CN116829717A - 含有无碱基核苷酸的核酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗或预防疾病的核酸分子。
Description
技术领域
本发明提供了适用于治疗用途的新型寡核苷酸化合物，该寡核苷酸化合物是核酸化合物。此外，本发明提供制备这些化合物的方法，以及使用此类化合物用于治疗各种疾病和病症的方法。
背景技术
寡核苷酸化合物在医学上具有重要的治疗应用。寡核苷酸可用于使导致特定疾病的基因沉默。基因沉默通过抑制翻译来阻止蛋白质的形成。重要的是，基因沉默剂是抑制与疾病相关的蛋白质功能的传统小型有机化合物的有前途的替代品。siRNA、反义RNA和微小RNA是通过基因沉默阻止蛋白质形成的寡核苷酸。
在过去的二十年中，特别是为了诊断和治疗目的开发了许多修饰的siRNA化合物，包括用于治疗各种疾病的siRNA/RNAi治疗剂，该疾病包括中枢神经系统疾病、炎性疾病、代谢障碍、肿瘤、传染性疾病和眼部疾病。
本发明涉及用于治疗和/或预防疾病的此类寡核苷酸化合物，该寡核苷酸化合物是核酸化合物。
发明内容
一种用于抑制细胞中靶基因的表达的核酸(任选地是RNA)，其包含至少一个双链体区域，该双链体区域包含第一链的至少一部分和与第一链至少部分互补的第二链的至少一部分，其中所述第一链与从待抑制的所述靶基因转录的RNA的至少一部分至少部分互补，其中第二链包含在第二链的末端区域中的一个或多个无碱基核苷酸，并且其中所述无碱基核苷酸通过反向核苷酸间键与相邻核苷酸连接。
一种用于抑制细胞中靶基因的表达的缀合物，所述缀合物包含核酸部分和一个或多个配体部分，所述核酸部分包含如本文所公开的核酸。
一种药物组合物，其包含如本文所公开的核酸或如本文所公开的缀合物以及生理上可接受的赋形剂。
附图说明
图1显示了总共45种人源性癌细胞裂解物和原代人肝细胞(PHH)裂解物中hsC5mRNA表达水平的分析。mRNA表达水平以相对光单位[RLU]显示。
图2显示了总共45种人源性癌细胞裂解物和原代人肝细胞(PHH)裂解物中hsHAO1mRNA表达水平的分析。mRNA表达水平以相对光单位[RLU]显示。
图3显示了总共45种人源性癌细胞裂解物和原代人肝细胞(PHH)裂解物中hsTTRmRNA表达水平的分析。mRNA表达水平以相对光单位[RLU]显示。
图4A-B显示了实例1中HepG2细胞中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图5A-B显示了实例1中HepG2细胞中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图6显示了所有三批原代人肝细胞BHuf16087(左)、CHF2101(中)和CyHuf19009(右)各自在培养0小时、24小时、48小时和72小时后的hsTTR(上)、hsC5(中)和hsHAO1(下)mRNA表达水平的分析。mRNA表达水平以相对光单位[RLU]显示。
图7显示了所有三批原代人肝细胞BHuf16087(左)、CHF2101(中)和CyHuf19009(右)各自在培养0小时、24小时、48小时和72小时后的hsGAPDH(上)和hsAHSA1(下)mRNA表达水平的分析。mRNA表达水平以相对光单位[RLU]显示。
图8A-B显示了实例1中PHH中靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图9A-B显示了实例1中PHH中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图10A-B显示了实例1中PHH中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图11A-B显示了实例3中HepG2细胞中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图12A-B显示了实例3中HepG2细胞中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图13A-B显示了实例3中PHH中靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图14A-B显示了实例3中PHH中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图15A-B显示了实例3中PHH中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的剂量响应分析结果。
图16.ETX005的单剂量小鼠药理学。HAO1 mRNA表达相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
图17.ETX005的单剂量小鼠药理学。显示了血清乙醇酸浓度。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差，除了来自一组5只小鼠的基线乙醇酸浓度(第0天)以外。
图18.ETX006的单剂量小鼠药理学。HAO1 mRNA表达相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
图19.ETX006的单剂量小鼠药理学。显示了血清乙醇酸浓度。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差，除了来自一组5只小鼠的基线乙醇酸浓度(第0天)以外。
图20.ETX014的单剂量小鼠药理学。C5 mRNA表达相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
图21.ETX0014的单剂量小鼠药理学。血清C5浓度相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
图22.ETX015的单剂量小鼠药理学。C5 mRNA表达相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
图23.ETX0015的单剂量小鼠药理学。血清C5浓度相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
图24.ETX023的单剂量NHP药理学。血清TTR浓度相对于研究第1天显示。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。
图25.ETX024的单剂量NHP药理学。血清TTR浓度相对于研究第1天显示。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。
图26ETX019的单剂量NHP药理学。血清TTR浓度相对于研究第1天以及给药前显示。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。显示最多84天的时间点。
图27ETX020的单剂量NHP药理学。血清TTR浓度相对于研究第1天以及给药前显示。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。显示最多84天的时间点。
图28a.ETX023的单剂量NHP药理学。血清TTR浓度相对于研究第1天以及给药前显示。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。显示最多84天的时间点。
图28b.在单次1mg/kg剂量的ETX023后持续抑制肝脏中的TTR基因表达。TTR mRNA相对于给药前测量的基线水平显示。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。显示最多84天的时间点。
图28c.用单次1mg/kg剂量的ETX023给药的动物体重。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。显示最多84天的时间点。
图28d用单次1mg/kg剂量的ETX023处理的动物的血清中的ALT浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。虚线显示对该物种被认为正常的值的范围(Park等人2016Reference values of clinical pathology parameter in cynomolgus monkeysused in preclinical studies.Lab Anim Res 32:79-86.)显示最多84天的时间点。
图28e.用单次1mg/kg剂量的ETX023处理的动物血清中的AST浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。虚线显示对该物种被认为正常的值的范围(Park等人2016Reference values of clinical pathology parameter in cynomolgus monkeysused in preclinical studies.Lab Anim Res 32:79-86。显示最多84天的时间点。
图29a.ETX024的单剂量NHP药理学。血清TTR浓度相对于研究第1天以及给药前显示。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。显示最多84天的时间点。
图29b.在单次1mg/kg剂量的ETX024后持续抑制肝脏中的TTR基因表达。TTR mRNA相对于给药前测量的基线水平显示。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。显示最多84天的时间点。
图29c.用单次1mg/kg剂量的ETX024给药的动物体重。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。显示最多84天的时间点。
图29d用单次1mg/kg剂量的ETX024处理的动物的血清中的ALT浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。虚线显示对该物种被认为正常的值的范围(Park等人2016Reference values of clinical pathology parameter in cynomolgus monkeysused in preclinical studies.Lab Anim Res 32:79-86.)显示最多84天的时间点。
图29e.用单次1mg/kg剂量的ETX024处理的动物血清中的AST浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。虚线显示对该物种被认为正常的值的范围(Park等人2016Reference values of clinical pathology parameter in cynomolgus monkeysused in preclinical studies.Lab Anim Res 32:79-86。显示最多84天的时间点。
图30ETX005、014、023的接头和配体部分
还应理解，在适当的情况下，虽然作为产物的ETX005包括如图30中具体描绘的基于接头和配体部分的分子，该分子与也如本文所描绘的寡核苷酸部分附接，但是该ETX005产物可以可替代地进一步包含以下分子或基本上由以下分子组成：在该分子中接头和配体部分基本上如图30所描绘，该分子与寡核苷酸部分附接但如图30所示在环辛基环上的F取代基被由于水解置换而产生的取代基(诸如OH取代基)替代。以这种方式，(a)ETX005可以基本上由如图30中具体描绘的具有接头和配体部分的分子组成，其中在环辛基环上具有F取代基；或(b)ETX005可以基本上由基本上如图30所描绘的具有接头和配体部分的分子组成，但如图30所示在环辛基环上的F取代基被由于水解置换而产生的取代基(诸如OH取代基)替代，或(c)ETX005可以包含如(a)和/或(b)中所定义的分子的混合物。
还应理解，在适当的情况下，虽然作为产物的ETX014包括如图30中具体描绘的基于接头和配体部分的分子，该分子与也如本文所描绘的寡核苷酸部分附接，但是该ETX014产物可以可替代地进一步包含以下分子或基本上由以下分子组成：在该分子中接头和配体部分基本上如图30所描绘，该分子与寡核苷酸部分附接但如图30所示在环辛基环上的F取代基被由于水解置换而产生的取代基(诸如OH取代基)替代。以这种方式，(a)ETX014可以基本上由如图30中具体描绘的具有接头和配体部分的分子组成，其中在环辛基环上具有F取代基；或(b)ETX014可以基本上由基本上如图30所描绘的具有接头和配体部分的分子组成，但如图30所示在环辛基环上的F取代基被由于水解置换而产生的取代基(诸如OH取代基)替代，或(c)ETX014可以包含如(a)和/或(b)中所定义的分子的混合物。
还应理解，在适当的情况下，虽然作为产物的ETX023包括如图30中具体描绘的基于接头和配体部分的分子，该分子与也如本文所描绘的寡核苷酸部分附接，但是该ETX023产物可以可替代地进一步包含以下分子或基本上由以下分子组成：在该分子中接头和配体部分基本上如图30所描绘，该分子与寡核苷酸部分附接但如图30所示在环辛基环上的F取代基被由于水解置换而产生的取代基(诸如OH取代基)替代。以这种方式，(a)ETX023可以基本上由如图30中具体描绘的具有接头和配体部分的分子组成，其中在环辛基环上具有F取代基；或(b)ETX023可以基本上由基本上如图30所描绘的具有接头和配体部分的分子组成，但如图30所示在环辛基环上的F取代基被由于水解置换而产生的取代基(诸如OH取代基)替代，或(c)ETX023可以包含如(a)和/或(b)中所定义的分子的混合物。
图31ETX001、010和019的接头和配体部分
还应理解，在适当的情况下，虽然作为产物的ETX001包括如图31中具体描绘的基于接头和配体部分的分子，该分子与也如本文所描绘的寡核苷酸部分附接，但是该ETX001产物可以可替代地进一步包含以下分子或基本上由以下分子组成：在该分子中接头和配体部分基本上如图31所描绘，该分子与寡核苷酸部分附接但如图31所示在环辛基环上的F取代基被由于水解置换而产生的取代基(诸如OH取代基)替代。以这种方式，(a)ETX001可以基本上由如图31中具体描绘的具有接头和配体部分的分子组成，其中在环辛基环上具有F取代基；或(b)ETX001可以基本上由基本上如图31所描绘的具有接头和配体部分的分子组成，但如图31所示在环辛基环上的F取代基被由于水解置换而产生的取代基(诸如OH取代基)替代，或(c)ETX001可以包含如(a)和/或(b)中所定义的分子的混合物。
还应理解，在适当的情况下，虽然作为产物的ETX010包括如图31中具体描绘的基于接头和配体部分的分子，该分子与也如本文所描绘的寡核苷酸部分附接，但是该ETX010产物可以可替代地进一步包含以下分子或基本上由以下分子组成：在该分子中接头和配体部分基本上如图31所描绘，该分子与寡核苷酸部分附接但如图31所示在环辛基环上的F取代基被由于水解置换而产生的取代基(诸如OH取代基)替代。以这种方式，(a)ETX010可以基本上由如图31中具体描绘的具有接头和配体部分的分子组成，其中在环辛基环上具有F取代基；或(b)ETX010可以基本上由基本上如图31所描绘的具有接头和配体部分的分子组成，但如图31所示在环辛基环上的F取代基被由于水解置换而产生的取代基(诸如OH取代基)替代，或(c)ETX010可以包含如(a)和/或(b)中所定义的分子的混合物。
还应理解，在适当的情况下，虽然作为产物的ETX019包括如图31中具体描绘的基于接头和配体部分的分子，该分子与也如本文所描绘的寡核苷酸部分附接，但是该ETX019产物可以可替代地进一步包含以下分子或基本上由以下分子组成：在该分子中接头和配体部分基本上如图31所描绘，该分子与寡核苷酸部分附接但如图31所示在环辛基环上的F取代基被由于水解置换而产生的取代基(诸如OH取代基)替代。以这种方式，(a)ETX019可以基本上由如图31中具体描绘的具有接头和配体部分的分子组成，其中在环辛基环上具有F取代基；或(b)ETX019可以基本上由基本上如图31所描绘的具有接头和配体部分的分子组成，但如图31所示在环辛基环上的F取代基被由于水解置换而产生的取代基(诸如OH取代基)替代，或(c)ETX019可以包含如(a)和/或(b)中所定义的分子的混合物。
图32ETX006、015和024的接头和配体部分
图33ETX002、011和020的接头和配体部分。
图34用单次1mg/kg剂量的ETX023处理的动物血清中的总胆红素浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。虚线显示对该物种被认为正常的值的范围(Park等人2016Reference values of clinical pathology parameter in cynomolgus monkeysused in preclinical studies.Lab Anim Res 32:79-86.)
图35.用单次1mg/kg剂量的ETX023处理的动物的血尿素氮(BUN)浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。虚线显示对该物种被认为正常的值的范围(Park等人2016Reference values of clinical pathology parameter in cynomolgus monkeysused in preclinical studies.Lab Anim Res 32:79-86.)
图36.用单次1mg/kg剂量的ETX023处理的动物的肌酐(CREA)浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。虚线显示对该物种被认为正常的值的范围(Park等人2016Reference values of clinical pathology parameter in cynomolgus monkeysused in preclinical studies.Lab Anim Res 32:79-86.)
图37.用单次1mg/kg剂量的ETX024处理的动物血清中的总胆红素浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。阴影部分显示在用于研究的设施中被认为正常的值的范围。虚线显示对该物种被认为正常的值(Park等人2016Reference values of clinicalpathology parameter in cynomolgus monkeys used in preclinical studies.LabAnim Res 32:79-86.)
图38.用单次1mg/kg剂量的ETX024处理的动物的血尿素氮(BUN)浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。阴影部分显示在用于研究的设施中被认为正常的值的范围。虚线显示对该物种被认为正常的值(Park等人2016Reference values of clinicalpathology parameter in cynomolgus monkeys used in preclinical studies.LabAnim Res 32:79-86.)
图39.用单次1mg/kg剂量的ETX024处理的动物的肌酐(CREA)浓度。每个点代表3只动物的平均值和标准偏差。阴影部分显示在用于研究的设施中被认为正常的值的范围。虚线显示对该物种被认为正常的值(Park等人2016Reference values of clinicalpathology parameter in cynomolgus monkeys used in preclinical studies.LabAnim Res 32:79-86.)
图40-图42如下所述。
图43显示了本文公开的句子1-101中描述的式的细节。
图44显示了本文公开的条款1-56中描述的式的细节
图45a显示了如本文所述的构建体ETX001、ETX002的有义(SS)和反义(AS)链的基础核苷酸序列。对于ETX001和ETX002二者，galnac接头与使用中的有义链的5'端区域附接(图45a中未描绘)。对于ETX001，galnac接头被附接并且如图31所示。对于ETX002，galnac接头被附接并且如图33所示。
如图45a中有义链的3'端区域所示的iaia表示(i)在有义链的3'端区域作为倒数第二个和末端核苷酸提供的两个无碱基核苷酸，(ii)其中在有义链的倒数第三个核苷酸(即在有义链位置21的A，其中位置1是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链5'端区域的末端G)与相邻的倒数第二个无碱基残基之间提供3'-3'反向连接，和(iii)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的3'端区域读取时，末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的连接是5'-3'。
对于图45a的有义链，当从有义链的位置1(是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链的5'端区域的末端G)读取时，则：(i)在位置1至6、8和12至21的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置7和9至11的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)无碱基核苷酸具有在位置1和2具有H的糖。
对于图45a的反义链，当从反义链的位置1(是反义链的末端5'核苷酸，即在反义链5'端区域的末端U)读取时，则：(i)在位置1、3至5、7、10至13、15、17至23的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置2、6、8、9、14、16的核苷酸具有2'F修饰的糖。
图45b显示了如本文所述的构建体ETX005、ETX006的有义(SS)和反义(AS)链的基础核苷酸序列。对于ETX005和ETX006二者，galnac接头与使用中的有义链的3'端区域附接(图45b中未描绘)。对于ETX005，galnac接头被附接并且如图30所示。对于ETX006，galnac接头被附接并且如图32所示。
如图45b中有义链的5'端区域所示的iaia表示(i)在有义链的5'端区域作为倒数第二个和末端核苷酸提供的两个无碱基核苷酸，(ii)其中在有义链的倒数第三个核苷酸(即在有义链位置1的G，在有义链上的核苷酸位置编号中不包括在有义链的5'端区域的iaia基序)与相邻的倒数第二个无碱基残基之间提供5'-5'反向连接，和(iii)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的5'端区域读取时，末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的连接是3'-5'。
对于图45b的有义链，当从有义链的位置1(是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链的5'端区域的末端G，在有义链上的核苷酸位置编号中不包括在有义链的5'端区域的iaia基序)读取时，则：(i)在位置1至6、8和12至21的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置7和9至11的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)无碱基核苷酸具有在位置1和2具有H的糖。
对于图45b的反义链，当从反义链的位置1(是反义链的末端5'核苷酸，即在反义链5'端区域的末端U)读取时，则：(i)在位置1、3至5、7、10至13、15、17至23的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置2、6、8、9、14、16的核苷酸具有2'F修饰的糖。
图46a显示了如本文所述的构建体ETX010、ETX011的有义(SS)和反义(AS)链的基础核苷酸序列。对于ETX010和ETX011二者，galnac接头与使用中的有义链的5'端区域附接(图46a中未描绘)。对于ETX010，galnac接头被附接并且如图31所示。对于ETX011，galnac接头被附接并且如图33所示。
如图46a中有义链的3'端区域所示的iaia表示(i)在有义链的3'端区域作为倒数第二个和末端核苷酸提供的两个无碱基核苷酸，(ii)其中在有义链的倒数第三个核苷酸(即在有义链位置21的A，其中位置1是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链5'端区域的末端A)与相邻的倒数第二个无碱基残基之间提供3'-3'反向连接，和(iii)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的3'端区域读取时，末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的连接是5'-3'。
对于图46a的有义链，当从有义链的位置1(是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链的5'端区域的末端A)读取时，则：(i)在位置1、2、4、6、8、12、14、15、17、19至21的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置3、5、7、9至11、13、16、18的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)无碱基核苷酸具有在位置1和2具有H的糖。
对于图46a的反义链，当从反义链的位置1(是反义链的末端5'核苷酸，即在反义链5'端区域的末端U)读取时，则：(i)在位置1、4、6、7、9、11至13、15、17、19至23的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置2、3、5、8、10、14、16、18的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)在反义链3'端区域位置24、25的倒数第二个和末端T核苷酸具有在位置2具有H的糖。
图46b显示了如本文所述的构建体ETX014、ETX015的有义(SS)和反义(AS)链的基础核苷酸序列。对于ETX014和ETX015二者，galnac接头与使用中的有义链的3'端区域附接(图46b中未描绘)。对于ETX014，galnac接头被附接并且如图30所示。对于ETX015，galnac接头被附接并且如图32所示。
如图46b中有义链的5'端区域所示的iaia表示(i)在有义链的5'端区域作为倒数第二个和末端核苷酸提供的两个无碱基核苷酸，(ii)其中在有义链的倒数第三个核苷酸(即在有义链位置1的A，在有义链上的核苷酸位置编号中不包括在有义链的5'端区域的iaia基序)与相邻的倒数第二个无碱基残基之间提供5'-5'反向连接，和(iii)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的5'端区域读取时，末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的连接是3'-5'。
对于图46b的有义链，当从有义链的位置1(是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链的5'端区域的末端A，在有义链上的核苷酸位置编号中不包括在有义链的5'端区域的iaia基序)读取时，则：(i)在位置1、2、4、6、8、12、14、15、17、19至21的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置3、5、7、9至11、13、16、18的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)无碱基核苷酸具有在位置1和2具有H的糖。
对于图46b的反义链，当从反义链的位置1(是反义链的末端5'核苷酸，即在反义链5'端区域的末端U)读取时，则：(i)在位置1、4、6、7、9、11至13、15、17、19至23的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置2、3、5、8、10、14、16、18的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)在反义链3'端区域位置24、25的倒数第二个和末端T核苷酸具有在位置2具有H的糖。
图47a显示了如本文所述的构建体ETX019、ETX020的有义(SS)和反义(AS)链的基础核苷酸序列。对于ETX019和ETX020二者，galnac接头与使用中的有义链的5'端区域附接(图47a中未描绘)。对于ETX019，galnac接头被附接并且如图31所示。对于ETX020，galnac接头被附接并且如图33所示。
如图47a中有义链的3'端区域所示的iaia表示(i)在有义链的3'端区域作为倒数第二个和末端核苷酸提供的两个无碱基核苷酸，(ii)其中在有义链的倒数第三个核苷酸(即在有义链位置21的A，其中位置1是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链5'端区域的末端U)与相邻的倒数第二个无碱基残基之间提供3'-3'反向连接，和(iii)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的3'端区域读取时，末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的连接是5'-3'。
对于图47a的有义链，当从有义链的位置1(是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链的5'端区域的末端U)读取时，则：(i)在位置1至6、8和12至21的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置7和9至11的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)无碱基核苷酸具有在位置1和2具有H的糖。
对于图47a的反义链，当从反义链的位置1(是反义链的末端5'核苷酸，即在反义链5'端区域的末端U)读取时，则：(i)在位置1、3至5、7、8、10至13、15、17至23的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置2、6、9、14、16的核苷酸具有2'F修饰的糖。
图47b显示了如本文所述的构建体ETX023、ETX024的有义(SS)和反义(AS)链的基础核苷酸序列。对于ETX023和ETX024二者，galnac接头与使用中的有义链的3'端区域附接(图47b中未描绘)。对于ETX023，galnac接头被附接并且如图30所示。对于ETX024，galnac接头被附接并且如图32所示。
如图47b中有义链的5'端区域所示的iaia表示(i)在有义链的5'端区域作为倒数第二个和末端核苷酸提供的两个无碱基核苷酸，(ii)其中在有义链的倒数第三个核苷酸(即在有义链位置1的U，在有义链上的核苷酸位置编号中不包括在有义链的5'端区域的iaia基序)与相邻的倒数第二个无碱基残基之间提供5'-5'反向连接，和(iii)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的5'端区域读取时，末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的连接是3'-5'。
对于图47b的有义链，当从有义链的位置1(是有义链的末端5'核苷酸，即在有义链的5'端区域的末端U，在有义链上的核苷酸位置编号中不包括在有义链的5'端区域的iaia基序)读取时，则：(i)在位置1至6、8和12至21的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置7和9至11的核苷酸具有2'F修饰的糖，(iii)无碱基核苷酸具有在位置1和2具有H的糖。
对于图47b的反义链，当从反义链的位置1(是反义链的末端5'核苷酸，即在反义链5'端区域的末端U)读取时，则：(i)在位置1、3至5、7、8、10至13、15、17至23的核苷酸具有2'O-甲基修饰的糖，(ii)在位置2、6、9、14、16的核苷酸具有2'F修饰的糖。
具体实施方式
本发明提供了可以影响靶基因表达的核酸(诸如抑制性RNA分子(可以称为iRNA))以及含有其的组合物。该基因可以在细胞(例如受试者(诸如人)内的细胞)内。核酸可以用于预防和/或治疗与靶基因表达相关的医学病症。抑制性RNA(iRNA)是本文优选的核酸。
在第一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中靶基因表达的核酸(任选地是RNA)，其包含至少一个双链体区域，该双链体区域包含第一链的至少一部分和与第一链至少部分互补的第二链的至少一部分，其中所述第一链与从待抑制的所述靶基因转录的RNA的至少一部分至少部分互补，其中第二链在第二链的末端区域包含一个或多个无碱基核苷酸，并且其中所述无碱基核苷酸通过反向核苷酸间键与相邻核苷酸连接。
本发明特别包括双链RNA分子(dsRNA)，其包括互补并且在将使用dsRNA的条件下杂交以形成双链体结构的两条RNA链。dsRNA的一条链(反义链)包括与靶序列基本上互补并且通常完全互补的互补性区域。靶序列可以源自目标基因表达期间形成的mRNA序列。另一条链(有义链)包括与反义链互补的区域，使得两条链在适当条件下结合时杂交并形成双链体结构。dsRNA的互补序列也可以是单个核酸分子的自身互补性区域。
定义
“第一链”(在本文中也称为反义链或引导链并且在本文中反义链或引导链可以互换使用)是指核酸链，例如iRNA的链，例如dsRNA，其包括与靶序列基本上互补的区域，例如与mRNA基本上互补的区域。如本文所用，术语“互补性区域”是指反义链上与序列(例如靶序列)基本上互补的区域。在互补性区域与靶序列不完全互补的情况下，错配可以在分子的内部或末端区域中。在一些实施例中，双链核酸(例如本发明的RNAi试剂)包括反义链中的核苷酸错配。
在包含提供有配体部分且任选地还提供有接头部分的核酸的分子的情况下，本发明的核酸可以称为寡核苷酸部分。
在一些实施例中，双链核酸(例如本发明的RNAi试剂)包括有义链中的核苷酸错配。在一些实施例中，核苷酸错配例如在距离核酸(例如iRNA)的3'-端5、4、3、2或1个核苷酸内。
在另一个实施例中，核苷酸错配例如在核酸(例如iRNA)的3'-末端核苷酸中。
“第二链”(在本文中也称为有义链或过客链，并且在本文中可以互换使用)是指核酸(例如iRNA)的链，其包括与反义链(该术语如本文所定义)区域基本上互补的区域。
“靶序列”(也可以称为靶RNA或靶mRNA)是指在基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。
靶序列的长度可以为约10-35个核苷酸，例如长度可以为约15-30个核苷酸。例如，靶序列的长度可以为约15-30个核苷酸，15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的一部分。
术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指修饰的核苷酸，如下文进一步详述的。
核酸可以是DNA或RNA，并且可以包含修饰的核苷酸。RNA是优选的核酸。
本文可互换使用的术语“iRNA”、“RNAi试剂”和“iRNA试剂”、“RNA干扰剂”是指一种试剂，该试剂含有RNA并经由RNA诱导沉默复合物(RISC)途径介导RNA转录物的靶向切割。iRNA通过RNA干扰(RNAi)引导mRNA的序列特异性降解。
双链RNA在本文中称为“双链RNAi试剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA试剂”或“dsRNA”，是指核糖核酸分子的复合物，具有包含两条反平行且基本上互补的核酸链的双链体结构，被称为相对于靶RNA具有“有义”和“反义”取向。
核酸(例如dsRNA分子)每条链的大多数核苷酸优选是核糖核苷酸，但在这种情况下，每条或两条链还可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸或修饰的核苷酸。此外，如本说明书中所用，“iRNA”可以包括具有化学修饰的核糖核苷酸。
术语“修饰的核苷酸”是指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷酸间键或修饰的核碱基或其任何组合的核苷酸。因此，术语修饰的核苷酸涵盖对核苷间键、糖部分或核碱基的例如官能团或原子的取代、添加或去除。出于本说明书和权利要求的目的，如在siRNA型分子中使用的任何此类修饰都被“iRNA”或“RNAi试剂”涵盖。
本发明的核酸(例如dsRNA)的双链体区域的长度范围可以是约9至40个碱基对，诸如长度为9至36个碱基对，例如长度为约15-30个碱基对，例如长度为约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个碱基对，诸如长度为约15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对。
形成双链体结构的两条链可以是一个较大分子的不同部分，或者它们可以是单独的分子，例如RNA分子。
术语“核苷酸突出端”是指从双链核酸的双链体结构延伸的至少一个未配对的核苷酸。ds核酸可以包含至少一个核苷酸的突出端；可替代地，突出端可以包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出端可以包含以下或由以下组成：核苷酸/核苷类似物，包括脱氧核苷酸/核苷。突出端可以在有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于反义链或有义链的5'-端、3'-端或两端。
在某些实施例中，反义链具有1-10个核苷酸，例如0-3、1-3、2-4、2-5、4-10、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，突出端位于3'-端或5'-端。
“平”或“平端”是指在双链核酸的那一端没有未配对的核苷酸，即没有核苷酸突出端。本发明的核酸包括在一端没有核苷酸突出端或在任一端都没有核苷酸突出端的那些。
除非另有说明，否则当用于描述与第二核苷酸序列相关的第一核苷酸序列时，术语“互补”是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力，如技术人员将理解的。例如，此类条件可以是严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mMEDTA，50℃或70℃，持续12-16小时，然后洗涤(参见例如，"Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Sambrook,等人(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
如本文所述的核酸(例如dsRNA)内的互补序列包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的全长上的碱基配对。此类序列在本文中可以称为相对于彼此“完全互补”。然而，当第一序列在本文中被称为相对于第二序列“基本上互补”时，这两个序列可以是完全互补的，或者它们可以形成一个或多个错配碱基对，诸如2、4或5个错配碱基对，但优选不超过5个，同时保留在与其最终应用(例如，经由RISC途径抑制基因表达)最相关的条件下杂交的能力。在确定互补性方面，突出端不应被视为错配。例如，包含一个长度为17个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度为19个核苷酸的寡核苷酸的核酸(例如dsRNA)，其中较长的寡核苷酸包含与较短的寡核苷酸完全互补的17个核苷酸的序列，仍可以称为“完全互补”。
如本文所用，“互补”序列还可以包括以下或完全由以下形成：非Watson-Crick碱基对或由非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对，只要关于它们杂交能力的上述要求得到满足即可。此类非Watson-Crick碱基对包括但不限于G:U Wobble或Hoogstein碱基配对。
本文中的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可以在核酸(例如dsRNA)的有义链和反义链之间或双链核酸的反义链(例如RNAi试剂)和靶序列之间的碱基匹配方面使用。
如本文所用，与信使RNA(mRNA)的至少一部分“基本上互补”的核酸或多核苷酸是指与目标mRNA(例如，编码基因的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码该基因的mRNA的未中断部分基本上互补，则多核苷酸与目标基因的mRNA的至少一部分互补。
因此，在一些优选的实施例中，本文公开的有义链多核苷酸和反义多核苷酸与靶基因序列完全互补。
在其他实施例中，本文公开的反义多核苷酸与靶RNA序列基本上互补，并且包含连续核苷酸序列，该核苷酸序列在其整个长度上与靶RNA序列的等效区域至少约80％互补，诸如至少约85％、86％、87％、88％、89％、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％互补或100％互补。
在一些实施例中，核酸(例如本发明的iRNA)包括与反义多核苷酸基本上互补的有义链，该反义多核苷酸又与靶基因序列互补，并且该核酸包含在其整个长度上与反义链核苷酸序列的等效区域至少约80％互补的连续核苷酸序列，诸如约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％互补或100％互补。
在一些实施例中，核酸(例如本发明的iRNA)包括与靶序列基本上互补的反义链并且包含在其整个长度上与靶序列至少80％互补的连续核苷酸序列，诸如约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％互补或100％互补。
如本文所用，“受试者”是动物，诸如哺乳动物，包括灵长类动物(诸如人、非人灵长类动物，例如猴子和黑猩猩)，或非灵长类动物或鸟类，当靶基因序列与核酸(例如iRNA试剂)具有足够的互补性时，该受试者内源地或异源性地表达靶基因以促进靶标敲低。在某些优选的实施例中，受试者是人。
术语“治疗(treating或treatment)”是指有益或期望的结果，包括但不限于减轻或改善与基因表达相关的一种或多种症状。“治疗”也可以指与没有治疗的预期存活相比延长存活。治疗可以包括预防并存疾病的发展，例如，减少患有肝感染的受试者的肝脏损伤。
如本文所用，“治疗有效量”旨在包括核酸(例如iRNA)的量，当向患者施用以治疗患有疾病的受试者时，该量足以实现疾病的治疗(例如，通过减少、改善或维持现有疾病或疾病的一种或多种症状或其相关并存疾病)。
本文所用的短语“药学上可接受的”是指适用于与人类受试者和动物受试者的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的化合物、材料、组合物或剂型。
如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂或溶剂包封材料的涉及将主题化合物从身体的一个器官或部分承载或输送到身体的另一个器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或媒剂。在与制剂的其它成分相容并且对治疗的受试者无害的意义上来讲，每种载体必须是“可接受的”。
在叙述参数的值或值的范围时，所叙述的值的中间值和范围也是本发明的一部分。
冠词“一个”和“一种”在本文中指代冠词的一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)语法宾语。
本文使用的术语“包括”是指短语“包括但不限于”，并且可与该短语互换使用。
本文使用的术语“或”是指术语“和/或”，并且可与术语“和/或”互换使用，除非上下文清楚地另有说明。例如，“有义链或反义链”被理解为“有义链或反义链或有义链和反义链”。
本文使用的术语“约”是指在本领域的典型公差范围内。例如，“约”可以理解为与平均值相差约2个标准偏差。在某些实施例中，约是指+10％。在某些实施例中，约是指+5％。当约出现在一系列数字或范围之前时，应当理解“约”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
在一个数字或一系列数字之前的术语“至少”被理解为包括与术语“至少”相邻的数字，以及逻辑上可以包括的所有后续数字或整数，如从上下文中可以清楚地看出的。例如，核酸分子中核苷酸的数量必须是整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子中的至少18个核苷酸”是指18、19、20或21个核苷酸具有指定的特性。当至少出现在一系列数字或范围之前时，应当理解“至少”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
如本文所用，“不超过”或“小于”被理解为与该短语相邻的值和逻辑上较低的值或整数(从上下文来看是合乎逻辑的)至零。例如，具有“不超过2个核苷酸”的突出端的双链体具有2、1或0个核苷酸的突出端。当“不超过”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解“不超过”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
链的末端区域是5'或3'端的最后5个核苷酸。
可以组合本发明的各种实施例，如本领域技术人员所适当确定的。
无碱基核苷酸
在核酸中存在1个，例如2个，例如3个，例如4个或更多个无碱基核苷酸。无碱基核苷酸是修饰的核苷酸，因为它们缺少通常在糖部分的位置1处看到的碱基。通常，在根据本发明的核酸中存在的无碱基核苷酸的糖部分的位置1处将存在氢。
无碱基核苷酸位于第二链的末端区域，优选位于该链端的末端5个核苷酸内。末端区域可以是末端5个核苷酸，其包括无碱基核苷酸。
第二链可以包含作为优选特征(除非相互排斥，否则所有这些特征均被具体组合考虑)的以下项：
第二链的末端区域中的2个或超过2个无碱基核苷酸；和/或
第二链的5'或3'末端区域中的2个或超过2个无碱基核苷酸；和/或
第二链的5'或3'末端区域中的2个或超过2个无碱基核苷酸，其中无碱基核苷酸存在于如本文所述的突出端中；和/或
第二链的末端区域中的2个或超过2个连续无碱基核苷酸，其中优选地一个此类无碱基核苷酸是末端核苷酸；和/或
第二链的5'或3'末端区域中的2个或超过2个连续无碱基核苷酸，其中优选地，一个此类无碱基核苷酸是第二链的5'或3'末端区域中的末端核苷酸；和/或
反向核苷酸间键，其将第二链末端区域中的至少一个无碱基核苷酸与相邻碱基核苷酸连接；和/或
反向核苷酸间键，其将第二链的5'或3'末端区域中的至少一个无碱基核苷酸与相邻碱基核苷酸连接；和/或
作为倒数第二个核苷酸的无碱基核苷酸，其经由反向键与不是末端核苷酸的核苷酸(本文称为倒数第三个核苷酸)连接；和/或
在朝向包含末端核苷酸的末端的方向读取链时，作为经由5'-3'键而连接的2个末端核苷酸的无碱基核苷酸；
在朝向包含末端核苷酸的末端的方向读取链时，作为经由3'-5'键而连接的2个末端核苷酸的无碱基核苷酸；
作为末端2个位置的无碱基核苷酸，其中倒数第二个核苷酸经由反向键与倒数第三个核苷酸连接，并且其中反向键为5-5'反向键或3'-3'反向键；
作为末端2个位置的无碱基核苷酸，其中倒数第二个核苷酸经由反向键与倒数第三个核苷酸连接，并且其中
(1)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的末端读取时，反向键是5-5'反向键并且末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的键是3'5'；或者
(2)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的末端读取时，反向键是3-3'反向键并且末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的键是5'3'。
优选地，在第二链的末端存在无碱基核苷酸。
优选地，在第二链的末端区域中(优选在末端和倒数第二个位置)存在2个或至少2个无碱基核苷酸。
优选地，2个或更多个无碱基核苷酸是连续的，例如所有无碱基核苷酸可以是连续的。例如，末端1个或末端2个或末端3个或末端4个核苷酸可以是无碱基核苷酸。
无碱基核苷酸也可以通过5'-3'磷酸二酯键或反向键与相邻核苷酸连接，除非末端只存在1个无碱基核苷酸，在这种情况下，它将具有与相邻核苷酸的反向键。
反向键(也可以称为倒置键，这在本领域中也可见)包含核苷酸的相邻糖部分之间的5'-5'、3'3'、3'-2'或2'-3'磷酸二酯键。
非末端的无碱基核苷酸将具有2个磷酸二酯键，每个相邻的核苷酸一个磷酸二酯键，并且这些可以是反向键或者可以是5'-3磷酸二酯键或者可以是两者之一。
一个优选的实施例在第二链的末端和倒数第二个位置包含2个无碱基核苷酸，并且其中反向核苷酸间键位于倒数第二个(无碱基)核苷酸和倒数第三个核苷酸之间。
优选地，在第二链的末端和倒数第二个位置存在2个无碱基核苷酸，并且倒数第二个核苷酸通过反向核苷酸间键与倒数第三个核苷酸连接，并通过5'-3'或3'-5'磷酸二酯键(沿分子末端方向读取)与末端核苷酸连接。
不同的优选特征如下：
反向核苷酸间键是3'3反向键。反向核苷酸间键位于远离第二链5'末端磷酸的末端区域。
反向核苷酸间键是5'5反向键。反向核苷酸间键位于远离第二链3'末端羟基的末端区域。
结构的实例如下(其中显示的特定RNA核苷酸不是限制性的，并且可以是任何RNA核苷酸)：
A 3'-3'反向键(并且还显示了朝向分子末端读取的两个无碱基分子之间最后一个磷酸二酯键的5'-3方向)
B 说明5'-5'反向键(并且还显示了朝向分子末端读取的两个无碱基分子之间最后一个磷酸二酯键的3'-5'方向)
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存在于核酸中的一个或多个无碱基核苷酸在一个或多个反向核苷酸间键(即5'-5'或3'-3'反向核苷酸间键)的存在下提供。反向键是由于相邻核苷酸糖的取向变化而发生的，使得糖将具有3'–5'取向，而不是传统的5'–3'取向(参考核苷酸糖上环原子的编号)。存在于本发明核酸中的一个或多个无碱基核苷酸优选包括此类倒置核苷酸糖。
在末端核苷酸具有倒置取向的情况下，这将导致整个核酸的“倒置”端构型。虽然本文绘制和引用的某些结构使用常规的5'-3'方向表示(参考核苷酸糖上环原子的编号)，但应理解存在具有取向变化和近侧3'-3'反向键的末端核苷酸将产生具有整体5'-5'端结构的核酸(即，常规的3'端核苷酸变为5'端核苷酸)。可替代地，应当理解，具有取向变化和近侧5'-5'反向键的末端核苷酸的存在将产生具有整体3'-3'端结构的核酸。
如本文所述的近侧3'-3'或5'-5'反向键可以包含与具有倒置取向的末端核苷酸(诸如具有倒置取向的单个末端核苷酸)直接相邻/附接的反向键。可替代地，如本文所述的近侧3'-3'或5'-5'反向键可以包含与2个或多于2个具有倒置取向的核苷酸(诸如2个或多于2个具有倒置取向的末端区域核苷酸，诸如末端和倒数第二个核苷酸)相邻的反向键。以这种方式，反向键可以与具有倒置取向的倒数第二个核苷酸附接。虽然技术人员会理解，如上所述的倒置取向可导致核酸分子具有如本文所述的整体3'-3'或5'-5'端结构，但也应理解，在存在一个或多个额外的反向键和/或具有倒置取向的核苷酸的情况下，则整个核酸可以具有对应于常规定位的5'/3'端的3'-5'端结构。
在一个方面，核酸可以具有3'-3'反向键，并且末端糖部分可以在该末端糖的5'位置包含5'OH而不是5'磷酸基团。
因此，本领域技术人员会清楚地理解本文绘制的更常规的5'-3'结构(参考端核苷酸糖上环原子的编号)的5'-5'、3'-3'和3'-5'(沿该末端方向读取)端变体包括在本公开的范围内，其中存在一个或多个反向键。
在产生倒置端的例如反向核苷酸间键和/或一个或多个具有倒置取向的核苷酸的情况下，并且其中连接的相对位置(例如与接头的相对位置)或内部特征(诸如修饰的核苷酸)的位置相对于核酸的5'或3'端定义，则5'或3'端是如果没有反向键就会存在的常规的5'或3'端，并且其中常规的5'或3'端是通过考虑核酸内大多数内部核苷酸连接的方向性和/或核苷酸取向来确定的。从这些内部键和/或核苷酸取向可以看出核酸的哪些端将构成没有反向键的分子的常规5'和3'端(参考端核苷酸糖上环原子的编号)。
例如，在下面显示的结构中，位于“5'”端的前2个位置存在无碱基残基。如果末端核苷酸具有倒置取向，则下图中所示的“5'”端是常规的5'端，鉴于末端位置的倒置核苷酸，实际上可以包含3'OH。然而，当沿核酸分子的标准的5'[PO4]到3'[OH]方向读取时(参考核苷酸糖上环原子的编号)，大多数分子将包含从糖的3'OH到下一个糖的5'磷酸的常规核苷酸间键，该标准方向可以用于确定发现没有倒置端构型的常规的5'和3'端。
A 5'A-A-Me-Me-Me-Me-Me-Me-F-Me-F-F-F-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me 3'
反向键优选位于核酸例如RNA的端处，其远离分子的配体部分，诸如含有GalNAc的部分。
在有义链上具有5'-GalNAc的GalNAc-siRNA构建体可以在有义链的另一端具有反向键。
在有义链上具有3'-GalNAc的GalNAc-siRNA构建体可以在有义链的另一端具有反向键。
核酸长度
在一个方面，i)核酸的第一链的长度在15至30个核苷酸范围内，优选19至25个核苷酸，更优选23或25个核苷酸；且/或
ii)核酸的第二链的长度在15至30个核苷酸范围内，优选19至25个核苷酸，更优选23个核苷酸。
通常，核酸(例如iRNA)的双链体结构的长度为约15至30个碱基对，例如长度为15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的一部分。
类似地，反义序列与靶序列的互补性区域和/或反义序列与有义序列的互补性区域的长度为约15至30个核苷酸，例如长度为15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本发明的一部分。
在某些优选的实施例中，反义序列与靶序列的互补性区域和/或反义序列与有义序列的互补性区域的长度为至少17个核苷酸。例如，反义链与靶标之间的互补性区域长度为19-21个核苷酸，例如，互补性区域长度为21个核苷酸。
在优选的实施例中，每条链的长度不超过30个核苷酸。
如本文所述的核酸(例如dsRNA)可以进一步包括一个或多个单链核苷酸突出端，例如1-4、2-4、1-3、2-3、1、2、3或4个核苷酸。核苷酸突出端可以包含以下或由以下组成：核苷酸/核苷类似物，包括脱氧核苷酸/核苷。突出端可以在有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于核酸(例如dsRNA)的反义链或有义链的5'-端、3'-端或两端。
在某些优选的实施例中，至少一条链包含至少1个核苷酸的3'突出端，例如，至少一条链包含至少2个核苷酸的3'突出端。突出端适当地位于反义/引导链和/或有义/过客链上。
核酸修饰
在某些实施例中，核酸(例如本发明的RNA，例如dsRNA)不包含进一步的修饰(超出所需的无碱基修饰)，例如本领域已知和本文描述的化学修饰或缀合。
在其他优选的实施例中，核酸(例如本发明的RNA，例如dsRNA)被进一步化学修饰(超出无碱基修饰)以增强稳定性或其他有益特征。
在本发明的某些实施例中，基本上所有核苷酸都被修饰。
本发明表征的核酸可以通过本领域公认的方法合成或修饰，诸如"Currentprotocols in nucleic acid chemistry,"Beaucage,S.L.等人(Edrs.),John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA中描述的那些，该文献通过引用并入本文。
修饰包括例如端修饰，例如5'-端修饰(磷酸化、缀合、反向键)或3'-端修饰(缀合、RNA内的DNA核苷酸，或DNA内的RNA核苷酸、反向键等)；碱基修饰，例如，用稳定碱基、去稳定碱基或与扩展的伴侣库、缀合碱基碱基配对的碱基替换；糖修饰(例如，在2'-位置或4'-位置)或糖的替换；或主链修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替换。
可用于本文描述的实施例的核酸(诸如iRNA化合物)的具体实例包括但不限于含有修饰主链或不含天然核苷间键的RNA。具有修饰的主链的核酸(诸如RNA)尤其包括在主链中不具有磷原子的那些。为了本说明书的目的，并且有时在本领域中引用，在其核苷间主链中没有磷原子的修饰的核酸(例如RNA)也可以被认为是寡核苷。在一些实施例中，修饰的核酸(例如iRNA)在其核苷间主链中会有磷原子。
修饰的核酸(例如RNA主链)包括例如硫代磷酸、手性硫代磷酸、二硫代磷酸、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸(包括3'-亚烷基膦酸和手性膦酸)、次膦酸、氨基磷酸(包括3'-氨基氨基磷酸和氨基烷基氨基磷酸)、硫代氨基磷酸、硫代烷基膦酸、硫代烷基磷酸三酯和具有正常的3'-5'连接的硼代磷酸、这些的2'-5'-连接类似物以及具有倒置极性的那些，其中相邻的核苷单元对在5'-3'或5'-2'处连接。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
修饰的核酸(例如RNA)也可以含有一个或多个取代的糖部分。本文表征的核酸(例如iRNA，例如dsRNA)可以在2'-位置包括以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是经取代或未经取代的。2'O-甲基和2'-F是优选的修饰。
在某些优选的实施例中，核酸分子包含至少一个修饰的核苷酸。
本发明的核酸可以在第一链和/或第二链上包含一个或多个修饰的核苷酸。
在一些实施例中，有义链的基本上所有核苷酸和反义链的所有核苷酸都包含修饰。
在一些实施例中，有义链的所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸都包含修饰。
在一些实施例中，有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸都包含修饰。
在一个实施例中，至少一个修饰核苷酸选自由以下项组成的组：脱氧-核苷酸、3'-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-0-甲基修饰的核苷酸(在本文中也称为2'-Me，其中Me是甲氧基)、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、未锁核苷酸、构象受限核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-羟基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含核苷酸的非天然碱基、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸基团的核苷酸、包含甲基膦酸基团的核苷酸、包含5'-磷酸的核苷酸和包含5'-磷酸模拟物的核苷酸。在另一个实施例中，修饰的核苷酸包含3'-末端脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)的短序列。
核苷酸上的修饰可以优选地选自包括但不限于以下项的组：LNA、HNA、CeNA、2-甲氧基乙基、2'-0-烷基、2-0-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-脱氧、2'-羟基及其组合。在另一个实施例中，核苷酸上的修饰是2-0-甲基(“2-Me”)或2'-氟修饰。
一种优选的修饰是在核糖糖的2'-OH基团处的修饰，任选地选自2'-Me或2'-F修饰。
优选的核酸包含在第一链和/或第二链上被修饰的一个或多个核苷酸，以形成修饰的核苷酸，如下：
一种核酸，修饰是在核糖糖的2'-OH基团处的修饰，任选地选自2'-Me或2'-F修饰。
一种核酸，其中第一链包含在从所述第一链的位置1开始计数的位置14、位置2、位置6或其任何组合中的任一个处的2'-F。
一种核酸，其中第二链包含在从所述第二链的位置1开始计数的位置7和/或9和/或11和/或13处的2'-F修饰。
一种核酸，其中第二链包含在从所述第二链的位置1开始计数的位置7和9以及11处的2'-F修饰。
一种核酸，其中第一链和第二链各自包含2'-Me和2'-F修饰。
一种核酸，其中该核酸包含至少一个热去稳定化修饰，其合适地在第一链的位置1至9中的一个或多个，和/或第二链上与第一链的位置1至9对齐的位置中的一个或多个处，其中去稳定化修饰选自修饰的未锁核酸(IMUNA)和乙二醇核酸(GNA)，优选乙二醇核酸。核酸可以是双链分子，优选双链RNA，其解链温度在约40℃至80℃的范围内。核酸可以包含在第一链的位置7处的至少一个热去稳定化修饰。
一种核酸，其中该核酸包含从所述第二链的位置1开始计数的在第二链的位置7至13处的3个或更多个2'-F修饰，诸如在第二链的位置7至13处的4、5、6或7个2'-F修饰。
一种核酸，其中所述第二链包含从所述第二链的位置1开始计数的在第二链的位置1至6处的至少3个，诸如4、5或6个2'-Me修饰。
一种核酸，其中所述第一链包含在3'末端区域处的至少5个2'-Me连续修饰，优选包括在3'末端区域处的末端核苷酸，或至少在距离3'末端区域处的末端核苷酸的1或2个核苷酸内。
一种核酸，其中所述第一链包含在3'末端区域处的7个2'-Me连续修饰，优选包括在3'末端区域处的末端核苷酸。
优选修饰模式包括：
一种核酸，其中第二链包括以下修饰模式：
NA–(N)3-5–NB
其中(上文和下文)N表示具有第一修饰的核苷酸；
NA表示具有不同于N的第一修饰的第二修饰的核苷酸；
NB表示具有不同于N的第一修饰但与NA的第二修饰相同或不同的第三修饰的核苷酸；且
其中所述模式具有沿第二链的5'至3'方向性。
一种核酸，其中第二链包括以下修饰模式：
NA–(N)3–NB。
一种核酸，其中第二链包括以下修饰模式：
NA–(N)5–NB。
一种核酸，其中第二链包括以下修饰模式：
Me–(F)3–Me。
一种核酸，其中第二链包括以下修饰模式：
Me–(F)5–Me。
一种核酸，其中第二链包括以下修饰模式：
NC–NA–(N)3-5–NB–ND
其中NC和ND可以相同或不同，分别表示多个5'和3'末端区域化学修饰的核苷酸，其中至少NC包含至少两个不同修饰的核苷酸。
一种核酸，其中ND包含至少两个不同修饰的核苷酸，或各自具有相同修饰，优选2'-Me连续修饰的多个核苷酸。
一种核酸，其中第二链包括以下修饰模式：
5'A-A-Me-Me-Me-Me-Me-Me-F-Me-F-F-F-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me 3'
其中A表示无碱基修饰。
一种核酸，其中第二链包括以下修饰模式：
5'A-A-Me-Me-F-Me-F-Me-F-Me-F-F-F-Me-F-Me-Me-F-Me-F-Me-Me-Me 3'
其中A表示无碱基修饰。
一种核酸，其中第二链包括以下修饰模式：
5'Me-Me-Me-Me-Me-Me-F-Me-F-F-F-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-A-A 3'
其中A表示无碱基修饰。
一种核酸，其中第二链包括以下修饰模式：
5'Me-Me-F-Me-F-Me-F-Me-F-F-F-Me-F-Me-Me-F-Me-F-Me-Me-Me-A-A 3'
其中A表示无碱基修饰。
一种核酸，其中第一链包括以下修饰模式：
MA–(M)3-5–MB
其中M表示具有第一修饰的核苷酸并且其中通常(M)3-5与所述第二链中的(N)3-5基本对齐；
MA表示具有不同于M的第一修饰的第二修饰的核苷酸；
MB表示具有不同于M的第一修饰但与MA的第二修饰相同或不同的第三修饰的核苷酸。
一种核酸，其中第一链包括以下修饰模式：
MA–(M)3–MB。
一种核酸，其中第一链包括以下修饰模式：
MA–(M)4–MB。
一种核酸，其中第一链包括以下修饰模式：
MA–(M)5–MB。
一种核酸，其中第一链包括以下修饰模式：
F–(Me)3–F。
一种核酸，其中第一链包括以下修饰模式：
F–(Me)4–F。
一种核酸，其中第一链包括以下修饰模式：
F–(Me)5–F。
一种核酸，其中第一链包括以下修饰模式：
MC–MA–(M)3-5–MB–MD
其中MC和MD可以相同或不同，分别表示多个5'和3'末端区域化学修饰的核苷酸，各自包含至少两个不同修饰的核苷酸。
一种核酸，其中第一链包括以下修饰模式：
3'Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-F-Me-F-Me-Me-Me-Me-F-F-Me-F-Me-Me-Me-F-Me 5'。
一种核酸，其中第一链包括以下修饰模式：
3'H-H-Me-Me-Me-Me-Me-F-Me-F-Me-F-Me-Me-Me-F-Me-F-Me-Me-F-Me-F-F-Me5'。
一种核酸，其中第一链包括以下修饰模式：
3'Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-F-Me-F-Me-Me-Me-Me-F-Me-Me-F-Me-Me-Me-F-Me 5'。
第一或第二链的位置1是距离核酸端最近(忽略任何无碱基核苷酸)并经由3'到5'内部键连接到相邻核苷酸(在位置2)的核苷酸，该内部键参照主链糖部分之间的键并沿远离该分子端的方向读取。
因此可以看出，“有义链的位置1”是有义链常规5'端处的最5'核苷酸(不包括无碱基核苷酸)。通常，有义链的这个位置1的核苷酸将等同于所选靶核酸序列的5'核苷酸，并且更一般地，有义链将具有与从有义链的这个位置1开始的靶核酸序列的核苷酸等同的核苷酸，同时也允许序列之间可接受的错配。
如本文所用，“反义链的位置1”是反义链常规5'端的最5'核苷酸(不包括无碱基核苷酸)。如上文所述，有义链和反义链之间将存在互补性区域，并且以这种方式反义链也将具有与上述靶核酸序列的互补性区域。
在某些实施例中，核酸(例如dsRNA试剂)进一步包含至少一个硫代磷酸或甲基膦酸核苷酸间键。例如，硫代磷酸或甲基膦酸核苷酸间键可以在一条链(即有义链或反义链)的3'-末端或末端区域；或者在两条链(有义链和反义链)的端。
在某些实施例中，硫代磷酸或甲基膦酸核苷酸间键在一条链(即有义链或反义链)的5'末端或末端区域；或者在两条链(有义链和反义链)的端。
在某些实施例中，硫代磷酸或甲基膦酸核苷酸间键在一条链(即有义链或反义链)的5'和3'末端或末端区域；或者在两条链(有义链和反义链)的端。
任何核酸都可以在核酸内包含一个或多个硫代磷酸(PS)修饰，诸如一条链端的至少两个PS核苷酸间键。
至少一个寡核糖核苷酸链优选地在寡核苷酸的最后3个核苷酸中包含至少两个连续的硫代磷酸修饰。
因此，本发明还涉及：本文公开的核酸，其包含硫代磷酸核苷酸间键，该连接分别在诸如在第二链的5'和/或3'末端区域和/或近末端区域中的至少两个或三个连续位置之间，由此所述近末端区域优选邻近所述末端区域，所述第二链的所述一个或多个无碱基核苷酸位于所述末端区域中。
本文公开的核酸，其包含分别在第一链的5'和/或3'末端区域中的至少两个或三个连续位置之间的硫代磷酸核苷酸间键，由此优选地在所述第一链的5'和/或3'末端区域的末端位置通过硫代磷酸核苷酸间键与其相邻位置附接。
核酸链可以是包含在与2个位于末端的无碱基核苷酸邻接的三个核苷酸之间的硫代磷酸核苷酸间键的RNA。
优选的核酸是双链RNA，其包含在第二链的5'末端的2个相邻的无碱基核苷酸和配体部分，该配体部分包含在第二链的相对3'端处的一个或多个GalNAc配体部分。进一步优选地，同一核酸还可以包含在第二链的位置3-4和4-5处的核苷酸之间的硫代磷酸键，从第二链的位置1开始读取。进一步优选地，同一核酸还可以包含在第二链的位置7、9和11处的2'F修饰。
缀合
核酸(例如RNA，例如本发明的iRNA)的另一种修饰涉及连接核酸，例如将iRNA与一个或多个配体部分连接，例如以增强核酸(例如iRNA)到细胞的活性、细胞分布或细胞摄取。
在一些实施例中，所述配体部分可以与核酸(例如iRNA寡核苷酸)经由可切割或不可切割的接头附接。术语“接头”或“连接基团”是指连接化合物的两个部分的有机部分，例如，共价连接化合物的两个部分的有机部分。
配体可以与有义链的3'或5'端附接。
配体优选与核酸(例如RNAi试剂)有义链的3'端缀合。
因此，本发明另一方面涉及一种用于抑制细胞中靶基因表达的缀合物，所述缀合物包含核酸部分和一个或多个配体部分，所述核酸部分包含如本文所公开的核酸。
在一个方面，核酸的第二链直接或间接(例如经由接头)与一个或多个配体部分缀合，其中所述配体部分通常存在于第二链的末端区域，优选地在其3'末端区域。
在某些实施例中，配体部分包含通过接头与核酸例如dsRNA附接的GalNAc或GalNAc衍生物。
因此，本发明涉及一种缀合物，其中配体部分包含
i)一个或多个GalNAc配体；和/或
ii)一个或多个GalNAc配体衍生物；和/或
iii)一个或多个通过接头与所述核酸缀合的GalNAc配体。
所述GalNAc配体可以直接或间接与核酸第二链的5'或3'末端区域(优选在其3'末端区域)缀合。
GalNAc配体在本领域中是众所周知的并且尤其在EP3775207A1中有所描述。
载体和细胞
在一个方面，本发明提供了一种细胞，其含有核酸，诸如本文所述的抑制性RNA[RNAi]。
在一个方面，本发明提供了一种细胞，其包含如本文所述的载体。
药学上可接受的组合物
在一个方面，本发明提供了一种用于抑制靶基因表达的药物组合物，该组合物包含如本文所公开的核酸。
药学上可接受的组合物可以包含赋形剂和或载体。
可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包含：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)黄芪粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，诸如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石粉；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)填充剂，诸如多肽和氨基酸；(23)血清组分，诸如血清白蛋白、HDL和LDL；以及(22)药物制剂中采用的其他无毒相容性物质。
典型的药物载体包括但不限于粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填料(例如，乳糖和其他糖类、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、羟基乙酸淀粉钠等)；和润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠等)。
适用于非肠胃外施用且不会与核酸发生有害反应的药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用于配制本发明的组合物。合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于核酸局部施用的制剂可以包括无菌和非无菌水溶液，普通溶剂诸如醇中的非水溶液，或核酸在液体或固体油基中的溶液。溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。可以使用适用于非肠胃外施用且不会与核酸发生有害反应的药学上可接受的有机或无机赋形剂。
在一个实施例中，核酸或组合物在非缓冲溶液中施用。在某些实施例中，非缓冲溶液是盐水或水。在其他实施例中，核酸(例如RNAi试剂)在缓冲溶液中施用。在此类实施例中，缓冲溶液可以包含乙酸盐、柠檬酸盐、谷醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合。例如，缓冲溶液可以是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
剂量
本发明的药物组合物可以以足以抑制基因表达的剂量施用。通常，核酸(例如本发明的iRNA)的合适剂量将在每天每千克接受者体重约0.001毫克至约200.0毫克的范围内，通常在每天每千克体重约1mg至50mg的范围内。通常，核酸(例如本发明的iRNA)的合适剂量将在约0.1mg/kg至约5.0mg/kg的范围内，例如约0.3mg/kg和约3.0mg/kg。
重复剂量方案可以包括定期(诸如每隔一天一次或每年一次)施用治疗量的核酸(例如iRNA)。在某些实施例中，核酸(例如iRNA)大约每月一次至大约每季度一次(即，大约每三个月一次)施用。
在各种实施例中，核酸(例如RNAi试剂)以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量施用。在一些实施例中，核酸(例如RNAi试剂)以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量施用。在某些实施例中，核酸(例如RNAi试剂)以选自约0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的剂量施用。在某些实施例中，核酸(例如RNAi试剂)以约0.1mg/kg至约5.0mg/kg的剂量约每周一次、每月一次、每隔两个月一次或每季度一次(即每三个月一次)施用。在某些实施例中，核酸(例如RNAi试剂)每周一次向受试者施用。在某些实施例中，核酸(例如RNAi试剂)每月一次向受试者施用。在某些实施例中，核酸(例如RNAi试剂)每季度一次(即每三个月一次)施用。
在初始治疗方案之后，治疗可以以较低的频率施用。例如，在每周或每两周施用持续三个月后，可以每月一次重复施用，持续六个月或一年；或更长。
药物组合物可以每天一次施用，或者在一天中以适当的间隔分两个、三个或更多个亚剂量施用，或者甚至使用连续输注或通过控释制剂递送。在那种情况下，为了达到每日总剂量，每个亚剂量中含的核酸(例如iRNA)必须相应地更小。剂量单位也可以混合以在几天内递送，例如，使用提供核酸(iRNA)在几天时段内持续释放的常规持续释放制剂递送。持续释放制剂在本领域中是众所周知的并且特别可用于在特定部位递送药剂，例如可以与本发明的药剂一起使用。在该实施例中，剂量单位含有相应的多个日剂量。
在其他实施例中，单剂量的药物组合物可以是持久的，使得后续剂量以不超过3、4或5天的间隔，或以不超过1、2、3或4周的间隔施用.在本发明的一些实施例中，每周一次施用单剂量的本发明的药物组合物。在本发明的其他实施例中，每两个月一次施用单剂量的本发明的药物组合物。在某些实施例中，iRNA大约每月一次至大约每季度一次(即，大约每三个月一次)或甚至每6个月或12个月一次施用。
可以使用常规方法学或基于使用合适的动物模型的体内测试来估计单个核酸(本发明涵盖的iRNA)的有效剂量和体内半衰期，如本领域已知的。
取决于需要局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域，可以以许多方式施用本发明的药物组合物。施用可以是局部{例如，通过透皮贴剂)、肺部(例如，通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过雾化器)；气管内、鼻内、表皮和透皮、口服或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；真皮下，例如，经由植入装置；或颅内，例如，通过实质内、鞘内或脑室内施用。在某些优选实施例中，通过静脉输注或注射施用组合物。在某些实施例中，通过皮下注射施用组合物。
在一个实施例中，核酸(例如RNAi试剂)皮下施用于受试者。
核酸(例如iRNA)可以以靶向特定组织{例如，特别是肝脏细胞)的方式递送。
抑制基因表达的方法
本发明还提供了抑制细胞中基因表达的方法。该方法包括使细胞与有效抑制细胞中基因表达的量的本发明的核酸(例如RNAi试剂，诸如双链RNAi试剂)接触，从而抑制细胞中的基因表达。
使细胞与核酸(例如iRNA，诸如双链RNAi试剂)接触可以在体外或体内进行。使体内细胞与核酸(例如iRNA)接触包括使受试者(例如人类受试者)内的细胞或细胞群与核酸(例如iRNA)接触。接触细胞的体外和体内方法的组合也是可能的。如上所讨论的，接触细胞可以是直接的或间接的。此外，接触细胞可以经由靶向配体部分(包括本文所述或本领域已知的任何配体部分)实现。在优选的实施例中，靶向配体部分是碳水化合物部分，例如GalNAc3配体，或将RNAi试剂引导至目标位点的任何其他配体部分。
如本文所用，术语“抑制”可以与“减少”、“沉默”、“下调”、“压制”和其他类似术语互换使用，并且包括任何水平的抑制。
在本发明方法的一些实施例中，基因的表达被抑制至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或被抑制至低于测定的检测水平。在某些实施例中，该方法包括临床相关的靶基因表达抑制，例如如用降低基因表达的药剂治疗受试者后的临床相关结果所证明的与合适的对照相比，目标靶基因的mRNA量的减少可以表明基因表达的抑制。
在其他实施例中，基因表达的抑制可以根据与基因表达功能相关的参数(例如蛋白质表达或信号传导途径)的减少来评估。
治疗或预防与基因表达相关的疾病的方法
本发明还提供了使用核酸(例如本发明的iRNA)或含有核酸(例如本发明的iRNA)的组合物减少或抑制细胞中的基因表达的方法。该方法包括使细胞与核酸(例如本发明的dsRNA)接触并维持细胞足以获得基因mRNA转录物降解的时间，从而抑制细胞中的基因表达。基因表达的减少可以通过本领域已知的任何方法评估。
在本发明的方法中，可以在体外或体内接触细胞，即，细胞可以在受试者内。
适用于使用本发明方法治疗的细胞可以是表达与疾病相关的目标基因的任何细胞。
本发明的体内方法可以包括向受试者施用含有本发明的核酸(例如iRNA)的组合物，其中核酸(例如iRNA)包括与待治疗的哺乳动物基因的RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。
本发明进一步提供了治疗有此需要的受试者的方法。本发明的治疗方法包括将治疗有效量的核酸(例如本发明的iRNA，例如靶向基因的核酸，诸如iRNA，或包含靶向基因的核酸的药物组合物)施用于受试者，例如将受益于减少或抑制基因表达的受试者。
在不存在药物组合物的情况下施用时，核酸(例如本发明的iRNA)可以作为“游离”核酸或“游离iRNA”施用。裸核酸可以在合适的缓冲溶液中。缓冲溶液可以包含乙酸盐、柠檬酸盐、谷醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合。在一个实施例中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以调节缓冲溶液的pH和渗透压以使其适合施用于受试者。
可替代地，核酸(例如本发明的iRNA)可以作为药物组合物(诸如dsRNA脂质体制剂)施用。
在一个实施例中，该方法包括施用本文表征的组合物，使得降低靶基因的表达，诸如持续约1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24小时、28、32或约36小时。在一个实施例中，靶基因表达的降低持续延长的持续时间，例如至少约两天、三天、四天或更长时间，例如，约一周、两周、三周或四周或更长时间，例如约1个月、2个月或3个月。
可以向受试者施用治疗量的核酸，例如iRNA，诸如约0.01mg/kg至约200mg/kg。
核酸(例如iRNA)可以在一段时间内通过静脉内输注定期施用。在某些实施例中，在初始治疗方案之后，治疗可以以较低的频率施用。施用iRNA可以使靶基因例如在患者的细胞或组织中的基因产物水平降低至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或降低至低于所用测定方法的检测水平。在某些实施例中，施用导致基因相关障碍的至少一种体征或症状的临床稳定或优选临床相关减少。
可替代地，核酸(例如iRNA)可以皮下施用，即通过皮下注射施用。一次或多次注射可以用于向受试者递送所需的每日剂量的核酸，例如iRNA。可以在一段时间内重复注射。施用可以定期重复。在某些实施例中，在初始治疗方案之后，治疗可以以较低的频率施用。重复剂量方案可以包括定期(诸如每隔一天一次或每年一次)施用治疗量的核酸。在某些实施例中，核酸大约每月一次至大约每季度一次(即，大约每三个月一次)施用。
在一个方面，本发明可以应用于以下编号为1-101的句子的化合物、方法、组合物或用途(其中提及句子1-101中的任何式仅指在句子1-101内定义的那些式。这些式在图43中再现)
1.一种化合物，其包含以下结构：
其中：
R1在每次出现时独立地选自由以下项组成的组：氢、甲基和乙基；
R2选自由以下项组成的组：氢、羟基、-OC1-3烷基、-C(＝O)OC1-3烷基、卤代和硝基；
X1和X2在每次出现时独立地选自由以下项组成的组：亚甲基、氧和硫；
m是1至6的整数；
n是1至10的整数；
q、r、s、t、v独立地是0至4的整数，条件是：
(i)q和r不能同时都是0；以及
(ii)s、t和v不能同时都是0；
Z是寡核苷酸部分。
2.根据句子1所述的化合物，其中R1在每次出现时是氢。
3.根据句子1所述的化合物，其中R1是甲基。
4.根据句子1所述的化合物，其中R1是乙基。
5.根据句子1至4中任一项所述的化合物，其中R2是羟基。
6.根据句子1至4中任一项所述的化合物，其中R2是卤素。
7.根据句子6所述的化合物，其中R2是氟。
8.根据句子6所述的化合物，其中R2是氯。
9.根据句子6所述的化合物，其中R2是溴。
10.根据句子6所述的化合物，其中R2是碘。
11.根据句子6所述的化合物，其中R2是硝基。
12.根据句子1至11中任一项所述的化合物，其中X1是亚甲基。
13.根据句子1至11中任一项所述的化合物，其中X1是氧。
14.根据句子1至11中任一项所述的化合物，其中X1是硫。
15.根据句子1至14中任一项所述的化合物，其中X2是亚甲基。
16.根据句子1至15中任一项所述的化合物，其中X2是氧。
17.根据句子1至16中任一项所述的化合物，其中X2是硫。
18.根据句子1至17中任一项所述的化合物，其中m＝3。
19.根据句子1至18中任一项所述的化合物，其中n＝6。
20.根据句子13和15所述的化合物，其中X1是氧并且X2是亚甲基，并且优选地其中：
q＝1，
r＝2，
s＝1，
t＝1，
v＝1。
21.根据句子12和15所述的化合物，其中X1和X2都是亚甲基，并且优选地其中：
q＝1，
r＝3，
s＝1，
t＝1，
v＝1。
22.根据句子1至21中任一项所述的化合物，其中Z是：
其中：
Z1、Z2、Z3、Z4在每次出现时独立地是氧或硫；并且
P和Z2之间以及P和Z3之间的键中的一个是单键，并且另一个键是双键。
23.根据句子22所述的化合物，其中所述寡核苷酸是能够调节、优选抑制靶基因表达的RNA化合物。
24.根据句子23所述的化合物，其中所述RNA化合物包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端。
25.根据句子24所述的化合物，其中所述RNA化合物在其第二链的5'端与相邻的磷酸附接。
26.根据句子24所述的化合物，其中所述RNA化合物在其第二链的3'端与相邻的磷酸附接。
27.一种式(II)化合物：
28.一种式(III)化合物：
29.根据句子27或28所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的5'端与相邻的磷酸附接。
30.一种组合物，其包含如句子27所定义的式(II)化合物和如句子28所定义的式(III)化合物，任选地从属于句子29。
31.根据句子30所述的组合物，其中如句子28所定义的所述式(III)化合物以按所述组合物的重量计在10％至15％范围内的量存在。
32.一种式(IV)化合物：
33.一种式(V)化合物：
34.根据句子32或33所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的3'端与相邻的磷酸附接。
35.一种组合物，其包含如句子32所定义的式(IV)化合物和如句子33所定义的式(V)化合物，任选地从属于句子34。
36.根据句子35所述的组合物，其中如句子33所定义的所述式(V)化合物以按所述组合物的重量计在10％至15％范围内的量存在。
37.根据句子1至29或32至34中任一项所定义的化合物，其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体进一步包含一个或多个在2'位置被修饰的核糖，优选多个在2'位置被修饰的核糖。
38.根据句子37所述的化合物，其中修饰选自2'-O-甲基、2'-脱氧-氟和2'-脱氧。
39.根据句子1至29、或32至34、或37至38中任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸在一个或多个端进一步包含一个或多个降解保护部分。
40.根据句子39所述的化合物，其中所述一个或多个降解保护部分不存在于寡核苷酸链的携带配体部分的端处，且/或其中所述一个或多个降解保护部分选自硫代磷酸核苷酸间键、二硫代磷酸核苷酸间键和反向无碱基核苷酸，其中所述反向无碱基核苷酸存在于链的携带配体部分的远端处。
41.根据句子1至29，或32至34，或37至40中任一项所述的化合物，其中如句子1中式(I)所描绘的所述配体部分包含一个或多个配体。
42.根据句子41所述的化合物，其中如句子1中式(I)所描绘的所述配体部分包含一个或多个碳水化合物配体。
43.根据句子42所述的化合物，其中所述一个或多个碳水化合物可以是单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖。
44.根据句子43所述的化合物，其中所述一个或多个碳水化合物包含一个或多个半乳糖部分、一个或多个乳糖部分、一个或多个N-乙酰半乳糖胺部分和/或一个或多个甘露糖部分。
45.根据句子44所述的化合物，其中所述一个或多个碳水化合物包含一个或多个N-乙酰基-半乳糖胺部分。
46.根据句子45所述的化合物，其包含两个或三个N-乙酰半乳糖胺部分。
47.根据句子41至46中任一项所述的化合物，其中所述一个或多个配体以线性构型或分支构型附接。
48.根据句子47所述的化合物，其中所述一个或多个配体以双触角或三触角分支构型附接。
49.根据句子46至48所述的化合物，其中如句子1中式(I)所描绘的所述部分
是式(VIa)、(VIb)或(VIc)中的任一个，优选式(VIa)：
其中：
AI是氢或合适的羟基保护基团；
a是2或3的整数；并且
b是2至5的整数；或者
其中：
AI是氢或合适的羟基保护基团；
a是2或3的整数；并且
c和d独立地是1至6的整数；或者
其中：
AI是氢或合适的羟基保护基团；
a是2或3的整数；并且
e是2至10的整数。
50.根据句子46至48所述的化合物，其中如句子1中式(I)所描绘的所述部分
是式(VII)：
其中：
AI是氢；
a是2或3的整数。
51.根据句子49或50所述的化合物，其中a＝2。
52.根据句子49或50所述的化合物，其中a＝3。
53.根据句子49所述的化合物，其中b＝3。
54.一种式(VIII)化合物：
55.一种式(IX)化合物：
56.根据句子54或55所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的5'端与相邻的磷酸附接。
57.一种组合物，其包含如句子54所定义的式(VIII)化合物和如句子55所定义的式(IX)化合物，任选地从属于句子56。
58.根据句子57所述的组合物，其中如句子55所定义的所述式(IX)化合物以按所述组合物的重量计在10％至15％范围内的量存在。
59.一种式(X)化合物：
60.一种式(XI)化合物：
61.根据句子59或60所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的3'端与相邻的磷酸附接。
62.一种组合物，其包含如句子59所定义的式(X)化合物和如句子60所定义的式(XI)化合物，任选地从属于句子61。
63.根据句子62所述的组合物，其中如句子60所定义的所述式(XI)化合物以按所述组合物的重量计在10％至15％范围内的量存在。
64.根据句子54至63中任一项所定义的化合物，其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体进一步包含一个或多个在2'位置被修饰的核糖，优选多个在2'位置被修饰的核糖。
65.根据句子64所述的化合物，其中修饰选自2'-O-甲基、2'-脱氧-氟和2'-脱氧。
66.根据句子54至65中任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸进一步包含在一个或多个端处的一个或多个降解保护部分。
67.根据句子66所述的化合物，其中所述一个或多个降解保护部分不存在于寡核苷酸链的携带配体部分的端处，且/或其中所述一个或多个降解保护部分选自硫代磷酸核苷酸间键、二硫代磷酸核苷酸间键和反向无碱基核苷酸，其中所述反向无碱基核苷酸存在于链的携带配体部分的远端处，如句子54、55、59或60中任一项中的式(VIII)、(IX)、(X)或(XI)中的任一个所示。
68.一种制备根据句子1至29、32至34、37至56、59至61和64至67中任一项所述的化合物和/或根据句子30、31、35、36、57、58、62、63中任一项所述的组合物的方法，其包括使式(XII)化合物和式(XIII)化合物反应：
在本文中：
R1在每次出现时独立地选自由以下项组成的组：氢、甲基和乙基；
R2选自由以下项组成的组：氢、羟基、-OC1-3烷基、-C(＝O)OC1-3烷基、卤代和硝基；
X1和X2在每次出现时独立地选自由以下项组成的组：亚甲基、氧和硫；
m是1至6的整数；
n是1至10的整数；
q、r、s、t、v独立地是0至4的整数，条件是：
(i)q和r不能同时都是0；以及
(ii)s、t和v不能同时都是0；
Z是寡核苷酸部分；
并且在适当情况下进行配体的脱保护和/或寡核苷酸部分的第二链的退火。
69.根据句子68所述的方法，其中通过使式(XIV)化合物和式(XV)化合物反应来制备式(XII)化合物：
R1在每次出现时独立地选自由以下项组成的组：氢、甲基和乙基；
R2选自由以下项组成的组：氢、羟基、-OC1-3烷基、-C(＝O)OC1-3烷基、卤代和硝基；
X1和X2在每次出现时独立地选自由以下项组成的组：亚甲基、氧和硫；
q、r、s、t、v独立地是0至4的整数，条件是：
(i)q和r不能同时都是0；以及
(ii)s、t和v不能同时都是0；
Z是寡核苷酸部分。
70.根据句子68所述的方法，其用于制备根据句子20、25、27、29、54、56中任一项所述的化合物和/或根据句子30、31、57、58中任一项所述的组合物，其中：
式(XII)化合物是式(XIIa)：
且式(XIII)化合物是式(XIIIa)：
其中寡核苷酸包含RNA双链体，该RNA双链体包含第一链和第二链，其中第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中第一链和第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的5'端与相邻的磷酸附接。
71.根据句子68所述的方法，其用于制备根据句子20、25、28、29、55、56中任一项所述的化合物和/或根据句子30、31、57、58中任一项所述的组合物，其中：
式(XII)化合物是式(XIIb)：
且式(XIII)化合物是式(XIIIa)：
其中寡核苷酸包含RNA双链体，该RNA双链体包含第一链和第二链，其中第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中第一链和第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的5'端与相邻的磷酸附接。
72.根据句子68所述的方法，其用于制备根据句子21、26、32、34、59、61中任一项所述的化合物和/或根据句子35、36、62、63中任一项所述的组合物，其中：
式(XII)化合物是式(XIIc)：
且式(XIII)化合物是式(XIIIa)：
其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的所述3'端与相邻的磷酸附接。
73.根据句子68所述的方法，其用于制备根据句子21、26、33、34、60、61中任一项所述的化合物和/或根据句子35、36、62、63中任一项所述的组合物，其中：
式(XII)化合物是式(XIId)：
且式(XIII)化合物是式(XIIIa)：
其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的所述3'端与相邻的磷酸附接。
74.根据句子70至73中任一项所述的方法，其中：
式(XIIIa)化合物是式(XIIIb)：
75.根据句子69所述的方法，其从属于句子70至73，其中：
式(XIV)化合物是式(XIVa)或式(XIVb)：
且式(XV)化合物是式(XVa)或式(XIVb)：
其中寡核苷酸包含RNA双链体，该RNA双链体包含第一链和第二链，其中第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中第一链和第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中(i)在式(XVa)中，所述RNA双链体在其第二链的5'端与相邻的磷酸附接，或(ii)在式(XVb)中，所述RNA双链体在其第二链的3'端与相邻的磷酸附接。
76.一种式(XII)化合物：
其中：
R1在每次出现时独立地选自由以下项组成的组：氢、甲基和乙基；
R2选自由以下项组成的组：氢、羟基、-OC1-3烷基、-C(＝O)OC1-3烷基、卤代和硝基；
X1和X2在每次出现时独立地选自由以下项组成的组：亚甲基、氧和硫；
q、r、s、t、v独立地是0至4的整数，条件是：
(i)q和r不能同时都是0；以及
(ii)s、t和v不能同时都是0；
Z是寡核苷酸部分。
77.一种式(XIIa)化合物：
78.一种式(XIIb)化合物：
79.一种式(XIIc)化合物：
80.一种式(XIId)化合物：
81.一种式(XIII)化合物：
其中：
R1在每次出现时独立地选自由以下项组成的组：氢、甲基和乙基；
m是1至6的整数；
n是1至10的整数。
82.一种式(XIIIa)化合物：
83.一种式(XIIIb)化合物：
84.一种式(XIV)化合物：
其中：
R1选自由以下项组成的组：氢、甲基和乙基；
R2选自由以下项组成的组：氢、羟基、-OC1-3烷基、-C(＝O)OC1-3烷基、卤代和硝基；
X2选自由以下项组成的组：亚甲基、氧和硫；
s、t、v独立地是0至4的整数，条件是s、t和v不能同时都是0。
85.一种式(XIVa)化合物：
86.一种式(XIVb)化合物：
87.一种式(XV)化合物：
其中：
R1在每次出现时独立地选自由以下项组成的组：氢、甲基和乙基；
X1选自由以下项组成的组：亚甲基、氧和硫；
q和r独立地是0至4的整数，条件是q和r不能同时都是0；
Z是寡核苷酸部分。
88.一种式(XVa)化合物：
89.一种式(XVb)化合物：
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90.根据句子76、81至84、87中任一项所述的化合物用于制备根据句子1至29、32至34、37至56、59至61和64至67中任一项所述的化合物和/或根据句子30、31、35、36、57、58、62和63中任一项所述的组合物的用途。
91.根据句子85所述的化合物用于制备根据句子1至29、32至34、37至56、59至61和64至67中任一项所述的化合物和/或根据句子30、31、35、36、57、58、62和63中任一项所述的组合物的用途，其中R2＝F。
92.根据句子86所述的化合物用于制备根据句子1至29、32至34、37至56、59至61和64至67中任一项所述的化合物和/或根据句子30、31、35、36、57、58、62和63中任一项所述的组合物的用途，其中R2＝OH。
93.根据句子77所述的化合物用于制备根据句子20、25、27、29、54、56中任一项所述的化合物和/或根据句子30、31、57、58中任一项所述的组合物的用途。
94.根据句子78所述的化合物用于制备根据句子20、25、28、29、55、56中任一项所述的化合物和/或根据句子30、31、57、58中任一项所述的组合物的用途。
95.根据句子79所述的化合物用于制备根据句子21、26、32、34、59、61中任一项所述的化合物和/或根据句子35、36、62、63中任一项所述的组合物的用途。
96.根据句子80所述的化合物用于制备根据句子21、26、33、34、60、61中任一项所述的化合物和/或根据句子35、36、62、63中任一项所述的组合物的用途。
97.根据句子88所述的化合物用于制备根据句子20、25、27至29、54至56中任一项所述的化合物和/或根据句子30、31、57、58中任一项所述的组合物的用途。
98.根据句子89所述的化合物用于制备根据句子21、26、32至34、59至61中任一项所述的化合物和/或根据句子35、36、62、63中任一项所述的组合物的用途。
99.一种化合物或组合物，其通过根据句子68至75中任一项所述的方法获得或可获得。
100.一种药物组合物，其包含根据句子1至29、32至34、37至56、59至61和64至67中任一项所述的化合物和/或根据句子30、31、35、36、57、58、62和63中任一项所述的组合物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
101.根据句子1至29、32至34、37至56、59至61和64至67中任一项所述的化合物和/或根据句子30、31、35、36、57、58、62和63中任一项所述的组合物，其用于治疗。
在另一个方面，本发明可以应用于以下编号为1-56的条款的化合物、方法、组合物或用途(其中提及条款中的任何式仅指在条款1-56内定义的那些式。这些式在图44中再现)。
1.一种化合物，其包含以下结构：
其中：
r和s独立地是选自1至16的整数；并且
Z是寡核苷酸部分。
2.根据条款1所述的化合物，其中s是选自4至12的整数。
3.根据条款2所述的化合物，其中s是6。
4.根据条款1至3中任一项所述的化合物，其中r是选自4至14的整数。
5.根据条款4所述的化合物，其中r是6。
6.根据条款4所述的化合物，其中r是12。
7.根据条款5所述的化合物，其从属于条款3。
8.根据条款6所述的化合物，其从属于条款3。
9.根据条款1至8中任一项所述的化合物，其中Z是：
其中：
Z1、Z2、Z3、Z4在每次出现时独立地是氧或硫；并且
P和Z2之间以及P和Z3之间的键中的一个是单键，并且另一个键是双键。
10.根据条款1至9中任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸是能够调节、优选抑制靶基因表达的RNA化合物。
11.根据条款10中任一项所述的化合物，其中所述RNA化合物包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端。
12.根据条款11所述的化合物，其优选还从属于条款3和6，其中所述RNA化合物在其第二链的5'端与相邻的磷酸附接。
13.根据条款11所述的化合物，其优选还从属于条款3和5，其中所述RNA化合物在其第二链的3'端与相邻的磷酸附接。
14.一种式(II)化合物，其优选从属于条款12：
15.一种式(III)化合物，其优选从属于条款13：
16.根据条款1至15中任一项所定义的化合物，其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体进一步包含一个或多个在2'位置被修饰的核糖，优选多个在2'位置被修饰的核糖。
17.根据条款16所述的化合物，其中修饰选自2'-O-甲基、2'-脱氧-氟和2'-脱氧。
18.根据条款1至17中任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸进一步包含在一个或多个端处的一个或多个降解保护部分。
19.根据条款18所述的化合物，其中所述一个或多个降解保护部分不存在于寡核苷酸链的携带接头/配体部分的端处，且/或其中所述一个或多个降解保护部分选自硫代磷酸核苷酸间键、二硫代磷酸核苷酸间键和反向无碱基核苷酸，其中所述反向无碱基核苷酸存在于相同链的相对于携带接头/配体部分的所述端的远端处。
20.根据条款1至19中任一项所述的化合物，其中如条款1中式(I)所描绘的所述配体部分包含一个或多个配体。
21.根据条款20所述的化合物，其中如条款1中式(I)所描绘的所述配体部分包含一个或多个碳水化合物配体。
22.根据条款21所述的化合物，其中所述一个或多个碳水化合物可以是单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖。
23.根据条款22所述的化合物，其中所述一个或多个碳水化合物包含一个或多个半乳糖部分、一个或多个乳糖部分、一个或多个N-乙酰半乳糖胺部分和/或一个或多个甘露糖部分。
24.根据条款23所述的化合物，其中所述一个或多个碳水化合物包含一个或多个N-乙酰基-半乳糖胺部分。
25.根据条款24所述的化合物，其包含两个或三个N-乙酰半乳糖胺部分。
26.根据前述条款中任一项所述的化合物，其中所述一个或多个配体以线性构型或分支构型附接。
27.根据条款26所述的化合物，其中所述一个或多个配体以双触角或三触角分支构型附接。
28.根据条款20至27所述的化合物，其中如条款1中式(I)所描绘的所述部分：
是式(IV)、(V)或(VI)中的任一个，优选式(IV)：
其中：
AI是氢或合适的羟基保护基团；
a是2或3的整数；并且
b是2至5的整数；或者
其中：
AI是氢或合适的羟基保护基团；
a是2或3的整数；并且
c和d独立地是1至6的整数；或者
其中：
AI是氢或合适的羟基保护基团；
a是2或3的整数；并且
e是2至10的整数。
29.根据条款1至28中任一项所述的化合物，其中如条款1中式(I)所描绘的所述部分：
是式(VII)：
其中：
AI是氢；
a是2或3的整数。
30.根据条款28或29所述的化合物，其中a＝2。
31.根据条款28或29所述的化合物，其中a＝3。
32.根据条款28所述的化合物，其中b＝3。
33.一种式(VIII)化合物：
34.一种式(IX)化合物：
35.根据条款33或34所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体进一步包含一个或多个在2'位置被修饰的核糖，优选多个在2'位置被修饰的核糖。
36.根据条款35所述的化合物，其中修饰选自2'-O-甲基、2'-脱氧-氟和2'-脱氧。
37.根据条款33至36中任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸进一步包含在一个或多个端处的一个或多个降解保护部分。
38.根据条款37所述的化合物，其中所述一个或多个降解保护部分不存在于寡核苷酸链的携带接头/配体部分的端处，且/或其中所述一个或多个降解保护部分选自硫代磷酸核苷酸间键、二硫代磷酸核苷酸间键和反向无碱基核苷酸，其中所述反向无碱基核苷酸存在于相同链的相对于携带接头/配体部分的所述端的远端处。
39.根据条款33所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的5'端与相邻的磷酸附接。
40.根据条款34所述的化合物，其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的3'端与相邻的磷酸附接。
41.一种制备根据条款1至40中任一项所述的化合物的方法，其包括使式(X)化合物和式(XI)化合物反应：
/>
其中：
r和s独立地是选自1至16的整数；并且
Z是寡核苷酸部分；
并且在适当情况下进行配体的脱保护和/或寡核苷酸的第二链的退火。
42.根据条款41所述的方法，其用于制备根据条款6、8至14、16至33和35至40中任一项所述的化合物，其中：
式(X)的化合物是式(Xa)：
且式(XI)的化合物是式(XIa)：
其中寡核苷酸包含RNA双链体，该RNA双链体包含第一链和第二链，其中第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中第一链和第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的5'端与相邻的磷酸附接。
43.根据条款41所述的方法，其用于制备根据条款5、7、9至13、15至32和34至40中任一项所述的化合物，其中：
式(X)的化合物是式(Xb)：
且式(XI)的化合物是式(XIa)：
其中所述寡核苷酸包含RNA双链体，所述RNA双链体包含第一链和第二链，其中所述第一链与靶基因的RNA序列至少部分地互补，并且所述第二链与所述第一链至少部分地互补，并且其中所述第一链和所述第二链中的每一个都具有5'端和3'端，并且其中所述RNA双链体在其第二链的所述3'端与相邻的磷酸附接。
44.根据条款42或43所述的方法，其中：
式(XIa)的化合物是式(XIb)：
45.一种式(X)化合物：
其中：
r独立地是选自1至16的整数；并且
Z是寡核苷酸部分。
46.一种式(Xa)化合物：
47.一种式(Xb)化合物：
48.一种式(XI)化合物：
其中：
s独立地是选自1至16的整数；并且
Z是寡核苷酸部分。
49.一种式(XIa)的化合物：
50.一种式(XIb)化合物：
51.根据条款45和48至50中任一项所述的化合物用于制备根据条款1至40中任一项所述的化合物的用途。
52.根据条款46所述的化合物用于制备根据条款6、8至14、16至33和35至40中任一项所述的化合物的用途。
53.根据条款47所述的化合物用于制备根据条款5、7、9至13、15至32和34至40中任一项所述的化合物的用途。
54.一种化合物或组合，其通过根据条款41至44中任一项所述的方法获得或可获得。
55.一种药物组合物，其包含根据条款1至40中任一项所述的化合物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
56.根据条款1至40中任一项所述的化合物，其用于治疗。
实例
通过参考以下实例将更全面地理解本发明。然而，它们不应被解释为限制本发明的范围。应当理解，本文描述的实例和实施例仅用于说明目的，并且根据其的各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和界限内以及所附条款的范围内。
实例中使用以下构建体：
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实例1
-发明内容
合成并QC靶向hsHAO1、hsC5或hsTTR mRNA的GalNAc-siRNA。整个siRNA集(靶向HAO1的siRNA除外)首先通过使用RNAiMAX进行的转染在HepG2细胞中在剂量响应设置下进行研究，然后在原代人肝细胞中在裸式自由摄取设置下在剂量响应分析中进行研究。
将原代人肝细胞与靶向hsHAO1、hsC5或hsTTR mRNA的GalNAc-siRNA直接一起孵育导致不同程度的剂量依赖性在靶mRNA沉默。
研究目的
该实验集的目的是分析不同GalNAc配体在靶向三种不同在靶(即hsHAO1、hsC5或hsTTR mRNA)的siRNA背景下的体外活性。
这项研究的工作包包括(i)测定开发以设计、合成和测试对每一个单独的目标在靶具有特异性的bDNA探针集，(ii)鉴定适合后续筛选实验的细胞系，(iii)一种或多种人癌细胞系中可能的所有siRNA(通过转染)的剂量响应分析，以及(iv)在裸式自由摄取环境下在原代人肝细胞中siRNA的剂量响应分析。在这两种环境下，应计算IC50值和最大抑制值，然后根据其效力对siRNA研究集进行排名。
材料和方法
寡核苷酸合成
标准固相合成方法用于化学合成目标siRNA(见表1)以及对照(见表2)。
细胞培养和体外转染实验
细胞培养、转染和QuantiGene2.0分支DNA测定如下所述，并且siRNA序列列于表1和表2。HepG2细胞由美国组织培养物保藏中心(ATCC)提供(HB-8065，批号：63176294)并在ATCC配制的补充含有10％胎牛血清(FCS)的Eagle最低基础培养基中培养。原代人肝细胞(PHH)来源于Primacyt(德国什未林)(批号：CyHuf19009HEc)。细胞是通过外植体技术从恶性胶质母细胞瘤肿瘤获得。本研究中使用的所有细胞均于37℃在含5％ CO2的大气中在加湿培养箱中培养。
为了用靶向hsC5或hsTTR的siRNA(和对照)转染HepG2细胞，将细胞以20.000个细胞/孔的密度接种在常规96孔组织培养板中。根据制造商的说明，使用市售转染试剂RNAiMAX(Invitrogen/Life Technologies)利用siRNA转染细胞。在HepG2细胞中进行20个候选物的10点剂量响应实验(11x hsC5、9x hsTTR)，siRNA终浓度分别为24nM、6nM、1.5nM、0.4nM、0.1nM、0.03nM、0.008nM、0.002nM、0.0005nM和0.0001nM。
PHH中的剂量响应分析通过在裸式自由摄取环境中直接孵育细胞来进行，从1.5μM最高siRNA终浓度开始，然后是500nM，此后以两倍稀释步骤连续下降。
将对照孔转染到HepG2细胞中或直接与原代人肝细胞在相应板上研究的最高测试siRNA浓度下一起孵育。表2总结并列出了细胞模拟处理后不同项目阶段中包括的所有对照siRNA。对于每个siRNA和对照，至少四个孔被平行转染/直接孵育，并从每个孔收集单独的数据点。
转染后与siRNA一起孵育24小时后，去除培养基并在裂解混合物(1体积裂解缓冲液加2体积无核酸酶的水)中裂解HepG2细胞，然后在53℃下孵育至少45分钟。在PHH的情况下，在细胞处理后5小时去除铺板培养基，然后每孔添加50μl完全维持培养基。以这种方式每24小时更换一次培养基，直至72小时的总孵育期。在4小时或72小时的时间点，去除细胞培养上清液，然后添加200μl补充有1:1000v/v蛋白酶K的裂解混合物。
根据制造商的说明进行分支DNA(bDNA)测定。在存在底物的情况下在黑暗中孵育30分钟后，使用1420发光计数器(WALLAC VICTOR Light,Perkin Elmer,Rodgau-Jügesheim,德国)读取发光。对于每个孔，将在靶mRNA水平标准化为hsGAPDH mRNA水平。任一siRNA的活性表示为处理细胞中的在靶mRNA浓度(标准化为hsGAPDH mRNA)相对于对照孔中的平均在靶mRNA浓度(标准化为hsGAPDH mRNA)的百分比。
测定开发
QuantiGene2.0分支DNA(bDNA)探针集是特别针对智人GAPDH、AHSA1、hsHAO1、hsC5和hsTTR设计和合成的。bDNA探针集最初根据制造商的说明通过bDNA分析进行测试，评估了两种不同裂解物量(即10μl和50μl)的紧邻原代人肝细胞的以下人和猴癌细胞系中的目标mRNA水平：SJSA-1、TF1、NCI-H1650、Y-79、Kasumi-1、EAhy926、Caki-1、Colo205、RPTEC、A253、HeLaS3、Hep3B、BxPC3、DU145、THP-1、NCI-H460、IGR37、LS174T、Be(2)-C、SW 1573、NCI-H358、TC71、22Rv1、BT474、HeLa、KBwt、Panc-1、U87MG、A172、C42、HepG2、LNCaP、PC3、SupT11、A549、HCT116、HuH7、MCF7、SH-SY5Y、HUVEC、C33A、HEK293、HT29、MOLM 13和SK-MEL-2。仅含bDNA探针集而不添加细胞裂解物的孔用于监测技术背景和噪声信号。
结果
鉴定适合筛选GalNAc-siRNa的细胞类型
图1至图3显示了三种目标在靶(即hsC5、hsHAO1和hsTTR)在人癌细胞系加原代人肝细胞的一个多样化集的裂解物中的mRNA表达数据。测试的每个细胞系的细胞数/裂解物体积相同，这是允许比较不同细胞类型之间的表达水平所必需的。图1显示了测试的所有细胞类型的hsC5 mRNA表达数据。
还筛选表达hsHAO1 mRNA的相同细胞类型，结果显示在作为图2一部分的条形图中。
最后，鉴定了合适的细胞类型，该细胞类型将允许筛选靶向hsTTR的GalNAc-siRNA，相应数据是图3的一部分。
总之，所有三个目标在靶的mRNA表达水平在原代人肝细胞(PHH)中都足够高。此外，HepG2细胞可以用于筛选靶向hsC5和hsTTR mRNA的GalNAc-siRNA，相比之下，无法鉴定出适合测试对hsHAO1 mRNA具有特异性的siRNA的癌细胞系。
HepG2细胞中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
转染优化后，使用RNAiMAX在剂量响应设置下，用靶向hsTTR的整个GalNAc-siRNA集(见表1)转染HepG2细胞。最高siRNA测试终浓度为24nM，以九个四倍稀释步骤下降。实验在HepG2细胞转染后4小时和24小时结束。表3列出了所有研究的靶向hsTTR的GalNAC-siRNA的活性数据。
表3：HepG2细胞中靶向hsTTR的siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表按照外部ID排序，孵育4小时在上，并且孵育24小时在下。
24小时孵育的结果也显示在图4A-B中
通常，用靶向hsTTR的siRNA转染HepG2细胞会导致在靶mRNA沉默，通常跨越从0％沉默到最大抑制的整个活性范围。与仅在转染后4小时生成的数据相比，转染后24小时生成的数据更稳健，标准偏差更低。此外，在靶敲低的程度通常会随着时间的推移(从孵育4小时直至24小时)而增加。已鉴定出使在靶mRNA沉默>95％的hsTTR GalNAc-siRNA，IC50值在低两位数pM范围内。
HepG2细胞中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
第二个目标靶标hsC5 mRNA通过使用RNAiMAX转染HepG2细胞在相同的剂量响应设置(无论如何，siRNA测试终浓度差异最小)下进行测试，其中GalNAc-siRNA与hsTTRsiRNA具有相同的停留/位置/GalNAc-配体变异，但序列对在靶hsC5 mRNA具有特异性。
表4：HepG2细胞中靶向hsC5的siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表按照外部ID排序，孵育4小时在上，并且孵育24小时在下。
24小时孵育的结果也显示在图5A-B中
在用对hsC5具有特异性的GalNAc-siRNA集转染HepG2细胞后，存在剂量依赖性的在靶hsC5 mRNA沉默。在细胞转染后4小时已经可以检测到一些敲低，在更长的孵育期(即24小时)后观察到甚至更高的在靶沉默。已鉴定出使在靶mRNA沉默将近90％的hsC5GalNAc-siRNA，IC50值在低个位数pM范围内。
鉴定适合测试所有GalNAc-siRNA的原代人肝细胞批次
人癌细胞系HepG2中两个GalNAc-siRNA集的剂量响应分析应证明(并确保)所有新的GalNAc-/接头/位置/帽变体确实是有效结合AGO2并加载到RISC中的底物，并且另外能够在RNAi介导的靶mRNA切割中发挥作用。然而，为了测试靶向GalNAc配体衍生物是否允许有效摄取到肝细胞中，应通过裸式自由摄取设置在原代人肝细胞中进行剂量响应分析实验。肝细胞确实以高水平专门表达去唾液酸糖蛋白受体(ASGR1)，并且肝脏通常使用该受体从循环中去除靶糖蛋白。现在众所周知，某些类型的与GalNAc配体缀合的寡核苷酸(例如siRNA或ASO)被这种高周转受体识别，并经由网格蛋白包被的囊泡有效地摄取到细胞质中并运输到内体隔室中。内体逃逸被认为是寡核苷酸递送的限速步骤。
进行中间体测定开发实验，其中测试了不同批次的原代人肝细胞的相关目标基因(即hsC5、hsTTR、hsHAO1、hsGAPDH和hsAHSA1)的表达水平。Primacyt(德国什未林)提供了三瓶不同的原代人肝细胞批次用于测试，即BHuf16087、CHF2101和CyHuf19009。将细胞接种在涂有胶原蛋白的96孔组织培养板上，随后将细胞孵育0小时、24小时、48小时和72小时，然后进行细胞裂解和bDNA分析以监测目标mRNA水平。图6显示了原代人肝细胞批次BHuf16087、CHF2101和CyHuf19009中所有三个目标在靶(hsTTR、hsC5和hsHAO1)的绝对mRNA表达数据。hsGAPDH和hsAHSA1的mRNA表达水平如图7所示。
在图6和图7中，每个数据集三元组的左侧列是BHuf16087，中间列是CHF2101，并且右侧列是CyHuf19009。
总体而言，原代人肝细胞批次BHuf16087和CyHuf19009中所有三个目标在靶的mRNA表达在72小时后都足够高以继续进行bDNA测定。由于可用于进一步实验的小瓶总量，我们继续使用批次CyHuf19009进行实验。
PHH中靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
在鉴定出合适的原代人肝细胞(PHH)批次(CyHuf19009)后，对表1中所列的靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA进行裸式自由摄取分析。测试的最高siRNA终浓度为1.5μM，然后是500nM，以八个两倍连续稀释步骤下降至1.95nM的最低siRNA终浓度。实验在PHH细胞直接孵育后4小时和72小时结束。表5列出了所有研究的靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的活性数据。表2总结并列出了本实验中包括的所有对照siRNA。
表5：原代人肝细胞(PHH)中靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表根据外部ID组织，4小时孵育和72小时孵育分别列于上部和下部。
72小时孵育的结果也显示在图8A-B中。
靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的裸式自由摄取不会在4小时内导致显著的在靶沉默，但是在72小时孵育后，在35.5％至58.1％的最大抑制范围内可见在靶沉默。
PHH中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
第二个目标靶标hsC5 mRNA在相同的剂量响应设置下通过裸式自由摄取在PHH中进行测试，GalNAc-siRNA与之前在测定中测试的hsTTR和hsHAO1具有相同的接头/位置/GalNAc-配体变异，除了对在靶hsC5 mRNA具有特异性的序列以外。靶向hsC5的GalNAc-siRNA的序列以及有关对照siRNA的所有序列和信息分别列于表1和表2中。实验在PHH直接孵育4小时和72小时后结束。表6列出了所有研究的靶向hsC5的GalNAc-siRNA的活性数据。
表6：PHH中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表根据外部ID组织，4小时孵育和72小时孵育分别列于上部和下部。
72小时孵育的结果也显示在图9A-B中。
孵育4小时后，未见到显著的GalNAc-siRNA的在靶沉默。在72小时的孵育期后生成的数据显示高达65.5％最大抑制的更稳健的在靶沉默。
PHH中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
最后一个目标靶标hsTTR mRNA再次以裸式自由摄取在PHH中以与靶标hsHAO1和hsC5相同的剂量响应设置进行测试，唯一的区别是使用在靶hsTTR mRNA的特异性siRNA序列(见表1)。
实验在PHH直接孵育72小时后结束。表7列出了所有研究的靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的活性数据。
表7：原代人肝细胞(PHH)中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表根据外部ID组织。
结果也在图10A-B中示出。
靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的裸式自由摄取确实在72小时内导致显著的在靶沉默，范围在46％至82.5％最大抑制之间。hsTTR GalNAc-siRNA被鉴定为使在靶mRNA沉默，其中IC50值在低两位数nM范围内。
-总结和讨论
本研究的范围是分析根据本发明的GalNAc配体在用于靶向三种不同的在靶(即hsHAO1、hsC5和hsTTR mRNA)的siRNA背景下的体外活性。对每个靶标具有特异性的siRNA集由具有不同接头/帽/修饰/GalNAc配体化学的siRNA(各自具有两个不同的反义链)组成。
对于所有靶标，表1中的GalNAc-siRNA被鉴定为显示出高总体效力和低IC50值。
1.1实例2
合成路线
i)缀合结构单元TriGalNAc的合成
薄层色谱法(TLC)在涂有二氧化硅的铝板上进行，254nm荧光指示剂来自Macherey-Nagel。在紫外光(254nm)下或用在甲醇(MeOH)中的5％ H2SO4或根据Stahl的茚三酮试剂(来自Sigma-Aldrich)喷洒后观察化合物，然后加热。使用配备有双可变UV波长检测器(200nm-400nm)的Biotage Isolera One快速色谱法仪器使用Biotage 二氧化硅10g、25g、50g或100g柱(瑞典乌普萨拉)进行快速色谱法。
所有对水分敏感的反应均在无水条件下使用干燥玻璃器皿、无水溶剂和氩气氛进行。所有市售试剂均购自Sigma-Aldrich，并且溶剂购自Carl Roth GmbH+Co.KG。D-半乳糖胺五乙酸酯购自AK scientific。
HPLC/ESI-MS在Dionex UltiMate 3000RS UHPLC系统和Thermo Scientific MSQPlus质谱仪上使用Waters的Acquity UPLC Protein BEH C4柱(1.7μm，2.1x 100mm)在60℃下进行。溶剂系统由溶剂A(含0.1％甲酸的H2O)和溶剂B(含0.1％甲酸的乙腈(ACN))组成。采用15分钟内5％-100％ B的梯度，流速为0.4mL/min。探测器和条件：Corona超荷电气溶胶检测(来自esa)。雾化器温度：25℃。N2压力：35.1psi。过滤器：Corona。
1H和13C NMR谱在室温下在Varian光谱仪上在500MHz(1H NMR)和125MHz(13C NMR)下记录。化学位移以ppm给出，参考溶剂残留峰(CDCl3–1H NMR：δ在7.26ppm和13C NMRδ在77.2ppm；DMSO-d6–1H NMR：δ在2.50ppm和13C NMRδ在39.5ppm)。耦合常数以赫兹给出。信号分裂模式被描述为单峰(s)、二重峰(d)、三重峰(t)或多重峰(m)。
ii)缀合结构单元TriGalNAc的合成路线
化合物2的制备：在氩气下将D-半乳糖胺五乙酸酯(3.00g,7.71mmol,1.0eq.)溶解在无水二氯甲烷(DCM)(30mL)中，并添加三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf,4.28g,19.27mmol,2.5eq.)。将反应在室温下搅拌3小时。将反应混合物用DCM(50mL)稀释并用冷饱和NaHCO3水溶液(100mL)和水(100mL)洗涤。将有机层分离，经Na2SO4干燥并浓缩，得到呈黄色油状物的标题化合物，将其通过快速色谱法(梯度洗脱：0-10％ MeOH于DCM中，10CV)纯化。获得呈无色油状物的产物(2.5g,98％,rf＝0.45(2％ MeOH于DCM中))。
化合物4的制备：在氩气下，将化合物2(2.30g,6.98mmol,1.0eq.)和叠氮基-PEG3-OH(1.83g,10.5mmol,1.5eq.)溶解在无水DCM(40mL)中，并将分子筛(5g)添加到溶液中。将混合物在室温搅拌1小时。然后将TMSOTf(0.77g,3.49mmol,0.5eq.)添加到混合物中并将反应搅拌过夜。过滤分子筛，将滤液用DCM(100mL)稀释并用冷饱和NaHCO3水溶液(100mL)和水(100mL)洗涤。将有机层分离，经Na2SO4干燥，并在减压下去除溶剂。粗物质通过快速色谱法(梯度洗脱：0-3％ MeOH于DCM中，10CV)纯化，得到呈浅黄色油状物的标题产物(3.10g,88％,rf＝0.25(2％ MeOH于DCM中))。MS：C20H32N4O11的计算值为504.21。实测值为505.4。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ6.21-6.14(m,1H),5.30(dd,J＝3.4,1.1Hz,1H),5.04(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.76(d,J＝8.6Hz,1H),4.23-4.08(m,3H),3.91-3.80(m,3H),3.74-3.59(m,9H),3.49-3.41(m,2H),2.14(s,3H),2.02(s,3H),1.97(d,J＝4.2Hz,6H)。13C NMR(125MHz,CDCl3)δ170.6(C),170.5(C),170.4(C),170.3(C),102.1(CH),71.6(CH),70.8(CH),70.6(CH),70.5(CH),70.3(CH2),69.7(CH2),68.5(CH2),66.6(CH2),61.5(CH2),23.1(CH3),20.7(3xCH3)。
化合物5的制备：将化合物4(1.00g,1.98mmol,1.0eq.)溶解在乙酸乙酯(EtOAc)和MeOH的混合物(30mL 1:1 v/v)中，并添加Pd/C(100mg)。使用真空/氩气循环(3x)将反应混合物脱气并在气球压力下氢化过夜。将反应混合物通过硅藻土过滤并用EtOAc(30mL)洗涤。在减压下除去溶剂，得到呈无色油状物的标题化合物(0.95g，定量产率，rf＝0.25(10％MeOH于DCM中))。该化合物不经进一步纯化即可用。MS：C20H34N2O11的计算值为478.2。实测值为479.4。
化合物7的制备：将三{[2-(叔丁氧基羰基)乙氧基]甲基}-甲胺6(3.37g,6.67mmol,1.0eq.)溶解在DCM/水的混合物(40mL 1:1 v/v)中，并在剧烈搅拌的同时添加Na2CO3(0.18g,1.7mmol,0.25eq.)。将氯甲酸苄酯(2.94mL,20.7mmol,3.10eq.)滴加到先前的混合物中并将反应在室温下搅拌24小时。将反应混合物用CH2Cl2(100mL)稀释并用水(100mL)洗涤。将有机层分离并经Na2SO4干燥。在减压下除去溶剂，并且所得粗物质通过快速色谱法(梯度洗脱：0-10％ EtOAc于环己烷中，12CV)纯化，得到呈淡黄色油状物的标题化合物(3.9g，91％，rf＝0.56(10％ EtOAc于环己烷中))。MS：C33H53NO11的计算值为639.3。实测值为640.9。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.38-7.26(m,5H),4.97(s,2H),3.54(t,6H),3.50(s,6H),2.38(t,6H),1.39(s,27H)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ170.3(3xC),154.5(C),137.1(C),128.2(2xCH),127.7(CH),127.6(2xCH),79.7(3xC),68.4(3xCH2),66.8(3xCH2),64.9(C),58.7(CH2),35.8(3xCH2),27.7(9xCH3)。
化合物8的制备：在氩气下将Cbz-NH-三-Boc-酯7(0.20g,0.39mmol,1.0eq.)溶解在CH2Cl2(1mL)中，添加三氟乙酸(TFA,1mL)并将反应在室温下搅拌1小时。在减压下除去溶剂，将残余物与甲苯(5mL)共蒸发3次并在高真空下干燥以得到作为其TFA盐的化合物(0.183g,98％)。该化合物不经进一步纯化即可用。MS：C21H29NO11的计算值为471.6。实测值为472.4。
化合物9的制备：将CbzNH-三-COOH 8(0.72g,1.49mmol,1.0eq.)和GalNAc-PEG3-NH25(3.56g,7.44mmol,5.0eq.)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(25mL)中。然后将N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)(2.78g,7.44mmol,5.0eq.)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)(1.05g,7.44mmol,5.0eq.)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(2.07mL,11.9mmol,8.0eq.)添加到溶液中并将反应搅拌72小时。在减压下除去溶剂，将残余物溶解在DCM(100mL)中并用饱和NaHCO3水溶液(100mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，蒸发溶剂，并将粗物质通过快速色谱法(梯度洗脱：0-5％ MeOH于DCM中，14CV)纯化。获得呈淡黄色油状物的产物(1.2g,43％,rf＝0.20(5％ MeOH于DCM中))。MS：C81H125N7O41的计算值为1852.9。实测值为1854.7。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.90-7.80(m,10H),7.65-7.62(m,4H),7.47-7.43(m,3H),7.38-7.32(m,8H),5.24-5.22(m,3H),5.02-4.97(m,4H),4.60-4.57(m,3H),4.07-3.90(m 10H),3.67-3.36(m,70H),3.23-3.07(m,25H),2.18(s,10H),2.00(s,13H),1.89(s,11H),1.80-1.78(m,17H)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ170.1(C),169.8(C),169.7(C),169.4(C),169.2(C),169.1(C),142.7(C),126.3(CH),123.9(CH),118.7(CH),109.7(CH),100.8(CH),70.5(CH),69.8(CH),69.6(CH),69.5(CH),69.3(CH2),69.0(CH2),68.2(CH2),67.2(CH2),66.7(CH2),61.4(CH2),22.6(CH2),22.4(3xCH3),20.7(9xCH3)。
化合物10的制备：将三触角GalNAc化合物9(0.27g,0.14mmol,1.0eq.)溶解在MeOH(15mL)中，添加3滴乙酸(AcOH)和Pd/C(30mg)。使用真空/氩气循环(3x)将反应混合物脱气并在气球压力下氢化过夜。反应完成后是质谱法，并且将所得混合物通过硅藻土薄垫过滤。蒸发溶剂并将获得的残余物在高真空下干燥并用于下一步骤而不经进一步纯化。获得呈淡黄色油状物的产物(0.24g，定量产率)。MS：C73H119N7O39的计算值为1718.8。实测值为1719.3。
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化合物11的制备：将市售辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(3.67g,9.9mmol,1.0eq.)溶解在DMF(5mL)中并添加三乙胺(1.2mL)。向该溶液中滴加3-叠氮基-1-丙胺(1.0g,9.9mmol,1.0eq.)在DMF(5mL)中的溶液。将反应在室温搅拌3小时。将反应混合物用EtOAc(100mL)稀释，并且用水(50mL)洗涤。将有机层分离，经Na2SO4干燥，并在减压下去除溶剂。粗物质通过快速色谱法(梯度洗脱：0-5％ MeOH于DCM中，16CV)纯化。获得呈白色固体的产物(1.54g，43％，rf＝0.71(5％ MeOH于DCM中))。MS：C15H23N5O5的计算值为353.4。实测值为354.3。
TriGalNAc(12)的制备：在氩气下将三触角GalNAc化合物10(0.35g,0.24mmol,1.0eq.)和化合物11(0.11g,0.31mmol,1.5eq.)溶解在DCM(5mL)中，并添加三乙胺(0.1mL,0.61mmol,3.0eq.)。将反应在室温下搅拌过夜。在减压下除去溶剂后，将残余物溶解在EtOAc(100mL)中并用水(100mL)洗涤。将有机层分离并经Na2SO4干燥。蒸发溶剂并将所得粗物质通过快速色谱法(洗脱梯度：0-10％ MeOH于DCM中，20CV)纯化，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(0.27g，67％，rf＝0.5(10％ MeOH于DCM中))。MS：C84H137N11O41的计算值为1957.1。实测值为1959.6。
化合物12用于采用“点击化学”的后续寡核苷酸缀合物制备。
iii)寡核苷酸合成
表8：
Af,Cf,Gf,Uf: 2’-F RNA核苷酸
a、c、g、u： 2’-O-Me RNA核苷酸
dT： DNA核苷酸
s： 硫代磷酸
invabasic： 1,2-二脱氧核糖
NH2-DEG： 氨基乙氧基乙基接头
NH2C12： 氨基十二烷基接头
NH2C6： 氨基己基接头
根据亚磷酰胺方法在固相上合成寡核苷酸。根据规模，使用Mermade 12(BioAutomation Corporation)或Oligopilot(GE Healthcare)。
合成在由可控孔隙玻璃制成的市售固体支持物上进行，该支持物装载有invabasic(CPG，载量为86μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-1047-B)或2’-F A(CPG，/>载量为90μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-1039-B)或NH2C6(CPG，/>载量为85μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-1397-B)或GalNAc(CPG，/>载量为57μmol/g；Primetech)或2’-O-甲基C(CPG，/>载量为84μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-10-B)或2’-O-甲基A(CPG，/>载量为85μmol/g，LGC Biosearch目录号BCG-1029-B)或dT(CPG，载量为87μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-1055-B)。
2’-O-Me、2’-F RNA亚磷酰胺和辅助试剂购自SAFC Proligo(德国汉堡)。
2’-O-甲基亚磷酰胺包括：5’-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-N-苯甲酰基-腺苷2’-O-甲基-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5’-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-N-苯甲酰基-胞苷2’-O-甲基-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5’-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-N-二甲基甲脒-鸟苷2’-O-甲基-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5’-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-尿苷2’-O-甲基-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。
2’-F亚磷酰胺包括：5’-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰基-脱氧腺苷2’-氟-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5’-二甲氧基三苯甲基-N-乙酰基-脱氧胞苷2’-氟-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5’-二甲氧基三苯甲基-N-异丁酰-脱氧鸟苷2’-氟-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺和5’-二甲氧基三苯甲基-脱氧尿苷2’-氟-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。
为了在寡核苷酸的5’-端引入所需的氨基接头，采用2-[2-(4-单甲氧基三苯甲基)氨基乙氧基]乙基-(2-氰基乙基)-N,N-二异丙基)-亚磷酰胺(Glen Research目录号1905)和12-(三氟乙酰基氨基)十二烷基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(ChemGenes目录号CLP-1575)。使用5-O-二甲氧基三苯甲基-1,2-二脱氧核糖-3-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(ChemGenes目录号ANP-1422)引入invabasic修饰。
所有结构单元均溶解在含有分子筛的无水乙腈(100mM(Mermade12)或200mM(/>Oligopilot))中，除了2’-O-甲基-尿苷亚磷酰胺溶解在于无水乙腈中的50％无水DCM中以外。碘(50mM，于吡啶/H2O中，9:1 v/v)用作氧化试剂。5-乙基硫代四唑(ETT，500mM，于乙腈中)用作活化剂溶液。
使用100mM氢化黄原素(TCI目录号6846-35-1，在乙腈/吡啶中，4:6v/v)进行引入硫代磷酸连接的硫醇化。
除非另有说明，否则偶联时间为5.4分钟。采用双偶联步骤将5’氨基修饰掺入序列，每次偶联的偶联时间为11分钟(总偶联时间为22分钟)。氧化剂接触时间设为1.2分钟，并且硫醇化时间为5.2分钟。
序列通过去除最终的DMT基团合成，但NH2DEG序列中的MMT基团除外。
在合成结束时，使用1:1体积的28％-30％氢氧化铵溶液(Sigma-Aldrich，目录号221228)和40％甲胺水溶液(Sigma-Aldrich，目录号8220911000)在6℃下从固体支持物上切割寡核苷酸，持续16小时。然后滤出固体支持物，用H2O彻底洗涤过滤器并通过在减压下蒸发减少合并溶液的体积。用10％ AcOH(Sigma-Aldrich，目录号A6283)将所得溶液的pH调节至pH 7。
粗物质通过反相(RP)HPLC或阴离子交换(AEX)HPLC纯化。
在Pure仪器(GE Healthcare)上使用XBridge C18Prep 19x 50mm柱(Waters)进行RP HPLC纯化。缓冲液A是100mM三乙基乙酸铵(TEAAc,Biosolve)pH 7，并且缓冲液B含有在缓冲液A中的95％乙腈。采用10mL/min的流速和60℃的温度。记录在280nm处的UV迹线。采用120个柱体积内的0％ B至100％ B的梯度。将适当的级分合并并在冰箱中用3M乙酸钠(NaOAc)(Sigma-Aldrich)pH 5.2和85％乙醇(VWR)沉淀。将沉淀通过离心分离，重新溶解在水(50mL)中，用5M NaCl(5mL)处理并在/>Pure仪器上使用填充有Sephadex G25-Fine树脂(GE Healthcare)的50x 165mm ECO柱(YMC，德国丁斯拉肯)通过尺寸排阻HPLC脱盐。
AEX HPLC纯化在Pure仪器(GE Healthcare)上使用TSK凝胶SuperQ-5PW20x200mm(BISCHOFF Chromatography)进行。缓冲液A是20mM磷酸钠(Sigma-Aldrich)pH7.8，并且缓冲液B与缓冲液A相同，但添加了1.4M溴化钠(Sigma-Aldrich)。采用10mL/min的流速和60℃的温度。记录在280nm处的UV迹线。采用27个柱体积内的10％ B至100％B的梯度。将适当的级分合并并在冰箱中用3M NaOAc，pH 5.2和85％乙醇沉淀。将沉淀通过离心分离，重新溶解在水(50mL)中，用5M NaCl(5mL)处理并通过尺寸排阻色谱法脱盐。
MMT基团用25％的乙酸水溶液去除。一旦反应完成，溶液就被中和，并且样品通过尺寸排阻色谱法脱盐。
在结合有LCQ Deca XP-plus Q-ESI-TOF质谱仪(Thermo Finnigan)或CompactESI-Qq-TOF质谱仪(Bruker Daltonics)的Dionex Ultimate 3000(Thermo FisherScientific)HPLC系统上通过分析型LC-MS在2.1x 50mm Xbridge C18柱(Waters)上分析单链。缓冲液A是在H2O中的16.3mM三乙胺、100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)和1％MeOH，并且缓冲液B含有在95％ MeOH中的缓冲液A。采用250μL/min的流速和60℃的温度。记录在260nm和280nm处的UV迹线。采用在0.5分钟内1％-40％ B，然后在13分钟内40％至100％ B的梯度。甲醇(LC-MS级)、水(LC-MS级)、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(超纯级)和三乙胺(超纯级)购自Sigma-Aldrich。
iv)在5'-或3'-端的单氟环辛炔(MFCO)缀合
5'-端MFCO缀合
3'-端MFCO缀合
MFCO缀合的一般条件：将胺修饰的单链以700OD/mL溶解在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH 9.6/二甲基亚砜(DMSO)4:6(v/v)中，并向该溶液中添加一摩尔当量的35mMMFCO-C6-NHS酯(Berry&Associates，目录号LK 4300)的DMF溶液。反应在室温下进行，并在1小时后添加另一摩尔当量的MFCO溶液。使反应再进行一小时，并通过LC/MS监测。需要相对于氨基修饰的寡核苷酸至少二摩尔当量过量的MFCO NHS酯试剂以实现起始材料的定量消耗。反应混合物用水稀释15倍，通过来自Sartorius的1.2μm过滤器过滤，然后在Pure仪器(GE Healthcare)上通过反相(RP HPLC)纯化。
使用来自Waters的XBridge C18 Prep 19x50mm柱进行纯化。缓冲液A是100mMTEAAc pH 7，并且缓冲液B含有在缓冲液A中的95％乙腈。采用10mL/min的流速和60℃的温度。记录在280nm处的UV迹线。采用60个柱体积内的0-100％ B梯度。
将含有全长缀合寡核苷酸的级分合并，在冰箱中用3M NaOAc，pH 5.2和85％乙醇沉淀，并将收集的沉淀溶解在水中。样品通过尺寸排阻色谱法脱盐，并使用speed-vac浓缩仪浓缩，得到缀合的寡核苷酸，分离产率为40％-80％。
表9：
v)在5'-或3'-端的TriGalNAc(GalNAc-T1)缀合
5’-GalNAc-T1缀合物
3’-GalNAc-T1缀合物
TriGalNAc缀合的一般程序：将MFCO修饰的单链以2000OD/mL溶解在水中，并向该溶液中添加一当量的化合物12(10mM)的DMF溶液。反应在室温下进行，并在3小时后添加0.7摩尔当量的化合物12溶液。允许反应过夜进行并通过LCMS监测完成。缀合物在水中稀释15倍，通过来自Sartorius的1.2μm过滤器过滤，然后在Pure仪器(GE Healthcare)上通过RP HPLC纯化。
使用来自Waters的XBridge C18 Prep 19x50mm柱进行RP HPLC纯化。缓冲液A是100mM三乙基乙酸铵pH 7，并且缓冲液B含有在缓冲液A中的95％乙腈。采用10mL/min的流速和60℃的温度。记录在280nm处的UV迹线。采用60个柱体积内的0-100％ B梯度。
将含有全长缀合寡核苷酸的级分合并，在冰箱中用3M NaOAc，pH 5.2和85％乙醇沉淀，并将收集的沉淀溶解在水中以得到约1000OD/mL的寡核苷酸溶液。通过添加20％氨水去除O-乙酸盐。这些保护基团的定量去除通过LC-MS验证。
在Pure(GE Healthcare)仪器上使用Sephadex G25Fine树脂(GEHealthcare)通过尺寸排阻色谱法将缀合物脱盐，得到缀合的核苷酸，分离产率为50％-70％。
表10：
vi)双链体退火
为了生成所需的siRNA双链体，两条互补链通过合并两条链的等摩尔水溶液进行退火。将混合物置于70℃的水浴中5分钟，随后在2小时内冷却至环境温度。将双链体冻干2天并储存在-20℃。
在Dionex Ultimate 3000(Thermo Fisher Scientific)HPLC系统上通过分析型SEC HPLC在SuperdexTM75Increase 5/150GL柱5x153-158mm(Cytiva)上分析双链体。流动相由含有10％乙腈的1x PBS组成。在室温下以1.5mL/min的流速在10分钟内运行等度梯度。记录在260nm和280nm处的UV迹线。水(LC-MS级)购自Sigma-Aldrich，并且磷酸盐缓冲盐水(PBS；10x,pH 7.4)购自GIBCO(Thermo Fisher Scientific)。
制备的GalNAc缀合物汇总在下表中。这些针对3种不同的靶基因。采集siRNA编码以及相应的单链、序列信息以及双链体的纯度。
表11：
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以下方案进一步阐述合成路线：方案1：
方案2：
方案3：
方案4：
方案5：
实例3
实例3和4使用以下构建体：
表12：
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实例3
-发明内容
合成并QC靶向hsHAO1、hsC5或hsTTR mRNA的GalNAc-siRNA。整个siRNA集(靶向HAO1的siRNA除外)首先通过使用RNAiMAX进行的转染在HepG2细胞中在剂量响应设置下进行研究，然后在原代人肝细胞中在裸式自由摄取设置下在剂量响应分析中进行研究。
将原代人肝细胞与靶向hsHAO1、hsC5或hsTTR mRNA的GalNAc-siRNA直接一起孵育导致不同程度的剂量依赖性在靶mRNA沉默。
-研究目的
该实验集的目的是分析不同GalNAc配体在靶向三种不同在靶(即hsHAO1、hsC5或hsTTR mRNA)的siRNA背景下的体外活性。
这项研究的工作包包括(i)测定开发以设计、合成和测试对每一个单独的目标在靶具有特异性的bDNA探针集，(ii)鉴定适合后续筛选实验的细胞系，(iii)一种或多种人癌细胞系中可能的所有siRNA(通过转染)的剂量响应分析，以及(iv)在裸式自由摄取环境下在原代人肝细胞中siRNA的剂量响应分析。在这两种环境下，应计算IC50值和最大抑制值，然后根据其效力对siRNA研究集进行排名。
-材料和方法
寡核苷酸合成
标准固相合成方法用于化学合成目标siRNA(见表12)以及对照(见表13)。
细胞培养和体外转染实验
细胞培养、转染和QuantiGene2.0分支DNA测定如下所述，并且siRNA序列列于表12和表13。HepG2细胞由美国组织培养物保藏中心(ATCC)提供(HB-8065，批号：63176294)并在ATCC配制的补充含有10％胎牛血清(FCS)的Eagle最低基础培养基中培养。原代人肝细胞(PHH)来源于Primacyt(德国什未林)(批号：CyHuf19009HEc)。细胞是通过外植体技术从恶性胶质母细胞瘤肿瘤获得。本研究中使用的所有细胞均于37℃在含5％ CO2的大气中在加湿培养箱中培养。
为了用靶向hsC5或hsTTR的siRNA(和对照)转染HepG2细胞，将细胞以20.000个细胞/孔的密度接种在常规96孔组织培养板中。根据制造商的说明，使用市售转染试剂RNAiMAX(Invitrogen/Life Technologies)利用siRNA转染细胞。在HepG2细胞中进行20个候选物的10点剂量响应实验(11x hsC5、9x hsTTR)，siRNA终浓度分别为24nM、6nM、1.5nM、0.4nM、0.1nM、0.03nM、0.008nM、0.002nM、0.0005nM和0.0001nM。
PHH中的剂量响应分析通过在裸式自由摄取环境中直接孵育细胞来进行，从1.5μM最高siRNA终浓度开始，然后是500nM，此后以两倍稀释步骤连续下降。
将对照孔转染到HepG2细胞中或直接与原代人肝细胞在相应板上研究的最高测试siRNA浓度下一起孵育。表13总结并列出了细胞模拟处理后不同项目阶段中包括的所有对照siRNA。对于每个siRNA和对照，至少四个孔被平行转染/直接孵育，并从每个孔收集单独的数据点。
转染后与siRNA一起孵育24小时后，去除培养基并在裂解混合物(1体积裂解缓冲液加2体积无核酸酶的水)中裂解HepG2细胞，然后在53℃下孵育至少45分钟。在PHH的情况下，在细胞处理后5小时去除铺板培养基，然后每孔添加50μl完全维持培养基。以这种方式每24小时更换一次培养基，直至72小时的总孵育期。在4小时或72小时的时间点，去除细胞培养上清液，然后添加200μl补充有1:1000v/v蛋白酶K的裂解混合物。
根据制造商的说明进行分支DNA(bDNA)测定。在存在底物的情况下在黑暗中孵育30分钟后，使用1420发光计数器(WALLAC VICTOR Light,Perkin Elmer,Rodgau-Jügesheim,德国)读取发光。对于每个孔，将在靶mRNA水平标准化为hsGAPDH mRNA水平。任一siRNA的活性表示为处理细胞中的在靶mRNA浓度(标准化为hsGAPDH mRNA)相对于对照孔中的平均在靶mRNA浓度(标准化为hsGAPDH mRNA)的百分比。
测定开发
QuantiGene2.0分支DNA(bDNA)探针集是特别针对智人GAPDH、AHSA1、hsHAO1、hsC5和hsTTR设计和合成的。bDNA探针集最初根据制造商的说明通过bDNA分析进行测试，评估了两种不同裂解物量(即10μl和50μl)的紧邻原代人肝细胞的以下人和猴癌细胞系中的目标mRNA水平：SJSA-1、TF1、NCI-H1650、Y-79、Kasumi-1、EAhy926、Caki-1、Colo205、RPTEC、A253、HeLaS3、Hep3B、BxPC3、DU145、THP-1、NCI-H460、IGR37、LS174T、Be(2)-C、SW 1573、NCI-H358、TC71、22Rv1、BT474、HeLa、KBwt、Panc-1、U87MG、A172、C42、HepG2、LNCaP、PC3、SupT11、A549、HCT116、HuH7、MCF7、SH-SY5Y、HUVEC、C33A、HEK293、HT29、MOLM 13和SK-MEL-2。仅含bDNA探针集而不添加细胞裂解物的孔用于监测技术背景和噪声信号。
-结果
鉴定适合筛选GalNAc-siRNA的细胞类型
图1至图3显示了三种目标在靶(即hsC5、hsHAO1和hsTTR)在人癌细胞系加原代人肝细胞的一个多样化集的裂解物中的mRNA表达数据。测试的每个细胞系的细胞数/裂解物体积相同，这是允许比较不同细胞类型之间的表达水平所必需的。图1显示了测试的所有细胞类型的hsC5 mRNA表达数据。
还筛选表达hsHAO1 mRNA的相同细胞类型，结果显示在作为图2一部分的条形图中。
最后，鉴定了合适的细胞类型，该细胞类型将允许筛选靶向hsTTR的GalNAc-siRNA，相应数据是图3的一部分。
总之，所有三个目标在靶的mRNA表达水平在原代人肝细胞(PHH)中都足够高。此外，HepG2细胞可以用于筛选靶向hsC5和hsTTR mRNA的GalNAc-siRNA，相比之下，无法鉴定出适合测试对hsHAO1 mRNA具有特异性的siRNA的癌细胞系。
HepG2细胞中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
转染优化后，使用RNAiMAX在剂量响应设置下，用靶向hsTTR的整个GalNAc-siRNA集(见表12)转染HepG2细胞。最高siRNA测试终浓度为24nM，在九个细胞中下降。表14列出了所有研究的靶向hsTTR的GalNAC-siRNA的活性数据。
表14：HepG2细胞中靶向hsTTR的siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表按照外部ID排序，孵育4小时在上，并且孵育24小时在下。
24小时孵育的结果也显示在图11A-B中
通常，用靶向hsTTR的siRNA转染HepG2细胞会导致在靶mRNA沉默，通常跨越从0％沉默到最大抑制的整个活性范围。与仅在转染后4小时生成的数据相比，转染后24小时生成的数据更稳健，标准偏差更低。此外，在靶敲低的程度通常会随着时间的推移(从孵育4小时直至24小时)而增加。已鉴定出使在靶mRNA沉默>95％的hsTTR GalNAc-siRNA，IC50值在低两位数pM范围内。
HepG2细胞中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
第二个目标靶标hsC5 mRNA通过使用RNAiMAX转染HepG2细胞在相同的剂量响应设置(无论如何，siRNA测试终浓度差异最小)下进行测试，其中GalNAc-siRNA与hsTTR siRNA具有相同的停留/位置/GalNAc-配体变异，但序列对在靶hsC5 mRNA具有特异性。
表15：HepG2细胞中靶向hsC5的siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表按照外部ID排序，孵育4小时在上，并且孵育24小时在下。
| 靶标 | 孵育[小时] | 外部ID | IC20[nM] | IC50[nM] | IC80[nM] | 最大抑制[％] |
| C5 | 4 | ETX011 | 0,091 | 0,424 | #N/A | 74,6 |
| C5 | 4 | ETX015 | 0,407 | 0,578 | #N/A | 61,9 |
| C5 | 24 | ETX011 | 0,001 | 0,005 | 0,045 | 88,4 |
| C5 | 24 | ETX015 | 0,003 | 0,013 | 0,099 | 88,8 |
24小时孵育的结果也显示在图12A-B中
在用对hsC5具有特异性的GalNAc-siRNA集转染HepG2细胞后，存在剂量依赖性的在靶hsC5 mRNA沉默。在细胞转染后4小时已经可以检测到一些敲低，在更长的孵育期(即24小时)后观察到甚至更高的在靶沉默。已鉴定出使在靶mRNA沉默将近90％的hsC5GalNAc-siRNA，IC50值在低个位数pM范围内。
鉴定适合测试所有GalNAc-siRNA的原代人肝细胞批次
人癌细胞系HepG2中两个GalNAc-siRNA集的剂量响应分析应证明(并确保)所有新的GalNAc-/接头/位置/帽变体确实是有效结合AGO2并加载到RISC中的底物，并且另外能够在RNAi介导的靶mRNA切割中发挥作用。然而，为了测试靶向GalNAc配体衍生物是否允许有效摄取到肝细胞中，应通过裸式自由摄取设置在原代人肝细胞中进行剂量响应分析实验。肝细胞确实以高水平专门表达去唾液酸糖蛋白受体(ASGR1)，并且肝脏通常使用该受体从循环中去除靶糖蛋白。现在众所周知，某些类型的与GalNAc配体缀合的寡核苷酸(例如siRNA或ASO)被这种高周转受体识别，并经由网格蛋白包被的囊泡有效地摄取到细胞质中并运输到内体隔室中。内体逃逸被认为是寡核苷酸递送的限速步骤。
进行中间体测定开发实验，其中测试了不同批次的原代人肝细胞的相关目标基因(即hsC5、hsTTR、hsHAO1、hsGAPDH和hsAHSA1)的表达水平。Primacyt(德国什未林)提供了三瓶不同的原代人肝细胞批次用于测试，即BHuf16087、CHF2101和CyHuf19009。将细胞接种在涂有胶原蛋白的96孔组织培养板上，随后将细胞孵育0小时、24小时、48小时和72小时，然后进行细胞裂解和bDNA分析以监测目标mRNA水平。图6显示了原代人肝细胞批次BHuf16087、CHF2101和CyHuf19009中所有三个目标在靶(hsTTR、hsC5和hsHAO1)的绝对mRNA表达数据。hsGAPDH和hsAHSA1的mRNA表达水平如图7所示。
总体而言，原代人肝细胞批次BHuf16087和CyHuf19009中所有三个目标在靶的mRNA表达在72小时后都足够高以继续进行bDNA测定。由于可用于进一步实验的小瓶总量，我们继续使用批次CyHuf19009进行实验。
PHH中靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
在鉴定出合适的原代人肝细胞(PHH)批次(CyHuf19009)后，对表12中所列的靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA进行裸式自由摄取分析。测试的最高siRNA终浓度为1.5μM，然后是500nM，以八个两倍连续稀释步骤下降至1.95nM的最低siRNA终浓度。实验在PHH细胞直接孵育后4小时和72小时结束。表16列出了所有研究的靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的活性数据。表13总结并列出了本实验中包括的所有对照siRNA。
表16：原代人肝细胞(PHH)中靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表根据外部ID组织，4小时孵育和72小时孵育分别列于上部和下部。
72小时孵育的结果也显示在图13A-B中。
靶向hsHAO1的GalNAc-siRNA的裸式自由摄取不会在4小时内导致显著的在靶沉默，但是在72小时孵育后，在35.5％至58.1％的最大抑制范围内可见在靶沉默。
PHH中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
第二个目标靶标hsC5 mRNA在相同的剂量响应设置下通过裸式自由摄取在PHH中进行测试，GalNAc-siRNA与之前在测定中测试的hsTTR和hsHAO1具有相同的接头/位置/GalNAc-配体变异，除了对在靶hsC5 mRNA具有特异性的序列以外。靶向hsC5的GalNAc-siRNA的序列以及有关对照siRNA的所有序列和信息分别列于表12和表13中。实验在PHH直接孵育4小时和72小时后结束。表17列出了所有研究的靶向hsC5的GalNAc-siRNA的活性数据。
表17：PHH中靶向hsC5的GalNAc-siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表根据外部ID组织，4小时孵育和72小时孵育分别列于上部和下部。
| 靶标 | 孵育[小时] | 外部ID | IC20[nM] | IC50[nM] | IC80[nM] | 最大抑制[％] |
| C5 | 4 | ETX011 | #N/A | #N/A | #N/A | -2,9 |
| C5 | 4 | ETX015 | #N/A | #N/A | #N/A | 7,6 |
| C5 | 72 | ETX011 | 2,6 | 295,3 | #N/A | 62,1 |
| C5 | 72 | ETX015 | 7,2 | 315,0 | #N/A | 57,2 |
72小时孵育的结果也显示在图14A-B中。
孵育4小时后，未见到显著的GalNAc-siRNA的在靶沉默。在72小时的孵育期后生成的数据显示高达65.5％最大抑制的更稳健的在靶沉默。
PHH中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的剂量响应分析
最后一个目标靶标hsTTR mRNA再次以裸式自由摄取在PHH中以与靶标hsHAO1和hsC5相同的剂量响应设置进行测试，唯一的区别是使用在靶hsTTR mRNA的特异性siRNA序列(见表12)。
实验在PHH直接孵育72小时后结束。表18列出了所有研究的靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的活性数据。
表18：原代人肝细胞(PHH)中靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的靶标、孵育时间、外部ID、IC20/IC50/IC80值和最大抑制。列表根据外部ID组织。
| 靶标 | 孵育[小时] | 外部ID | IC20[nM] | IC50[nM] | IC80[nM] | 最大抑制[％] |
| hsTTR | 72 | ETX020 | 2,2 | 31,0 | #N/A | 78,4 |
| hsTTR | 72 | ETX024 | 9,5 | 110,0 | #N/A | 71,3 |
结果也在图15A-B中示出。
靶向hsTTR的GalNAc-siRNA的裸式自由摄取确实在72小时内导致显著的在靶沉默，范围在46％至82.5％最大抑制之间。
-总结和讨论
本研究的范围是分析根据本发明的GalNAc配体在用于靶向三种不同的在靶(即hsHAO1、hsC5和hsTTR mRNA)的siRNA背景下的体外活性。对每个靶标具有特异性的siRNA集由具有不同接头/帽/修饰/GalNAc配体化学的siRNA(各自具有两个不同的反义链)组成。
对于所有靶标，表12中的GalNAc-siRNA被鉴定为显示出高总体效力和低IC50值。
实例4
合成路线
vii)缀合结构单元TriGalNAc的合成
薄层色谱法(TLC)在涂有二氧化硅的铝板上进行，254nm荧光指示剂来自Macherey-Nagel。在紫外光(254nm)下或用在甲醇(MeOH)中的5％ H2SO4或根据Stahl的茚三酮试剂(来自Sigma-Aldrich)喷洒后观察化合物，然后加热。使用配备有双可变UV波长检测器(200nm-400nm)的Biotage Isolera One快速色谱法仪器使用Biotage 二氧化硅10g、25g、50g或100g柱(瑞典乌普萨拉)进行快速色谱法。
所有对水分敏感的反应均在无水条件下使用干燥玻璃器皿、无水溶剂和氩气氛进行。所有市售试剂均购自Sigma-Aldrich，并且溶剂购自Carl Roth GmbH+Co.KG。D-半乳糖胺五乙酸酯购自AK scientific。
HPLC/ESI-MS在Dionex UltiMate 3000RS UHPLC系统和Thermo Scientific MSQPlus质谱仪上使用Waters的Acquity UPLC Protein BEH C4柱(1.7μm，2.1x100mm)在60℃下进行。溶剂系统由溶剂A(含0.1％甲酸的H2O)和溶剂B(含0.1％甲酸的乙腈(ACN))组成。采用15分钟内5％-100％ B的梯度，流速为0.4mL/min。探测器和条件：Corona超荷电气溶胶检测(来自esa)。雾化器温度：25℃。N2压力：35.1psi。过滤器：Corona。
1H和13C NMR谱在室温下在Varian光谱仪上在500MHz(1H NMR)和125MHz(13C NMR)下记录。化学位移以ppm给出，参考溶剂残留峰(CDCl3–1H NMR：δ在7.26ppm和13C NMRδ在77.2ppm；DMSO-d6–1H NMR：δ在2.50ppm和13C NMRδ在39.5ppm)。耦合常数以赫兹给出。信号分裂模式被描述为单峰(s)、二重峰(d)、三重峰(t)或多重峰(m)。
viii)缀合结构单元TriGalNAc的合成路线
化合物2的制备：在氩气下将D-半乳糖胺五乙酸酯(3.00g,7.71mmol,1.0eq.)溶解在无水二氯甲烷(DCM)(30mL)中，并添加三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf,4.28g,19.27mmol,2.5eq.)。将反应在室温下搅拌3小时。将反应混合物用DCM(50mL)稀释并用冷饱和NaHCO3水溶液(100mL)和水(100mL)洗涤。将有机层分离，经Na2SO4干燥并浓缩，得到呈黄色油状物的标题化合物，将其通过快速色谱法(梯度洗脱：0-10％ MeOH于DCM中，10CV)纯化。获得呈无色油状物的产物(2.5g,98％,rf＝0.45(2％ MeOH于DCM中))。
化合物4的制备：在氩气下，将化合物2(2.30g,6.98mmol,1.0eq.)和叠氮基-PEG3-OH(1.83g,10.5mmol,1.5eq.)溶解在无水DCM(40mL)中，并将分子筛(5g)添加到溶液中。将混合物在室温搅拌1小时。然后将TMSOTf(0.77g,3.49mmol,0.5eq.)添加到混合物中并将反应搅拌过夜。过滤分子筛，将滤液用DCM(100mL)稀释并用冷饱和NaHCO3水溶液(100mL)和水(100mL)洗涤。将有机层分离，经Na2SO4干燥，并在减压下去除溶剂。粗物质通过快速色谱法(梯度洗脱：0-3％ MeOH于DCM中，10CV)纯化，得到呈浅黄色油状物的标题产物(3.10g,88％,rf＝0.25(2％ MeOH于DCM中))。MS：C20H32N4O11的计算值为504.21。实测值为505.4。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ6.21-6.14(m,1H),5.30(dd,J＝3.4,1.1Hz,1H),5.04(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.76(d,J＝8.6Hz,1H),4.23-4.08(m,3H),3.91-3.80(m,3H),3.74-3.59(m,9H),3.49-3.41(m,2H),2.14(s,3H),2.02(s,3H),1.97(d,J＝4.2Hz,6H)。13C NMR(125MHz,CDCl3)δ170.6(C),170.5(C),170.4(C),170.3(C),102.1(CH),71.6(CH),70.8(CH),70.6(CH),70.5(CH),70.3(CH2),69.7(CH2),68.5(CH2),66.6(CH2),61.5(CH2),23.1(CH3),20.7(3xCH3)。
化合物5的制备：将化合物4(1.00g,1.98mmol,1.0eq.)溶解在乙酸乙酯(EtOAc)和MeOH的混合物(30mL 1:1 v/v)中，并添加Pd/C(100mg)。使用真空/氩气循环(3x)将反应混合物脱气并在气球压力下氢化过夜。将反应混合物通过硅藻土过滤并用EtOAc(30mL)洗涤。在减压下除去溶剂，得到呈无色油状物的标题化合物(0.95g，定量产率，rf＝0.25(10％MeOH于DCM中))。该化合物不经进一步纯化即可用。MS：C20H34N2O11的计算值为478.2。实测值为479.4。
化合物7的制备：将三{[2-(叔丁氧基羰基)乙氧基]甲基}-甲胺6(3.37g,6.67mmol,1.0eq.)溶解在DCM/水的混合物(40mL 1:1 v/v)中，并在剧烈搅拌的同时添加Na2CO3(0.18g,1.7mmol,0.25eq.)。将氯甲酸苄酯(2.94mL,20.7mmol,3.10eq.)滴加到先前的混合物中并将反应在室温下搅拌24小时。将反应混合物用CH2Cl2(100mL)稀释并用水(100mL)洗涤。将有机层分离并经Na2SO4干燥。在减压下除去溶剂，并且所得粗物质通过快速色谱法(梯度洗脱：0-10％ EtOAc于环己烷中，12CV)纯化，得到呈淡黄色油状物的标题化合物(3.9g，91％，rf＝0.56(10％ EtOAc于环己烷中))。MS：C33H53NO11的计算值为639.3。实测值为640.9。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.38-7.26(m,5H),4.97(s,2H),3.54(t,6H),3.50(s,6H),2.38(t,6H),1.39(s,27H)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ170.3(3xC),154.5(C),137.1(C),128.2(2xCH),127.7(CH),127.6(2xCH),79.7(3xC),68.4(3xCH2),66.8(3xCH2),64.9(C),58.7(CH2),35.8(3xCH2),27.7(9xCH3)。
化合物8的制备：在氩气下将Cbz-NH-三-Boc-酯7(0.20g,0.39mmol,1.0eq.)溶解在CH2Cl2(1mL)中，添加三氟乙酸(TFA,1mL)并将反应在室温下搅拌1小时。在减压下除去溶剂，将残余物与甲苯(5mL)共蒸发3次并在高真空下干燥以得到作为其TFA盐的化合物(0.183g,98％)。该化合物不经进一步纯化即可用。MS：C21H29NO11的计算值为471.6。实测值为472.4。
化合物9的制备：将CbzNH-三-COOH 8(0.72g,1.49mmol,1.0eq.)和GalNAc-PEG3-NH25(3.56g,7.44mmol,5.0eq.)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(25mL)中。然后将N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)(2.78g,7.44mmol,5.0eq.)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)(1.05g,7.44mmol,5.0eq.)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(2.07mL,11.9mmol,8.0eq.)添加到溶液中并将反应搅拌72小时。在减压下除去溶剂，将残余物溶解在DCM(100mL)中并用饱和NaHCO3水溶液(100mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，蒸发溶剂，并将粗物质通过快速色谱法(梯度洗脱：0-5％ MeOH于DCM中，14CV)纯化。获得呈淡黄色油状物的产物(1.2g,43％,rf＝0.20(5％ MeOH于DCM中))。MS：C81H125N7O41的计算值为1852.9。实测值为1854.7。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.90-7.80(m,10H),7.65-7.62(m,4H),7.47-7.43(m,3H),7.38-7.32(m,8H),5.24-5.22(m,3H),5.02-4.97(m,4H),4.60-4.57(m,3H),4.07-3.90(m 10H),3.67-3.36(m,70H),3.23-3.07(m,25H),2.18(s,10H),2.00(s,13H),1.89(s,11H),1.80-1.78(m,17H)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ170.1(C),169.8(C),169.7(C),169.4(C),169.2(C),169.1(C),142.7(C),126.3(CH),123.9(CH),118.7(CH),109.7(CH),100.8(CH),70.5(CH),69.8(CH),69.6(CH),69.5(CH),69.3(CH2),69.0(CH2),68.2(CH2),67.2(CH2),66.7(CH2),61.4(CH2),22.6(CH2),22.4(3xCH3),20.7(9xCH3)。
化合物10的制备：将三触角GalNAc化合物9(0.27g,0.14mmol,1.0eq.)溶解在MeOH(15mL)中，添加3滴乙酸(AcOH)和Pd/C(30mg)。使用真空/氩气循环(3x)将反应混合物脱气并在气球压力下氢化过夜。反应完成后是质谱法，并且将所得混合物通过硅藻土薄垫过滤。蒸发溶剂并将获得的残余物在高真空下干燥并用于下一步骤而不经进一步纯化。获得呈淡黄色油状物的产物(0.24g，定量产率)。MS：C73H119N7O39的计算值为1718.8。实测值为1719.3。
化合物14的制备：在氩气下将三触角GalNAc化合物10(0.45g,0.26mmol,1.0eq.)、HBTU(0.19g,0.53mmol,2.0eq.)和DIPEA(0.23mL,1.3mmol,5.0eq.)溶解在DCM(10mL)中。向该混合物中滴加化合物13(0.14g,0.53mmol,2.0eq.)在DCM(5mL)中的溶液。将反应在室温下搅拌过夜。除去溶剂，并将残余物溶解在EtOAc(50mL)中，用水(50mL)洗涤并经Na2SO4干燥。蒸发溶剂并将粗物质通过快速色谱法(梯度洗脱：0-5％ MeOH于DCM中，20CV)纯化。获得呈白色蓬松固体的产物(0.25g,48％,rf＝0.4(10％ MeOH于DCM中))。MS：C88H137N7O42的计算值为1965.1。实测值为1965.6。
TriGalNAc(15)的制备：将三触角GalNAc化合物14(0.31g,0.15mmol,1.0eq.)溶解在EtOAc(15mL)中并添加Pd/C(40mg)。通过使用真空/氩气循环(3x)将反应混合物脱气并在气球压力下氢化过夜。通过质谱法监测反应的完成，并将所得混合物通过硅藻土薄垫过滤。在减压下除去溶剂，并且将所得残余物在高真空下干燥过夜。将残余物用于与寡核苷酸的缀合而不经进一步纯化(0.28g，定量产率)。MS：C81H131N7O42的计算值为1874.9。实测值为1875.3。
ix)寡核苷酸合成
表19：
Af,Cf,Gf,Uf: 2'-F RNA核苷酸
a、c、g、u： 2'-O-Me RNA核苷酸
dT： DNA核苷酸
s： 硫代磷酸
invabasic： 1,2-二脱氧核糖
NH2-DEG： 氨基乙氧基乙基接头
NH2C12： 氨基十二烷基接头
NH2C6： 氨基己基接头
根据亚磷酰胺方法在固相上合成寡核苷酸。根据规模，使用Mermade 12(BioAutomation Corporation)或Oligopilot(GE Healthcare)。
合成在由可控孔隙玻璃制成的市售固体支持物上进行，该支持物装载有invabasic(CPG，载量为86μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-1047-B)或2'-F A(CPG，/>载量为90μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-1039-B)或NH2C6(CPG，/>载量为85μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-1397-B)或GalNAc(CPG，/>载量为57μmol/g；Primetech)或2'-O-甲基C(CPG，/>载量为84μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-10-B)或2'-O-甲基A(CPG，/>载量为85μmol/g，LGC Biosearch目录号BCG-1029-B)或dT(CPG，载量为87μmol/g；LGC Biosearch目录号BCG-1055-B)。
2'-O-Me、2'-F RNA亚磷酰胺和辅助试剂购自SAFC Proligo(德国汉堡)。
2'-O-甲基亚磷酰胺包括：5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N-苯甲酰基-腺苷2'-O-甲基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N-苯甲酰基-胞苷2'-O-甲基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-N-二甲基甲脒-鸟苷2'-O-甲基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-尿苷2'-O-甲基-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。
2'-F亚磷酰胺包括：5'-二甲氧基三苯甲基-N-苯甲酰基-脱氧腺苷2'-氟-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-二甲氧基三苯甲基-N-乙酰基-脱氧胞苷2'-氟-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5'-二甲氧基三苯甲基-N-异丁酰-脱氧鸟苷2'-氟-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺和5'-二甲氧基三苯甲基-脱氧尿苷2'-氟-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。
为了在寡核苷酸的5'-端引入所需的氨基接头，采用2-[2-(4-单甲氧基三苯甲基)氨基乙氧基]乙基-(2-氰基乙基)-N,N-二异丙基)-亚磷酰胺(Glen Research目录号1905)和12-(三氟乙酰基氨基)十二烷基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(ChemGenes目录号CLP-1575)。使用5-O-二甲氧基三苯甲基-1,2-二脱氧核糖-3-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(ChemGenes目录号ANP-1422)引入invabasic修饰。
所有结构单元均溶解在含有分子筛的无水乙腈(100mM(Mermade12)或200mM(/>Oligopilot))中，除了2'-O-甲基-尿苷亚磷酰胺溶解在于无水乙腈中的50％无水DCM中以外。碘(50mM，于吡啶/H2O中，9:1 v/v)用作氧化试剂。5-乙基硫代四唑(ETT，500mM，于乙腈中)用作活化剂溶液。使用100mM氢化黄原素(TCI目录号6846-35-1，在乙腈/吡啶中，4:6v/v)进行引入硫代磷酸连接的硫醇化。
除非另有说明，否则偶联时间为5.4分钟。采用双偶联步骤将5'氨基修饰掺入序列，每次偶联的偶联时间为11分钟(总偶联时间为22分钟)。氧化剂接触时间设为1.2分钟，并且硫醇化时间为5.2分钟。
序列通过去除最终的DMT基团合成，但NH2DEG序列中的MMT基团除外。
在合成结束时，使用1:1体积的28％-30％氢氧化铵溶液(Sigma-Aldrich，目录号221228)和40％甲胺水溶液(Sigma-Aldrich，目录号8220911000)在6℃下从固体支持物上切割寡核苷酸，持续16小时。然后滤出固体支持物，用H2O彻底洗涤过滤器并通过在减压下蒸发减少合并溶液的体积。用10％ AcOH(Sigma-Aldrich，目录号A6283)将所得溶液的pH调节至pH 7。
粗物质通过反相(RP)HPLC或阴离子交换(AEX)HPLC纯化。
在Pure仪器(GE Healthcare)上使用XBridge C18Prep 19x 50mm柱(Waters)进行RP HPLC纯化。缓冲液A是100mM三乙基乙酸铵(TEAAc,Biosolve)pH 7，并且缓冲液B含有在缓冲液A中的95％乙腈。采用10mL/min的流速和60℃的温度。记录在280nm处的UV迹线。采用120个柱体积内的0％ B至100％ B的梯度。将适当的级分合并并在冰箱中用3M乙酸钠(NaOAc)(Sigma-Aldrich)pH 5.2和85％乙醇(VWR)沉淀。将沉淀通过离心分离，重新溶解在水(50mL)中，用5M NaCl(5mL)处理并在/>Pure仪器上使用填充有Sephadex G25-Fine树脂(GE Healthcare)的50x 165mm ECO柱(YMC，德国丁斯拉肯)通过尺寸排阻HPLC脱盐。
AEX HPLC纯化在Pure仪器(GE Healthcare)上使用TSK凝胶SuperQ-5PW20x200mm(BISCHOFF Chromatography)进行。缓冲液A是20mM磷酸钠(Sigma-Aldrich)pH7.8，并且缓冲液B与缓冲液A相同，但添加了1.4M溴化钠(Sigma-Aldrich)。采用10mL/min的流速和60℃的温度。记录在280nm处的UV迹线。采用27个柱体积内的10％ B至100％B的梯度。将适当的级分合并并在冰箱中用3M NaOAc，pH 5.2和85％乙醇沉淀。将沉淀通过离心分离，重新溶解在水(50mL)中，用5M NaCl(5mL)处理并通过尺寸排阻色谱法脱盐。
MMT基团用25％的乙酸水溶液去除。一旦反应完成，溶液就被中和，并且样品通过尺寸排阻色谱法脱盐。
在结合有LCQ Deca XP-plus Q-ESI-TOF质谱仪(Thermo Finnigan)或CompactESI-Qq-TOF质谱仪(Bruker Daltonics)的Dionex Ultimate 3000(Thermo FisherScientific)HPLC系统上通过分析型LC-MS在2.1x 50mm XBridge C18柱(Waters)上分析单链。缓冲液A是在H2O中的16.3mM三乙胺、100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)和1％MeOH，并且缓冲液B含有在95％ MeOH中的缓冲液A。采用250μL/min的流速和60℃的温度。记录在260nm和280nm处的UV迹线。采用在0.5分钟内1％-40％ B，然后在13分钟内40％至100％ B的梯度。甲醇(LC-MS级)、水(LC-MS级)、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(超纯级)和三乙胺(超纯级)购自Sigma-Aldrich。
x)在5'-端或3'-端的TriGalNAc系链2(GalNAc-T2)缀合5'-GalNAc-T2缀合物
3'-GalNAc-T2缀合物
TriGalNAc系链2NHS酯的制备：向羧酸系链2(化合物15，227mg，121μmol)在DMF(2.1mL)中的溶液中添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(15.3mg,133μmol)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)(19.7μL,127μmol)。将溶液在室温下搅拌18小时，并用于后续的缀合反应而不经纯化。
triGalNAc系链2缀合的一般程序：将胺修饰的单链以700OD/mL溶解在50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH 9.6/DMSO 4:6(v/v)中，并向该溶液中添加一摩尔当量的系链2NHS酯(57mM)的DMF溶液。反应在室温下进行，并在1小时后添加另一摩尔当量的NHS酯溶液。允许反应再进行一小时并且通过LCMS监测反应进展。需要相对于氨基修饰的寡核苷酸至少二摩尔当量过量的NHS酯试剂以实现起始材料的定量消耗。反应混合物用水稀释15倍，通过Sartorius的1.2μm过滤器过滤一次，然后在Pure(GE Healthcare)仪器上通过反相(RPHPLC)纯化。
使用来自Waters的XBridge C18 Prep 19x 50mm柱进行纯化。缓冲液A是100mMTEEAc pH 7，并且缓冲液B含有在缓冲液A中的95％乙腈。采用10mL/min的流速和60℃的温度。记录在280nm处的UV迹线。采用60个柱体积内的0-100％ B梯度。
将含有全长缀合寡核苷酸的级分合并在一起，在冰箱中用3M NaOAc，pH 5.2和85％乙醇沉淀，然后以1000OD/mL溶解在水中。用20％氢氧化铵水溶液除去O-乙酸盐直至完成(通过LC-MS监测)。
在Pure(GE Healthcare)仪器上使用Sephadex G25Fine树脂(GEHealthcare)通过尺寸排阻色谱法将缀合物脱盐，得到缀合的寡核苷酸，分离产率为60％-80％。
表20：
在配备有Compact ESI-Qq-TOF质谱仪(Bruker Daltonics)的Dionex Ultimate3000(Thermo Fisher Scientific)HPLC系统上通过HPLC-MS分析使用2.1x 50mm XBridgeC18柱(Waters)表征缀合物。缓冲液A是在H2O中的16.3mM三乙胺、100mM HFIP/1％ MeOH，并且缓冲液B含有在缓冲液A中的95％ MeOH。采用250μL/min的流速和60℃的温度。记录在260nm和280nm处的UV迹线。采用在31分钟内1％-100％ B的梯度。
xi)双链体退火
为了生成所需的siRNA双链体，两条互补链通过合并两条链的等摩尔水溶液进行退火。将混合物置于70℃的水浴中5分钟，随后在2小时内冷却至环境温度。将双链体冻干2天并储存在-20℃。
在Dionex Ultimate 3000(Thermo Fisher Scientific)HPLC系统上通过分析型SEC HPLC在SuperdexTM75Increase 5/150GL柱5x153-158mm(Cytiva)上分析双链体。流动相由含有10％乙腈的1x PBS组成。在室温下以1.5mL/min的流速在10分钟内运行等度梯度。记录在260nm和280nm处的UV迹线。水(LC-MS级)购自Sigma-Aldrich，并且磷酸盐缓冲盐水(PBS；10x,pH 7.4)购自GIBCO(Thermo Fisher Scientific)。
制备的GalNAc缀合物汇总在下表中。这些针对3种不同的靶基因。采集siRNA编码以及相应的单链、序列信息以及双链体的纯度。
表21：
以下方案进一步阐述合成路线：方案6：
方案7：
方案8：
方案9：
本发明的范围不限于所公开的特定实施例的范围，提供该实施例例如用于说明本发明的各个方面。根据本文的描述和教导，对所描述的组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下实施此类变化，并且旨在落入本公开的范围内。
实例5
GalNAc-siRNA构建体ETX005、ETX006、ETX014和ETX015的小鼠数据ETX005(靶向HAO1 mRNA)T1a反向无碱基
进行一项体内小鼠药理学研究，该研究表明在高达3mg/kg的GalNAc缀合修饰siRNA ETX005的单次皮下剂量后，肝脏组织中HAO1 mRNA的敲低以及血清乙醇酸水平的相关增加。
将大约8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分入各组，每组21只小鼠。在研究的第0天，动物接受溶解在盐水(无菌0.9％氯化钠)中的0.3mg/kg或3mg/kg GalNAc-siRNA的单次皮下剂量或作为对照的仅盐水。在研究的第1天、第2天、第4天、第7天、第14天、第21天和第28天，对每组的3只小鼠实施安乐死，并采集血清和肝脏样品。
在第0天从一组5只未处理的小鼠中提取血清以提供乙醇酸浓度的基线测量值。
将血清储存在-80℃直至进一步分析。将肝脏样品(约50mg)用RNAlater处理并在4℃下储存过夜，然后在-80℃下储存。
使用定量实时PCR分析肝脏样品的HAO1 mRNA(Thermo测定ID Mm00439249_m1)和管家基因GAPDH mRNA(Thermo测定ID Mm99999915_g1)。ΔΔCt方法用于计算标准化为GAPDH并相对于盐水对照组的HAO1表达变化。
7天后，单次3mg/kg剂量的ETX005使HAO1 mRNA表达抑制超过80％(图16)。HAO1表达的抑制是持久的，其中在第28天研究结束时单次3mg/kg剂量的ETX005保持大于60％的HAO1 mRNA抑制。与盐水对照组相比，0.3mg/kg ETX005的单次剂量也抑制HAO1表达，其中HAO1表达水平仅在研究的第28天达到正常水平。
预计HAO1 mRNA表达的抑制会导致血清乙醇酸水平增加。使用LC-MS/MS测量血清乙醇酸浓度(图17)。单次3mg/kg剂量的ETX005导致血清乙醇酸浓度显著增加，在给药后14天达到峰值水平，并保持高于基线水平(第0天)和盐水对照组，直到第28天研究结束。单次0.3mg/kg剂量的ETX005显示血清乙醇酸浓度高于基线和盐水对照组中见到的水平，血清乙醇酸浓度的增加更小和更短暂，表明非常小的剂量也可以以足以影响血清中代谢生物标志物浓度的量级抑制HAO1 mRNA。
图16.ETX005的单剂量小鼠药理学。HAO1 mRNA表达相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
图17.ETX005的单剂量小鼠药理学。显示了血清乙醇酸浓度。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差，除了来自一组5只小鼠的基线乙醇酸浓度(第0天)以外。
ETX006(靶向HAO1 mRNA)T2a反向无碱基
进行一项体内小鼠药理学研究，该研究表明在高达3mg/kg的GalNAc缀合修饰siRNA ETX006的单次皮下剂量后，肝脏组织中HAO1 mRNA的敲低以及血清乙醇酸水平的伴随增加。
将大约8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分入各组，每组21只小鼠。在研究的第0天，动物接受溶解在盐水(无菌0.9％氯化钠)中的0.3mg/kg或3mg/kg GalNAc-siRNA的单次皮下剂量或作为对照的仅盐水。在研究的第1天、第2天、第4天、第7天、第14天、第21天和第28天，对每组的3只小鼠实施安乐死，并采集血清和肝脏样品。
在第0天从一组5只未处理的小鼠中提取血清以提供乙醇酸浓度的基线测量值。
将血清储存在-80℃直至进一步分析。将肝脏样品(约50mg)用RNAlater处理并在4℃下储存过夜，然后在-80℃下储存。
使用定量实时PCR分析肝脏样品的HAO1 mRNA(Thermo测定ID Mm00439249_m1)和管家基因GAPDH mRNA(Thermo测定ID Mm99999915_g1)。ΔΔCt方法用于计算标准化为GAPDH并相对于盐水对照组的HAO1表达变化。
7天后，单次3mg/kg剂量的ETX006使HAO1 mRNA表达抑制超过80％(图18)。对HAO1表达的抑制是持久的，并一直持续到研究结束，其中ETX006在第28天时对HAO1mRNA的抑制保持大于60％。与盐水对照组相比，0.3mg/kg的单次剂量也抑制HAO1表达，其中HAO1表达水平仅在研究的第28天达到正常水平。
预计HAO1 mRNA表达的抑制会导致血清乙醇酸水平增加。使用LC-MS/MS测量血清乙醇酸浓度(图19)。单次3mg/kg剂量的ETX006导致血清乙醇酸浓度显著增加，在给药后14天达到峰值水平，并保持高于基线水平(第0天)和盐水对照组，直到第28天研究结束。单次0.3mg/kg剂量的ETX006显示血清乙醇酸浓度高于基线和盐水对照组中见到的水平，血清乙醇酸浓度的增加更小和更短暂，表明非常小的剂量也可以影响血清中代谢生物标志物的浓度。
图18.ETX006的单剂量小鼠药理学。HAO1 mRNA表达相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
图19.ETX006的单剂量小鼠药理学。显示了血清乙醇酸浓度。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差，除了来自一组5只小鼠的基线乙醇酸浓度(第0天)以外。
ETX014(靶向C5 mRNA)T1a反向无碱基
进行一项体内小鼠药理学研究，该研究表明在高达3mg/kg的GalNAc缀合修饰siRNA ETX014的单次皮下剂量后，肝脏组织中C5 mRNA的敲低以及引起的血清C5蛋白浓度的降低。
将大约8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分入各组，每组21只小鼠。在研究的第0天，动物接受溶解在盐水(无菌0.9％氯化钠)中的0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg GalNAc-siRNA的单次皮下剂量或作为对照的仅盐水。在研究的第1天、第2天、第4天、第7天、第14天、第21天和第28天，对每组的3只小鼠实施安乐死，并采集血清和肝脏样品。
将血清储存在-80℃直至进一步分析。将肝脏样品(约50mg)用RNAlater处理并在4℃下储存过夜，然后在-80℃下储存。
使用定量实时PCR分析肝脏样品的C5 mRNA(Thermo测定ID Mm00439275_m1)和管家基因GAPDH mRNA(Thermo测定ID Mm99999915_g1)。ΔΔCt方法用于计算标准化为GAPDH并相对于盐水对照组的C5表达变化。
ETX014以剂量依赖性方式抑制C5 mRNA表达(图20)，其中在第14天，3mg/kg剂量实现大于90％的C5 mRNA减少。ETX014对C5表达的抑制是持久的，其中每个分子的3mg/kg剂量显示出C5 mRNA的明显敲低，直到第28天研究结束。
对于C5蛋白水平分析，使用市售的C5 ELISA试剂盒(Abcam ab264609)测量血清样品。血清C5水平是相对于匹配时间点的盐水组平均值计算的。
血清蛋白质数据支持mRNA分析(图21)。用ETX014治疗引起血清C5蛋白浓度的剂量依赖性降低。所有剂量的ETX014都将C5蛋白水平降低了超过70％，其中在研究的第7天，3mg/kg剂量将C5水平降低到几乎不可检测的水平。所有剂量均将血清C5的降低持续到研究终止，即使是最低剂量0.3mg/kg在第28天时仍显示出约40％的抑制。
图20.ETX014的单剂量小鼠药理学。C5 mRNA表达相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
图21.ETX0014的单剂量小鼠药理学。血清C5浓度相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
ETX015(靶向C5 mRNA)T2a反向无碱基
进行一项体内小鼠药理学研究，该研究表明在高达3mg/kg的GalNAc缀合修饰siRNA ETX015的单次皮下剂量后，肝脏组织中C5 mRNA的敲低以及引起的血清C5蛋白浓度的降低。
将大约8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分入各组，每组21只小鼠。在研究的第0天，动物接受溶解在盐水(无菌0.9％氯化钠)中的0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg GalNAc-siRNA的单次皮下剂量或作为对照的仅盐水。在研究的第1天、第2天、第4天、第7天、第14天、第21天和第28天，对每组的3只小鼠实施安乐死，并采集血清和肝脏样品。
将血清储存在-80℃直至进一步分析。将肝脏样品(约50mg)用RNAlater处理并在4℃下储存过夜，然后在-80℃下储存。
使用定量实时PCR分析肝脏样品的C5 mRNA(Thermo测定ID Mm00439275_m1)和管家基因GAPDH mRNA(Thermo测定ID Mm99999915_g1)。ΔΔCt方法用于计算标准化为GAPDH并相对于盐水对照组的C5表达变化。
ETX015以剂量依赖性方式抑制C5 mRNA表达(图22)，其中3mg/kg剂量实现大于85％的C5 mRNA减少。C5表达的抑制是持久的，其中每个分子的3mg/kg剂量显示出C5mRNA的明显敲低，直到第28天研究结束。给药3mg/kg ETX015的小鼠在给药后28天仍表现出低于正常肝脏C5 mRNA水平的50％。
对于C5蛋白水平分析，使用市售的C5 ELISA试剂盒(Abcam ab264609)测量血清样品。血清C5水平是相对于匹配时间点的盐水组平均值计算的。
血清蛋白质数据支持mRNA分析(图23)。ETX015引起血清C5蛋白浓度的剂量依赖性降低。3mg/kg和1mg/kg剂量的ETX015使血清C5蛋白水平降低超过90％。最高剂量表现出对C5蛋白表达的持久抑制，其中与盐水对照相比，在研究的第28天C5减少超过70％。
图22.ETX015的单剂量小鼠药理学。C5 mRNA表达相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
图23.ETX0014的单剂量小鼠药理学。血清C5浓度相对于盐水对照组显示。每个点代表3只小鼠的平均值和标准偏差。
实例6
GalNAc-siRNA构建体ETX023和ETX024的NHP数据
ETX023(靶向TTR mRNA)T1a反向无碱基
通过量化血清转甲状腺素蛋白(TTR)蛋白水平，在非人灵长类动物(NHP)中评估ETX023药理学。1mg/kg的GalNAc缀合修饰siRNA ETX023的单次皮下剂量表明对TTR蛋白表达的持久抑制。
将雄性食蟹猴(3-5岁，2-3kg)分入各组，每组3只动物。使动物适应环境2周，并在给药前14天采血以提供基线TTR浓度。在给药前18或38天进行肝脏活检以提供基线mRNA水平。在研究的第0天，动物接受溶解在盐水(无菌0.9％氯化钠)中的1mg/kg GalNAc-siRNAETX023的单次皮下剂量。在研究的第3天、第14天、第28天、第42天、第56天、第70天和第84天，进行肝脏活检并提取RNA用于测量TTR mRNA。在研究的第1天、第3天、第7天、第14天、第28天、第42天、第56天、第70天和第84天，采集血液样品用于测量血清TTR浓度和临床血液化学分析。
预计TTR mRNA表达的抑制会导致血清TTR蛋白水平降低。通过市售的ELISA试剂盒(Abcam ab231920)测量血清TTR蛋白浓度。计算每只个体动物的作为第1天级分的TTR浓度，并将其绘制为3只动物组的平均值和标准偏差(图24)。
单次1mg/kg剂量的ETX023导致血清TTR浓度快速且显著的降低，在给药后28天达到最低点，并保持抑制直到第70天。
进一步获得数据直到第84天。使用ETX019进行相同的实验。ETX0019的图26和ETX0023的图28a中提供了84天的数据。
使用TaqMan基因表达试剂盒TTR(Thermo，测定ID Mf02799963_m1)通过实时定量PCR测量TTR mRNA。还测量了GAPDH表达(Thermo，测定ID Mf04392546_g1)以提供参考。通过DDCt方法计算每只动物标准化为GAPDH并相对于给药前水平的相对TTR表达。单次1mg/kg剂量的ETX023也引起肝脏TTR mRNA的快速且显著的降低，在给药后14天达到最低点，并保持抑制直到第84天(图28b)。
在研究期间每周一次测量动物体重。体重的波动或降低与ETX023的给药无关，并且动物在整个研究过程中继续增重(图28c)。
使用自动生化分析仪在2小时内分析血清。ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的显著增加通常用于证明肝脏毒性。ALT(图28d)或ALT(图28e)的增加与ETX023的给药无关。
ETX024(靶向TTR mRNA)T2a反向无碱基
通过量化血清转甲状腺素蛋白(TTR)蛋白水平，在非人灵长类动物(NHP)中评估ETX024药理学。1mg/kg的GalNAc缀合修饰siRNA ETX024的单次皮下剂量表明对TTR蛋白表达的持久抑制。
将雄性食蟹猴(3-5岁，2-3kg)分入各组，每组3只动物。使动物适应环境2周，并在给药前14天采血以提供基线TTR浓度。在给药前18或38天进行肝脏活检以提供基线mRNA水平。在研究的第0天，动物接受溶解在盐水(无菌0.9％氯化钠)中的1mg/kg GalNAc-siRNAETX024的单次皮下剂量。在研究的第3天、第14天、第28天、第42天、第56天、第70天和第84天，进行肝脏活检并提取RNA用于测量TTR mRNA。在研究的第1天、第3天、第7天、第14天、第28天、第42天、第56天、第70天和第84天，采集血液样品用于测量血清TTR浓度和临床血液化学分析。
预计TTR mRNA表达的抑制会导致血清TTR蛋白水平降低。通过市售的ELISA试剂盒(Abcam ab231920)测量血清TTR蛋白浓度。计算每只个体动物的作为第1天级分的TTR浓度，并将其绘制为3只动物组的平均值和标准偏差(图25)。
单次1mg/kg剂量的ETX024导致血清TTR浓度快速且显著的降低，在给药后28天达到最低点，并保持抑制直到第70天。
使用ETX024进一步获得数据直到第84天。使用ETX020进行相同的实验。ETX0020的图27和ETX0024的图29a中提供了84天的数据。
使用TaqMan基因表达试剂盒TTR(Thermo，测定ID Mf02799963_m1)通过实时定量PCR测量TTR mRNA。还测量了GAPDH表达(Thermo，测定ID Mf04392546_g1)以提供参考。通过DDCt方法计算每只动物标准化为GAPDH并相对于给药前水平的相对TTR表达。单次1mg/kg剂量的ETX024引起肝脏TTR mRNA的快速且显著的降低，在给药后14天达到最低点，并保持抑制直到第84天(图29b)。
在研究期间每周一次测量动物体重。体重的波动或降低与ETX024的给药无关，并且动物在整个研究过程中继续增重(图29c)。
使用自动生化分析仪在2小时内分析血清。ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的显著增加通常用于证明肝脏毒性。ALT(图29d)或ALT(图29e)的增加与ETX024的给药无关。
在优选的方面，本发明的化合物能够在第0天后长达至少约14天、第0天后长达至少约21天、第0天后长达至少约28天、第0天后长达至少约35天、第0天后长达至少约42天、第0天后长达至少约49天、第0天后长达至少约56天、第0天后长达至少约63天、第0天后长达至少约70天、第0天后长达至少约77天或第0天后长达至少约84天(以下称为“剂量持续时间”)的时段内将靶蛋白的血清蛋白水平降低至低于第0天的初始(起始)浓度的值。本文中提到的“第0天”是开始向患者给药本发明化合物的那一天，换言之就是剂量持续时间的开始或给药后的时间。
在优选的方面，本发明的化合物能够将靶蛋白的血清蛋白水平降低至第0天的初始(起始)浓度的至少约90％或更低的值，诸如第0天的初始(起始)浓度的至少约85％或更低、至少约80％或更低、至少约75％或更低、至少约70％或更低、至少约65％或更低、至少约60％或更低、至少约55％或更低、至少约50％或更低、至少约45％或更低、至少约40％或更低、至少约35％或更低、至少约30％或更低、至少约25％或更低、至少约20％或更低、至少约15％或更低、至少约10％或更低、至少约5％或更低。通常，此类血清蛋白抑制可以保持在第0天后长达至少约14天、第0天后长达至少约21天、第0天后长达至少约28天、第0天后长达至少约35天、第0天后长达至少约42天、第0天后长达至少约49天、第0天后长达至少约56天、第0天后长达至少约63天、第0天后长达至少约70天、第0天后长达至少约77天或第0天后长达至少约84天的时段。更优选地，在第0天后长达至少约84天的时段，血清浓度可以降低至第0天的初始(起始)浓度的至少约90％或更低的值，诸如第0天的初始(起始)浓度的至少约85％或更低、至少约80％或更低、至少约75％或更低、至少约70％或更低、至少约65％或更低、至少约60％或更低、至少约55％或更低、至少约50％或更低、至少约45％或更低、至少约40％或更低。
在优选的方面，本发明的化合物能够将靶蛋白血清蛋白水平的最大抑制实现至第0天的初始(起始)浓度的至少约50％或更低的值，诸如第0天的初始(起始)浓度的至少约45％或更低、至少约40％或更低、至少约35％或更低、至少约30％或更低、至少约25％或更低、至少约20％或更低、至少约15％或更低、至少约10％或更低、至少约5％或更低。通常，此类血清蛋白的最大抑制发生在第0天后的约第14天、第0天后的约第21天、第0天后的约第28天、第0天后的约第35天或第0天后的约第42天。更典型地，此类血清蛋白的最大抑制发生在第0天后的约第14天、第0天后的约第21天或第0天后的约第28天。
本发明的具体化合物通常可以实现靶蛋白血清蛋白水平的最大抑制％和/或在长达至少约84天的时段内的抑制％，如下：
ETX019通常可以在第0天后约7至21天，特别是在第0天后约14天，实现靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少50％抑制，和/或通常可以在第0天(如上文所述，本文中提到的“第0天”是开始向患者给药本发明化合物的那一天，并且本身表示给药后时间)后长达至少约84天的时段内维持靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少90％抑制；
ETX020通常可以在第0天后约7至21天，特别是在第0天后约14天，实现靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少30％抑制，和/或通常可以在第0天(如上文所述，本文中提到的“第0天”是开始向患者给药本发明化合物的那一天，并且本身表示给药后时间)后长达至少约84天的时段内维持靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少80％抑制；
ETX023通常可以在第0天后约7至21天，特别是在第0天后约14天，实现靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少20％抑制，和/或通常可以在第0天(如上文所述，本文中提到的“第0天”是开始向患者给药本发明化合物的那一天，并且本身表示给药后时间)后长达至少约84天的时段内维持靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少50％抑制；
ETX024通常可以在第0天后约7至21天，特别是在第0天后约14天，实现靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少20％抑制，和/或通常可以在第0天(如上文所述，本文中提到的“第0天”是开始向患者给药本发明化合物的那一天，并且本身表示给药后时间)后长达至少约84天的时段内维持靶蛋白(通常为TTR)的血清蛋白水平的至少60％抑制。
适当地，通过递送1mg/kg溶解在盐水(无菌0.9％氯化钠)中的相关活性剂(例如ETX0023或ETX0024)的单次皮下剂量在非人灵长类动物中确定血清水平的抑制。本文描述了合适的方法。应当理解，这不是限制性的，并且可以使用具有适当控制的其他合适的方法。
实例7 ETX023(靶向TTR mRNA)T1a反向无碱基
总胆红素水平在整个研究过程中保持稳定(图34)
在整个研究过程中，通过评估尿素(血尿素氮，BUN)和肌酐浓度来监测肾脏健康。在单次1mg/kg剂量的ETX023后，血尿素浓度(BUN)和肌酐水平都保持稳定并在预期范围内(图35和36)。
实例8 ETX024(靶向TTR mRNA)T2a反向无碱基
总胆红素水平在整个研究过程中保持稳定(图37)
在整个研究过程中，通过评估尿素(血尿素氮，BUN)和肌酐浓度来监测肾脏健康。在单次1mg/kg剂量的ETX024后，血尿素浓度(BUN)和肌酐水平都保持稳定并在预期范围内(图38和39)。
下面描述本发明的另一个方面，非限制性实例在下面的图40-42和实例9-18中描述。下述化合物适用于以上公开的任何方面和实施例，例如在用途、核酸长度、定义、药学上可接受的组合物、给药、抑制基因表达的方法以及治疗或预防与基因表达相关的疾病的方法方面，除非可以其他方式从本公开中立即看出。
图40A描绘了三触角GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)单元。
图40B描绘了根据本发明的一个实施例的可替代的三触角GalNAc，显示了连接基团的变化。
图41A描绘了根据本发明的三触角GalNAc缀合的siRNA，显示了连接基团的变化。
图41B描绘了一类根据本发明的一个实施例的三触角GalNAc缀合的siRNA。
图41C描绘了一类根据本发明的一个实施例的双触角GalNAc缀合的siRNA，显示了连接基团的变化。
图41D描绘了一类根据本发明的另一个实施例的双触角GalNAc缀合的siRNA，显示了连接基团的变化。
图42A描绘了根据本发明的一个实施例的三触角GalNAc缀合的siRNA的另一个实施例。
图42B描绘了图27A中所示的变体，其具有可替代的分支GalNAc缀合物。
图42C描绘了一类根据本发明的一个实施例的三触角GalNAc缀合的siRNA，显示了连接基团的变化。
图42D描绘了一类根据本发明的一个实施例的双触角GalNAc缀合的siRNA，显示了连接基团的变化。
另一方面公开了ASGP-R配体缀合的、化学修饰的RNAi试剂的形式，以及此类缀合分子的制备和使用方法。
在某些实施例中，ASGP-R配体包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。在某些实施例中，本发明提供与下式(I)的GalNAc的三触角或双触角单元缀合的siRNA：
在式I*中，n是0、1、2、3或4。在一些实施例中，乙二醇单元的数量可以在不同分支中彼此独立地变化。例如，中间分支可以具有n＝4，而侧分支可以具有n＝3等。其他实施例可仅含两个分支，如式(II-a)中所描绘的
在式II*和II*-a中，n选自0、1、2、3或4。在一些实施例中，乙二醇单元的数量可以在不同分支中彼此独立地变化。例如，一个分支可以具有n＝4或3，而其他分支可以具有n＝3或2，等等。
还可以添加额外的GalNAc分支，例如，可以使用4-、5-、6-、7-、8-、9-分支的GalNAc单元。
在相关的实施例中，分支的GalNAc可以通过添加另一个靶向部分进行化学修饰，该靶向部分例如脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、靶向(多)肽，包括多肽和蛋白质(例如，RGD肽、转铁蛋白、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、糖基化肽、生物素、去唾液酸糖蛋白胰岛素和EGF。
选项1.在进一步的实施例中，GalNAc单元可以经由系链(诸如式(III*)中所示的系链)与RNAi试剂附接：
在式III*中，m选自0、1、2、3、4或5，并且p独立于m，选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14，并且X是CH2或O。
在另外的实施例中，系链可以经由磷酸(Z＝O)或硫代磷酸基团(Z＝S)与寡核苷酸附接，如式(IV*)所示：
此类GalNAc分支单元经由特定系链附接优选在RNAi试剂有义链的3'或5'端。在一个实施例中，通过如式(V*)所示的C6氨基接头与RNAi试剂的3'附接：
该接头是如实例15所示的合成的起点。
如上所述的相同接头和系链可以与如式VI*和VII*所示的可替代的分支GalNAc结构一起使用：
类似于式II*-a，基于式VI*和VII*的配体的双触角形式可以用于本发明的组合物中。
选项2.在进一步的实施例中，GalNAc单元可以经由系链(诸如式(III*-2)中所示的系链)与RNAi试剂附接：
在式III*-2中，q选自1、2、3、4、5、6、7或8。
在另外的实施例中，系链可以经由磷酸(Z＝O)或硫代磷酸基团(Z＝S)与寡核苷酸附接，如式(IV*)所示：
此类GalNAc分支单元经由特定系链附接优选在双链RNAi试剂有义链的3'或5'端。在一个实施例中，与RNAi试剂的3'的附接如实例17所示。在一个实施例中，当GalNAc系链与3'位点附接时，系链与寡核苷酸3'端之间的过渡接头包含式(V*-a；也参见图42C)的结构，或者可以使用另一合适的接头，例如式(V*-b)所示的C6氨基接头：
另外的和/或可替代的缀合位点可以包括任何非末端核苷酸，包括糖残基、磷酸基团或核酸碱基。
相同的接头和系链可以与如式VI*-2和VII*-2所示的可替代的分支GalNAc结构一起使用：
本发明的RNAi试剂的特征及其化学修饰
在某些实施例中，缀合的寡聚化合物(本文称为RNA干扰化合物(RNAi化合物))包含两条链，每条链具有在反义链或有义链中的8至55个连接的核苷酸单体亚基(包括反向无碱基(ia)核苷酸)的序列。在某些实施例中，缀合的寡聚化合物链包含例如16至55、53、49、40、25、24、23、21、20、19、18、17或最多(约)18-25、18-23、21-23个连接的核苷酸单体亚基的序列。在某些实施例中，本发明的RNAi试剂可以具有发夹结构，其具有如上所述两条链的组合长度的单链。(通篇使用的术语“核苷酸”在上下文需要时也可以指核苷(即没有磷酸/硫代磷酸基团的核苷酸)。)
在某些实施例中，双链RNAi试剂是平端的或在一端或两端具有突出端。在一些实施例中，突出端是反义链的1-6、1-5、1-4、1-3、2-4、4、3、2或1个核苷酸(在3'端或在5'端)以及有义链的2-4、3或2或1个核苷酸(在3'端或在5'端)。在某些示例性实施例中，参见实例9，构建体9.1、9.2和9.3，RNAi试剂在反义链的3'端包含2个核苷酸突出端，并且在有义链的3'端包含2个核苷酸突出端。在某些其他示例性实施例中，参见实例10，构建体10.1和10.3；实例11，构建体11.1和11.3；和实例12，构建体12.1和12.3，RNAi试剂在反义链的3'端包含2个核苷酸突出端，并且另一端是平端。在某些其他示例性实施例中，参见实例10，构建体10.3，构建体两端都是平端。在另一个示例性实施例中，参见实例12，构建体12.2，RNAi试剂在反义链的3'端包含4个核苷酸突出端，并且另一端是平端。
在某些实施例中，利用通过使用末端帽、一个或多个反向无碱基核苷酸、一个或多个硫代磷酸键、一个或多个脱氧核苷酸(例如，D-核糖核苷酸、D-2'-脱氧核糖核苷酸或另一修饰的核苷酸)或其组合来阻止或抑制核酸酶切割的降解保护部分来修饰构建体。此类降解保护部分可以存在于未与ASGP-R配体缀合的任何一个或所有端。在某些实施例中，降解保护部分单独或作为来自由以下组成的组的任何组合选择：1-4、1-3、1-2或1个硫代磷酸键，1-4、1-3、1-2或1个脱氧核苷酸，以及1-4、1-3、1-2或1个反向无碱基核苷酸。在某些示例性实施例中，降解保护部分被配置为构建体9.1、9.2、9.3、10.1、10.2、10.3、11.1、11.2、11.3、12.1、12.2和12.3之一，如实例9-18中所示。此类示例性保护部分的构型可以与本发明的任何RNAi试剂结合使用。
在某些实施例中，有义链和/或反义链中核苷酸的全部或部分核糖被修饰。在某些实施例中，RNAi试剂中至少50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，100％)的核糖被修饰。在某些实施例中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核糖未被修饰。
在优选的实施例中，核糖修饰包括2'取代基，诸如2'-O-烷基修饰，包括2'-O-甲基和2'-脱氧氟。其他修饰是本领域已知的，包括2'-脱氧、LNA(例如，2'-O,4'-C亚甲基桥或2'-O,4'-C亚乙基桥)、2'-甲氧基乙氧基(MOE)、2'-O-(CH2)OCH3等。
在某些实施例中，许多修饰提供不同的修饰模式，例如，如实例9-18中的构建体所示，或如美国专利号7,452,987；7,528,188；8,273,866；9,150,606；和10,266,825中所述；所有这些专利都通过引用并入本文。
在一些实施例中，siRNA例如在反义链的位置11(优选)、12、13和/或有义链的位置9和10(优选)包含一个或多个热不稳定核苷酸，例如GNA、ENA等。。
另外，核酸碱基可以被修饰，例如，如美国专利号10,119,136中所述在C4位置。
一般而言，本发明的RNAi试剂针对治疗靶标，对治疗靶标的抑制将导致预防、减轻或治疗疾病，包括不希望的或病理状况。大量此类靶标在本领域中是已知的。此类靶标的非限制性实例包括：ApoC、ApoB、ALAS1、TTR、GO、C5(见实例)等。一般而言，由于ASGP-R在肝细胞表面的表达丰富，此类靶标优选在肝脏中表达，但它们也可以在其他组织或器官中表达。在优选的实施例中，靶标是人，而RNAi试剂包含与此类靶标完全或部分地互补的反义链。在某些实施例中，RNAi试剂可以包含两种或更多种化学连接的针对相同或不同靶标的RNAi试剂。
实例
实例9：使用5'-GalNAc的反向无碱基化学
在实例中描绘的所有RNAi试剂中，使用以下约定：
ia＝反向无碱基核苷酸；
m＝2'-O-甲基核苷酸；
f＝2'-脱氧-2'-氟核苷酸；
s＝硫代磷酸核苷酸间键；
Xd＝2'-脱氧-核苷酸；
～＝系链。
使用标准合成技术，合成各种形式的以下构建体，该构建体具有系链1和2并具有根据本发明的各种三触角GalNAc单元，如上文所述或图41A-42B中所示。
9.1.
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:1；下链(反义)SEQ ID NO:2)
9.2.
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:3；下链(反义)SEQ ID NO:4)
9.3.
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:5；下链(反义)SEQ ID NO:6)
实例10：使用3'-GalNAc的反向无碱基化学
使用标准合成技术，合成各种形式的以下构建体，该构建体具有根据本发明的系链1和2并具有根据本发明的各种三触角GalNAc单元，如上文所述或图41A-42B中所示。为了保持一致性，显示了与实例9相同的序列。
10.1
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:7；下链(反义)SEQ ID NO:8)
10.2
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:9；下链(反义)SEQ ID NO:10)
10.3.
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:11；下链(反义)SEQ ID NO:12)
实例11：使用具有可替代修饰模式的5'-GalNAc的反向无碱基化学
使用标准合成技术，合成各种形式的以下构建体，该构建体具有根据本发明的系链1和2并具有根据本发明的各种三触角GalNAc单元，如上文所述或图41A-42B中所示。为了保持一致性，此处显示了与实例9相同的序列。
11.1.
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:13；下链(反义)SEQ ID NO:14)
11.2
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:15；下链(反义)SEQ ID NO:16)
11.3.
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:17；下链(反义)SEQ ID NO:18)
实例12：使用具有可替代修饰模式的5'-GalNAc的反向无碱基化学
使用标准合成技术，合成各种形式的以下构建体，该构建体具有根据本发明的系链1和2并具有根据本发明的各种三触角GalNAc单元，如上文所述或图41A-42B中所示。为了保持一致性，显示了与实例9相同的序列。
12.1.
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:19；下链(反义)SEQ ID NO:20)
12.2
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:21；下链(反义)SEQ ID NO:22)
12.3
(上链(有义(ss))：SEQ ID NO:23；下链(反义)SEQ ID NO:24)
实例13：siRNA-GalNAc缀合物的基准
实例9-18中使用的构建体通过其编号引用并列于表22中。系链1和系链2分别如图41和42所示。
表22.
/>
下表23反映了用本发明的各种选择构建体完成的基准。
/>
体外药效学表征
表1中列出的8种构建体(GO1 siRNA-GalNAc、C5 siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc类似物)的体外药效学活性、结合亲和力和肝脏摄取以这些分子的临床验证版本为基准。
人肝脏细胞系(HepG2或Hep3B)转染测定--将GO1 siRNA-GalNAc、C5 siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc类似物分子中的每一个在存在转染试剂(例如RNAiMAX)的情况下在人肝脏细胞系中以10种不同浓度在37℃下孵育0小时和24小时。每个浓度的所有孵育一式四份进行。孵育后，裂解每个样品并通过bDNA或RT-qPCR测定分析HAO1 C5、TTR和管家基因(诸如GAPDH)mRNA浓度。获得的mRNA浓度数据用于分析以确定GO1siRNA-GalNAc、C5siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc分子中的每一个的沉默活性和IC50。
原代人肝细胞摄取测定--在原代人肝细胞中评估GO1 siRNA-GalNAc、C5siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc分子中的每一个的肝脏摄取和沉默活性。将GO1siRNA-GalNAc、C5 siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc类似物分子中的每一个在原代人肝细胞中以10种不同浓度在37℃下孵育0、4和72小时。每个浓度的所有孵育一式四份进行。孵育后，裂解每个样品并通过bDNA或RT-qPCR测定分析HAO1、C5、TTR和管家基因(诸如GAPDH)mRNA浓度。获得的mRNA浓度数据用于分析以确定GO1siRNA-GalNAc、C5 siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc分子中的每一个的沉默活性、摄取和IC50。
体内药效学表征
在向雄性小鼠或食蟹猴进行单次皮下施用后，将8种构建体(GO1 siRNA-GalNAc、C5 siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc类似物中的每一个)的体内药效学活性与临床验证的GO1siRNA-GalNAc、C5 siRNA-GalNAc和TTR siRNA-GalNAc分子中的每一个的体内药效学活性进行比较。
对于每种类似物的GO1 siRNA-GalNAc的体内小鼠药理学，在如下表24中提供的0.3mg/kg或3mg/kg的单次皮下剂量后进行评估。存在2个剂量组，其中每个GO1siRNA-GalNAc类似物以0.3mg/kg或1mg/kg皮下施用至C57BL/6雄性小鼠(n＝3/时间点/组)。在不同的时间点获取血液样品以获得血清样品和肝脏活检样品，以通过LCMS确定血清乙醇酸的浓度，并通过RT-qPCR或bDNA测定确定HAO1 mRNA的浓度。在每个特定时间点处死来自每组的动物并收集血液(约0.5mL/动物)和肝脏(约100mg)。对于第1至9组，在给药后24、48、96、168、336、504和672小时从3只动物/时间点/组收集血液(约0.5mL/动物)和肝脏(约100mg)。第10组(n＝3)是对照组，该组未被给药以提供血清乙醇酸和mRNA HAO1浓度的基线值。将给药后不同时间点血清乙醇酸增加和肝脏中HAO1mRNA沉默的药效学作用与第10组对照血清和肝脏样品进行比较。
表24.GO1 siRNA-GalNAc类似物小鼠药理学研究设计
/>
表格图例：
SC 皮下
NA 不适用
a 第10组动物是对照动物并且未被给药
c 第1至9组的动物在第1天给药
实例14：使用点击化学的5'缀合(选项1)
在该实施例中，寡核苷酸101的有义链在固体支持物上合成并与市售的辛炔亚磷酰胺102偶联以在固体支持物上利用点击化学前体得到所需寡核苷酸。其在经过标准切割和脱保护后提供纯寡核苷酸103。将叠氮化物104溶解在DMSO(150μL/mg)中，并将该溶液添加到在100μL水中的10OD寡核苷酸103中。然后将反应混合物在室温孵育过夜。将缀合的寡核苷酸105在Glen Gel-PakTM上脱盐以去除有机物，并通过用甲胺处理去除乙酰氧基保护基，然后进行制备型HPLC以得到纯的寡核苷酸106，将其与等摩尔量的有义链一起退火以得到最终双链体。
实例15：5'缀合(选项2)
在该实施例中，寡核苷酸101的有义链在固体支持物上合成并与市售的亚磷酰胺108偶联以在固体支持物上得到所需的寡核苷酸。其在经过标准切割和脱保护后提供纯寡核苷酸109。将胺109溶解在水(15μL/OD)中，并将该溶液添加到酸110在DMSO(100mL/mg)中的溶液中，然后添加10摩尔当量的EDC和10当量的HOBT，并且将反应混合物在室温孵育过夜。然后将缀合的寡核苷酸111在Glen Gel-PakTM上脱盐以去除有机物，并通过用甲胺处理去除乙酰氧基保护基团，然后进行制备型HPLC以得到纯的寡核苷酸112，将其与等摩尔量的有义链一起退火以得到最终双链体。
实例16：使用点击化学的5'缀合(选项1)
对于寡核苷酸构建体119的合成，采用类似的方法，其中将三触角GalNAc缀合物加载到固体支持物118(CPG)上并进行寡核苷酸合成。在切割和脱保护后，纯化提供纯寡核苷酸119，其与反义链一起退火以提供所需的纯形式的最终双链体。在另一种方法中，3'缀合物的合成也类似于116的合成，从氨基连接的寡核苷酸113开始，并在合成后缀合GalNAc羧酸以得到缀合的寡核苷酸119。
实例17：3'缀合(选项2)
对于寡核苷酸构建体119的合成，采用类似的方法，其中将三触角GalNAc缀合物加载到固体支持物118(CPG)上并进行寡核苷酸合成。在切割和脱保护后纯化提供纯寡核苷酸119，其与反义链一起退火以提供所需的纯形式的最终双链体。在另一种方法中，3'缀合物的合成也类似于116的合成，从氨基连接的寡核苷酸113开始，并在合成后缀合GalNAc羧酸以得到缀合的寡核苷酸119。
实例18：合成后缀合方法
/>
在这种方法中，3'缀合物的合成也类似于116的合成，从氨基连接的寡核苷酸113开始，并在合成后缀合GalNAc羧酸以得到缀合的寡核苷酸121，其与反义链一起退火以得到所需的纯形式的最终双链体。
先前的实例并不旨在是限制性的。根据本公开内容，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对具体材料和公开内容进行许多改变并且仍然获得相同或类似的结果。
声明
1.一种修饰的RNAi试剂，其包含经由系链与ASGP-R配体缀合的RNA干扰化合物(RNAi化合物)，其中所述系链包含：
其中m选自0、1、2、3、4或5，并且p独立于m，选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14；并且X选自O和CH2
2.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其中m＝1。
3.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其中x是O。
4.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其中p＝6。
5.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其中m＝1，p＝6，并且x是O。
6.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其中所述ASGP-R配体包含分支GalNAc。
7.根据声明6所述的修饰的RNAi试剂，其中所述分支GalNAc选自由以下项组成的组：
其中n是0、1、2、3或4。
8.根据声明7所述的修饰的RNAi试剂，其中n＝1。
9.根据声明6所述的修饰的RNAi试剂，其中所述分支GalNAc包含
或其双触角形式。
10.根据声明6所述的修饰的RNAi试剂，其中所述分支GalNAc包含或为其双触角形式。
/>
或其双触角形式。
11.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链与有义链的5'端附接。
12.根据声明11所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链如式IV*所示附接。
其中Z是P或S。
13.根据声明11所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链与有义链的3'端附接。
14.根据声明13所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链如式V*-a或V*-b所示附接：
15.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其如图41A、41B、41C或41D所示。
16.根据声明15所述的修饰的RNAi试剂，其中所述RNAi化合物包含在2'位置被修饰的修饰核糖。
17.根据声明16所述的修饰的RNAi试剂，其中所述修饰选自2'-O-甲基、2'-脱氧-氟和2'-脱氧。
18.根据声明1所述的修饰的RNAi试剂，其中RNAI化合物在未与所述ASGP-R配体缀合的任一或所有端含有一个或多个降解保护部分。
19.根据声明18所述的修饰的RNAi试剂，其中所述降解保护部分单独或作为来自由以下项组成的组的任何组合选择：1-4个硫代磷酸键，1-4个脱氧核苷酸和1-4个反向无碱基核苷酸。
20.根据声明19所述的修饰的RNAi试剂，其中所述降解保护部分选自以下构建体中的一种中存在的构型：9.1、9.2、9.3、10.1、10.2、10.3、11.1、11.2、11.3、12.1、12.2和12.3。
21.一种修饰的RNAi试剂，其包含经由系链与ASGP-R配体缀合的RNA干扰化合物(RNAi化合物)，其中所述系链包含：
其中q选自1、2、3、4、5、6、7或8。
22.根据声明21所述的修饰的RNAi试剂，其中q＝1。
23.根据声明21所述的修饰的RNAi试剂，其中所述ASGP-R配体包含分支GalNAc。
24.根据声明23所述的修饰的RNAi试剂，其中所述分支GalNAc选自由以下项组成的组：
其中n是0、1、2、3或4。
25.根据声明24所述的修饰的RNAi试剂，其中n＝1。
26.根据声明23所述的修饰的RNAi试剂，其中所述分支GalNAc包含
/>
或其双触角形式。
27.根据声明23所述的修饰的RNAi试剂，其中所述分支GalNAc包含或为其双触角形式。
或其双触角形式。
28.根据声明21所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链与有义链的5'端附接。
29.根据声明28所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链如式IV*所示附接。
其中Z是P或S。
30.根据声明28所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链与有义链的3'端附接。
31.根据声明30所述的修饰的RNAi试剂，其中所述系链如式V*-a或V*-b所示附接：
32.根据声明31所述的修饰的RNAi试剂，其如图42A、42B、42C或42D所示。
33.根据声明21所述的修饰的RNAi试剂，其中所述RNAi化合物包含在2'位置被修饰的修饰核糖。
34.根据声明33所述的修饰的RNAi试剂，其中所述修饰选自2'-O-甲基、2'脱氧-氟和2'-脱氧。
35.根据声明21所述的修饰的RNAi试剂，其中siRNA在未与所述ASGP-R配体缀合的任一或所有端含有一个或多个降解保护部分。
36.根据声明35所述的修饰的RNAi试剂，其中所述降解保护部分单独或作为来自由以下项组成的组的任何组合选择：1-4个硫代磷酸键，1-4个脱氧核苷酸和1-4个反向无碱基核苷酸。
37.根据声明36所述的修饰的RNAi试剂，其中所述降解保护部分选自以下构建体中的一种中存在的构型：9.1、9.2、9.3、10.1、10.2、10.3、11.1、11.2、11.3、12.1、12.2和12.3。
38.一种制备根据声明1或2所述的RNAi试剂的方法，所述方法显示在实例11-15中。
39.一种预防、减轻或治疗受试者疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效预防、减轻或治疗所述疾病的治疗量的根据声明1或2所述的RNAi试剂，从而预防、减轻或治疗疾病。
40.根据声明40所述的方法，其中所述受试者是人。
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序列表
<110> e-生物有限公司
<120> 含有无碱基核苷酸的核酸
<130> 169692.00050
<150> US63/271,684
<151> 2021-10-25
<150> US63/262,316
<151> 2021-10-08
<150> US63/143,805
<151> 2021-01-30
<160> 176
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 1
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 2
accugaaagu aggaccuuua uau 23
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 3
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 4
uuuucguucu auaaaaauau uau 23
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 5
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 6
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 6
cuacccuaaa guacauuggu ucu 23
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 7
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 8
accugaaagu aggaccuuua uau 23
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 9
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 10
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 10
uuuucguucu auaaaaauau uau 23
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 11
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 12
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 12
cuacccuaaa guacauuggu ucu 23
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰： 说明书末尾的序列总结
<400> 13
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 14
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 14
accugaaagu aggaccuuua uau 23
<210> 15
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 15
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
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<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 16
uuuucguucu auaaaaauau uau 23
<210> 17
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<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 17
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 18
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<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 18
cuacccuaaa guacauuggu ucu 23
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 19
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 20
<211> 23
<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 20
accugaaagu aggaccuuua uau 23
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 21
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
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<212> RNA
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<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 22
uuuucguucu auaaaaauau uau 23
<210> 23
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<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 23
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 24
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 24
cuacccuaaa guacauuggu ucu 23
<210> 25
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 25
gacuuucauc cuggaaauau a 21
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<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 26
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 27
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<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 27
gacuuucauc cuggaaauau a 21
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<211> 23
<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 28
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 29
<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 29
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 30
<211> 23
<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 30
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 31
<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 31
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 32
<211> 23
<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 32
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 33
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 34
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 34
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 35
ugggauuuca uguaaccaag a 21
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 36
ucuugguuac augaaauccc auc 23
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<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 37
cuuacgcuga guacuucga 19
<210> 38
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 38
ucgaaguacu cagcguaag 19
<210> 39
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 39
agauaugcac acacacgga 19
<210> 40
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 40
uccgugugug ugcauaucu 19
<210> 41
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 41
ucucguggcc uuaaugaaa 19
<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 42
uuucauuaag gccacgagau u 21
<210> 43
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 43
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 44
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 45
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 45
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 46
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 46
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 47
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 48
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 49
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 49
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 50
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 51
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 51
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 52
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 53
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 54
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 55
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 55
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 56
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 56
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 57
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 57
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 58
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 58
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 59
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 59
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 60
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 61
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 61
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 62
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 63
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 63
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 64
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 64
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 65
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 65
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 66
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 66
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 67
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<212> RNA
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<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 67
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 68
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 68
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 69
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 69
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 70
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 70
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 71
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 71
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 72
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 72
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 73
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 73
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 74
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 74
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 75
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 75
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 76
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 76
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 77
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 77
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 78
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 78
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 79
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 79
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 80
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 80
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 81
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 81
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 82
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 82
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 83
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 83
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 84
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 84
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 85
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 85
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 86
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 86
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 87
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 87
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 88
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 88
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 89
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 89
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 90
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 90
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 91
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 91
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 92
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 92
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 93
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 93
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 94
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 94
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 95
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 95
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 96
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 96
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 97
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 97
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 98
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 98
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 99
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 99
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 100
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 100
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 101
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 101
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 102
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 103
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 103
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 104
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 104
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 105
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 105
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 106
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 106
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 107
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 107
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 108
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 108
cuuacgcuga guacuucga 19
<210> 109
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 109
ucgaaguacu cagcguaag 19
<210> 110
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 110
agauaugcac acacacgga 19
<210> 111
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 111
uccgugugug ugcauaucu 19
<210> 112
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 112
ucucguggcc uuaaugaaa 19
<210> 113
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 113
uuucauuaag gccacgagau u 21
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 114
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 115
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 115
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 116
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 116
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 117
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 117
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 118
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 118
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 119
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 119
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 120
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 120
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 121
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 121
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 122
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 123
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 123
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 124
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 124
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 125
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 125
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 126
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 126
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 127
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 127
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 128
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 128
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 129
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 129
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 130
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 130
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 131
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 131
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 132
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 132
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 133
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 133
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 134
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 134
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 135
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 135
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 136
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 136
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 137
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 137
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 138
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 138
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 139
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 139
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 140
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 140
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 141
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 141
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 142
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 142
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 143
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 143
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 144
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 144
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 145
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 145
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 146
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 146
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 147
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 147
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 148
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 148
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 149
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 149
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 150
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 150
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 151
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 151
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 152
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 152
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 153
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 153
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 154
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 154
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 155
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 155
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 156
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 156
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 157
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 157
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 158
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 158
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 159
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 159
gacuuucauc cuggaaauau a 21
<210> 160
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 160
uauauuucca ggaugaaagu cca 23
<210> 161
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 161
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 162
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 162
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 163
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 163
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 164
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 164
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 165
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 165
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 166
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 166
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 167
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 167
aagcaagaua uuuuuauaau a 21
<210> 168
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 168
uauuauaaaa auaucuugcu uuu 23
<210> 169
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 169
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 170
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 170
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 171
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 171
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 172
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 172
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 173
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 173
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 174
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 174
ucuugguuac augaaauccc auc 23
<210> 175
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 175
ugggauuuca uguaaccaag a 21
<210> 176
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<220>
<223> 修饰的_碱基，根据表A修饰：说明书末尾的序列总结
<400> 176
ucuugguuac augaaauccc auc 23
Claims (48)
1.一种用于抑制细胞中靶基因的表达的核酸，任选地是RNA，其包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和与所述第一链至少部分地互补的第二链的至少一部分，其中所述第一链与从待抑制的所述靶基因转录的RNA的至少一部分至少部分地互补，
其中所述第二链包含在所述第二链的末端区域中的一个或多个无碱基核苷酸，并且其中所述无碱基核苷酸通过反向核苷酸间键与相邻核苷酸连接。
2.根据权利要求1所述的核酸，其中所述第二链包含：
i所述第二链的末端区域中的2个或超过2个无碱基核苷酸；和/或
ii所述第二链的5'或3'末端区域中的2个或超过2个无碱基核苷酸；和/或
iii所述第二链的5'或3'末端区域中的2个或超过2个无碱基核苷酸，其中所述无碱基核苷酸存在于如本文所述的突出端中；和/或
iv所述第二链的末端区域中的2个或超过2个连续无碱基核苷酸，其中优选地一个此类无碱基核苷酸是末端核苷酸；和/或
v所述第二链的5'或3'末端区域中的2个或超过2个连续无碱基核苷酸，其中优选地，一个此类无碱基核苷酸是所述第二链的5'或3'末端区域中的末端核苷酸；和/或
vi反向核苷酸间键，其将所述第二链的末端区域中的至少一个无碱基核苷酸与相邻碱基核苷酸连接；和/或
vii反向核苷酸间键，其将所述第二链的5'或3'末端区域中的至少一个无碱基核苷酸与相邻碱基核苷酸连接；和/或
viii作为倒数第二个核苷酸的无碱基核苷酸，其经由反向键与不是所述末端核苷酸的核苷酸(本文称为倒数第三个核苷酸)连接；和/或
ix在朝向末端的方向读取所述链时，作为经由5'-3'键而连接的2个末端核苷酸的无碱基核苷酸；
x在朝向包含所述末端核苷酸的末端的方向读取所述链时，作为经由3'-5'键而连接的2个末端核苷酸的无碱基核苷酸；
xi作为末端2个位置的无碱基核苷酸，其中所述倒数第二个核苷酸经由所述反向键与所述倒数第三个核苷酸连接，并且其中所述反向键是5-5'反向键或3'-3'反向键；
xii作为末端2个位置的无碱基核苷酸，其中所述倒数第二个核苷酸经由所述反向键与所述倒数第三个核苷酸连接，并且其中
(1)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的末端读取时，所述反向键是5-5'反向键并且所述末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的键是3'5'；或者
(2)当朝向包含末端和倒数第二个无碱基核苷酸的末端读取时，所述反向键是3-3'反向键并且所述末端与倒数第二个无碱基核苷酸之间的键是5'3'。
3.根据权利要求1或2所述的核酸，其中所述反向核苷酸间键是3'3反向键。
4.根据权利要求3所述的核酸，其中所述反向核苷酸间键位于远离所述第二链的5'末端区域的末端区域，或位于远离所述第二链的3'末端区域的末端区域。
5.根据权利要求1或2所述的核酸，其中所述反向核苷酸间键是5'5反向键。
6.根据权利要求5所述的核酸，其中所述反向核苷酸间键位于远离所述第二链的5'末端区域的末端区域，或位于远离所述第二链的3'末端区域的末端区域。
7.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中
i)所述核酸的所述第一链的长度在15至30个核苷酸范围内，优选19至25个核苷酸，更优选23或25个核苷酸；且/或
ii)所述核酸的所述第二链的长度在15至30个核苷酸范围内，优选19至25个核苷酸，更优选23个核苷酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中在所述第一链和/或所述第二链上的一个或多个核苷酸被修饰以形成经修饰的核苷酸。
9.根据权利要求8所述的核酸，其中修饰是在核糖糖的2'-OH基团处的修饰，任选地选自2'-Me或2'-F修饰。
10.根据权利要求9所述的核酸，其中所述第一链包含在从所述第二链的位置1开始计数的位置14、位置2、位置6或其任何组合中的任一个处的2'-F。
11.根据权利要求9或10所述的核酸，其中所述第二链包含在从所述第二链的位置1开始计数的位置7和/或9和/或11和/或13处的2'-F修饰。
12.根据权利要求9至11所述的核酸，其中所述第一链和所述第二链各自包含2'-Me和2'-F修饰。
13.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含至少一个热去稳定化修饰，其合适地在所述第一链的位置1至9中的一个或多个处，和/或所述第二链上与所述第一链的位置1至9对齐的位置中的一个或多个处，其中所述去稳定化修饰选自修饰的未锁核酸(IMUNA)和乙二醇核酸(GNA)，优选乙二醇核酸。
14.根据权利要求13所述的核酸，其是双链分子，优选双链RNA，其解链温度在约40℃至80℃的范围内。
15.根据权利要求14或15所述的核酸，其包含在所述第一链的位置7处的至少一个热去稳定化修饰。
16.根据权利要求9至15中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含从所述第二链的位置1开始计数的在所述第二链的位置7至13处的3个或更多个2'-F修饰，诸如在所述第二链的位置7至13处的4、5、6或7个2'-F修饰
17.根据权利要求9至16中任一项所述的核酸，其中所述第二链包含从所述第二链的位置1开始计数的在所述第二链的位置1至6处的至少3个，诸如4、5或6个2'-Me修饰。
18.根据权利要求9至17中任一项所述的核酸，其中所述第一链包含在3'末端区域处的至少5个2'-Me连续修饰，优选包括在所述3'末端区域处的末端核苷酸，或至少在距离所述3'末端区域处的末端核苷酸1或2个核苷酸内。
19.根据权利要求18所述的核酸，其中所述第一链包含在所述3'末端区域处的7个2'-Me连续修饰，优选包括在所述3'末端区域处的末端核苷酸。
20.根据权利要求9至19中任一项所述的核酸，其中所述第二链包括以下修饰模式：
NA–(N)3-5–NB
其中N表示具有第一修饰的核苷酸；
NA表示具有不同于N的所述第一修饰的第二修饰的核苷酸；
NB表示具有不同于N的所述第一修饰但与NA的所述第二修饰相同或不同的第三修饰的核苷酸；且
其中所述模式具有沿所述第二链的5'至3'方向性。
21.根据权利要求20所述的核酸，其中所述第二链包括以下修饰模式：
NA–(N)3–NB。
22.根据权利要求20所述的核酸，其中所述第二链包括以下修饰模式：
NA–(N)5–NB。
23.根据权利要求21所述的核酸，其中所述第二链包括以下修饰模式：
Me–(F)3–Me。
24.根据权利要求22所述的核酸，其中所述第二链包括以下修饰模式：
Me–(F)5–Me。
25.根据权利要求20所述的核酸，其中所述第二链包括以下修饰模式：
NC–NA–(N)3-5–NB–ND
其中NC和ND可以相同或不同，分别表示多个5'和3'末端区域化学修饰的核苷酸，其中至少NC包含至少两个不同修饰的核苷酸。
26.根据权利要求25所述的核酸，其中ND包含至少两个不同修饰的核苷酸，或各自具有相同修饰，优选2'-Me连续修饰的多个核苷酸。
27.根据权利要求26所述的核酸，其中所述第二链包括以下修饰模式：
5'A-A-Me-Me-Me-Me-Me-Me-F-Me-F-F-F-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me 3'
其中A表示无碱基修饰。
28.根据权利要求26所述的核酸，其中所述第二链包括以下修饰模式：
5'A-A-Me-Me-F-Me-F-Me-F-Me-F-F-F-Me-F-Me-Me-F-Me-F-Me-Me-Me 3'
其中A表示无碱基修饰。
29.根据权利要求26所述的核酸，其中所述第二链包括以下修饰模式：
5'Me-Me-Me-Me-Me-Me-F-Me-F-F-F-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-A-A 3'
其中A表示无碱基修饰。
30.根据权利要求26所述的核酸，其中所述第二链包括以下修饰模式：
5'Me-Me-F-Me-F-Me-F-Me-F-F-F-Me-F-Me-Me-F-Me-F-Me-Me-Me-A-A 3'
其中A表示无碱基修饰。
31.根据权利要求9至30中任一项所述的核酸，其中所述第一链包括以下修饰模式：
MA–(M)3-5–MB
其中M表示具有第一修饰的核苷酸并且其中通常(M)3-5与如权利要求20所定义的所述第二链中的(N)3-5基本对齐；
MA表示具有不同于M的所述第一修饰的第二修饰的核苷酸；
MB表示具有不同于M的所述第一修饰但与MA的所述第二修饰相同或不同的第三修饰的核苷酸。
32.根据权利要求31所述的核酸，其中所述第一链包括以下修饰模式：
MA–(M)3–MB。
33.根据权利要求31所述的核酸，其中所述第一链包括以下修饰模式：
MA–(M)4–MB。
34.根据权利要求31所述的核酸，其中所述第一链包括以下修饰模式：
MA–(M)5–MB。
35.根据权利要求32所述的核酸，其中所述第一链包括以下修饰模式：
F–(Me)3–F。
36.根据权利要求33所述的核酸，其中所述第一链包括以下修饰模式：
F–(Me)4–F。
37.根据权利要求34所述的核酸，其中所述第一链包括以下修饰模式：
F–(Me)5–F。
38.根据权利要求31所述的核酸，其中所述第一链包括以下修饰模式：
MC–MA–(M)3-5–MB–MD
其中MC和MD可以相同或不同，分别表示多个5'和3'末端区域化学修饰的核苷酸，各自包含至少两个不同修饰的核苷酸。
39.根据权利要求38所述的核酸，其中所述第一链包括以下修饰模式：
3'Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-F-Me-F-Me-Me-Me-Me-F-F-Me-F-Me-Me-Me-F-Me 5'。
40.根据权利要求38所述的核酸，其中所述第一链包括以下修饰模式：
3'H-H-Me-Me-Me-Me-Me-F-Me-F-Me-F-Me-Me-Me-F-Me-F-Me-Me-F-Me-F-F-Me 5'。
41.根据权利要求38所述的核酸，其中所述第一链包括以下修饰模式：
3'Me-Me-Me-Me-Me-Me-Me-F-Me-F-Me-Me-Me-Me-F-Me-Me-F-Me-Me-Me-F-Me 5'。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的核酸，其进一步包含分别在所述第二链的5'或3'近末端区域中的至少三个连续位置之间的硫代磷酸核苷酸间键，由此所述近末端区域优选地邻近所述第二链的所述一个或多个无碱基核苷酸位于其中的所述末端区域。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的核酸，其进一步包含分别在所述第一链的5'和/或3'末端区域中的至少三个连续位置之间的硫代磷酸核苷酸间键，由此优选地在所述第一链的5'和/或3'末端区域处的末端位置通过硫代磷酸核苷酸间键与其相邻位置附接。
44.一种用于抑制细胞中靶基因的表达的缀合物，所述缀合物包含核酸部分和一个或多个配体部分，所述核酸部分包含根据权利要求1至43中任一项所述的核酸。
45.根据权利要求44所述的缀合物，其中所述核酸的所述第二链直接或间接与所述一个或多个配体部分缀合，其中所述配体部分通常存在于所述第二链的末端区域，优选在其3'末端区域处。
46.根据权利要求44或45所述的缀合物，其中所述配体部分包含
i)一个或多个GalNAc配体；和/或
ii)一个或多个GalNAc配体衍生物；和/或
iii)一个或多个通过接头与所述核酸缀合的GalNAc配体。
47.根据权利要求46所述的缀合物，其中所述GalNAc配体直接或间接与所述核酸的所述第二链的5'或3'末端区域，优选在其3'末端区域处缀合。
48.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至43中任一项所述的核酸或根据权利要求44至47中任一项所述的缀合物以及生理上可接受的赋形剂。
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