CN116848127A - 缀合寡核苷酸化合物、其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供适用于治疗用途的新型缀合寡核苷酸化合物。此外，本发明提供制备这些化合物的方法，以及使用此类化合物用于治疗各种疾病和病症的方法。
Description
技术领域
本发明提供适用于治疗用途的新型缀合寡核苷酸化合物。此外，本发明提供制备这些化合物的方法，以及使用此类化合物用于治疗各种疾病和病症的方法。
背景技术
寡核苷酸化合物在医学上具有重要的治疗应用。寡核苷酸可用于使导致特定疾病的基因沉默。基因沉默通过抑制翻译来阻止蛋白质的形成。重要的是，基因沉默剂是抑制与疾病相关的蛋白质功能的传统小型有机化合物的有前途的替代品。siRNA、反义RNA和微小RNA是通过基因沉默阻止蛋白质形成的寡核苷酸。
在过去的二十年中，特别是为了诊断和治疗目的开发了许多经修饰的siRNA化合物，包括用于治疗各种疾病的SiRNA/RNAi治疗剂，该疾病包括中枢神经系统疾病、炎性疾病、代谢障碍、肿瘤、传染性疾病和眼部疾病。
将寡核苷酸有效递送至体内细胞需要特异性靶向和实质性保护以免受细胞外环境(特别是血清蛋白)的影响。实现特异性靶向的一种方法是将配体靶向部分缀合至寡核苷酸试剂。配体靶向部分有助于将寡核苷酸递送至所需的靶位点。例如，将包含末端半乳糖或其衍生物的配体靶向部分与寡核苷酸附接有助于经由结合去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)靶向肝细胞。
需要新型配体缀合的寡核苷酸及其制备方法。
发明内容
本发明提供新型配体缀合的寡核苷酸化合物、制备这些化合物的方法及其用途。
本文提供了包含以下结构的化合物：
其中：
r和s独立地是选自1至16的整数；并且
Z是寡核苷酸部分。
本文提供了式(II)的化合物：
本文提供了式(III)的化合物：
本文提供了式(VIII)的化合物：
本文提供了式(IX)的化合物：
本文提供了一种制备如本文任何地方所述的化合物的方法，该方法包括使式(X)的化合物和式(XI)的化合物反应：
其中：
r和s独立地是选自1至16的整数；并且
Z是寡核苷酸部分；
并且在适当情况下进行配体的脱保护和/或寡核苷酸的第二链的退火。
本文提供了式(X)的化合物：
其中：
r独立地是选自1至16的整数；并且Z是寡核苷酸部分。
本文提供了式(Xa)的化合物：
本文提供了式(Xb)的化合物：
本文提供了式(XI)的化合物：
其中：
s独立地是选自1至16的整数；并且Z是寡核苷酸部分。
本文提供了式(XIa)的化合物：
本文提供了式(XIb)的化合物：
本文提供了如本文任何地方所述的化合物用于制备如本文任何地方所述的化合物的用途。
本文提供了通过如本文任何地方所述的方法获得或可获得的化合物。
本文提供了一种药物组合物，其包含如本文任何地方所述的化合物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本文提供了用于治疗的如本文任何地方所述的化合物。
附图说明
图1显示了总共45种人源性癌细胞裂解物和原代人肝细胞(PHH)裂解物中hsC5mRNA表达水平的分析。mRNA表达水平以相对光单位[RLU]显示。
图2显示了总共45种人源性癌细胞裂解物和原代人肝细胞(PHH)裂解物中hsHAO1mRNA表达水平的分析。mRNA表达水平以相对光单位[RLU]显示。
图3显示了总共45种人源性癌细胞裂解物和原代人肝细胞(PHH)裂解物中hsTTRmRNA表达水平的分析。mRNA表达水平以相对光单位[RLU]显示。
图4A-D显示了实例1中HepG2细胞中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图5A-D显示了实例1中HepG2细胞中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图6显示了所有三批原代人肝细胞BHuf16087(左)、CHF2101(中)和CyHuf19009(右)各自在培养0小时、24小时、48小时和72小时后的hsTTR(上)、hsC5(中)和hsHAO1(下)mRNA表达水平的分析。mRNA表达水平以相对光单位[RLU]显示。
图7显示了所有三批原代人肝细胞BHuf16087(左)、CHF2101(中)和CyHuf19009(右)各自在培养0小时、24小时、48小时和72小时后的hsGAPDH(上)和hsAHSA1(下)mRNA表达水平的分析。mRNA表达水平以相对光单位[RLU]显示。
图8A-D显示了实例1中PHH中靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图9A-D显示了实例1中PHH中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图10A-D显示了实例1中PHH中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图11ETX006的单剂量小鼠药理学。HAO1 mRNA表达相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
图12ETX006的单剂量小鼠药理学。显示了血清乙醇酸浓度。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差，除了来自一组5只小鼠的基线乙醇酸浓度(第0天)以外。
图13ETX015的单剂量小鼠药理学。C5 mRNA表达相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
图14ETX0015的单剂量小鼠药理学。血清C5浓度相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
图15ETX024的单剂量NHP药理学。血清TTR浓度相对于研究第1天显示。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。
图16.ETX020的单剂量NHP药理学。血清TTR浓度相对于研究第1天以及给药前显示。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。显示最多84天的时间点。
图17ETX022的单剂量NHP药理学。血清TTR浓度相对于研究第1天以及给药前显示。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。显示最多84天的时间点。
图18a ETX024的单剂量NHP药理学。血清TTR浓度相对于研究第1天以及给药前显示。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。显示最多84天的时间点。
图18b.在单次1mg/kg剂量的ETX024后持续抑制肝脏中的TTR基因表达。TTR mRNA相对于给药前测量的基线水平显示。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。显示最多84天的时间点。
图18c.用单次1mg/kg剂量的ETX024给药的动物体重。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。显示最多84天的时间点。
图18d用单次1mg/kg剂量的ETX024处理的动物的血清中的ALT浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。虚线显示对该物种被认为正常的值的范围(Park等人2016Reference values of clinical pathology parameter in cynomolgus monkeysused in preclinical studies.Lab Anim Res 32:79-86.)显示最多84天的时间点。
图18e.用单次1mg/kg剂量的ETX024处理的动物血清中的AST浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。虚线显示对该物种被认为正常的值的范围(Park等人2016Reference values of clinical pathology parameter in cynomolgus monkeysused in preclinical studies.Lab Anim Res 32:79-86。显示最多84天的时间点。
图19ETX026的单剂量NHP药理学。血清TTR浓度相对于研究第1天以及给药前显示。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。显示最多84天的时间点。
图20ETX006、008、0015、0016、0024和0026的接头和配体部分。
图21ETX002、004、0011、0013、0020和0022的接头和配体部分。
图22.用单次1mg/kg剂量的ETX024处理的动物血清中的总胆红素浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。阴影部分显示在用于研究的设施中被认为正常的值的范围。虚线显示对该物种被认为正常的值(Park等人2016Reference values of clinicalpathology parameter in cynomolgus monkeys used in preclinical studies.LabAnim Res 32:79-86.)
图23.用单次1mg/kg剂量的ETX024处理的动物的血尿素氮(BUN)浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。阴影部分显示在用于研究的设施中被认为正常的值的范围。虚线显示对该物种被认为正常的值(Park等人2016Reference values of clinicalpathology parameter in cynomolgus monkeys used in preclinical studies.LabAnim Res 32:79-86.)
图24.用单次1mg/kg剂量的ETX024处理的动物的肌酐(CREA)浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。阴影部分显示在用于研究的设施中被认为正常的值的范围。虚线显示对该物种被认为正常的值(Park等人2016Reference values of clinicalpathology parameter in cynomolgus monkeys used in preclinical studies.LabAnim Res 32:79-86.)
图25-27在下面更详细地描述。
图28显示了本文公开的式的细节。
图29：图29a显示了如本文所述的构建体ETX002的有义(SS)和反义(AS)链的基础核苷酸序列。对于ETX002，galnac接头与使用中的有义链的5'端区域附接(图29a中未描绘)。对于ETX002，galnac接头被附接并且如图21所示。后续段落中提及图29a是提及ETX002的序列、构建体设计和修饰模式。
如图29a中有义链的3'端区域所示的iaia表示(i)在有义链的3'端区域作为倒数第二个和末端核苷酸提供的两个无碱基核苷酸，(ii)其中在有义链的倒数第三个核苷酸(即在有义链位置21的A，其中位置1是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链5'端区域的末端G)与相邻的倒数第二个无碱基残基之间提供3'-3'反向连接，和(iii)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的3'端区域读取时，末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的连接是5'-3'。
对于图29a的有义链，当从有义链的位置1(是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链的5'端区域的末端G)读取时，则：(i)在位置1至6、8和12至21的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置7和9至11的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)无碱基核苷酸具有在位置1和2具有H的糖。
对于图29a的反义链，当从反义链的位置1(是反义链的末端5'核苷酸，即在反义链5'端区域的末端U)读取时，则：(i)在位置1、3至5、7、10至13、15、17至23的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置2、6、8、9、14、16的核苷酸具有2'F修饰的糖。
如本文所述的ETX004具有与图29a中针对ETX002所描绘的相同的基础序列和galnac接头以及附接，但没有末端iaia基序并且在核苷酸的糖上具有完全交替的2'O-甲基/2'F修饰模式。对于有义链，完全交替的修饰模式从在有义链5'端区域位置1的2'F修饰开始。对于反义链，完全交替的修饰模式从在反义链5'端区域位置1的2'O-甲基修饰开始。
图29b显示了如本文所述的构建体ETX006的有义(SS)和反义(AS)链的基础核苷酸序列。对于ETX006，galnac接头与使用中的有义链的3'端区域附接(图29b中未描绘)。对于ETX006，galnac接头被附接并且如图20所示。后续段落中提及图29b是提及ETX006的序列、构建体设计和修饰模式。
如图29b中有义链的5'端区域所示的iaia表示(i)在有义链的5'端区域作为倒数第二个和末端核苷酸提供的两个无碱基核苷酸，(ii)其中在有义链的倒数第三个核苷酸(即在有义链位置1的G，在有义链上的核苷酸位置编号中不包括在有义链的5'端区域的iaia基序)与相邻的倒数第二个无碱基残基之间提供5'-5'反向连接，和(iii)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的5'端区域读取时，末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的连接是3'-5'。
对于图29b的有义链，当从有义链的位置1(是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链的5'端区域的末端G，在有义链上的核苷酸位置编号中不包括在有义链的5'端区域的iaia基序)读取时，则：(i)在位置1至6、8和12至21的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置7和9至11的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)无碱基核苷酸具有在位置1和2具有H的糖。
对于图29b的反义链，当从反义链的位置1(是反义链的末端5'核苷酸，即在反义链5'端区域的末端U)读取时，则：(i)在位置1、3至5、7、10至13、15、17至23的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置2、6、8、9、14、16的核苷酸具有2'F修饰的糖。
如本文所述的ETX008具有与图29b中针对ETX006所描绘的相同的基础序列和galnac接头以及附接，但没有末端iaia基序并且在核苷酸的糖上具有完全交替的2'O-甲基/2'F修饰模式。对于有义链，完全交替的修饰模式从在有义链5'端区域位置1的2'F修饰开始。对于反义链，完全交替的修饰模式从在反义链5'端区域位置1的2'O-甲基修饰开始。
图30：图30a显示了如本文所述的构建体ETX011的有义(SS)和反义(AS)链的基础核苷酸序列。对于ETX011，galnac接头与使用中的有义链的5'端区域附接(图30a中未描绘)。对于ETX011，galnac接头被附接并且如图21所示。后续段落中提及图30a是提及ETX011的序列、构建体设计和修饰模式。
如图30a中有义链的3'端区域所示的iaia表示(i)在有义链的3'端区域作为倒数第二个和末端核苷酸提供的两个无碱基核苷酸，(ii)其中在有义链的倒数第三个核苷酸(即在有义链位置21的A，其中位置1是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链5'端区域的末端A)与相邻的倒数第二个无碱基残基之间提供3'-3'反向连接，和(iii)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的3'端区域读取时，末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的连接是5'-3'。
对于图30a的有义链，当从有义链的位置1(是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链的5'端区域的末端A)读取时，则：(i)在位置1、2、4、6、8、12、14、15、17、19至21的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置3、5、7、9至11、13、16、18的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)无碱基核苷酸具有在位置1和2具有H的糖。
对于图30a的反义链，当从反义链的位置1(是反义链的末端5'核苷酸，即在反义链5'端区域的末端U)读取时，则：(i)在位置1、4、6、7、9、11至13、15、17、19至23的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置2、3、5、8、10、14、16、18的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)在反义链3'端区域位置24、25的倒数第二个和末端T核苷酸具有在位置2具有H的糖。
如本文所述的ETX013具有与图30a中针对ETX011所描绘的相同的基础序列和galnac接头以及附接，但没有末端iaia基序并且在核苷酸的糖上具有完全交替的2'O-甲基/2'F修饰模式(除了在位置2具有H的末端T核苷酸以外)。对于有义链，完全交替的修饰模式从在有义链5'端区域位置1的2'F修饰开始。对于反义链，完全交替的修饰模式从在反义链5'端区域位置1的2'O-甲基修饰开始。
图30b显示了如本文所述的构建体ETX015的有义(SS)和反义(AS)链的基础核苷酸序列。对于ETX015，galnac接头与使用中的有义链的3'端区域附接(图30b中未描绘)。对于ETX015，galnac接头被附接并且如图20所示。后续段落中提及图30b是提及ETX015的序列、构建体设计和修饰模式。
如图30b中有义链的5'端区域所示的iaia表示(i)在有义链的5'端区域作为倒数第二个和末端核苷酸提供的两个无碱基核苷酸，(ii)其中在有义链的倒数第三个核苷酸(即在有义链位置1的A，在有义链上的核苷酸位置编号中不包括在有义链的5'端区域的iaia基序)与相邻的倒数第二个无碱基残基之间提供5'-5'反向连接，和(iii)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的5'端区域读取时，末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的连接是3'-5'。
对于图30b的有义链，当从有义链的位置1(是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链的5'端区域的末端A，在有义链上的核苷酸位置编号中不包括在有义链的5'端区域的iaia基序)读取时，则：(i)在位置1、2、4、6、8、12、14、15、17、19至21的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置3、5、7、9至11、13、16、18的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)无碱基核苷酸具有在位置1和2具有H的糖。
对于图30b的反义链，当从反义链的位置1(是反义链的末端5'核苷酸，即在反义链5'端区域的末端U)读取时，则：(i)在位置1、4、6、7、9、11至13、15、17、19至23的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置2、3、5、8、10、14、16、18的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)在反义链3'端区域位置24、25的倒数第二个和末端T核苷酸具有在位置2具有H的糖。
如本文所述的ETX017具有与图30b中针对ETX015所描绘的相同的基础序列和galnac接头以及附接，但没有末端iaia基序并且在核苷酸的糖上具有完全交替的2'O-甲基/2'F修饰模式(除了在位置2具有H的末端T核苷酸以外)。对于有义链，完全交替的修饰模式从在有义链5'端区域位置1的2'F修饰开始。对于反义链，完全交替的修饰模式从在反义链5'端区域位置1的2'O-甲基修饰开始。
图31：图31a显示了如本文所述的构建体ETX020的有义(SS)和反义(AS)链的基础核苷酸序列。对于ETX020，galnac接头与使用中的有义链的5'端区域附接(图31a中未描绘)。对于ETX020，galnac接头被附接并且如图21所示。后续段落中提及图31a是提及ETX020的序列、构建体设计和修饰模式。
如图31a中有义链的3'端区域所示的iaia表示(i)在有义链的3'端区域作为倒数第二个和末端核苷酸提供的两个无碱基核苷酸，(ii)其中在有义链的倒数第三个核苷酸(即在有义链位置21的A，其中位置1是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链5'端区域的末端U)与相邻的倒数第二个无碱基残基之间提供3'-3'反向连接，和(iii)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的3'端区域读取时，末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的连接是5'-3'。
对于图31a的有义链，当从有义链的位置1(是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链的5'端区域的末端U)读取时，则：(i)在位置1至6、8和12至21的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置7和9至11的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)无碱基核苷酸具有在位置1和2具有H的糖。
对于图31a的反义链，当从反义链的位置1(是反义链的末端5'核苷酸，即在反义链5'端区域的末端U)读取时，则：(i)在位置1、3至5、7、8、10至13、15、17至23的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置2、6、9、14、16的核苷酸具有2'F修饰的糖。
如本文所述的ETX022具有与图31a中针对ETX020所描绘的相同的基础序列和galnac接头以及附接，但没有末端iaia基序并且在核苷酸的糖上具有完全交替的2'O-甲基/2'F修饰模式。对于有义链，完全交替的修饰模式从在有义链5'端区域位置1的2'F修饰开始。对于反义链，完全交替的修饰模式从在反义链5'端区域位置1的2'O-甲基修饰开始。
图31b显示了如本文所述的构建体ETX024的有义(SS)和反义(AS)链的基础核苷酸序列。对于ETX024，galnac接头与使用中的有义链的3'端区域附接(图31b中未描绘)。对于ETX024，galnac接头被附接并且如图20所示。后续段落中提及图31b是提及ETX024的序列、构建体设计和修饰模式。
如图31b中有义链的5'端区域所示的iaia表示(i)在有义链的5'端区域作为倒数第二个和末端核苷酸提供的两个无碱基核苷酸，(ii)其中在有义链的倒数第三个核苷酸(即在有义链位置1的U，在有义链上的核苷酸位置编号中不包括在有义链的5'端区域的iaia基序)与相邻的倒数第二个无碱基残基之间提供5'-5'反向连接，和(iii)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的5'端区域读取时，末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的连接是3'-5'。
对于图31b的有义链，当从有义链的位置1(是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链的5'端区域的末端U，在有义链上的核苷酸位置编号中不包括在有义链的5'端区域的iaia基序)读取时，则：(i)在位置1至6、8和12至21的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置7和9至11的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)无碱基核苷酸具有在位置1和2具有H的糖。
对于图31b的反义链，当从反义链的位置1(是反义链的末端5'核苷酸，即在反义链5'端区域的末端U)读取时，则：(i)在位置1、3至5、7、8、10至13、15、17至23的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置2、6、9、14、16的核苷酸具有2'F修饰的糖。
如本文所述的ETX026具有与图31b中针对ETX024所描绘的相同的基础序列和galnac接头以及附接，但没有末端iaia基序并且在核苷酸的糖上具有完全交替的2'O-甲基/2'F修饰模式。对于有义链，完全交替的修饰模式从在有义链5'端区域位置1的2'F修饰开始。对于反义链，完全交替的修饰模式从在反义链5'端区域位置1的2'O-甲基修饰开始。
具体实施方式
本发明提供新型配体缀合的寡核苷酸化合物、制备这些化合物的方法及其用途。
如本文所公开，本发明的化合物包含寡核苷酸部分和/或接头和/或配体部分或它们的部分。优选地，本发明的化合物包含寡核苷酸部分、接头和配体部分。这些部分可以共价结合在一起，使得寡核苷酸部分经由接头与配体部分共价结合。
应当理解，本发明的化合物可以结合如本文任何地方所述的任何寡核苷酸部分，和/或如本文任何地方所述的任何接头，和/或如本文任何地方所述的任何配体部分。
本发明的示例性化合物包含以下一般结构：
其中：
r和s独立地是选自1至16的整数；并且
Z是寡核苷酸部分。
1.配体部分
本发明的示例性化合物包含‘配体部分’，如式(I)中所描绘的。
在一些实施例中，如式(I)中所描绘的配体部分包含一个或多个配体。
在一些实施例中，如式(I)中所描绘的配体部分包含一个或多个碳水化合物配体。
在一些实施例中，一个或多个碳水化合物可以是单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖和/或多糖。
在一些实施例中，一个或多个碳水化合物包含一个或多个半乳糖部分、一个或多个乳糖部分、一个或多个N-乙酰半乳糖胺部分和/或一个或多个甘露糖部分。
在一些实施例中，一个或多个碳水化合物包含一个或多个N-乙酰基-半乳糖胺部分。
在一些实施例中，如本文任何地方所述的化合物包含两个或三个N-乙酰半乳糖胺部分。
在一些实施例中，一种或多种配体以线性构型或分支构型附接，例如每种构型分别与总接头中的分支点附接。
配体部分的示例性线性构型或分支构型可以如下使用在下文第2、3和4节中进一步解释的命名法描绘。
示例性线性构型：
其中(a)和/或(b)通常可以表示连接键或基团，诸如磷酸或硫代磷酸基团，并且虚线框涵盖接头部分。
示例性分支构型：
其中虚线框涵盖接头部分。
在一些实施例中，一种或多种配体以双触角或三触角分支构型附接。通常，可以优选三触角分支构型，诸如N-乙酰半乳糖胺三触角分支构型。
2.接头
本发明的示例性化合物包含‘接头部分’，如式(I)中所描绘的，它是总‘接头’的一部分。
如本领域将进一步理解的，本发明的示例性化合物包含位于这些化合物的寡核苷酸部分与配体部分之间的总接头。总接头因而将寡核苷酸部分和配体部分相互‘连接’。
总接头通常在理论上被设想为包含一个或多个接头结构单元。例如，存在被描绘为如式(I)中所示的‘接头部分’的接头部分，该接头部分定位成与配体部分相邻并且通常经由分支点将配体部分直接或间接地与寡核苷酸部分附接。式(I)中描绘的接头部分通常也可以称为总接头的‘配体臂’。在寡核苷酸部分与分支点之间也可以但不总是存在进一步的接头部分，该接头部分通常被称为总接头的‘系链部分’，其将寡核苷酸部分‘系’到缀合化合物的其余部分。此类‘配体臂’和/或‘接头部分’和/或‘系链部分’可通过参考如上所列的线性和/或分支构型来设想。
从权利要求和专利说明书的其余部分可以看出，本发明的范围扩展到线性或分支构型，并且不限制可能存在的单个配体的数量。此外，访问者还将意识到，根据现有技术和寡核苷酸化学家的专业知识，存在可以用作接头部分的许多结构。
如权利要求和专利说明书的其余部分所列的总接头的其余部分(接头部分除外)由其在式(I)中的化学成分显示，发明人认为该化学成分对于本发明而言是特别独特的。然而，在更一般的术语中，这些化学成分可以被描述为如上文所述的‘系链部分’，其中‘系链部分’是总接头的包含Z之间的原子团的部分(即寡核苷酸部分)以及如式(I)中所描述的接头部分。
2.1系链部分
关于式(I)，‘系链部分’包含Z之间的原子团(即寡核苷酸部分)和接头部分。
在一些实施例中，s是选自4至12的整数。在一些实施例中，s是6。
在一些实施例中，r是选自4至14的整数。在一些实施例中，r是6。在一些实施例中，r是12。
在一些实施例中，r是12并且s是6。
因此，在一些实施例中，本发明的示例性化合物包含以下结构：
在一些实施例中，r是6并且s是6。
因此，在一些实施例中，本发明的示例性化合物包含以下结构：
2.2接头部分
关于式(I)，式(I)中描绘的‘接头部分’包含位于如本文任何地方所述的系链部分与如本文任何地方所述的配体部分之间的原子团。
在一些实施例中，如本文任何地方所述的式(I)中描绘的部分：
是式(IV)、(V)或(VI)中的任一种，优选式(IV)：
其中：
AI是氢或合适的羟基保护基；
a是2或3的整数；并且
b是2至5的整数；或者
其中：
AI是氢或合适的羟基保护基；
a是2或3的整数；并且
c和d独立地是1至6的整数；或者
其中：
AI是氢或合适的羟基保护基；
a是2或3的整数；并且
e是2至10的整数。
在一些实施例中，如本文任何地方所述的式(I)中描绘的部分：
是式(VIa)：
其中：
AI是氢或合适的羟基保护基；
a是3；并且
b是整数3。
在一些实施例中，如本文任何地方所述的式(I)中描绘的部分：
是式(VII)：
其中：
AI是氢；
a是2或3的整数。
在一些实施例中，a＝2。在一些实施例中，a＝3。在一些实施例中，b＝3。
3.寡核苷酸部分
本发明的示例性化合物包含寡核苷酸部分，其在式(I)中描绘为‘Z’。
在一些实施例中，Z是：
其中：
Z1、Z2、Z3、Z4在每次出现时独立地是氧或硫；并且
P和Z2之间以及P和Z3之间的键中的一个是单键，并且另一个键是双键。
在一些实施例中，寡核苷酸是能够调节靶基因的表达的RNA化合物。在一些实施例中，寡核苷酸是能够抑制靶基因的表达的RNA化合物。
在一些实施例中，RNA化合物包含RNA双链体，该RNA双链体包含第一链和第二链，其中第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中第一链和第二链中的每一个都具有5'端和3'端。
在一些实施例中，第一链与靶基因的RNA序列至少80％互补，诸如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％互补，诸如在第一链的长度上100％互补。
在一些实施例中，RNA化合物在其第二链的5'端与相邻的磷酸附接。
在一些实施例中，RNA化合物在其第二链的3'端与相邻的磷酸附接。
应当理解，当RNA化合物在第二链的5'端附接时，将寡核苷酸与接头部分连接的磷酸基团(即连接到Z1、Z2、Z3和Z4的‘P’)是来自寡核苷酸的5'末端核糖的天然存在的磷酸基团。
应当理解，当RNA化合物在第二链的3'端附接时，将寡核苷酸与接头部分连接的磷酸基团(即连接到Z1、Z2、Z3和Z4的‘P’)被工程化到寡核苷酸的3'末端核糖上以替代在位置3'的天然存在的羟基基团。
在一些实施例中，寡核苷酸包含RNA双链体，其进一步包含在位置2'被修饰的一个或多个核糖。在一些实施例中，RNA双链体包含在位置2'被修饰的多个核糖。在一些实施例中，修饰选自2'-O-甲基、2'-脱氧-氟和2'-脱氧。
在一些实施例中，寡核苷酸进一步包含在一个或多个端处的一个或多个降解保护部分。在一些实施例中，所述一个或多个降解保护部分不存在于寡核苷酸链的携带接头/配体部分的端处。在一些实施例中，所述一个或多个降解保护部分不存在于寡核苷酸链的与如式(I)、(VII)、(IX)、(X)或(XI)所示的化合物的其余部分相邻的端。在一些实施例中，所述一个或多个降解保护部分选自硫代磷酸核苷酸间键、二硫代磷酸核苷酸间键和反向无碱基核苷酸，其中所述反向无碱基核苷酸存在于相同链的相对于携带接头/配体部分的端的远端处。
4.示例性化合物
本发明的化合物结合了如本文任何地方所述的任何寡核苷酸部分、如本文任何地方所述的任何接头部分和/或如本文任何地方所述的任何配体部分，或它们的部分。
在一些实施例中，化合物包含式(VIII)：
在一些实施例中，化合物包含式(IX)：
4.1中间体化合物
本发明的化合物还包括在如本文任何地方所述的本发明生产方法期间生产或使用的中间体化合物，该中间体化合物用于生产如本文任何地方所述的化合物。
因此，在一些实施例中，化合物包含式(X)的化合物：
其中：
r独立地是选自1至16的整数；并且
Z是寡核苷酸部分。
在一些实施例中，化合物包含式(Xa)：
在一些实施例中，化合物包含式(Xb)：
在一些实施例中，化合物包含式(XI)：
其中：
s独立地是选自1至16的整数；并且
Z是寡核苷酸部分。
在一些实施例中，化合物包含式(XIa)：
在一些实施例中，化合物包含式(XIb)：
5.生产方法
本发明进一步提供了一种制备如本文任何地方所述的化合物的方法。本发明进一步提供了一种制备如本文任何地方所述的组合物的方法。
在一些实施例中，该方法包括使式(X)的化合物和式(XI)的化合物反应：
其中：
r和s独立地是选自1至16的整数；并且
Z是寡核苷酸部分；
并且在适当情况下进行配体的脱保护和/或寡核苷酸的第二链的退火。
在一些实施例中，式(X)是式(Xa)：
且式(XI)的化合物是式(XIa)：
其中寡核苷酸包含RNA双链体，该RNA双链体包含第一链和第二链，其中第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中第一链和第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的5'端与相邻的磷酸附接。
在一些实施例中，式(X)是式(Xb)：
且式(XI)的化合物是式(XIa)：
其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的所述3'端与相邻的磷酸附接。
在一些实施例中，式(XIa)是式(XIb)：
6.用途
本发明涉及如本文任何地方所述的化合物和组合物的用途。
本发明还涉及如本文任何地方所述的化合物用于制备如本文任何地方所述的另一种化合物的用途。
本发明还涉及通过如本文任何地方所述的方法获得或可获得的化合物。
因此，本发明涉及一种药物组合物，其包含如本文任何地方所述的化合物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还涉及用于治疗的如本文任何地方所述的化合物或药物组合物。
本发明也涵盖合适的剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与其他治疗剂的组合、前药制剂。
本发明的化合物可作为研究试剂使用，例如用于诊断、治疗和预防。
在治疗中，本发明的化合物可以用于特异性调节细胞中靶蛋白的合成。这可以通过降解、沉默或抑制所述靶蛋白的mRNA来实现，从而阻止所述蛋白质的形成。可替代地，本发明的化合物可以用于调节非编码DNA或RNA分子，对细胞和实验动物的细胞内机制发挥调节作用，从而促进靶标的功能分析或其作为治疗干预靶标的有用性的评估。
在优选的实施例中，靶蛋白在表面包含去唾液酸糖蛋白受体(ASPGR)的靶细胞(诸如肝脏细胞，特别是肝细胞)中。
因此，本发明的化合物可以用作怀疑患有疾病或障碍的动物或人的疗法，该疾病或障碍可以通过在所述动物或人中调节编码哺乳动物靶多肽的DNA或RNA来缓解或治疗。
在优选的实施例中，靶核酸是基因、信使RNA(mRNA)或微小RNA(miRNA)。
进一步提供了通过施用治疗或预防有效量的一种或多种本发明的化合物或组合物来治疗怀疑患有或易于患有疾病或病症的哺乳动物(诸如治疗人)的方法。
本发明还提供了如所述的本发明的化合物或缀合物在制造用于治疗障碍的药物中的用途或用于治疗受调节靶核酸影响的障碍的方法中的用途。
本发明还提供了一种治疗障碍的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用根据本发明的化合物和/或根据本发明的药物组合物。
待治疗的障碍的实例是肝脏疾病，诸如肝炎(包括病毒性肝炎，诸如HBV或HCV)、肝脂肪变性、动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症例如载脂蛋白B的功能获得性突变、HDL/LDL胆固醇失衡、血脂异常例如家族性高脂血症(FCHL)、获得性高脂血症、他汀类抗性高胆固醇血症、冠状动脉疾病(CAD)和冠心病(CHD)、肝硬化和癌症。
7.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用语旨在具有所要求保护的主题物所属领域的普通技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为清晰起见和/或为便于参考，本文定义了具有通常理解含义的术语，并且与现有技术中通常理解的术语定义相比，本文包含的这些定义不一定解释成表示与本领域的通常理解存在明显差异。
应当理解，本发明不限于特定的组合物或生物系统，这些组合物或生物系统当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。应注意的是，除非上下文另外明确表示，否则如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a/an)”以及“所述(the)”均包括复数指代物。
如本文所用的术语“约”是指为此技术领域中的技术人员容易知晓的相应值的常见误差范围。在本文中提及“约”值或参数包括(且描述)涉及该值或参数本身的实施例。
应当理解，本文所述的发明的方面和实施例包括“包含”、“由以下组成”及“基本上由以下组成”所指的方面和实施例。
如本文所用，术语“和/或”是指与该术语相关联的项目中的任何一项、该项目的任何组合或所有项目。例如，短语“A、B和/或C”旨在涵盖以下实施例中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或B；A或C；B或C；A和B；A和C；B和C；A和B或C；B和A或C；C和A或B；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
术语“互补”是指当一个序列可以以反平行方式与另一个序列结合时两个序列是互补的，其中每个序列的3'-端与另一个序列的5'-端结合，并且一个序列的每个A、T(U)、G和C则分别与另一个序列的T(U)、A、C和G对齐。
8.实例
通过参考以下实例将更全面地理解本发明。然而，它们不应被解释为限制本发明的范围。应当理解，本文描述的实例和实施例仅用于说明目的，并且其各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和界限内以及所附权利要求的范围内。
实例中使用以下构建体：
表1：
在表1中，具有以下命名(NHC6)、(NH2C12)和(ET-GalNAc-T2CO)的括号中的组分是接头元件的描述符，并且完整的相应接头结构显示于本文的图20和图21中。这种缩写与实际接头结构的对应关系类似地适用于本文上述缩写的所有其他引用。
提及(invabasic)(invabasic)是指一种多核苷酸，其中末端2个糖部分是无碱基的且处于反向构型，倒数第二个糖部分和倒数第三个糖之间的键是反向键(5-5或3-3键)。
表1A
实例中还使用以下对照构建体：
表2：
缩写：
AHSA1 热休克蛋白ATPase1激活剂
ASGR1 去唾液酸糖蛋白受体1
ASO 反义寡核苷酸
bDNA 分支DNA
bp 碱基对
C5 补体C5
conc. 浓度
ctrl. 对照
CV 变异系数
dG,dC,dA,dT DNA残基
F 氟
FCS 胎牛血清
GalNAc N-乙酰半乳糖胺
GAPDH 甘油醛3-磷酸脱氢酶
G、C、A、U RNA残基
g、c、a、u 2’-O-甲基修饰残基
Gf、Cf、Af、Uf 2'-氟修饰残基h 小时
HAO1 羟基酸氧化酶1
HPLC 高效液相色谱法
Hs 智人
IC50 响应降低50％时抑制剂的浓度
ID 标识符
KD 敲低
LF2000 Lipofectamine2000
M 摩尔
Mf 食蟹猴
min 分钟
MV 平均值
n.a.或N/A 不适用
NEAA 非必需氨基酸
nt 核苷酸
QC 质量控制
QG2.0 QuantiGene 2.0
RLU 相对光单位
RNAi RNA干扰
RT 室温
s 硫代磷酸主链修饰
SAR 构效关系
SD 标准偏差
siRNA 小干扰RNATTR 转甲状腺素蛋白
8.1实例1
-发明内容
合成并QC靶向hsHAO1、hsC5或hsTTR mRNA的GalNAc-siRNA。整个siRNA集(靶向HAO1的siRNA除外)首先通过使用RNAiMAX进行的转染在HepG2细胞中在剂量响应设置下进行研究，然后在原代人肝细胞中在裸式自由摄取设置下在剂量响应分析中进行研究。
将原代人肝细胞与靶向hsHAO1、hsC5或hsTTR mRNA的GalNAc-siRNA直接一起孵育导致不同程度的剂量依赖性在靶mRNA沉默。
-研究目的
该实验集的目的是分析不同GalNAc配体在靶向三种不同在靶(即hsHAO1、hsC5或hsTTR mRNA)的siRNA背景下的体外活性。
这项研究的工作包包括(i)测定开发以设计、合成和测试对每一个单独的目标在靶具有特异性的bDNA探针集，(ii)鉴定适合后续筛选实验的细胞系，(iii)一种或多种人癌细胞系中可能的所有siRNA(通过转染)的剂量响应分析，以及(iv)在裸式自由摄取环境下在原代人肝细胞中siRNA的剂量响应分析。在这两种环境下，应计算IC50值和最大抑制值，然后根据其效力对siRNA研究集进行排名。
-材料和方法
寡核苷酸合成
标准固相合成方法用于化学合成目标siRNA(见表1)以及对照(见表2)。
细胞培养和体外转染实验
细胞培养、转染和QuantiGene2.0分支DNA测定如下所述，并且siRNA序列列于表1和表2。HepG2细胞由美国组织培养物保藏中心(ATCC)提供(HB-8065，批号：63176294)并在ATCC配制的补充含有10％胎牛血清(FCS)的Eagle最低基础培养基中培养。原代人肝细胞(PHH)来源于Primacyt(德国什未林)(批号：CyHuf19009HEc)。细胞是通过外植体技术从恶性胶质母细胞瘤肿瘤获得。本研究中使用的所有细胞均于37℃在含5％ CO2的大气中在加湿培养箱中培养。
为了用靶向hsC5或hsTTR的siRNA(和对照)转染HepG2细胞，将细胞以20.000个细胞/孔的密度接种在常规96孔组织培养板中。根据制造商的说明，使用市售转染试剂RNAiMAX(Invitrogen/Life Technologies)利用siRNA转染细胞。在HepG2细胞中进行20个候选物的10点剂量响应实验(11x hsC5、9x hsTTR)，siRNA终浓度分别为24nM、6nM、1.5nM、0.4nM、0.1nM、0.03nM、0.008nM、0.002nM、0.0005nM和0.0001nM。
PHH中的剂量响应分析通过在裸式自由摄取环境中直接孵育细胞来进行，从1.5μM最高siRNA终浓度开始，然后是500nM，此后以两倍稀释步骤连续下降。
将对照孔转染到HepG2细胞中或直接与原代人肝细胞在相应板上研究的最高测试siRNA浓度下一起孵育。表2总结并列出了细胞模拟处理后不同项目阶段中包括的所有对照siRNA。对于每个siRNA和对照，至少四个孔被平行转染/直接孵育，并从每个孔收集单独的数据点。
转染后与siRNA一起孵育24小时后，去除培养基并在裂解混合物(1体积裂解缓冲液加2体积无核酸酶的水)中裂解HepG2细胞，然后在53℃下孵育至少45分钟。在PHH的情况下，在细胞处理后5小时去除铺板培养基，然后每孔添加50μl完全维持培养基。以这种方式每24小时更换一次培养基，直至72小时的总孵育期。在4小时或72小时的时间点，去除细胞培养上清液，然后添加200μl补充有1:1000v/v蛋白酶K的裂解混合物。
根据制造商的说明进行分支DNA(bDNA)测定。在存在底物的情况下在黑暗中孵育30分钟后，使用1420发光计数器(WALLAC VICTOR Light,Perkin Elmer,Rodgau-Jügesheim,德国)读取发光。对于每个孔，将在靶mRNA水平标准化为hsGAPDH mRNA水平。任一siRNA的活性表示为处理细胞中的在靶mRNA浓度(标准化为hsGAPDH mRNA)相对于对照孔中的平均在靶mRNA浓度(标准化为hsGAPDH mRNA)的百分比。
测定开发
QuantiGene2.0分支DNA(bDNA)探针集是特别针对智人GAPDH、AHSA1、hsHAO1、hsC5和hsTTR设计和合成的。bDNA探针集最初根据制造商的说明通过bDNA分析进行测试，评估了两种不同裂解物量(即10μl和50μl)的紧邻原代人肝细胞的以下人和猴癌细胞系中的目标mRNA水平：SJSA-1、TF1、NCI-H1650、Y-79、Kasumi-1、EAhy926、Caki-1、Colo205、RPTEC、A253、HeLaS3、Hep3B、BxPC3、DU145、THP-1、NCI-H460、IGR37、LS174T、Be(2)-C、SW 1573、NCI-H358、TC71、22Rv1、BT474、HeLa、KBwt、Panc-1、U87MG、A172、C42、HepG2、LNCaP、PC3、SupT11、A549、HCT116、HuH7、MCF7、SH-SY5Y、HUVEC、C33A、HEK293、HT29、MOLM 13和SK-MEL-2。仅含bDNA探针集而不添加细胞裂解物的孔用于监测技术背景和噪声信号。
-结果
鉴定适合筛选GalNAc-siRNA的细胞类型
图1至图3显示了三种目标在靶(即hsC5、hsHAO1和hsTTR)在人癌细胞系加原代人肝细胞的一个多样化集的裂解物中的mRNA表达数据。测试的每个细胞系的细胞数/裂解物体积相同，这是允许比较不同细胞类型之间的表达水平所必需的。图1显示了测试的所有细胞类型的hsC5 mRNA表达数据。
还筛选表达hsHAO1 mRNA的相同细胞类型，结果显示在作为图2一部分的条形图中。
最后，鉴定了合适的细胞类型，该细胞类型将允许筛选靶向hsTTR的GalNAc-siRNA，相应数据是图3的一部分。
总之，所有三个目标在靶的mRNA表达水平在原代人肝细胞(PHH)中都足够高。此外，HepG2细胞可以用于筛选靶向hsC5和hsTTR mRNA的GalNAc-siRNA，相比之下，无法鉴定出适合测试对hsHAO1 mRNA具有特异性的siRNA的癌细胞系。
HepG2细胞中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
转染优化后，使用RNAiMAX在剂量响应设置下，用靶向hsTTR的整个GalNAc-siRNA集(见表1)转染HepG2细胞。最高siRNA测试终浓度为24nM，以九个四倍稀释步骤下降。实验在HepG2细胞转染后4小时和24小时结束。表3列出了所有研究的靶向hsTTR的GalNAC-siRNA的活性数据。
表3：HepG2细胞中靶向hsTTR的siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表按照外部ID排序，孵育4小时在上，并且孵育24小时在下。
24小时孵育的结果也显示在图4A-D中
通常，用靶向hsTTR的siRNA转染HepG2细胞会导致在靶mRNA沉默，通常跨越从0％沉默到最大抑制的整个活性范围。与仅在转染后4小时生成的数据相比，转染后24小时生成的数据更稳健，标准偏差更低。此外，在靶敲低的程度通常会随着时间的推移(从孵育4小时直至24小时)而增加。已鉴定出使在靶mRNA沉默>95％的hsTTR GalNAc-siRNA，IC50值在低两位数pM范围内。
HepG2细胞中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
第二个目标靶标hsC5 mRNA通过使用RNAiMAX转染HepG2细胞在相同的剂量响应设置(无论如何，siRNA测试终浓度差异最小)下进行测试，其中GalNAc-siRNA与hsTTR siRNA具有相同的停留/位置/GalNAc-配体变异，但序列对在靶hsC5 mRNA具有特异性。
表4：HepG2细胞中靶向hsC5的siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表按照外部ID排序，孵育4小时在上，并且孵育24小时在下。
24小时孵育的结果也显示在图5A-D中
在用对hsC5具有特异性的GalNAc-siRNA集转染HepG2细胞后，存在剂量依赖性的在靶hsC5 mRNA沉默。在细胞转染后4小时已经可以检测到一些敲低，在更长的孵育期(即24小时)后观察到甚至更高的在靶沉默。已鉴定出使在靶mRNA沉默将近90％的hsC5GalNAc-siRNA，IC50值在低个位数pM范围内。
鉴定适合测试所有GalNAc-siRNA的原代人肝细胞批次
人癌细胞系HepG2中两个GalNAc-siRNA集的剂量响应分析应证明(并确保)所有新的GalNAc-/接头/位置/帽变体确实是有效结合AGO2并加载到RISC中的底物，并且另外能够在RNAi介导的靶mRNA切割中发挥作用。然而，为了测试靶向GalNAc配体衍生物是否允许有效摄取到肝细胞中，应通过裸式自由摄取设置在原代人肝细胞中进行剂量响应分析实验。肝细胞确实以高水平专门表达去唾液酸糖蛋白受体(ASGR1)，并且肝脏通常使用该受体从循环中去除靶糖蛋白。现在众所周知，某些类型的与GalNAc配体缀合的寡核苷酸(例如siRNA或ASO)被这种高周转受体识别，并经由网格蛋白包被的囊泡有效地摄取到细胞质中并运输到内体隔室中。内体逃逸被认为是寡核苷酸递送的限速步骤。
进行中间体测定开发实验，其中测试了不同批次的原代人肝细胞的相关目标基因(即hsC5、hsTTR、hsHAO1、hsGAPDH和hsAHSA1)的表达水平。Primacyt(德国什未林)提供了三瓶不同的原代人肝细胞批次用于测试，即BHuf16087、CHF2101和CyHuf19009。将细胞接种在涂有胶原蛋白的96孔组织培养板上，随后将细胞孵育0小时、24小时、48小时和72小时，然后进行细胞裂解和bDNA分析以监测目标mRNA水平。图6显示了原代人肝细胞批次BHuf16087、CHF2101和CyHuf19009中所有三个目标在靶(hsTTR、hsC5和hsHAO1)的绝对mRNA表达数据。hsGAPDH和hsAHSA1的mRNA表达水平如图7所示。
在图6和图7中，每个数据集三元组的左侧列是BHuf16087，中间列是CHF2101，并且右侧列是CyHuf19009。
总体而言，原代人肝细胞批次BHuf16087和CyHuf19009中所有三个目标在靶的mRNA表达在72小时后都足够高以继续进行bDNA测定。由于可用于进一步实验的小瓶总量，我们继续使用批次CyHuf19009进行实验。
PHH中靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
在鉴定出合适的原代人肝细胞(PHH)批次(CyHuf19009)后，对表1中所列的靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA进行裸式自由摄取分析。测试的最高siRNA终浓度为1.5μM，然后是500nM，以八个两倍连续稀释步骤下降至1.95nM的最低siRNA终浓度。实验在PHH细胞直接孵育后4小时和72小时结束。表5列出了所有研究的靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的活性数据。表2总结并列出了本实验中包括的所有对照siRNA。
表5：原代人肝细胞(PHH)中靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表根据外部ID组织，4小时孵育和72小时孵育分别列于上部和下部。
72小时孵育的结果也显示在图8A-D中。
靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的裸式自由摄取不会在4小时内导致显著的在靶沉默，但是在72小时孵育后，在35.5％至58.1％的最大抑制范围内可见在靶沉默。
PHH中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
第二个目标靶标hsC5 mRNA在相同的剂量响应设置下通过裸式自由摄取在PHH中进行测试，GalNAc-siRNA与之前在测定中测试的hsTTR和hsHAO1具有相同的接头/位置/GalNAc-配体变异，除了对在靶hsC5 mRNA具有特异性的序列以外。靶向hsC5的GalNAc-siRNA的序列以及有关对照siRNA的所有序列和信息分别列于表1和表2中。实验在PHH直接孵育4小时和72小时后结束。表6列出了所有研究的靶向hsC5的GalNAc-siRNA的活性数据。
表6：PHH中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表根据外部ID组织，4小时孵育和72小时孵育分别列于上部和下部。
72小时孵育的结果也显示在图9A-D中。
孵育4小时后，未见到显著的GalNAc-siRNA的在靶沉默。在72小时的孵育期后生成的数据显示高达65.5％最大抑制的更稳健的在靶沉默。
PHH中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
最后一个目标靶标hsTTR mRNA再次以裸式自由摄取在PHH中以与靶标hsHAO1和hsC5相同的剂量响应设置进行测试，唯一的区别是使用在靶hsTTR mRNA的特异性siRNA序列(见表1)。
实验在PHH直接孵育72小时后结束。表7列出了所有研究的靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的活性数据。
表7：原代人肝细胞(PHH)中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表根据外部ID组织。
结果也显示在图10A-D中。
靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的裸式自由摄取确实在72小时内导致显著的在靶沉默，范围在46％至82.5％最大抑制之间。
-总结和讨论
本研究的范围是分析根据本发明的GalNAc配体在用于靶向三种不同的在靶(即hsHAO1、hsC5和hsTTR mRNA)的siRNA背景下的体外活性。对每个靶标具有特异性的siRNA集由具有不同接头/帽/修饰/GalNAc配体化学的siRNA(各自具有两个不同的反义链)组成。
对于所有靶标，表1中的GalNAc-siRNA被鉴定为显示出高总体效力和低IC50值。
8.2实例2
合成路线
i)缀合结构单元TriGalNAc的合成
薄层色谱法(TLC)在涂有二氧化硅的铝板上进行，254nm荧光指示剂来自Macherey-Nagel。在紫外光(254nm)下或用在甲醇(MeOH)中的5％ H2SO4或根据Stahl的茚三酮试剂(来自Sigma-Aldrich)喷洒后观察化合物，然后加热。使用配备有双可变UV波长检测器(200nm-400nm)的Biotage Isolera One快速色谱法仪器使用Biotage二氧化硅10g、25g、50g或100g柱(瑞典乌普萨拉)进行快速色谱法。
所有对水分敏感的反应均在无水条件下使用干燥玻璃器皿、无水溶剂和氩气氛进行。所有市售试剂均购自Sigma-Aldrich，并且溶剂购自Carl Roth GmbH+Co.KG。D-半乳糖胺五乙酸酯购自AK scientific。
HPLC/ESI-MS在Dionex UltiMate 3000RS UHPLC系统和Thermo Scientific MSQPlus质谱仪上使用Waters的Acquity UPLC Protein BEH C4柱(1.7μm，2.1x 100mm)在60℃下进行。溶剂系统由溶剂A(含0.1％甲酸的H2O)和溶剂B(含0.1％甲酸的乙腈(ACN))组成。采用15分钟内5％-100％ B的梯度，流速为0.4mL/min。探测器和条件：Corona超荷电气溶胶检测(来自esa)。雾化器温度：25℃。N2压力：35.1psi。过滤器：Corona。
1H和13C NMR谱在室温下在Varian光谱仪上在500MHz(1H NMR)和125MHz(13C NMR)下记录。化学位移以ppm给出，参考溶剂残留峰(CDCl3–1H NMR：δ在7.26ppm和13C NMRδ在77.2ppm；DMSO-d6–1H NMR：δ在2.50ppm和13C NMRδ在39.5ppm)。耦合常数以赫兹给出。信号分裂模式被描述为单峰(s)、二重峰(d)、三重峰(t)或多重峰(m)。
ii)缀合结构单元TriGalNAc的合成路线
化合物2的制备：在氩气下将D-半乳糖胺五乙酸酯(3.00g,7.71mmol,1.0eq.)溶解在无水二氯甲烷(DCM)(30mL)中，并添加三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf,4.28g,19.27mmol,2.5eq.)。将反应在室温下搅拌3小时。将反应混合物用DCM(50mL)稀释并用冷饱和NaHCO3水溶液(100mL)和水(100mL)洗涤。将有机层分离，经Na2SO4干燥并浓缩，得到呈黄色油状物的标题化合物，将其通过快速色谱法(梯度洗脱：0-10％ MeOH于DCM中，10CV)纯化。获得呈无色油状物的产物(2.5g,98％,rf＝0.45(2％ MeOH于DCM中))。
化合物4的制备：在氩气下，将化合物2(2.30g,6.98mmol,1.0eq.)和叠氮基-PEG3-OH(1.83g,10.5mmol,1.5eq.)溶解在无水DCM(40mL)中，并将分子筛(5g)添加到溶液中。将混合物在室温搅拌1小时。然后将TMSOTf(0.77g,3.49mmol,0.5eq.)添加到混合物中并将反应搅拌过夜。过滤分子筛，将滤液用DCM(100mL)稀释并用冷饱和NaHCO3水溶液(100mL)和水(100mL)洗涤。将有机层分离，经Na2SO4干燥，并在减压下去除溶剂。粗物质通过快速色谱法(梯度洗脱：0-3％ MeOH于DCM中，10CV)纯化，得到呈浅黄色油状物的标题产物(3.10g,88％,rf＝0.25(2％ MeOH于DCM中))。MS：C20H32N4O11的计算值为504.21。实测值为505.4。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ6.21-6.14(m,1H),5.30(dd,J＝3.4,1.1Hz,1H),5.04(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.76(d,J＝8.6Hz,1H),4.23-4.08(m,3H),3.91-3.80(m,3H),3.74-3.59(m,9H),3.49-3.41(m,2H),2.14(s,3H),2.02(s,3H),1.97(d,J＝4.2Hz,6H)。13C NMR(125MHz,CDCl3)δ170.6(C),170.5(C),170.4(C),170.3(C),102.1(CH),71.6(CH),70.8(CH),70.6(CH),70.5(CH),70.3(CH2),69.7(CH2),68.5(CH2),66.6(CH2),61.5(CH2),23.1(CH3),20.7(3xCH3)。
化合物5的制备：将化合物4(1.00g,1.98mmol,1.0eq.)溶解在乙酸乙酯(EtOAc)和MeOH的混合物(30mL 1:1v/v)中，并添加Pd/C(100mg)。使用真空/氩气循环(3x)将反应混合物脱气并在气球压力下氢化过夜。将反应混合物通过硅藻土过滤并用EtOAc(30mL)洗涤。在减压下除去溶剂，得到呈无色油状物的标题化合物(0.95g，定量产率，rf＝0.25(10％ MeOH于DCM中))。该化合物不经进一步纯化即可用。MS：C20H34N2O11的计算值为478.2。实测值为479.4。
化合物7的制备：将三{[2-(叔丁氧基羰基)乙氧基]甲基}-甲胺6(3.37g,6.67mmol,1.0eq.)溶解在DCM/水的混合物(40mL 1:1v/v)中，并在剧烈搅拌的同时添加Na2CO3(0.18g,1.7mmol,0.25eq.)。将氯甲酸苄酯(2.94mL,20.7mmol,3.10eq.)滴加到先前的混合物中并将反应在室温下搅拌24小时。将反应混合物用CH2Cl2(100mL)稀释并用水(100mL)洗涤。将有机层分离并经Na2SO4干燥。在减压下除去溶剂，并且所得粗物质通过快速色谱法(梯度洗脱：0-10％ EtOAc于环己烷中，12CV)纯化，得到呈淡黄色油状物的标题化合物(3.9g，91％，rf＝0.56(10％ EtOAc于环己烷中))。MS：C33H53NO11的计算值为639.3。实测值为640.9。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.38-7.26(m,5H),4.97(s,2H),3.54(t,6H),3.50(s,6H),2.38(t,6H),1.39(s,27H)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ170.3(3xC),154.5(C),137.1(C),128.2(2xCH),127.7(CH),127.6(2xCH),79.7(3xC),68.4(3xCH2),66.8(3xCH2),64.9(C),58.7(CH2),35.8(3xCH2),27.7(9xCH3)。
化合物8的制备：在氩气下将Cbz-NH-三-Boc-酯7(0.20g,0.39mmol,1.0eq.)溶解在CH2Cl2(1mL)中，添加三氟乙酸(TFA,1mL)并将反应在室温下搅拌1小时。在减压下除去溶剂，将残余物与甲苯(5mL)共蒸发3次并在高真空下干燥以得到作为其TFA盐的化合物(0.183g,98％)。该化合物不经进一步纯化即可用。MS：C21H29NO11的计算值为471.6。实测值为472.4。
化合物9的制备：将CbzNH-三-COOH 8(0.72g,1.49mmol,1.0eq.)和GalNAc-PEG3-NH25(3.56g,7.44mmol,5.0eq.)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(25mL)中。然后将N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)(2.78g,7.44mmol,5.0eq.)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)(1.05g,7.44mmol,5.0eq.)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(2.07mL,11.9mmol,8.0eq.)添加到溶液中并将反应搅拌72小时。在减压下除去溶剂，将残余物溶解在DCM(100mL)中并用饱和NaHCO3水溶液(100mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，蒸发溶剂，并将粗物质通过快速色谱法(梯度洗脱：0-5％ MeOH于DCM中，14CV)纯化。获得呈淡黄色油状物的产物(1.2g,43％,rf＝0.20(5％ MeOH于DCM中))。MS：C81H125N7O41的计算值为1852.9。实测值为1854.7。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.90-7.80(m,10H),7.65-7.62(m,4H),7.47-7.43(m,3H),7.38-7.32(m,8H),5.24-5.22(m,3H),5.02-4.97(m,4H),4.60-4.57(m,3H),4.07-3.90(m 10H),3.67-3.36(m,70H),3.23-3.07(m,25H),2.18(s,10H),2.00(s,13H),1.89(s,11H),1.80-1.78(m,17H)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ170.1(C),169.8(C),169.7(C),169.4(C),169.2(C),169.1(C),142.7(C),126.3(CH),123.9(CH),118.7(CH),109.7(CH),100.8(CH),70.5(CH),69.8(CH),69.6(CH),69.5(CH),69.3(CH2),69.0(CH2),68.2(CH2),67.2(CH2),66.7(CH2),61.4(CH2),22.6(CH2),22.4(3xCH3),20.7(9xCH3)。
化合物10的制备：将三触角GalNAc化合物9(0.27g,0.14mmol,1.0eq.)溶解在MeOH(15mL)中，添加3滴乙酸(AcOH)和Pd/C(30mg)。使用真空/氩气循环(3x)将反应混合物脱气并在气球压力下氢化过夜。反应完成后是质谱法，并且将所得混合物通过硅藻土薄垫过滤。蒸发溶剂并将获得的残余物在高真空下干燥并用于下一步骤而不经进一步纯化。获得呈淡黄色油状物的产物(0.24g，定量产率)。MS：C73H119N7O39的计算值为1718.8。实测值为1719.3。
化合物14的制备：在氩气下将三触角GalNAc化合物10(0.45g,0.26mmol,1.0eq.)、HBTU(0.19g,0.53mmol,2.0eq.)和DIPEA(0.23mL,1.3mmol,5.0eq.)溶解在DCM(10mL)中。向该混合物中滴加化合物13(0.14g,0.53mmol,2.0eq.)在DCM(5mL)中的溶液。将反应在室温下搅拌过夜。除去溶剂，并将残余物溶解在EtOAc(50mL)中，用水(50mL)洗涤并经Na2SO4干燥。蒸发溶剂并将粗物质通过快速色谱法(梯度洗脱：0-5％ MeOH于DCM中，20CV)纯化。获得呈白色蓬松固体的产物(0.25g,48％,rf＝0.4(10％ MeOH于DCM中))。MS：C88H137N7O42的计算值为1965.1。实测值为1965.6。
TriGalNAc(15)的制备：将三触角GalNAc化合物14(0.31g,0.15mmol,1.0eq.)溶解在EtOAc(15mL)中并添加Pd/C(40mg)。通过使用真空/氩气循环(3x)将反应混合物脱气并在气球压力下氢化过夜。通过质谱法监测反应的完成，并将所得混合物通过硅藻土薄垫过滤。在减压下除去溶剂，并且将所得残余物在高真空下干燥过夜。将残余物用于与寡核苷酸的缀合而不经进一步纯化(0.28g，定量产率)。MS：C81H131N7O42的计算值为1874.9。实测值为1875.3。
iii)寡核苷酸合成
表8：
Af,Cf,Gf,Uf:2'-F RNA核苷酸
a、c、g、u：2'-O-Me RNA核苷酸
dT： DNA核苷酸
s： 硫代磷酸
invabasic： 1,2-二脱氧核糖
NH2-DEG：氨基乙氧基乙基接头
NH2C12： 氨基十二烷基接头
NH2C6： 氨基己基接头
根据亚磷酰胺方法在固相上合成寡核苷酸。根据规模，使用Mermade 12(BioAutomation Corporation)或Oligopilot(GE Healthcare)。
合成在由可控孔隙玻璃制成的市售固体支持物上进行，该支持物装载有invabasic(CPG，载量为86μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-1047-B)或2'-F A(CPG，载量为90μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-1039-B)或NH2C6(CPG，载量为85μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-1397-B)或GalNAc(CPG，载量为57μmol/g；Primetech)或2'-O-甲基C(CPG，载量为84μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-10-B)或2'-O-甲基A(CPG，载量为85μmol/g，LGC Biosearch目录号BCG-1029-B)或dT(CPG，载量为87μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-1055-B)。
2'-O-Me、2'-F RNA亚磷酰胺和辅助试剂购自SAFC Proligo(德国汉堡)。
具体而言，使用了以下2'-O-甲基亚磷酰胺：5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N-苯甲酰基-腺苷2'-O-甲基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N-苯甲酰基-胞苷2'-O-甲基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N-二甲基甲脒-鸟苷2'-O-甲基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-尿苷2'-O-甲基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。
使用了以下2'-F亚磷酰胺：5'-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰基-脱氧腺苷2'-氟-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-二甲氧基三苯甲基-N-乙酰基-脱氧胞苷2'-氟-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-二甲氧基三苯甲基-N-异丁酰-脱氧鸟苷2'-氟-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺和5'-二甲氧基三苯甲基-脱氧尿苷2'-氟-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。
为了在寡核苷酸的5'-端引入所需的氨基接头，采用2-[2-(4-单甲氧基三苯甲基)氨基乙氧基]乙基-(2-氰基乙基)-N,N-二异丙基)-亚磷酰胺(Glen Research目录号1905)和12-(三氟乙酰基氨基)十二烷基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(ChemGenes目录号CLP-1575)。使用5-O-二甲氧基三苯甲基-1,2-二脱氧核糖-3-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(ChemGenes目录号ANP-1422)引入invabasic修饰。
所有结构单元均溶解在含有分子筛的无水乙腈(100mM(Mermade12)或200mM(Oligopilot))中，除了2'-O-甲基-尿苷亚磷酰胺溶解在于无水乙腈中的50％无水DCM中以外。碘(50mM，于吡啶/H2O中，9:1v/v)用作氧化试剂。5-乙基硫代四唑(ETT，500mM，于乙腈中)用作活化剂溶液。使用100mM氢化黄原素(TCI目录号6846-35-1，在乙腈/吡啶中，4:6v/v)进行引入硫代磷酸连接的硫醇化。
除非另有说明，否则偶联时间为5.4分钟。采用双偶联步骤将5'氨基修饰掺入序列，每次偶联的偶联时间为11分钟(总偶联时间为22分钟)。氧化剂接触时间设为1.2分钟，并且硫醇化时间为5.2分钟。
序列通过去除最终的DMT基团合成，但NH2DEG序列中的MMT基团除外。
在合成结束时，使用1:1体积的28％-30％氢氧化铵溶液(Sigma-Aldrich，目录号221228)和40％甲胺水溶液(Sigma-Aldrich，目录号8220911000)在6℃下从固体支持物上切割寡核苷酸，持续16小时。然后滤出固体支持物，用H2O彻底洗涤过滤器并通过在减压下蒸发减少合并溶液的体积。用10％ AcOH(Sigma-Aldrich，目录号A6283)将所得溶液的pH调节至pH 7。
粗物质通过反相(RP)HPLC或阴离子交换(AEX)HPLC纯化。
在Pure仪器(GE Healthcare)上使用XBridge C18Prep 19x 50mm柱(Waters)进行RP HPLC纯化。缓冲液A是100mM三乙基乙酸铵(TEAAc,Biosolve)pH 7，并且缓冲液B含有在缓冲液A中的95％乙腈。采用10mL/min的流速和60℃的温度。记录在280nm处的UV迹线。采用120个柱体积内的0％ B至100％ B的梯度。将适当的级分合并并在冰箱中用3M乙酸钠(NaOAc)(Sigma-Aldrich)pH 5.2和85％乙醇(VWR)沉淀。将沉淀通过离心分离，重新溶解在水(50mL)中，用5M NaCl(5mL)处理并在Pure仪器上使用填充有Sephadex G25-Fine树脂(GE Healthcare)的50x 165mm ECO柱(YMC，德国丁斯拉肯)通过尺寸排阻HPLC脱盐。
AEX HPLC纯化在Pure仪器(GE Healthcare)上使用TSK凝胶SuperQ-5PW20x200mm(BISCHOFF Chromatography)进行。缓冲液A是20mM磷酸钠(Sigma-Aldrich)pH7.8，并且缓冲液B与缓冲液A相同，但添加了1.4M溴化钠(Sigma-Aldrich)。采用10mL/min的流速和60℃的温度。记录在280nm处的UV迹线。采用27个柱体积内的10％ B至100％ B的梯度。将适当的级分合并并在冰箱中用3M NaOAc，pH 5.2和85％乙醇沉淀。将沉淀通过离心分离，重新溶解在水(50mL)中，用5M NaCl(5mL)处理并通过尺寸排阻色谱法脱盐。
MMT基团用25％的乙酸水溶液去除。一旦反应完成，溶液就被中和，并且样品通过尺寸排阻色谱法脱盐。
在结合有LCQ Deca XP-plus Q-ESI-TOF质谱仪(Thermo Finnigan)或CompactESI-Qq-TOF质谱仪(Bruker Daltonics)的Dionex Ultimate 3000(Thermo FisherScientific)HPLC系统上通过分析型LC-MS在2.1x 50mm XBridge C18柱(Waters)上分析单链。缓冲液A是在H2O中的16.3mM三乙胺、100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)和1％MeOH，并且缓冲液B含有在95％ MeOH中的缓冲液A。采用250μL/min的流速和60℃的温度。记录在260nm和280nm处的UV迹线。采用在0.5分钟内1％-40％ B，然后在13分钟内40％至100％B的梯度。甲醇(LC-MS级)、水(LC-MS级)、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(超纯级)和三乙胺(超纯级)购自Sigma-Aldrich。
iv)在5'-端或3'-端的TriGalNAc系链2(GalNAc-T2)缀合5'-GalNAc-T2缀合物
3'-GalNAc-T2缀合物
TriGalNAc系链2NHS酯的制备：向羧酸系链2(化合物15，227mg，121μmol)在DMF(2.1mL)中的溶液中添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(15.3mg,133μmol)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)(19.7μL,127μmol)。将溶液在室温下搅拌18小时，并用于后续的缀合反应而不经纯化。
triGalNAc系链2缀合的一般程序：将胺修饰的单链以700OD/mL溶解在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH 9.6/DMSO 4:6(v/v)中，并向该溶液中添加一摩尔当量的系链2NHS酯(57mM)的DMF溶液。反应在室温下进行，并在1小时后添加另一摩尔当量的NHS酯溶液。允许反应再进行一小时并且通过LCMS监测反应进展。需要相对于氨基修饰的寡核苷酸至少二摩尔当量过量的NHS酯试剂以实现起始材料的定量消耗。反应混合物用水稀释15倍，通过Sartorius的1.2μm过滤器过滤一次，然后在Pure(GE Healthcare)仪器上通过反相(RPHPLC)纯化。
使用来自Waters的XBridge C18 Prep 19x 50mm柱进行纯化。缓冲液A是100mMTEEAc pH 7，并且缓冲液B含有在缓冲液A中的95％乙腈。采用10mL/min的流速和60℃的温度。记录在280nm处的UV迹线。采用60个柱体积内的0-100％ B梯度。
将含有全长缀合寡核苷酸的级分合并在一起，在冰箱中用3M NaOAc，pH 5.2和85％乙醇沉淀，然后以1000OD/mL溶解在水中。用20％氢氧化铵水溶液除去O-乙酸盐直至完成(通过LC-MS监测)。
在Pure(GE Healthcare)仪器上使用Sephadex G25Fine树脂(GEHealthcare)通过尺寸排阻色谱法将缀合物脱盐，得到缀合的寡核苷酸，分离产率为60％-80％。
表9：
在配备有Compact ESI-Qq-TOF质谱仪(Bruker Daltonics)的Dionex Ultimate3000(Thermo Fisher Scientific)HPLC系统上通过HPLC-MS分析使用2.1x 50mm XBridgeC18柱(Waters)表征缀合物。缓冲液A是在H2O中的16.3mM三乙胺、100mM HFIP/1％ MeOH，并且缓冲液B含有在缓冲液A中的95％ MeOH。采用250μL/min的流速和60℃的温度。记录在260nm和280nm处的UV迹线。采用在31分钟内1％-100％ B的梯度。
v)双链体退火
为了生成所需的siRNA双链体，两条互补链通过合并两条链的等摩尔水溶液进行退火。将混合物置于70℃的水浴中5分钟，随后在2小时内冷却至环境温度。将双链体冻干2天并储存在-20℃。
在Dionex Ultimate 3000(Thermo Fisher Scientific)HPLC系统上通过分析型SEC HPLC在SuperdexTM75Increase 5/150GL柱5x 153-158mm(Cytiva)上分析双链体。流动相由含有10％乙腈的1x PBS组成。在室温下以1.5mL/min的流速在10分钟内运行等度梯度。记录在260nm和280nm处的UV迹线。水(LC-MS级)购自Sigma-Aldrich，并且磷酸盐缓冲盐水(PBS；10x,pH 7.4)购自GIBCO(Thermo Fisher Scientific)。
制备的GalNAc缀合物汇总在下表中。这些针对3种不同的靶基因。采集siRNA编码以及相应的单链、序列信息以及双链体的纯度。
表10：
以下方案进一步阐述合成路线：方案1：
方案2：
方案3：
方案4：
实例3
GalNAc-siRNA构建体ETX006和ETX015的小鼠数据
ETX006(靶向HAO1 mRNA)T2a反向无碱基
进行一项体内小鼠药理学研究，该研究表明在高达3mg/kg的GalNAc缀合修饰siRNA ETX006的单次皮下剂量后，肝脏组织中HAO1 mRNA的敲低以及血清乙醇酸水平的伴随增加。
将大约8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分入各组，每组21只小鼠。在研究的第0天，动物接受溶解在盐水(无菌0.9％氯化钠)中的0.3mg/kg或3mg/kg GalNAc-siRNA的单次皮下剂量或作为对照的仅盐水。在研究的第1天、第2天、第4天、第7天、第14天、第21天和第28天，对每组的3只小鼠实施安乐死，并采集血清和肝脏样品。
在第0天从一组5只未处理的小鼠中提取血清以提供乙醇酸浓度的基线测量值。
将血清储存在-80℃直至进一步分析。将肝脏样品(约50mg)用RNAlater处理并在4℃下储存过夜，然后在-80℃下储存。
使用定量实时PCR分析肝脏样品的HAO1 mRNA(Thermo测定ID Mm00439249_m1)和管家基因GAPDH mRNA(Thermo测定ID Mm99999915_g1)。△△Ct方法用于计算标准化为GAPDH并相对于盐水对照组的HAO1表达变化。
7天后，单次3mg/kg剂量的ETX006使HAO1 mRNA表达抑制超过80％(图11)。对HAO1表达的抑制是持久的，并一直持续到研究结束，其中ETX006在第28天时对HAO1mRNA的抑制保持大于60％。与盐水对照组相比，0.3mg/kg的单次剂量也抑制HAO1表达，其中HAO1表达水平仅在研究的第28天达到正常水平。
预计HAO1 mRNA表达的抑制会导致血清乙醇酸水平增加。使用LC-MS/MS测量血清乙醇酸浓度(图12)。单次3mg/kg剂量的ETX006导致血清乙醇酸浓度显著增加，在给药后14天达到峰值水平，并保持高于基线水平(第0天)和盐水对照组，直到第28天研究结束。单次0.3mg/kg剂量的ETX006显示血清乙醇酸浓度高于基线和盐水对照组中见到的水平，血清乙醇酸浓度的增加更小和更短暂，表明非常小的剂量也可以影响血清中代谢生物标志物的浓度。
ETX015(靶向C5 mRNA)T2a反向无碱基
进行一项体内小鼠药理学研究，该研究表明在高达3mg/kg的GalNAc缀合修饰siRNA ETX015的单次皮下剂量后，肝脏组织中C5 mRNA的敲低以及引起的血清C5蛋白浓度的降低。
将大约8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分入各组，每组21只小鼠。在研究的第0天，动物接受溶解在盐水(无菌0.9％氯化钠)中的0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg GalNAc-siRNA的单次皮下剂量或作为对照的仅盐水。在研究的第1天、第2天、第4天、第7天、第14天、第21天和第28天，对每组的3只小鼠实施安乐死，并采集血清和肝脏样品。
将血清储存在-80℃直至进一步分析。将肝脏样品(约50mg)用RNAlater处理并在4℃下储存过夜，然后在-80℃下储存。
使用定量实时PCR分析肝脏样品的C5 mRNA(Thermo测定ID Mm00439275_m1)和管家基因GAPDH mRNA(Thermo测定ID Mm99999915_g1)。△△Ct方法用于计算标准化为GAPDH并相对于盐水对照组的C5表达变化。
ETX015以剂量依赖性方式抑制C5 mRNA表达(图13)，其中3mg/kg剂量实现大于85％的C5 mRNA减少。C5表达的抑制是持久的，其中每个分子的3mg/kg剂量显示出C5 mRNA的明显敲低，直到第28天研究结束。给药3mg/kg ETX015的小鼠在给药后28天仍表现出低于正常肝脏C5 mRNA水平的50％。
对于C5蛋白水平分析，使用市售的C5 ELISA试剂盒(Abcam ab264609)测量血清样品。血清C5水平是相对于匹配时间点的盐水组平均值计算的。
血清蛋白质数据支持mRNA分析(图14)。ETX015引起血清C5蛋白浓度的剂量依赖性降低。3mg/kg和1mg/kg剂量的ETX015使血清C5蛋白水平降低超过90％。最高剂量表现出对C5蛋白表达的持久抑制，其中与盐水对照相比，在研究的第28天C5减少超过70％。实例4GalNAc-siRNA构建体ETX024的NHP数据
通过量化血清转甲状腺素蛋白(TTR)蛋白水平，在非人灵长类动物(NHP)中评估ETX024药理学。1mg/kg的GalNAc缀合修饰siRNA ETX024的单次皮下剂量表明对TTR蛋白表达的持久抑制。
将雄性食蟹猴(3-5岁，2-3kg)分入各组，每组3只动物。使动物适应环境2周，并在给药前14天采血以提供基线TTR浓度。在给药前18或38天进行肝脏活检以提供基线mRNA水平。在研究的第0天，动物接受溶解在盐水(无菌0.9％氯化钠)中的1mg/kg GalNAc-siRNAETX024的单次皮下剂量。在研究的第3天、第14天、第28天、第42天、第56天、第70天和第84天，进行肝脏活检并提取RNA用于测量TTR mRNA。在研究的第1天、第3天、第7天、第14天、第28天、第42天、第56天、第70天和第84天，采集血液样品用于测量血清TTR浓度和临床血液化学分析。
预计TTR mRNA表达的抑制会导致血清TTR蛋白水平降低。通过市售的ELISA试剂盒(Abcam ab231920)测量血清TTR蛋白浓度。计算每只个体动物的作为第1天级分的TTR浓度，并将其绘制为3只动物组的平均值和标准偏差(图15)。
单次1mg/kg剂量的ETX024导致血清TTR浓度快速且显著的降低，在给药后28天达到最低点，并保持抑制直到第70天。
使用ETX024进一步获得数据直到第84天。使用ETX020、022和026进行相同的实验。在图16、17、18a和19(分别为ETX 020、022、024和026)中提供了84天的数据。
使用TaqMan基因表达试剂盒TTR(Thermo，测定ID Mf02799963_m1)通过实时定量PCR测量TTR mRNA。还测量了GAPDH表达(Thermo，测定ID Mf04392546_g1)以提供参考。通过DDCt方法计算每只动物标准化为GAPDH并相对于给药前水平的相对TTR表达。单次1mg/kg剂量的ETX024引起肝脏TTR mRNA的快速且显著的降低，在给药后14天达到最低点，并保持抑制直到第84天(图18b)。
在研究期间每周一次测量动物体重。体重的波动或降低与ETX024的给药无关，并且动物在整个研究过程中继续增重(图18c)。
使用自动生化分析仪在2小时内分析血清。ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的显著增加通常用于证明肝脏毒性。ALT(图18d)或ALT(图18e)的增加与ETX024的给药无关。
在优选的方面，本发明的化合物能够在第0天后长达至少约14天、第0天后长达至少约21天、第0天后长达至少约28天、第0天后长达至少约35天、第0天后长达至少约42天、第0天后长达至少约49天、第0天后长达至少约56天、第0天后长达至少约63天、第0天后长达至少约70天、第0天后长达至少约77天或第0天后长达至少约84天(以下称为“剂量持续时间”)的时段内将靶蛋白的血清蛋白水平降低至低于第0天的初始(起始)浓度的值。本文中提到的“第0天”是开始向患者给药本发明化合物的那一天，换言之就是剂量持续时间的开始或给药后的时间。
在优选的方面，本发明的化合物能够将靶蛋白的血清蛋白水平降低至第0天的初始(起始)浓度的至少约90％或更低的值，诸如第0天的初始(起始)浓度的至少约85％或更低、至少约80％或更低、至少约75％或更低、至少约70％或更低、至少约65％或更低、至少约60％或更低、至少约55％或更低、至少约50％或更低、至少约45％或更低、至少约40％或更低、至少约35％或更低、至少约30％或更低、至少约25％或更低、至少约20％或更低、至少约15％或更低、至少约10％或更低、至少约5％或更低。通常，此类血清蛋白抑制可以保持在第0天后长达至少约14天、第0天后长达至少约21天、第0天后长达至少约28天、第0天后长达至少约35天、第0天后长达至少约42天、第0天后长达至少约49天、第0天后长达至少约56天、第0天后长达至少约63天、第0天后长达至少约70天、第0天后长达至少约77天或第0天后长达至少约84天的时段。更优选地，在第0天后长达至少约84天的时段，血清浓度可以降低至第0天的初始(起始)浓度的至少约90％或更低的值，诸如第0天的初始(起始)浓度的至少约85％或更低、至少约80％或更低、至少约75％或更低、至少约70％或更低、至少约65％或更低、至少约60％或更低、至少约55％或更低、至少约50％或更低、至少约45％或更低、至少约40％或更低。
在优选的方面，本发明的化合物能够将靶蛋白血清蛋白水平的最大抑制实现至第0天的初始(起始)浓度的至少约50％或更低的值，诸如第0天的初始(起始)浓度的至少约45％或更低、至少约40％或更低、至少约35％或更低、至少约30％或更低、至少约25％或更低、至少约20％或更低、至少约15％或更低、至少约10％或更低、至少约5％或更低。通常，此类血清蛋白的最大抑制发生在第0天后的约第14天、第0天后的约第21天、第0天后的约第28天、第0天后的约第35天或第0天后的约第42天。更典型地，此类血清蛋白的最大抑制发生在第0天后的约第14天、第0天后的约第21天或第0天后的约第28天。
本发明的具体化合物通常可以实现靶蛋白血清蛋白水平的最大抑制％和/或在长达至少约84天的时段内的抑制％，如下：
ETX020通常可以在第0天后约7至21天，特别是在第0天后约14天，实现靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少30％抑制，和/或通常可以在第0天(如上文所述，本文中提到的“第0天”是开始向患者给药本发明化合物的那一天，并且本身表示给药后时间)后长达至少约84天的时段内维持靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少80％抑制；
ETX022通常可以在第0天后约7至21天，特别是在第0天后约14天，实现靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少60％抑制，和/或通常可以在第0天(如上文所述，本文中提到的“第0天”是开始向患者给药本发明化合物的那一天，并且本身表示给药后时间)后长达至少约84天的时段内维持靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少80％抑制；
ETX024通常可以在第0天后约7至21天，特别是在第0天后约14天，实现靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少20％抑制，和/或通常可以在第0天(如上文所述，本文中提到的“第0天”是开始向患者给药本发明化合物的那一天，并且本身表示给药后时间)后长达至少约84天的时段内维持靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少60％抑制；
ETX026通常可以在第0天后约7至21天，特别是在第0天后约14天，实现靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少40％抑制，和/或通常可以在第0天(如上文所述，本文中提到的“第0天”是开始向患者给药本发明化合物的那一天，并且本身表示给药后时间)后长达至少约84天的时段内维持靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少70％抑制。合适地，通过递送1mg/kg的相关活性剂(例如溶解在盐水(无菌0.9％氯化钠)中的ETX0024)的单次皮下剂量在非人灵长类动物中确定血清水平的抑制。本文描述了合适的方法。应当理解，这不是限制性的，并且可以使用具有适当控制的其他合适的方法。
实例5ETX024(靶向TTR mRNA)T2a反向无碱基
总胆红素水平在整个研究过程中保持稳定(图22)
在整个研究过程中，通过评估尿素(血尿素氮，BUN)和肌酐浓度来监测肾脏健康。在单次1mg/kg剂量的ETX024后，血尿素浓度(BUN)和肌酐水平都保持稳定并在预期范围内(图23和24)。
本发明的范围不限于所公开的特定实施例的范围，提供该实施例例如用于说明本发明的各个方面。根据本文的描述和教导，对所描述的组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下实施此类变化，并且旨在落入本公开的范围内。
下面描述本发明的另一个方面，非限制性实例在下面的图25-27和实例6-15中描述。下述化合物适用于以上公开的任何方面和实施例，例如在用途、核酸长度、定义、药学上可接受的组合物、给药、抑制基因表达的方法以及治疗或预防与基因表达相关的疾病的方法方面，除非可以其他方式从本公开中立即看出。
图25A描绘了三触角GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)单元。
图25B描绘了根据本发明的一个实施例的可替代的三触角GalNAc，显示了连接基团的变化。
图26A描绘了根据本发明的三触角GalNAc缀合的siRNA，显示了连接基团的变化。
图26B描绘了一类根据本发明的一个实施例的三触角GalNAc缀合的siRNA。
图26C描绘了一类根据本发明的一个实施例的双触角GalNAc缀合的siRNA，显示了连接基团的变化。
图26D描绘了一类根据本发明的另一个实施例的双触角GalNAc缀合的siRNA，显示了连接基团的变化。
图27A描绘了根据本发明的一个实施例的三触角GalNAc缀合的siRNA的另一个实施例。
图27B描绘了图27A中所示的变体，其具有可替代的分支GalNAc缀合物。
图27C描绘了一类根据本发明的一个实施例的三触角GalNAc缀合的siRNA，显示了连接基团的变化。
图27D描绘了一类根据本发明的一个实施例的双触角GalNAc缀合的siRNA，显示了连接基团的变化。
另一方面公开了ASGP-R配体缀合的、化学修饰的RNAi试剂的形式，以及此类缀合分子的制备和使用方法。
在某些实施例中，ASGP-R配体包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。在某些实施例中，本发明提供与下式(I)的GalNAc的三触角或双触角单元缀合的siRNA：
在式I*中，n是0、1、2、3或4。在一些实施例中，乙二醇单元的数量可以在不同分支中彼此独立地变化。例如，中间分支可以具有n＝4，而侧分支可以具有n＝3等。其他实施例可仅含两个分支，如式(II-a)中所描绘的
在式II*和II*-a中，n选自0、1、2、3或4。在一些实施例中，乙二醇单元的数量可以在不同分支中彼此独立地变化。例如，一个分支可以具有n＝4或3，而其他分支可以具有n＝3或2，等等。
还可以添加额外的GalNAc分支，例如，可以使用4-、5-、6-、7-、8-、9-分支的GalNAc单元。
在相关的实施例中，分支的GalNAc可以通过添加另一个靶向部分进行化学修饰，该靶向部分例如脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、靶向(多)肽，包括多肽和蛋白质(例如，RGD肽、转铁蛋白、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、糖基化肽、生物素、去唾液酸糖蛋白胰岛素和EGF。
选项1.在进一步的实施例中，GalNAc单元可以经由系链(诸如式(III*)中所示的系链)与RNAi试剂附接：
在式III*中，m选自0、1、2、3、4或5，并且p独立于m，选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14，并且X是CH2或O。
在另外的实施例中，系链可以经由磷酸(Z＝O)或硫代磷酸基团(Z＝S)与寡核苷酸附接，如式(IV*)所示：
此类GalNAc分支单元经由特定系链附接优选在RNAi试剂有义链的3'或5'端。在一个实施例中，通过如式(V*)所示的C6氨基接头与RNAi试剂的3'附接：
该接头是如实例12所示的合成的起点。
如上所述的相同接头和系链可以与如式VI*和VII*所示的可替代的分支GalNAc结构一起使用：
类似于式II*-a，基于式VI*和VII*的配体的双触角形式可以用于本发明的组合物中。
选项2.在进一步的实施例中，GalNAc单元可以经由系链(诸如式(III*-2)中所示的系链)与RNAi试剂附接：
在式III*-2中，q选自1、2、3、4、5、6、7或8。
在另外的实施例中，系链可以经由磷酸(Z＝O)或硫代磷酸基团(Z＝S)与寡核苷酸附接，如式(IV*)所示：
此类GalNAc分支单元经由特定系链附接优选在双链RNAi试剂有义链的3'或5'端。在一个实施例中，与RNAi试剂的3'的附接如实例14所示。在一个实施例中，当GalNAc系链与3'位点附接时，系链与寡核苷酸3'端之间的过渡接头包含式(V*-a；也参见图27C)的结构，或者可以使用另一合适的接头，例如式(V*-b)所示的C6氨基接头：
另外的和/或可替代的缀合位点可以包括任何非末端核苷酸，包括糖残基、磷酸基团或核酸碱基。
相同的接头和系链可以与如式VI*-2和VII*-2所示的可替代的分支GalNAc结构一起使用：
本发明的RNAi试剂的特征及其化学修饰
在某些实施例中，缀合的寡聚化合物(本文称为RNA干扰化合物(RNAi化合物))包含两条链，每条链具有在反义链或有义链中的8至55个连接的核苷酸单体亚基(包括反向无碱基(ia)核苷酸)的序列。在某些实施例中，缀合的寡聚化合物链包含例如16至55、53、49、40、25、24、23、21、20、19、18、17或最多(约)18-25、18-23、21-23个连接的核苷酸单体亚基的序列。在某些实施例中，本发明的RNAi试剂可以具有发夹结构，其具有如上所述两条链的组合长度的单链。(通篇使用的术语“核苷酸”在上下文需要时也可以指核苷(即没有磷酸/硫代磷酸基团的核苷酸)。)
在某些实施例中，双链RNAi试剂是平端的或在一端或两端具有突出端。在一些实施例中，突出端是反义链的1-6、1-5、1-4、1-3、2-4、4、3、2或1个核苷酸(在3'端或在5'端)以及有义链的2-4、3或2或1个核苷酸(在3'端或在5'端)。在某些示例性实施例中，参见实例6，构建体6.1、6.2和6.3，RNAi试剂在反义链的3'端包含2个核苷酸突出端，并且在有义链的3'端包含2个核苷酸突出端。在某些其他示例性实施例中，参见实例7，构建体7.1和7.3；实例8，构建体8.1和8.3；和实例9，构建体9.1和9.3，RNAi试剂在反义链的3'端包含2个核苷酸突出端，并且另一端是平端。在某些其他示例性实施例中，参见实例7，构建体7.3，构建体两端都是平端。在另一个示例性实施例中，参见实例9，构建体9.2，RNAi试剂在反义链的3'端包含4个核苷酸突出端，并且另一端是平端。
在某些实施例中，利用通过使用末端帽、一个或多个反向无碱基核苷酸、一个或多个硫代磷酸键、一个或多个脱氧核苷酸(例如，D-核糖核苷酸、D-2'-脱氧核糖核苷酸或另一修饰的核苷酸)或其组合来阻止或抑制核酸酶切割的降解保护部分来修饰构建体。此类降解保护部分可以存在于未与ASGP-R配体缀合的任何一个或所有端。在某些实施例中，降解保护部分单独或作为来自由以下组成的组的任何组合选择：1-4、1-3、1-2或1个硫代磷酸键，1-4、1-3、1-2或1个脱氧核苷酸，以及1-4、1-3、1-2或1个反向无碱基核苷酸。在某些示例性实施例中，降解保护部分被配置为构建体6.1、6.2、6.3、7.1、7.2、7.3、8.1、8.2、8.3、9.1、9.2和9.3之一，如实例6-15中所示。此类示例性保护部分的构型可以与本发明的任何RNAi试剂结合使用。
在某些实施例中，有义链和/或反义链中核苷酸的全部或部分核糖被修饰。在某些实施例中，RNAi试剂中至少50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，100％)的核糖被修饰。在某些实施例中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核糖未被修饰。
在优选的实施例中，核糖修饰包括2'取代基，诸如2'-O-烷基修饰，包括2'-O-甲基和2'-脱氧氟。其他修饰是本领域已知的，包括2'-脱氧、LNA(例如，2'-O,4'-C亚甲基桥或2'-O,4'-C亚乙基桥)、2'-甲氧基乙氧基(MOE)、2'-O-(CH2)OCH3等。
在某些实施例中，许多修饰提供不同的修饰模式，例如，如实例6-15中的构建体所示，或如美国专利号7,452,987；7,528,188；8,273,866；9,150,606；和10,266,825中所述；所有这些专利都通过引用并入本文。
在一些实施例中，siRNA例如在反义链的位置11(优选)、12、13和/或有义链的位置9和10(优选)包含一个或多个热不稳定核苷酸，例如GNA、ENA等。
另外，核酸碱基可以被修饰，例如，如美国专利号10,119,136中所述在C4位置。
一般而言，本发明的RNAi试剂针对治疗靶标，对治疗靶标的抑制将导致预防、减轻或治疗疾病，包括不希望的或病理状况。大量此类靶标在本领域中是已知的。此类靶标的非限制性实例包括：ApoC、ApoB、ALAS1、TTR、GO、C5(见实例)等。一般而言，由于ASGP-R在肝细胞表面的表达丰富，此类靶标优选在肝脏中表达，但它们也可以在其他组织或器官中表达。在优选的实施例中，靶标是人，而RNAi试剂包含与此类靶标完全或部分地互补的反义链。在某些实施例中，RNAi试剂可以包含两种或更多种化学连接的针对相同或不同靶标的RNAi试剂。
实例
实例6：使用5'-GalNAc的反向无碱基化学
在实例中描绘的所有RNAi试剂中，使用以下约定：
ia＝反向无碱基核苷酸；
m＝2'-O-甲基核苷酸；
f＝2'-脱氧-2'-氟核苷酸；
s＝硫代磷酸核苷酸间键；
Xd＝2'-脱氧-核苷酸；
～＝系链。
使用标准合成技术，合成各种形式的以下构建体，该构建体具有系链1和2并具有根据本发明的各种三触角GalNAc单元，如上文所述或图26A-27B中所示。
6.1.
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:1；下链(反义)SEQ ID NO:2)
6.2.
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:3；下链(反义)SEQ ID NO:4)
6.3.
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:5；下链(反义)SEQ ID NO:6)
实例7：使用3'-GalNAc的反向无碱基化学
使用标准合成技术，合成各种形式的以下构建体，该构建体具有根据本发明的系链1和2并具有根据本发明的各种三触角GalNAc单元，如上文所述或图26A-27B中所示。为了保持一致性，显示了与实例6相同的序列。
7.1
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:7；下链(反义)SEQ ID NO:8)
7.2
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:9；下链(反义)SEQ ID NO:10)
7.3.
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:11；下链(反义)SEQ ID NO:12)
实例8：使用具有可替代修饰模式的5'-GalNAc的反向无碱基化学
使用标准合成技术，合成各种形式的以下构建体，该构建体具有根据本发明的系链1和2并具有根据本发明的各种三触角GalNAc单元，如上文所述或图26A-27B中所示。为了保持一致性，此处显示了与实例6相同的序列。
8.1.
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:13；下链(反义)SEQ ID NO:14)
8.2
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:15；下链(反义)SEQ ID NO:16)
8.3.
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:17；下链(反义)SEQ ID NO:18)
实例9：使用具有可替代修饰模式的5'-GalNAc的反向无碱基化学
使用标准合成技术，合成各种形式的以下构建体，该构建体具有根据本发明的系链1和2并具有根据本发明的各种三触角GalNAc单元，如上文所述或图26A-27B中所示。为了保持一致性，显示了与实例6相同的序列。
9.1.
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:19；下链(反义)SEQ ID NO:20)
9.2
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:21；下链(反义)SEQ ID NO:22)
9.3
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:23；下链(反义)SEQ ID NO:24)
实例10：siRNA-GalNAc缀合物的基准
实例6-15中使用的构建体通过其编号引用并列于表11中。系链1和系链2分别如图26和27所示。
表11.
下表12反映了用本发明的各种选择构建体完成的基准。
体外药效学表征
表11中列出的8种构建体(GO1 siRNA-GalNAc、C5 siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc类似物)的体外药效学活性、结合亲和力和肝脏摄取以这些分子的临床验证版本为基准。
人肝脏细胞系(HepG2或Hep3B)转染测定--将GO1 siRNA-GalNAc、C5 siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc类似物分子中的每一个在存在转染试剂(例如RNAiMAX)的情况下在人肝脏细胞系中以10种不同浓度在37℃下孵育0小时和24小时。每个浓度的所有孵育一式四份进行。孵育后，裂解每个样品并通过bDNA或RT-qPCR测定分析HAO1 C5、TTR和管家基因(诸如GAPDH)mRNA浓度。获得的mRNA浓度数据用于分析以确定GO1siRNA-GalNAc、C5siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc分子中的每一个的沉默活性和IC50。
原代人肝细胞摄取测定--在原代人肝细胞中评估GO1 siRNA-GalNAc、C5 siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc分子中的每一个的肝脏摄取和沉默活性。将GO1 siRNA-GalNAc、C5siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc类似物分子中的每一个在原代人肝细胞中以10种不同浓度在37℃下孵育0、4和72小时。每个浓度的所有孵育一式四份进行。孵育后，裂解每个样品并通过bDNA或RT-qPCR测定分析HAO1、C5、TTR和管家基因(诸如GAPDH)mRNA浓度。获得的mRNA浓度数据用于分析以确定GO1 siRNA-GalNAc、C5 siRNA-GalNAc和TTRsiRNA-GalNAc分子中的每一个的沉默活性、摄取和IC50。
体内药效学表征
在向雄性小鼠或食蟹猴进行单次皮下施用后，将8种构建体(GO1 siRNA-GalNAc、C5siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc类似物中的每一个)的体内药效学活性与临床验证的GO1siRNA-GalNAc、C5 siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc分子中的每一个的体内药效学活性进行比较。
对于每种类似物的GO1 siRNA-GalNAc的体内小鼠药理学，在如下表13中提供的0.3mg/kg或3mg/kg的单次皮下剂量后进行评估。存在2个剂量组，其中每个GO1 siRNA-GalNAc类似物以0.3mg/kg或1mg/kg皮下施用至C57BL/6雄性小鼠(n＝3/时间点/组)。在不同的时间点获取血液样品以获得血清样品和肝脏活检样品，以通过LCMS确定血清乙醇酸的浓度，并通过RT-qPCR或bDNA测定确定HAO1 mRNA的浓度。在每个特定时间点处死来自每组的动物并收集血液(约0.5mL/动物)和肝脏(约100mg)。对于第1至9组，在给药后24、48、96、168、336、504和672小时从3只动物/时间点/组收集血液(约0.5mL/动物)和肝脏(约100mg)。第10组(n＝3)是对照组，该组未被给药以提供血清乙醇酸和mRNA HAO1浓度的基线值。将给药后不同时间点血清乙醇酸增加和肝脏中HAO1 mRNA沉默的药效学作用与第10组对照血清和肝脏样品进行比较。
表13.GO1 siRNA-GalNAc类似物小鼠药理学研究设计
表格图例：
SC 皮下
NA 不适用
a 第10组动物是对照动物并且未被给药c 第1至9组的动物在第1天给药
实例11：使用点击化学的5'缀合(选项1)
在该实施例中，寡核苷酸101的有义链在固体支持物上合成并与市售的辛炔亚磷酰胺102偶联以在固体支持物上利用点击化学前体得到所需寡核苷酸。其在经过标准切割和脱保护后提供纯寡核苷酸103。将叠氮化物104溶解在DMSO(150μL/mg)中，并将该溶液添加到在100μL水中的10OD寡核苷酸103中。然后将反应混合物在室温孵育过夜。将缀合的寡核苷酸105在Glen Gel-PakTM上脱盐以去除有机物，并通过用甲胺处理去除乙酰氧基保护基，然后进行制备型HPLC以得到纯的寡核苷酸106，将其与等摩尔量的有义链一起退火以得到最终双链体。
实例12：5'缀合(选项2)
在该实施例中，寡核苷酸101的有义链在固体支持物上合成并与市售的亚磷酰胺108偶联以在固体支持物上得到所需的寡核苷酸。其在经过标准切割和脱保护后提供纯寡核苷酸109。将胺109溶解在水(15μL/OD)中，并将该溶液添加到酸110在DMSO(100mL/mg)中的溶液中，然后添加10摩尔当量的EDC和10当量的HOBT，并且将反应混合物在室温孵育过夜。然后将缀合的寡核苷酸111在Glen Gel-PakTM上脱盐以去除有机物，并通过用甲胺处理去除乙酰氧基保护基团，然后进行制备型HPLC以得到纯的寡核苷酸112，将其与等摩尔量的有义链一起退火以得到最终双链体。
实例13：使用点击化学的5'缀合(选项1)
对于寡核苷酸构建体119的合成，采用类似的方法，其中将三触角GalNAc缀合物加载到固体支持物118(CPG)上并进行寡核苷酸合成。在切割和脱保护后，纯化提供纯寡核苷酸119，其与反义链一起退火以提供所需的纯形式的最终双链体。在另一种方法中，3'缀合物的合成也类似于116的合成，从氨基连接的寡核苷酸113开始，并在合成后缀合GalNAc羧酸以得到缀合的寡核苷酸119。
实例14：3'缀合(选项2)
对于寡核苷酸构建体119的合成，采用类似的方法，其中将三触角GalNAc缀合物加载到固体支持物118(CPG)上并进行寡核苷酸合成。在切割和脱保护后纯化提供纯寡核苷酸119，其与反义链一起退火以提供所需的纯形式的最终双链体。在另一种方法中，3'缀合物的合成也类似于116的合成，从氨基连接的寡核苷酸113开始，并在合成后缀合GalNAc羧酸以得到缀合的寡核苷酸119。
实例15：合成后缀合方法
在这种方法中，3'缀合物的合成也类似于116的合成，从氨基连接的寡核苷酸113开始，并在合成后缀合GalNAc羧酸以得到缀合的寡核苷酸121，其与反义链一起退火以得到所需的纯形式的最终双链体。
先前的实例并不旨在是限制性的。根据本公开内容，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对具体材料和公开内容进行许多改变并且仍然获得相同或类似的结果。
声明
1.一种修饰的RNAi试剂，其包含经由系链与ASGP-R配体缀合的RNA干扰化合物(RNAi化合物)，其中所述系链包含：
其中m选自0、1、2、3、4或5，并且p独立于m，选自0、1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13或14；并且X选自O和CH2。
2.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其中m＝1。
3.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其中x是O。
4.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其中p＝6。
5.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其中m＝1，p＝6，并且x是O。
6.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其中所述ASGP-R配体包含分支GalNAc。
7.根据声明6所述的修饰的RNAi试剂，其中所述分支GalNAc选自由以下项组成的组：
其中n是0、1、2、3或4。
8.根据声明7所述的修饰的RNAi试剂，其中n＝1。
9.根据声明6所述的修饰的RNAi试剂，其中所述分支GalNAc包含
或其双触角形式。
10.根据声明6所述的修饰的RNAi试剂，其中所述分支GalNAc包含或为其双触角形式。
或其双触角形式。
11.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链与有义链的5'端附接。
12.根据声明11所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链如式IV*所示附接。
其中Z是P或S。
13.根据声明11所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链与有义链的3'端附接。
14.根据声明13所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链如式V*-a或V*-b所示附接：
15.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其如图26A、26B、26C或26D所示。
16.根据声明15所述的修饰的RNAi试剂，其中所述RNAi化合物包含在2'位置被修饰的修饰核糖。
17.根据声明16所述的修饰的RNAi试剂，其中所述修饰选自2'-O-甲基、2'-脱氧-氟和2'-脱氧。
18.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其中RNAI化合物在未与所述ASGP-R配体缀合的任一或所有端含有一个或多个降解保护部分。
19.根据声明18所述的修饰的RNAi试剂，其中所述降解保护部分单独或作为来自由以下项组成的组的任何组合选择：1-4个硫代磷酸键，1-4个脱氧核苷酸和1-4个反向无碱基核苷酸。
20.根据声明19所述的修饰的RNAi试剂，其中所述降解保护部分选自以下构建体中的一种中存在的构型：6.1、6.2、6.3、7.1、7.2、7.3、8.1、8.2、8.3、9.1、9.2和9.3。
21.一种修饰的RNAi试剂，其包含经由系链与ASGP-R配体缀合的RNA干扰化合物(RNAi化合物)，其中所述系链包含：
其中q选自1、2、3、4、5、6、7或8。
22.根据声明21所述的修饰的RNAi试剂，其中q＝1。
23.根据声明21所述的修饰的RNAi试剂，其中所述ASGP-R配体包含分支GalNAc。
24.根据声明23所述的修饰的RNAi试剂，其中所述分支GalNAc选自由以下项组成的组：
和
式II*-a
其中n是0、1、2、3或4。
25.根据声明24所述的修饰的RNAi试剂，其中n＝1。
26.根据声明23所述的修饰的RNAi试剂，其中所述分支GalNAc包含
或其双触角形式。
27.根据声明23所述的修饰的RNAi试剂，其中所述分支GalNAc包含或为其双触角形式。
或其双触角形式。
28.根据声明21所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链与有义链的5'端附接。
29.根据声明28所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链如式IV*所示附接。
其中Z是P或S。
30.根据声明28所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链与有义链的3'端附接。
31.根据声明30所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链如式V*-a或V*-b所示附接：
32.根据声明31所述的修饰的RNAi试剂，其如图27A、27B、27C或27D所示。
33.根据声明21所述的修饰的RNAi试剂，其中所述RNAi化合物包含在2'位置被修饰的修饰核糖。
34.根据声明33所述的修饰的RNAi试剂，其中所述修饰选自2'-O-甲基、2'脱氧-氟和2'-脱氧。
35.根据声明21所述的修饰的RNAi试剂，其中siRNA在未与所述ASGP-R配体缀合的任一或所有端含有一个或多个降解保护部分。
36.根据声明35所述的修饰的RNAi试剂，其中所述降解保护部分单独或作为来自由以下项组成的组的任何组合选择：1-4个硫代磷酸键，1-4个脱氧核苷酸和1-4个反向无碱基核苷酸。
37.根据声明36所述的修饰的RNAi试剂，其中所述降解保护部分选自以下构建体中的一种中存在的构型：6.1、6.2、6.3、7.1、7.2、7.3、8.1、8.2、8.3、9.1、9.2和9.3。
39.一种制备根据声明1或2所述的RNAi试剂的方法，所述方法显示在实例11-15中。
40.一种预防、减轻或治疗受试者疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效预防、减轻或治疗所述疾病的治疗量的根据声明1或2所述的RNAi试剂，从而预防、减轻或治疗疾病。
41.根据声明40所述的方法，其中所述受试者是人。
序列表
<110> e-生物有限公司
<120> 缀合寡核苷酸化合物、其制备方法和用途
<130> 169692.00049
<150> US63/271,683
<151> 2021-10-25
<150> US63/262,315
<151> 2021-10-08
<150> US63/143,805
<151> 2021-01-30
<160> 176
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 1
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 2
accugaaagu aggaccuuua uau 23
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 3
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 4
uuuucguucu auaaaaauau uau 23
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 5
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 6
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 6
cuacccuaaa guacauuggu ucu 23
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 7
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 8
accugaaagu aggaccuuua uau 23
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 9
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 10
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 10
uuuucguucu auaaaaauau uau 23
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 11
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 12
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 12
cuacccuaaa guacauuggu ucu 23
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 13
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 14
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 14
accugaaagu aggaccuuua uau 23
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 15
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 16
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 16
uuuucguucu auaaaaauau uau 23
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 17
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 18
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 18
cuacccuaaa guacauuggu ucu 23
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 19
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 20
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 20
accugaaagu aggaccuuua uau 23
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 21
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 22
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 22
uuuucguucu auaaaaauau uau 23
<210> 23
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 23
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 24
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 24
cuacccuaaa guacauuggu ucu 23
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 25
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 26
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 26
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 27
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 27
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 28
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 28
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 29
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 29
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 30
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 30
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 31
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 31
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 32
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 32
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 33
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 34
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 34
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 35
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 36
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 36
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 37
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 37
cuuacgcuga guacuucga 19
<210> 38
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 38
ucgaaguacu cagcguaag 19
<210> 39
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 39
agauaugcac acacacgga 19
<210> 40
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 40
uccgugugug ugcauaucu 19
<210> 41
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 41
ucucguggcc uuaaugaaa 19
<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 42
uuucauuaag gccacgagau u 21
<210> 43
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 43
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 44
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 45
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 45
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 46
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 46
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 47
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 48
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 49
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 49
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 50
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 51
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 51
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 52
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 53
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 54
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 55
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 55
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 56
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 56
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 57
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 57
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 58
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 58
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 59
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 59
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 60
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 61
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 61
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 62
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 63
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 63
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 64
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 64
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 65
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 65
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 66
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 66
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 67
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 67
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 68
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 68
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 69
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 69
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 70
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 70
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 71
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 71
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 72
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 72
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 73
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 73
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 74
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 74
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 75
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 75
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 76
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 76
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 77
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 77
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 78
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 78
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 79
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 79
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 80
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 80
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 81
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 81
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 82
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 82
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 83
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 83
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 84
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 84
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 85
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 85
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 86
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 86
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 87
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 87
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 88
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 88
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 89
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 89
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 90
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 90
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 91
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 91
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 92
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 92
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 93
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 93
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 94
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 94
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 95
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 95
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 96
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 96
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 97
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 97
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 98
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 98
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 99
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 99
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 100
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 100
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 101
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 101
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 102
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 103
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 103
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 104
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 104
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 105
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 105
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 106
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 106
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 107
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 107
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 108
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 108
cuuacgcuga guacuucga 19
<210> 109
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 109
ucgaaguacu cagcguaag 19
<210> 110
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 110
agauaugcac acacacgga 19
<210> 111
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 111
uccgugugug ugcauaucu 19
<210> 112
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 112
ucucguggcc uuaaugaaa 19
<210> 113
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 113
uuucauuaag gccacgagau u 21
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 114
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 115
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 115
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 116
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 116
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 117
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 117
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 118
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 118
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 119
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 119
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 120
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 120
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 121
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 121
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 122
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 123
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 123
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 124
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 124
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 125
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 125
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 126
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 126
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 127
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 127
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 128
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 128
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 129
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 129
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 130
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 130
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 131
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 131
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 132
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 132
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 133
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 133
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 134
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 134
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 135
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 135
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 136
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 136
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 137
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 137
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 138
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 138
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 139
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 139
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 140
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 140
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 141
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 141
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 142
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 142
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 143
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 143
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 144
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 144
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 145
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 145
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 146
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 146
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 147
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 147
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 148
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 148
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 149
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 149
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 150
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 150
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 151
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 151
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 152
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 152
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 153
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 153
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 154
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 154
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 155
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 155
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 156
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 156
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 157
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 157
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 158
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 158
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 159
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 159
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 160
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 160
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 161
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 161
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 162
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 162
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 163
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 163
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 164
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 164
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 165
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 165
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 166
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 166
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 167
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 167
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 168
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 168
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 169
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 169
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 170
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 170
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 171
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 171
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 172
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 172
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 173
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 173
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 174
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 174
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 175
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 175
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 176
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 176
ucuugguuac augaaauccc auc 23
Claims (56)
1.一种化合物，其包含以下结构：
其中：
r和s独立地是选自1至16的整数；并且
Z是寡核苷酸部分。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中s是选自4至12的整数。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中s是6。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中r是选自4至14的整数。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中r是6。
6.根据权利要求4所述的化合物，其中r是12。
7.根据权利要求5所述的化合物，其从属于权利要求3。
8.根据权利要求6所述的化合物，其从属于权利要求3。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中Z是：
其中：
Z1、Z2、Z3、Z4在每次出现时独立地是氧或硫；并且
P和Z2之间以及P和Z3之间的键中的一个是单键，并且另一个键是双键。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸是能够调节、优选抑制靶基因的表达的RNA化合物。
11.根据权利要求10中任一项所述的化合物，其中所述RNA化合物包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端。
12.根据权利要求11所述的化合物，其优选还从属于权利要求3和6，其中所述RNA化合物在其第二链的所述5'端与相邻的磷酸附接。
13.根据权利要求11所述的化合物，其优选还从属于权利要求3和5，其中所述RNA化合物在其第二链的所述3'端与相邻的磷酸附接。
14.一种式(II)的化合物，其优选从属于权利要求12：
15.一种式(III)的化合物，其优选从属于权利要求13：
16.根据权利要求1至15中任一项所定义的化合物，其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体进一步包含一个或多个在2'位置被修饰的核糖，优选多个在2'位置被修饰的核糖。
17.根据权利要求16所述的化合物，其中所述修饰选自2'-O-甲基、2'-脱氧-氟和2'-脱氧。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸进一步包含在一个或多个端处的一个或多个降解保护部分。
19.根据权利要求18所述的化合物，其中所述一个或多个降解保护部分不存在于寡核苷酸链的携带接头/配体部分的端处，且/或其中所述一个或多个降解保护部分选自硫代磷酸核苷酸间键、二硫代磷酸核苷酸间键和反向无碱基核苷酸，其中所述反向无碱基核苷酸存在于相同链的相对于携带接头/配体部分的所述端的远端处。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的化合物，其中如权利要求1中式(I)所描绘的所述配体部分包含一个或多个配体。
21.根据权利要求20所述的化合物，其中如权利要求1中式(I)所描绘的所述配体部分包含一个或多个碳水化合物配体。
22.根据权利要求21所述的化合物，其中所述一个或多个碳水化合物可以是单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖。
23.根据权利要求22所述的化合物，其中所述一个或多个碳水化合物包含一个或多个半乳糖部分、一个或多个乳糖部分、一个或多个N-乙酰半乳糖胺部分和/或一个或多个甘露糖部分。
24.根据权利要求23所述的化合物，其中所述一个或多个碳水化合物包含一个或多个N-乙酰基-半乳糖胺部分。
25.根据权利要求24所述的化合物，其包含两个或三个N-乙酰半乳糖胺部分。
26.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述一个或多个配体以线性构型或分支构型附接。
27.根据权利要求26所述的化合物，其中所述一个或多个配体以双触角或三触角分支构型附接。
28.根据权利要求20至27所述的化合物，其中如权利要求1中式(I)所描绘的所述部分：
是式(IV)、(V)或(VI)中的任一个，优选式(IV)：
其中：
AI是氢或合适的羟基保护基；
a是2或3的整数；并且
b是2至5的整数；或者
其中：
AI是氢或合适的羟基保护基；
a是2或3的整数；并且
c和d独立地是1至6的整数；或者
其中：
AI是氢或合适的羟基保护基；
a是2或3的整数；并且
e是2至10的整数。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的化合物，其中如权利要求1中式(I)所描绘的所述部分：
是式(VII)：
其中：
AI是氢；
a是2或3的整数。
30.根据权利要求28或29所述的化合物，其中a＝2。
31.根据权利要求28或29所述的化合物，其中a＝3。
32.根据权利要求28所述的化合物，其中b＝3。
33.一种式(VIII)的化合物：
34.一种式(IX)的化合物：
35.根据权利要求33或34所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体进一步包含一个或多个在2'位置被修饰的核糖，优选多个在2'位置被修饰的核糖。
36.根据权利要求35所述的化合物，其中所述修饰选自2'-O-甲基、2'-脱氧-氟和2'-脱氧。
37.根据权利要求33至36中任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸进一步包含在一个或多个端处的一个或多个降解保护部分。
38.根据权利要求37所述的化合物，其中所述一个或多个降解保护部分不存在于寡核苷酸链的携带接头/配体部分的端处，且/或其中所述一个或多个降解保护部分选自硫代磷酸核苷酸间键、二硫代磷酸核苷酸间键和反向无碱基核苷酸，其中所述反向无碱基核苷酸存在于相同链的相对于携带接头/配体部分的所述端的远端处。
39.根据权利要求33所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的所述5'端与相邻的磷酸附接。
40.根据权利要求34所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的所述3'端与相邻的磷酸附接。
41.一种制备根据权利要求1至40中任一项所述的化合物的方法，其包括使式(X)的化合物和式(XI)的化合物反应：
其中：
r和s独立地是选自1至16的整数；并且
Z是寡核苷酸部分；
并且在适当情况下进行配体的脱保护和/或寡核苷酸的第二链的退火。
42.根据权利要求41所述的方法，其用于制备根据权利要求6、8至14、16至33和35至40中任一项所述的化合物，其中：
式(X)的化合物是式(Xa)：
且式(XI)的化合物是式(XIa)：
其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的所述5'端与相邻的磷酸附接。
43.根据权利要求41所述的方法，其用于制备根据权利要求5、7、9至13、15至32和34至40中任一项所述的化合物，其中：
式(X)的化合物是式(Xb)：
且式(XI)的化合物是式(XIa)：
其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的所述3'端与相邻的磷酸附接。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中：
式(XIa)的化合物是式(XIb)：
45.一种式(X)的化合物：
其中：
r独立地是选自1至16的整数；并且
Z是寡核苷酸部分。
46.一种式(Xa)的化合物：
47.一种式(Xb)的化合物：
48.一种式(XI)的化合物：
其中：
s独立地是选自1至16的整数；并且
Z是寡核苷酸部分。
49.一种式(XIa)的化合物：
50.一种式(XIb)的化合物：
51.根据权利要求45和48至50中任一项所述的化合物用于制备根据权利要求1至40中任一项所述的化合物的用途。
52.根据权利要求46所述的化合物用于制备根据权利要求6、8至14、16至33和35至40中任一项所述的化合物的用途。
53.根据权利要求47所述的化合物用于制备根据权利要求5、7、9至13、15至32和34至40中任一项所述的化合物的用途。
54.一种化合物或组合物，其通过根据权利要求41至44中任一项所述的方法获得或可获得。
55.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至40中任一项所述的化合物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
56.根据权利要求1至40中任一项所述的化合物，其用于治疗。
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