különítsük el.
Noha mind a reakciót, mind pedig az összes egyéb műveletet argonban végeztük el, a kapott termék 31P-NMR-spektruma alapján a megfelelő oxidált foszforamiditnek (3) bizonyult, nem pedig (2)-nek. Ezenfelül a minta jelentős mennyiségben tartalmazott EtiPr2NHCl-t is, miként az 'H-NMR-spektrum kimutatta.
Kísérletek a CGX-0093901 (1) foszfonát készítésére: CGX-0093903 (4) készítése A (2) vegyület P-amidittel való sikertelen reakciója után úgy határoztunk, hogy ígéretesebb, alternatív aktív foszfitot szintetizálunk az (l)-ből, azaz a megfelelő Hfoszfonátot (4), a CGX-0093903-at (4. ábra). A foszfonátcsoport alkalmazása az amiditcsoporthoz hasonlóan szintén széles körben elterjedt az oligonukleotidszintézisek terén.
HU 221 002 Bl í
CGX-0093901
PClj, 1,2,4-triazol N-Me-morfolin, CI-^CI^ -vizes piridin Et3N*H2C(^
CGX-0093903
SiQj, kromatográfia
CGX-0093904
4. ábra
A CGX-0093903 (4) lehetséges előnyei Esetünkben a H-foszfonát (4) használata a következő indokok miatt sokkal előnyösebbnek tűnik a P-amiditnál (2):
1. A H-foszfonátot elkészíteni és kapcsolni is piridinben kell, amelyben az alapvegyület, a P-amiditkémia kedvelt oldószereivel, az acetonitrillel és a diklorometánnal ellentétben megfelelően oldódik.
2. A H-foszfonátok szintetizálásához nem szükségesek drága és érzékeny reagensek, mivel esetünkben a foszfitilációs ágenst (P-trisz-triazolidot) helyben el lehet készíteni PCl3-ból és 1,2,4-triazolból.
3. A H-foszfonát (4) szintézishez nincs szükség tiszta, IR-144-mentes (l)-re, hiszen a (4) polárisabb és lassabban mozog, mint az (1), ezért az IR-144-et könnyebben és teljesebben el lehet távolítani SiO26
HU 221 002 Bl kromatográfiával, ha az (l)-et előbb (4)-gyé alakítjuk. Ugyanakkor az IR-144 és a száraz P-amidit (2}-festék közelítőleg ugyanolyan Rrfel fut vékonyréteg-kromatográfiás rendszerekben, ezért a (2) szintetizálása előtt az (l)-et teljesen IR-144mentessé kell tenni.
4. Az öt vegyértékű P-atomot tartalmazó és a foszfitrészen egy negatív töltést hordozó H-foszfonátok sokkal jobban ellenállnak a hidrolízisnek és az oxidációnak, így jól tűrik a SiO2-kromatográfiás tisztítás körülményeit.
5. A H-foszfonátokat nemcsak alkoholokkal, hanem aminokkal is lehet kapcsolni oxidatív amidáció felhasználásával, míg a P-amidit-kémia nem alkalmas P-amidátok szintetizálására.
Ebből következően találmányunk az alábbi:
Biomolekulák azonosítására, és észlelésére alkalmas módszer, mégpedig főként olegonukleotidoké vagy DNS-láncoké, amely abból áll, hogy a szálakat megjelöljük fluoreszcens jelzéssel, majd megvilágítjuk a jelzett biomolekulákat, a fluoreszcens biomolekulákból kibocsátott fényt észleljük, olyan módon, hogy a jelzett vegyületek olyan hullámtartományokban bocsátanak ki fényt, melyek legalább egyike az infravörös tartományban vagy annak közelében van, míg a jelzett vegyület az alábbi képletben megadott kromofor csoportok egyikét tartalmazza.
A fenti képletben X jelentése: -SCN, -PO3H, -CH2OH, -COOH-csoport: a biomolekulák besugárzására szolgáló fény hullámhossza valamelyik infravörös tartományban vagy annak közelében található. Az általános képletbe tartozó vegyületeket az igénypontokban és a példákban nevezzük meg.
Találmányunk tárgya ezentúl egy előállítási eljárás, mely szerint az IR-144-t vízmentes környezetben diótokkal hozzuk reakcióba, az így kapott alkoholt (CGX-0093901) pedig PCl3-dal reagáltatjuk triazol és N-metil-morfolin jelenlétében diklór-metán-oldatban és vizes etil-amin-hidrokarbonát-oldatban.
A foszfonátvegyület (CGX0093903) összekapcsolását biomolekulákkal úgy végezzük, hogy a foszfonátvegyületet (CGX0093903) szerves bázisban feloldjuk és ehhez adjuk a biomolekulát és a pivaloil-kloridot, majd a biomolekula és a pivaloil-klorid ismételt hozzáadása után a konjugált terméket tiboxidáljuk a stabil terméket előállítva.
CGX-0093903 (4) készítése
A szakirodalomból jól ismert eljárást követve sikeresen szintetizáltuk és megtisztítottuk a kívánt H-foszfonát-festéket (4) melyet normál körülmények között stabilnak találtunk. A nukleozidanalógokkal ellentétben esetünkben a (4) nagyobbik része a vizes fázisban marad, miután a reakciókeveréket vizes Et3N+H HCO3-oldattal extraháljuk. A (4) oldékonyságának növelésére a következő kísérletben a CH2Cl2-piridin keveréket DBUHCO3--oldattal extraháltuk.
Meglepetésünkre úgy találtuk, hogy összerázás után kis idővel mindkét fázis sötétkékre színeződött. Az oldatok vékonyréteg-kromatográfiás ellenőrzése a domináns kék hidrolízistermék megjelenését, valamint ezzel egyidejűleg a zöld főtennék eltűnését mutatta ki, mindkét fázisból.
Ezen felismerés arra vezetett bennünket fel, hogy vizsgáljuk meg az (1) stabilitását a bázikus pHtartományban. Kiderült, hogy az (1) több hétig eltartható hidrolízis nélkül 0,5 M Et3N+H HCO3-oldatban (pH=8,5-9,0), azonban nem viseli el a 0,5 M DBU HCO3--oldatot, amelyben vékonyréteg-kromatográfia szerint hidrolízis következtében 2,5 óra alatt kékre színeződik. Koncentrált NH4OH-ban a teljes hidrolízishez mindössze 20 percre van szükség, míg 0,5 M NaOH-oldatban ez 10 perc alatt lezajlik. Az (1) ammóniaoldatban való rövid élettartama lehetetlenné teszi, hogy oligonukleotidot szintézisben szilárd fázisban használják fel, mivel az eljárás utolsó lépése ammonolízis, melynek eredményeképpen megszűnik az aminocsoportok védettsége.
Úgy találtuk, hogy nemcsak az (1), hanem összes származékai is (2), (3) és (4) hidrolizálnak pH=10 fölött. Ez a bomlás valószínűleg az indol rész C2-szénatomján történő nukleofiltámadás miatt áll elő, amely a szomszédos N-atom elektronhiánya miatt következik be. Ez a nem kívánatos részbeni vagy teljes bomlás akkor is lezajlik, ha a (4) kromatográfiájához nemdesztillált oldószereket használunk. Ilyenkor a bennük található bázikus szennyezések a feldolgozási lépések bepárlási szakasza után kissé feldúsulnak.
CGX—0093904 (5) készítése
A javasolt foszfonátvegyület (CGX-0093903) felhasználhatóságának szemléltetésére, valamint azért, hogy a közeli IR-en alapuló fluoreszcenciás meghatározási módszerhez történő kifejlesztéséhez standard anyagot készítsünk, a foszfonátot a 3’-O-levulinil-timidinhez kapcsoltuk.
Az elúcióhoz desztillált oldószereket használva a kék színű melléktermék egyáltalán nem képződött.
A (4) reakciókészségének bizonyítására, azt összekapcsoltuk 3’-O-levulinil-timidinnel, majd a megfelelő H-foszfonát-diésztert elemi kénnel tiooxidáltuk és így stabilis, összekapcsolt termék keletkezett, tiofoszforsavdiészter (5). Szerkezetét a *H- és 31P-NMR-spektroszkópiával azonosítottuk.
Találmányunkat az alábbi kísérleti példákkal mutatjuk be.
HU 221 002 Bl
Kísérleti rész
CGX-0093901 (1) előállítása
IR-144-et (1,00 g:0,992 mmol) 100 ml 1,3-propán-diol (97 ppm vízmennyiségre szárítva) és 5 ml trietil-amin (24 ppm vízmennyiségre szárítva) keverékében szuszpendáltuk. A keveréket tíz percig átöblítjük száraz nitrogénnel, majd 23 órán át vákuumban olajfúrdőben 110 °C-on kevertük, enyhe száraz nitrogénáram mellett. 3, 6, 19 és 23 óra eltelte után mintákat vettünk és a reakciót vékonyréteg-kromatográfiával, valamint UV-VIS-közeli IR-spektroszkópiával követtük nyomon. Az IR-144 Xmax értéke 744 nm-nél fokozatosan megnőtt 780 nm-re ezen időszak alatt, majd alapvetően ugyanekkora maradt. 23 órányi reakció után a vékonyréteg-kromatográfia még mindig jelezte, hogy a keverékben még elreagálatlan IR-144 van, azonban a termék egy idő után nem növekedett számottevően, tehát a keverék feldolgozását megkezdtük.
A keveréket szobahőmérsékletre hűtöttük, majd 500 ml hideg telített NaCl-oldatra öntöttük, miközben az elegyet kevertük. A sötét keverék 30 percig tartó ülepedése után kiszűrtük, a sötét, olajos csapadékot üvegszűrő tetején elhelyezett papírszűrő segítségével. Ezután a szilárd anyagot telített NaCl-oldattal (50 ml), vízzel (2x25 ml) és etanollal (50 ml) mostuk. A nyersterméket ekszikkátorban P2O5 fölött vákuumban szárítjuk két napig. A termék 1,17 g sötét por volt, mely még mindig tartalmazott szervetlen maradékot és reakcióba nem lépett IR-144-t.
A nyerstermékből 100 mg-ot feloldottunk 6 ml metanolban és megtisztítottuk Kieselgel 60-nal (0,063-0,2 mm) 140 g adszorbens és lineárgradiens módszer kloroform:metanol 9:1; kloroform:metanol 2:1 (800-800 ml) alkalmazásával, majd ez utóbbi eluensből 1200 ml-t használtunk. 700 ml párlatot kaptunk a jellegzetesen zöld elúcióból, mellyel ellentétben a reakcióba nem lépett IR-144 sötétkék oldatot eredményezett.
I. frakció: 51 mg (<60 pmol, 71%) terméket kaptunk, melyben körülbelül 10% IR-144 volt a Ή-NMR szerint, melyet ismételt kromatográfiával tisztítottunk meg.
II. frakció: a kapott terméket 18 mg (21 pmol, 25%) elemeztük MS-, IR-, Ή- és 13C-NMR-spektroszkópiával.
Ή-NMR (DMSO-dft) σ (ppm): 1,93 (12 H, 2s, CH3);
2,05-2,15 (6H, m, β CH2+bCH2); 2,65 (4H, m, yCH2); 2,87 (4H. s. cp CH2); 3,78 (2H, q, c CH2); 4,40 (4H, t, α CH2); 4,65 (2H, t, a CH2); 6,16 (2H, d, 10H); 7,96 (2H, d, 20H): 7,4-8,25 (14-2=12H, m aromás protonok) MS-, IR- és 13C-NMRmérések szintén az adott szerkezetet valószínűsítették.
További származékok készítéséhez szintén fel lehet használni a CGX-0093901 (1) nyers vagy egyszer kromatografált fajtáját, mivel az IR-144 reakcióba nem lépett része a további szintézislépésekben sem reagál.
CGX-0093901 (1) 2-cianoetil-N,N-diizopropilfoszforamidit szintetizálása: CGX-0093902 (2) előállítása
Foszfitilációs reakció 2-cianoetil-N,N,N’,N’~ tetraizopropil-foszforodiamidittel mg (13 pmol) CGX-0093901-et és ekvimolekuláris mennyiségű diizopropil-ammónium-tetrazolidot oldottunk fel 1,5 ml száraz DMF-ben, majd 30 pl (90 pmol)
2-ciano-etil-N,N,N’,N’-tetraizopropil-foszforodiamiditet adtunk hozzá. A keveréket szobahőmérsékleten, inért atmoszférában kevertettük, majd vékonyréteg-kromatográfiával ellenőriztük (kloroform:metanol 2:1). 48 óra elteltével sem tudtuk észlelni valamilyen új termék keletkezését.
Foszfitilációs reakciók 2-cianoetil-N,N-diizopropilklór-foszforamidittel mg (60 pmol) CGX-0093901-et feloldottunk 5 ml száraz piridinben (víz 30 ppm) majd szárazra pároltuk. A maradékot feloldottuk 3 ml piridinben, majd 41 pl (240 pmol) diizopropil-etil-amint és néhány szem molekulaszitát adtunk hozzá (Merck, 3A). Ezután a keveréket 10 percig kevertük, majd inért atmoszférában 20 pl (90 pmol) 2-ciano-etil-N,N-diizopropil-klorofoszforamiditet adtunk hozzá, majd a kivett mintákat vékonyrétegkromatográfiával (kloroform:metanol 2:1) vizsgáltuk. 90 perc elteltével a CGX-0093901 okozta folt Rf :0,43on eltűnt és a keverékben egy kissé magasabb értékű (Rf :0,47) új termék vált dominánssá. 2 óra elteltével 12 ml diklór-metánt adtunk hozzá, majd a keveréket telített nátrium-karbonát-oldattal kezeltük. A fázisok elkülönítése 48 óra alatt ment végbe elkülönítőtölcsérben. A szerves fázist elkülönítettük és vízmentes nátrium-szulfáton megszárítottuk, majd bepároltuk, így sötét, szilárd anyagot kaptunk.
A nyerstermék 70 mg volt, az amidát és a CGX-0093901 (1) közti kötést pedig 31P-NMR-spektroszkópiával jellemeztük.
31P-NMR (DMSO-dg) σ ppm-ben (a termék relatív %-ában, a becsült értékben): 9 és 10 (11%) oxidált foszforamidát-termék(CGX-0093910); 15,1 (53%) hidrolízistermék a reagensből; 147,6 és 148,3 (36% CGX-0093902, várt termék)
CGX—0093902 (2) tisztítása kromografikus eljárás segítségével
A CGX-0093902 amiditreakcióból kromatográfiás elválasztásához az alábbi kísérletet végeztük el: 152 mg (180 pmol) CGX-0093901-et léptettünk rekacióba 3,0 ekvivalens klóramidittel. A reakció vékonyréteg-kromatográfiával történő megfigyelése során a reagensfelesleget 0,3 ml metanol hozzáadásával szüntettük meg. A keveréket kloroform:piridin elegyben (98:2) oldottuk fel, majd Kieselgel-oszlopon szétválasztottuk, amelyet előzőleg argonnal átöblítettünk. Ezután az oszlopot először lemostuk kloroform:metanol lineáris gradiensével 85:15, majd kloroform: metanol (66:33), 1000-1000 ml, majd tovább eluáltuk az utóbbi keverékkel. A sötét, zöld frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával analizáltuk, majd összegyűjtöttük és bepárologtattuk. A száraz, szilárd anyagot vákuumban P2O5 fölött szárítottuk, 179 mg sötét termék keletkezett. A 31P-NMR (DMSO-dg-ban) kimutatta, hogy a termék nem tartalmaz foszforatomot, a teljes defoszforizáció megtörtént.
HU 221 002 Bl
CGX-0093902 (2) tisztítása kristályosítással mg (106 pmol) tiszta CGX-0093901 felhasználásával megismételtük a foszforamidit-szintézist. A kapott reakcióelegyből eltávolítottuk az alkoholt 2 χ 25 ml száraz piridin kidesztillálásával, majd a kapott maradékot feloldottuk 5 ml piridinben, amihez diizopropiletil-amint (73 mg, 240 pmol), majd 47 pl (212 pmol) 2-ciano-etil-N,N-diizopropil-klór-foszforamiditet adtunk. Másfél óra után további 1,5 egyenértékű klór-amiditot adtunk a keverékhez. A reakciót vékonyréteg-kromatográfiával követtük. A reakció 3,5 óra alatt zajlott le és a keverékhez argon alatt cseppenként 30 ml diizopropilétert adtunk (melyet frissen desztilláltunk LiAlH4-ről). A sötét üledéket argonatmoszférában kiszűrtük és diizopropil-éterrel mostuk. A kapott terméket vákuumban P2O5 fölött szárítottuk, ami 72,5 mg sötét terméket eredményezett, melyet NMR-spektroszkópiával azonosítottunk.
Az Ή-NMR alifatikus maradékot mutatott ki az oldószerben és a diizopropil-etil-ammónium-kloridban.
A 31P-NMR (DMSO-d6-ban) egy csúcs (σ=10,52 ppm) kimutatta, hogy a termék nem tartalmaz három vegyértékű foszforatomot, tehát a teljes termék oxidálódott foszforamidátszármazékká.
CGX-0093903 (4) szintézise (CGX-0093901-Hfoszfonát)
Frissen elkészítettük a következő keveréket:
228 mg (3,3 mmol) 1,2,4-triazolt feloldottunk Nmetil-morfolin (1,09 ml=10 mmol) és száraz diklór-metán (12 ml) keverékében, az elegyet erőteljesen kevertük 20 °C-on 10 percen keresztül, majd 87 pl (1 mmol) desztillált PCl3-at adtunk hozzá, és a keveréket további 30 percen át szobahőmérsékleten kevertük.
82,4 mg (100 pmol) CGX-0093901-et, mely 20% IR-144-et tartalmazott, oldottunk fel száraz piridinben (5 ml) majd a metanolnyomok eltávolítása érdekében bepároltuk. A maradékot 3,5 ml száraz piridinbe helyeztük, majd cseppenként +2-+4 °C-on jégfördő által hűtött acilezőkeverékbe csepegtettük, melynek elkészítését az előző bekezdésben ismertettük. A reakciót vékonyréteg-kromatográfiával követtük (kloroform :metanol=3:2) és az 10 perc alatt teljesen lezajlott. A foszfonát Rrértéke 0,17, a kiindulási anyag Rr értéke pedig 0,48 volt. Az IR-144 és az egyéb apoláris szennyeződések változatlanul maradtak.
A keveréket hideg 1M trietil-ammónium-hidrogénkarbonát-oldattal (12 ml) extraháltuk pH 8,5-9,0 értéken. Az extrakciós fázisok elkülönítése 3 órát vett igénybe, és mivel a vizes rétegben több termék volt, mint a szerves rétegben, mindkét oldatot szárazra pároltuk és Kieselgelen kromatografáltuk. Az összegyűjtött maradékokat (0,26 g) 3 ml metanolba helyeztük és 600 ml kloroform: metanol=8:2 felhasználásával eluáltuk lineáris gradiens módszerrel folytatva 600 ml kloroform: metanol 1:1 eleggyel, majd ez utóbbival tovább eluáltuk (800 ml). Összegyűjtöttük és szárazra pároltuk a megfelelő frakciókat. A sötétzöld szilárd anyagot exszikkátorban szárítottuk P2O5 fölött vákuumban.
A terméket: [28,5 mg (27,2 pmol)] Ή és 31P-NMR-spektroszkópiával azonosítottuk.
Eredmények:
Ή-NMR (DMSO-d6) σ (ppm): 1,93 (12 H, 2s, CH3):
2,10 (4H, m, β CH2): 2,18 (2H, m, bCH2); 2,68 (4H, m, yCH2): 2,86 (4H, s, cp CH2); 4,05 (2H, q, c
CH2): 4,45 (4H, t, α CH2): 4,66 (2H, t, aCH2); 5,98 (0,5H, s, P-H); 6,18 (2H, d, 10H); 7,6-7,7 (0,5 H, s
P-H): 7,96 (2H, d 20H); 7,2-8,65 (20,5-2,5=18H, m, aromás protonok) 31P-NMR (DMSO-d6): σ 1,22 ppm
CGX-0093903 (4) kapcsolása 3 ’-O-levuliniltimidinnel: eljárás CGX-0093904 (5) előállítására 14 mg (13,3 pmol) CGX-0093903-at feloldottunk száraz piridinben (6 ml), majd szárazra pároltuk. 6 mg (17,3 pmol) 3’-O-levulinil-timidint adtunk hozzá, majd a keveréket kevergetés közben száraz piridinben (4 ml) oldottuk. A teljes oldódás után 6,5 pl (53 pmol) frissen desztillált pivaloil-kloridot adtunk hozzá, majd a keveréket szobahőmérsékleten kevertük. 30 perc elteltével 8 mg (23 pmol) 3’-O-levulinil-timidint és 15 pl (122 pmol) frissen desztillált pivaloil-kloridot adtunk hozzá, így az átalakulást teljessé tettük. 1 óra elteltével 1 ml szén-diszulfidot és 16 mg (0,5 mmol) porított ként adtunk az elegyhez. Mivel a tiooxidáció lassabban zajlott, mint általában, 2 óra elteltével újabb 15 mg ként adtunk hozzá, és az elegyet egész éjszakán át kevertük.
Újabb 0,5 ml metanol hozzáadása után a keveréket megszűrtük, majd 70 g Kieselgelből készült oszlopra helyeztük. Lineáris gradiens módszerrel eluáltuk az oldatot először 400 ml kloroform:metanol 8:2, majd 400 ml kloroform:metanol 2:1 elegy felhasználásával, majd az utóbbi eluens további 150 ml-ével fejeztük be az eluálást. Ezután a frakciókat összegyűjtöttük és bepároltuk, majd P2O5 fölött vákuumban megszárítottuk. A tiszta tennék: 1,5 mg (1,07 pmol); melyet Ή- és 31P-NMR-spektroszkópiával azonosítottuk.
Ή-NMR (CDjOD) σ (ppm): 1,92 (3H, d, 5CH3); 1,97 (12H, s, dCH3); 2,00 (3H, d, 1 CH3); 2,25-2,35 (8H, m, βεΗ2+δ CH2+2’CH2; 2,42-2,72 (4H, m, 1
CH2); 2,88 (4H, s, cp CH2); 3,02 (4H, t, γ CH2);
4,13-4,37 (5H, m, c CH2+5’CH2+H4’); 4,41 (4H, t, α CH2); 4,75 (2H, t, aCH2); 5,35 (1H, m, H3’); 6,06 (2H, d, 10H); 6,28 (1H, q, Hl’); 8,22 (2H, d, 20H); 8,5 (1H, s, H6); 7,38-8,00 (24H, m, aromás protonok)
31P-NMR (CD3OD): σ 58,15 ppm
Claims (4)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás biomolekulák, előnyösen olegonukleotidok vagy DNS-láncok azonosítására és kimutatására, melybe beletartozik az alkotóelemek megjelölése fluoreszcens jelzéssel, a biomolekulák besugárzása és a fluoreszcens biomolekulákból kibocsátott fény érzékelése, azzal jellemezve, hogy a jelzett vegyületek olyan hullámtartományokban bocsátanak ki fényt, amelyek legalább egyike az infravörös tartományban vagy annak közelében van, és egyúttal a jelzett vegyület az alábbi (I) képletben bemutatott kromofor csoportot tartalmazza :HU 221 002 Bl ahol a képletben X jelentése : SCN, PO3H, CH2OH, COOH csoportok valamelyike, továbbá ahol n=0,1, 2, 20 3... egész számok valamelyike, és a biomolekulák megvilágítására szolgáló fény hullámhossza valamelyik infravörös tartományban vagy annak közelében található.
- 2. Az 1. igénypontban definiált (I) általános képletű csoportot tartalmazó vegyületek.
- 3. A 2. igénypontban definiált vegyületek előállítási eljárása, azzal jellemezve, hogy az IR-144-et vízmentes közegben diótokkal reagáltatjuk, majd a kapott alkoholt, (CGX-0093901)-et előnyösen PCl3-dal triazol ésN-Me-morfolin jelenlétében diklór-metán-oldatban és vizes etil-amin-hidrokarbonát-oldatban reagáltatjuk.
- 4. Eljárás foszfonát (CGX0093903) biomolekulákkal való összekapcsolására, azzal jellemezve, hogy a foszfonát (CGX0093903)-vegyületet szerves bázisban feloldjuk, az oldathoz biomolekulát adunk, majd az ele25 gyet pivaloil-kloriddal kezeljük, majd az ismételt biomolekula- és pivaloil-klorid-adagolás révén kapott konjugált terméket tiooxidációnak vetjük alá, a kívánt stabil végtermék előállítására.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9801027A HU221002B1 (hu) | 1998-05-05 | 1998-05-05 | Új lézerfestékek, eljárás azok előállítására és alkalmazására |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9801027A HU221002B1 (hu) | 1998-05-05 | 1998-05-05 | Új lézerfestékek, eljárás azok előállítására és alkalmazására |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9801027D0 HU9801027D0 (en) | 1998-06-29 |
| HUP9801027A1 HUP9801027A1 (hu) | 1999-11-29 |
| HU221002B1 true HU221002B1 (hu) | 2002-07-29 |
Family
ID=89996513
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9801027A HU221002B1 (hu) | 1998-05-05 | 1998-05-05 | Új lézerfestékek, eljárás azok előállítására és alkalmazására |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU221002B1 (hu) |
-
1998
- 1998-05-05 HU HU9801027A patent/HU221002B1/hu not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU9801027D0 (en) | 1998-06-29 |
| HUP9801027A1 (hu) | 1999-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0180492B1 (fr) | Complexes macropolycycliques de terres rares-et application à titre de marqueurs fluorescents | |
| US7795423B2 (en) | Polynucleotide labeling reagent | |
| Haralambidis et al. | Preparation of base-modified nucleosides suitable for non-radioactive label attachment and their incorporation into synthetic oligodeoxyribonucleotides | |
| EP0241363B1 (fr) | Dérivés de nucléosides et leur utilisation pour la synthèse d'oligonucléotides | |
| US6287780B1 (en) | Compounds for mass spectrometry comprising nucleic acid bases and aryl ether mass markers | |
| US6288221B1 (en) | Methods of synthesis of halogen base-modified oligonucleotides and subsequent labeling with a metal-catalyzed reaction | |
| EP2734518B1 (fr) | Agents complexants et complexes de lanthanide correspondants | |
| EP1151350A1 (en) | Protecting groups with increased photosensitivities | |
| WO2006087459A2 (fr) | Dipyrromethenes-bore borocarbones insatures | |
| BG61484B1 (bg) | 3'-(2')-амино-и тиолмодифицирани, свързани с флуоресциращо багрило нуклеозиди,нуклеотиди и олигонуклеотиди и метод за тяхното получаване и приложението им | |
| CN103649102A (zh) | 包含二芳基硫化物骨架的对光不稳定的保护基团 | |
| CN101631796B (zh) | 具有由单核苷或单核苷酸衍生的结构的化合物、核酸、标记物以及核酸检测方法和试剂盒 | |
| JP2009186350A (ja) | リン酸イオンの検出方法および検出用キット | |
| EP0422090B1 (fr) | Derives de nucleosides utilisables pour la synthese d'oligonucleotides marques, oligonucleotides obtenus a partir de ces derives et leur synthese | |
| EP0304215A2 (en) | Phosphorylating reagents and method of using the same | |
| WO2013126034A1 (en) | Synthesis of high purity dmt-c3-disulfide phosphoramidite | |
| Coppola et al. | On the compatibility of azides in phosphoramidite‐based couplings: Synthesis of a novel, convertible azido‐functionalized CyPLOS analogue | |
| HU221002B1 (hu) | Új lézerfestékek, eljárás azok előállítására és alkalmazására | |
| EP2758391B1 (fr) | Sondes luminescentes pour le marquage biologique et l'imagerie, et leur procédé de préparation. | |
| EP2820003B1 (fr) | Derives du diaminophenothiazinium pour le marquage de biomolecules, procede et support de marquage d'oligonucleotides et oligonucleotides obtenus | |
| La Clair | Synthesis of a New Class of Solvent‐Sensitive Fluorescent Labels | |
| EP1308452B1 (en) | Oligonucleotide labeling reactants based on acyclonucleosides and conjugates derived thereof | |
| JPS60500817A (ja) | ヌクレオシド・ホスホルアミダイト中間体の製造方法 | |
| US20040116680A1 (en) | Photolabile protective groups for the synthesis of biopolymers | |
| Wojczewski et al. | Synthesis of 3′‐Thioamido‐Modified 3′‐Deoxythymidine 5′‐Triphosphates by Regioselective Thionation and Their Use as Chain Terminators in DNA Sequencing |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |