PT98963B - Processo para a preparacao de compostos intermediarios para a sintese quimica de oligonucleotidos e para a preparacao de derivados de nucleosidos, de nucleotidos e de oligonucleotidos, utilizado esses intermediarios - Google Patents
Processo para a preparacao de compostos intermediarios para a sintese quimica de oligonucleotidos e para a preparacao de derivados de nucleosidos, de nucleotidos e de oligonucleotidos, utilizado esses intermediarios Download PDFInfo
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Description
Descrição
A policondensação química dos mononucleétidos é um método importante para a preparação de ácido desoxiribonucleico (ADN) ou ácido ribonucleioo (ARN).
problema de base na síntese química do DNS ou RNS é a descoberta de grupos de bloqueio apropriados dos grupes amino e hidroxi das bases nucleásidos e dos resíduos de açúcar. Estes grupos de bloqueio por um lado, nas condições de reacção de polieondensação, isto é, durante a formaçã© da ligação fosfodiéster, tem que ser estáveis e, por outro lado, tem que ser sufioientemente dissociáveis para poderem ser facilmente eliminados no termo da reacção sem dissociar a ligação fosfodiéster (H. G, Khoranaj Pure Appl. Chem. 1£ (1968) 549).
A síntese química de ARN é particularmente problemática visto que o resíduo de açúcar ribose transporta 2 grupos hidroxi que tem que ser ambos protegidos. 0 grupo de bloqueio do grupo 5’-hidroxi, no presente caso, tem que ser dissociado de novo selectivamente antes de cada passo de policondensaçâo, isto é, sem a dissociação do grupo de bloqueio de 2’-hidroxi. 0 grupo de bloqueio do grupo 2*-hidroxi, pelo contrário, deve ser dissociado somente no termo da síntese de ARN, e nomeadamente em condições gue não conduzam a qualquer dissociação ou isomerização das ligações fosfodiéster (C.B. Reese, Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol. 3 (F. Eckstein & D. M. J. Lilley eds.) Springer-Verlag, Weinheim).
uma possibilidade para a dissociação selectiva dos grupos de bloqueio de 5*-hidroxi sem a dissociação dos grupos de bloqueio de 2‘-hidroxi é conseguida através da combinação de um grupo de bloqueio de 5’-hidroxidissociável por bases, com um grupo de bloqueio de 2’-hidroxi dissociável por ácidos (Ghr. Lehemann et al (1989) Nucleic Acids Res. 17, 2379-2390, ns 7). A utilização de um grupo de bloqueio de 5'-hidroxi separável por bases também é Vantajoso na síntese de ADN, visto que nas condições de hidrólise não ácida suaves as ligações de fosfodiéster ou fos fotriéster, já formadas na síntese em geral não são dissociadas. Além disso, nas condições de hidrólise não ácida sUaves tem lugar uma despurinação dos nucleótidos, como é descrita por E. Sonveaux (E. Sonveaux (1986) Biorganic Chemistry
14,286). uma outra exigência posta aos grupos de bloqueio de 5’-hidroxi, tanto na síntese de ADN como também na de ARN, é uma possibilidade de verificação fácil e altamente sensível dos grupos de bloqueio. Deste modo, o grau de reacção dos passos de reacção individuais pode ser acompanhado de forma especialmente boa e consegue-se obter uma reacção praticamente completa. Deste modo é possível preparar, com elevado rendimento gligonucleótidos especialmente longos.
Isto permite também a realização de pequenas instalações de
síntese à escala nanomolar e picomolar.
Descobriu-se agora, surpreendentemente, que o grupo dansil-etoxicarbonilo (âans-EOC) pode ser utilizado como grupo de bloqueio de 5'-hidroxi dissociável por base na síntese química de oligonucleótidos.
objectivo da invenção é, por conseguin tei
Um processo para a preparação do composto de fórmula (I)
N(CH,)..HC1 J 2
(I)
II
SO CH2CH2OCC1 o que e caracterizado por se fazer reagir o composto de fórmula (II)
(II),
SO CH2CH2OH com um composto dador de clorocarbonilo.
Um composto de fórmula (illa) ou (illb)
nas quais:
R1 representa hidrogénio ou independentemente um do outro representa um grupo de fórmula ,OCH.
\ / 3
-O-Si-C(CH3) ,
I
CH3
e β representa
em que R , em cada caso independentemente um do outro, re presentam um grupo de fórmula
em que R t em cada caso independentemente um do outro, representa hidrogénio ou
-oh2°h2NO.
R representa
ou
Y representa hidrogénio, alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, especialmente metilo.
3£. Um processo para a preparação de um composto de formula (Illa) ou (IIIb) por reacção do composto de fórmula (I) com um correspondente composto de fórmula (IVa) ou (IVb)
(IVa)
(IVb) nas guais R e B tem os significados indicados acima, na presença de uma base, de preferência piridina, ou de uma mistura constituída por tetràhidrofurano, dioxano, cloreto de metileno, clorofórmio e/ou acetonitrilo e um composto de fórmula
21 22 em que R , R e R são iguais ou independentemente uns dos outros, são diferentes e representam hidrogénio ou o radical alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, de preferência um grupo trimetilo, trietilo ou diisopropilo.
Um composto de fórmula (Va) ou (vb)
nas quais
DansEOC, R e B tem os significados anteriormente indicados 6 7 e R / R são iguais ou, independentemente um do outro, são diferentes e representam um grupo alquilo com 1 a 8 átomos de carbono, de preferência um grupo isopropilo, ou um grupo cicloalquilo com 5 a 12 átomos de carbono, de preferência tendo até 8 átomos de carbono, um grupo benzilo ou fenilo, ou conjuntamente com o átomo de azoto ao qual estão ligados formam um anel heterocíclico saturado ou insaturado, que pode eventualmente conter outros heteroátomos e substituintes e
R representa um grupo de fórmula
- 8 -CH2CH2
NO
2'
Cl
OU CHg, ou um grupo benzilo que não está substituído, ou está substituído no anel uma ou mais vezes, mas de preferência não está substituído, sendo o ou os seus substituintes, independer temente uns dos outros, um átomo de halogéneo, um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, um grupo nitro, metoxi ou carboxilo.
52. Um processo para a preparação de um composto de fórmula (Va) ou (Vb) por reacção do composto de fórmula (Illa) ou (Illb) com um composto de fórmula (VI)
Z »
R7R6NPOR8 (VI)
7 8 na qual R , R e R tem os significados anteriormente indicados e 2 representa cloro ou bromo ou um radical de fórmula
10 9 10
-NR R . na qual para R e R , independentemente um do outro, interessam os mesmos radicais que para R^ se Z representar cloro, na presença de uma base, de preferência piridina, ou de uma mistura de tetrahidrofurano, dioxano, cloreto de metileno, clorofórmio e/ou acetonitrilo com uma trialguilamina possuindo 1 a 4 átomos de carbono em cada grupo alquilo, de preferência uma trimetilamina, trietilamina ou diisopropiletilamina, ou se Z representar um radical de fórmula -NR^R^, a reacção na presença de um composto de fórmula (+)χ(-> , /-hnri:lr12r13_7
12 13 na qual R , R , R indepenêentemente uns dos outros são iguais ou diferentes e representam um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono e X representa halogéneo, especialmente cloro, ou tetrazol, de preferência na presença de tetrazol.
Um processo para a preparação de oligonucleótidos a partir dos compostos de fórmula (Va) e/ou (vb), o qual é caracterizado por se fazer reagir um composto de fórmula (Va) ou (Vb) com um composto de fórmula (Vila) ou (Vllb)
(vila) ou
(Vllb) nas quais B e R^ tem os significados indicados acima 1 e G ou tem o mesmo significado que R , ou representa um suporte polimérico que está ligado ao composto de fórmula (Vila) ou (VIIb) através dos grupos 2*-hidroxi ou 3*-hidroxi.
2. se oxidar o composto obtido.
3s se dissociar o grupo dansiletoxicarbonilo, se fazer reagir o composto obtido com um composto de fórmula (Va) ou (Vb) e se repetirem os passos de reacção 2 a 4 até se obter o comprimento de cadeia pretendido.
7s
(VlIIa) ou (VlIIb) um composto de fórmula
(VlIIb) nas quais DansEOC, R e B tem os significados indica(t) <
dos acima e K representa um catião, especialmente
Z“hn(c2h5)3_7 (+).
Um processo para a preparação de um composto de fórmula (VlIIa) ou (VlIIb) por reacção de um composto de fórmula (IIIa) ou (Illb) com um composto de fórmula (IX)
15 16 PR R R
15 16 na qual R , R , R são iguais ou, independentemente uns dos outros, são diferentes e representam hidrogénio ou um grupo alquilo com 1 a 8 átomos de carbono, um grupo fluoralquilo com 1 a 8 átomos de carbono ou um grupo arilo, de preferência um grupo 2, 2, 2-trifluoretilo, 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propilo, etilo ou fenilo, na presença de uma base.
Um processo para a preparação âe um composto âe fórmula (villa) ou (VIHb) por reacção de um composto de fórmula (Illa) ou (Illb) com um composto de fórmula (X) pr17r18r19
18 19 na qual R , R e R são iguais ou diferentes e independentemente uns dos outros representam cloro, bromo ou um grupo alquilamino com 1 a 8 átomos de carbono ou um grupo 1,2,4-triazolilo, de preferência um grupo 1,2,4-triazolilo, na presença de uma base, e por em seguida se hidrolisar.
los Um processo para a preparação de oligonucleótidos a partir de compostos de fórmula (villa) e/ou (VIHb), o qual é caracterizado por se fazer reagir um composto de fórmula (Villa) ou (VIHb) is com um composto de fórmula (Vila) ou (Vllb), se dissociar o grupo dansiletoxicarbonilo, se fazer reagir o composto obtido com um composto de fórmula (VIIIa) ou (VIHb)
4S se repetirem os passos de reacção 2 e 3 até se obter α comprimento de cadeia pretendido e se oxidar o oligonucleótido obtido.
Para a introdução do grupo dansiletoxi carbonilo no nucleósido fez-se reagir o cloridrato de cloroformiato de 2-dansiletilo com um nucleósido no qual, consoan te o nucleósido, as funções amino ou hidroxi do nucleósido base estão protegidas por grupos apropriados. Como grupos de bloqueio prestam-se por exemplo para o grupo 6-amino da adenina, os grupos t-butilcarbonilo, benzoilo, 4-(t-butil)-benzoilo ou grupos para-nitrofeniletiloxicarbonilo, especialmente os grupos benzoilo ou para-nitrofeniletiloxicarbonilo.
Para os grupos 2-amino de guanina prestara-se por exemplo os grupos isobutirilo, 4-(t-butil )-feni· lacetilo ou para-nitrofeniletiloxicarbonilo, especialmente o grupo isobutitilo ou o grupo para-nitrofeniletiloxicarbonilo. 0 grupo 6-hidroxi de guanina ou o grupo 4-bidroxi de uracilo ou permanecem em geral não bloqueados, ou são bloqueados por um grupo para-nitrofeniletilo. No caso de citosina o grupo 4-amino é protegido por exemplo por um grupo benzoilo, 4-(t-butil)-benzoilo ou para-nitrofeniletiloxicarbonilo, especialmente o grupo benzoilo ou o grupo para-nitroetiloxicarbonilo. A timidina em geral permanece não bloqueada. No caso da uridina o grupo 3-N é protegido por exemplo por um grupo Boc ou anisoilo.
Em vez das bases nucleósido naturais podem também ser utilizadas bases nucleósido modificadas, cujos grupos amino ou hidroxi podem estar bloqueados de forma análoga pelos grupos de bloqueio mencionados acima.
Os exemplos de nucleósidos com bases modificadas são os nucleósidos inosina, 8-aza-7-desazaadenosina, tubercidina, nebularina, xantosina, 2-aminoadenDsina ou piridopirimidina Os nucleósidos existem comercialmente e a introdução dos grupos de bloqueio individuais pode ser realizada por exemplo de acordo com C. Lehmann et al. (1989), C. B. Reese (1989) /The Chemical Synthesis of Oligo and Polyribonucleotides'' in Nucleic Acids and Molecular Biology 3_, F. Eckstein & D. M. J. Lilley (eds.), Springer Verlag Berlin, Heidelberg_7# E. Sonveaux (1986(, Bioorganic Cftemistry 14, 274-325 ou E. Uhlmann & A. Peyman (1990), Chemical Reviews 90, 543-584, Ns 4.
No caso da utilização de ribonucleótidos, adicionalmente aos grupos hidroxi e amino das bases nucleótido, tem também que ser bloqueados os grupos 2'-hidroxi do radical ribose. Como já foi referido, é importante para a síntese de RNS, através da escolha de uma combinação apropriada de grupos de bloqueio de 5’-hidroxi e
2'~hidroxi, poderem ser eliminados selectivamente os grupos de bloqueio de 5'-hidroxi, isto é, sem dissociação dos grupos de bloqueio de 2'-hidroxi.
Na presença de grupos de bloqueio de 2'-hidroxi separáveis em meio ácido, o grupo dansiletoxicarbonilo pode agora ser dissociado selectivamente corro grupo de bloqueio de 5*-hidroxi em condições não ácidas. Como grupos de bloqueio de 2'-hidroxi separáveis em meio ácido podem ser utilizados por exemplo, os grupos 4-metoxitetrahidropirano-4-ilo, tetrahidropiranilo, t-butil-dimetilsililo, 2-nitrobenzilo, 1-(2-cloro-4-metilfenil)-4-metoxipiperidino-4-ilo ou o grupo 1-(2-fluorofenil)-4-metoxipiperidino-4-ilo. A dissociação dos grupos dansiletoxicarbonilo é realizada de preferência num dissolvente polar aprótico, especiaimente acetonitrilo ou piridina, com auxílio de 1 a 3 equivalentes e de preferência 1,5 a 2,5 equivalentes molares de DBU (= 1,5-diazobiciclo /~5.4.O__7 undeca-5-eno). Como alternativa podem ser utilizadas para a dissociação outras bases, tais como tmg (= N^N^N^l^tetrametilguanidina) ou trialquilaminas com 1 a 4 átomos de carbono em cada grupo alquilo, como por exemplo trietilamina.
cloridrato do cloroformiato de 2dansiletilo, como composto de partida dos grupos de bloqueio de 5'-hidroxi do radical ribose ou do radical desoxiribose, foi preparado por reacção de 2-dansiletanol com um dador de clorocarbonilo, como por exemplo cloroformiato de triclorometilo (difosgeno) e/ou com fosgeno, de preferência o cloroformiato de triclorometilo, na presença de um dissolvente aprótico polar. Numa forma de realização preferida a reacção foi realizada na presença de um unico dissolvente aprótico polar, especialmente na presença de acetonitrilo. A proporção molar de 2-dansiletanol para o dtdor de clorocarbonilo era de 0, 5 - 1 para 1-2, de preferência 1 para 1-2, especialmente 1 para 1,5-2.A temperatura da reacção situou-se num intervalo compreendido desde -20°C até ao ponto de ebulição da mistura reactiva, de preferência de -5°C até +20°C, especialrrente de 0°C a 5°C.
De acordo com o processo da presente invenção o cloridrato de cloroformiato de 2-dansiletilo precipita como um produto puro e com a sua composição confirmada por análise elementar. Isto é de facto surpreendente, visto que A. Dakadate et al (A. Takadate et al (1983)
Yakugaku Zasshi 103, 982-966) por reacção de 2-dansiletanol com cloroformiato de triclorometilo, obtiveram um produto cujo ponto de fusão é mais baixo cerca de 20°C do que o produto sintetizado no processo citado. 0 2-dansiletanol pode ser preparado por exemplo de acordo com S. Goya et al (1981) (S. Goya et al (1981) Yakugaku Zasshi 101, 1164).
A reacção do cloridrato do cloroformiato de 2-dansiletilo com o nucleõsido bloqueado pode ser realizada por exemplo analogamente à reacção com cloreto de 9-fluorenilmetoxicarbonilo de acordo com C. Lehmann et al, na presença de uma base. Como bases prestam-se bases orgânicas, especialmente piridina ou uma mistura constituida por tetrahidrofurano, dioxano, cloreto de metileno, clorofórmio e/ou acetonitrilo e um composto de fórmula
NR
2Or21r22
21 22 na qual R , R e R são iguais ou são diferentes independentemente entre si e representam hidrogénio ou um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, de preferência um grupo trimetilo, trietilo ou diisopropilo. Se neste caso se utilizar como substrato um ribonucleósido protegido na posição 2*, forma-se então um produto misto constituito pelo dansiletiloxicarbonil-ribonucleósido e o bis-dansiletiloxicarbonil-ribonucleósido como produto secundário. Este produto misto pode ser utilizado directamente na reacção subsequente de fosforilação. Preferivelmente a mistura pode também ser purificada, por exemplo por meio de cromatografia instantânea.
bis-dansiletiloxicarbonil-ribonucleósido separado pode então ser dissociado em seguida no ribonucleósido sem grupos dansilo, por exemplo com DBU, o qual pode ser de novo utilizado como composto de partida para a reacção de dansilação.
Para a construção de oligonubonucleótidos com acoplamento 2’, 5’ que, por exemplo, como triadenilato ou tetraadeàilato inibem a biossíntese da proteína (Kerr, I., M. & Brown, R. E. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei.
USA 75, 256-260) pode-se fazer reagir um nucleósido bloqueado de acordo com a descrição anterior, com um grupo 2‘-hidroxi livre, de modo análogo com cloridrato de cloroformiato de 2-dansiletilo.
nucleósido dansilado, com os grupos 2*-hidroxi ou 3'-hidroxi ainda livres no radical açúcar, é em geral fosfitilado. Oomo reagente de fosfitilação pode ser utilizado por exemplo o composto de fórmula (VI) t
R?R6NPOR (VI), na quali 6 7
R , R são iguais ou, independentemente um do outro são diferentes, e representam grupos alquilo com 1 a 8 átomos de carbono, de preferência um grupo isopropilo, ou um grupo cicloalquilo com 5 a 12 átomos de carbono, de preferência tendo até 8 átomos de carbono, um grupo benzilo ou um grupo fenilo, ou em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados formam um anel heterocíclico saturado ou insaturado que pode eventualmente conter outros heteroátomos e substituintes.
R representa um grupo de fórmula
-CH2CH2 //
Cl M02-
Cl, ou -CH3 ou um grupo benzilo, o qual não está substituido ou está substituido uma ou mais vezes no anel, mas de preferência está insubstituído, sendo o ou os substituintes, independentemente uns dos outros, por exemplo um átomo de halogénio, um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, nitro, metoxi ou carboxilo,
Z representa cloro, bromo ou um radical de fórmula
10 9 10
-NR R , em que R , R são iguais ou sao diferentes independentemente entre si e representam um grupo alquilo com 1 a 8.átomos de carbono, de preferência um grupo isopropilo ou um grupo ciclo-alquilo com 5 a 12 átomosxde carbono, tendo de preferência até 8 átomos de carbono um grupo benzilo ou um grupo fenilo.
Utilizou-se preferivelmente como reagente de fosfitilação um composto de fórmula (VII) no qual
7 representa cloro, R e R representam cada um radical isopropilo e Εθ representa um grupo de fórmula
A reacção foi realizada na generalidade num dissolvente orgânico, tal como tetrahidrof urano ou cloreto de metileno, de preferência cloreto de metileno, na presença de 1 a 8 equivalentes molares, de preferência 1 a
equivalentes e especialmente 1 a 4 equivalentes molares de uma base orgânica, tal como piridina, ou de uma mistura de tetràhidrofurano (THF), dioxano, cloreto de metileno, clorofórmio e/ou acetonitrilo e uma trialquilamina com 1 a 4 átomos de carbono em cada grupo alquilo, de preferência uma trimetilamina, trietilamina ou diisopropiletilamina, especialmente a diisopropiletilamina. Se Z representar um radical de fórmula -NR^R^°, realizou-se a reacção de preferência na presença de um composto de fórmula / HNRllR12Rl3--7
12 13 na qual RA , R , R são iguais ou independentemente uns dos outros são diferentes e representam um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono e representa halogeneto, especialmente um cloreto, ou uma tetrazolida, ou tetrazol, de preferência na presença de tetrazol. A relação molar de nucleósido dansilado para o reagente de fosfitilação foi de 1 para 1-4, de preferencia 1 para 2-4, especialmente 1 para 2, 5-3, 5.
Os compostos de fórmula (Va) ou (Vb) assim obtidos podem em seguida ser utilizados para a a síntese de oligonucleótidos. Nesse caso os radicais de açúcar dos nucleótidos para a síntese do ADN são desoxiribose, para a síntese de ARN são ribose. mas também podem ser misturadas de desoxiribase e ribose para a síntese de um oligonucleótido consistindo em radicais de açúcar desoxiribose e ribose dispostos regular ou irregularmente. Além disso o oligonocueótido pode ser construído regular ou irregularmente a partir de mononucleótidos de fórmulas (Va) e (Vb). A síntese de oligonucleótidos ou polinucleótidos pode ser realizada de forma análoga ao método de fosforamidite, tal como é descrito por exemplo por Chr. Lehmann et al (1989).
Basicamente existem 2 posssibilidades de sintetizar oligonucleótidos. Numa delas a síntese pode ser realizada em solução, por exemplo de harmonia com o método descrito por C. B. Reese (C.B. Reese (1989)
The Chemical Synthesis of Oligo- and Poly-ribonucleótides in Nucleic Acids and Molecular Biology (F. Eckstein &
D.M.J. Lilley, eds.) 3, 164-181).
Por outro lado a síntese de oligonucleótidos pode ser realizada em fase sólida, por exemplo sobre o vidro funcionalizado para nucleósidos (κ. P. Stengele St W. Pfleiderer (1989) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 21, 101,
K. P. Stangele & W. Pfleiderer (1990) Tetrahedron Lett. 31, 2549 ou Chr. Lehmann et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 2379-2390, N2 7).
Em geral a síntese em fases sólida é o método preferido.
No presente caso escolheu-se por exemplo o seguinte sequência reactiva:
ls Reacção de um composto de fórmula (Va) ou (Vb) com o nucleósido de fórmula (Vila) ou (Vllb)
na qual 3 e R tem os significados indicados acima, e G tem o mesmo significado que R1, ou representa um suporte polimérico que está ligado através dos grupos 2'-hidroxi ou 3‘-hidroxi ao composto de fórmula (Vila) ou (Vllb), na presença de um ácido fraco, por exemplo tetrazol ou p-nitrofeniltetrazol.
Retenção dos compostos de fórmula (Vila) ou (Vllb) não reagidos, por exemplo com anidrido acético.
Oxidação a fosfato, fosforamidato ou a tiofosfato, por exemplo com iodo, enxofre ou iodo/amina:
Dissociação do grupo dansiletoxicarbonilo, por exemplo com DBU em acetonitrilo.
Reacção do composto ligado ao suporte, assim como obtido, com um composto de fórmula (Va) ou (Vb):
Repetição dos passos de reacção 2 a 6 até ao comprimento de cadeia pretendidos do oligonucleótido.
Os compostos de fórmulas (Va) ou (Vb) ou (vllb) ou (vila) foram submetidos à reacção de preferência a -20 até +1OO°C, especialmente à temperatura ambiente, na presença de por exemplo tetrazol ou para-nitrofenil-tetra zol como ácidos fracos. A oxidação foi realizada a uma temperatura desde -80 até 1OO°C, de preferência a -20 até +60°C na presença de iodo, enxofre, ou iodo na presença de u.ma amina (A. Jager et al, Biochemistry 27, 7237 (1988)).
Quando se utilizou uma mistura de iodo, água e uma base orgâ nica tal como lutidina ou piridina, realiza-se então a oxidação de preferência à temperatura ambiente. Se, pelo contrário, se utilizou uma mistura de enxofre elementar, tolueno e uma base orgânica, realizou-se então a oxidação de preferência a 60°C.
Os oligunucleótidos sintetisados consistiam em geral em £ até cerca de 200 mononucleótidos, de preferência 2 a 100 mononucleótidos e especialmente 2 a 20 monoulcleótidos.
Em alternativa à fosfitilação, o nucleósido dansilado, com os grupos 2’-hidroxi ou 3’-hidroxi ainda livres no radical de açúcar, pode também ser submetito a reacção com obtenção de H-fosfonato de fórmula (VlIIa) ou (Vlllb).
Dans-EOC-O-CH^
Dans-EOC-O-CH, (villa) (VlIIto)
O=P - H 'θκ© na qual DansEOC, R1 e B tem os significados indicados acima (+) e K representa um catião, especialmente /“NH (C0H(-)- / (J.) λ O O* , (R. Stromberg, Chem. Commun. 1987, 1? B.C. Froebler, P. G. Ng, M. D. Matteucci, Nucleic Acids Res. 14 (1986)
5389; M. Thhalu et al., Chem. Lett. 1988, 1675).
Neste caso faz-se em geral reagir um (Illa) ou (IIIb) com um composto de fór* (IX) (X)
R são iguais ou independentemente uns dos outros são diferentes e representam hidrogénio ou um grupo alquilo com 1 a 8 átomos de carbono, fluoroalquilo com 1 a 8 átomos de carbono ou arilo, e R , R , R são iguais ou indepenêentemente uns dos outros são diferentes e representam cloro, bromo, ou um grupo alquilamino com 1 a composto de formula mula (IX) ou (X) ^14R15R16 PR17R18R19 • T,14 D15 nas auais R , R .
a©
átomos de carbono ou um grupo 1, 2,4-triazolilo.
nucleósido dansilado foi submetido a reacção de preferência com H-fosfonato de bis(2, 2, 2-trifluoroetilo), fosfonato de bis(1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propi~ lo), fosfito de trietilo, fosfito de trifenilo ou com PClg, tri-(dialquilamino)-fosfinas ou fosfito de tris-(l, 2,4-triazolfo), de preferência fosfito de tris-(1, 2,4-triazolilo,' e especialmente de preferência com PClg depois de activação com imidazol/trietilamina e em seguida hidrólise para obtenção de H-fosfonato.
A reacção foi realizada num dissolvente orgânico# como por exemplo tetrahidrofurano ou cloreto de metileno# de preferência, cloreto de metileno, na presença de 1 a 50 equivalentes molares, de preferência 10 a 50 e especialmente 30 a 50 equivalentes molares de uma base orgânica, como por exemplo trialquilamina com 1 a 4 átomos de carbono em cada grupo alquilo, ou N-alquilmorfolina com 1 a 4 átomos de carbono no grupo alquilo, de preferência N-metilmorfolina. A relação molar do nucleósido dansilado para o reagente ie fosfdinilação era de 1 para 1-10, de preferência 1 para 2-8, especialmente 1 para 5.
Os compostos de fórmula (Vllla) ou (villb) assim obtidos podem em seguida ser utilizados para a síntese de oligonucleótidos.
Neste caso os radicais de açúcar do nucleótido para a síntese de ADN são desoxiribose, para a síntese de ARN são ribose, mas também podem ser utilizados misturas de desoxiribose e ribose para a síntese de um oligonucleótido constituído por radicais de açúcar desoxiribose e ribose dispostos regular ou irregularmente. Além disso o oligonucleótido pode ser construido regular ou irregularmente a partir de monocnucleótidos de fórmula (Vllla) ou (Villb).
A síntese dos oligonucleótidos pode ser realizada de acordo com o método do H-fosfonato, como é descrito por exemplo por B.C. Froehler et al (Froehler,
B.C. (1986) Nucleic Acids Res. 14, 5399-5407, u2 13) sendo a dissociação em meio ácido do grupo de bloqueio de 5’-hidroxi substituida pela dissociação em meio básico do grupo dansiletoxicarbonilo.
Basicamente a síntese pode ser realizada ou em solução, por exemplo analogamente ao processo de acordo com C.B, Reese (1989), ou fsse sólida, por exemplo analogamente ao processo de acordo com B.C. Froehler (1986). Em geral é preferido a síntese em fase sólida.
Neste caso escolheu-se de preferência a seguinte sequência reactiva:
is Reacção de um composto de fórmula (VlIIa) ou (VlIIb) com o suporte polimárico de fórmula (Vila) ou (Vllb) associado ao nucleósído, na presençade um cloreto de acilo, por exemplo cloreto de pivaloilo ou cloreto de adamantoilo?
2S Dissociação do grupo dansiletoxicarbonilo, por exemplo com DBU?
3£ Reacção do composto obtido com um composto de fórmula (VlIIa) ou (VlIIb)?
4Ô Repetição dos passos 2 e 3 até à obtenção do comprimento de cadeia pretendido do oligonucleótido;
Oxidação ao fosfato, fosforamidato ou ao tiofosfato, por exemplo com iodeto ou enxofre, ou com amina/CCl4/ /trifenilfosfina (Jager et al, var acima).
Os compostos de fórmulas (VlIIa) ou (VlIIb) e (Vila) a (VlIIb) foram submetidos a reacção por
exemplo a uma temperatura desde -20°C até +100°C, especialmente à temperatura ambiente, na presença de por exemplo cloreto de pivaloilo como ácido.A oxidação foi realizada por exemplo com iodo numa mistura de dissolventes constituída em geral por piridina, N-metilimidazol, água, tetrahidrofurano, à temperatura ambiente.
Os oligunucleótidos sintetizados de acordo com o método de H-fosfonato descrito consisti tuiam em geral 2 até cerca de 200 e de preferência 2 a 110, especialmente 2 a 40 mononucleótidos.
A vantagem da síntese de oligonucleóti•dos a partir de mononucleótidos dansilados, de acordo com o método da fosforoamidite ou o método de H-fosfonato, são:
a) Fácil comprovação do grupo dansilo devido à sua forte fluorescência a 550 nm
b) Síntese de polinucleótidos ou de oligonucleótidos â escala picomolar;
c) Eliminação do grupo de bloqueio dansilo de 5‘-hidroxi sem dissociação de outros grupos de bloqueio de hidroxi na base nucleótido ou no radical de açúcar:
d) Síntese de oligonubonucleótidos ou oligodesoxiribonucleótidos, especialmente de oligoribonucleótidos,
e) Síntese em fase sólida de oligonucleótidos com elevado rendimento e de comprimentos de cadeia grandes.
Uma outra vantagem da utilização dos grupos de bloqueio dansilo de 5‘-hidroxi na síntese de ARN é o facto de, no termo da síntese, os grupos 2'-hidroxi do grupo radical ribose poderem permanecer bloqueados. Os oligoribonucleótidos assim modificados são em geral protegidos deste modo antes da hidrólise por RNases, mas também antes de reacções de isomerização possíveis, e podem deste modo ser conservados estáveis ao longo de períodos de tempo longos. Os grupos de bloqueio de 2’-hidroxi são em geral dissociados apenas imediatamente antes da utilização do ARN.
A dissociação dos suportes, tal como a dissociação de grupos de bloqueio de amino e hidroxi nos oligonucleótidos sintetizados, realiza-se de acordo com métodos gerais conhecidos, como por exemplo os descritos por M. Gait (Hrsg.): Oligonucleotide Synthesis, a practical approach? IRL Press? Oxford 1984.
Os exemplos seguintes permitem elucidar mais pormenorizadamente a invenção. Utilizaram-se como abreviaturas:
Bz para benzoilo
Mthp para metoxitetralqidropiranilo dansEOC para dansiletoxicarbonilo e
ΕΞ para acetato de etilo.
Exemplo 1
Reacção de 2-dansiletanol com cloroformiato de triclorometilo
Pipetaram-se, mediante arrefecimento por gelo e agitação, 0,8 ml (1,32 g = 6,64 mmole) de cloroformiato de triclorometilo em 10 ml de CHLCN absoluto. SeguidaO mente adicionaram-se gota a gota, mediante arrefecimento por gelo e agitação, através de um doseador de soro com uma agulha, 1 g (3,58 mmol) de 2-dansiletanol dissolvidos em 5 ml de GH^CN absoluto, Agita-se condinuamente em banho de gelo durante 5 horas. 0 sólido incolor que precipitará â isolado por filtração, é lavado com tetrahidrofurano absoluto e é seco em alto vácuo. Obtem-se 1,135 g (3,00 mmol = 84%) de um sólido incolor de ponto de fusão 154-155°C.
| valores: | A análise elementar fornece os seguintes | |
| determinado | calculado | |
| carbono | 47,90 % | 47,63 % |
| hidrogénio | 4,64 % | 4,53 % |
| azoto | 3,96 % | 3,70 % |
Exemplo 2
Reacção de 2’-0-(4-metoxitetrahidropiranil)-N^-benzoil-adenosina com o cloridrato de cloroformiato de 2-dansiletilo
2,43 g (5 mmol) de 2,-0-Mthp-I'T6-Bz-adenosina são coevaporados por duas vezes, utilizando-se de cada vez 30 ml de piridina absoluta, seguidamente dissolvem-se em 40 ml de piridina absoluta. Mediante arrefecimento por gelo e agitação adicionam-se então 2,46 g (6,5 mmol =
1,3 eg) de cloridrato de cloroformiato de 2-dansiletilo na forma sólida. Agita-se 1 hora em banho de gelo, dissolvendo-se deste modo o cloridrato, decorrida cerca de meia hora. Seguidamente interrompe-se com 0,5 ml (8,8 mmol) de glicol, evapora-se em evaporador rotativo, dilui-se com 200 ml de GH9Gl2/ lava-se com 200 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio, extrai-se a fase aquosa por duas vezes utilizando-se de cada vez 100 ml de diclorometano, secam-se as fases orgânicas, depois de reunidas, com sulfato de sódio, filtra-se e evapora-se em evaporador rotativo. Coevaporam-se duas vezes utilizando de cada vez 100 ml de tolueno e ainda duas vezes utilizando-se de cada vez 100 ml de diclorometano. Purifica-se através de uma coluna de sílica-gel (100 g, 23 x 3,5 cm). Eluiu-se com 0.5 litros de diclorometano, 1 litro de CH2Cl2/MeOH lOOíl e 1,5 litros de CH2C12/ /MeOH 100:2 por cromatografia instantânea. As fracções individuais do produto são submetidas a evaporação em evaporador rotativo e seguem-se em alto vácuo. O^tem-se 2.86 g (3.62
mmol - 72%) de produto monossubstituído em 5 * e 0,47 g (0,43 mmol = 9%) do produto dissubstituido em 3',5', em ambos os casos na forma de uma espuma amarela fortemente fluorescente. Para a análise elementar purifica-se ainda 100 mg do produto dissubstituido por meio de uma placa de silica-gel (40 x 20 cm) com CHgClg/MeOH 100:2.
Dados analíticos para 2’-0-(4-metoxite£ trahidropiranil)-5'-O-dansil-etoxicarbonil-N -benzoil-adenosina.
a) Cromatografia de camada fina
A cromatografia de camada fina foi reali zada com silica^gel Schleicher & Schull 3? 1500/LS 254 em diclorometano/metanol (95:5) e determinou-se um valor Rf de 0.48.
b) Espectroscopia UV em metanol:
| y\ max | 257 | 272 | 339 |
| log € max | 4,42 | 4,38 | 3, 65 |
| Análise elementar | |||
| determinado | calculado com | ||
| carbono | 56,58 % | 56,43 % | |
| hidrogénio | 5,46 % | 5,48 % | |
| azoto | 10,28 % | 10,39 % |
d) Espectroscopia RMN em CDC13 a 250 MHz
9,03 s largo (1) NH, 8,81 s (1) H-8, 8,61 d (2), Dansil-H-2, 8,35-8,30 m .(:2) Dansil-H-4, Dansil-H-8 8,23 s (1) H-2, 8,03 d (2) 2H de o-Bz, 7,65-7,50 m (5) 3H de Bz, Dansil-H-3, Dansil-H-7, 7,20 d (1) Dansil-H-6, 6,20 d (l) H-l', 5.13 t (1) H-2*, 4.52-4.32 m (6) CH2OCO, H-3', H-4·, H-5', H-5,
3,72 t (2) SO2CH2, 3.77-3.43 m (4) CH2OCH2 (Mthp), a 2,90 s largo (1) 3’-0H, 2,89 s (6) NMe2, 2,87 s (3) OCH3, 1,95-1, 55 m (4) CH2CGH2 (Mthp)
7“Ί Λ » T ί 4 —, > Ο I Ζ Λ ιλλ4» λ',* 4 4-
a)
b)
Cromatografia de camada fina
A cromatografia de camada fina foi realizada em placas de sílica-gel P 1500/LS 254 (Schleicher & Schull) em diclorometano/metanol (100:2) e determinou-se um valor Rf de 0.35.
Espectroscopia UV em metanol max log ,
254
278
343
4.58
4.37
3.91
c) Análise elementar detdrminado calculado carbono hidrogénio azoto
57,87 %
58,07 %
5,46 % 8.67 %
5,24 % 8,94 %
Espectroscopia de RMN em CDC13 a 250 MHz
9,05 s largo (1) NH, 8,83 s (1) H-8, 8,69-8,60 2d (2) 2 x Dansil-H-2, 8,35-8,29 m (4) 2 x Dansil-H-4, x Dansil-H-8, 8,22 s (1) H-2, 8,03 d (2) 2H de o~Bz, 7,68-7,50 m (7) 3H de Bz, 2 x Dansil-H-3, x Dansil-H-7, 7,24-7,18 2 até t sobreposta a d (2) 2 x Dansil-H-6, 6.13 d (1H6, H-l', 5,32 t (1) H-2·, 5.13-5.11 m (l) H-3', 4,60-4, 22 m (7) x CHgOCO, H-4', H-5’, H-5, 3, 77-3.26 m (8) 2 x SO2CH2, CH2OCH2 (Mthp), 2,89 s (6), MMe^ 2,88 s (6) MMe2, 2,63 s (3) OCH3, 1.78-1.20 m (4) CH2 CCH2 (Mthp).
Exemplo 3
Reacção de 2'-0-(4-metoxitetrahidropiranil)-5'-0-dansiletoxicarbonil-N -benzoil-adenosina com éster 2-(4-nitrofenil) -etílico-N,N-diisopropilamida de ácido clorofosforoso.
g (1,264 mmol) de 2'-O-Mthp-5’-O6
-dansEOC-N -8z-adenosina são dissolvidos em 6 ml de diclorometano absoluto, seguidamente adicionam-se 0,86 ml (0,65 g = = 5,03 mmol » 4 eq) de base de Hunigs e 0,84 g (2, 528 mmol = = 2 eq) de éster de 2-(4-nitrofenil)-etilo-N,N-diisopropilamida de cloreto de ácido fosforoso. 0 preparado reactivo é agi tado à temperatura ambiente sob atmosfera de azoto e escurecimento com uma folha de alumínio. Depois de 1 1/4 horas adicionam-se de novo 0,42 g (1, 264 mmol = 1 eq) do reagente de fosfitilação. Após um total de 2,5 horas de agitação à temperatura ambiente diluiu-se com 75 ml de diclorometano, lava-se com 75 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio, as fases orgânicas depois de reunidas são reextraídas 4 vezes utilizando-se de cada vez 50 ml de diclorometano, as fases orgânicas são reunidas e são secas com sulfato de sódio, filtra-se e evapora-se em evaporador rotativo. Purifica-se através de uma coluna de sílica-gel (30 g, 12 x 3 em) por cromatografia instantânea: eluiu-se com
250 ml CH2C12, 100 ml CH^l^E 100:1, 100 ml CH2C12/EE 100:2, 100 ml CH2Cl2/EE 100:3, 100 ml CH2Cl2/EE 100:5,
100 ml CH2C12/EE 100:7, 100 ml CH2Cl2/EE 9:1, 350 ml CH2C12/ /EE 4:1 (Reagente), 100 ml CH2C12/EE 2:1 (Produto), 100 ml CH2C12/EE 1:1 (Produto), 100 ml CH2C12/EE 1:2 (Produto) e 100 ml EE (Produto).
Ag fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e secas em alto vácuo.
Obtem-se 0,955 g (0,878 mmol = 70%) de uma espuma amarela fluorescente.
Dados analíticos
a) Cromatografia de camada fina
A cromatografia de camada fina foi realizada sobre placas de sílica Scbleicher & Scbuull P 1500/LS 254 em tolue no/EE (1:6) e determinou-se um valor Rf de 0,50.
b) Espectroscopia UV em metanol
J max 261 330 339
1°S £ max 4'54 3'55 3'51
c) Análibse elementar
| determinado | calculado | |
| carbono | 57,08 % | 57,45 % |
| hidrogénio | 5,87 % | 5,84 % |
| azoto 10,29 % | 10, 29 % | 10,31 % |
| Espectroscopia de RMN | ||
| 1. 31P-RMN em CDClg a | 161,70 MHz | |
| 151,34 ppm s | (31 %) | |
| 149,47 ppm s | (69 %) - 30 - |
2. ^H-RMN em CDC13 a 250 MHz
9,07 s largo (1) NH, 8,83 e 8,82 2s (l) H-8, 8,61 d (1) Dansil-H-2, 8,35-8,29 m (2) Dansil-H-4, Dansil-H-8, 8,24 e 8, 22 2S (1) H-2, 8,18-8,13 2d (2) 2H o para fenil-NO2, 8,03 d (2) 2H de o-Bz, 7,64-7,49 m (5) 3H,de Bz, Dansil-H-3, Dansil-H-7, 7,45-7,38
2d (2) 2H m para fenil-N09, 7,19 d (1) Dansil-H-6, 6,23 e 6,15 2d (l) H-l', 5,20 e 5,11 2t (1) H-2’, -8,48 t (2) CH20C0, 4,44-4,18 m (4) H-3», H-4·,
H-5·, H-5, 4,10-3,88 m (2) CHgOP, 3,84-3, 25 m (6) 2 x CH (i-Pr). CH2OCH2 (Mthp), 3,71 t (2) SO2CH2, 3,06 t (2) CH2-fenil-NO, 2,88 s (6) NMe2, 2,66 e 2,61 2s (3) OCH3, 2,00-1,45 m (4) CH2CSH2 (Mthp), 1,26-1,12 sobpepostos d (12) 2 x c(CH3)2 (i-Pr)
Exemplo 4
Síntese automática de oligorribonucleótidos com 2'-O-(4-metoxi-tetrahidropiranil)-5'-O-dansiletoxicarbonil-fosfitoamidas. Preparação do decanucleótido (rAp)^T.
As sínteses foram realizadas com um sintetizador de ADN 380 B (Applied Biosystems).
Coluna utilizada: coluna Standard ABI
Substância veicular utilizada: suporte LCAMA-CPG, gue estava ligado ao nucleósido através de grupos 3’-hidroxi.
(Literatura: K.P. Stangele, W. Pfleiderer Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 21, 101 (1989); K.P. Stangele, W. Pfleiderer Tetrahedron Lett. 31, 2549 (1990)).
Carga com timidina que está ligada ao suporte através de grupos 3'-hidroxi; 19 yimol/g
Dimensão do preparados cerca de 0,6 ^umol (determinação por dissociação do tritilo).
Ciclo de sínteses is condensação com tetrazol 0,5 M e 2’-0-(4-metoxi-tetrahidropiranil)-5‘-O-dansiletoxi-carbonil-N^-benzoil-adenosino-3'-O-fosfitamida 0,1 M em acetonitrilo absoluto de acordo com a seguinte sequencia de pulsos:
| Tetrazol | 8 | sec. | |
| fosfitamida + | Tetrazol | 4 | sec. |
| Tetrazol | 3 | sec. | |
| fosfitamida + | Tetrazol | 3 | sec. |
| Tetrazol | 3 | sec. | |
| passo de espera | 60 | sec. | |
| fosfitamida + | Tetrazol | 3 | sec. |
| Tetrazol | 3 | sec. | |
| passo de espera | 700 | sec. |
neutralização do nucleótido não reagido com acetanidrido/lutidina/tetrabidrofurano (1:1:3) e dimetilaminopiridina (DMAP) a 6,5% em tetrahidrofurano débito 20 sec.
passo de espera 30 sec.
oxidação com solução de iodo (1,269 g de I2/2O ml
Η2θ/1θ ml piridina / 100 ml (THF) débito 30 sec.
passo de espera 30 sec.
dissociação de dansiletoxicarbonilo com DBU 0,1 M em acetonitrilo em fluxo por impulsos de 2 x 30 sec e 8 x 10 sec com fluxo inverso de 1 sec. intermédio
Os eluídos do 4s passo foram reunidos e o rendimento da condensação foi determinado com base na 5-dimetilamino-naftil-l-vinilsulfona formada por meio de espectroscopia de fluorescência (estimulação: 368 nm? emissão 526 nm).
rendimento médio por passos foi de cerca de 98%.
Entre os passos individuais 1-4 realizaram-se passos de lavagem correntes com acetonitrilo, assim como o fluxo em bloco ou inverso.
Exemplo 5
Síntese de H-fosfonatos bloqueados com 5'-O-dansiletoxicarbonilo
10,75 equivalentes de imidazol são dissol vidos em 5 ml de cloreto de metileno absoluto, seguidamente arrefece-se com gelo/sal e em seguida a solução arrefecida é misturada com 3,5 equivalentes de PCIg e 11,25 equivalentes de trietilamina. Agita-se 15 minutos mediante arrefecimen to e adicionam-se depois 0,25 mmol (1 equivalente) de 2’-06
-(4-metoxitetrahidropiranil)-5'-O-dansil-etoxicarbonil-N -benzoiladenosina ou 0,25 mmol de 2'-O-(4-metoxitetrahidropiranil)-5‘-O-dansil-etoxicarbonil-N -para-nitrofenil-etilexicarboniladenosina (coevaporado 1 x com acetonitrilo) em 5 ml de cloreto de metileno absoluto, durante 10 minutos, gota a gota e mediante agitação.
seguidamente retira-se o banho de arrefecimento e agita-se por mais 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida a solução reactiva é extraída com 10 ml de uma solução 1 M de bicarbonato de trietilamónio. Separam-se as fases, extrai-se a fase aquosa com 10 ml de diclorometano, secam-se as fases orgânicas, depois de reunidas, '<ι'***>,μλ*^1
com sulfato de sódio, filtra-se e evapora-se em evaporador rotativo até à obtenção de uma espuma amarela fluorescente. Purifica-se através de uma curta colunà de sílica-gel (cromatografia instantânea) com um gradiente de diclorometano/metanol.
Exemplo 6
Síntese automática de oligorribonucleótidos com 2'-O-(4-metoxi-tetrahidropiranil)-5'-O-dansiletoxicarbonil-ribonucleósido-3'-O-H-fosfonatos. Preparação de (rAp) T.
As sínteses foram realizadas com um sintetizador de ADN 380 B (Applied Biosystems).
Coluna utilizada: coluna Standard ABI
Substância veicular utilizada: suporte LCAMA-CPG (K.P. Stengele, W.
Pfleiderer Nucleic Acids Res. Symp. Ser 21, 101 (1989);
K. P. Stangele, W. Pfeiderer Tetrahedron Lett. 31, 2549 (1990)).
Carga com timidina que está ligada ao suporte através de grupos 3'-hidroxi, 19 umol/g.
Dimensão do preparado: cerca de 0,6 umol (determinação por dissociação de tritilo).
Ciclo de síntese:
1. Lavagem com piridina absoluta/acetonitrilo (1:1)
2. Reacção com H-fosfonato de 2’-0-(4-metoxitetrahidropiranil)-5'-O-dansiletoxicarbonilo (10 mM) e cloreto de pivaloilo (50 mM) em piridina absoluta/acetonitrilo (1:1).
3. Lavagem com acetonitrilo absoluto (45 sec).
4. Dissociação de tansiletoxicarbonilo com DBU 0,1 M em acetonitrilo (2 minutos)
5. Repetição dos passos 1 a 4 até se alcançar o comprimento de cadeia pretendido.
6. Dissociação de dansiletoxicarbonilo com DBU 0,1 M em acetonitrilo (2 minutos) e recolha do eluido
7. Oxidação com iodo (0,1 M em piridina/N-metilimidazol/água/tetrahidrofurano (5/1/5/90) (2,5 minutos) ou com iodo (0,1 M) em trietilamina/água/tetrahidrofurano (5/5/90) (2,5 minutos).
A oxidação ao tiofosfato ou forforamidato foi realizada também como é descrito em Uhlmann & Peyman (1990).
Os eluídos do 6s passo são recolhidos e determina-se o rendimento de condensação com base na 5-dimetilamino-naftil-l-vinilsulfona formada por meio de espectroscopia de fluorescência (estimulação: 368 nm; emissão: 526 nm).
rendimento médio por passos é de cerca de 98%.
Claims (6)
- REIVINDICAÇÕES- lâ Processo para a preparação de um composto intermediário na síntese química de oligonucleótidos com a fórmula (I) (I), caracterizado por se fazer reagir o composto de fórmula (II) (II), so2oh2ch2oh com um composto dador de olorooarbonilo.- 2fi Processo para a preparação de derivados de nucleásidos intermediários na síntese química de oligonuoleósidos com a fórmula (Illa) ou (illb) i \ (Illa) (Illh) nas quaisDansEOG representa um grupo de fórmula so2oh2ch2ocrepresenta hidrogénio ou independentemente um do outro representa um grupo de fórmulas oO-Si-O(GH5)5, ch5 ch3B representa em que R , em cada caso independentemente um do outro, representam um grupo de fórmula em que R em cada caso independentemente um do outro represente hidrogénio ou-ch2oh2 '/ ho2AR em cada caso independentemente um do outro representa um grupo de fórmula ouB representa cR”Y representa hidrogénio, metilo (ou n-alquilo com 1 a 4 átomos de carbono)I em que R^ em oada easo independentemente um do outro representa ?0H,-ooh2ch2 !/ »C(0H5)5 ou- 40 caracterizado por se fazer reagir o composto de fórmula (I) com um correspondente composto de fórmula (IVa) ou (IVb) (IVa) (IVb) nas quais R e B tem os significados indicados acima, na presença de uma base.- 5& Processo para a preparação de derivados de nucleósidos de fórmula (Va) ou (Vb) intermediários na síntese química de oligonucleótidosDansEOC-O-Gl^DaasEOO-O-OHg e7e6npoe5 (Ia) (Vb) nas quaisDansEOG, R1 e B tem os significados anteriormente indicados β 7 e R , R* são iguais ou independentemente um do outro são diferentes e representam um grupo alquilo com 1 a 8 átomos- 41 de carbono,de preferência um grupo isopropilo, ou um grupo cicloalquilo oom 5 a 12 átomos de carbono, de preferênoia tendo até 8 átomos de carbono, um grupo benzilo ou fenilo, ou conjuntamente com o átomo de azoto ao qual estão ligados formam um anel heterocíclico saturado ou insaturado que eventualmente pode oonter outros heteroátomos e substituintes eR representa um grupo de fórmulaCl ou CH5 ou um grupo benzilo que não está substituido ou está substituido no anel uma ou mais vezes, mas de preferência não está substituido, sendo o ou os substituintes independentemente uns dos outros um átomo de halogéneo, um grupo alquilo oom 1 a 4 átomos de carbono, um grupo nitro, metoxi ou carboxilo, caracterizado por se fazer reagir o composto de fórmula (Illa) ou (Illb) oom um composto de fórmula (VI)Z tR7R6NP0R8 (VI), na qual Rg, Ry e RQ tem os significados anteriormente indicados e Z representa cloro ou bromo ou um radical de fórmula -NRgR10, na qual R^ e R^q são iguais ou independentemente um do outro são diferentes, e representam um grupo alquilo com 1 a 8 átomos de carbono, de preferência um grupo isopropilo ou um grupo cicloalquilo com 5 a 12 átomos de carbono, tendo de preferência até 8 átomos de carbono, um grupo benzilo ou um grupo fenilo, de preferência represen ta cloro, na presença de uma base.- 4& Processo para a preparação de oligo nucleótidos a partir dos compostos de fórmula (Va) e/ou (Vb) caracterizado por se fazer reagir um composto de fórmula (Va) ou (Vb) is eom um eomposto de fórmula (Vila) ou (Vllb) (Vllb) nas quais B e R tem os significados indicados acima, e 1G ou tem o mesmo significado que R ou representa um suporte polimórico que está ligado ao composto de fórmula (Vila) ou (Vllb) através dos grupos 2*-hidroxi ou 3'-h.idroxi,
- 2a se oxidar o composto obtido,
- 32 se dissociar o grupo Dansiletoxicarbonilo,
- 4a se fazer reagir o composto obtido com um composto de fór· mula (Va) ou (Vb) e
- 5a se repetirem os passos de reacção 2 e 4 até se obter o cumprimento de cadeia pretendido.- 43 4. *b.- 5& rivados de nucleótidosProcesso para a preparação de de eom a fórmula (VXIIa) ou (VlIIb)Dans-B0C-0-CH2DansEOC-O-CHr (VHIa)0=P-H h© (VlIIb)0=P-H οΘκ© nas quais DabsEOC, R e B tem os significados indicados í 4·) acima e K v ' representa um eatião, espeeialmente caracterizado por se fazer reagir um eomposto de fórmula (Illa) ou (Illb) com um oomposto de fórmula (IX) | pr14r15r16 Ix^ na qual R-^, R·^, R·^ são iguais ou diferentes uns dos outros são diferentes e representam hidrogénio ou um grupo alquilo oom 1 a 8 átomos de carbono, um grupo fluoralquilo com 1 a 8 átomos de carbono ou um grupo arilo, de preferência um grupo 2,2,2-trifluoretilo, 1,1,1,5,3,5-hexafluor-2-propilo, etilo ou fenilo, na presença de uma base.- 44 Prooesso para a preparação de derivado de nucleótidos com a fórmula (VlIIa) ou (VlIIb)O=P~H10 k© (VlIIa) θΘκΘ (VlIIb) nas quais DansEOC, R^ e B têm os significados acima indicados e K representa um oatião, especialaente — } //0(02^5)5 J , caracterizado por se fazer reagir um composto de fórmula (Illa) ou (Illb) com um composto de fórmula (X) ^17^18^19 W na qual R-^, R-^θ e R^g são iguais ou diferentes e independentemente uns dos outros representam cloro, bromo ou um grupo alquilamino com 1 a 8g átomos de carbono ou um grupo 1,2,4-triazolilo, de preferência um grupo 1,2,4-triazolilo, na presença de uma base, e por em seguida se hidrolisar.- 45 4
- 7® Processo para a preparação de oligonucleótidos e de oligonuoleóticos bloqueados por dansiletoxioarbonilo, caracterizado por serem preparados a partir de pelo menos um composto de fórmula (Va) e/ou (Vb).A requerente reivindica a prioridade dos pedidos de patente alemã apresentado em 14 de Setembro de 1990 e 09 de Abril de 1991» sob os números P 4029244.4 e P 4111363.2, respectivamente.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4029244A DE4029244A1 (de) | 1990-09-14 | 1990-09-14 | Verfahren zur chemischen synthese von oligonukleotiden |
| DE4111363 | 1991-04-09 |
Publications (2)
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| PT98963A PT98963A (pt) | 1992-08-31 |
| PT98963B true PT98963B (pt) | 1999-02-26 |
Family
ID=25896883
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT98963A PT98963B (pt) | 1990-09-14 | 1991-09-13 | Processo para a preparacao de compostos intermediarios para a sintese quimica de oligonucleotidos e para a preparacao de derivados de nucleosidos, de nucleotidos e de oligonucleotidos, utilizado esses intermediarios |
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