WO1988003149A1 - Process for synthesizing oligonucleotides and compounds for forming high-molecular protective group - Google Patents

Description

明 柳 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド の合成法 および高分子保護基形成用化合物

〔技術分野〕

本発明は、 ヌク レオチ ドまたはオ リ ゴヌク レオチ ドを縮合 させ、 核酸内結合様式に従って鎖長が延長されたオリ ゴヌク レオチ ドを合成する方法に関するものである。 さらに詳し く は、 高分子量の保護基を導入したヌク レオチ ドまたはオリ ゴ ヌク レオチ ドを縮合することにより、 縮合反応を均一系で且 つ分離精製を不均一系でそれぞれ行う ことを可能にし、 しか も、 高純度の生成物を高い時空収率で得ることを可能にした- 鎖長延長されたオリ ゴヌク レオチ ドの合成法に閩するもので ある。

本発明は、 さらに、 上記オ リ ゴヌク レオチ ドの合成および 核酸、 オリ ゴ糖、 多糖類などの合成に有用な高分子保護基形 成のための化合物に関するものである。

〔背景技術〕

核酸はヌク レオチ ドの耱成分の特定部位の水酸基がリ ン酸 ジエステル基を経由して多数連結した構造、 即ち,、 ヌク レオ チ ドのアルコール水酸基とリ ン酸基が逐次エステル結合して 連結した構造をとつている。 従って、 2 つのヌク レオチ ドを 核酸内結合様式に従って縮合させるには、 次の 2方式が考え られる。

(a) 3 ' またば 2 ' ^r; ン酸基と 5 ' 水酸基とを縮合する方 法

(b) 3 ' または 2 ' 水酸基と 5 ' ン酸基とを縮合する方 法

び ン酸基がバルキーであること、 5 ' 水酸基が 1級アルコー ルで比較的自由度があるのに 3 ' 及び 2 ' 水酸基ば 2級アル コ一ルで且つ互いに近接していることなどの理由により、 上 記 2法のうちでは （a)法が有利である。

(a)法においても、 縮合反応の形式により、 ジエステル法 ト リエステル法、 ホスファイ ト法、 H —ホスホナ一 ト法など があるが、 反 収率、 中間体の安定性、 反応速度、 生成物精 製の難易などから、 トリエステル法およびホスフアイ ト法が 比較的すぐれた方法と考えられている。

ト リエステル法の反応は下記 （1)式で表わすことができる, 縮合剤

式（1) において、 および B _z はァ ミノ基が保護された塩 基成分、 ば水酸基の保護基、 R ₂ および R ₄ はデォキシ リ ボヌク レオチ ドにあっては水素て'あり、 リ ボヌク レオチ ド にあっては保護された水酸基であり、 R ₃ および R ₅ はリ ン 酸基の保護基である。 .

上記 ト リヱステル生成反応の後、 官能基の保護基を除去し て目的物を得るが、 反応生成物、 未反応物および副生物は一 般に溶解度などに大きな差がないため、 それらの分離精製は 必ずしも容易でない。

官能基の保護基を形成する化合物として高分子量の化合物 を用いることにより、 反応生成物間の物性に差を生ぜしめ、 分離精製を容易にする手法がい く つか提案されている。 特に、 上記高分子量の保護基を有する化合物が反応条件で固体であ るか、 反応後固体として得られるものであれば濾別、 洗滌に より容易に分離回収するこ とができる.。

高分子保護基の結合部位としては式（1) における R ₅ を形 成するものが考えられており、 R s と して架橋ポリ スチレン やシ リ カゲルに官能基を結合させたものを用いた例が報告さ れている（V.A.Efimov et al, Nucleic Acid Res. ,11, 8369 (1983)) 。 末端リ ン酸基をこれらの高分子保護基と結会させ たォ ゴヌク レオチ ドば固体であり、 所請固栢法と呼ばれる 一連の技術を構成する。 これとは対照的に、 （1)式の縮合反 応を埒一溶液中で行う方法を液相法と呼んでいる。 高分子保 護基を形成する化合物として、 ボリ ビュルアルコ ール （H. Scott et al.Makromolekular C emie 173 ,247(1973〉、 ボひ エチレングリ コ一スレ（H.K5sler,Tetrahedroa Letters, Να16, 1535(1972)) 、 ポ スチレン（H.HayatsLi' li.G.K&orana, J. Am. Chera. Soc. _s 88 » 3182 (1966) ) . ビュルアルコ ール/ボリ ビニル ピロ リ ドンコボ I； — (H.Seliger.G.Aumann. Tetrahedron Letters, Να 31 , 2911 (1973 ))などがジエステル法において提 案されている これらの溶媒溶解性の高分子を用いた場合ば 液相法の範ちゆ うに入ることになるが、 この場合も反応生虎 物の分離精製ば容易でない。

〔発明の開示〕

本発明の百的ば、 百的生成物の分離精製を容易に行う こと ができ、 且つ高純度の目的生成物を高収率で得ることのでき る トリヱステル法または *スフアイ ト法による鎖長延長され たオリ ゴヌク レオチ ドの合成方法を提供するにある。

本発明は、 （a) 末端 5 ' 水酸基のみがプロックされておら ず、 他の官能基が複数の低分子保護基と 1つの多糖類誘導体 保護基でブロックされているモノヌク レオチド、 オリゴヌク レオチド、 モノヌクレオシドサクシナー トまたばオリゴヌク レオチ ドサクシナー ト と、 （b) 末端リ ン酸基を除く その他の 官能基が低分子保護基でプロ ックされたモノ またはオリ ゴヌ ク レオチ ドとを共通の溶媒中均一系で縮合させることを特徴 とする鎖長延長されたォリ ゴヌク レオチ ドの合成法を提供す る。

本発明は、 さ らに、 多糖類誘導体保護基形成のための下記 一般式 （ I ) で表わされる化合物を提供する。

0

II 八

C (H0CH₂CH₂S- O VCHzCHz -C-0) _x (0C CH₂)₃-x-y(0R)_yC₆H₇O₂)n ( I )

0 0 0

但し、 C₆H ₇0₂は無 グルコ ース残基であり、

Rは CH₃C— , C₂H₅C—または C₃H₇C—であり、

II II - II

0 0 0 nは 10〜2000の数であり、

X は 0. 4 〜 0. 8 の数であり、

y は 1. 0 〜 2. 0の数である。

〔図面の簡単な説明〕

第 1図ば、 本発明の実施例 （例 9 ) で得た、 完全に脱保護 基を行ったオ リ ゴヌク レオチ ド（BNA型ゥ ンデカマー） の逆相 高速液体ク ロマ トグラフ ィ によるク ロマ トグラムである。 第 2図は、 第 1 図のオ リ ゴヌ ク レオチ ドの精製品を再度ク ロマ トグラフィ にかけて得たク ロマ トグラムである。

第 3図は、 本発明の実施例 （例 1 5 ) で得た、 完全に脱保 護基を行ったオリ ゴヌク レオチ ド（DNA型ォクタマ一） の逆相 高速液体ク ロマ トグラフィによるク ロマ トグラムである。

第 4図は、 第 3図のオリ ゴヌク レオチ ドの精製品を再度ク ロマ トグラフィ にかけて得たクロマ トグラムである。 〔発明を実施するための最良の形態〕

本発明に使用する、 多糖類誘導体保護基を形成する化合物 ば、 オリ ゴヌク レオチ ド及び低分子保護基でプロ ック したォ リ ゴヌク レオチ ドと共通の溶媒に可溶であり、 この共通溶媒 の溶液に非溶剤を混合することにより容易に沈緵分離させる ことが可能なものである。

本発明の目的に好適な多糖類誘導体保護基形成用化合物ば- 多糖類から誘導することができるが、 特に、 低ァセチル化度 のァセチルセルロース、 またはァセチルセゾレロースとプロビ ォニルセルロースとのセルロース混合エステルおよびァセチ ルセルロースとブチリルセルロースとのセルロース'混合エス テルなどを出発原料とするものが有用である。 多糖類誘導体. 例えば、 ァセチルセルロースを修飾して保護基形成用化合物 とするためには、 リ ン酸基ブロ ック用官能基としてヒ ドロキ シスルホニル基を導入することが好ま しい。 ヒ ド σキシスル ホ二ル基の一 0 Ηグループはホスフエ一 トエステル生成によ り リ ン酸基をプロフクする。

多糖類誘導体保護基形成用化合物の骨格は、 ヌク レオチ ド のようなパルキーな化合物との反応においてそれ自身が立体 障害を構成するので、 ヒ ドロキシスルホニル基に充分な反応 性を与えるためには高分子主鎮と官能基が或る距離を隔てて いることが必要である。 即ち、 本発明の方法に好適な多糖類 誘導休保護基形成用化合物は、 例えば、 4 一 （ 2 _ ヒ ドロキ シェチルスルホニル） ジヒ ド ロ シ ンナモ イ ル基が主鎖の水酸 基との間でエステル結合している ァセチルセル口 ース誘導体 である。 この化合物の出発原料として好ましい置換度 1. 7 〜 1. 8程度のァセチルセルロ ースは、 エステル生成反応に関与 する水酸基の数が多いこと、 及び溶解性の良く多 く の極性溶 媒に可溶であるという特徴をもつ。

上記ァセチルセルロ ース誘導体の合成反応は、 次式（2〉 お よび（3) に従って説明される。

iPr_zEtN

MllTrOCHzCHzC OH + HCJ2

式（2) において、 MMTrはモノ メ トキシ ト リ チル基である。 式（2) はエチ レ ンク ロルヒ ド リ ンのモノ メ ト キ シ ト リ チル エーテル 〈 1 〉 と 4 — メ ルカブ トジヒ ドロ桂皮酸 〈 2 〉 との 脱塩酸縮合反応による 4 — ( 2 —モノ メ トキシ ト リ チルォキ シェチルチオ） ジヒ ドロ桂皮酸 〈 3 〉 の合戒を示している。 { 3 ) +ァセチルセルロ ース

Tps, 1 - Meim Ac₂0 H_z0₂, Na₂W0₄- ZnBr₂

ピ リ ジン ピリ ジ ン 0

II

•HOCHzCHzS O — CHzCHzC - O

I!

0 < 4 > 0

一 〔ァセチルセル口ース〕

( 3 > 式（3) において Tps は 2 , 4ノ 6 — ト リ イ ソブ π ピルベン ゼンスルホユルク 口ライ ド、 1 — Me imは 1 ーメチルイ ミダゾ -ルである。

式（3〉 ば、 4 一 （ 2 —モノ メ トキシ ト リ チルォキシェチル チォ） ジヒ ドロ桂皮酸 〈 3 〉 とァセチルセルロースを ί—メ チルイ ミダゾールを触媒とし、 2 , 4 , 6 - リ ィ ？プロピ ルベンゼンスルホニルクロライ ドを縮合剤としてエステル縮 合させ、 次いで、 ァセチルセルロース中の未反応水酸基を無 水酢酸でエステル化し、 さ らに、 過酸化水素とタ ンダステン 酸ナ ト リゥムを用いて酸化して分子中にスルホ二ル基を導入 し、 しかる後臭化亜鉛を用いてモノ メ トキシ ト リチル基を脱 離させ、 高分子で支持されたプロ ック用化合物 く 4 )を合成 する反応を示している。 〈 4 〉 は 4 — ( 2 —匕 ドロキシェチ ルスルホニル） ジヒ ドロ シンナモイル基を有するァセチルセ ルロース誘導体であつて、 このものはビリ ジンに可溶である < 以下簡明のため、 モノ ヌク レオチ ドとモノヌク レオチ ドの 縮合反応を例にとって說明するが、 この手法は、 いずれか一 方または両方がォリゴヌク レオチドである本発明-の方法に適 用する ことができる。 即ち、 化合物 く 4 〉を 1つのリ ン酸基 を除く官能基がブロ ックされているヌク レオチ ド、 例えば 5 一 O —ジメ トキシ ト リ チルー 2 ' - 0 —テ ト ラ ヒ ドロ ビラ二 ルリ ボヌ ク レオシ ド 3 ' — （ 2 —ク ロロフヱニル） ホスフヱ ー ト 〈 5 〉 と反応させ、 リ ン酸基をブロ ックする。

Ac₂0 2 ¾TsOH · H₂0 ビリジン CHC ₃ /MeOH

/

OPh

ス）

式（4) において、 DMTrはジメ トキ シ ト リ チル基、 Thp はテ ト ラ ヒ ドロビラ二ル基、 PhC は 2 —ク ロルフエ二ル基、

TsOHは ρ ― トノレエ ンスルホン酸である。

〈 4 > と 〈 5 〉 の縮合反応液に冷水を加えて反応を停止し メ チレンク ロライ ドで抽出すると反応生成物はメ チレンク ロ ライ ド層に移る。 〈 4 >中の反応に関与しなかったヒ ドロキ シェチルの水酸基をァセチル基でブロ ック した後 P — トルェ ンスルホン酸を加えて、 ジメ トキシ ト リチル基を遊離させ、 反応液を非溶剤、 この場合メ タノ ールに加えると く 6 〉が沈 穀として得られる。 ( 6 〉 ば多糖類誘導体保護基でブロック されたモノヌク レオチ ドである。

然る後 （ 5 〉 と く 6 》 とを縮合させると 2偭のヌクレオチ ドがリ ン酸ト リ エステルで結合し、 末端リ ン酸基が高分子保 護基でブロックされた化合物 （ 7 >が得られる。

(5>

0~ (ァセチ!瞻 -ス)

CH2CH2C 一 0 "(ァセチ セ) -ス）

0

0? C&

〈 7 〉 の末端リ ン酸基をブロ ッ クする多糖類誘導体保護基を

脱離させ、 生成物を分離すれば目的とするジヌク レオチ ド誘

導体 〈 8 〉を得る。 この場合の脱離反応は β脱離反応であり、 末端ォ レフィ ンを有するァセチルセル口ース誘導体 〈 9 〉が

生成する。 〈 9 > は反応液をヱタノ一ルに注ぐことにより沈

降し、 〈 8 〉 と容易に分離することができる。 〈 8 > と未反

応ヌク レオチ ドなどの分離は逆相ク ロマ トグラフ ィ —によつ

て行う。

上記のようにして合成したオリ ゴヌク レオチ ドは、 保護基

を結合させたままさ らに鎮長延長の反応原料として使用する。

一方保護基を結合させたままのオ リ ゴヌク レオチ ドから、 ォ

リ ゴヌク レオチ ドを得るには次のようにして保護基を脱離さ

せる。 先ず 0. 5 Μ 2 — ビリ ジンアル ドォキシメ ー ト ー 0. 5 Μ

1 ， 1 , 3 , 3 —テ ト ラメ チルダァニジンノビリ ジン一水

( 9 : 1 Vノ V ) 中室温で 1 6時間処理し、 リ ン酸基の保護 基である 2 -クロコフヱ二ル基を除去する。 つづいて、 アン モニァ水 （28〜30 % ) で 5 0 でにて 5時間処理して塩基部の ァミノ基の保護基を除去する。

さらに、 pH 2水溶液で室温、 1 日間処理して 5 ' 一水酸基 の保護基であるジメ トキシ ト チル基、 及び 2 ' —水酸基の 保護基であるテトラヒ ドロビラ二ル基を除去する。

以上により、 保護基が完全に除去されたオリゴヌク レオチ ドを得る。

本発明の方法によれば、 ヌク レオチ ド 2量体からヌク レオ チ ド多量体 （例えば、 2 0 体） に亘る範囲の任意のオリ ゴ ヌク レオチ ドを得ることができる。 すなわち、 モノォ ¹ /ゴヌ クレオチ ドから出発してォリゴヌク レオチ ドを得、 このォリ ゴヌク レオチドとモノまたはォリゴヌク レオチ ドとの縮令に よってより高分子量のォぴゴヌク レオチ ドを得、 この手法を 缲返すことによって任意の多量体に到達することができる。

なお、 鎮長延長されたォリゴヌク レオチ ドの合成をト リ ェ ステル法について詳述したが、 本発明の方法ば 、スフア イ ト 法についても同様に適用可能である。

生理活性物質として重要な多糖類、 オリ ゴ糖類、 核酸など は、 一般に少数の種類の単糖類や塩基などが或る規則性をも つて縮合したものであり、 それらの純合成は化学の重要な命 題であるが、 なお未解決の問題を多く抱えている。 これらの 合成における問題の多く ば、 多官能基を有する構成成分を所 望の結合様式に導く反 ¾のみを選択的に行う ことが函難なこ とにある。 加えて、 反応原料、 生成物、 副生物などの間に大 きな物性の差がないので、 目的の反応が行われても、 目的物 の分離精製が甚だ困難である。 上述の理由により、 構成成分 のそれぞれの官能基を選択的に保護し、 またその解除を行う 技術は、 多糖、 オリ ゴ糖、 核酸などの合成や分析に重要な手 段を提供する ものである。

本発明の特徴は、 ヌク レオチ ドの末端リ ン酸基の保護基が 溶剤可溶性で且つ沈殺分離が容易な高分子化合物から形成さ れるものであって、 縮合反応は均一液相で行われ、 生成物は 固液分離が可能である。

本発明の特徵を従来の方法と対比して以下に説明する。

I ) 液相法との比較

従来の液相法の要点を下記 （6)式および （7)式に示す。

R,0

(6)式において R ₆ = — Hまたは— O R ⁷ R a = 0 R または— NHR ⁹

O R₃

1)β₈基の除去

2〉 シリカケ

ク πマトグラフ -

液相法即ち、 低分子量保護基のみを用いる方法では、 各反応 工程ごとに生成物を力ラムクロマ トグラフィ 一によつて精製 する必要がある。 これに対し、 本発明の方法は、 生成物が高 分子誘導体として非溶剤で沈鏺させ、 容易且つ迅速に精製が 行える点、 ならびに高分子と結合していない反応原料を過剰 に使用し、 且つ過剰分を高純度で回収できる点で有利である. I ) 固相法との比較

徒来の固栢法ではすべての反応が不均一系となる。 従って 固枏担持体に対する担持量、 即ち、 反応原料の結合量が小さ い。 従来、 担持量が多いといわれている 1 〜 2 %ジビュルべ ンゼン架橋ボリ スチレン樹脂の場合でもヌク レオチ ドまたは ヌク レオチ ドの担持量は 0. 1 〜0.4mraojg /g である。 これに 対し、 本発明に用いたァチセルセルロースの場合、 スぺーサ 一の導入量が 1.65〜： 1.97 mmo£ /g であり且つヌク レオチ ド を導入する縮合反応がほぼ定量的に進行することから、 多量 のヌク レオチ ドを担持することができる。 また、 従来の固相 法では、 不均一系反応であるため、 縮合剤、 ヌク レオチ ドま たはオ リ ゴヌク レオチ ド 3 ' — リ ン酸ジエステル誘導体を大' 過剰に使用する必要があつたが、 本発明の方法は縮合反応は 均一系で行うため原料使用量が少くて良く 、 時空収率が大き いという特徴がある。 本発明の具体例においては、 多糖類誘 導体保護基を形成する化合物の出発原料として低酢化度（D.S. = 1. 7 〜 1. 8 ) のァセチルセルロースを用いたが、 低酢化度 のァセチルセルロースは水酸基を多数有するこ と、 ピリ ジン、 ピリ ジン /水などに溶解すること、 反応に関与しない水酸基 は容易にブロ ッ クできる こ と、 適当な非溶荊があるこ となど が有利な条件と考えられる。

本発明の具体例において用いた多糖類誘導体保護基を形成 する化合物は、 ァセチルセルロースに官能基を結合するにあ たり、 スぺーサーを導入したことも特徴の一つである。 スぺ ーサ—を有する官能基を導入する反応は本発明の具体例の場 合、 4 — ( 2 —モノ メ トキ シ ト リ チルォキシェチルチオ〉 ジ ヒ ドロキ シ桂皮酸 〈 3 〉を作用させるものである。 この反応 はエステル化反応であつ.て高分子単位量あたり の反応量が大 き く 、 スぺーサー導入量として大きな数値となる。 これがヌ ク レオチドのリ ン酸基ブロ ッキングのための官能基の結合量 を支配し、 結局、 高分子当りのヌク レオチ ド結合量の大きい ものを得ることができる。 本発明の具体例においては、 リ ン 酸基をブ口ッキングする官能基として、 2 —ヒ ドロキシェチ ルスルホ二ル基を用いているが、 この基中のアルコ一ル水酸 基は 1級であって、 リ ン酸エステル化反応を行い易い。 一方 β位炭素原子に隣接するスルホニル基のため、 0脱離による 除去が可能であって、 他の保護基に影響を与えない緩和な条 件で行う ことができる。 この場合のスルホニル基ば、 4 — ( 2 —モソ メ トキシ ト リ チルォキシェチルチオ） ジヒ ドロキ シ桂皮酸 く 3 >の硫黄原子を後に酸化して得られたものであ る.。 この硫黄原子は導入スぺーサ一の定量にも使用できる。 本発明の多糖類誘導体保護基耷形成する化合物の 2 -ヒ ド σキシェチルスルホニル基のアルコール水酸基は、 リ ン酸の ほか力ルボン酸やスルホン酸と反応してエステル結合を形成 して保護基となる。 本発明においては、 リ ン酸基との反応の ほか糖の水酸基にコハク酸を結合させてカルボキシル末端と したモノ ヌク レオチ ドサク シナー ト、 オリ ゴヌク レオチ ドサ ク シナ一 トの保護基としても多糖類誘導体保護基形成化合物 を利用している。

〔実施-例〕

以下、 実施例について本発明を具体的に説明するが、 本癸 明はこれにより限定されるものではない。

多糖類誘導体保護基を形成する化合物の合成例を例 1 に、 RNA型ォリ ゴヌク レオチ ドの合成例を例 2 〜例 9 に、 DNA型 オ リ ゴヌク レオチ ドの合成例を例 1 0 〜例 1 5 にそれぞれ示 す。

〔例 1 〕

4 - ( 2 —ヒ ドロキシェチノレスルホニル） ジヒ ドロ シンナ モイ ルァセチルセルロース く 4 〉 の合成

i ) 2 —ク ロ 口ェチルモノ メ トキシ ト リ チルエーテル く 1 〉

2 —ク ロ 口エタノ ール （ 4.02m£， 60mmo ) とモノ メ トキ シ ト リ チルク ロ リ ド （ 9.2643g, 30ιηηιο£ ) をピリ ジン（150 ） 中、 室温で 3時間攪拌した。 反応溶液に冷水 （15 ） を加えて 3 0分間攪拌したのち、 ク ロ口ホルム（500 m£ ) で 抽出し、 水（200>n£ X 3 ) で洗浄し、 有機層を無水硫酸マグ ネ シゥムで乾燥した。 硫酸マクネシゥムを濾別除去し、 口 液を減圧留去したのち、 残留物に η — へキサン（ΙΟΟ を 加え、 結晶化して、 2 —ク ロ 口ェチルモノ メ トキ シ ト リ チ ルエーテル く 1 〉 9.6307g (収率 9 1 % ) 得た。

rap87 - 88 'C 、

¹ H -n.m.r. (CDC i 3 一 TMS) ： 5 3.30 - 3.50 ( 4 H , m , - C - CJiz x 2 ) 3.60 ( 3 H , s , 0 〇且₃) 6.70 ( 2 H , d , J = 9 Hz、 フヱニルプロ ト ン x 2 ) 6.97 - 7.53 (12 H , m ， フヱニルプロ ト ン x l 2 )

元素分析 C₂₂H₂₁0_zC と しての

計算値 ： C , 74.89 ； H , 6.00 ,

実測値 ： C , 75.00 ； H , 5.98 , ii ) 4 —メ ルカ プ ト ジヒ ドロ桂皮酸 〈 2 〉

Gaitらの方法 (M. J.Gait and . C . Sheppard , Nuc 1 e i c Acids Res. , 丄， 1135- 1158 (1977)〕 によ り 4 —メ ルカ プ ト ジヒ ドロ桂皮酸を^：成した。

iii ) 4 — ( 2 — ヒ ドロキ シェチルチオ） ジヒ ドロ シンナモ イ スレァセチゾレセノレロ ース 〈 4 〉

2 一 ク ロ 口 ェチルモノ メ トキ シ ト リ チノレエ ーテノレく 1 > (2.1172 g , Smmo& ) と 4 —メ ルカ プ ト ジヒ ドロ桂皮酸 く 2 〉 （0,9112 g , 5 o ） をエタノ ール （15m£ ) に溶か し、 ジイ ソプロピルェチルァ ミ ン（2.45m , 15 mmojg ) を 加え、 1 2時間加熱還流した。 溶媒を減圧留去し、 残留物 をシ リ 力ゲルカ ラ ムク ロマ ト グラ フ ィ —で精製し、 シラ ッ プ状の 4 一 （ 2 —モノ メ ト キシ ト リ チルォキ シェチルチオ） ジヒ ドロ桂皮酸 く 3 〉 を 1.9945g( 8 0 %) 得た。

1 H -n.m.r. (CDC & ₃ — TMS) ： δ 2.56 ( 2 Η , t , J =

L 6 Hz , C 一 C_H ₂)、 2.83 ( 2 H , t , J = 7. 6 Hz , C 一 C_H ₂)、 3.01 ( 2 H , t , J = 6. 8 Hz , C - C E__z)、 3.32 ( 2 H , t ， J = 6. 8 Hz , C — CJLz)、 3.64 ( 3 H ， s , 〇 C E_₃)、 6.75 ( 2 H , d ， J = 8. 8 Hz , フエニルプロ ト ン x 2 ) 、 6.98— 7.45 (16 H , m , フ エ ニルプロ ト ン X 16) iv ) 4 - ( 2 —モノ メ ト キシ ト リ チルォキ シェチルチオ） ジ ヒ ドロ桂皮酸 〈 3 〉 ( 2.7924 g , 5.6ramo^ ) とァセチル セルロ ース （D,S. = 1.77) ( 1· 1794 g ) をビリ ジ ン （ 5 mi ) に溶かしたのち、 ピリ ジ ンを減圧留去した。 こ の操作を 3 回く り返し、 系内の水分を共沸脱水したのち、 ピリ ジ ン ( 28 mi) に溶かし、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソ プロ ピルべンゼ ンスルホユルク 口 リ ド （4.0231 g , 14.0 mmojg ) と 1 — メ チルイ ミダゾール （2.24m£ , 28.0mmog ) を加え、 2時間室 - 温で攪拌した。

反応溶液に冷水 （ 5 m£) を加え、 3 0分間攪拌したのち、 ク ロ 口ホルムで抽出、 水で洗浄し、 有機層を減圧濃縮した。 残留物をピリ ジン （ 5 m X 3 ) で共沸脱水したのち、 ピリ ジ ン （14 ) に溶かし、 無水酢酸 （ 4. 7 m£ ) を加え、 5時 間室温で攪拌した。 反応溶液を減圧濃縮したのち、 ピリ ジ ン臭がな く なるまで少量の ト ルエ ンを加え減圧下、 共沸留 去した。 残留物をジォキサ ン —酢酸 （ 9 mi ) に溶 かし、 Na₂W0₄ · H₂0 (0.1868 g ) —水溶液 （19fni ) を加え、 8 0 °C に加温し、 3 0 %過酸化水素水 （ 2 8 m ) を 1 時間 かけて滴下したのち、 さ らに 1 時間攬拌を続けた。 反応温 度を室温まで下げたの ち、 ク ロ 口ホルム （150 ) — ピ リ ジ ン （20 m ) で抽出し、 水（100 m X 2 ) で洗浄した。 有璣層 を减圧濃縮したのち、 残留物をク ロ 口ホルム （30m£ ) に溶 かし、 エタノ ール（500 ） 中に激し く 攪拌しながら滴下し た。 生じた沈緵を濾別したのち、 さ らに、 エタノ ール（200 m ) で洗浄し、 減圧下乾燥し、 白色粉末を 2.9573 g得た。

こ のよ う に して得た白色粉末（2.6316g) を、 0. 7 M臭化 亜鉛一ク ロ 口 ホルム — メ タ ノ ール （ 7 ： 3 V / V ) 溶液

(30m£ ) に溶かし、 2時間室温で攪拌した。 反応溶液を約 ½まで減圧濃縮したのち、 エタ ノ ール（400 m 中に激し く 攪拌しながら滴下した。 生じた沈殺を濾別したのち、 さ ら にエタノ ール（lOOmi ) で洗浄し、 減圧下乾燥し、 白色粉末 状の 4 一 （ 2 — ヒ ド ロキ シェチルチオ） ジヒ ドロ シ ンナモ ィ ルァセチルセル口一ス 〈 4 〉を 1.8160 gを得た。'化合物 ( 4 〉中に導入されたスぺーサー量は、 Sの含有量 （5.30 % , 1.65 mmo^ S/g)から 1.65 mmo£ /g と算定された。

〔例 2〕

4 - ( 2 — ヒ ド Qキ シヱチノレススレホニル） ジヒ ドロ シ ンナ モ イ ノレァセチルセルロ ース く 4 〉 を甩いる ジヌ ク レオチ ド

3 ' — リ ン酸ジエステル誘導体 8 ) ( B ！ = B ₂ = ³ —ァニソ ィ ルゥ リ ジ ン一 1 一 ィ ル） の合成

4 — ( 2 — ヒ ドロ キ シ工チルスルホニル） ジ ヒ ドロ シンナ モ イ クレアセチノレセルロ ース 〈 4 〉 (1.65 mmoj2 / g) (0.2424g, 0.4mmo£ ) と N ³ —ァニソィ ルー 5 ' — ジメ トキ シ ト リ チスレ一 2 ' 一 0 —テ ト ラ ヒ ドロ ビラ二ゾレゥ リ ジ ン 3 ' - ( 2 — ク ロ コフ ヱニル） ホスフェ ー ト ト リ ェチルァ ミ ン塩

( 5 ) (0.3170 g , 0.3關 o ) をピリ ジ ン （ 3 ） に溶かし たのち、 ピリ ジンを減圧留去した。 この操作を 3回く り返し、 系内の水分を共沸脱水したのち、 ピリ'ジン （ 3 ） に溶かし、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソプロ ピルベンゼンスルホユルク 口 リ ド (0.2726 g , 0.9mmojg ) と I —メチルイ ミダゾール （(K14m£ ,

1.8 m mo ,2 ) を加え 1時間室温で攪拌した。 反応溶液に冷水 (0.5mi) を加え 3 0分間攪拌したのち塩化メチ レ ン （50αι ) を加え水 （30 ） で洗浄し、 有機層を減圧濃縮した。 残留物 をピ リ ジン （ 3 mi X 3 ) で共沸脱水したのち、 ピリ ジ ン（7.5 ml ) に溶かし、 無水酢酸 （ 2. 5 ） を加え、 5時間室温で攪 拌した。 反応溶液を減圧漶縮したのち、 ピリ ジ ン臭がな く な るまで少量の ト ルエ ンを加え、 減圧下共沸留去した。

少量の N ³ —ァニソィノレ一 5 ' — 0 —ジメ トキシ ト リ チル 一 2 ' 一 0 —テ ト ラ ヒ ド ロ ビラ ニノレゥ リ ジ ン 3 ' ― ( 2 - ク ロ 口 フ エ ニル） ホス フ ヱ 一 ト ト リ ェチルァ ミ ン塩 く 5 〉 の 導入された酢酸セルロ ース誘導体 く 4 〉を含む残留物を少量 の塩化メ チ レ ンに溶力'、し、 エタノ ール中に滴下し、 く 4 〉 を 粉末状 （ 3. 1 ) と したのち、 2 % ト ルエ ンスルホ ン酸ー ク π 口 ホルム 一 メ タ ノ ール （ 7 ： 3 v/v ) 溶液で処理しジメ トキシ ト リ チル基を 5 ' —水酸基より除去したのち、 6 0 % 過塩素酸—エタノ ール （ 3 ： 2 ν / ν ) 中発色させ、 498nm ( s = 72000)の吸光度を測定することにより く 5 〉 の酢酸セ ルロース誘導体 ぐ 4 〉 への導入量を測定したところ、 0,56 mmoi ノ g 、 縮合収率 9 9 %であった。

残渣をク ロ 口ホルム 一 メ タ ノ ール （ 7 ： 3 v/v ) (lOmi ) に溶かし、 0 °c に冷却して ト ルエ ンスルホ ン酸 1水塩（0.3954 g ) のク ロ 口 ホルム 一 メ タ ノ ーノレ （ 7 ： 3 v/v ) ( 5 m£ ) 溶 液を加え、 1 5分間攪拌したのち、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウ ム 水溶液を加え、 反応溶液を中和し、 ク ロ 口 ホルムで抽出し、 有機層を減圧濃縮した。 残渣をク ロ口ホルム （lOmi ) に溶か し、 ェタノ ール（200 mi ) 中に激し く 攪拌しながら滴下し、 生 じた沈緵を濾過し、 粉末状 く 6 ) 〔 ( 4 ) 式参照〕 を 0, 3330 g (0.224 mmo^ 、 収率 7 5 %、 0.674 mmo^ Zg)得た。

く 6 ) (0.3330g) と N ³ — ァ ニソ ィ ル一 5 ' — 0 — ジメ ト シキ ト リ チル一 2 ' 一 〇 — テ ト ラ ヒ ドロ ビラ ニルゥ リ ジ ン 3 ' - ( 2 —ク ロ 口 フエ二ゾレ） ホスフ ェ ー ト ト リ ェチルア ミ ン塩 く 5 ) (0.2958 g , 0.28mmojg ) をピリ ジン （ 3 m£ x 3 ) で共沸脱水したのち、 ピリ ジ ン （ 2. 8 m ) に溶かし、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソプロ ピルベンゼンスルホニルク ロ リ ド （ 0.2544 g , 0.84 mmo ) と 1 —メ チルイ ミダゾール （ 0.13 m£ , 0.168 mi) を加え 1時間室温で攪拌した。 反応液に冷水（0.5ini) を 加え、 3 0分間攪拌したのち、 塩化メ チ レンで抽岀、 水で洗 浄し、 有機層を減圧濃縮した。 少量の残渣を、 塩化メ チ レ ン に溶かし、 ェタノ ール中滴下し、 粉末状 （ 2 9 ） とし、 ジ メ トキシ ト リ チル基を定量したところ 0.401 關 o£ Z g、 縮 合収率 9 7 %であった。

残渣を、 ピリ ジ ン— ト リ ェチルァ ミ ン （ 3 1 v/v ) ( 8 mi) に溶かし、 室温下 2時間攬拌したのち、 反応溶液を減圧 濃縮した。 残渣をピリ ジン （10 m ) に溶かし、 ェダノ ―ル (200 mi) 中に激し く攪拌しながら滴下し、 生じた沈殺〈 9 > 〔 ( 5 ) 式参照〕 を濾別除去したのち、 '瀘液を減圧濃縮した。 残渣を逆相シリ 力ゲル力 ラムク ロマ ト グラフ ィ ー （溶出液 40 一 60%アセ ト ン — 0.0511 TEAB水溶液） で分難し、 ジヌ ク レオ チ ド誘導体〈 8 〉を 0,2926 g (0.173 mmo^ 、 5 8 % ) を得た。 この際 〈 5 〉を 0,0526 g (0.05ιιιπιο ) 回収した。

なお、 〈 8 > は、 液柑法で合成した 〈 8 ' 〉 と シ リ 力ゲル を担体とする TLC の R f 値、 — n.tn.r.がー致し、 その構 造を示していることを確認した。

〈 8 〉 の物性値

B！ = B ₂ = N ³ 一ァニソイ ノレゥ リ ジ ン一 1 一 イ スレ、 但し 測定には 2ノ —〇ーテ ト ラ ヒ ド ロ ビラ ニルゥ リ ジ ンのジァ ステ レオマーの極性大のものを使用

1 H - n.m.r. (CDC ί ₃ - THS) ： δ 1.21 ( 9 Η , t , J = 7. 3 Hz - CJi₃ x 3 ) 、 1.27 - 1.75 (12 H > m ， C — C且 ₃ x 6 ) 、 295( 6 H , q , C — 〇且₂ x 3 ) 、 3.41 - 3.68 ( 6 H , m , H - 5 ' , 5 ' ぉょび 0 — 〇且₂ x 2 ) 、 3.796, 3.80 , 3.83および 3.85 (12 H , S x 4 , O CJL₃ x 4 ) 、 4.16— 5.75 (12 H , m , H - 5 x 2 , 2 ' x 2 , 3 ' x 2 , 4 ' x 2 , 5 ' , 5 " および— O — C L— 0 x 2 ) 、 5.30 ( 1 H , S , — O H ) 、 6.05 , 6.11 , 6.15および 6,27 ( 2 H : d x 4 , H I ' 2 ) 、 6.83 - 7.92 ( 31 H , m ， フ ヱ ニノレプ 口 ト ン x 29および H 6 x 2 ) 。

R f 値 ： 0.28 (アセ ト ン —水、 6 ： 4 ν/ν) , 0.65 (ァセ ト ン一水、 7 ： 3 v/v )

〔例 3 〕

ァセチルセルロ ース誘導体 〈 4 〉を用いる、 （ B i = N ³ — ァ ニソ ィ ルゥ リ ジ ン 一 1 一 ィ ル、 B ₂ = N ^ά 一 べ ンゾィ ルァデニ ン 一 9 一 ィ ル） である ジヌ ク レオチ ド 3 ' — リ ン g変ジエ ステル誘導体 く 8 〉 の合成

例 2 と同様な操作で、 〈 4 〉 ( 1.65 mmo^ / g) (0.2424g,

0.4 mmo ） と N ³ —ァニソ ィ ル一 5 ' 一 0—ジメ トキシ ト リ チノレー 2 ' 一 0 — テ ト ラ ヒ ド ロ ビラ ニノレゥ リ ジ ン 3 ' - ( 2 — ク ロ σフ エ ニル） ホス フ エ一 ト ト リ ェチルア ミ ン塩 ( 5 ) (0.3170 g , 0.3mmo^ をピ リ ジ ン （ 3 ） 溶媒中、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソ プロ ピルベ ンゼ ンスルホ二ノレク ロ リ ド (0.2726g , 0.9ramo£ ) と 1 —メ チルイ ミダゾ—ル （O.Umi, 1.8mmo ) を加え反応させたのち、 無氷酢酸 （ 2. 5 mi) — ピ リ ジ ン （ 7. 5 mi) で処理じた （縮合収率 9 9 %) 。 つづいて、 2 % ト ルエ ンスノレホ ン酸一ク ロ ロホゾレム 一メ タ ノ ール ( 7 ： 3 ν/ν ) 溶液で処理したのち、 クロ口ホルムに溶かし、 ェ - タノ —ル中に滴下し、 玢末钛 く 6 〉を 0.3680 g (0.255 mmoi , 8 5 Μ , 0.693 mmo^ / g ) 得た。

( 6 ) (0.3680 g ) と N ⁶ —べンゾィ ルー 5 ' —〇 ー ジメ ト キ シ ト リ チルー 2 ' — 0 —テ ト ラ 匕 ドロ ビラニルアデノ シ ン 3 ' — ( 2 —ク ロ 口 フエ二ル） 永スフエ ー ト ト リ ェチル ア ミ ン塩 5 (0.3359 , 0.32 mmoS, ) をピリ ジン （3,2 mi ) 容媒中、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソプ口ピルベンゼンスルホ二ル ク ロ リ ド （0.2907 g , 0.96 mmo^ ) と 1· —メ チルイ ミダゾ一 ル （Q.15(ni , 1.92 mnio^ ) を加え反応させた （縮合収率 9 6 %) 。 つづいて、 ト リ ェチルァ ミ ン一 ピ リ ジ ン （ 1 ： 3 / ' V ) ( 8 ^ ) で処理し、 酢酸セルロ ース残渣をェタノ 一ルで沈 毂させ、 濾別除去し、 逆相シリ 力ゲル力 ラムク ロ マ トダラ フ ィ —で分離し、 ジヌク レオチ ド誘導体 （ 8 )を 0.2978 g (1.77 mmo^ , 5 9 ¾) 得た。 この際 〈 5 ) (Β ₂ = Ν⁶ ― ベンゾィ ルアデニン一 9 —ィ ル） を (L0630 g (0.06 mmoi ) 回収した。 なお、 〈 8 ) は、 液栢法で合成した 〈 8 ' 〉 と TLC の R i 値、 ¹ H— n.m.r.が一致し、 その構造を示してい ることを確認した。

< 8 >の物性値

B I = N ³ —ァニソ イ ノレゥ リ ジ ン 一 1 一ィ ル、 B ₂ = N ⁶ —ベンゾィルアデニン一 9 —ィ ル、 但し測定には 2 ' 一 0 ー テ ト ラ ヒ ド ロ ビラ ニノレゥ リ ジ ン、 2 ' — 0 — チ ト ラ ヒ ド ロビラニルアデノ シ ン共に、 ジァステ レオマーの極性が大 きいものを使用した。

1 H - n.m.r. (CDC i ₃ 一 TMS) ： <51.19 - 1.66 (12 H , m ,

C ― C_H.₂ x 6 ) 、 1.22( 9 H , t , J = 7. 3 Hz , C且 ₃ x 3 ) 、 2.96 ( 6 H , q , C 一 CJiz x 3 ) 、 3.04 - 3.78 ( 6 H , m , H 5 ' , 5〃 および〇 一 C i_₂ x 2 ) 、 3.75 ( 6 H , S , 〇 C且 ₃)、 3.83 ( 3 H , S , 0 C且₃)、 4.28 - 5.84 (11 H , m , H - 5 , 2 ' x 2 , 3 ' x 2 , 4 ' 4 , 5 ' 5〃 および〇— CJi一 0 x 2 ) 、 5.38 ( 1 H , S , - 0 H ) 、 6.15 , 6.17 , 6.34および 6.39 ( 2 H , d x 4 , H - 1 ' x 2 ) 、 6.76 - 8.67 (33 H , m, フヱ ニルプロ ト ン x 30 , H 一 2 , 8 および— 6 ) 、 9.28( 1 Η , br-S , Ν Η ) R f 値 ： 0.30 (アセ ト ン一水、 6 ： 4 v/v ) 0.67 (アセ ト ン —水、 7 ： 3 v v )

〔例 4 〕

ァセ チルセルロ ース誘導体 〈 4 〉 を用いる、 = B ₂ N ⁶ 一 べンゾイ ノレ アデニ ン 一 9 ー ィ ノレ ） であ る ジヌ ク レオ チ ド 3 ' — リ ン酸ジエステル誘導体 く 8 〉 の合成

例 2 と同様な操作で、 〈 4 〉、 (1.65 mmo^ / g) (0.6061g, .00 mmo ） と N ⁶ — べンゾイ ノレー 5 ' — 0 —ジメ トキシ ト リ チノレ 一 2 ' 一 〇 一 チ ト ラ ヒ ド ロ ビラ ニルアデノ シ ン 3 ' 一 （ 2 — ク ロ ロ フ ヱ ニル） ホス フ ェー ト ト リ ェチルァ ミ ン塩 〈 5 〉 (0.7872 g , 0.75 mmo^ ) をピ リ ジ ン 7. 5 m ) 溶媒中、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソプロ ビルベンゼンスルホニルク ロ リ ド

(0.6814 g , 2.25 mmo£ ) と 1 -メ チルイ ミダゾール （0.36 ml , .5mmo^ ) を加え反応させたのち、 無水酢酸 （6.25mT) 二 ピ リ ジ ン (18.25 mi ) で処理した （縮合収率 9 6 % ) 。 つ づいて、 2 % トルエ ンスルホ ン酸一ク ロ ロホノレム 一メ タノ一 ル （ 7 ： 3 v/v ) 溶液で処理したのち、 ク ロ 口ホルムに溶 かし、 ェタノ ール中に滴下し、 粉末状 く 6 >を 0 9166 g

(0.638 關 o 、 収率 8 5 %、 0.696mtno /g ) 得た。

〈 6 〉 (0.9166 g ) と N ⁶ —べンゾィ ルー 5 ' — 0 —ジメ ト キ シ ト リ チル一 2 ' 一 0 —テ ト ラ ヒ ド π ビラ ニルアデノ シ ン 3 ' 一 （ 2 —ク ロ 口 フエニル） ホスフェ ー ト ト リ ェチル ァ ミ ン塩 く 5 ) (0.8370 g , 0.80 mmo£ ) をピ リ ジ ン （ 8 m£ ) '溶液中、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソ プロ ピルベンゼンスルホニル ク ロ リ ド （0.7269 g , 2.40 mmo ） と I 一メ チルイ ミダゾー ル （0.38mi , 4.8ηιηιο£ ) を加え反応させた （缩合収率 9 4 %) , つづいて、 ト リ ェチルア ミ ンー ビリ ジン （ 1 ： 3 v/v )

(20 ） で処理し、 ァセチルセルロ ース残渣〈 9 〉をヱタ ノ 一ルで沈缀させ、 濾別除去し、 逆相シリ力ゲル力ラムク ロマ ト グラ フ ィ —で分離し、 ジヌ ク レオチ ド誘導体 く 8 〉 を

0.7701 g (0.459 mmojg 、 収率 6 1 % ) 得た。 その際 〈 5 >

( B ₂ = N ⁶ —ベンゾィ ルアデニ ン一 9 一ィ ル） を 0.1679 g ( (K160mmo ） を回収した。

なお、 （ 8 〉 は、 液相法で合成した ( 8 ' 〉 と R f 値 ¹ H 一 n. m. が一致し、 その構造を示していることを確認した。 く 8 ) の物性値

B , = B z = N ⁶ — ベ ンゾイ ノレアデニン一 9 — ィ ノレ、 但し 測定には 2 ' — 0 —テ ト ラ ヒ ドロ ビラニルアデノ シ ンジァ ス テ レオマーの =極性が小さ く 、 B ₂ =極性が大きい ものを使用した。 .

1 H - n.m.r. (CDC ί ₃ 一 TMS) ： 5 1.22 - 1.62 (12 Η , m , . C - CJiz X 6 ) 、 1.25 ( 9 H , t ， J = 7. 3 Hz , 〇且₃ x 3 ) . 2.60 - 3.85 ( 6 H , m , H - 5 ' , 5〃 および一 C — CJiz x 2 ) 、 3.00( 6 H , q , - C - C E_₂ x 3 ) 、 3.74 および 3.75 ( 6 H , S x 2 , 0 CJi₃ x 2 ) 、 4.53 - 5.51

(10 H , m , H - 2 ' x 2 , 3 ' x 2 , 4 ' x 2 , 5 ' , 5 " および 0 - CJi— 0 X 2 ) 、 5.30 ( 1 H , S , - O H ) , 6.26 , 6.31 ， 6.36および 6.39 ( 2 H , d x 4 , H - 1 ' 2 ) 6.74 - 8.79 (35 H , m , H - 2 x 2 , 8 x 2 およびフヱ ニル プロ ト ン x 31) 、 9.20 - 9.44 ( 2 H , m , - Ν Η x 2 ) R f 値 ： 0.32 ， 0.29 (アセ ト ン —水、 6 ： d v/v ) 、 0.69 , 0.66 (アセ ト ン —水、 7 ： 3 ν/ν )

〔—例 5 〕

4 一 （ 2 — ヒ ドロキ シェチゾレスノレホニル） ジ ヒ ド ロ シ ン ナモ イ ルァセチルセルロ ース く 4 〉 を用いる 3 ' 一末端 に リ ン酸ジエステル官能基をもつテ ト ラヌ ク レオチ ド誘 導体 （ B _t = B 2 = B ₃ = B 4 = N ⁶ —ベンゾィ ルアデ ニ ン — 9 — ィ ル） 〈 10 〉 の合成 DM

0

< 10 > 前述 く 8 ) の合成 （ i ) と同様な操作で、 〈 4 > (1.65 mmo^ /g) (0.3182g , 0.525 mmo^ ) と 〈 8 〉 ( B！ = B ₂

= ⁶ —ベ ンゾィ ルアデニ ン 一 9 —ィ ノレ) (0.5871 g , 0.35 。^ ) をピ リ ジ ン （10.5 m ) 溶媒中、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソ プロ ピルベ ンゼンスノレホニルク ロ リ ド （0.3180 g , 1.05 mmoi ) と 1 —メチルイ .ミダゾ一ル （0.17 m , 2.10 mmo ) を加え、 反応させたのち、 無水酢酸 ( 2. 5· mi ) —ピリ ジ ン ( 7, 5 m ) で処理した （縮合収率 100%) 。 つづいて、 2 % トルエ ンスルホ ン酸一ク ロ ロ ホノレム 一メ タ ノ ール （ 7 ： 3 v/v ) 溶液で処理したのち、 クロ口ホルムに溶かし、 エタ ノ ール中に滴下し、 粉末状の 5 ' -末端に遊離水酸基を有す る ジヌ ク レオチ ドを担持したァセ チルセルロ ース誘導体を 0.6248 g (0.288 mmo 、 収率 8 2 % . 0.462 mmo£ ノ g ) 得 た。

こ の粉末 （0.6248g)と 〈 8 〉 （ B _t = B ₂ = N ⁶ —ベ ンゾ イ ノレアデニ ン — 9 一 ィ ル） （0.6760 g , 0.403mmo ) をピ リ ジ ン （ 8 溶媒中、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソ プロ ピルベ ンゼン スルホニルク 口 リ ド （0.3662 g , 1.21 mmo£ ) と 1 一 メ チル イ ミダゾール （0.20 ， 2.42 mmo ） を加え反応させた （縮 合収率 9 0 %) 。 ·

つづいて、 ト リ ェチルァ ミ ン 一 ピ リ ジ ン （ 1 ： 3 v/v )

(10.5 ） で処理し、 ァセチルセルロ ース残渣をエタ ノ ール で、 沈毂させ、 濾別除去し、 逆相シ リ 力ゲル力 ラ ム ク ロマ ト グラフ ィ —で分離し、 テ 卜 ラヌク レオチ ド誘導体を 0.5095 g (0.174 itimo£ 、 収率 5 0 % ) を得た。 こ の際 く 8 > を 0.1778 g (0.106 mrno^ ) 回収した。

( 10 ) の物性値

B , = B , = B 3 = B 4 = N ⁶ 一 べ ンゾイ ノレアデニ ン 一 9 一 ィ ル、 但し測定には 2 ' — 0 — テ ト ラ ヒ ド ロ ビラ ニルァ デ リ シ ンのジァステ レオマ一の極性大の ものを使用

1 H - n. m. r. (CDC i ₃ 一 TilS) ： <5 1.12 - 1.76 (24 H , m ,

C - C H _Z 12) 、 1.23 ( 9 H , t , J = 7. 3 Hz , C x 3 ) 、 2.90 - 3.56 ( 8 H , m , 0 - C H ₂ - x 4 ) 、 2.97 ( 6 H , q , C - C H ₂ - x 4 ) 、 3.68— 3.92 ( 2 H , m , H 5 ' および 5〃 ） 、 3.72 ( 6 H , S , 0 CJL₃ x 2 ) 、 4.12 - 5.72 (22 H , m , H - 2 ' x 4 , 3 ' x 4 , 4 ' x 4 , 5 ' x 3 , 5〃 x 3 、 および 0 — C H— 0 x 4 ) 5.30 ( 1 H , S , O H ) 、 6.10— 6.35 ( 4 H , m , H - 1 ' 4 ) 、 6.73 — 8.81 (57 H , m , H - 2 x 4 ， 8 x 4およびフ ヱニルプロ ト ン x 4 9 ) 、 9.20— 9.76 ( 4 H , m , N H x 4 ) 、 Rf値： 0.10 (アセ ト ン一水、 6 ： 4 v/v ) . 0.45 (アセ ト ン —水、 7 : 3 v/v に

C 6 )

5 ' 一 0 — ジメ ト キ シ ト リ 3チル一 0⁶ _—ジフ ヱ二ルカルバ o

モイ スレ一 N ² 一 イ ソブチ リ ル一 2 ' — 0 — (テ ト ラ ヒ ビラ ン ー 2 - -ィ ル） グアノ シ ン 3 ' — 0 ーサク シナ一 ト

< 11 ) の合成

5 ' — 0 —ジメ トキ シ ト リ チゾレ一 〇ら 一 ジフエ二ルカルノ モ イ ルー N ₂ —.イ ソブチリ-ルー 2 ' —〇 一 （テ ト ラ ヒ ド ロ ピ ラ ン一 2 —ィル） グアノ シ ン （1.6670 g , 1.78 mmo ) を塩 化メ チ レ ン （ 8. 9 ） に溶かし、 無水コ八ク酸 (0.3568 g , 3.57 mmo^ ) D!l AP (0.4362g , 3.57 mmo^ ) を加； 、 室 で 3 0分間攪拌した。 冷水 ( 5 m£) を加えたのち室温で 3 0分 間攪拌し、 塩化メチレ ン （SO ) で抽出したのち、 有機層を 0. 1 M ΤΒΑΒ X 3 ) で洗浄した。 有機層を無水硫酸マグ ネ シゥ ムで乾燥後、 硫酸マグネ シウ ムを濾別除去し、 濾液を 減圧留去した。 残留物を、 シ リ カゲルカ ラムク ロマ トグラフ ィ 一 （ ø 2. 5 X 10 cm、 メ タノ ール塩化メ チレン系） で精製し、 グラス状の 5 ' 一 0 —ジメ トキシ トリ チル一〇 ⁶ —ジフエ二 ノレ力 /レノ、 モ イ フレ ー Ν ² — イ ソブチ リ スレ一 2 ' 一 0 — （テ ト ラ ヒ ドロ ピラ ン 一 2 —ィ ル） グアノ シ ン 3 ' 一 0 —サク シナ ー ト 〈 11 〉を 1.7370 g (収率 9 4 ¾ ) 得た。

R f 0.42(CHC & 3 - MeOH, 9 ： 1 v/v )

1 H - n.m.r. (CDC ί ₃ - TMS) ： 5 1.12— 1.19 ( 6 H , m ,

C ( C H ₃) ₂)、 1.24 - 1.70 ( 6 H , m , C - C H ₂ - C x 3 )

2.51 - 2.84 ( 3 H , m , C_H ( C H ₃) _Z および— CH₂C00H)、

2.96 - 3.23 ( 2 H , m , 0 - 〇且₂)、 3.29— 3.49 ( 2 H , m ,

CHzCOO - ) 、 3.67 - 3.82 ( 2 H , m , H — 5 ' および 5〃 ) 、

3.75 , 3.74および 3.79 ( 9 H , S x 3 , 0 C B_₃) , 4.30 - 4.35 ( 1 H , m , H - 4 ' ) 、 4.68 - 4.74 ( 1 H , m , O - C H - 0 ) 、 5.25 ( 1 H , dd , J ₂' ₃' = 4.88Hz , Hz ' )、 5.50 — 5.56 ( l H , m , H - 3 ' ) 、 6.27 ( 1 H , d , J ₂. =

7.81Hz , H — 1 ' ) 、 6.77 - 7.76 (23 H ， m、 フ エ ニルプロ

ト ン x 23) 、 8.18 ( 1 H , S , H - 8 ) 、 8.31 (1 H , S ,

N ² - H ) 8.54 - 8.62 ( 1 H， m , C O O B

元素分折値 （C_{S 7}H₅₃N₆0_{1 3} · H₂0)

計算値 ： C , 65.01 ； H , 5.74 ； , 7.98

実測値 ： C , 64.74 ; Η , 5.62 ； Ν , 7.92

〔例 7〕

遊離 5 ' —水酸基を有するグアノ シ ン 3 ' — コハク駿ェ

ステルを担挣したァセチルセルロ ース誘導体 く 12 ) の合成

Η0 〔 G〕 -C-CH₂CH₂C-0CH₂CH₂S O VCHzCHzC-O- [Cell] < 12 >

II II !1 II

0 0 0 0 例 1 で得た 4 ( 2 — ヒ ド ロキ シェチノレスノレホニル） ジ ヒ ドロ シンナモイ ルァセチゾレセ ノレロ ース く 4 > (1.65 mmo£ S /% ) (0.3636 g , 0.6πιιηο£ ) と例 6で得た 5 ' — Ο —ジメ ト キ シ ト リ チルー 0⁶ — ジフ エ二ルカルバモイ ル一 Ν ² — イ ソ ブチリ ル一 2ノ 一 0 — (テ ト ラ ヒ ドロ ビラ ン一 2 —ィ ノレ） グ ァノ シン 3 ' ―ひ—サクシナ一 ト 〈 11 〉 （0.4140 g , 0. 4 0 》 をビリ ジ ン （ 5 X 3 ) で共沸脱水したのち、 ピ リ ジ ン （ 6 ml ) に溶かし、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソプロ ピルベン ゼンスルホニルク ロ リ ド（ひ.3634 , 1.2mmo ) と 1 — メ チノレ ィ ミダゾール （0.20 ， 2.4mmo≤ ) を加え、 室 i¾で 2時間攪 拌した。 冷水 （ 2. m£) を加え、 室温で 3 0分間攪拌したのち、 塩化メチ レ ン （60 ） で抽出し、 水 （20 ） で洗浄した。 有 機層を濃縮したのち、 さ らに、 ピリ ジ ン （ 5 πι χ 3 ) で共沸 脱水し、 無氷酢酸—ピリ ジ ン （ 1 ： 3 vZv ) (15mi ) を加え 室温で 5時間攪拌した。 反応溶液を濃縮したのち、 ピ リ ジ ン 臭がな く なるまで トルェン少量を加え、 共沸留去を操りかえ し行なった。 残留物の少量を塩化メ チ レ ンに溶かし、 エタゾ ール中に激しく攪拌しながら滴下し、 沈緵させ、 精製した白 色粉末 （ 4. 3 ） を用い、 ジメ トキシ ト リ チル基の定量を行 なった。 （担持量 0.5mmo /g 、 縮合収率 9 8 %)

他の残留物を、 ク ロ口ホルム 一メ タノ ール ( Ί ： 3 v/v)

( 5 ） に溶かし、 0 で に冷却下、 p —TsOfl · H₂0 (0.3954g) — ク ロ 口ホルム一メ タ ノ ール （ 7 ： 3 vXv) ( 5 <a£ ) 溶液を 加え、 1 5分間攪拌した。 5 %炭酸水素ナ ト リ ゥ ム水溶液を 加え中和したのち、 ク ロ口ホルム（lOOmi) で抽出し有機層を、 減圧下濃縮した。 残留物をクロ口ホルム (10 m£) に溶かし、 エタノ ー ル（200mi) 中に激し く 攪拌しながら滴下した。 生成 した沈殺を濾別収集し、 遊離な 5 ' -水酸基を有するグアノ シ ン 3 ' — コ ノヽク酸エステルを担持したァセチルセルロ ー ス誘導体 〈 12 〉を 6 6 % (0.4511g, 0.589mmo /g ) 得た。 〔例 8 〕

へキ サヌ ク レオチ ド 3 ' — リ ン酸ジエステル誘導体 〈 13 〉 ( m = 6 , B , = B 3 = B 4 = U^An , B ₂ = B ₅ - B _b = A ^{B g}) の合成

例 1 で得た 4 — ( 2 — ヒ ド ロ キ シェチルスノレホニル） ジ ヒ ド ロ シ ンナモ イ ルァセチゾレセルロ ー ス 〈 4 〉 （1.65 mmo / g ) (0.2727g, 0.45mmoi ) と ジヌ ク レオチ ド 3 ' — リ ン酸ジ エ ステル誘導体 く 8 〉 ( B , = U ^An , B z = A^BZ) (0.5048 g , 0.3mmo ） をピ リ ジ ン（4.5 m ) に溶かし、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソ プロ ピルベンゼ ンスルホユルク 口 リ ド（TPS) (0.2726 g , 0.9mmo£ ) と 1 -メ チルイ ミダゾー ル （ 1 一 Meim) (0.144mf , 1.8mmo ) を加え、 縮合したのち、 無水酢酸（2.5 — ピ リ ジ ン （7.5 mi) で処理した （縮合収率 9 4 % ) 。 つづいて、 2 ¾ p ― 卜 ノレエ ンスノレホ ン酸一水和物ノク ロ ロ ホノレム ー メ タ ノ ール （ 7 ： 3 Vノ V ) 溶液で処理したのち、 ク ロ 口 ホルム (10 m ) に溶かし、 エタノ ー ル（200 mi) 中に激し く 攪拌しな がら滴下し、 粉末状の 5 ' -末端に遊離な水酸基を有するジ ヌ ク レオチ ドが導入されたァセチルセル口 ース誘導体 く 14 ) ( n = 2 , B , = U ^Αη , B 2 = A ^Bz) を 7 2 % (0.5090 g ,

/ g ) 得た ₀

つづいて、 〈 14 〉 ( n = 2 , B j = U ^An , B ₂ = A ^B2) (0.5090 g ) とジヌ ク レオチ ド 3 ' — リ ン酸ジェステル誘導 体〈 8 ) ( B X = B 2 = U ^An) (0.5526g, 0.326 mmo^ ) をビ リ ジ ン（6.5m£) に溶かし、 TPS (0.2962 g , 0.978ιηιτιο£ ) と 1 - eim(0.156in2 , 1.96 mmo£ ) を加え繚合 （縮合収率 9 9 %) したのち、 塩化メチレン （10m ) に溶かし、 エタノ ール（200 rnf ) 中に激しく攪拌しながら滴下し、 賴末扰のテ トラマ-が 担持したァセチルセルロ ース誘導体〈 15 〉を 6 1 % (0.730Tg, 0.252mtnojg / g ) 得た。

なお、 濾液を濃縮し、 残留物を逆相シ 力ゲ'ルカラムク ロ マ ト グラ フ 一 ( 2. 5 emID X lOonL , 40— 60%ァセ ト ン一

ΤΕΑΒ水溶液系） で精製し、 〈 8 〉 （Β、 = Β ₂ = U ^Αη) を 0.1251g(0.072 mmo^ ) 回収した。

• 次に、 もう 1 サイ クル同様な操作で、 テ ト ラマーが担持さ れたァセチルセルロ ース誘導体く 15 ) の粉末（0.7307g) を無 水酢酸（2.5m£) —ビリ ジン（7.5mi) で処理したのち、 2 % p - ト ルエ ンスルホ ン酸一水和物/ク ロ αホノレム 一メ タノ 一ル ( 7 ： 3 ν/ν ) 溶液で処理し、 クロ口ホルム (ΙΟπιέ) に溶 かし、 ヱタノ ール（200 ） 中に激し く攪拌しながら滴下し、 粉末状の 5 ' —末端に遊離な水酸基を有するテ ト ラヌ ク レオ チドを担持したァセチルセルロ ース誘導体〈 16 〉 i n = i ,

B ！ = B 3 = B * = U^an , B 2 = A^BZ) を 4 7 % (0.5173 g , 0.273mmo£ ,g ) 得た。

さらに、 （ 16〉 ( n = 4 ， B , = B 3 = B ₄ = U ^An , B ₂ = A ^BZ) (0.5173 g) と 8 ) ( B _r = B ₂ = A^BZ) (0.3523 g , 0.21 mmojZ ) をピ リ ジン（4.2 m£ ) に溶かし、 TPS(0.19Q8 g , 0.63 mmo£ ) と 1 一 Me i m (0.1 ^ , 1.26 mmo& ) をカロえ、 縮合 した （縮合収率 8 4 % ) 。 つづいて、 ト リ ェチルア ミ ン ー ビ リ ジ ン （ 1 ： 3 v/v ) 溶液で処理し、 スルホニルアルゲ ン となったァセチルセルロ ース誘導体残基部をエタノ ールから 沈澱させ、 濾別除去し、 逆相シ リ カゲルカ ラ ムク ロマ トグラ フ ィ 一で分離し、 へキサヌ ク レオチ ド 3 ' — リ ン酸ジエステ ル誘導体 〈 13 〉 ( m = 6 , B , = B ₃ = B ₄ = U ^An , B ₂ = B ₅ = B 6 = A ^{B Z} ) を 2 1 % (0.2527 g ) 得た。 こ の際、 ジ ヌク レオチ ド 3 ' — リ ン酸ジエステル誘導体 〈 8 〉 ( B , = B 2 = A ^Bz) を 0· 1310 g (0.078 nimo ) 回収した。

へキサヌ ク レオチ ド 3 ' — リ ン酸ジエステル誘導体 〈 13 〉 ( m == 6 , B , = B a = B 4 = U " , B ₂ = B ₅ = B _h = A ⁸² ) の物性 ' -

R f 値 0.05 (アセ ト ン —水、 6 ： 4 v/v ) 、 0.27 (ァセ ト ン —水、 7 : 3 v/v ) o

'：例 9 ]

i ) ァセチルセルロ ース誘導体を担持に用いる 1 1量体

(AAAAAAUUAUG) ( 17 ) の合成

5 ' -末端にリ ン酸ジヱ ステル官能基をもつへキサヌ ク レ ォチ ド誘導体 〈 13 ) ( DMTr CAAUUAU] pOH) (0.4208g, 0.1 關 o ） と、 例 7 で得た遊離な 5 ' —水酸基を有するグアノ シ ン 3 ' ー コ ノヽク酸エス テルを担持したァセチルセノレロ ース 導体 く 12 ) (0.4244g , 0.25 mmo^ ) をピ リ ジン x 3 ) で共沸脱水したのち、 ピリ ジ ン （ 5 m ) に溶かし、 2 , 4 , 6 - ト リ イ ソ プロ ピノレベ ンゼ ンスルホニルク ロ リ ド（0.1211 g, 0.4 mmo ) 、 1 —メ チルイ ミダゾール（0.065 ， 0.8 ひ ） を加え、 室温で 2時間攪拌した。 つづいて、 冷水 ( 2 mi) を加え、 室温で 3 0分間攬拌したのち、 塩化メチレ ン （60mi) で抽出、 水 （20mn で洗浄した。 有機層を濃縮し たのち、 ざらに、 ピ ジン （ 5 ni X 3 ) で共沸脱水し、 無水 酢酸ー ビリ ジ ン （ 1 : 3 vZv) (10 ） を加え、 室温で 5時 間攪拌した。 反応溶液を濃縮したのちピリ ジ ン臭がなく なる まで、 トルエ ン少量を加え ¾沸留去を操りかえし行なった (縮合収率 9 & %、 0.117ηιηιο£ /g ) 。 残留物をク ロロホル ム 一 メ タノ ーノレ （ 7 ： v/v ) (lQm£) に溶かし、 0 でに冷 却下、 p — TsOH' H₂0 (0.3954 g ) —ク ロ 口ホルム ーメ タノ 一 ル （ 7 ： 3 溶液を加え、 1 5分間攪拌した。 5

%炭酸水素ナ ト リ ウム水溶液を加え中和したのち、 ク αロホ ルム （100 ） で抽出し、 有機層を減圧下濃縮した。 残留物を ク ロ 口ホルム （ 10 》 に溶かし、 エタ ノ ール（200 mi ) 中に激 しく攪拌しながら滴下した。 生成した沈澱を瀘別収集し、 5 -末端に水酸基を有する 7量体が担持されたァセチルセル口 —ス誘導体 〈 18 〉を 8 7 ¾ (0.7210§, 0.121mmo£ /g ) 得た < さらに、 このようにして得たセルロース誘導体 〈 18 ) (0.7210g , 0.087 mmo^ ) と例 5で得た 3 ' —未端にリ ン酸 ジエステル官能基をもつテ ト ラ スク レオチド誘導体く 10 〉

(DMTr CftAAA) pOH) (0.6424g, 0.219ηιιηο£ ) をピ リ 、ジン （ 5 mi X 3 ) で共沸脱水したのち、 ピリ ジン （ 8. 7 m£ ) に溶かし - 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソプロ ピゾレベンゼンスルホニルク ロ リ ド (0.1990s , 0.657mmo^ 》 と 1 —メチルイ ミダゾール（0.107 m , 1.314mmo£ ) を加え室温で 2時間撹拌した。 つづいて、 冷水 （ 2 m ) を加え室温で 3 0分間攪拌したのち、 塩化メ チ レ ン（lOOmi ) で抽出、 水 （30mi ) で洗浄した。 有機層を、 減 圧下濃縮したのち、 残留物を塩化メ チ レ ン （10 ） に溶かし、 ヱタノ ール（200 ) 中に、 激し く 攪拌しながら滴下した。 生 成した沈澱を濾別収集し、 1 1量体が担持されたァセチルセ ルロ ー ス誘導体 〈 19 〉を通算収率 6 9 % (0.7911Ε, 0.087mm_OJ2 /g ) で得た （縮合収率 9 6 % ) 。 なお、 濾液中のテ ト ラヌ ク レオチ ド誘導体 〈 10 〉 は、 エタノ ールを留去したのち、 逆 相 シ リ カゲルカ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ —によ り精製する こ と により、 0.2180g (0.074mmo£ ) 回収した。

ii ) 1 1 量体 （AAAAAAUUAUG)から.の保護基の除去および精製

1 1 量体が担持されたァセチルセルロ ー ス誘導体 〈 19 〉 ( 44.8呵， 3.97 mmo^ ) を、 0. 5 M 2 — ピ リ ジ ンカ ルボキ シアル ドォキ シム ー 1 , 1 , 3 , 3 — テ ト ラ メ チルダァニジ ンの ピ リ ジ ン一水 （ 9 ： 1 V / V ) 溶液 （ 0. 6 mi ) に溶力、し、 室温で 1 日放置した。 反応溶液にエタノ ール （30 ） を加え、 I 1 量体が遊離したァセチルセルロ ース誘導体残渣 く 9 〉 を 沈殺させたのち、 違心分離 （3000回転 Z分、 4 で、 1 0分間） し、 上澄み液を缰縮した。 残留物に濃ァンモニァ水 （ 2 8 %) (20m ) を加え、 密栓をし、 5 5 °cで 6時間放置したのち、 減圧濃縮した。 あらかじめ、 ァセ トニ ト リ ル一水 （ 9 ： 1 v/v) (lOmi) を注入して 3時間以上放置しておいた SEP— PAK (C-18) (Waters社） をさらに、 50 mM TEAB (1M TEAB pH8.0 をうすめて調整した） 20m£で洗浄後、 50 mM TEAB (20mi ) で 溶かしたサンブル （残暂物） を注入した。

1 5 %ァセ ト ニ ト リ ル一 50 mM TEAB (30 ） 、 つづいて、 1 8 %ァセ ト ニ ト リ ノレ 一 50 mM TEAB (10m£) で 2 — ピ リ ジン 力ルボキ シアル ドォキシム、 1 , 1 , 3 , 3 —テ ト ラメ チル グァニジ ンを溶出したのち、 3 5 %ァセ ト ニ ト リ ル— 50mM TEAB(lOmi) で 1 1量体を溶出し、 溶出液を凍結乾燥した。 残留物を水 （ 1 ) に溶かし、 HPLCCM&S PACK C-18 4.6¾*ID x ISOnraL 、 10— 50%ァセ十 二 ト リ ル— 0 1 Ϊ1 TEAA) によ り 、 サンプル ( 0. 1 m ) を精製した。 （結果を第 1図に示す。 ） この際溶出液は、 U Vモニター（280nm) で確認し、 主ピーク の中央部分を分取し、 減圧下濃縮した。 さらに、 水 （ l m£ ) を加え、 ト リヱチルァ ミ ン臭がな く なるまで減圧留去した。 残暂物を pH 2. 0水溶液 （ 5 m ) に溶かし、 室温で 2 日間放置 した。 稀ア ンモニア水で中和し、 酢酸ヱチル （10mi x 3 ) で 洗浄後、 水相を滅圧下濃縮した。 サンプル （残留物） を水 (200 ^) に溶力、し、 HPLC(M&S PACK C-18 , 4. 6 mlD x 150 諷し， 5 — 19%ァセ ト ニ ト リ ル一 0. 1 M TEAA) でサ ンプル（180 i) を锖製した。 （結果を第 2図に示す。 ） この際、 溶出液 は U Vモニタ —により確認し、 各ピーク の中央部分を分取し、 凍結乾燥し、 すべての保護基が除去された 1 1量体

(ApApApApApApUpUpApUpG) を 1.51 0ひ 得た。

iii ) 1 1 ¾ (ApApApApApApUpUpApUpG) の構造確認

保護基を除去した 1 1量体く 17 〉 （0.1 0D)の水溶液（86.32 i に 1 M酢酸ア ンモニゥムバッ フ ァ ー （pH5.3) (10 と Nuclease PKYamasa shoyu Co., 1 ng / 5 ( 3 ^ ) を加え、 3 7 で 3 0分間放置した。

酵素分解生成物は、 HPLC(M&S PACK C-18,4.6a« ID x 150««L) で分離した。

1 1 量体は、 完全に分解され、 アデノ シ ン ： グアノ シ ン 5 一 リ ン酸 ： ゥ リ ジ ン 5 ' — リ ン酸 ： アデノ シ ン 5 ' — リ ン酸 (1.38 ： 1.31 ： 3.00 ： 5.95) の比の分解生成物を得た。

なお、 Nuclease PI は、 分解生成物であるアデノ シ ン 5 ' ー リ ン酸をさ らにアデノ シ ンへ分解する性質を有すると言わ れており、 このことを考慮した比を次に示した。 （アデノ シ ン + アデノ シ ン 5 ' — リ ン酸） ： ゥ リ ジ ン 5 ' — リ ン酸 ： グ ァノ シ ン 5 ' — リ ン酸 （7.00 ： 2.87 ： 1.25) 。

〔例 10〕 .

ァセ チルセルロ ー ス誘導体 〈 -4 〉 を担体とするジー 2 ' - デォキ シ リ ボヌ ク レオチ ド 3 ' — リ ン酸ジエステル誘導体

{ 20 ) ( B ！ = B ₂ = T ^Bz) の合成

下記反応式に従って、 例 1 で得た 4 — ( 2 — ヒ ドロキシェ チノレス ゾレホ ニノレ） ジ ヒ ド ロ シ ンナ モ イ ノレァ セ チノレセノレロ ー ス く 4 〉 力、ら ジ — 2 ' —デォキ シ リ ボヌ ク レオチ ド 3 ' 一 リ ン 酸ジヱ ス テル誘導体 〈 20 〉 ( B , = B 2 = T ^BZ) を合成した。

- 0 セチ a ス）

〇 o

( 4 )

o

一- o p I t ί TPS, 1— Heim AC₂0

h

ピリ ジン ピリ ジン

〈21 〉

2¾TsOH · HzO EtOH

CHC H ₃/MeOH

CH_ZCH₂— S 〇）~ CH2CH2- C - O ~ァ ! tn-ス） く 22 > O？ h & 0 O

-TPS, Meiffl

( 21 ) - O = P - O- DMTrO 'CK ,Β

― 0~ァセチルセル n-ス）

Et₃N—ピリ ジン

π-ス）

( 9 )

0 = P —〇_

I

OPhC^ 〈20〉 例 1 で得たァセチルセルロ ース誘導体 く 4 ) ( 1.65 mmo^ g ) (0.3272g, 0.53πιπιο£ ) と ト リ ェチルア ンモニゥ ム N ⁴ ベンゾイ ノレー 5 ' — 0 — ジメ ト キ シ ト リ チルチ ミ ジ ン 3 ' ( 2 — ク ロ 口 フ エ ニル） ホスフ ァ ー ト 〈 21 〉 (0.3766g, 0.4mmo£ ) をピリ ジン （ 3 m£ ) に溶かしたのち、 ピ ジンを 減圧留去した。 この操作を 3回繰り返し、 系内の水分を共沸 脱水したのち、 ピリ ジン （ 4 ） に溶かし、 2 , 4 , 6 — ト リ ィ ソプ Ώ ピルベンゼンスルホニルク ロ リ ド （0.3634g , 1.2 mmojg ) と 1 ーメ チルイ ミダゾール （0.19 ， 2.4mmo£ ) を 加え、 室温で 1時間攪拌した。 反応溶液に、 冷水（0.5 ） を 加え、 3 0分間攪拌したのち、 反応溶液を減圧濃縮し、 ピリ ジン （ 3 m£ X 3 ) を加え、 減圧留去し、 系内の水分を共沸脱 水した。 残留物をピリ ジ ン （ 9 m ) に溶かし、 無水酢酸 （ 3 m ) を加え、 室温で 5時間攪拌したのち、 反応溶液を減圧瀵 縮し、 さらに、 ピリ ジン臭がなく なるまで、 少量の ト ルエ ン を加え、 減圧留去した。 〈 21 )が導入されたァセチルセル口 ― ス誘導体の極く少量を少量の塩化メ チレンに.溶かし、 エタ ノ ール中に滴下し、 生じた沈緵を濾別分取したのち減圧下に 乾燥し、 粉未状（4.6 ) とした。

2 % P - ト スレエ ンスノレホ ン酸ク ロ ロ ホゾレム 一メ タノ ール ( 7 : 3 v/v ) 溶液 （ 1 m ) を加え室温で 1 5分間放置し、 ジメ トキシ ト ' Jチル基を除去したのち、 6 0 %過塩素酸 -ェ タノ ール （ 3 ： 2 v/v ) を加え発色させ、 498nm ( ε = 72000)の吸光度を測定することにより、 〈 21 〉 のァセチルセ ルロ ース誘導体への導入量を測定したところ、 0.604 mmo£ / 、 縮合収率 100%と算出された。

残りの 〈 21 〉が導入されたァセチルセル口ース誘導体をク ロ ロ ホルム 一 メ タ ノ ール （ 7 ： 3 V V ) ( 8 m£ ) に溶かし、 0 でに冷却下、 p — ト ルェンスルホ ン酸—水和物（0.3164g) ク ロ ロ ホノレム 一 メ タ ノ ーノレ （ 7 ： 3 v/v ) ( 4 m ) 溶液を加 え 1 5分間攪拌した。 つづいて、 ピ リ ジ ン （ 1 mi) を加えた のち、 反応溶液を約 ½まで減圧下に濃縮した。 残留溶液を、 ェタ ノ 一ル（200 ） 中に、 激し く攪拌しながら滴下し、 生じ た沈殺を濾別分取したのち、 減圧下に乾燥し、 粉末状の 5 ' -位に遊離な水酸基をもつチミ ジ ン 3 ' - リ ン酸誘導体を担 持したァセチルセルロ ース誘導体 〈 22 〉 ( B , = T ^Bz) 9 5 % (0.5120 g ,0.378 mmo^ ： 0.739mmo£ / g ) を得た。

さ らに 〈 22 〉 ( B , = T ^Bz) と 〈 21 〉 ( B z = T ^Bz)

(0.4449g, 0.473mmo ) をピ リ ジ ン （ 3 mi X 3 ) を加え、 系 内の水分を共沸脱水したのち、 ピリ ジ ン（9.5mi) に溶かし、 2 , 4 , 6 - ト リ イ ソ プロ ピルベ ンゼ ンスノレホニノレク ロ リ ド (0.4298g, 1.42mmo^ ) と 1 ー メ チルイ ミ ダゾール（0.225 m , 2.84 oimo^ ) を加え、 室温で 1時間攪拌した（0.432mmo£ /g 、 縮合収率 9 9 %) 。 冷水 （ 1 m ) を加え、 室温で 3 0分間攪 拌したのち、 反応溶液を減圧下に濃縮した。

つづいて、 ト リ ェチルァ ミ ン — ピ リ ジ ン （ 1 ： 3 V V ) ( 16 inO に溶かし、 室温で 2時間攪拌したのち、 スルホニル アルケ ンとなったァセチルセル口—ス誘導体残基部 〈 9 〉 を エタノ ール（lOOnii) から圻出させ、 濾別除去し、 濾液を減圧 下濃縮したのち、 逆相シリ 力ゲルク ロマ トグラフ ィ ― （ 10〜 40%アセ ト ン — 0.05M TEAB系） で分離し、 〈 20 〉 ( B , = B ₂ = T ^B3) を 6 3 % (0.3710 g , 0.254mmo£ ) 得た。 この 際 〈 21 〉 （ B = T ^Bz) を 0.789 g (0.083 mmo ) 回収した。 ( 20 ) ( B , = B ₂ = T⁸³) の物性値 R f 値 ： 0.29 (ァセ ト ンー水、 6 : 4 /> ) '

1 H - n.m.r. ((？ DC I ₃ -TMS) : δ 1.24 ( 9 H , t , J = 7. 3 Hz , N— C₂H_S基中の C 一 CJL₃ x 3 ) 、 1.27 ( 3 H , S , C H 3 - 5 ) 、 1.35 ( 3 H , S , C H ₃ — 5 ) 2.05〜2.70 ( 4 H , m , H - 2 ' x 2および H - 2 " x 2 ) .. 2.97 ( 6 H , 9 , C -

- N x 3 ) 、 3.78 ( 6 H , S _t O C H ₃ x 2 ) 、 3.30 - 4.50 ( 6 H , m , H - 4 ' x 2 H - 5 ' x 2 および H — 5〃 x 2 ) 、 4.95- 5.40 ( 2 H , m , H - 3 ' x 2 ) 6.29 - 6.45 ( 2 H , m , H — 1 ' x 2 ) および 6.30— 8.60 (33 H , m , フ ヱ ニルプロ ト ン x 31および H — 6 x 2 )。

〔例 II〕

ァセチルセル口一ス誘導体 ( 4 〉を担持とするジ— 2 ' ― デォキ シ リ -ボヌ ク レオチ ド 3 ' 一 リ ン酸エステル誘導体

( 20 ) ( B 1 = B ₂ = A^{a ca} ) の合成

例 1 ひ に記載の反応式に従って、 ァセチルセルロ ース誘導 体 く 4 〉 から ジ — 2 ' —デォキ シ リ ボヌ ク レオチ ド一 3 ' 一 リ ン羧ヱステル誘導体 〈 20 〉 ( B , = B z = A^flca ) を合成 した。

すなわち、 例 1 0 と同様に、 く 4 ) (K65 mmo^ /g ) (0.3272g, 0.53mmo^ ) と ト リ ェチルア ンモニゥ ム 5 ' — 〇 ー ジメ ト キ シ ト リ チルー N ⁶ ― (ジメ チルァ ミ ノ ） エチ レ ン 一 2 ' —デォキ シアデノ シ ン 3 ' 一 （ 2 — ク ロ π フ ヱニル） ホスフ ァ ー ト 〈 21 > (0.3882 g , 0.4mmo^ ) をピ リ ジン（4m ) に Ϋ容かし、 , 4 , S — ト リ イ ソプロピルベンゼンスルホ二 ルクロ リ ド （0.3634 g , l.2mm i ) と 1 一メ チルイ ミダゾー ル （0.19mi , 2.4 mi ) を加え、 室温で 1 時間攪拌したのち、 冷水 （ 1 m ) を加え反応を停止し、 反応溶液を減圧下濃縮し、 無水酢酸— ピ リ ジ ン （ 1 ： 3 v/v ) (12mi ) で処理した

(0.590 mmo / g 縮合収率 9 9 % ) 。 つづいて、 ρ — ト ルェ ンスルホ ン酸—水和物 （0.3164 g ) ク ロ ロ ホノレム —メ タノ ー ル （ 7 _: 3 v/v ) 溶液 （12m で処理したのち、 エタノ ー ル（200 πιΟ 中に激し く攪拌しながら滴下し、 粉末状の 〈 22 〉 ( Β , = A ^Aca ) を 8 9 % (0.4970 g , 0.357mmo£ ； 0.717 mmojg /g ) 得た o

さ らに、 〈 22 〉 ( B , = A ^{A c a} ) と 〈 21 〉 ( B ₂ = A ^{A c a} )

(0.4325g, 0.446mmo^ ) を ピ リ ジ ン（9 ） に溶かし、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソ プロ ピノレベンゼ ンスルホユルク ロ リ ド

(0.3377g, 1.34 mmo^ ) と 1 一 メ チルイ ミダゾ一ル （ 0.21 m , 2.68 mmo^ ) を加え、 室温で 1 時間攪拌したのち、 冷水 （ 1 m£ ) を加え反応を停止し、 反応溶液を減圧下約 ½まで濃縮し、 ェ タ ノ —ル（200 mi) 中に激し く 攪拌しながら滴下し、 粉末状 の ジヌ ク レオチ ドが担持されたァセチルセルロ ース誘導体 〈 23 〉 を 7 1 % (0.6900 g , 0.283mmo ) 得た（0.410 mmo^ /g 、 縮合収率 9 7 %) 。

卜 リ エチルァ ミ ン — ピ リ ジ ン （ 1 ： 3 v/v ) (16mi ) で処 理し、 スルホニルアルケ ンとなったァセチルセルロ ース誘導 体残渣 く 9 〉をエタ ノ ール（100 m ) から折出させ、 瀘別除去 し、 逆相シ リ カゲルカ ラ ム ク ロマ ト グラ フ ィ 一で分離し、

( 20 ) ( B ！ = B 2 = A ^{A c a} ) を 6 3 % (0.3710 g , 0.254 wmo£ ) 得た。 この際、 〈 21 〉 ( B = A ^Aca ) を 0.0789 g (0.083mmo£ ) 回収した。

〈 20 〉 ( B i = B 2 = A ^Aca ) の物性値

R f 値： 0.34 (アセ ト ン一水、 6 ： 4 v/v )

1 H -n.m.r. (CDC & ₃ — TMS) ： 51.27 ( 9 H , t , J = 7. 3 Hz、 N -ヱチル基中の C一 CJL₃ x 3 ) 、 2.10 ( 6 H , S , C ( CJLs ) N ( CJi ₃' ₂ X 2 ) 、 2.85〜2.90 ( 4 H , m , H— 2 ' x 2および H - 2〃 x 2 ) . 2.90 ( 6 H , 9 , C ― CJlz — N x 3 ) 、 3.13 (12 H , m , N ( C H ₃) ₂ x 2 )

-4

6

3.34 ( 4 H , m , H - 5 ' x 2および H - 5〃 x 2 ) 、 3.72 ( 6 H , S , O - C H 3 x 2 ) . 4.40 ( 2 H , m , H - 4 ^Λ x 2 ) 5.40 - 5.55 ( 2 H , m , H— 3 ' x 2 ) 、 6.36-6.50 ( 2 H , m , H - 1 ' x 2 ) 6.70,- 7.50 (21 H , m , フ エ ニルプロ ト ン X21) 8.00 ( 2 H , S , Η - 2 x 2 ) および 8.55 ( 2 Η， S , Η— 8 x 2 ) 。

〔例 12〕

ァセチルセル口一ス誘導体 ( 4 )を担体とするジー 2 ' 一 デォキ シ リ ボヌ ク レオチ ド 3 ' — リ ン酸エステル誘導体 〈 20 〉 ( B t = Β ₂ = G^DPC' ^iBu ) の合成

例 1 0 に記載の反応式に従って、 ァセチルセルロ ース誘導 体 く 4 〉 から ジ一 2 ' —デォキ シ リ ボヌク レオチ ド 3 ' — リ ン羧ヱステル誘導体 〈 20 〉 ( B _l = B z = G^DPC' ^iBu ) を合 成した。

すなわち 例 1 0 と同様に、 〈 4 >

/g) (0.2424 g , 0.4mmo£ ) と ト リ ェチルア ンモニゥ ム 5 ' — Ο— ジメ ト キ シ ト リ チルー Ν ⁶ ―ジフ ェニルカルバモイ ルー Ν ² — ィ ソ ブチ リ ノレー 2 ' —デォキ シグアノ シ ン 〈 21 〉 ( B , =

G ^{D p c}， ^iBu ) (0.3375 g , 0.3mmo£ ) をビ リ ジ ン （ 3 m ) に溶 かし、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソ プロ ピゾレベ ンゼ ンスノレホニノレク ロ リ ド （ 0.2726 g , 0.9mmo ） と 1 — メ チルイ ミ ダゾール ( 0.144mi , 1.8mmo ) を加え、 室温で 1 時間攪拌したのち、 冷水 （ 1 ） を加え反応を停止し、 反応溶液を減圧下濃縮し、 無水酢酸 - ピ リ ジ ン （ 1 : 3 ν/ν ) (10<η£) で処理した

(0.533 mmo^ /g 、 縮合収率 9 8 % ) 。 つづいて、 p — ト ル エ ン ス ルホ ン酸一水和物 （ 0 , 3164 g ) およびク ロ 口 ホルム — メ タ ノ ール （ 7 ： 3 v/v ) (12 mi) で処理したのち、 ェタ ノ

—ル（200 m ) 中に激し く攪拌しながら滴下し、 粉末状の 〈 22 〉 ( B , - G ^Dpc' ^{i B u} ) を 8 8 % (0.4150 g , 0.264mmo^ ； 0.635mmo^ / g ) 得た。

さ らに、 〈 22 〉 ( B , = G^Dpc' ^{i Bu} ) と （ B ₂ = G ^Dpc' ^{i Bu}) (0.3708 g , 0.33 mmo^ ) をピ リ ジ ン（6.6mi ) に溶かし、 2 ,

4 ， 6 — ト リ イ ソ プロ ピルベ ンゼ ンスノレホニノレク ロ リ ド

(0.2999g, 0.99mmo ) と 1 — メ チルイ ミ ダゾール （ 0.16 mi , 1.98 mmo^ ) を加え、 室温で 1 時間攪拌したのち、 冷水 （ 1 m ) を加え反応を停止し、 反応溶液を減圧濃縮した （0.356 mmo ノ g 、 縮合収率 9 5 % ) 。 ト リ ェチルァ ミ ン - ピ リ ジ ン （ 1 ： 3 v/v ) ( 8 m ) で処理し、 スルホニルアルゲ ンと な っ たァセチルセルロ ース誘導体残渣 く 9 〉をエタ ノ ール

(100 mi) から折出させ、 濾別除去し、 逆相シ リ カゲルカ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ —で分離し、 〈 20 〉 ( B ！ = B 2 =

G ^Dpc， ^{i Bu} ) を 5 1 % (0.2797 g , 0.153ηκηοί ) 得た。 こ の 際、 く 21 〉 ( B = G^DPC' ^iBtt ) を 0.0496 g (0.0441m_moJg ) 回 収した。

く 20 〉 ( B i = B 2 = G^Dpc' ^{i B u} ) の物性値

R f 値 ： 0.Π (アセ ト ン—水、 6 ： 4 ν/ν )

1 Η - n.m.r. (CDC 5₃ 一 TMS) ： δ 1.05 - 1.25 (21 Η , m , Ν —ェチル基中の C — Cii₃ x 3および C H ( CJLs) 2 x 2 ) 、 2.50 - 3.45 (14 H , m , C - C E^_Z - N x 3 , C E_ ( C H ₃) ₂ x 2 , H — 2 ' x 2 , H - 2 " 2 , H - 5 ' x 2および H - 5 " x 2 ) 、 3.70 ( 6 H , S , 0 C H ₃ x 2 ) 、 4.50— 4.65 ( 2 H , m , H - 4 ' x 2 ) 、 5.30— 5.55 ( 2 H , m , H — 3 ' x 2 ) 、 6.30— 6.45 ( 2 H ， m , H - 1 ' x 2 ) 、 "6.66 -7.64 (41 H, m , Ptiプロ ト ン x 41) 、 8.05および 8.07

( 2 H , S x 2 , H - 8 x 2 ) 8, 55および 8.80 ( 2 H , S x 2 , NJiC 0 x 2 ) o

〔例 13〕

ァセチルセル口一ス誘導体 ( )を担体とする ト リ — 2 ^f 一デォキ シ リ ボヌ ク レオチ ド 3 ' — リ ン酸ジエステル誘導 体 （ 24 〉 ( B _t = C ^An , B z = B 3 = T ^Bつ の合成

下記反応式に従って、 ァセチルセル口—ス誘導体 〈 4 〉力、 ら ト リ — 2 ^f —デォキ シ リ ボヌ ク レオチ ド 3 ' 一 リ ン酸ジェ ステル誘導体 〈 24〉 ( B , = C ^an , B 2 = B 3 = T ^Bz) を合 成した。 CH₂CH_Z- C一 O ~fァセチルセ) tn -ス）

!1

OPhCi2 0 〇

(25 > (B, =C

〈20〉 (B_t =B₂ =T^BZ) -TPS, 1 -Meim

DMTrO /Ox

0

— 0~ァセチルセル n-ス）

oPhce o o

Et3N—ピリジン i¾¾シ' ゲ Mラムク ϋマトタラ 7ィ-

EtOH

く 9 ) DMTr

例 1 で得たァセチルセルロ ース誘導体 く 4 ) (1.63 mmo^ /z ) (0.8650 g , 1.39 mino£ ) と Ν ⁴ —ァニソィ ノレ 一 5 ' — 0 — ジメ ト キ シ ト リ チル— 2 ' —デォキ シチ ミ ジ ン 3 ' 一 ( 2 — ク ロ ロ フ ヱニル) ホスフ ァ ー ト 〈 21 〉 (0.9550 g , 1 mmo ） をピリ ジン （ 5 m x 3 ) で系内の水分を共沸脱水し ピリ ジ ン （10 mi) に溶かし、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソプロピル ベンゼンスルホ二ノレク ロ リ ド （0.9086 g , 3mmoj2 ) と 1 — メ チルイ ミダゾール （0.48m , 6mmo^ ) を加え、 室温で 4時間 攪拌した。 反応溶液に冷水（0.5mO を加え反応を停止し、 減 圧濃縮したのち、 ピリ ジン （ 5 mi X 3 ) で系内の水分を共沸 脱水し、 残留物をピ リ ジン （ 7. 5 mi) に溶かし、 無水酢酸

( 2. 5 ） を加え、 室温で 5時間攪拌した。 反応溶液を減圧 濃缩し、 さ らに、 ビリ ジ ン臭がなく なるまで少量の ト ルエ ン を加え、 減圧留去を操り返した （0.554mmo Zg 、 縮合収率 8 2 ¾) ₀ つづいて、 残留物を p - トルエ ンスルホ ン酸 -水和物

(0.5412 g ) ク ロ 口ホルム 一 メ タ ノ ーノレ （ 7 ： 3 v/v ) 溶 液 （20πι£ ) に溶かし、 0 'c 1 5分間攪拌したのち、 ビリ ジ ンを加え中和し、 反応溶液を減圧濃縮した。 残留物を塩化メ チ レ ン （10mO に溶かし、 エタノ ール（100 中に激し く攪 拌しながら滴下した。 生じた沈殺を濾別分取したのち、 減圧 下乾燥し、 粉末状の 〈 25 〉 ( B = C ^{A n}) を 6 4 % (0.9624g, 0.64 0.665mmojg ノ g)得た <>

さ らに、 〈 25 〉 ( B ！ = C ^An) と 〈 20 〉 ( B , = B ₂ = T ^{B z}) (0.7565 g , 0.518mmo£ ) をピ リ ジ ン ( 5 m£ x 3 ) で系 内の水分を共沸脱水したのち、 ピリ ジン （ΙΟπΟ に溶かし、 2 4 , 6 — ト リ イ ソ プロ ピゾレベ ンゼ ンスルホ二ノレク ロ リ ド (0.4840 g , 1.60mmo£ ) と 1 —メ チルイ ミダゾール （ 0.26 m£ , 3.2η,πιο£ ) を加え、 室温で 4時間攪拌した。 反応溶液に冷水 (0.5 m ) を加え、 室温で 3 0分間攪拌したのち減圧濃縮して 〈 26 〉 を得た。

残留物を ト リ エチルァ ミ ン — ピ リ ジ ン （ 1 ： 3 v/v)

(20mf ) に溶かし、 室温で 2時間攪拌したのち、 減圧濃縮し た。 残留物を塩化メ チ レ ン （10m£ ) に溶かし、 エタ ノ ール (100 ） 中に激し く 攪拌しながら滴下し、 スルホニルァルケ ンとなったァセチルセルロ ース誘導体残渣 く 9 〉を折出させ、 濾別除去した。 瀘液を減圧の濃縮し、 逆相シ リ カゲルカ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ ー （10〜40%アセ ト ン — 0.05M TEAB系） で 分離し、 〈 24 〉 （ B , = C ^{A n} , B ₂ = B 3 = T ^{B z}) を 4 7 % (0.5180 g , 0.25mmo^ ) 得た。 〈 24〉 ( B I = C ^An , B z = B 3 = T ^BZ) の物性値

R f 値： 0.19 (アセ ト ン—水、 6 ： 4 v/v ) 、 0.43 (ァ セ ト ン一水、 7 ： 3 v/v )

〔例 14〕

ァセチルセルロース誘導体 く 4 )を担体とするテ ト ラ— 2 ' —デォキシリ ボヌク レオチ ド 3 ' -リ ン酸ジエステル誘導

■f* ( 27 ) _ ( B 1 = _B 2 = A ^{A ca} 」 B ₃— = B ₄— = G ^{D p c}' ^{1 B u}―)— の合成

下記反応式に従って、 ァセチルセルロース誘導体 〈 4 〉か らテ ト ラー 2 ^r —デォキシリ ボヌク レオチ ド 3 ' 一リ ン酸ジ エステル誘導体 〈 27 〉 （ B t = B 2 = A^aca , Β 3 = Β ₄ = G ^Dpc' ^iBu ) を合成した。

ピひジン ピリジン

2 %TsOH - H₂0 EtOH

CHC£₃ /MeOH

〈28 )

0 = P-OCH₂CH₂ S-(0 CH₂CH₂- c-o ~ァセチ ftお —ス）

I

OPhCjg O o 〈20〉 (B, =B₂ =G^Dpc'^iBつ — TMS, 1—Meim

Et₃N—ピリジン

EtOh" く 9 )

翻シリカケ Mラ マトク'ラフィ—

0 = P -〇—

OPhC

例 1 で得たァセチルセルロ ース誘導体 く 4 〉 (1.63ηιιιιο£ / g) (0.3750g, 0.604mmo£ ) と例 I t で得た 〈 20 〉 ( B , = B ₂ = A ^Aca ) (0.6140g,0.405mmo£ ) をピリ ジ ン （ 5 m x 3 ) で系内の水分を共沸脱水し、 ピリ ジ ン （10 ） に溶かし、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソ プロ ピノレベ ンゼンスルホ二 ノレク ロ リ ド (0.3660g, 1.21rnmo£ ) と 1 一 メ チルイ ミダゾ一ル （0.20 mi , 2.48 mmo£ ) を加え、 室温で 4時間攪拌した。 冷水（0.5 ） を加え反応を停止し、 反応溶液を減圧下濃縮したのち ピ リ ジ ン （ 5 m£ x 3 ) で系丙の水分を共沸脱水し、 残留物をピリ ジ ン （ 7. 5 ） に溶かし、 無水酢酸 （ 2. 5 ) を加え、 室温で 5時間攪拌した。 反応溶液を減圧濃縮し、 さらに、 ピリ ジン 臭がなく なるまで少量のトルェンを加え、 減圧留去を操り返 した （0.354mmo /% 、 縮合収率 9 4 %) 。

残留物を P — ト ルヱンスルホ ン酸—水和物 （0.5412 g〉 ク ロ ロホルム一メ タノ ール （ 7 ： 3 V / V ) (20 m に溶かし、 0 で、 1 5分.間攪拌したのち、 ピリ ジゾを加え中和し、 反応 溶液を減圧濃縮した。 残晳物を塩化メ チレン （lOnii) に溶か し、 エタノ ール（100 m£) 中に、 激しく攪拌しながら滴下した, 生じた沈緵を濾別分取したのち、 減圧下乾燥し、 粉末扰の く 28〉 ( B _t = B 2 = A ^Aca ) を 7 6 % (0.7720 g , 0.306 mmo^ ； 0 , 397mmo£ /g ) 得た。

さらに、 〈 28 〉 ( B！ = B z = A ^Aca ) と例 1 2で得た ( 20 ) ( B！

) を ピリ ジ ン （ 5 m£ x 3 ) で系内の水分を共沸脱水したのち、 ピ リ ジ ン （10 mi ) に溶かし、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソプロピルベ ンゼンスルホニルク ロ K (0.3336 g , 1. lrnmojg ) と 1 —メ チルイ ミダゾール （0.18^£₅2.21mmo ) を加え、 室温で 4時 間攪拌した。 つづいて、 反応溶液に冷水 （ 0. 5 m£) を加え、 室温で 3 0分間攪拌したのち、 减圧濃縮した

残留物を ト リ エチルァ.ミ ン — ピリ ジ ン （ 1 ： 3 v/v ) (20mi) に溶かし、 室温で 2時間攪掙したのち、 減圧濃縮し た。 残留物を塩化メ チレ ン （10m£) に溶かし、 エタ ノ ール (100 m ) 中に激し く攪拌しながら滴下し、 スルホニルァルケ ンとなったァセチルセルロ ース誘導体残渣 〈 9 〉 を圻出させ、 ³濾別除去した。 濾液を減圧濃縮し、 逆相シリ カゲルカ ラムク 口マ ト グラフ ィ ー （10〜40%ァセ ト ン— 0.05^1 7£48系） で分 離し、 〈 27 〉 ( B , = B 2 = A ^{A c a} , Β 3 = Β ₄ = G ^{D p c}' ^{i B u}) を 6 9 % (0.6000 g , 0.21mm_OJg ) 得た。

〈 27 〉 ( B i = B 2 = A ^{A c a} , B ₃ = B ₄ = G ^{D p c}' ^{i B u} ) の 物性値

R f 値 ： 0.17 (アセ ト ン —水、 7 : 3 v v )

〔例 15〕

ァセチルセルロ ー ス誘導体 く 4 〉 を担体に用いるォク ター - 2 ' —デォキ シ リ ボヌク レオチ ド 〈 29 〉 (GPGPAPAPTPTPCPC ) の合成

下記反応式に従って、 ァセチルセルロ ース誘導体 く 4 〉力、 ら、 2 ' —デォキ シ シチジン 3 ' —サク シナ一 トを担持した ァセチルセルロ ース誘導体.〈 30 〉 を合成し、 次に、 〈 30 〉 か らォクタ — 2 ' —デォキ シ リ ボヌ ク レオチ ドを担持したァセ チルセルロ ース誘導体 〈 31 〉を合成し、 さ らに 〈 31 〉から保 護基の除去および精製を行ってォクタ — 2 ' —デォキ シ リ ボ ヌ ク レオチ ド 〈 29 〉 (GpGpApApTpTpCpC) を得た。

C一 CH₂CH₂C - OH

!1 II

o o

(32 ) Ac₂0 2%TsOH - H₂0 BtOH

ピリジン C &z /MeOH

C -CH_ECH₂ -C-0 -CH₂CH₂ S-<〇 CH₂CH₂ c-o -i7 nn -j) (30) li II

o o o o

TPS'l— Meim Ac₂0

(24 ) + (30 )

ピリジン ピ ijジン

2¾TsOH · H₂0 EtOH

- CHC£₃ /MeOH -

HOCTpTpCpC) ― CHzCHz- C-0 セチ!請-ス）

0

(33)

<27>- TPS, 1 -Meim EtOH

DMTrCGpGpApApTpTpCpC) ― CH2CH2 C セチ!赚 -ス）

ひ 〇 O 〇

く 31〉

0.5M TMG-PAO conc.aq.NHa

ピリジン一 H₂0 55で

(9:1 v /V)

( 9 ) 逆相 HPLC

80% aq.CH₃C00H

D 1TrGpGpApApTpTpCp ^;

く 34 >

逆相 HPLC

^GpGpApApTpTpCpC

く 29 )

1 ) 2 ' —デォキ シシチジン 3 ' —サク シナー トを担持し たァセチルセルロース誘導体 〈 30 ) の合成

ァセチルセルロ ース誘導体 く 4 ) (1.63 mmo^ / g) (0.9663 g , 1.58 mmo£ ) と Ν ⁴ — ァ ニ ソ イ ノレー 3 ' — 0 — ( 3 —力 ルボキ シプロ ピオ ニル） 一 5 ' 二 0 — ジメ トキ シ ト リ チノレ ー

2 ' —デォキ シシチジン 〈 32 〉 (0.802g , 1.05 mmo^ ) をピ リ ジン （ 5 m X 3 ) で共沸脱水したのち、 ピリ ジン （ 10.5 rn に溶力、し、 2 ， 4 , 6 — ト リ イ ソプロ ピルベンゼンスルホ二 ルク ロ リ ド （0.9450 g , 3.15 mo£ ) と 1 —メ チルイ ミ ダゾ ー ル （0.53 mi , 6.3mmoi2 ) を加え、 室溫で 2時間攪拌した。 反応溶液に冷水 （ l mi ) を加え 3 0分間攪拌したのち、 塩化 メ チ レ ン （lOOmO を加え、 水 0tn£ ) で洗浄した。 有機層を 減圧濃縮したのち、 ピリ ジン （ 5 ^ x 3 ) で共沸脱水し、 無 水酢酸— ピ リ ジ ン （ 1 ： 3 v/v ) (20m£ ) を加え室温で 5時 間攪拌した。 反応溶液を減圧濃縮し、 さ らに、 ピ リ ジ ン臭が な く なるまで少量の ト ルエ ンを加え共沸留去を繰り返した (0.5 mmo ノ g 、 縮合収率 9 8 % ) 。 残留物をク ロ 口ホルム 一メ タノ ール ( 7 ： 3 v/v ) (10 m ) に溶かし、 0 °cに冷却 し、 p — ト ルエ ンスルホ ン酸一水和物（0.5412g) ク ロ 口ホル ム —メタノ ール （ 7 ： 3 v/v ) 溶液 （10 mi) を加え、 1 5 分間攪拌したのち、 ピリ ジ ンを加え中和し、 反応溶液を減圧 濃縮した。 残留物を塩化メ チ レ ン （20 mi) に溶かし、 工タ ノ ール（200mi) 中に、 激しく攪拌しながら滴下し、 生じた沈緵 を濾別分取したのち、 減圧下乾燥し、 紛未状の 〈 30 〉を 8 4 ¼ (1.3190 g , 0.877mmo£ ί 0.665mmo£ ,_g)得た。

ϋ ) ォクター 2 ' 一デォキシリ ボヌク レオチ ドを担持したァ セチルセル口ース誘導体 〈 31 ) の合成

\ 1 3で得た く 24 〉 ( B 1 = C ^Sn , B 2 = B 3 = T^Ez) (0.2735g, 0.132mmo£ ) と上記 ί ) で得た （ 30 〉 （0.4910g , 0.33 mmo^ ) をピひ ジン （ 5 mi x 3 ) で系内の水分を共沸脱 水し、 ピリ ジン （ 3. 3 m ) に溶かし、 2 , 4 , 6 — ト リ イ ソ プロ ピルベンゼンスルホニルク ロ リ ド（0.1599g,

) と 1 ーメ チルイ ミ ダゾ ル （0.09 ， 1.06 mmo ) を加え、 室温で 2時簡攪拌した。 反応溶液に冷水 （ 0. 5 mf ) を加え、 室温で 3 0分閩攙拌したのち、 減圧濃縮した。 残留物をピリ ジ ン （ 5 X 3 ) で系内の水分を共沸脱水し、 ピリ ジン （15 mi) に溶かし、 無水酢酸 （ 5 m£) を加え、 室温で 5時間攪拌 した。 反応溶液を減圧濃縮し、 さらに、 ピリ ジ ン臭がなく な るまで少量-の トル工ンを加え、 減圧留去を操り返した（0.163 mmo /g 、 縮合収率 9 3 % ) 。 つづいて、 残留物をク 口口 ホルム—メ タノ ール （10m£) に溶かし、 0 で に冷却し、 p — トルエ ンスルホ ン酸—水和物 （0.5412 g ) ク ロ 口ホルム —メ タノ ール （ 7 ： 3 v/v ) 溶液 （10 ） を加え、 1 5分間攪 拌したのち、 ピリ ジンを加え中和し、 反応溶液を減圧濃縮し た。 残留物を塩化メ チ レ ン （10 mi ) に溶かし、 エタノ ール (I00m£ ) 中に激し く攪拌しながら滴下した。 生じた沈澱を濾 別分.取したのち、 減圧下乾燥し、 粉末状の 〈 33 〉を 8· 6 %

(0.6685 g , 0.115mmo ； 0. nimmojg /g ) 得た。

さ らに、 〈 33 〉 （0.445g, 0,076mmo ） と例 1 4で得た 〈 27 〉 ( B ₅ = B i, = A ^{A c a} , Β 7 = Β a = G ^{D PC}' ^{i B}つ (0.4343 g , 0.152mmo£ ) をピリ ジン （ 5 m X 3 ) で共沸脱水したのち、 ピ リ ジ ン （ 3. 4 m ) に溶かし、 2 ， 4 , 6 — ト リ イ ソ プロ ピ ルベ ンゼ ンスルホ二ノレク ロ リ ド（0.1726g, 0.57 mmo& ) と 1 ー メ チルイ ミダゾール （ 0.09 m , 1.14 mmo ） を力 Πえ、 室温 で 2時間攪拌した。 反応溶液に冷水 （ 0. 5 m ) を加え、 室瘟 で 3 0分間攪拌したのち、 減圧濃縮した （縮合収率 80.43%) , 残留物を塩化メ チ レ ン （ 1 0 ni ) に溶かし、 エタノ ール（100 m£) 中に、 激し く攪拌しながら滴下し、 生じた沈殺を濾別分 取したのち、 減圧下乾燥し、 粉末状の 〈 31 〉 を 9 1 %

(0.6120 g , 0.069mmo ； 0.113mmoi / g ) 得た。

iii ) ォクタマー 〈 31 〉からの保護基の除去及び精製

上記 ii ) で得たォクタマ— 〈 31 〉 （30 ， 3.39 mo ） を

0. 5 M ¹ , N ¹ , ³ , ³ — テ ト ラ メ チルダァニ ジ ゥ ム （ E ) 一 2 — ピ リ ジ ンアル ドォキ シマー ト Zピ リ ジ ン一水 （ 9 ： 1 v/v ) 溶液 （ 0. 6 m ) に溶かし、 室温で 1 日放置した。 反 応溶液にエタノ ール （30 mi ) を加え、 ァセチルセルロ ース誘 導体残基部 く 9 〉 を圻出させたのち、 濾別除去し、 濾液を減 圧下に濃縮した。 残留物に濃ァンモユア水 （ 2 8 ¾) (20m£ ) を加え、 密桎をし、 5 5 'c、 6時間放置したのち、 減圧下に 濃縮した。 あらかじめ、 ァセ トニ ト リ ル—水 （ 9 ： 1 v/v) (IQml) を注入して 3時間以上放置し おいた SEP - PAK (C-18) (Waters 社） を、 さらに、 50 mM TEAB水溶液 （20m£) で洗浄後、 50 mM TEAB氷溶液 （20 で溶かしたォクタマ ー 残留物を注入した。 5 %ァセ トニ ト リ ル— (K05M TEAB水溶液 (20 mf ) で N ¹， N ¹ , N ³, N ³ —テ ト ラメ チルダァニジン、 ( E ) 一 2 —ピリ ジンアルドォキシマ ー トを溶出したのち、 1 0 %ァセ トニ ト リ ル— 0.05M TEAB水溶液 （20mi ) 1 5 %ァ セ ト ニ ト リ ル— 0.05M TEAB水溶液 （lOmO でォクタマ ーを溶 出し、 溶出液を減圧濃縮した。 残留物を水 （ l mi ) に溶かし、 サンプル （0.63mi) を HPLCにより 5 ' —位にジメ トキシ ト リ チル基をもつォクタマ一 （ 34〉を精製した。 主ピークの中央 部分を分取し、 減圧下濃縮した。 さらに、 水 （ l mi ) を加え、 ト リェチルア ミ ン臭がなく なるまで減圧留去したのち、 分取 した ½のサンプルを 8 0 %酢酸水溶液 （1.31 mO を加え、 室 温で 3 0分間攪拌した。 つづいて、 反応溶液を減圧下に濃縮 し、 さらに、 少量の水を加え、 酢酸を共沸留去した。 残留物 を水 （ 1 m£) に溶かし、 サンプル （0,46 ） を HPLC(LiChro- sorb RP-18, 4iaID x 250™し 、 1 0 %ァセ トニ ト リ ル一 0. 1 M TeAA水溶液系） により精製した （結果を第 3図に示す） 。 主ピーグの中央部を分取し、 溶出液を減圧下濃縮し、 全ての 保護基が除去されたォクタマー 〈 29 〉を 1.95 0D 得た。 （結 果を第 4図に示す。 ） 1

5 61 iv ) ォクタマー 〈 29 〉 GpGpApApTpTpCpC)の構造確認 ォクタマー 〈 29 〉 （0.6 0D)を 0.05M ト リ ス緩衝剤（_PH8.48) (200^) に溶かし、 Snake Venom Phos hod i es teras e (20 w ) を加え 3 7 で で 2時間放置したのち、 さらに、 Alkaline P osphatase(50^) を加え 2 5 で で 1 時間放置した。 酵素分 解生成物 ま、 HPし C 〔し iChrosorb RP-18 , 4 mm ID x 250mmLs 1 0 %ァセ ト ニ ト リ ル— 0. 1 M リ ン酸— ナ ト リ ウ ム水溶液 (PH 4. 2 ) 〕 で分離し、 〈 29 〉 力く、 各 2 ' —デ^キ シヌ ク レ ォチ ドに完全に分解しているのを確認した。

10

〔産業上の利用可能性〕

生化学や遺伝子工学の急速な進歩、 特に、 組換え DNA技術 の開発に伴って、 合成ォ リ ゴヌ ク レオチ ドの需要が大変高ま つて来ているが、 本発明はこの需要にこたえ得る点で有用で ある。

合成 DNA においては、 ヒ ト — イ ンタ ー フ ヱ ロ ン、 ヒ ト成長 ホルモ ンなど多数の構造遺伝子の合成に対する成果のみでな く 、 配列の決定のためのプライ マー、 ク ローニ ングに用いる リ ンカ一、 目的の遺伝子を選択したり、 存在を確認するため 0 のプローブ、 微生物感染症の直接診断 （遺伝子診断） 、 医薬 品 （抗ウ ィ ルス剤） 等の医薬、 および医療閔連分野において 10〜20量体の合成 DNA の用途が限りな く広がっている。 プラ イ マ一、 リ ンカ一およびプローブは、 いずれも特定の配列を 有し、 高純度の DNAオ リ ゴマーを量的に必要としており、 簡5 便な大量合成法である本法の寄与するところが大きい。 & 2 他方、 SNA は、 タンパク質の生合成系で D A とタンパク質 の中間に位置し、 その役割も重要であり、 未知の部分も多く、 その機能解明などの與味から任意の配列を有する RNA を大量 に手にすることが望まれているが、 酵素を用いる方法では、 極く少量しか得られず、 また、 その目的とする配列にも制約 があ ¾ .、 化学的に合成する方がはるかに有利である。 しかし ながら、 従来の液相法—リ ン酸ト リエステル法による限り 1 0量体程度の RNAオリ ゴマーを量的に高純度の巨的物を得 ることは大変な函難を伴う。 また、 固柑法—リ ン酸 ト リ エス テル法は、 RNAオリ ゴマー合成に関して、 ォ 'Jゴマー合 成のような一般的方法が確立されていないのが現祛である。

本発明の方法は、 DMオリ ゴマーさらに、 合成に大変労力 を要する オ リ ゴマーに対しても、 簡便かつ大量 オ リ ゴ マーを供給できる方法として有用である。

Claims

(1) 末 R端 5 ' 水酸基のみがブロ ックされておらず、 他の官 ま

能基が複数の c低分子保護基と 1 つの多糖類誘導体保護基でブ

H

π ッ ク されているΠ o c Μ モノ ヌ ク レオチ ド、 ォ リ ゴヌ ク レオチ ド、 モ ノ ヌ ク レオ シ サク シナ ー ト またはオ リ ゴヌ ク レオチ ドサ ク シナー ト と、 末端リ ン酸基を除く その他の官能基が低分子 保護基でプロ ックされたモノ またはオ リ ゴヌク レオチ ドとを の

共通の溶媒中均一系で縮合させることを特徴とする、 鎮長延 長されたオ リ ゴヌク レオチ ドの合成法。

囲

(2) 前記多糖類誘導体保護基を形成する化合物が、 多糖類 誘導体にスぺーサ一と官能基を結合させたものである請求の 範囲第 1 項記載のォリ ゴヌク レ； f チ ドの合成法。

(3) 前記多糖類誘導体保護基を形成する化合物が下記一般 式 （ I ) で表わされる請求の範囲第 1 項または第 2項記載の オ リ ゴヌ ク レオチ ドの合成法。

CH₂)₃-_x-_y(0 ) _yCi,H70₂], (I)

但し、 H ₇0₂は無水グルコ ース残基であり、

C₂H₅C一または C₃H₇C—であり、

II II

0 0

nは 10〜2000の数であり、

Xは 0.

4〜 0. 8 の数であり、

yは 1. 0 〜 2. 0 の数である。 (4) 前記多糖類誘導体保護基を形成する化合物における多 糖類誘導体がァセチルセル口 ースである請求の範囲第 1項か ら第 3項までのいずれかに記戴のオリ ゴヌクレオチ ドの合成 法。 ' -

(5) 下記一般式 （ I ) で表わされる、 多糖類誘導体保護基 形成のための化合物。

CH₂) ₃-x-_y(0S) _yC₆H₇0₂ n ( I )

但し、 C₆H₇0₂は無水グルコース残基であり、

Rは CH₃C— , C₂H₅C—またば C₃H₇C—であり、

0 0 0

nば 10〜20ΌΟの数であり、 "

Xは 0. 4〜（3, 8 の数であり、

yは 1. 0 〜 2. 0 の数である。

(6) 式 （ I ) 中の Rが CH₃C—である請求の範囲第 5項記載

!1

0

の化合物。