JP2000327695A - ヌクレオチド化合物 - Google Patents
ヌクレオチド化合物Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
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Abstract
(57)【要約】
【課題】オリゴヌクレオチドの製造において、その原料
となる２量体など短鎖オリゴマーの出発原料となる、新
規なヌクレオチド化合物を提供する。 【解決手段】下記式（１）で表されるヌクレオチド化合
物。 【化１】 （式中、Ｂはヌクレオチド化学において通常用いられる
核酸塩基を示し、Ｒ1およびＲ2は水素原子、ヘテロ原子
を含んでいてもよいアルキル基、シクロアルキル基、ア
リール基もしくはアラルキル基を示し、Ｒ1とＲ2は同一
であっても異なっていても良く、Ｒ3はヌクレオチド化
学において通常用いられる保護基を示し、Ｒ4は水素原
子、水酸基、アルコキシ基またはトリアルキルシリルオ
キシ基を示し、Ｘはジアルキルアミノ基、アゾリル基も
しくは飽和窒素複素環を示し、ｎは３以上の整数、Ａは
２価基でアリレン基もしくはヘテロ原子を含んでも良い
直鎖あるいは分岐鎖を含むアルキレン基を示す。）
となる２量体など短鎖オリゴマーの出発原料となる、新
規なヌクレオチド化合物を提供する。 【解決手段】下記式（１）で表されるヌクレオチド化合
物。 【化１】 （式中、Ｂはヌクレオチド化学において通常用いられる
核酸塩基を示し、Ｒ1およびＲ2は水素原子、ヘテロ原子
を含んでいてもよいアルキル基、シクロアルキル基、ア
リール基もしくはアラルキル基を示し、Ｒ1とＲ2は同一
であっても異なっていても良く、Ｒ3はヌクレオチド化
学において通常用いられる保護基を示し、Ｒ4は水素原
子、水酸基、アルコキシ基またはトリアルキルシリルオ
キシ基を示し、Ｘはジアルキルアミノ基、アゾリル基も
しくは飽和窒素複素環を示し、ｎは３以上の整数、Ａは
２価基でアリレン基もしくはヘテロ原子を含んでも良い
直鎖あるいは分岐鎖を含むアルキレン基を示す。）
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なヌクレオチド
化合物に関するものであり、本発明のヌクレオチド化合
物は、例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチドの製造
中間原料として有機合成化学、生化学および医薬産業
上、有用な化合物である。
化合物に関するものであり、本発明のヌクレオチド化合
物は、例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチドの製造
中間原料として有機合成化学、生化学および医薬産業
上、有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】従来のオリゴデオキシリボヌクレオチド
およびオリゴリボヌクレオチドの合成に関しては、固相
合成法が採用されている。この方法に従えば、ヌクレオ
シドの３’−水酸基を多孔質ガラスなどの不溶性担体上
に固定した出発物質を用い、オリゴヌクレオチド鎖を
３’末端から５’末端方向に１塩基ずつ伸長していくの
が一般的であり、任意の配列のオリゴヌクレオチドの合
成が可能である（ケスラーら、特公昭６２−５０４７９
号公報、およびカルザースら特公昭６３−２８４３９号
公報を参照）。しかしながら、上記の方法では、すべて
の工程が逐次反応によって構成されているため、どの工
程も反応収率１００％か限りなくそれに近く進行しなけ
れば、目的とする配列を有するオリゴヌクレオチドは得
られないという点が技術的に難しい。特に、ヌクレオチ
ド鎖伸長工程であるリン酸化反応工程（縮合反応）は、
現在の最高レベルでも各伸長反応毎の収率が９８．５〜
９９．５％であって、この反応収率の高低が、目的とす
る配列を有するオリゴヌクレオチドの全収率を決定す
る。最近、全収率を向上させる方策として、縮合回数を
減らすことの出来る２量体ヌクレオチドをヌクレオチド
鎖を構築する際のビルディングブロックとする合成法が
有効であるとする報告がなされている｛クロッツら，バ
イオオルガニックアンドメディシナルケミストリーレタ
ーズ（Bioorg. Med. Chem. Lett.,），1997，7，73-7
8.｝。また、上記以外にも、２量体以上をビルディング
ブロックとしたオリゴヌクレオチドの化学合成法は多く
見受けられる（例えば総説として日本化学会編, 「核酸
の化学と分子生物学−化学総説４６」, 学会出版センタ
ー, 1985, pp. 209-240.など）。しかしながら、これら
のビルディングブロックは水酸基の保護・脱保護および
リン酸化という一連の工程が非常に複雑であり、しかも
各工程で副生物や不純物を除去するために、抽出やクロ
マトグラフィーなどの操作が必要である。これらは操作
上の繁雑さを招くだけでなく、ビルディングブロックを
合成するためのコストを高くしている。
およびオリゴリボヌクレオチドの合成に関しては、固相
合成法が採用されている。この方法に従えば、ヌクレオ
シドの３’−水酸基を多孔質ガラスなどの不溶性担体上
に固定した出発物質を用い、オリゴヌクレオチド鎖を
３’末端から５’末端方向に１塩基ずつ伸長していくの
が一般的であり、任意の配列のオリゴヌクレオチドの合
成が可能である（ケスラーら、特公昭６２−５０４７９
号公報、およびカルザースら特公昭６３−２８４３９号
公報を参照）。しかしながら、上記の方法では、すべて
の工程が逐次反応によって構成されているため、どの工
程も反応収率１００％か限りなくそれに近く進行しなけ
れば、目的とする配列を有するオリゴヌクレオチドは得
られないという点が技術的に難しい。特に、ヌクレオチ
ド鎖伸長工程であるリン酸化反応工程（縮合反応）は、
現在の最高レベルでも各伸長反応毎の収率が９８．５〜
９９．５％であって、この反応収率の高低が、目的とす
る配列を有するオリゴヌクレオチドの全収率を決定す
る。最近、全収率を向上させる方策として、縮合回数を
減らすことの出来る２量体ヌクレオチドをヌクレオチド
鎖を構築する際のビルディングブロックとする合成法が
有効であるとする報告がなされている｛クロッツら，バ
イオオルガニックアンドメディシナルケミストリーレタ
ーズ（Bioorg. Med. Chem. Lett.,），1997，7，73-7
8.｝。また、上記以外にも、２量体以上をビルディング
ブロックとしたオリゴヌクレオチドの化学合成法は多く
見受けられる（例えば総説として日本化学会編, 「核酸
の化学と分子生物学−化学総説４６」, 学会出版センタ
ー, 1985, pp. 209-240.など）。しかしながら、これら
のビルディングブロックは水酸基の保護・脱保護および
リン酸化という一連の工程が非常に複雑であり、しかも
各工程で副生物や不純物を除去するために、抽出やクロ
マトグラフィーなどの操作が必要である。これらは操作
上の繁雑さを招くだけでなく、ビルディングブロックを
合成するためのコストを高くしている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、オリ
ゴヌクレオチドの製造において、その原料となる２量体
など短鎖オリゴマーの出発原料となる、新規なヌクレオ
チド化合物を提供することである。
ゴヌクレオチドの製造において、その原料となる２量体
など短鎖オリゴマーの出発原料となる、新規なヌクレオ
チド化合物を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、ヌクレオシドの核
酸塩基の保護基部分にポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）が導入されたヌクレオチド化合物を短鎖オリゴデオ
キシリボヌクレオチドの製造に利用した場合、上記課題
が解決されることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、下記式（１）で表されるヌク
レオチド化合物である。
を解決すべく鋭意研究を行った結果、ヌクレオシドの核
酸塩基の保護基部分にポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）が導入されたヌクレオチド化合物を短鎖オリゴデオ
キシリボヌクレオチドの製造に利用した場合、上記課題
が解決されることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、下記式（１）で表されるヌク
レオチド化合物である。
【０００５】
【化２】
【０００６】（式中、Ｂはヌクレオチド化学において通
常用いられる核酸塩基を示し、Ｒ1およびＲ2は水素原
子、ヘテロ原子を含んでいてもよいアルキル基、シクロ
アルキル基、アリール基もしくはアラルキル基を示し、
Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていても良く、Ｒ3は
ヌクレオチド化学において通常用いられる保護基を示
し、Ｒ4は水素原子、水酸基、アルコキシ基またはトリ
アルキルシリルオキシ基を示し、Ｘはジアルキルアミノ
基、アゾリル基もしくは飽和窒素複素環を示し、ｎは３
以上の整数、Ａは２価基でアリレン基もしくはヘテロ原
子を含んでも良い直鎖あるいは分岐鎖を含むアルキレン
基を示す。）
常用いられる核酸塩基を示し、Ｒ1およびＲ2は水素原
子、ヘテロ原子を含んでいてもよいアルキル基、シクロ
アルキル基、アリール基もしくはアラルキル基を示し、
Ｒ1とＲ2は同一であっても異なっていても良く、Ｒ3は
ヌクレオチド化学において通常用いられる保護基を示
し、Ｒ4は水素原子、水酸基、アルコキシ基またはトリ
アルキルシリルオキシ基を示し、Ｘはジアルキルアミノ
基、アゾリル基もしくは飽和窒素複素環を示し、ｎは３
以上の整数、Ａは２価基でアリレン基もしくはヘテロ原
子を含んでも良い直鎖あるいは分岐鎖を含むアルキレン
基を示す。）
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明におけるヌクレオチド化合
物は、前記式（１）で表されるように、核酸塩基のアミ
ノ基またはイミノ基の保護基にポリエチレングリコール
鎖を含む化合物である。前記式（１）におけるＢとして
は、下記式（２）で表されるアデニン、グアニン、シト
シン、チミンおよびウラシルの誘導体が挙げられる。
物は、前記式（１）で表されるように、核酸塩基のアミ
ノ基またはイミノ基の保護基にポリエチレングリコール
鎖を含む化合物である。前記式（１）におけるＢとして
は、下記式（２）で表されるアデニン、グアニン、シト
シン、チミンおよびウラシルの誘導体が挙げられる。
【０００８】
【化３】
【０００９】また、前記式（１）におけるＲ1およびＲ2
としては、水素原子、メチル基、プロピル基、ブチル
基、１，１−ジエチル−３−ブテニル基などが挙げら
れ、Ｒ3としては４，４’−ジメトキシトリチル基など
が挙げられ、Ｒ4としては水素原子、メトキシ基、t-ブ
チルジメチルシリルオキシ基などが挙げられ、Ｘとして
はジメチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、イミダ
ゾリル基および４−メチルイミダゾリル基などが挙げら
れ、Ａとしてはフェニレン基、メチレン基およびジメチ
ルエチレン基などが挙げられる。
としては、水素原子、メチル基、プロピル基、ブチル
基、１，１−ジエチル−３−ブテニル基などが挙げら
れ、Ｒ3としては４，４’−ジメトキシトリチル基など
が挙げられ、Ｒ4としては水素原子、メトキシ基、t-ブ
チルジメチルシリルオキシ基などが挙げられ、Ｘとして
はジメチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、イミダ
ゾリル基および４−メチルイミダゾリル基などが挙げら
れ、Ａとしてはフェニレン基、メチレン基およびジメチ
ルエチレン基などが挙げられる。
【００１０】本発明のヌクレオチド化合物は下記式
（３）で表されるヌクレオシドを適当なリン酸化剤と反
応させることによって得られる。
（３）で表されるヌクレオシドを適当なリン酸化剤と反
応させることによって得られる。
【００１１】
【化４】
【００１２】（式中、Ｂ、Ｒ3、Ｒ4、Ａおよびｎは前記
式（１）と同じである）
式（１）と同じである）
【００１３】前記リン酸化剤との反応については、前記
ケスターおよびカルザースらの方法を用いることもでき
るし、本発明者らの別の報告による方法（北村ら、特願
平１０−３６７３８４号公報）を利用することもでき
る。
ケスターおよびカルザースらの方法を用いることもでき
るし、本発明者らの別の報告による方法（北村ら、特願
平１０−３６７３８４号公報）を利用することもでき
る。
【００１４】例えば、前記反応は、前記式（３）で表さ
れる５’−Ｏ,塩基保護−ヌクレオシドを減圧乾燥する
か、あるいはピリジンもしくは１，４−ジオキサン等の
有機溶媒に溶解してから共沸脱水した後、トルエン、ピ
リジン、テトラヒドロフラン、クロロホルムおよびアセ
トニトリル等の有機溶媒溶液中、−８０℃〜室温の条件
下、０．９〜１．２当量の下記式（４）で表される化合
物を反応させることにより達成される。低温で反応させ
た方が、ヌクレオチド化合物の収率は良く、有機溶媒は
乾燥剤で乾燥後、蒸留精製したものを用いた方が良い。
この反応溶液の31Ｐ ＮＭＲスペクトルを測定して反応
が完了したことを確認すれば良い。
れる５’−Ｏ,塩基保護−ヌクレオシドを減圧乾燥する
か、あるいはピリジンもしくは１，４−ジオキサン等の
有機溶媒に溶解してから共沸脱水した後、トルエン、ピ
リジン、テトラヒドロフラン、クロロホルムおよびアセ
トニトリル等の有機溶媒溶液中、−８０℃〜室温の条件
下、０．９〜１．２当量の下記式（４）で表される化合
物を反応させることにより達成される。低温で反応させ
た方が、ヌクレオチド化合物の収率は良く、有機溶媒は
乾燥剤で乾燥後、蒸留精製したものを用いた方が良い。
この反応溶液の31Ｐ ＮＭＲスペクトルを測定して反応
が完了したことを確認すれば良い。
【００１５】
【化５】
【００１６】（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＸは前記式（１）
と同じである）
と同じである）
【００１７】上記反応で得られたヌクレオチド化合物
は、分離・精製すること無く、次の反応に用いれば良
い。例えば、少なくとも核酸塩基だけは適当に保護され
たヌクレオシド化合物を、別に減圧乾燥するか共沸操作
を行い、トルエン、ピリジン、テトラヒドロフラン、ク
ロロホルムおよびアセトニトリル等の有機溶媒の溶液と
して、−８０℃〜室温の条件下、上記の反応溶液に混合
し反応させることにより２量化反応は達成される。この
場合、上記反応で用いるヌクレオシド化合物の３’水酸
基は、必ずしも保護されている必要はない。
は、分離・精製すること無く、次の反応に用いれば良
い。例えば、少なくとも核酸塩基だけは適当に保護され
たヌクレオシド化合物を、別に減圧乾燥するか共沸操作
を行い、トルエン、ピリジン、テトラヒドロフラン、ク
ロロホルムおよびアセトニトリル等の有機溶媒の溶液と
して、−８０℃〜室温の条件下、上記の反応溶液に混合
し反応させることにより２量化反応は達成される。この
場合、上記反応で用いるヌクレオシド化合物の３’水酸
基は、必ずしも保護されている必要はない。
【００１８】本発明のヌクレオチド化合物は、アセトニ
トリル、テトラヒドロフラン、ピリジンおよび有機塩素
系溶媒などには可溶であり、これらポリエチレングリコ
ールに対する良溶媒中、適当に保護された第２番目のヌ
クレオシドを反応させることにより、２量体を得ること
ができる。一方、２量体成分を含む溶液に、ポリエチレ
ングリコールに対する貧溶媒、例えば、ジエチルエーテ
ルやジイソプロピルエーテルを、その溶液量に対して５
〜２０倍容量加えると、２量体成分は沈澱し容易に回収
できる。このためポリエチレングリコールを有しない従
来の保護ヌクレオチドを利用して２量体成分を得るとき
に必要であった分離・精製操作の大半が不要となる。か
つ、この分離・精製方法は、後工程であるヌクレオチド
鎖構築に対して十分なものであり、この分離・精製方法
は２量体ヌクレオチドを大量に得るためにも好都合であ
る。従って、本発明におけるヌクレオチド化合物は、２
量体および多量体ビルディングブロックを調製する上に
おいて、極めて簡便なオリゴデオキシリボヌクレオチド
の合成方法の提供を可能にする。
トリル、テトラヒドロフラン、ピリジンおよび有機塩素
系溶媒などには可溶であり、これらポリエチレングリコ
ールに対する良溶媒中、適当に保護された第２番目のヌ
クレオシドを反応させることにより、２量体を得ること
ができる。一方、２量体成分を含む溶液に、ポリエチレ
ングリコールに対する貧溶媒、例えば、ジエチルエーテ
ルやジイソプロピルエーテルを、その溶液量に対して５
〜２０倍容量加えると、２量体成分は沈澱し容易に回収
できる。このためポリエチレングリコールを有しない従
来の保護ヌクレオチドを利用して２量体成分を得るとき
に必要であった分離・精製操作の大半が不要となる。か
つ、この分離・精製方法は、後工程であるヌクレオチド
鎖構築に対して十分なものであり、この分離・精製方法
は２量体ヌクレオチドを大量に得るためにも好都合であ
る。従って、本発明におけるヌクレオチド化合物は、２
量体および多量体ビルディングブロックを調製する上に
おいて、極めて簡便なオリゴデオキシリボヌクレオチド
の合成方法の提供を可能にする。
【００１９】
【実施例】以下、実施例により本発明の化合物について
詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定され
るものではない。 （実施例１） 前記式（１）において、Ｂ＝シトシン誘導体、Ｒ1＝水
素原子、Ｒ2＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ3
＝４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｒ4＝水素原子、
Ｘ＝イミダゾリル基、Ａ＝フェニレン基の場合の化合物
の合成例 （ａ）２−シアノ−１−（１，１−ジエチル−３−ブテ
ニル）エトキシジクロロホスフィン（３５０ｍｇ，１．
２５ｍｍｏｌ）のトルエン（５ｍｌ）溶液に、アルゴン
雰囲気下、室温の条件で、トリメチルシリルイミダゾー
ル（０．４０ｍｌ，２．７５ｍｍｏｌ）を加え５分間反
応させた。副生したクロロトリメチルシランおよびトル
エンを室温で１０分間減圧留去した後、残留トルエンお
よび過剰のトリメチルシリルイミダゾールを３５℃の条
件で2時間減圧留去し、無色透明、油状の２−シアノ−
１−（１，１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシビス
イミダゾリルホスフィンを得た。この化合物の31Ｐ Ｎ
ＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝
１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝１０９．３であっ
た。
詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定され
るものではない。 （実施例１） 前記式（１）において、Ｂ＝シトシン誘導体、Ｒ1＝水
素原子、Ｒ2＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ3
＝４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｒ4＝水素原子、
Ｘ＝イミダゾリル基、Ａ＝フェニレン基の場合の化合物
の合成例 （ａ）２−シアノ−１−（１，１−ジエチル−３−ブテ
ニル）エトキシジクロロホスフィン（３５０ｍｇ，１．
２５ｍｍｏｌ）のトルエン（５ｍｌ）溶液に、アルゴン
雰囲気下、室温の条件で、トリメチルシリルイミダゾー
ル（０．４０ｍｌ，２．７５ｍｍｏｌ）を加え５分間反
応させた。副生したクロロトリメチルシランおよびトル
エンを室温で１０分間減圧留去した後、残留トルエンお
よび過剰のトリメチルシリルイミダゾールを３５℃の条
件で2時間減圧留去し、無色透明、油状の２−シアノ−
１−（１，１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシビス
イミダゾリルホスフィンを得た。この化合物の31Ｐ Ｎ
ＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝
１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝１０９．３であっ
た。
【００２０】（ｂ）上記で得られた２−シアノ−１−
（１，１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシビスイミ
ダゾリルホスフィンを重クロロホルム（２．５ｍｌ）に
溶解させて、０．５０Ｍ溶液とし、アルゴン雰囲気下、
室温で２時間減圧乾燥した５’−Ｏ，塩基保護−２’−
デオキシシチジン−ポリエチレングリコール誘導体（ポ
リエチレングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０、
式（２）においてＢ＝シトシン誘導体，Ｒ3＝４，４’
−ジメトキシトリチル，Ｒ4＝水素，Ａ＝フェニレンの
もの，１．２０ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰
囲気下、室温の条件下で加えた。均一にさせた後、その
まま一晩静置して反応させ、目的のホスホルアゾリド化
合物（Ｉ，Ｘ＝イミダゾリル，in situ ＤＮＡ合成試
薬）を得た。得られた化合物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．
９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，
ＣＤＣｌ3）は、δ＝１３４．３，１３１．５，１３
０．８，１２７．４であった。
（１，１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシビスイミ
ダゾリルホスフィンを重クロロホルム（２．５ｍｌ）に
溶解させて、０．５０Ｍ溶液とし、アルゴン雰囲気下、
室温で２時間減圧乾燥した５’−Ｏ，塩基保護−２’−
デオキシシチジン−ポリエチレングリコール誘導体（ポ
リエチレングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０、
式（２）においてＢ＝シトシン誘導体，Ｒ3＝４，４’
−ジメトキシトリチル，Ｒ4＝水素，Ａ＝フェニレンの
もの，１．２０ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰
囲気下、室温の条件下で加えた。均一にさせた後、その
まま一晩静置して反応させ、目的のホスホルアゾリド化
合物（Ｉ，Ｘ＝イミダゾリル，in situ ＤＮＡ合成試
薬）を得た。得られた化合物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．
９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，
ＣＤＣｌ3）は、δ＝１３４．３，１３１．５，１３
０．８，１２７．４であった。
【００２１】（実施例２） 前記式（１）においてＢ＝チミン誘導体、Ｒ1＝水素原
子、Ｒ2＝イソプロピル基、Ｒ3＝４，４’−ジメトキシ
トリチル基、Ｒ4＝水素原子、Ｘ＝４−メチルイミダゾ
リル基、Ａ＝フェニレン基の場合の化合物の合成 実施例１と同様な方法で、２−シアノ−１−イソプロピ
ルエトキシジクロロホスフィン（１９６ｍｇ，０．９２
ｍｍｏｌ）、トリメチルシリル−４−メチルイミダゾー
ル（０．３１ｍｌ，２．０２ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩
基保護−チミジン−ポリエチレングリコール誘導体（ポ
リエチレングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０、
式（２）においてＢ＝チミン誘導体、Ｒ3＝４，４’−
ジメトキシトリチル，Ｒ4＝水素原子，Ａ＝フェニレン
のもの，１．１９ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）より、目的の
ホスホルアゾリド化合物（Ｉ，Ｘ＝４−メチルイミダゾ
リル，in situ ＤＮＡ合成試薬）を得た。得られた化合
物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（Ｃ
Ｈ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝１３
８．２，１２７．９，１２４．４であった。
子、Ｒ2＝イソプロピル基、Ｒ3＝４，４’−ジメトキシ
トリチル基、Ｒ4＝水素原子、Ｘ＝４−メチルイミダゾ
リル基、Ａ＝フェニレン基の場合の化合物の合成 実施例１と同様な方法で、２−シアノ−１−イソプロピ
ルエトキシジクロロホスフィン（１９６ｍｇ，０．９２
ｍｍｏｌ）、トリメチルシリル−４−メチルイミダゾー
ル（０．３１ｍｌ，２．０２ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩
基保護−チミジン−ポリエチレングリコール誘導体（ポ
リエチレングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０、
式（２）においてＢ＝チミン誘導体、Ｒ3＝４，４’−
ジメトキシトリチル，Ｒ4＝水素原子，Ａ＝フェニレン
のもの，１．１９ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）より、目的の
ホスホルアゾリド化合物（Ｉ，Ｘ＝４−メチルイミダゾ
リル，in situ ＤＮＡ合成試薬）を得た。得られた化合
物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（Ｃ
Ｈ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝１３
８．２，１２７．９，１２４．４であった。
【００２２】（実施例３） 前記式（１）においてＢ＝アデニン誘導体、Ｒ1＝水素
原子、Ｒ2＝ｔ−ブチル基、Ｒ3＝４，４’−ジメトキシ
トリチル基、Ｒ4＝水素原子、Ｘ＝イミダゾリル基、Ａ
＝フェニレン基の場合の化合物の合成 実施例１と同様な方法で、２−シアノ−１−ｔ−ブチル
エトキシジクロロホスフィン（ＩＩＩ，２４０ｍｇ，
１．０５ｍｍｏｌ）、トリメチルシリルイミダゾール
（０．３４ｍｌ，２．３２ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩基
保護−２’−デオキシアデノシン−ポリエチレングリコ
ール誘導体（ポリエチレングリコールの数平均分子量
（Ｍｎ）３５０、式（２）においてＢ＝アデニン誘導
体，Ｒ3＝４，４’−ジメトキシトリチル，Ｒ4＝水素原
子，Ａ＝フェニレンのもの，１．４１ｇ、１．４０ｍｍ
ｏｌ）より、目的のホスホルアゾリド化合物（Ｉ，Ｘ＝
イミダゾリル，in situ ＤＮＡ合成試薬）を得た。得ら
れた化合物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標
準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、
δ＝１３２．１，１２９．２，１２８．９，１２８．５
であった。
原子、Ｒ2＝ｔ−ブチル基、Ｒ3＝４，４’−ジメトキシ
トリチル基、Ｒ4＝水素原子、Ｘ＝イミダゾリル基、Ａ
＝フェニレン基の場合の化合物の合成 実施例１と同様な方法で、２−シアノ−１−ｔ−ブチル
エトキシジクロロホスフィン（ＩＩＩ，２４０ｍｇ，
１．０５ｍｍｏｌ）、トリメチルシリルイミダゾール
（０．３４ｍｌ，２．３２ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩基
保護−２’−デオキシアデノシン−ポリエチレングリコ
ール誘導体（ポリエチレングリコールの数平均分子量
（Ｍｎ）３５０、式（２）においてＢ＝アデニン誘導
体，Ｒ3＝４，４’−ジメトキシトリチル，Ｒ4＝水素原
子，Ａ＝フェニレンのもの，１．４１ｇ、１．４０ｍｍ
ｏｌ）より、目的のホスホルアゾリド化合物（Ｉ，Ｘ＝
イミダゾリル，in situ ＤＮＡ合成試薬）を得た。得ら
れた化合物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標
準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、
δ＝１３２．１，１２９．２，１２８．９，１２８．５
であった。
【００２３】（実施例４） 前記式（１）においてＢ＝グアニン誘導体、Ｒ1＝水素
原子、Ｒ2＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ3＝
４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｒ4＝水素原子、Ｘ
＝イミダゾリル基、Ａ＝ベンジレン基の場合の化合物の
合成 実施例１と同様の方法に従い、２−シアノ−１−（１，
１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシジクロロホスフ
ィン（３７９ｍｇ，１．３４ｍｍｏｌ）、トリメチルシ
リルイミダゾール（０．４３ｍｌ，２．９６ｍｍｏ
ｌ）、５’−Ｏ，塩基保護−２’−デオキシグアノシン
−ポリエチレングリコール誘導体（ポリエチレングリコ
ールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０，式（２）において
Ｂ＝グアニン誘導体，Ｒ3＝４，４'-ジメトキシトリチ
ル，Ｒ4＝水素原子，Ａ＝ベンジレンのもの，１．６２
ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）より、目的のホスホルアゾリド
化合物（Ｉ，Ｘ＝イミダゾリル，in situ ＤＮＡ合成試
薬）を得た。得られた化合物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．
９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，
ＣＤＣｌ3）は、δ＝１３２．５，１３１．６，１２
８．６，１２８．４であった。
原子、Ｒ2＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ3＝
４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｒ4＝水素原子、Ｘ
＝イミダゾリル基、Ａ＝ベンジレン基の場合の化合物の
合成 実施例１と同様の方法に従い、２−シアノ−１−（１，
１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシジクロロホスフ
ィン（３７９ｍｇ，１．３４ｍｍｏｌ）、トリメチルシ
リルイミダゾール（０．４３ｍｌ，２．９６ｍｍｏ
ｌ）、５’−Ｏ，塩基保護−２’−デオキシグアノシン
−ポリエチレングリコール誘導体（ポリエチレングリコ
ールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０，式（２）において
Ｂ＝グアニン誘導体，Ｒ3＝４，４'-ジメトキシトリチ
ル，Ｒ4＝水素原子，Ａ＝ベンジレンのもの，１．６２
ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）より、目的のホスホルアゾリド
化合物（Ｉ，Ｘ＝イミダゾリル，in situ ＤＮＡ合成試
薬）を得た。得られた化合物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．
９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，
ＣＤＣｌ3）は、δ＝１３２．５，１３１．６，１２
８．６，１２８．４であった。
【００２４】（実施例５） 前記式（１）においてＢ＝グアニン誘導体、Ｒ1＝水素
原子、Ｒ2＝１，１−メチル−３−メチル−３−ブテニ
ル基、Ｒ3＝４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｒ4＝水
素原子、Ｘ＝イミダゾリル基、Ａ＝メチレン基の場合の
化合物の合成 実施例１と同様な方法により、２−シアノ−１−（１，
１−ジエチル−３−メチル−３−ブテニル）エトキシジ
クロロホスフィン（３８３ｍｇ，１．４３ｍｍｏｌ）、
トリメチルシリルイミダゾール（０．４６ｍｌ，３．１
４ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩基保護−２’−デオキシグ
アノシン−ポリエチレングリコール誘導体（ポリエチレ
ングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０，式（２）
においてＢ＝グアニン誘導体，Ｒ3＝４，４’−ジメト
キシトリチル，Ｒ4＝水素原子，Ａ＝メチレン基のも
の，１．５０ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）より、目的のホス
ホルアゾリド化合物（Ｉ，Ｘ＝イミダゾリル，in situ
ＤＮＡ合成試薬）を得た。得られた化合物の31Ｐ ＮＭ
Ｒ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１
４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝１３２．４，１２
９．０，１２８．５，１２８．４であった。
原子、Ｒ2＝１，１−メチル−３−メチル−３−ブテニ
ル基、Ｒ3＝４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｒ4＝水
素原子、Ｘ＝イミダゾリル基、Ａ＝メチレン基の場合の
化合物の合成 実施例１と同様な方法により、２−シアノ−１−（１，
１−ジエチル−３−メチル−３−ブテニル）エトキシジ
クロロホスフィン（３８３ｍｇ，１．４３ｍｍｏｌ）、
トリメチルシリルイミダゾール（０．４６ｍｌ，３．１
４ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩基保護−２’−デオキシグ
アノシン−ポリエチレングリコール誘導体（ポリエチレ
ングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０，式（２）
においてＢ＝グアニン誘導体，Ｒ3＝４，４’−ジメト
キシトリチル，Ｒ4＝水素原子，Ａ＝メチレン基のも
の，１．５０ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）より、目的のホス
ホルアゾリド化合物（Ｉ，Ｘ＝イミダゾリル，in situ
ＤＮＡ合成試薬）を得た。得られた化合物の31Ｐ ＮＭ
Ｒ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１
４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝１３２．４，１２
９．０，１２８．５，１２８．４であった。
【００２５】（応用例１）実施例１で得られたホスホル
アゾリド化合物（in situ ＤＮＡ合成試薬）の重クロロ
ホルム反応溶液（２．０ｍｌ，約１ｍｍｏｌ）に、塩基
保護−２’−デオキシシチジン−ポリエチレングリコー
ル誘導体（ポリエチレングリコールの数平均分子量（Ｍ
ｎ）３５０，式（２）においてＢ＝シトシン誘導体，Ｒ
3＝Ｒ4＝水素原子，Ａ＝フェニレンのもの，６５０ｍ
ｇ，１ｍｍｏｌ）の重クロロホルム溶液（２ｍｌ）をア
ルゴン雰囲気下、０℃で加え、そのまま一晩４℃で静置
して反応させ２量体を得た。この時の第２番目のヌクレ
オシドの水酸基の反応選択性は、31Ｐ ＮＭＲによると
５’水酸基／３’水酸基＝９２／８であった。得られた
化合物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；
（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝
１４１．７，１４１．０，１４０．８，１４０．４であ
った。上記の反応溶液の一部（２ｍｌ，総重量２．９５
ｇ，約０．５ｍｍｏｌ）を測り取り、これを無水ジエチ
ルエーテル（３０ｍｌ）に攪拌しながら加えると、２〜
５分で白色の固体が析出した。更に１０分間激しく攪拌
した後、４℃で一晩放置した。デカンテーションしてエ
ーテルを除去し、残査は無水エーテル（５ｍｌ）で３回
洗浄した。この残査を減圧乾燥し、31Ｐ ＮＭＲを測定
した結果、上記で得られたスペクトルと同様であり、目
的とした２量体が回収されたことが確認できた（８８２
mg，回収率８８％）。
アゾリド化合物（in situ ＤＮＡ合成試薬）の重クロロ
ホルム反応溶液（２．０ｍｌ，約１ｍｍｏｌ）に、塩基
保護−２’−デオキシシチジン−ポリエチレングリコー
ル誘導体（ポリエチレングリコールの数平均分子量（Ｍ
ｎ）３５０，式（２）においてＢ＝シトシン誘導体，Ｒ
3＝Ｒ4＝水素原子，Ａ＝フェニレンのもの，６５０ｍ
ｇ，１ｍｍｏｌ）の重クロロホルム溶液（２ｍｌ）をア
ルゴン雰囲気下、０℃で加え、そのまま一晩４℃で静置
して反応させ２量体を得た。この時の第２番目のヌクレ
オシドの水酸基の反応選択性は、31Ｐ ＮＭＲによると
５’水酸基／３’水酸基＝９２／８であった。得られた
化合物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；
（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝
１４１．７，１４１．０，１４０．８，１４０．４であ
った。上記の反応溶液の一部（２ｍｌ，総重量２．９５
ｇ，約０．５ｍｍｏｌ）を測り取り、これを無水ジエチ
ルエーテル（３０ｍｌ）に攪拌しながら加えると、２〜
５分で白色の固体が析出した。更に１０分間激しく攪拌
した後、４℃で一晩放置した。デカンテーションしてエ
ーテルを除去し、残査は無水エーテル（５ｍｌ）で３回
洗浄した。この残査を減圧乾燥し、31Ｐ ＮＭＲを測定
した結果、上記で得られたスペクトルと同様であり、目
的とした２量体が回収されたことが確認できた（８８２
mg，回収率８８％）。
【００２６】（応用例２）実施例１で得られたホスホル
アゾリド化合物（in situ ＤＮＡ合成試薬）のクロロホ
ルム反応溶液（５ｍｌ，約２．５ｍｍｏｌ）に、Ｎ−ベ
ンゾイル−２’−デオキシアデノシン（８９０ｍｇ，
２．５ｍｍｏｌ）のクロロホルム／ピリジン混合溶液
（１／２（ｖ／ｖ），５ｍｌ）をアルゴン雰囲気下、０
℃で加え、そのまま一晩４℃で静置して反応させ２量化
させた。この反応溶液に、室温条件下、予め別に３時間
以上減圧乾燥させておいた硫黄粉末（１６０ｍｇ，５ｍ
ｍｏｌ）を投入し、更に１２時間攪拌した。溶媒を室温
以下の温度で減圧留去し、残査をクロロホルム（２０ｍ
ｌ）に再溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー
（クロロホルム／メタノール＝１００／３）で精製する
と、目的とする２量体（チオリン酸トリエステル）が得
られた（３．４３ｇ，収率８８％）。得られた化合物の
31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ3
Ｏ）3Ｐ＝１４０ppm，ＣＤＣｌ3）は、δ＝６６．３，
６６．０，６５．６であった。同様にＮ−イソブチリル
−２’−デオキシグアノシン（８９０ｍｇ，２．５ｍｍ
ｏｌ）のクロロホルム／ピリジン混合溶液（１／２（ｖ
／ｖ），５ｍｌ）を用いても、目的とする２量体（チオ
リン酸トリエステル）が得られた（３．１５ｇ，収率８
１％）。得られた化合物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９Ｍ
Ｈｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ppm，ＣＤＣ
ｌ3）は、δ＝６６．６，６６．２，６５．８，６５．
４であった。
アゾリド化合物（in situ ＤＮＡ合成試薬）のクロロホ
ルム反応溶液（５ｍｌ，約２．５ｍｍｏｌ）に、Ｎ−ベ
ンゾイル−２’−デオキシアデノシン（８９０ｍｇ，
２．５ｍｍｏｌ）のクロロホルム／ピリジン混合溶液
（１／２（ｖ／ｖ），５ｍｌ）をアルゴン雰囲気下、０
℃で加え、そのまま一晩４℃で静置して反応させ２量化
させた。この反応溶液に、室温条件下、予め別に３時間
以上減圧乾燥させておいた硫黄粉末（１６０ｍｇ，５ｍ
ｍｏｌ）を投入し、更に１２時間攪拌した。溶媒を室温
以下の温度で減圧留去し、残査をクロロホルム（２０ｍ
ｌ）に再溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー
（クロロホルム／メタノール＝１００／３）で精製する
と、目的とする２量体（チオリン酸トリエステル）が得
られた（３．４３ｇ，収率８８％）。得られた化合物の
31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ3
Ｏ）3Ｐ＝１４０ppm，ＣＤＣｌ3）は、δ＝６６．３，
６６．０，６５．６であった。同様にＮ−イソブチリル
−２’−デオキシグアノシン（８９０ｍｇ，２．５ｍｍ
ｏｌ）のクロロホルム／ピリジン混合溶液（１／２（ｖ
／ｖ），５ｍｌ）を用いても、目的とする２量体（チオ
リン酸トリエステル）が得られた（３．１５ｇ，収率８
１％）。得られた化合物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９Ｍ
Ｈｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ppm，ＣＤＣ
ｌ3）は、δ＝６６．６，６６．２，６５．８，６５．
４であった。
【００２７】
【発明の効果】本発明のヌクレオチド化合物は、オリゴ
ヌクレオチドの製造において、ヌクレオチド鎖を構築す
る際の出発原料として、あるいは鎖長を伸長する基本構
成単位（ビルディングブロック）として利用できる。こ
れを利用して調製する多量体は、ポリエチレングリコー
ルの性質を利用して分離・精製することが可能で、従来
法のそれと比較すると生成物の取り扱いが極めて容易と
なる。従って本発明のヌクレオチド化合物は新たな多量
体ビルディングブロックの調製に対して極めて有用であ
る。
ヌクレオチドの製造において、ヌクレオチド鎖を構築す
る際の出発原料として、あるいは鎖長を伸長する基本構
成単位（ビルディングブロック）として利用できる。こ
れを利用して調製する多量体は、ポリエチレングリコー
ルの性質を利用して分離・精製することが可能で、従来
法のそれと比較すると生成物の取り扱いが極めて容易と
なる。従って本発明のヌクレオチド化合物は新たな多量
体ビルディングブロックの調製に対して極めて有用であ
る。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年３月３０日（２０００．３．３
０）
０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】
【従来の技術】従来のオリゴデオキシリボヌクレオチド
およびオリゴリボヌクレオチドの合成に関しては、固相
合成法が採用されている。この方法に従えば、ヌクレオ
シドの３’−水酸基を多孔質ガラスなどの不溶性担体上
に固定した出発物質を用い、オリゴヌクレオチド鎖を
３’末端から５’末端方向に１塩基ずつ伸長していくの
が一般的であり、任意の配列のオリゴヌクレオチドの合
成が可能である（ケスターら、特公昭６２−５０４７９
号公報、およびカルザースら特公昭６３−２８４３９号
公報を参照）。しかしながら、上記の方法では、すべて
の工程が逐次反応によって構成されているため、どの工
程も反応収率１００％か限りなくそれに近く進行しなけ
れば、目的とする配列を有するオリゴヌクレオチドは得
られないという点が技術的に難しい。特に、ヌクレオチ
ド鎖伸長工程であるリン酸化反応工程（縮合反応）は、
現在の最高レベルでも各伸長反応毎の収率が９８．５〜
９９．５％であって、この反応収率の高低が、目的とす
る配列を有するオリゴヌクレオチドの全収率を決定す
る。最近、全収率を向上させる方策として、縮合回数を
減らすことの出来る２量体ヌクレオチドをヌクレオチド
鎖を構築する際のビルディングブロックとする合成法が
有効であるとする報告がなされている｛クロッツら，バ
イオオルガニックアンドメディシナルケミストリーレタ
ーズ（Bioorg. Med. Chem. Lett.,），1997，7，73-7
8.｝。また、上記以外にも、２量体以上をビルディング
ブロックとしたオリゴヌクレオチドの化学合成法は多く
見受けられる（例えば総説として日本化学会編, 「核酸
の化学と分子生物学−化学総説４６」, 学会出版センタ
ー, 1985, pp. 209-240.など）。しかしながら、これら
のビルディングブロックは水酸基の保護・脱保護および
リン酸化という一連の工程が非常に複雑であり、しかも
各工程で副生物や不純物を除去するために、抽出やクロ
マトグラフィーなどの操作が必要である。これらは操作
上の繁雑さを招くだけでなく、ビルディングブロックを
合成するためのコストを高くしている。
およびオリゴリボヌクレオチドの合成に関しては、固相
合成法が採用されている。この方法に従えば、ヌクレオ
シドの３’−水酸基を多孔質ガラスなどの不溶性担体上
に固定した出発物質を用い、オリゴヌクレオチド鎖を
３’末端から５’末端方向に１塩基ずつ伸長していくの
が一般的であり、任意の配列のオリゴヌクレオチドの合
成が可能である（ケスターら、特公昭６２−５０４７９
号公報、およびカルザースら特公昭６３−２８４３９号
公報を参照）。しかしながら、上記の方法では、すべて
の工程が逐次反応によって構成されているため、どの工
程も反応収率１００％か限りなくそれに近く進行しなけ
れば、目的とする配列を有するオリゴヌクレオチドは得
られないという点が技術的に難しい。特に、ヌクレオチ
ド鎖伸長工程であるリン酸化反応工程（縮合反応）は、
現在の最高レベルでも各伸長反応毎の収率が９８．５〜
９９．５％であって、この反応収率の高低が、目的とす
る配列を有するオリゴヌクレオチドの全収率を決定す
る。最近、全収率を向上させる方策として、縮合回数を
減らすことの出来る２量体ヌクレオチドをヌクレオチド
鎖を構築する際のビルディングブロックとする合成法が
有効であるとする報告がなされている｛クロッツら，バ
イオオルガニックアンドメディシナルケミストリーレタ
ーズ（Bioorg. Med. Chem. Lett.,），1997，7，73-7
8.｝。また、上記以外にも、２量体以上をビルディング
ブロックとしたオリゴヌクレオチドの化学合成法は多く
見受けられる（例えば総説として日本化学会編, 「核酸
の化学と分子生物学−化学総説４６」, 学会出版センタ
ー, 1985, pp. 209-240.など）。しかしながら、これら
のビルディングブロックは水酸基の保護・脱保護および
リン酸化という一連の工程が非常に複雑であり、しかも
各工程で副生物や不純物を除去するために、抽出やクロ
マトグラフィーなどの操作が必要である。これらは操作
上の繁雑さを招くだけでなく、ビルディングブロックを
合成するためのコストを高くしている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２０】（ｂ）上記で得られた２−シアノ−１−
（１，１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシビスイミ
ダゾリルホスフィンを重クロロホルム（２．５ｍｌ）に
溶解させて、０．５０Ｍ溶液とし、室温で２時間減圧乾
燥した５’−Ｏ，塩基保護−２’−デオキシシチジン−
ポリエチレングリコール誘導体（ポリエチレングリコー
ルの数平均分子量（Ｍｎ）３５０、式（３）においてＢ
＝シトシン誘導体，Ｒ3＝４，４’−ジメトキシトリチ
ル，Ｒ4＝水素，Ａ＝フェニレンのもの，１．２０ｇ、
１．２５ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰囲気下、室温の条件
下で加えた。均一にさせた後、そのまま一晩静置して反
応させ、目的のホスホルアゾリド化合物（Ｘ＝イミダゾ
リル，in situ ＤＮＡ合成試薬）を得た。得られた化合
物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（Ｃ
Ｈ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ 3）は、δ＝１３
４．３，１３１．５，１３０．８，１２７．４であっ
た。
（１，１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシビスイミ
ダゾリルホスフィンを重クロロホルム（２．５ｍｌ）に
溶解させて、０．５０Ｍ溶液とし、室温で２時間減圧乾
燥した５’−Ｏ，塩基保護−２’−デオキシシチジン−
ポリエチレングリコール誘導体（ポリエチレングリコー
ルの数平均分子量（Ｍｎ）３５０、式（３）においてＢ
＝シトシン誘導体，Ｒ3＝４，４’−ジメトキシトリチ
ル，Ｒ4＝水素，Ａ＝フェニレンのもの，１．２０ｇ、
１．２５ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰囲気下、室温の条件
下で加えた。均一にさせた後、そのまま一晩静置して反
応させ、目的のホスホルアゾリド化合物（Ｘ＝イミダゾ
リル，in situ ＤＮＡ合成試薬）を得た。得られた化合
物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（Ｃ
Ｈ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ 3）は、δ＝１３
４．３，１３１．５，１３０．８，１２７．４であっ
た。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】（実施例２） 前記式（１）においてＢ＝チミン誘導体、Ｒ1＝水素原
子、Ｒ2＝イソプロピル基、Ｒ3＝４，４’−ジメトキシ
トリチル基、Ｒ4＝水素原子、Ｘ＝４−メチルイミダゾ
リル基、Ａ＝フェニレン基の場合の化合物の合成 実施例１と同様な方法で、２−シアノ−１−イソプロピ
ルエトキシジクロロホスフィン（１９６ｍｇ，０．９２
ｍｍｏｌ）、トリメチルシリル−４−メチルイミダゾー
ル（０．３１ｍｌ，２．０２ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩
基保護−チミジン−ポリエチレングリコール誘導体（ポ
リエチレングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０、
式（３）においてＢ＝チミン誘導体、Ｒ3＝４，４’−
ジメトキシトリチル，Ｒ4＝水素原子，Ａ＝フェニレン
のもの，１．１９ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）より、目的の
ホスホルアゾリド化合物（Ｘ＝４−メチルイミダゾリ
ル，insitu ＤＮＡ合成試薬）を得た。得られた化合物
の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ
3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝１３
８．２，１２７．９，１２４．４であった。
子、Ｒ2＝イソプロピル基、Ｒ3＝４，４’−ジメトキシ
トリチル基、Ｒ4＝水素原子、Ｘ＝４−メチルイミダゾ
リル基、Ａ＝フェニレン基の場合の化合物の合成 実施例１と同様な方法で、２−シアノ−１−イソプロピ
ルエトキシジクロロホスフィン（１９６ｍｇ，０．９２
ｍｍｏｌ）、トリメチルシリル−４−メチルイミダゾー
ル（０．３１ｍｌ，２．０２ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩
基保護−チミジン−ポリエチレングリコール誘導体（ポ
リエチレングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０、
式（３）においてＢ＝チミン誘導体、Ｒ3＝４，４’−
ジメトキシトリチル，Ｒ4＝水素原子，Ａ＝フェニレン
のもの，１．１９ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）より、目的の
ホスホルアゾリド化合物（Ｘ＝４−メチルイミダゾリ
ル，insitu ＤＮＡ合成試薬）を得た。得られた化合物
の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ
3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝１３
８．２，１２７．９，１２４．４であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】（実施例３） 前記式（１）においてＢ＝アデニン誘導体、Ｒ1＝水素
原子、Ｒ2＝ｔ−ブチル基、Ｒ3＝４，４’−ジメトキシ
トリチル基、Ｒ4＝水素原子、Ｘ＝イミダゾリル基、Ａ
＝フェニレン基の場合の化合物の合成 実施例１と同様な方法で、２−シアノ−１−ｔ−ブチル
エトキシジクロロホスフィン（２４０ｍｇ，１．０５ｍ
ｍｏｌ）、トリメチルシリルイミダゾール（０．３４ｍ
ｌ，２．３２ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩基保護−２’−
デオキシアデノシン−ポリエチレングリコール誘導体
（ポリエチレングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５
０、式（３）においてＢ＝アデニン誘導体，Ｒ3＝４，
４’−ジメトキシトリチル，Ｒ4＝水素原子，Ａ＝フェ
ニレンのもの，１．４１ｇ、１．４０ｍｍｏｌ）より、
目的のホスホルアゾリド化合物（Ｘ＝イミダゾリル，in
situ ＤＮＡ合成試薬）を得た。得られた化合物の31Ｐ
ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3
Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝１３２．１，
１２９．２，１２８．９，１２８．５であった。
原子、Ｒ2＝ｔ−ブチル基、Ｒ3＝４，４’−ジメトキシ
トリチル基、Ｒ4＝水素原子、Ｘ＝イミダゾリル基、Ａ
＝フェニレン基の場合の化合物の合成 実施例１と同様な方法で、２−シアノ−１−ｔ−ブチル
エトキシジクロロホスフィン（２４０ｍｇ，１．０５ｍ
ｍｏｌ）、トリメチルシリルイミダゾール（０．３４ｍ
ｌ，２．３２ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩基保護−２’−
デオキシアデノシン−ポリエチレングリコール誘導体
（ポリエチレングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５
０、式（３）においてＢ＝アデニン誘導体，Ｒ3＝４，
４’−ジメトキシトリチル，Ｒ4＝水素原子，Ａ＝フェ
ニレンのもの，１．４１ｇ、１．４０ｍｍｏｌ）より、
目的のホスホルアゾリド化合物（Ｘ＝イミダゾリル，in
situ ＤＮＡ合成試薬）を得た。得られた化合物の31Ｐ
ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3
Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝１３２．１，
１２９．２，１２８．９，１２８．５であった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】（実施例４） 前記式（１）においてＢ＝グアニン誘導体、Ｒ1＝水素
原子、Ｒ2＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ3＝
４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｒ4＝水素原子、Ｘ
＝イミダゾリル基、Ａ＝ベンジレン基の場合の化合物の
合成 実施例１と同様の方法に従い、２−シアノ−１−（１，
１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシジクロロホスフ
ィン（３７９ｍｇ，１．３４ｍｍｏｌ）、トリメチルシ
リルイミダゾール（０．４３ｍｌ，２．９６ｍｍｏ
ｌ）、５’−Ｏ，塩基保護−２’−デオキシグアノシン
−ポリエチレングリコール誘導体（ポリエチレングリコ
ールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０，式（３）において
Ｂ＝グアニン誘導体，Ｒ3＝４，４'-ジメトキシトリチ
ル，Ｒ4＝水素原子，Ａ＝ベンジレンのもの，１．６２
ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）より、目的のホスホルアゾリド
化合物（Ｘ＝イミダゾリル，in situ ＤＮＡ合成試薬）
を得た。得られた化合物の31ＰＮＭＲ（１６１．９ＭＨ
ｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣ
ｌ3）は、δ＝１３２．５，１３１．６，１２８．６，
１２８．４であった。
原子、Ｒ2＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ3＝
４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｒ4＝水素原子、Ｘ
＝イミダゾリル基、Ａ＝ベンジレン基の場合の化合物の
合成 実施例１と同様の方法に従い、２−シアノ−１−（１，
１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシジクロロホスフ
ィン（３７９ｍｇ，１．３４ｍｍｏｌ）、トリメチルシ
リルイミダゾール（０．４３ｍｌ，２．９６ｍｍｏ
ｌ）、５’−Ｏ，塩基保護−２’−デオキシグアノシン
−ポリエチレングリコール誘導体（ポリエチレングリコ
ールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０，式（３）において
Ｂ＝グアニン誘導体，Ｒ3＝４，４'-ジメトキシトリチ
ル，Ｒ4＝水素原子，Ａ＝ベンジレンのもの，１．６２
ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）より、目的のホスホルアゾリド
化合物（Ｘ＝イミダゾリル，in situ ＤＮＡ合成試薬）
を得た。得られた化合物の31ＰＮＭＲ（１６１．９ＭＨ
ｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣ
ｌ3）は、δ＝１３２．５，１３１．６，１２８．６，
１２８．４であった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】（実施例５） 前記式（１）においてＢ＝グアニン誘導体、Ｒ1＝水素
原子、Ｒ2＝１，１−ジメチル−３−メチル−３−ブテ
ニル基、Ｒ3＝４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｒ4＝
水素原子、Ｘ＝イミダゾリル基、Ａ＝メチレン基の場合
の化合物の合成 実施例１と同様な方法により、２−シアノ−１−（１，
１−ジメチル−３−メチル−３−ブテニル）エトキシジ
クロロホスフィン（３８３ｍｇ，１．４３ｍｍｏｌ）、
トリメチルシリルイミダゾール（０．４６ｍｌ，３．１
４ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩基保護−２’−デオキシグ
アノシン−ポリエチレングリコール誘導体（ポリエチレ
ングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０，式（３）
においてＢ＝グアニン誘導体，Ｒ3＝４，４’−ジメト
キシトリチル，Ｒ4＝水素原子，Ａ＝メチレン基のも
の，１．５０ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）より、目的のホス
ホルアゾリド化合物（Ｘ＝イミダゾリル，in situ ＤＮ
Ａ合成試薬）を得た。得られた化合物の31Ｐ ＮＭＲ
（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４
０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝１３２．４，１２９．
０，１２８．５，１２８．４であった。
原子、Ｒ2＝１，１−ジメチル−３−メチル−３−ブテ
ニル基、Ｒ3＝４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｒ4＝
水素原子、Ｘ＝イミダゾリル基、Ａ＝メチレン基の場合
の化合物の合成 実施例１と同様な方法により、２−シアノ−１−（１，
１−ジメチル−３−メチル−３−ブテニル）エトキシジ
クロロホスフィン（３８３ｍｇ，１．４３ｍｍｏｌ）、
トリメチルシリルイミダゾール（０．４６ｍｌ，３．１
４ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩基保護−２’−デオキシグ
アノシン−ポリエチレングリコール誘導体（ポリエチレ
ングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０，式（３）
においてＢ＝グアニン誘導体，Ｒ3＝４，４’−ジメト
キシトリチル，Ｒ4＝水素原子，Ａ＝メチレン基のも
の，１．５０ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）より、目的のホス
ホルアゾリド化合物（Ｘ＝イミダゾリル，in situ ＤＮ
Ａ合成試薬）を得た。得られた化合物の31Ｐ ＮＭＲ
（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４
０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝１３２．４，１２９．
０，１２８．５，１２８．４であった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】（応用例１）実施例１で得られたホスホル
アゾリド化合物（in situ ＤＮＡ合成試薬）の重クロロ
ホルム反応溶液（２．０ｍｌ，約１ｍｍｏｌ）に、塩基
保護−２’−デオキシシチジン−ポリエチレングリコー
ル誘導体（ポリエチレングリコールの数平均分子量（Ｍ
ｎ）３５０，式（３）においてＢ＝シトシン誘導体，Ｒ
3＝Ｒ4＝水素原子，Ａ＝フェニレンのもの，６５０ｍ
ｇ，１ｍｍｏｌ）の重クロロホルム溶液（２ｍｌ）をア
ルゴン雰囲気下、０℃で加え、そのまま一晩４℃で静置
して反応させ２量体を得た。この時の第２番目のヌクレ
オシドの水酸基の反応選択性は、31Ｐ ＮＭＲによると
５’水酸基／３’水酸基＝９２／８であった。得られた
化合物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；
（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝
１４１．７，１４１．０，１４０．８，１４０．４であ
った。上記の反応溶液の一部（２ｍｌ，総重量２．９５
ｇ，約０．５ｍｍｏｌ）を測り取り、これを無水ジエチ
ルエーテル（３０ｍｌ）に攪拌しながら加えると、２〜
５分で白色の固体が析出した。更に１０分間激しく攪拌
した後、４℃で一晩放置した。デカンテーションしてエ
ーテルを除去し、残査は無水エーテル（５ｍｌ）で３回
洗浄した。この残査を減圧乾燥し、31Ｐ ＮＭＲを測定
した結果、上記で得られたスペクトルと同様であり、目
的とした２量体が回収されたことが確認できた（８８２
mg，回収率８８％）。
アゾリド化合物（in situ ＤＮＡ合成試薬）の重クロロ
ホルム反応溶液（２．０ｍｌ，約１ｍｍｏｌ）に、塩基
保護−２’−デオキシシチジン−ポリエチレングリコー
ル誘導体（ポリエチレングリコールの数平均分子量（Ｍ
ｎ）３５０，式（３）においてＢ＝シトシン誘導体，Ｒ
3＝Ｒ4＝水素原子，Ａ＝フェニレンのもの，６５０ｍ
ｇ，１ｍｍｏｌ）の重クロロホルム溶液（２ｍｌ）をア
ルゴン雰囲気下、０℃で加え、そのまま一晩４℃で静置
して反応させ２量体を得た。この時の第２番目のヌクレ
オシドの水酸基の反応選択性は、31Ｐ ＮＭＲによると
５’水酸基／３’水酸基＝９２／８であった。得られた
化合物の31Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；
（ＣＨ3Ｏ）3Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）は、δ＝
１４１．７，１４１．０，１４０．８，１４０．４であ
った。上記の反応溶液の一部（２ｍｌ，総重量２．９５
ｇ，約０．５ｍｍｏｌ）を測り取り、これを無水ジエチ
ルエーテル（３０ｍｌ）に攪拌しながら加えると、２〜
５分で白色の固体が析出した。更に１０分間激しく攪拌
した後、４℃で一晩放置した。デカンテーションしてエ
ーテルを除去し、残査は無水エーテル（５ｍｌ）で３回
洗浄した。この残査を減圧乾燥し、31Ｐ ＮＭＲを測定
した結果、上記で得られたスペクトルと同様であり、目
的とした２量体が回収されたことが確認できた（８８２
mg，回収率８８％）。
Claims (1)
- 【請求項１】下記式（１）で表されるヌクレオチド化合
物。 【化１】 （式中、Ｂはヌクレオチド化学において通常用いられる
核酸塩基を示し、Ｒ1およびＲ2は水素原子、ヘテロ原子
を含んでいてもよいアルキル基、シクロアルキル基、ア
リール基もしくはアラルキル基を示し、Ｒ1とＲ2は同一
であっても異なっていても良く、Ｒ3はヌクレオチド化
学において通常用いられる保護基を示し、Ｒ4は水素原
子、水酸基、アルコキシ基またはトリアルキルシリルオ
キシ基を示し、Ｘはジアルキルアミノ基、アゾリル基も
しくは飽和窒素複素環を示し、ｎは３以上の整数、Ａは
２価基でアリレン基もしくはヘテロ原子を含んでも良い
直鎖あるいは分岐鎖を含むアルキレン基を示す。）
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13988299A JP3485024B2 (ja) | 1999-05-20 | 1999-05-20 | ヌクレオチド化合物 |
| US09/471,802 US6380378B1 (en) | 1998-12-24 | 1999-12-23 | Nucleotide compound, nucleotide block oligonucleotide, and method for producing them |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13988299A JP3485024B2 (ja) | 1999-05-20 | 1999-05-20 | ヌクレオチド化合物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000327695A true JP2000327695A (ja) | 2000-11-28 |
| JP3485024B2 JP3485024B2 (ja) | 2004-01-13 |
Family
ID=15255787
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13988299A Expired - Fee Related JP3485024B2 (ja) | 1998-12-24 | 1999-05-20 | ヌクレオチド化合物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3485024B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1379257A2 (en) * | 2001-03-23 | 2004-01-14 | Enzon, Inc. | Prodrugs of anticancer agents employing substituted aromatic acids |
-
1999
- 1999-05-20 JP JP13988299A patent/JP3485024B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1379257A2 (en) * | 2001-03-23 | 2004-01-14 | Enzon, Inc. | Prodrugs of anticancer agents employing substituted aromatic acids |
| EP1379257A4 (en) * | 2001-03-23 | 2005-02-02 | Enzon Inc | PROMOTERS OF ANTICANCER AGENTS BASED ON SUBSTITUTED AROMATIC ACIDS |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3485024B2 (ja) | 2004-01-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |