CN101522701B - 核酸保护基的导入方法 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及对于3’位羟基和5’位羟基被硅保护基保护的核糖核酸衍生物,在核糖的2’位羟基导入下述取代基(I)的方法。
式(I)中,WG1表示吸电子基团。
作为WG1的吸电子基团,可例举例如氰基、硝基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、卤素。其中优选氰基。
作为WG1的烷基磺酰基的烷基部分,可例举例如直链状或支链状的碳数1~5的烷基。具体可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基。
作为WG1的芳基磺酰基的芳基部分,可例举例如碳数6~12的芳基。具体可例举例如苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基。该芳基可被取代,作为该取代基,可例举例如卤素、烷基、烷氧基、氰基、硝基,它们可在任意位置取代有1~3个。
作为WG1的卤素,可例举例如氟、氯、溴、碘。
作为WG1的芳基的取代基的卤素及烷基,可例举与所述卤素及烷基同样的基团。作为WG1的芳基的取代基的烷氧基,可例举例如直链状或支链状的碳数1~4的烷氧基。具体可例举甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。其中优选碳数1~3的所述烷氧基。
背景技术
低聚RNA作为基因分析的RNA探针、RNA药物原材料(利用反义RNA、核酶、RNAi的基因表达控制)、人工酶、适体有用。作为该低聚RNA的制造过程中使用的试剂,已知的有核糖的2’位羟基被中性条件下可脱离的2-氰基乙氧基甲基(CEM基)取代的亚磷酰胺化合物(非专利文献1,专利文献1)。
作为制造该亚磷酰胺化合物的工序,有在核糖的2’位的羟基导入作为保护基的CEM的工序,以往该工序如下实施。即,在三氟甲磺酸或三氟甲磺酸银等酸的存在下,使作为烷基化试剂的甲硫基甲基2-氰基乙基醚、作为将烷基化试剂中的硫原子卤化的试剂(氧化剂)的N-碘琥珀酰亚胺(NIS)或N-溴琥珀酰亚胺(NBS)作用于核糖的3’位和5’位的羟基被硅保护基(例如,四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)保护的核糖核酸衍生物(原料化合物)(专利文献1)。
所述将烷基化试剂中的硫原子卤化的试剂及所述酸,即,NIS、NBS、三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银都是反应性非常高的化合物,因此即使将反应温度降至0℃附近,作为原料化合物的核糖核酸衍生物的核酸碱基也可能被卤化。因此,为了防止核酸碱基的卤化,必须在-50℃~-40℃这样的极低温度条件下来实施该工序。但是,作为原料化合物的核糖核酸衍生物为100mg~2g左右的少量时,有时即使反应温度在0℃附近,反应还是会完全地进行。
此外,使用NIS或NBS时,会生成来自琥珀酰亚胺的副产物。该副产物很难通过萃取操作除去,通常必须采用不利于大量精制的柱色谱法来除去。
另外,NIS、NBS、三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银都是价格非常高的试剂,不利于成本控制。
采用该NIS或NBS等的现有制法并不适合大量生产所述亚磷酰胺化合物。
专利文献1:国际公报WO 2006/022323 A1文本
非专利文献1:大木等,有机快报(ORGANIC LETTERS),Vol.7,3477(2005)
发明的揭示
本发明的目的主要是提供对于3’位羟基和5’位羟基被硅保护基保护的核糖核酸衍生物,低成本且简便地在核糖的2’位羟基导入下述取代基(I)(例如,CEM基)的方法。
式(I)中,WG1如前所述。
本发明者为了实现上述目的进行了认真探讨,找到了解决以上课题的方法,藉此完成了本发明。
作为本发明,可例举例如以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物的制造方法,该方法的特征在于,在使以下的通式(2)表示的单缩硫醛(monothioacetal)化合物与以下的通式(1)表示的核糖核酸衍生物反应而制造以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物的方法中,在酸存在下,用碘作为将单缩硫醛化合物(2)的硫原子卤化的试剂。
式(1)、(2)及(3)中,Bz表示可具有保护基的核酸碱基,WG1如前所述,R3表示烷基或芳基,A表示以下的通式(4a)或(4b)表示的硅取代基,
式(4a)及(4b)中,R6表示烷基。
作为Bz的核酸碱基,只要是被用于核酸的合成的碱基即可,无特别限定,例如可例举胞嘧啶、尿嘧啶等嘧啶碱基,腺嘌呤、鸟嘌呤等嘌呤碱基或它们的修饰体。
Bz的核酸碱基可被保护,其中具有氨基的核酸碱基,例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶,其氨基最好被保护。作为该氨基的保护基,只要是作为核酸的保护基使用的基团即可,无特别限定,具体可例举例如苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。
Bz的修饰体是指核酸碱基被任意的取代基取代的化合物,作为该取代基,可例举例如卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基,它们在任意的位置取代有1~3个。
作为Bz的修饰体中的卤素,可例举例如氟、氯、溴、碘。
作为Bz的修饰体中的酰基,可例举例如直链状或支链状的碳数1~6的烷酰基、碳数7~13的芳酰基。具体可例举例如甲酰基、乙酰基、正丙酰基、异丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、己酰基、苯甲酰基、萘甲酰基、乙酰丙酰基。
作为Bz的修饰体中的烷基,可例举例如直链状或支链状的碳数1~5的烷基。具体可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基。该烷基可被取代,作为该取代基,可例举例如卤素、烷基、烷氧基、氰基、硝基,它们可在任意的位置取代有1~3个。
Bz的修饰体中的芳烷基、烷氧基烷基、一烷基氨基、二烷基氨基及烷基磺酰基的烷基部分可例举与上述烷基相同的基团。
作为Bz的修饰体中的烷氧基,可例举例如直链状或支链状的碳数1~4的烷氧基。具体可例举例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。其中较好的是碳数1~3的烷氧基,特好的是甲氧基。
Bz的修饰体中的烷氧基烷基的烷氧基部分可例举与上述烷氧基相同的基团。
Bz的修饰体中的芳烷基的芳基部分可例举例如碳数6~12的芳基。具体可例举例如苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基等。该芳基可被取代,作为该取代基,可例举例如卤素、烷基、烷氧基、氰基、硝基,它们可在任意的位置取代有1~3个。
Bz的修饰体中的作为烷基、芳基的取代基的卤素、烷基及烷氧基可分别例举与上述相同的基团。
作为R3的烷基、芳基,可例举与所述Bz的修饰体中的烷基、芳基相同的基团。
作为单缩硫醛化合物(11)的具体例,可例举2-氰基乙基甲硫基甲基醚。
作为R6的烷基,可例举例如直链状或支链状的碳数1~5的烷基。具体可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基。
此外,作为本发明,还可例举以下的通式(A)表示的亚磷酰胺化合物(以下称为亚磷酰胺化合物(A))的制造方法,该方法包括在使以下的通式(2)表示的单缩硫醛化合物与以下的通式(1)表示的核糖核酸衍生物反应而制造以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物的方法中,在酸存在下,通过用碘作为将单缩硫醛化合物(2)的硫原子卤化的试剂而制造以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物的步骤。
式(1)、(2)及(3)中,A、Bz、R3、WG1如前所述。
式(A)中,Bz、WG1如前所述,R2a、R2b相同或不同,表示烷基或表示R2a、R2b与邻接的氮原子一起形成的5~6元的饱和氨基环基,该饱和氨基环基除了氮原子以外可具有1个作为成环原子的氧原子或硫原子,WG2相同或不同,表示吸电子基团,R1表示以下的通式(5)表示的取代基。
式(5)中,R11、R12、R13相同或不同,表示氢或烷氧基。
作为R11、R12、R13的烷氧基,可例举与所述Bz的修饰体中的烷氧基相同的基团。
作为R2a、R2b的烷基,可例举与所述Bz的修饰体中的烷基相同的基团。
作为R2a、R2b的5~6元饱和氨基环基,可例举例如吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、吗啉-4-基或硫代吗啉-4-基。
作为WG2的吸电子基团,可例举与所述WG1的吸电子基团相同的基团。
亚磷酰胺化合物(A)是核糖的2’位羟基被下述取代基(I)保护的亚磷酰胺化合物。此外,由于被导入2’位羟基的基团是直链状的取代基,与3’位的羟基结合的磷原子的周围的空间不拥挤,因此与以往使用的亚磷酰胺化合物相比,在合成低聚RNA时具有缩合反应在非常短的时间内进行、缩合收率良好的特点。通过使用亚磷酰胺化合物(A),用与低聚DNA的制造大致相同的方法可制得高纯度的低聚RNA。
式(I)中,WG1如前所述。
在这里,本发明中的低聚RNA是指作为低聚核酸的构成单体含有至少1个核糖核酸(RNA)的低聚核酸。此外,低聚DNA是指作为低聚核酸的构成单体不含核糖核酸(RNA)的低聚核酸。
以下,对本发明进行详细说明。
实施发明的最佳方式
以下所示的制法中,在原料具备对反应有影响的取代基(例如,羟基、氨基、羧基)时,预先按照公知的方法用合适的保护基对原料进行保护后再进行反应。最后可通过催化还原、碱处理、酸处理等公知方法将保护基脱离。
I.核糖核酸衍生物(3)的制法
该制法可通过在酸及碘的存在下,使以下的通式(I)表示的核糖核酸衍生物和以下的通式(2)表示的单缩硫醛化合物反应而实施。
式(1)、(2)及(3)中,A、Bz、R3、WG1如前所述。
单缩硫醛化合物(2)可通过公知方法(例如,国际公开公报WO 2006/022323A1文本)来制备。
该制法可通过在酸存在下,使单缩硫醛化合物(2)和碘作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的核糖核酸衍生物(1)而实施。该制法中的碘用量相对于核糖核酸衍生物(1)以摩尔比计较好在0.8倍量~20倍量的范围内,更好在等倍量~10倍量的范围内。反应温度以在-20℃~20℃的范围内为宜,较好是在-10℃~10℃的范围内,更好是在-5℃~5℃的范围内。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异,但通常以在5分钟~5小时的范围内为宜。可在该制法中使用的单缩硫醛化合物(2)的用量相对于核糖核酸衍生物(1)以摩尔比计较好在0.8倍量~5倍量的范围内,更好在等倍量~3倍量的范围内。作为酸,只要是可活化对核糖的2’位的烷基化反应且具有可与核酸碱基的部分形成盐的程度的酸性度的有机酸即可,无特别限定。例如,作为该酸,可例举甲磺酸、三氟甲磺酸或它们的混合物。特好的是甲磺酸或三氟甲磺酸和甲磺酸的混合酸。该酸的用量相对于核糖核酸衍生物(1)以摩尔比计较好在0.01倍量~10倍量的范围内,更好在0.1倍量~5倍量的范围内。采用三氟甲磺酸和甲磺酸的混合酸的情况下,三氟甲磺酸相对于甲磺酸以摩尔比计以在0.01倍量~0.9倍量的范围内为宜,较好在0.02倍量~0.5倍量的范围内,更好在0.05倍量~0.2倍量的范围内。所用溶剂只要不影响反应即可,无特别限定,可例举例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、四氢呋喃(以下称为THF)、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺或它们的任意的混合溶剂。特好的是THF。
II.亚磷酰胺化合物(A)的制法
亚磷酰胺化合物(A)可由公知化合物或易制备的中间体通过实施例如以下的步骤a~步骤d的操作而制得。
以下,进行详细说明。
(1)步骤a:
该步骤与所述I的制法相同。
(2)步骤b:
该步骤是通过将步骤a中制得的核糖核酸衍生物(3)溶于合适的溶剂,使用于脱离硅取代基的试剂作用而制备以下的通式(7)表示的核糖核酸衍生物的步骤。
式(3)及(7)中,A、Bz、WG1如前所述。
作为可在该步骤中使用的用于脱离硅取代基的试剂,可例举氟化四丁基铵、胺和氢氟酸的盐或在合适的溶剂中胺和氢氟酸以任意比混合而得的混合物。
此外,根据情况,也可使用于胺和氢氟酸的盐或在合适的溶剂中胺和氢氟酸以任意比混合而得的混合物中再加入合适的酸而得的混合试剂来实施该步骤。作为此时可使用的酸,可例举例如乙酸、盐酸、硫酸。作为该酸的用量,相对于胺以摩尔比计较好在0.01倍量~10倍量的范围内,更好在0.1倍量~5倍量的范围内。
作为所用溶剂,可例举例THF、乙腈、甲醇、异丙醇、甲苯、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺或它们的任意的混合溶剂。特好的是THF、甲醇。
可在该步骤中使用的用于脱离硅取代基的试剂的用量因核糖核酸衍生物(3)的种类、所用的用于脱离硅取代基的试剂、所用溶剂等而异,但相对于核糖核酸衍生物(3)其用量以摩尔比计较好在等倍量~10倍量的范围内,更好在1.2倍量~1.5倍量的范围内。反应温度在0℃~80℃的范围内为宜。反应时间因核糖核酸衍生物的种类、所用的用于脱离硅取代基的试剂、所用溶剂和反应温度等而异,通常在30分钟~10小时的范围内为宜。
反应结束后,通过直接冷却或在反应混合物中加入适量的水来冷却,可获得作为析出物的核糖核酸衍生物(7)。作为所添加的水的用量,相对于所用溶剂,以容量比计在0.05倍量~5倍量的范围内为宜,较好在0.06倍量~等倍量的范围内,更好在0.07倍量~0.1倍量的范围内。
作为该步骤中可用的胺和氢氟酸的盐,具体可例举氟化铵、三甲胺氢氟酸盐、三甲胺二氢氟酸盐、三甲胺三氢氟酸盐、三甲胺四氢氟酸盐、三甲胺五氢氟酸盐、三甲胺六氢氟酸盐、三乙胺氢氟酸盐、三乙胺二氢氟酸盐、三乙胺三氢氟酸盐、三乙胺四氢氟酸盐、三乙胺五氢氟酸盐、奎宁环三氢氟酸盐、三亚乙基二胺四氢氟酸盐等(例如,参考分子结构期刊(Journal Molecular Structure),193,247(1989),Pol.J.Chem,67(2),281(1993),Chem.Europ.J.,4(6),1043(1998),J.Fluorine.Chem.,118(1-2),123,(2002))。尤其好的是氟化铵、三乙胺三氢氟酸盐。
此外,作为该步骤中可用的在合适的溶剂中胺和氢氟酸以任意比混合而得的混合物,可例举例如将氨、三甲胺、三乙胺、奎宁环、三亚乙基二胺等胺与氢氟酸在合适的溶剂中(例如,THF、乙腈、甲醇、异丙醇、甲苯)以例如1∶1~1∶30(胺∶氢氟酸)的混合比(摩尔比)混合而得的混合物。
(3)步骤c:
该步骤是按照公知方法使以下的通式(8)表示的R1X3作用于步骤b制得的核糖核酸衍生物(7),将在酸性条件下脱离的保护基(R1)导入核糖核酸衍生物(7)的5’位羟基,藉此制备以下的通式(9)表示的核糖核酸衍生物的步骤。
式(7)、(8)及(9)中,Bz、R1、WG1如前所述,X3表示卤素。
作为X3的卤素,可例举与所述Bz的修饰体中的卤素相同的例子。
R1X3(8)的用量相对于核糖核酸衍生物(7)以摩尔比计较好在0.8倍量~20倍量的范围内,更好在等倍量~10倍量的范围内。所用的溶剂只要不影响反应即可,无特别限定,可例举例如乙腈、THF等。作为碱,可例举吡啶、2,6-二甲基吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯等有机碱。该碱的用量相对于核糖核酸衍生物(7)以摩尔比计较好在0.8倍量~20倍量的范围内,更好在等倍量~10倍量的范围内。反应温度以0℃~120℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异,通常以30分钟~24小时为宜。
(4)步骤d:
该步骤是使亚磷酰胺化试剂和根据需要使用的活化剂作用于步骤c制得的核糖核酸衍生物(9),使3’位羟基亚磷酰胺化,藉此制备亚磷酰胺化合物(A)的步骤。
式(9)及(A)中,Bz、R1、R2a、R2b、WG1、WG2如前所述。
作为亚磷酰胺化试剂,可例举例如以下的通式(10a)、(10b)表示的化合物。
式(10a)及(10b)中,R2a、R2b、WG2如前所述,X1表示卤素。
作为X1所表示的卤素,可例举与所述Bz的修饰体中的卤素相同的卤素。
所用溶剂只要对反应没有影响即可,无特别限定,可例举例如乙腈、THF等。
该步骤中可用的亚磷酰胺化试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(9)以摩尔比计较好在0.8倍量~20倍量的范围内,更好在等倍量~10倍量的范围内。作为活化剂,可例举例如1H-四唑、5-乙硫基四唑、4,5-二氯咪唑、4,5-二氰基咪唑、三氟甲磺酸苯并三唑盐、三氟甲磺酸咪唑盐、三氟甲磺酸吡啶鎓盐、N,N-二异丙基乙胺、2,4,6-三甲基吡啶/N-甲基咪唑。活化剂的用量相对于核糖核酸衍生物(9)以摩尔计较好在0.8倍量~20倍量的范围内,更好在等倍量~10倍量的范围内。反应温度以0℃~120℃为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异,通常以30分钟~24小时为宜。
如上所述制得的亚磷酰胺化合物(A)本身可通过例如浓缩、液相转换、转溶、溶剂萃取、结晶、重结晶、分馏、层析等公知的方法进行分离精制。
III.低聚RNA的制法
通过使用按照所述制法获得的亚磷酰胺化合物(A),可制造以下的通式(B)表示的低聚RNA(以下称为低聚RNA(B))。
以下进行详述。
式(B)中,各B分别独立,表示核酸碱基或其修饰体,各Q分别独立,表示O或S,各R分别独立,表示H、羟基、卤素、烷氧基、烷硫基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基或烷氧基烷基氧基,但至少1个表示羟基,各Y表示烷基、烷氧基、烷硫基、O-、S-、NR2aR2b(R2a、R2b如前所述),但构成低聚RNA(B)的核酸单体单元的R为羟基时,Y表示O-,Z表示H、磷酸基或硫代磷酸基,n表示1~200的范围内的整数。
n较好为10~100的范围内的整数,更好为15~50的范围内的整数。
对B表示的核酸碱基无特别限定,例如可例举胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等嘧啶碱基,腺嘌呤、鸟嘌呤等嘌呤碱基或它们的修饰体。
B的修饰体是指核酸碱基被任意的取代基取代的化合物,作为B的修饰体中的取代基,可例举例如卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、羟基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基,它们在任意的位置取代有1~3个。
作为B的修饰体中的卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基,可例举与所述Bz的修饰体中的对应的基团相同的基团。
作为Y的烷基、烷氧基、烷硫基的烷基,可例举与所述Bz的修饰体中的对应的基团相同的基团。
作为R的卤素、烷氧基、烷基氨基或二烷基氨基,可例举与所述Bz的修饰体中的对应的基团相同的基团。
作为R的烷氧基烷基氧基、烷硫基的烷基,可例举与所述Bz的修饰体中的烷基相同的基团。
作为R的烷氧基烷基氧基的烷氧基,可例举与所述Bz的修饰体中的烷氧基相同的基团。
作为R的链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基的链烯基,可例举例如直链状或支链状的碳数2~6的链烯基。具体可例举例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、1-己烯基等。
作为R的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基,可例举例如直链状或支链状的碳数2~4的炔基。具体可例举例如乙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基等。
这里,本发明中的核酸单体单元是指构成低聚RNA(B)及各(低聚)核酸衍生物的各核酸单体的部分。
使用亚磷酰胺化合物(A)的低聚RNA(B)的制法可按照公知方法进行,但也可以例如通过重复实施以下所示的步骤A~步骤G,分步骤地由3’至5’的方向缩合核酸单体化合物。
由低聚RNA的制法可制得各R中的至少1个为羟基的低聚RNA(B)。例如在后述的步骤B中,作为核酸单体化合物全部使用亚磷酰胺化合物(A),藉此可制得各R都为羟基的低聚RNA(B)。
被用于下述步骤的化合物及试剂中,除亚磷酰胺化合物(A)以外,只要是常用于低聚RNA或低聚DNA的合成的化合物及试剂就可以使用,无特别限定。此外,与使用现有的核酸合成试剂的情况同样,所有的步骤可采用人工方法或市售的DNA自动合成机来进行。从操作方法的简化及合成的准确性的角度来看,理想的是采用自动合成机。
(1)步骤A:
该步骤是使用于脱离R1的酸作用于以下的通式(11)表示的(低聚)核酸衍生物,将5’位羟基的保护基脱离,藉此制备以下的通式(12)表示的低聚核酸衍生物的步骤。
式(11)及(12)中,n、各Q、R1分别如前所述,各Bx分别独立,表示可具有保护基的核酸碱基或其修饰体,各R4分别独立,表示H、卤素、烷氧基、烷硫基、可被保护的氨基、可被保护的烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、可被保护的链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、可被保护的炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷基氧基或以下的通式(13)表示的取代基,但至少1个为以下的通式(13)表示的取代基。
式(13)中,WG1如前所述。
各Y1表示烷基、烷氧基、烷硫基、NR2aR2b(R2a、R2b如前所述)或以下的通式(14)表示的取代基。
式(14)中,WG2如前所述。
但是,构成(低聚)核酸衍生物(11)及(12)的核酸单体单元的R4为所述通式(13)表示的取代基时,Y1为所述通式(14)表示的取代基。
E表示酰基或以下的通式(15)表示的取代基。
式(15)中,E1表示单键或以下的通式(16)表示的取代基。
式(16)中,Q、Y1如前所述。
T表示H、酰氧基、卤素、烷氧基、烷硫基、可被保护的氨基、可被保护的烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、可被保护的链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、可被保护的炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷基氧基或以上的通式(13)表示的取代基或以上的通式(15)表示的取代基,但E或T的任一方表示取代基(15)。
Bx的核酸碱基只要是被用于核酸的合成的碱基即可,无特别限定,例如可例举胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等嘧啶碱基,腺嘌呤、鸟嘌呤等嘌呤碱基或它们的修饰体。
Bx的核酸碱基可被保护,其中具有氨基的核酸碱基,例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶,其氨基最好被保护。
作为该氨基的保护基,只要是作为核酸的保护基使用的基团即可,无特别限定,可例举例如苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。
Bx的修饰体是指核酸碱基被任意的取代基取代的化合物,作为Bx的修饰体中的取代基,可例举例如卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基,它们在任意的位置取代有1~3个。
作为Bx的修饰体中的卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、一烷基氨基、二烷基氨基,可例举与所述Bz的修饰体中的对应的基团相同的基团。
作为R4的卤素、烷氧基、烷基氨基及二烷基氨基,可例举与所述Bz的修饰体中的对应的基团相同的基团。
作为R4的烷氧基烷基氧基及烷硫基的烷基部分,可例举与所述Bz的修饰体中的烷基相同的基团。
作为R4的烷氧基烷基氧基的烷氧基部分,可例举与所述Bz的修饰体中的烷氧基相同的基团。
作为R4的链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基的链烯基部分,可例举与所述R的链烯基相同的基团。
作为R4的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分,可例举与所述R的炔基相同的基团。
R4的氨基、烷基氨基、链烯基氨基、炔基氨基可被保护,作为该保护基,只要是作为氨基的保护基使用的基团即可,无特别限定,可例举例如三氟乙酰基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。特好的是三氟乙酰基。
作为E的酰基,可例举与所述Bz的修饰体中的酰基相同的基团。
作为T的酰氧基中的酰基部分,可例举与所述Bz的修饰体中的酰基相同的基团。
作为T中的卤素、烷氧基、烷基氨基及二烷基氨基,可例举与所述Bz的修饰体中的对应的基团相同的基团。
作为T中的烷氧基烷基氧基及烷硫基的烷基部分,可例举与所述Bz的修饰体中的烷基相同的基团。
作为T中的烷氧基烷基氧基的烷氧基部分,可例举与所述Bz的修饰体中的烷氧基相同的基团。
作为T中的链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基的链烯基部分,可例举与所述R中的链烯基相同的基团。
作为T中的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分,可例举与所述R中的炔基相同的基团。
作为Y1的烷基、烷氧基、烷硫基的烷基,可例举与所述Bz的修饰体中的对应的基团相同的基团。
该步骤可通过使酸作用于被负载于固相载体的以下的通式(17a)、(17b)表示的核酸衍生物(相当于n=1的核酸衍生物(11))或通过进行步骤A~步骤D的操作而制得的被负载于固相载体的低聚RNA或低聚DNA(相当于n=2~100的低聚核酸衍生物(11))(以下称为被负载于固相载体的低聚核酸衍生物)而实施。
式(17a)及(17b)中,Bx、R1如前所述,R2L、R4L表示取代基(15),R2表示酰氧基,R4a表示H、酰氧基、卤素、烷氧基、烷硫基、可被保护的氨基、可被保护的烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、可被保护的链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、可被保护的炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷基氧基或取代基(13)。
作为R2、R4a的酰氧基的酰基部分,可例举与所述Bz的修饰体中的酰基相同的基团。
作为R4a的卤素、烷氧基、烷基氨基及二烷基氨基,可例举与所述Bz的修饰体中的对应的基团相同的基团。
作为R4a的烷氧基烷基氧基及烷硫基的烷基部分,可例举与所述Bz的修饰体中的烷基相同的基团。
作为R4a的烷氧基烷基氧基的烷氧基部分,可例举与所述Bz的修饰体中的烷氧基相同的基团。
作为R4a的链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基的链烯基部分,可例举与所述R中的链烯基相同的基团。
作为R4a的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分,可例举与所述R中的炔基相同的基团。
R4a的氨基、烷基氨基、链烯基氨基、炔基氨基可被保护,作为该保护基,只要是作为氨基的保护基使用的基团即可,无特别限定,可例举例如三氟乙酰基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。特好的是三氟乙酰基。
作为固相载体,可例举例如可控孔度玻璃(controlled pore glass;CPG)、草酰化-可控孔度玻璃(例如参照Alul等,核酸研究(Nucleic Acids Research),Vol.19,1527(1991))、TentaGel支承体-氨基聚乙二醇衍生物化支承体(例如参照Wright等,四面体快报(Tetrahedron Letters),Vol.34,3373(1993))、Poros-聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物。
作为连接基,可例举例如3-氨基丙基、琥珀酰基、2,2’-二乙醇磺酰基、长链烷基氨基(LCAA)。
核酸衍生物(17a)、核酸衍生物(17b)是按照公知方法制得的化合物或可作为市售品获得的被负载于固相载体的化合物,作为其优选例子,可例举例如以下的通式(18)、(19)表示的核酸衍生物。
式(18)及(19)中,Bx、Q、R1、R4、WG2如前所述。
R4为取代基(13)的核酸衍生物(19)可按照公知方法由亚磷酰胺化合物(A)制得。
作为可用于该步骤的用于脱离R1的酸,可例举例如三氟乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸。该酸也可用适当的溶剂将其浓度稀释至1~5%后再使用。作为溶剂,只要不会对反应有影响即可,无特别限定,可例举二氯甲烷、甲苯、乙腈、甲醇、水或它们的任意的混合溶剂。可用于该步骤的酸的用量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以摩尔比计较好在0.8倍量~100倍量的范围内,更好在等倍量~10倍量的范围内。上述反应的反应温度优选在20℃~50℃的范围内。反应时间因(低聚)核酸衍生物(11)的种类、所用酸的种类、反应温度等而异,通常以1分钟~1小时为宜。
(2)步骤B:
该步骤是采用活化剂使核酸单体化合物与步骤A制得的低聚核酸衍生物(12)缩合,藉此制备以下的通式(20)表示的低聚核酸衍生物的步骤。
式(12)及(20)中,各Bx、E、n、各Q、R1、各R4、T、各Y1如前所述,但是,构成(低聚)核酸衍生物(12)及(20)的核酸单体单元的R4为所述通式(13)表示的取代基时,Y1为所述通式(14)表示的取代基。
作为核酸单体化合物,可例举亚磷酰胺化合物(A)或以下的通式(21)表示的核酸衍生物。
式(21)中,R1、R2a、R2b、R4a、Y1如前所述,BY表示可具有保护基的核酸碱基或其修饰体。
作为BY中的核酸碱基,只要是被用于核酸的合成的碱基即可,无特别限定,可例举例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等嘧啶碱基,腺嘌呤、鸟嘌呤等嘌呤碱基或它们的修饰体。
BY中的核酸碱基可被保护,其中具有氨基的核酸碱基,例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶,其氨基最好被保护。
作为该氨基的保护基,只要是作为核酸的保护基使用的基团即可,无特别限定,具体可例举例如苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。
BY的修饰体是指核酸碱基被任意的取代基取代的化合物,作为BY的修饰体中的取代基,可例举例如卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基,它们可在任意的位置取代有1~3个。
作为BY的修饰体中的卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、一烷基氨基、二烷基氨基,可例举与所述Bz的修饰体中的对应的基团相同的基团。
作为核酸衍生物(21),可例举作为市售品可购得的核酸化合物或按照文献(低聚核苷酸及其类似物的实验方案(Protocols for oligonucleotides andanalogs);S.Agrawal编:Humann Press Inc.:Totowa,NJ,1993.)公知的方法可合成的核酸化合物。
作为活化剂,可例举与上述相同的试剂。该活化剂的用量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以摩尔比计较好在0.8倍量~100倍量的范围内,更好在等倍量~10倍量的范围内。作为反应溶剂,只要不会对反应有影响即可,无特别限定,例如可例举乙腈、THF。上述反应的反应温度以20℃~50℃为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(12)的种类、所用活化剂的种类和反应温度等而异,通常以1分钟~1小时为宜。
(3)步骤C:
该步骤是为了保护步骤B中未反应的低聚核酸衍生物(12)的5’位羟基而使加帽剂作用于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物(12)的步骤。
式(12)及(22)中,各Bx、E、n、各Q、各R4、T、各Y1如前所述,R5表示甲基、苯氧基甲基、4-叔丁基苯氧基甲基,但是,构成(低聚)核酸衍生物(12)及(22)的核酸单体单元的R4为所述通式(13)表示的取代基时,Y1为所述通式(14)表示的取代基。
作为加帽剂,可例举例如乙酸酐、苯氧基乙酸酐或4-叔丁基苯氧基乙酸酐。加帽剂也可用合适的溶剂将其浓度稀释至0.05~1M后再使用。作为溶剂,只要不会对反应有影响即可,无特别限定,可例举例如吡啶、二甲基吡啶、二氯甲烷、乙腈、THF或它们的任意的混合溶剂。可在该步骤中使用的加帽剂的用量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以摩尔比计较好在0.8倍量~100倍量的范围内,更好在等倍量~10倍量的范围内。此外,该步骤中可根据需要使用例如4-二甲基氨基吡啶、N-甲基咪唑、2-二甲基氨基吡啶这样的反应促进剂。该反应促进剂的用量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以摩尔比计较好在0.01倍量~100倍量的范围内,更好在0.1倍量~10倍量的范围内。上述反应的反应温度以20℃~50℃为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(12)的种类、所用加帽剂的种类、反应温度等而异,通常以1分钟~30分钟为宜。
(4)步骤D:
该步骤是通过使氧化剂作用于步骤B中制备的低聚核酸衍生物(20)而将亚磷酸基(3价的磷)转变为磷酸基或硫代磷酸基(5价的磷)的步骤。
式(20)及(23)中,各Bx、E、n、各Q、R1、各R4、T、各Y1如前所述,但是,构成低聚核酸衍生物(20)及(23)的核酸单体单元的R4为所述通式(13)表示的取代基时,Y1为所述通式(14)表示的取代基。
作为用氧来氧化磷时的氧化剂,例如可使用碘、过氧化氢叔丁基。该氧化剂也可用适当的溶剂将其浓度稀释至0.05~2M后再使用。作为用于反应的溶剂,只要不会对反应有影响即可,可例举吡啶、THF、水或它们的任意的混合溶剂。例如可采用碘/水/吡啶-THF或者碘/吡啶-乙酸或过氧化剂(过氧化氢叔丁基/二氯甲烷等)。
此外,作为用硫来氧化磷时的氧化剂,例如可使用硫、Beaucage试剂(3H-1,2-苯并二噻茂-3-酮-1,1-二氧化物)、3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)。该氧化剂可用适当的溶剂将其浓度稀释至0.05~2M后再使用。作为用于反应的溶剂,只要不会对反应有影响即可,可例举二氯甲烷、乙腈、吡啶或它们的任意的混合溶剂。
可在该步骤中使用的氧化剂的用量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以摩尔比计较好在0.8倍量~100倍量的范围内,更好在10倍量~50倍量的范围内。反应温度以20℃~50℃为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(20)的种类、所用氧化剂的种类、反应温度等而异,通常以1分钟~30分钟为宜。
(5)步骤E:
该步骤是将步骤D制备的低聚核酸衍生物(23)从固相载体切割(cleave),脱离各核酸碱基部及各磷酸基的保护基的步骤。
式(23)及(24)中,各B、各Bx、E、各Q、R、R1、各R4、n、T、各Y、各Y1、Z如前所述,但是,构成低聚核酸衍生物(23)及(24)的核酸单体单元的R4为所述通式(13)表示的取代基时,Y1或Y分别为所述通式(14)表示的取代基或O-。
切割步骤是利用切割试剂将所需链长的低聚RNA从固相载体及连接基分离的反应,可通过向负载有所需链长的低聚RNA的固相载体添加切割试剂而实施。该步骤中可脱离核酸碱基部的保护基。
作为切割试剂,可例举例如浓氨水、甲胺等。该步骤中可使用的切割试剂也可用例如水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、THF或它们的任意的混合溶剂稀释后再使用。其中,优选使用乙醇。被用于脱保护的溶液中的氢氧化铵的浓度以20重量%~30重量%为宜,优选25重量%~30重量%,更好为28重量%~30重量%。
可在该步骤中使用的切割试剂的用量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以摩尔比计较好在0.8倍量~100倍量的范围内,更好在10倍量~50倍量的范围内。反应温度以15℃~75℃为宜,优选15℃~30℃,更好为18℃~25℃。脱保护反应时间以10分钟~30小时为宜,优选30分钟~24小时,更好为1~4小时。
(6)步骤F:
该步骤是使用于脱离各核糖的2’位羟基的保护基的试剂作用于步骤E制造的低聚核酸衍生物(24),藉此制备以下的通式(25)表示的低聚核酸衍生物的步骤。
式(24)及(25)中,各B、n、各Q、各Y、各R、R1、各R4、Z如前所述,但是,构成低聚核酸衍生物(24)及(25)的核酸单体单元的R4为所述通式(13)表示的取代基时,Y表示O-。
作为脱离2’位羟基的保护基的试剂,可例举例如TBAF、三乙胺三氢氟酸盐。该脱离2’位羟基的保护基的试剂的用量相对于被除去的保护基以摩尔比计较好在等倍量~500倍量的范围内,更好在5倍量~10倍量的范围内。作为所用溶剂,只要是不会影响反应的溶剂即可,无特别限定,例如可例举THF、N-甲基吡咯烷酮、吡啶、二甲亚砜或它们的任意的混合溶剂。反应溶剂的用量相对于脱离2’位羟基的保护基的试剂以摩尔比计较好在0.8倍量~100倍量的范围内,更好在等倍量~10倍量的范围内。反应温度以20℃~80℃为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(24)的种类、所用脱离2’位羟基的保护基的试剂的种类、反应温度等而异,通常以1小时~100小时为宜。
此外,还可根据需要添加用于清除该步骤中作为副产物生成的丙烯腈的试剂,作为丙烯腈的清除剂,例如可添加硝基烷、烷基胺、脒、硫醇、硫醇衍生物或它们的任意的混合物。作为硝基烷,可例举例如直链状的碳数1~6的硝基烷。具体可例举例如硝基甲烷。作为烷基胺,可例举例如直链状的碳数1~6的烷基胺。具体可例举例如甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺。作为脒,可例举例如苯甲脒、甲脒。作为硫醇,可例举例如直链状的碳数1~6的硫醇。具体可例举例如甲硫醇、乙硫醇、1-丙硫醇、1-丁硫醇、1-戊硫醇、1-己硫醇。作为硫醇衍生物,可例举例如具有相同或不同的直链状的碳数1~6的烷基巯基的醇或醚。具体可例举例如2-巯基乙醇、4-巯基-1-丁醇、6-巯基-1-己醇、巯基甲醚、2-巯基乙醚、3-巯基丙醚、4-巯基丁醚、5-巯基戊醚、6-巯基己醚。该丙烯腈清除剂的用量因低聚核酸衍生物(24)的种类等而异,相对于保护低聚核酸衍生物(24)的各核糖的2’位羟基的2-氰基乙氧基甲基以摩尔比计较好在0.8倍量~500倍量的范围内,更好在1~10倍量的范围内。。
可通过使用例如萃取、浓缩、中和、过滤、离心分离、重结晶、硅胶柱色谱法、薄层色谱法、反相ODS柱色谱法、离子交换柱色谱法、凝胶过滤柱色谱法、透析、超滤等常规的分离精制方法,从上述反应混合物分离精制5’位得到了保护的低聚RNA。
(7)步骤G:
该步骤是使酸作用于步骤F制得的低聚核酸衍生物(25),藉此脱离5’位羟基的步骤。
式(25)及(B)中,各B、n、各Q、各Y、各R、R1、Z如前所述,但是,构成低聚核酸衍生物(25)及低聚RNA(B)的核酸单体单元的R为羟基时,Y表示O-。
作为可用于该步骤的酸,可例举例如三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸等。该步骤中可使用的酸也可用适当的溶剂稀释后再使用。作为溶剂,只要是不会对反应有影响的溶剂即可,无特别限定,可例举例如二氯甲烷、乙腈、水、pH为2~5的缓冲液或它们的任意的混合溶剂。作为缓冲液,可例举例如乙酸缓冲液。可在该步骤中使用的酸的用量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以摩尔比计较好在0.8倍量~100倍量的范围内,更好在等倍量~10倍量的范围内。上述反应的反应温度以20℃~50℃为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(25)的种类、所用酸的种类、反应温度等而异,通常以1分钟~5小时为宜。
(8)步骤H:
该步骤是分离精制步骤G制备的低聚RNA(B)的步骤。
分离精制步骤是指通过单独或组合使用例如萃取、浓缩、中和、过滤、离心分离、重结晶、C8-C18的反相柱色谱法、C8-C18的反相卡套柱(cartridgecolumn)色谱法、阳离子交换柱色谱法、阴离子交换柱色谱法、凝胶过滤柱色谱法、高效液相色谱法、透析、超滤等常规的分离精制方法,从上述反应混合物分离精制所需低聚RNA(B)的步骤。
作为洗脱溶剂,可例举例如乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、水的单独溶剂或任意比例的混合溶剂。这种情况下,也可以1mM~2M的范围内的浓度添加作为添加物的例如磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、氯化钾、乙酸铵、乙酸三乙基铵、乙酸钠、乙酸钾、Tris-HCl、乙二胺四乙酸,在1~9的范围调整溶液的pH。
通过重复实施步骤A~步骤D的操作,能够制得所需链长的低聚RNA(B)。作为该制法中用于制造低聚RNA(B)的起始原料,可使用R4a为取代基(13)的核酸衍生物(17a)、R4a为H或酰氧基的核酸衍生物(17a)或R2为酰基的核酸衍生物(17b)等。但是,作为起始原料,使用R4a为H或酰氧基的核酸衍生物(17a)或R2为酰基的核酸衍生物(17b)时,作为核酸单体化合物必须使用至少1种本发明的亚磷酰胺化合物。
此外,该制法中在实施步骤E的操作前进行步骤G的操作,然后进行步骤E的操作,接着再进行步骤F和步骤H的操作,也可分离精制低聚RNA(B)。
实施例
以下,例举实施例对本发明进行更详细的说明,但本发明并不仅限定于此。
参考例1甲硫基甲基2-氰基乙基醚
将32g(450mmol)3-羟基丙腈溶于450ml二甲亚砜,加入324mL乙酸酐和231mL乙酸,室温下搅拌24小时。将990g碳酸氢钠溶于4.5L水调制成溶液,用1小时的时间将反应液滴入该溶液中。在该状态下搅拌1小时,用乙酸乙酯萃取反应液,用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂,用硅胶柱色谱法对所得油状物进行精制,获得41g呈无色油状物的目标化合物(收率70%)。1H-NMR(CDCl3):δ2.18(s,3H);2.66(t,2H,J=6.3Hz);3.77(t,2H,J=6.3Hz);4.69(s,2H)
参考例2 2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷
步骤1 3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基) 尿苷的制备
氩气氛下,将150mg(0.3mmol)3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)尿苷溶于7mL的THF,加入54mg(0.4mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和100mg分子筛4A,搅拌10分钟。将反应液冷却至0℃,加入含10mg(0.06mmol)三氟甲磺酸的THF溶液2mL,搅拌后加入92mg(0.4mmol)N-碘琥珀酰亚胺,搅拌1小时。用硅藻土过滤反应液,用二氯甲烷洗涤后,有机层用1M硫代硫酸氢钠水溶液洗涤,再用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤,然后用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂。用薄层色谱法对所得残渣进行精制,获得3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(150mg,收率85%)。
1H-NMR(CDCl3):δ0.97-1.12(m,28H);2.68-2.73(m,2H);3.78-3.86(m,1H);3.96-4.05(m,2H);4.12-4.30(m,4H);5.0-5.04(m,2H);5.70(d,1H,J=8.2Hz);5.75(s,1H);7.90(d,1H,J=8.2Hz);9.62(br.s,1H)
ESI-质谱:570[M+H]+
步骤2 2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制备
将200mg(0.35mmol)步骤1获得的3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷溶于2mL甲醇,再加入65mg(1.76mmol)氟化铵,于50℃加热搅拌5小时。放冷后加入乙腈搅拌,过滤浓缩。用硅胶柱色谱法对所得残渣进行精制,获得目标化合物(108mg,收率94%)。
1H-NMR(CD3OD):δ2.72-2.76(t,2H,J=6.2Hz);3.68-3.92(m,4H);4.00-4.03(m,1H);4.26-4.32(m,2H);4.81-4.95(m,2H);5.71(d,1H,J=8.1Hz);6.00(d,1H,J=3.3Hz);8.10(d,1H,J=8.1Hz)
ESI-质谱:350[M+Na]+
参考例3 2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷
步骤1 3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基) 尿苷的制备
氩气氛下,将50.2g(103mmol)3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)尿苷溶于400mL的THF,加入21.0g(160mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和40g分子筛4A,进行干燥。将反应液冷却至-45℃,加入24.0g(160mmol)三氟甲磺酸并搅拌后,加入将36.1g(161mmol)N-碘琥珀酰亚胺溶于100ml的THF而得的溶液,搅拌15分钟。冷却下,加入三乙胺进行中和,室温下过滤反应液,用二氯甲烷稀释后,用硫代硫酸钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤,蒸除溶剂。将所得反应混合物溶于乙酸乙酯,用水、硫代硫酸钠水溶液和饱和食盐水进行洗涤,再用无水硫酸钠干燥,蒸除溶剂,获得3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(64.2g,收率定量)。
步骤2 2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制备
将64.2g(103mmol)步骤1获得的3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷溶于500mL甲醇,再加入15.3g(413mmol)氟化铵,于50℃加热搅拌5小时。放冷后蒸除溶剂。在残渣中加入乙腈并搅拌后过滤。滤液用己烷洗涤后浓缩,获得目标化合物(40.5g,收率定量)。
参考例4 N 4 -乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷
步骤1 N 4 -乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基 乙氧基甲基)胞苷的制备
混合1.00g(1.89mmol)N4-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)胞苷和500mg(3.79mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚,将混合物溶于10mL甲苯和10mL THF的混合溶剂。然后,加入975mg(3.79mmol)三氟甲磺酸银,再加入分子筛4A,干燥。冰冷下加入370mg(2.08mmol)N-溴琥珀酰亚胺,将反应容器遮光,搅拌10分钟。再追加70mg(0.39mmol)N-溴琥珀酰亚胺,搅拌25分钟。反应结束后加入二氯甲烷稀释,用饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤,用无水硫酸钠干燥,蒸除溶剂,用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制,获得N4-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(936mg,收率81%)。
1H-NMR(CDCl3):δ0.90-1.11(m,28H);2.28(s,3H);2.62-2.79(m,2H);3.78-3.89(m,1H);3.96-4.04(m,2H);4.19-4.23(m,3H);4.30(d,1H,J=13.6Hz);5.00(d,1H,J=6.8Hz);5.09(d,1H,J=6.8Hz);5.77(s,1H);7.44(d,1H,J=7.5Hz);8.30(d,1H,J=7.5Hz);10.13(s,1H)
ESI-质谱:611[M+H]+
步骤2 N 4 -乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制备
将500mg(0.819mmol)步骤1获得的N4-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2.5mL THF和2.5mL甲醇的混合溶剂,加入150mg(4.10mmol)氟化铵,于50℃反应4小时。反应结束后,用乙腈稀释,过滤,蒸除溶剂,再用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制,获得目标化合物(210mg,收率70%)。
1H-NMR(D2O):δ2.13(s,3H);2.66-2.71(m,2H);3.72-3.78(m,3H);3.90(dd,1H,J=13.0,2.6Hz);4.06-4.11(m,1H);4.20(dd,1H,J=7.1,5.2Hz);4.29(dd,1H,J=5.1,2.9Hz);4.83(d,1H,J=7.2Hz);4.94(d,1H,J=7.2Hz);5.95(d,1H,J=2.9Hz);7.25(d,1H,J=7.6Hz);8.25(d,1H,J=7.6Hz)
ESI-质谱:391[M+Na]+
参考例5 N 4 -乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷
氩气氛下,将50g(95mmol)的N4-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)胞苷溶于500mL的THF,加入18.64g(142mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和40g分子筛4A,-45℃搅拌30分钟。滴加21.41g(142mmol)三氟甲磺酸后,加入31.97g(142mmol)N-碘琥珀酰亚胺,搅拌30分钟。在反应液中加入三乙胺80ml,过滤后用乙酸乙酯萃取,有机层依次用1M硫代硫酸氢钠水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤,然后用无水硫酸钠干燥,蒸除溶剂。
将所得残渣溶于300mL的THF,加入18.3g(110mmol)三乙胺三氢氟酸盐,于45℃搅拌2小时。过滤生成的沉淀,用经冷却的THF洗涤,干燥,获得目标化合物(27g,收率78%)。
参考例6 N 6 -乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷
步骤1 N 6 -乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基 乙氧基甲基)腺苷的制备
使245mg(1.09mmol)N-碘琥珀酰亚胺和280mg(1.09mmol)三氟甲磺酸银悬浮于8mL二氯甲烷,加入分子筛4A,干燥。冰冷下在其中加入400mg(0.73mmol)的N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)腺苷和145mg(1.11mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于4mL的二氯甲烷而形成的溶液,在该状态下搅拌3小时。反应结束后加入二氯甲烷进行稀释,用硫代硫酸钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤,用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂,所得混合物用硅胶柱色谱法精制,获得N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(201mg,收率45%)。1H-NMR(CDCl3):δ0.98-1.11(m,28H);2.62(s,3H);2.69(td,2H,6.5,J=1.5Hz);3.81-3.89(m,1H);4.02-4.09(m,2H);4.17(d,1H,J=9.4Hz);4.28(d,1H,J=13.4Hz);4.50(d,1H,J=4.5Hz);4.67(dd,1H,J=8.8,4.5Hz);5.02(d,1H,J=7.0Hz);5.08(d,1H,J=7.0Hz);6.10(s,1H);8.34(s,1H);8.66(s,1H);8.67(s,1H)
ESI-质谱:636[M+H]+
步骤2N 6 -乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备
将300mg(0.47mmol)步骤1获得的N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于0.1mL乙酸和2mL的0.5M氟化四丁基铵的THF溶液的混合溶液,室温下搅拌2小时。反应结束后用硅胶柱色谱法对所得反应混合物进行精制,获得目标化合物(160mg,收率86%)。
1H-NMR(DMSO-d6):δ2.25(s,3H);2.53-2.68(m,2H);3.41-3.46(m,1H);3.56-3.64(m,2H);3.69-3.73(m,1H);4.00-4.01(m,1H);4.36-4.37(m,1H);4.72-4.78(m,3H);5.20(bt,2H);5.41(d,1H,J=5.2Hz);6.17(d,1H,J=5.7Hz);8.66(s,1H);8.72(s,1H);10.72(s,1H)
ESI-质谱:415[M+Na]+
参考例7 N 6 -乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷
步骤1 N 6 -乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-甲硫基 甲基腺苷的制备
将15g(27.4mmol)N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)腺苷溶于100mL二甲亚砜、80mL乙酸酐和80mL乙酸的混合溶液中,室温下彻夜搅拌。将150g碳酸氢钠悬浮于1L的水而调制出悬浮液,将反应混合物注入该悬浮液后用乙酸乙酯萃取,蒸除溶剂。将残渣再次溶于乙酸乙酯,用水洗涤,用无水硫酸钠干燥,浓缩。所得混合物用硅胶柱色谱法精制,获得N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-甲硫基甲基腺苷(7.2g,收率52%)。
1H-NMR(CDCl3):δ0.96-1.11(m,28H);2.20(s,3H);2.61(s,3H);4.03(dd,1H,J=13.4,2.4Hz);4.18(d,1H,J=9.1Hz);4.27(d,1H,J=13.4Hz);4.63-4.71(m,2H);5.00(d,1H,J=11.5Hz);5.07(d,1H,J=11.5Hz);6.09(s,1H);8.31(s,1H);8.65(s,1H);8.69(s,1H)
ESI-质谱:634[M+Na]+
步骤2 N 6 -乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基 乙氧基甲基)腺苷的制备
将49.0g(80.1mmol)步骤1获得的N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-甲硫基甲基腺苷和142g(2.00mol)3-羟基丙腈混合,溶于500mL的THF。加入分子筛4A,干燥,冷却至-45℃。接着,加入21.6g(96.1mmol)N-碘琥珀酰亚胺,再加入24.2g(161mmol)三氟甲磺酸,于-45℃搅拌20分钟。反应结束后,在冷却的状态下加入三乙胺进行中和,用二氯甲烷稀释,再用硫代硫酸钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤,蒸除溶剂。将所得反应混合物溶于乙酸乙酯,用水和饱和食盐水洗涤,用无水硫酸钠干燥,蒸除溶剂,用己烷和乙酸乙酯重结晶并用硅胶柱色谱法精制,获得N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(45.6g,收率90%)。
1H-NMR(CDCl3):δ0.98-1.11(m,28H);2.62(s,3H);2.69(td,2H,6.5,J=1.5Hz);3.81-3.89(m,1H);4.02-4.09(m,2H);4.17(d,1H,J=9.4Hz);4.28(d,1H,J=13.4Hz);4.50(d,1H,J=4.5Hz);4.67(dd,1H,J=8.8,4.5Hz);5.02(d,1H,J=7.0Hz);5.08(d,1H,J=7.0Hz);6.10(s,1H);8.34(s,1H);8.66(s,1H);8.67(s,1H)
ESI-质谱:635.5[M+H]+
步骤3 N 6 -乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备
将44g(69mmol)步骤2获得的N6-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于150mL的THF,在其中加入13.4g(83mmol)的三乙胺三氢氟酸盐溶于50mL的THF而形成的溶液,于45℃搅拌1小时。反应结束后,加入50mL己烷,冰冷下搅拌,吸滤析出物,获得目标化合物(29g,收率定量)。
参考例8 N 2 -苯氧基乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷
步骤1 N 2 -苯氧基乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’- O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备
氩气氛下,将2.0g(3.0mmol)N2-苯氧基乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)鸟苷溶于16mL的THF,加入0.99g(7.6mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和1.0g分子筛4A,于-45℃搅拌10分钟。然后,加入0.68g(4.5mmol)三氟甲磺酸的5mL THF溶液,搅拌后加入1.02g(4.5mmol)N-碘琥珀酰亚胺,搅拌15分钟。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液,过滤后用乙酸乙酯萃取,有机层用1M硫代硫酸氢钠水溶液洗涤,再依次用水和饱和氯化钠水溶液洗涤,接着用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂。所得残渣用硅胶柱色谱法精制,获得N2-苯氧基乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷(2.0g,收率89%)。
1H-NMR(CDCl3):δ0.99-1.11(m,28H);2.59-2.77(m,2H);3.82-4.05(m,3H);4.15(d,1H,J=9.3Hz);4.25-4.35(m,2H);4.52-4.56(dd,1H,J=9.3,4.3Hz);5.00,5.07(2d,2H,J=7.2Hz);5.95(s,1H);6.99-7.12(m,3H);7.35-7.40(m,2H);8.09(s,1H);9.38(br.s,1H);11.85(br.s,1H)
ESI-质谱:766[M+Na]+
步骤2 N 2 -苯氧基乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备
在2.83mL(2.83mmol)的1M氟化四丁基铵的THF溶液中加入0.14mL(0.14mmol)乙酸,调制出用于脱离硅取代基的试剂。将1.0g(1.35mmol)步骤1获得的N2-苯氧基乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷溶于2.83mL的THF,在其中加入先前调制的用于脱离硅取代基的试剂,氩气氛下于室温搅拌1小时。减压下浓缩反应液后将其溶于二氯甲烷,用硅胶柱色谱法精制,获得目标化合物(0.67g,收率99%)。
1H-NMR(DMSO-d6):δ2.59-2.66(m,2H);3.41-3.63(m,4H);3.98(m,1H);4.32(m,1H);4.58-4.62(t,1H,J=5.3Hz);4.71-4.78(dd,2H,J=13.1,6.8Hz);4.87(s,2H);5.12(s,1H);5.37(s,1H);5.97(d,1H,J=6.1Hz);6.96-6.99(m,3H);7.28-7.34(m,2H);8.30(s,1H);11.78(br.s,2H)
ESI-质谱:500[M-H]-
参考例9 N 2 -苯氧基乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷
步骤1 N 2 -苯氧基乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’- O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备
氩气氛下,将36g(55mmol)N2-苯氧基乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)鸟苷溶于380mL的THF,加入17.2g(131mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和36g分子筛4A,于-45℃搅拌10分钟。滴加12.3g(82mmol)三氟甲磺酸后加入18.4g(82mmol)N-碘琥珀酰亚胺,搅拌20分钟。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液,过滤后用乙酸乙酯萃取,有机层用1M硫代硫酸氢钠水溶液洗涤,再依次用水和饱和氯化钠水溶液洗涤,接着用无水硫酸镁干燥,蒸除溶剂。所得残渣用硅胶柱色谱法精制,获得N2-苯氧基乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷(32g,收率79%)。
步骤2 N 2 -苯氧基乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备
将47g(63mmol)的N2-苯氧基乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷溶于280mL乙腈,加入15.3g(95mmol)三乙胺三氢氟酸盐,于35℃搅拌2小时。用100ml己烷对反应液进行萃取,在剩余的乙腈层中加入30ml水,室温下搅拌5分钟。过滤生成的沉淀,用经冷却的水和乙腈的混合溶剂(1∶1)洗涤,干燥,获得目标化合物(22g,收率69%)。
实施例1 2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷
将50.6g(104mmol)3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)尿苷溶于104mL的THF,氩气氛下于0℃加入0.76mL(10.4mmol)甲磺酸、158g(624mmol)碘和16.4g(125mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚。45分钟后在饱和碳酸氢钠水溶液和饱和硫代硫酸钠水溶液的混合溶剂中加入反应溶液,用乙酸乙酯萃取。有机层用饱和食盐水洗涤。用硫酸镁干燥,减压浓缩,获得粗生成物。
在所得粗生成物中加入300mL甲醇,氩气氛下于室温搅拌的同时加入11.6g氟化铵。升温至50℃,搅拌7.5小时。反应结束后加入乙腈,滤去不溶物。用己烷洗涤滤液后减压浓缩,获得目标化合物(21.5g,收率63%)。
实施例2 N 4 -乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷
将70g(133mmol)N4-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)胞苷溶于133mL的THF,氩气氛下于0℃加入10.3mL(160mmol)甲磺酸、201g(798mmol)碘和19.9g(200mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚。30分钟后在饱和碳酸氢钠水溶液和饱和硫代硫酸钠水溶液的混合溶剂中加入反应溶液,用乙酸乙酯萃取。有机层用饱和食盐水洗涤。用硫酸镁干燥,减压浓缩,获得粗生成物。
在所得粗生成物中加入266mL的THF,氩气氛下于室温搅拌的同时加入25.9mL三乙胺三氢氟酸盐。升温至45℃,搅拌1小时。反应结束后放冷至室温,用THF洗涤析出的沉淀物,获得目标化合物(42.0g,收率86%)。
实施例3 N 6 -乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷
将60g(109mmol)N4-乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)腺苷溶于109mL的THF,氩气氛下于0℃搅拌的同时加入1.04g(10.9mmol)甲磺酸、165.6g(654mmol)碘和21.3g(164mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚。2小时后在饱和碳酸氢钠水溶液和饱和硫代硫酸钠水溶液的混合溶剂中加入反应溶液,用乙酸乙酯萃取。收集的有机层用饱和食盐水洗涤。用硫酸镁干燥,减压浓缩,获得粗生成物。
在所得粗生成物中加入218mL的THF,氩气氛下于室温搅拌的同时加入21.3mL三乙胺三氢氟酸盐。升温至45℃,搅拌3小时。反应结束后放冷至室温,滤取析出的沉淀物,用THF及甲醇和乙酸乙酯的混合溶剂(1∶9)洗涤,获得目标化合物(28.4g,收率67%)。
实施例4 N 2 -苯氧基乙酰基-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷
将52.8g(80mmol)N2-苯氧基乙酰基-3’,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)鸟苷溶于180mL的THF,氩气氛下于0℃搅拌的同时加入7.69g(80mmol)甲磺酸、1.20g(8mmol)三氟甲磺酸、203.0g(800mmol)碘、31.5g(240mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚。1小时后在饱和碳酸氢钠水溶液和饱和硫代硫酸钠水溶液的混合溶剂中加入反应溶液,用乙酸乙酯萃取。收集的有机层用饱和食盐水洗涤。用硫酸镁干燥,减压浓缩,获得粗生成物。
在所得粗生成物中加入170mL的THF,氩气氛下于室温搅拌的同时加入15.6mL三乙胺三氢氟酸盐。升温至35℃,搅拌2小时。反应结束后放冷至室温,加入17mL水,滤取析出的沉淀物,获得目标化合物(16.7g,收率42%)。
实施例5 5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)-5-甲 基尿苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)
步骤1 3′,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-5-甲基尿苷的制备
在27g(105mml)5-甲基尿苷中加入300ml吡啶,冰冷下滴加35g(110mmol)1,3-二氯四异丙基二硅氧烷,室温下搅拌4小时。减压浓缩反应液后用乙酸乙酯萃取,用饱和食盐水洗涤。用硫酸镁干燥,减压浓缩,获得54.6g作为粗生成物的3′,5’-O-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-5-甲基尿苷。
步骤2 2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)-5-甲基尿苷的制备
氩气氛下,将45g(89.9mmol)步骤1获得的粗生成物溶于90mL的THF,于0℃加入0.58mL(8.99mmol)甲磺酸、137g(539mmol)碘和14.1g(107.8mmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚。30分钟后在饱和碳酸氢钠水溶液和饱和硫代硫酸钠水溶液的混合溶剂中加入反应溶液,用乙酸乙酯萃取。有机层用饱和食盐水洗涤。用硫酸镁干燥,减压浓缩,获得粗生成物。
在所得粗生成物中加入250mL甲醇,氩气氛下于室温搅拌的同时加入10.0g氟化铵。升温至50℃,搅拌11小时。反应结束后减压浓缩,在残渣中加入300ml乙腈和90ml甲醇,滤去不溶物。滤液用己烷洗涤后减压浓缩,用150ml乙醇析出了2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)-5-甲基尿苷(23.3g,收率76%)。
1H-NMR(D2O):δ1.79(s,3H);2.58-2.74(m,2H);3.68-3.84(m,4H);3.99-4.03(m,1H);4.23-4.32(m,2H);4.74-4.83(m,2H);5.93(d,1H,J=3Hz);7.62(s,1H)
步骤3 5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)-5-甲基 尿苷的制备
在20.7g(60.6mmol)步骤2获得的2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)-5-甲基尿苷中加入150ml脱水四氢呋喃和150ml脱水吡啶后,加入50g经活化的分子筛4A和22.6g(66.7mmol)4,4’-二甲氧基三苯甲基氯,室温下彻夜搅拌。反应结束后,在反应液中加入5ml甲醇,搅拌15分钟后吸滤反应液,用乙酸乙酯洗涤,浓缩滤液。在残渣中加入饱和碳酸氢钠水溶液,用乙酸乙酯进行萃取操作,有机层用饱和食盐水洗涤后用硫酸镁干燥,过滤,浓缩。所得残渣用硅胶柱色谱法精制,获得5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)-5-甲基尿苷(35.6g,收率91.2%)。
1H-NMR(CDCl3):δ2.05(s,1H);2.62-2.68(m,3H);3.41-3.58(m,2H);3.79(s,6H);3.84(t,2H,J=6.1Hz);4.03-4.13(m,2H);4.38-4.41(m,1H);4.48-4.54(m,1H);4.91,5.05(2d,2H,J=6.9Hz);6.04(d,1H,J=3.2Hz);6.83-6.86(m,4H);7.22-7.42(m,10H);7.63(d,1H,J=1.1Hz);8.96(br.s,1H)
步骤4 5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)-5-甲基 尿苷3’-O-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)的制备
将38g(59mmol)步骤3获得的5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-(2-氰基乙氧基甲基)-5-甲基尿苷溶于350ml脱水乙腈,加入15g经活化的分子筛4A、11.1g(64.9mmol)二异丙基氨基四唑盐、19.6g(64.9mmol)双(N,N-二异丙基氨基)氰基乙基亚磷酸盐,于40℃搅拌3小时。过滤反应液,浓缩滤液。所得残渣用硅胶柱色谱法精制,获得目标化合物(44g,收率88%)。
31P NMR(CDCl3):δ152.072;153.108
产业上利用的可能性
利用本发明可以低成本、简便且大量地制得作为制造各种核糖核酸衍生物的中间体有用的核糖核酸衍生物(3)。此外,由于能够以高于现有方法的浓度实施反应,因此可减少反应溶剂的用量。
因此,利用本发明可以低成本地制造亚磷酰胺化合物(A),该亚磷酰胺化合物(A)能够用于作为基因分析的RNA探针、RNA药物原材料(利用反义RNA、核酶、RNAi的基因表达控制)、人工酶、适体有用的低聚RNA(B)的制造。
Claims (27)
2.如权利要求1所述的核糖核酸衍生物的制造方法,其特征在于,酸为甲磺酸或三氟甲磺酸和甲磺酸的混合酸。
3.如权利要求1或2所述的核糖核酸衍生物的制造方法,其特征在于,R3为甲基。
4.如权利要求1或2所述的核糖核酸衍生物的制造方法,其特征在于,WG1为氰基。
5.如权利要求3所述的核糖核酸衍生物的制造方法,其特征在于,WG1为氰基。
6.以下的通式(A)表示的亚磷酰胺化合物的制造方法,
式(A)中,Bz表示可具有保护基的核酸碱基,R2a、R2b相同或不同,表示烷基或表示R2a、R2b与邻接的氮原子一起形成的5~6元的饱和氨基环基,该饱和氨基环基除了氮原子以外可具有1个作为成环原子的氧原子或硫原子,W G1、WG2相同或不同,表示吸电子基团,R1表示以下的通式(5)表示的取代基,
式(5)中,R11、R12、R13相同或不同,表示氢或烷氧基,
其特征在于,包括下述步骤:在使以下的通式(2)表示的单缩硫醛化合物与以下的通式(1)表示的核糖核酸衍生物反应而制造以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物的工序中,在酸存在下,通过用碘作为将单缩硫醛化合物(2)的硫原子卤化的试剂来制造以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物,
式(1)、(2)及(3)中,Bz表示可具有保护基的核酸碱基,WG1表示吸电子基团,R3表示烷基或芳基,A表示以下的通式(4a)或(4b)表示的硅取代基,
式(4a)及(4b)中,R6表示烷基。
7.如权利要求6所述的亚磷酰胺化合物的制造方法,其特征在于,酸为甲磺酸或三氟甲磺酸和甲磺酸的混合酸。
8.如权利要求6或7所述的亚磷酰胺化合物的制造方法,其特征在于,R3为甲基。
9.如权利要求6或7所述的亚磷酰胺化合物的制造方法,其特征在于,WG1为氰基。
10.如权利要求8所述的亚磷酰胺化合物的制造方法,其特征在于,WG1为氰基。
11.以下的通式(A)表示的亚磷酰胺化合物的制造方法,
式(A)中,Bz表示可具有保护基的核酸碱基,R2a、R2b相同或不同,表示烷基或表示R2a、R2b与邻接的氮原子一起形成的5~6元的饱和氨基环基,该饱和氨基环基除了氮原子以外可具有1个作为成环原子的氧原子或硫原子,WG1、WG2相同或不同,表示吸电子基团,R1表示以下的通式(5)表示的取代基,
式(5)中,R11、R12、R13相同或不同,表示氢或烷氧基,
其特征在于,包括下述步骤a~d:
步骤a:
在使以下的通式(2)表示的单缩硫醛化合物与以下的通式(1)表示的核糖核酸衍生物反应而制造以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物的工序中,在酸存在下,通过用碘作为将单缩硫醛化合物(2)的硫原子卤化的试剂来制造以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物的步骤,
式(1)、(2)及(3)中,Bz、WG1如前所述,R3表示烷基或芳基,A表示以下的通式(4a)或(4b)表示的硅取代基,
式(4a)及(4b)中,R6表示烷基;
步骤b:
使用于脱离硅取代基的试剂作用于步骤a中制得的核糖核酸衍生物(3)而制备以下的通式(7)表示的核糖核酸衍生物的步骤,
式(3)及(7)中,A、Bz、WG1如前所述;
步骤c:
通过使以下的通式(8)表示的R1X3作用于步骤b中制得的核糖核酸衍生物(7)的5位羟基,导入酸性条件下脱离的保护基R1,藉此制备以下的通式(9)表示的核糖核酸衍生物的步骤,
式(7)、(8)及(9)中,Bz、R1、WG1如前所述,X3表示卤素;
步骤d:
使亚磷酰胺化试剂和根据需要使用的活化剂作用于步骤c中制得的核糖核酸衍生物(9),藉此制备3位羟基被亚磷酰胺化的以下的通式(A)表示的亚磷酰胺化合物的步骤,
式(9)及(A)中,Bz、R1、R2a、R2b、WG1、WG2如前所述。
12.如权利要求11所述的亚磷酰胺化合物的制造方法,其特征在于,酸为甲磺酸或三氟甲磺酸和甲磺酸的混合酸。
13.如权利要求11或12所述的亚磷酰胺化合物的制造方法,其特征在于,R3为甲基。
14.如权利要求11或12所述的亚磷酰胺化合物的制造方法,其特征在于,WG1为氰基。
15.如权利要求13所述的亚磷酰胺化合物的制造方法,其特征在于,WG1为氰基。
19.如权利要求15所述的亚磷酰胺化合物的制造方法,其特征在于,亚磷酰胺化试剂为以下的通式(10a)或(10b)表示的化合物,
式(10a)及(10b)中,R2a、R2b相同或不同,表示烷基或表示R2a、R2b与邻接的氮原子一起形成的5~6元的饱和氨基环基,该饱和氨基环基除了氮原子以外可具有1个作为成环原子的氧原子或硫原子,WG2表示吸电子基团,X1表示卤素。
20.如权利要求11或12所述的亚磷酰胺化合物的制造方法,其特征在于,步骤d中使用的活化剂为1H-四唑、5-乙硫基四唑、5-苯甲基巯基-1H-四唑、4,5-二氯咪唑、4,5-二氰基咪唑、三氟甲磺酸苯并三唑盐、三氟甲磺酸咪唑盐、三氟甲磺酸吡啶盐、N,N-二异丙基乙胺或2,4,6-三甲基吡啶/N-甲基咪唑。
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