JPS6330317B2

JPS6330317B2 -

Info

Publication number: JPS6330317B2
Application number: JP59501995A
Authority: JP
Inventors: Saaji Roorento Byuukeeji
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1983-06-01
Filing date: 1984-05-14
Publication date: 1988-06-17
Also published as: DE3479662D1; EP0144386B1; JPS60500817A; WO1984004749A1; EP0144386A1

Description

請求の範囲１次式で表される亜リン酸塩化剤：と、弱酸および次式で表わされる保護されたヌ
クレオシド：とを溶媒中で反応させることから成ることを特徴
とする、次式で表されるヌクレオシド・ホスホル
アミダイト中間体の製造方法：但し、上式におけるＸはリン酸保護基である；各Ｙは第二アミノ基R₁―Ｎ―R₂ （但し、 (a) R₁とR₂の各々は、別々にとつたとき、炭素
原子10個までを含むアルキル、ハロアルキル、
アルケニル、ハロアルケニル、アラルキル、ハ
ロアラルキル、シクロアルキル、ハロシクロア
ルキル、シクロアルキルアルキル、ハロシクロ
アルキルアルキル、シクロアルケニル、ハロシ
クロアルケニル、を表わし、各ハロゲン置換は
窒素原子から除去された少なくとも３つの炭素
原子であり、各不飽和は窒素原子から除去され
た少なくともC₂〜C₃結合である； (b) R₁とR₂は、一緒にとつたとき、主鎖に炭素
原子５個までを含むアルキレン、ハロアルキレ
ン、アルケニレン、およびハロアルケニレン連
鎖からなる群から選んだ連鎖を形成し、該連鎖
の両末端原子価結合と共に合計10個までの炭素
原子が、R₁およびR₂に結合される前記窒素原
子に結合され、各ハロゲン置換原子は窒素原子
から除去された少なくとも３個の炭素原子であ
り、各不飽和は窒素原子から除去された少なく
ともC₂〜C₃結合である； (c) R₁とR₂は、結合される前記窒素原子と一緒
にとつたとき、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群か
ら選んだ少なくとも１個の追加ヘテロ原子を含
む飽和窒素複素環を形成する）であり；Ｚはヒドロキシ保護基である；前記弱酸は前記第二アミノ基の１つのアミンだ
けを選択的に保護することができる；各Ａは―Ｈ、―OH、および―OZからなる群
から選ぶ；Ｂは天然および非天然のプリンおよびピリミジ
ン塩基からなる群から選ぶ；Ｇは複素環塩基保護基である；各Ｄは―Ｈおよび―OZからなる群から選ぶ；Ｅは―OHおよび―OZからなる群から選ぶ、
但し(a)両方のAsが同一で、かつ―Ｈまたは―
OZ、従つてＥが―OHであるとき、および(b)両
方のAsが同一で、かつ―OH、従つてＥが―OZ
であるとき；ｎは０〜２の数である；ｒ、ｓおよびｔはそれぞれ０または１、但しｒ
＋ｓ＋ｔ＝２；前記溶媒は(a)、およびを可溶化し、(b)前
記反応を進行させることができる；そしては反応性のモル濃度に少なくとも等しいモ
ル濃度で存在する。２が反応性より高モル濃度で存在し；が
のモル濃度の少なくとも２倍のモル濃度で存在
することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の
方法。３がのモル濃度の約２〜約５倍のモル濃度
で存在することを特徴とする請求の範囲第２項に
記載の方法。４：反応性のモル比が約1.2：１であり、：１のモル比が約４：１であることを特徴
とする請求の範囲第３項に記載の方法。５前記弱酸がH₂O中約25℃において約7.5〜約
11のpKを有することを特徴とする請求の範囲第
１項に記載の方法。６前記弱酸のpKが約８〜約10.5であることを
特徴とする請求の範囲第５項に記載の方法。７前記弱酸のpKが約８〜約９であることを特
徴とする請求の範囲第６項に記載の方法。８前記弱酸のpKが約8.2〜約8.5であることを特
徴とする請求の範囲第７項に記載の方法。９前記弱酸はH₂O中25℃において約7.5〜約11
のpKを有する；前記溶媒はテトラメチル尿素、Ｎ，Ｎ―ジメチ
ルアセトアミド、１―メチル―２―ピロリジノ
ン、Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド、ジオキサ
ン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、クロロホ
ルム、１，３―ジメチル―２―イミダゾリジノ
ン、Ｎ，N′―ジメチル―Ｎ，N′―プロピレン尿
素、それらの同族体および類似体、およびそれら
の混合体からなる群から選ぶ；は反応性より高いモル濃度で存在する；そしてはのモル濃度の少なくとも２倍のモル濃度
で存在することを特徴とする請求の範囲第１項に
記載の方法。１０各Ｙはジメチルアミン、ジエチルアミン、
ジイソプロピルアミン、ジプチルアミン、メチル
プロピルアミン、メチルヘキシルアミン、メチル
シクロプロピルアミン、エチルシクロヘキシルア
ミン、メチルベンジルアミン、メチルシクロヘキ
シルメチルアミン、ブチルシクロヘキシルアミ
ン、モルホリン、チオモルホリン、ピロリジン、
ピペリジン、および２，６―ジメチルピペリジン
からなる群から選び；前記酸のpKが約８〜約10.5であり；がのモル濃度の約２〜約５倍のモル濃度で
存在することる特徴とする請求の範囲第１項に記
載の方法。１１前記弱酸のpKが約８〜約９であることを
特徴とする請求の範囲第１０項に記載の方法。１２前記弱酸のpKが約8.2〜約8.5であることる
特徴とする請求の範囲第１１項に記載の方法。１３前記弱酸は１，２，４―トリアゾール；
１，２，３―トリアゾール；４，５―ジクロロイ
ミダゾール；４―ニトロイミダゾール；３―クロ
ロトリアゾール；ベンゾトリアゾール；およびそ
れらの混合体からなる群から選ぶことを特徴とす
る請求の範囲第１２項に記載の方法。１４前記弱酸は４，５―ジクロロイミダゾー
ル、ベンゾトリアゾールおよびこれらの混合体か
らなる群から選ぶことを特徴とする請求の範囲第
１３項に記載の方法。１５前記弱酸が４，５―ジクロロイミダゾール
であり；前記溶媒がテトラメチル尿素、１，３―ジメチ
ル―２―イミダゾリジノン、１―メチル―２―ピ
ロリジノン、およびこれらの混合体からなる群か
ら選び；：反応性のモル比が約1.2：１であり；：のモル比が約４：１であることを特徴と
する請求の範囲第６項に記載の方法。１６亜リン酸塩化剤を弱酸と反応させて中間体
組成物を生成し、該中間組成物は次に被保護ヌク
レオシドと反応させる特許請求の範囲第１項記載
の方法。１７亜リン酸塩化剤を弱酸および被保護ヌクレ
オシドと実質的に同時に反応させる特許請求の範
囲第１項記載の方法。１８亜リン酸塩化剤を弱酸および被保護ヌクレ
オシドと実質的に環境温度において反応させる特
許請求の範囲第１項記載の方法。１９ R₁とR₂の各々は、別々にとつたとき、炭
素原子10個までを含むアルキル、ハロアルキル、
アルケニル、ハロアルケニル、アラルキル、ハロ
アラルキル、シクロアルキル、ハロシクロアルキ
ル、シクロアルキルアルキル、ハロシクロアルキ
ルアルキル、シクロアルケニル、ハロシクロアル
ケニル、を表わし、各ハロゲン置換は窒素原子か
ら除去された少なくとも３つの炭素原子であり、
各不飽和は窒素原子から除去された少なくとも
C₂〜C₃結合である特許請求の範囲第１項記載の
方法。２０ R₁とR₂は、一緒にとつたとき、主鎖に炭
素原子５個までを含むアルキレン、ハロアルキレ
ン、アルケニレン、およびハロアルケニレン連鎖
からなる群から選んだ連鎖を形成し、該連鎖の両
末端原子価結合と共に合計10個までの炭素原子
が、R₁およびR₂に結合される前記窒素原子に結
合され、各ハロゲン置換原子は窒素原子から除去
された少なくとも３個の炭素原子であり、各不飽
和は窒素原子から除去された少なくともC₂〜C₃
結合である特許請求の範囲第１項記載の方法。２１ R₁とR₂は、結合される前記窒素原子と一
緒にとつたとき、Ｎ、Ｏ、およびＳからなる群か
ら選んだ少なくとも１個の追加ヘテロ原子を含む
飽和窒素複素環を形成する特許請求の範囲第１項
記載の方法。技術分野この発明は、ヌクレオシド・ホスホルアミダイ
ト（nucleoside phosphoramidite）中間体に関
する。背景技術オリゴヌクレオチド合成における最近の主な技
術革新は、Letsingerら^(1〜3)による亜リン酸塩結
合法の導入であつた。この方法は、デオキシオリ
ゴヌクレオチド^(4〜8)、オリゴリボヌクレオチド^(9〜
^１２）、および核酸類似体^(13〜15)の合成に採用されて
きた。一般に、その方法は適当な被保護ヌクレオ
シド、メトキシジクロロホスフインのような二官
能性亜リン酸塩化剤、および第２の被保護ヌクレ
オシドの反応を含む。テトラヒドロフラン中のヨ
ウ素、ルチジンおよび水を使用したおだやかな酸
化が自然のヌクレオチド間の結合を生成する。酸
化過程を変えることによつて、セレノリン酸塩⁽¹⁴
^）、イミドリン酸塩⁽¹⁴⁾およびチオリン酸塩⁽¹⁴、¹⁵⁾
のようなリン類似体を生成することができる。し
かしながら、この方法の重大な制約は、反応性の
中間体（ヌクレオシド・ホスホモノクロリダイト
またはモノテトラアゾリド）が不安定で加水分解
および空気酸化する傾向にあることであつた。こ
の問題は、反応性の物質を使用直前に調製する
か、または反応性亜リン酸塩を−20℃でヘキサン
中の沈殿物として貯蔵することによつて回避され
た。新しい類のヌクレオシド亜リン酸塩の合成が、
この問題を解決するための試みとして提案され
た。⁽¹⁶⁾これらの中間体は次式を有する⁽¹⁶、¹⁷⁾：上式におけるＸはリン酸塩保護基；Ｙはある種
の第二アミノ基；Ｚはヒドロキシ保護基；Ａは―
Ｈ、―OH、および―OZからなる群から選ぶ；
そしてＢはプリンおよびピリミジン塩基からなる
群から選ぶ。さらに詳しくは、Ｙは飽和第二アミノ基、即ち
第二アミノ基に二重結合が存在しないものであ
る。さらに詳しく言うならば、ＹはNR₁R₂であ
つて、R₁およびR₂は別々にとるとそれぞれ炭素
原子10個までを含むアルキル、アラルキル、シク
ロアルキルおよびシクロアルキルアルキルを表わ
し；R₁とR₂は一緒にとると主鎖に炭素原子５個
までを含むアルキレン連鎖を形成し、全体で10個
までの炭素原子と前記連鎖の両末端原子価結合が
窒素原子に結合され、それにR₁とR₂が結合され
ている；そしてR₁とR₂は、それらが結合される
窒素原子と共にとるときは、窒素、酸素および硫
黄からなる群から少なくとも１つの追加ヘテロ原
子を含む飽和窒素複素環を形成する。 NR₁R₂基を誘導することができるアミンは、
ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジイソプロピ
ルアミン、ジブチルアミン、メチルプロピルアミ
ン、メチルヘキシルアミン、メチルシクロプロピ
ルアミン、エチルシクロヘキシルアミン、メチル
ベンジルアミン、メチルシクロヘキシルメチルア
ミン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルホリ
ン、チオモルホリン、ピロリジン、ピペリジン、
２，６―ジメチルピペリジン、ピペラジンおよび
類似の飽和単環式窒素複素環のような種々の飽和
第二アミンを含む。前記の式においてＢで表わされるリボヌクレオ
シドおよびデオキシヌクレオシド塩基は周知であ
つて、プリン誘導体（例えば、アデニン、ハイポ
キサンチンおよびグアニン）、およびピリミジン
誘導体（例えば、シトシン、ウラシルおよびチミ
ン）を含む。前記の式においてＺで表わされる保護基はトリ
チル、メトキシトリチル、ジメトキシトリチル、
ジアルキル亜リン酸塩、ピバリル、イソブチルオ
キシカルボニル、ｔ―ブチル、ジメチルシリル、
および類似の保護基を含む。Ｘで表わされるリン酸塩保護基は、限定ではな
いが、約10個までの炭素原子を含むアルキル、ア
ルケニル、アリール、アラルキル、およびシクロ
アルキルを含む種々のヒドロカルビル基を含む。
代表的なラジカルはメチル、ブチル、ヘキシル、
フエネチル、ベンジル、シクロヘキシル、フエニ
ル、ナフチル、アリルおよびシクロブチルであ
る。これらの中で、低級アルキル、特にメチルお
よびエチルが望ましい。これらの化合物は、反応性ではなく、かつ先行
技術の化合物のように不安定でないと報告され
た。これらの化合物は普通の条件下でヌクレオシ
ドの保護されていない3′―OHまたは5′―OHと容
易に反応することが注目された。さらに、これら
のホスホルアミダイトは普通の研究室の条件下で
加水分解および空気酸化に対して安定であつて、
乾燥、安定粉末として貯蔵できると言われた。最近、アセトニトリル溶液におけるこれらヌク
レオシド・ホスホルアミダイトの安定性が問題に
なつてきた⁽¹⁸、¹⁹⁾。さらに、これらのヌクレオシ
ド・ホスホルアミダイトの入手は、それらの単離
が容易でなく時間がかかるので、困難であること
が指摘されてきた⁽²⁰、²¹⁾。その上、それらの価格
が高くて寄りつけないことが、それらの使用を主
に熟練した人に限定させている。これらの欠点を緩和するために、亜リン酸塩化
学を用いたデオキシヌクレオチド（DNA）固態
合成に対する２、３の方法が提案された⁽²⁰、²¹⁾。
これらの方法の主な特徴は、メトキシジクロロホ
スフインまたはビス―（テトラゾリル）メトキシ
ホスフインのような二官能性亜リン酸塩化剤で固
体支持体を亜リン酸塩化することを含む。しかし
ながらDNA合成に対するこれらの方法は、少量
の水分が連鎖伸長工程前または中に固体支持体上
に固定された極めて反応性のリン部分を加水分解
するため、再現性の問題が起る傾向にあると思わ
れる。他の問題は、吸湿性アミン塩酸塩の除去、およ
びデオキシヌクレオシド・ホスホルアミダイトの
調製中に生成された複素環リングの有害な亜リン
酸塩化を破壊するのに必要な問題となる水性仕上
げ⁽¹⁶⁾；低温ヘキサン（−70℃）中において前記
デオキシヌクレオシド・ホスホルアミダイトのト
ルエンまたは酢酸エチル溶液の沈殿からなる難し
い単離工程⁽¹⁶⁾；これらのデオキシヌクレオシ
ド・ホスホルアミダイトをアセトニトリル溶液に
長期間保存することによつて生じる安定性の問
題；および取扱いが困難で大気中の水分に極めて
敏感であるクロロ―（Ｎ，Ｎ―ジメチルアミノ）
メトキシホスフイン⁽¹⁶⁾、クロロ―（Ｎ，Ｎ―ジ
イソプロピルアミノ）メトキシホスフイン⁽¹⁸⁾、
メトキシジクロロホスフイン⁽²⁰、²¹⁾、ビス―（テ
トラゾリル）メトキシホスフイン⁽²¹⁾のような自
然性および／または反応性の亜リン酸塩化剤の使
用を含む。従つて、単純化された製造方法の提供が切望さ
れている。発明の開示本発明により、自動化が容易にできると共に、
手動の固相デオキシヌクレオチド（DNA）およ
び／またはリボヌクレオチド（RNA）合成が望
ましい場合には、非化学者によつて用いることが
容易な単純化された方法が提供される。さらに詳
しくは、本発明は、対応する天然および非天然の
ヌクレオシドから元の位置にデオキシヌクレオシ
ドおよびリボヌクレオシド・ホスホルアミダイト
中間体を調製する便利な方法を包含する。この方
法で調製されたヌクレオシド・ホスホルアミダイ
ト中間体は適当な作用物質で活性化することがで
きる、そして活性化されたヌクレオシド・ホスホ
ルアミダイト中間体は適当に保護されたヌクレオ
シドとの共役反応中に過剰に使用することがで
き、従つて溶媒および周囲の環境からの微量の水
分に対する望ましい競争を保証する。本発明の一実施態様におけるヌクレオシド・ホ
スホルアミダイト中間体は、次式で表わされる化
学反応によつて調製される：本発明のもう１つの実施態様におけるヌクレオ
シド・ホスホルアミダイト中間体は次式で表わさ
れる化学反応によつて調製される：上記化学反応式の両方において、Ｘはリン酸塩
保護基；各Ｙは第二アミノ基；Ｚはヒドロキシ保
護基；弱酸は第二アミノ基の１個のアミンのみを
選択的にプロトン化できるもの；各Ａは―Ｈ、―
OHおよび―OZからなる群から選択される；Ｂ
は天然および非天然プリンおよびピリミジン塩基
からなる群から選択される；Ｇは複素環塩素保護
基；各Ｄは―Ｈおよび―OZからなる群から選択
される；Ｅは―OHおよび―OZからなる群から
選ぶ（但し(a)両方のA_Sが同一で―Ｈまたは―OZ
であり、Ｅが―OHのとき、および(b)両方のA_Sと
Ｅが全て同時に等しくないとき）；ｎは０〜２の
数；ｒ、ｓ、およびｔはそれぞれ０または１（但
し、ｒ＋ｓ＋ｔ＝２）；溶媒は(a)、および
を可溶化し、(b)反応を進行さすことができるも
の；そしては反応性物質のモル濃度に少なく
とも等しいモル濃度で存在する（即ち、の若干
量は反応媒質中の水分または他の汚染物質によつ
て破壊されうる、そしてかく損失された部分はこ
の比には含まれない）。また、次式（式中のＸはメチルである）を有す
る新規の化合物も本発明の範囲内に含まれる：発明を実施するための最良の形態Ｘは実質的に全てのリン酸塩保護基が可能であ
る。多くのリン酸塩保護基が当業者には知られて
いる^(31〜39)。Ｘは炭素原子10個までを含むアルキ
ル、ハロアルキル、シアノアルキル、アルキルジ
アリールシリルアルキル、トリアルキルシリルア
ルキル、アリールスルホニルアルキル、アルキル
チオアルキル、アリールチオアルキル、アルケニ
ル、ハロアルケニル、アリール、ハロアリール、
アラルキル、ハロアラルキル、シクロアルキル、
ハロシクロアルキル、有枝アルキル、および有枝
ハロアルキルからなる群から選ぶことが望まし
い。Ｘがメチルであることが最も望ましい。各Ｙは

【式】が望ましい、ここでそれぞれのR₁とR₂は、別々にとつた場合には、炭素
原子10個までを含むアルキル、ハロアルキル、ア
ルケニル、アラルキル、ハロアラルキル、シクロ
アルキル、ハロシクロアルキル、シクロアルキル
アルキル、ハロシクロアルキルアルキル、シクロ
アルケニリル、ハロシクロアルケニリルを表わ
す、ここで各ハロゲン置換は窒素原子から除去さ
れた少なくとも３個の炭素原子であり、各不飽和
は窒素原子から除去された少なくともC₂―C₃結
合である（即ち、ハロゲン置換および／または不
飽和はアミノ官能性の塩基性度を余り低下させて
はならない）；R₁およびR₂は、一緒にとつたとき
には、主鎖に炭素原子５個までを含むアルキレ
ン、ハロアルキレン、アルケニレン、およびハロ
アルケニレンからなる群から選んだ連鎖を形成す
る、そして該連鎖の両末端原子価結合と共に全体
で10個までの炭素原子がR₁およびR₂が結合され
る窒素原子に結合される、そして各ハロゲン置換
原子は窒素原子から除去された少なくとも３個の
炭素原子であり、各不飽和は窒素原子から除去さ
れた少なくともC₂〜C₃結合である；R₁およびR₂
は、それらが結合される窒素原子と共にとつたと
きには、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から選んだ少
なくとも１つ余分のヘテロ原子を含む飽和窒素複
素環を形成する。さらに望ましいのは、各Ｙはジ
メチルアミン、ジエチルアミン、ジイソプロピル
アミン、ジブチルアミン、メチルプロピルアミ
ン、メチルヘキシルアミン、メチルシクロプロピ
ルアミン、エチルシクロヘキシルアミン、メチル
ベンジルアミン、メチルシクロヘキシルメチルア
ミン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルホリ
ン、チオモルホリン、ピロリジン、ピペリジン、
および２，６―ジメチルピペリジンからなる群か
ら選ぶことである。最適のＹはピロリジンであ
る。Ｚは実質的に全てのヒドロキシ保護基が可能で
ある。当業者には多くのヒドロキシ保護基が知ら
れている。Ｚはピキシル基（例えば、９―アリー
ルサンテン―９―イル）、トリアリールメチル基
（例えばトリチル、メトキシトリチル、トリメト
キシトリチル、ジ―ｐ―アニシルフエニルメチ
ル、ｐ―フルオロフエニル―１―ナフチルフエニ
ルメチル、ｐ―アニシル―１―マフチルフエニル
メチル、ジ―Ｏ―アニシル―１―ナフチルメチ
ル、ジ―Ｏ―アニシルフエニルメチル、およびｐ
―トリルジフエニルメチル）、ジアルキル亜リン
酸塩基、アルキルカルボニル基（例えば、ベンゾ
イル）、トリアルキルシリアルキルオキシカルボ
ニル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキ
シカルボニル基（例えば、イソブチルオキシカル
ボニル）、アリールスルホニルアルコキシカルボ
ニル基、アリールチオアルキルオキシカルボニル
基、アラルキル基、アルキル基、アルケニル基、
トリアルキルシリル基、ケタル官能基（例えば、
テトラヒドロピラニル、４―メトキシテトラヒド
ロプラン―４―イル）、およびアセタール官能基
からなる群から選ぶことが望ましい。本発明に用いることができる種々のヌクレオシ
ドは第表に示すものを含む。

【表】 2′−Ａ＝3′−Ａのときには、2′−Ａおよび3′−
Ａは―OHでないことが望ましい。さらに望まし
くは、ヌクレオシドは第表のヌクレオシド３、
５、15および14によつて表わされる式を有するこ
とである。ヌクレオシドが２つの―OZ置換基を含むとき
は、一方のＺ保護基は他方を脱保護することなく
脱保護できることが必須である。これは周知の方
法で達せられる。例えば、１つのＺがトリチルで
あつて第２のＺがベンゾイル、トリアルキルシリ
ル、テトラヒドロピラニル、または他のケタルま
たはアセタール官能基からなる群から選ぶ場合に
は、トリチルは弱酸またはルイス酸（例えば、臭
化亜鉛）によつて他の保護基を除去することなく
除去することができる。同様に、一方の保護基が
トリチルで、他方がベンゾイルである場合、ベン
ゾイル基は塩基性の条件下でトリチル基を除去す
ることなく除去することができる。同様に、一方
の保護基がトリチルで他方がトリアルキルシリル
である場合、トリアルキルシリル基はフツ化物イ
オンで処理することによつてトリチル基を除去す
ることなく除去することができる。Ｂは実質的にいずれの天然または非天然リボヌ
クレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基も可
能である。そのような塩基は限定ではないがプリ
ン誘導体、例えばアデニン、ハイポキサンチンお
よびグアニン、ピリミジン誘導体、例えばシトシ
ン、ウラシルおよびチミン、並びにそれらの同族
体および類似体を含む。Ｇは実質的にいずれの複素環塩基保護基も可能
である。当業者には多くの複素環塩基保護基が知
られている⁽²³―³³⁾。Ｇは複素環塩基に対応するア
ミノ、イミド、およびアミド保護基からなる群か
ら選ぶことが望ましい。そのようなアミノ、イミ
ド、およびアミド保護基は、限定ではないが、ト
リアリールメチル、トリアルキルシリルアルキ
ル、アリールチオアルキル、アリールアルキル、
シアノアルキル、フタロイル、アリール、アリー
ルオキシカルボニル、アルコキシカルボニル、ア
リールカルボニル、アルキルカルボニル、および
Ｎ―ジアルキルアミノメチレンを含む。数字ｎは複素環リング上の１個以上の反応性官
能基が保護されるように選ぶ。この点の説明を第
表に示す。

【表】弱酸は水中約25℃において約7.5〜約11のpKを
有することが望ましい、さらに望ましくは約８〜
約９、最適には約8.2〜約8.5のpKを有することが
望ましい。さらに、弱酸は、１，２，４―トリア
ゾール；１，２，３―トリアゾール；４，５―ジ
クロロイミダゾール；４―ニトロイミダゾール；
３―クロロトリアゾール；ベンゾトリアゾール；
およびそれらの混合物からなる群から選ぶことが
望ましい。さらに望ましくは、弱酸は４，５―ジ
クロロイミダゾール、ベンゾトリアゾール、およ
びそれらの混合物からなる群から選ぶ。最適の弱
酸は４，５―ジクロロイミダゾールである。溶媒はテトラメチル尿素、Ｎ，Ｎ―ジメチルア
セトアミド、１―メチル―２―ピロリジノン、
Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド（DMF）、ジオキ
サン、テトラヒドロフラン（THF）、酢酸エチ
ル、クロロホルム、１，３―ジメチル―２―イミ
ダゾリジノン、Ｎ，N′―ジメチル―Ｎ，N′―プ
ロピレン尿素、それらの同族体および類似体、そ
れらの混合体からなる群から選ぶことが望まし
い。さらに望ましくは、溶媒はテトラメチル尿
素、１，３―ジメチル―２―イミダゾリジノン、
１―メチル―２―ピロリジノン、およびそれらの
混合体からなる群から選ぶ。さらに、溶媒は無水
（即ち、0.06％以下の水を含む）であることが望
ましい。その化学反応は便利な温度で行なうことができ
る。この温度は反応混合体の凍結点から沸点まで
の範囲に及ぶ。化学反応は室温付近での実施が望
ましい。化学反応の実施には便利な時間を採用すること
ができる。例えば、反応時間は数秒から１日以上
にすることができる。しかしながら、反応はでき
るだけ速く（典型的には約５〜15分間、さらに望
ましくは約10分間）行なうことが望ましい。は反応性物質よりも高モル濃度で存在する
ことが望ましい。さらに望ましくは、：反応物
質のモル比は1.2：１である。との相対的モル濃度は重要ではないが、
のモル濃度はのモル濃度の少なくとも２倍であ
ることが望ましい。さらに望ましくは、のモル
濃度はのモル濃度の約２〜５倍である。最適に
は、のモル濃度はのモル濃度の約４倍であ
る。反応物質は便利な順序で添加することができ
る。しかしながら、本発明の一工程回転実施態様
にしては、を含む溶液にを添加することが望
ましい。この望ましい順序は、反応の経過中にお
ける副産物の生成を少なくすると考えられる。かく生成されたヌクレオシド・ホスホルアミダ
イト中間体は、適当な剤、例えば1H―テトラゾ
ールで活性化させることができる、そして過剰の
被活性化ヌクレオシド・ホスホルアミダイト中間
体は周知の液体または固相法⁽¹⁶、²²⁾における適当
な被保護ヌクレオシドとの共役反応中に使用する
ことができる。従つてこの方法は、溶媒並びに周
囲環境からの極微量水分に対する望ましい競争を
保証する。共役反応は固相法で実施することが望ましい。次の実施例は、本発明の説明のためのものであ
つて、本発明の限定を意図するものではない。例１ビス―（Ｎ，Ｎ―ジメチルアミノ）メトキシホ
スフインの調製 100mlの丸底フラスコ中で−15℃に冷却された
0.1モルのメトキシジクロロホスフインに、窒素
雰囲気下でＮ，Ｎ―ジメチルアミノトリメチルシ
ラン（0.21モル）を約30分かけて１滴ずつ添加し
た。次にその反応混合体を冷浴から取り出して、
環境温度で約１時間かくはんした。反応経過中に
生成したクロロトリメチルシランは減圧（水アス
ピレーター）下で除去した。残つた物質は温度38
〜40℃、圧力13mmHgで蒸留した。濁つた液体は
中位気孔率のガラス焼結漏斗を介してろ過した。
物理的な特性は次のように固定された： 1_HNMR（CDCl₃）＝3.5ppm（ｄ、―OCH₃、3H）
J_P-H＝13Hz そのスペクトルは外部TMSレフアレンスに関
して記録された。31_PNMR（CDCl₃）：−
138.18ppm（外部85％H₃PO₄レフアレンスに関し
て）。透明液体の密度は25℃において0.936ｇ/mlであ
つた。例２ビス（ピロリジノ）メトキシホスフインの調製 100mlの丸底フラスコ中で−15℃に冷却された
0.1モルのメトキシジクロロホスフインに、窒素
雰囲気下でＮ―トリメチルシリルピロリジン
（0.21モル）を約30分かけて１滴ずつ添加した。
次にその反応混合体を冷浴から取り出して、環境
温度で約１時間かくはんした。その反応過程で生
成されたクロロトリメチルシランは減圧（水アス
ピレーター）下で除去した。残留した物質は温度
66〜68℃、圧力0.16mmHgで蒸留した。濁つた液
体は中位気孔率のガラス焼結漏斗を介してろ過し
た。その収率は82％であつた。物理的特性は次の
ように同定された： 1_HNMR（CDCl₃）：3.4ppm（ｄ、OCH₃）J_P-H＝
13Hz 3.1ppm（ｍ、―Ｎ―CH₂） 1.8ppm（ｍ、―CH₂―CH₂―）スペクトルは外部TMSレフアレンスに関して
記録された。 31_PNMR（CDCl₃）：−134.01ppm（85％H₃PO₄
レフアレンスに関して）。 25℃における透明液体の密度は1.037ｇ/mlであ
つた。例３ビス―（Ｎ，Ｎ―ジイソプロピル）メトキシホ
スフインの調製 100mlの無水エチルエーテル中のメトキシジク
ロロホスフイン（15ｇ、0.11モル）に、窒素雰囲
気下、−15℃において100mlの無水エチルエーテル
中のＮ，Ｎ―ジイソプロピルアミン（44.5ｇ、
0.44モル）を約30分かけて一滴ずつ添加した。次
にそのけん濁液を冷浴から取り出して、環境温度
において約１時間かくはんした。次にアミン塩酸
塩をろ過し、無水エーテル100mlで洗浄した。ろ
液から過剰のエーテルは大気気圧下で蒸留除去し
た。残つた物質は、ろ過によつて残留アミン塩酸
塩から分離し、59〜61℃、0.2mmHgにおいて分別
沸とうを与えるために高真空下で蒸留した。その
収率は79％であつた。物理的特性は次のように同
定された： 1_HNMR（CDCl₃）：3.3ppm（ｄ、―OCH₃）J_P-H
＝14Hz 3.4ppm（ｍ、―Ｎ（CH）₂） 1.0ppm（ｄ、―CH（CH₃）₂） 31_PNMR（CDCl₃）：−131.8ppm（外部の85％
H₃PO₄レフアレンスに関して）。 26℃における透明液体の密度は0.911ｇ/mlであ
つた。例４ dmt＝ジ―ｐ―アニシルフエニルメチル例２で調製したビス―（ピロリジノ）メトキシ
ホスフイン（ａ：0.25mmol）を0.5mlの乾燥１
―メチル―２―ピロリジノン中の5′―被保護デオ
キシヌクレオシド（；0.28mmol）および４，
５―ジクロロイミダゾール（；1.00mmol）の
溶液に注入した、31_PNMRは、少量の対称的な
ジヌクレオシド・モノ亜リン酸塩Ｖ（−
139.7ppm；8.8％副産物）と共にヌクレオシド・
ホスホルイミダイトａのほゞ定量的収率を示し
た。例５オリゴマーの調製ポリヌクレオチド合成への新規合成法を試験す
るために、次の実験を行つた。乾燥１―メチル―
２―ピロリジノン（0.5ml）中の5′―被保護ヌク
レオシドａ（153mg、0.28mmol）と４，５―ジ
クロロイミダゾール（、136mg、1.00mmol）の
溶液に、窒素雰囲気下、環境温度において50μ
のビス―（ピロリジノ）メトキシホスフイン、
（ａ；0.25mmol）を添加した。約10分後、1H
―テトラゾールの0.5Mアセトニトリル溶液250μ
中にけん濁した1μモルのジオキシチミジンで
誘導された固体支持体30mgを含む４mlのガラスび
んに70μ（25mmol）の貯蔵溶液を注入した。
その反応混合体は室温で約５分間振とうし、
THF：２，６―ルチジン：H₂O（２：１：２）の
溶液1.5mlで冷却し、普通の方法に従つて酸化し
た。標準の脱保護の後、反応生成物を高性能液体
クロマトグラフ法によつて分析した。ｄ（T_pＴ）
の高収率（＞95％）と若干量（＜５％）の未反応
デオキシチミジンが観察された。ｄ（C_pＴ）、ｄ
（A_pＴ）およびｄ（G_pＴ）も95％以上の収率で生
成された。これらの生成物は市販の本物の試料に
厳密に同一であつた。例６例５に示した方法に従つて、次のオリゴヌクレ
オチドをうまく調製した：ｄ（GCATCGCCAGTCACTATGGCGT）全体の収率は約30％であつた。これは平均収率
99.4％が各工程で得られることを意味する
（498nmの波長において７×10⁴の吸光度を用いて
ジメトキシトリチル陽イオンから分光的に測定）。
その場でのヌクレオシド・ホスホルアミダイトの
調製に式の化合物の選択的活性化を用いて、こ
こに開示した合成法は、自動化された固相DNA
およびRNA合成用に優れた手段である。現存す
る方法に比べて本法の利点のいくつかは次の通り
である：デオキシヌクレオシド・ホスホルアミダイトの
調製中に生成される複素環リングの有害な亜リン
酸塩化の破壊、および吸湿性アミン塩酸塩の除去
に必要な水性仕上げの排除⁽¹⁶⁾。ヘキサン中における（−70℃）デオキシヌクレ
オシド・ホスホルアミダイトのトルエンまたは酢
酸エチル溶液の沈殿からなる困難な単離操作の排
除⁽¹⁶⁾。その場所で作られたデヌクレオシド・ホスホル
アミダイトが一般に比較的短期間で消費されるた
め、アセトニトリル溶液中にデオキシヌクレオシ
ド・ホスホルアミダイトの長期放置によつて生じ
る安定性の問題の排除。取扱いが困難であり、大気中の水分に極めて敏
感であるところのクロロ―（Ｎ，Ｎ―ジメチルア
ミノ）メトキシホスフイン⁽¹⁶⁾、クロロ（Ｎ，Ｎ
―ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフイン⁽¹⁸
^）、メトキシジクロロホスフイン⁽²⁰、²¹⁾、ビス―
（テトラゾリル）メトキシホスフイン⁽²¹⁾のような
自然性および／または反応性の亜リン酸塩化剤の
排除。式の化合物は、対応するクロロホスフインに
比較して大気中の水分に対して極めて安定である
ため、容易に調製されると共に取扱いが安全であ
る。従つて、適当な活性化剤によつてその場所で生
成されたヌクレオシド・ホスホルアミダイト中間
体の効率的な活性化を介した高結合収率と共に、
式の化合物の選択的活性化を介した高収率でヌ
クレオシド・ホスホルアミダイト中間体に変換さ
れる安定な被保護ヌクレオシドの使用は、本発明
の方法を自動化しやすくすると共に、固相または
液相のDNAおよび／またはRNAの手動合成が望
ましい場合には非化学者による使用をしやすくす
る。当然のことながら、この開示に基いて、多くの
他の改良および分枝が当業者には示唆されるであ
ろう。それらは本発明の範囲内に包含されるもの
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