KR20110102492A - 다가 올리고뉴클레오티드 변형된 나노입자 접합체에 의한 박테리아 단백질의 생산 저해 방법 - Google Patents

다가 올리고뉴클레오티드 변형된 나노입자 접합체에 의한 박테리아 단백질의 생산 저해 방법 Download PDF

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prokaryotic
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채드 에이. 머킨
데이비드 에이. 길조한
니마 나바이
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노오쓰웨스턴 유니버시티
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Abstract

본 발명은 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자 접합체 및 박테리아의 단백질 생산을 저해하는 방법에 관한 것이다.

Description

다가 올리고뉴클레오티드 변형된 나노입자 접합체에 의한 박테리아 단백질의 생산 저해 방법{INHIBITION OF BACTERIAL PROTEIN PRODUCTION BY POLYVALENT OLIGONUCLEOTIDE MODIFIED NANOPARTICLE CONJUGATES}
관련 출원의 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)에 근거하여 2009년 1월 8일자 미국 가출원번호 61/143,293과 2009년 4월 15일자 61/169,384에 대한 우선권을 주장하며, 이들 특허 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
정부 이해 관계에 대한 진술
본 발명은 국립 보건원(NIH)이 지원한 과제 번호 제 5DP1 OD000285호에 따라 미국 정부의 지원으로 완성된 것이다. 미국 정부는 본 발명에 대하여 소정의 권리를 가진다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자 접합체 및 박테리아 단백질의 생산 저해 방법에 관한 것이다.
박테리아의 증식을 통제하기 위한 새로운 물질의 개발은 매우 중요한 사항이다. 항생제 물질에 대한 분자적 접근을 통해 의미있는 성과들이 달성되고 있지만, 현행 항생제 치료는 항생제 내성 박테리아의 출현으로 인해 점점 제한되고 있는 실정이다. 매우 다양한 박테리아 기능을 표적으로 하는 많은 유형의 항생제들이 존재하고 있다. 전체 리스트는 아니지만, 일부 방식으로는 박테리아의 단백질 생산 타겟화(번역 차단, 예컨대 항-리보솜 제제), 박테리아 세포벽 온전성 타겟화 및 게놈 온전성 타겟화(예, DNA 자이라제)를 포함한다. 그런데도, 이러한 물질 대부분은 박테리아의 진화 및 접합을 통한 전이성 내성의 발생으로 인해 무력화되고 있으며, 그외 물질들도 동일한 운명에 처해질 것으로 예상된다. 일부 경우에, 박테리아 내성은 박테리아 한가지 종으로부터 다른 종으로 이동되기도 한다. 또한, 현재의 광범위한 항생제 사용은 대부분의 의학적 개입에 저항성을 보이는 "슈퍼 균주"의 출현을 유도하고 있다. 따라서, 박테리아를 타겟으로 하는 새로운 유형의 약물에 대한 연구가 우선시되고 있다.
다가 올리고뉴클레오티드 나노입자 접합체는 진핵 생물 시스템에서 유전자 조절과 검출 전략에 있어 상당한 능력을 입증받고 있다. 유전자 조절의 경우, 단백질 생산은 RNA 간섭 경로의 활성화에 의해 또는 안티센스 전략으로 mRNA의 격리 및/또는 분해에 의해 차단되고 있다. 검출의 경우, 올리고뉴클레오티드 나노입자 접합체에 대한 mRNA 결합을 형광 신호로 전환시킬 수 있다. 포유류 세포 배양 시스템에서, 나노입자 접합체는 무독성이고, 안정적이며, 상보적인 타겟에 대해 보다 높은 친화성을 가지고 있으며, 형질전환제 없이도 세포에 도입할 수 있다.
그러나, 박테리아에서, 특히 살균제로서의 올리고뉴클레오티드의 사용은, 유용성에 있어 제한이 있었다. 몇가지 제제가 개발되었지만, 이의 광범위한 사용은 결코 받아들여지지 않았다. 개념상으로는 유효하지만, 이러한 전략으로 충분히 사용되지 않고 있는 이유는 기술적인 문제가 있기 때문이다(예, 유전자 넉-다운 능력 부족, 결여된 박테리아내 전달 능력, 및 박테리아 내부에서의 올리고뉴클레오티드 가닥의 안정성(즉, 뉴클레이즈 내성)).
본원에서는 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자 및 담체를 포함하며, 상기 올리고뉴클레오티드가 혼성화를 허용하는 조건 하에서 타겟 서열과 혼성화될 정도로 원핵 생물 유전자의 비-코딩 타겟 서열과 충분히 상보적인 것을 특징으로 하는, 항생제 조성물을 기술한다. 본원에 기술된 상기 항생제 조성물은 원핵생물의 세포 안으로 도입되어, 원핵생물의 유전자 전사 및/또는 번역을 조절한다.
일부 구현예들에서, 상기 항생제 조성물은, 원핵생물 유전자에 혼성시 원핵생물 세포의 증식을 저해한다. 다른 구현예에서, 상기 항생제 조성물은, 올리고뉴클레오티드의 혼성화시 원핵생물 유전자에 의해 코딩되는 기능성 원핵생물 단백질의 발현을 저해한다. 일 측면에서, 상기 항생제 조성물은, 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 접촉되지 않은 세포와 비교하여 기능성 원핵생물 단백질의 발현을 약 75%까지 저해한다.
다른 구현예에서, 항생제 조성물은, 혼성화시 원핵생물 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 저해하고 활성을 변화시킨다. 일 측면에서, 항생제 조성물은, 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 발현되는 유전자 생성물의 활성을 약 10%까지 감소시킨다. 또는 다른 측면에서, 항생제 조성물은, 발현되는 유전자 생성물의 활성을 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 접촉되지 않은 세포와 비교하여 약 10%까지 증가시킨다.
다른 구현예에서, 항생제 조성물은 타겟 서열에 올리고뉴클레오티드 혼성화시 원핵생물 유전자의 전사를 저해한다. 다른 구현예에서, 항생제 조성물은 타겟 서열에 올리고뉴클레오티드 혼성화시 원핵생물 유전자에 의해 코딩되는 기능성 단백질의 번역을 저해한다.
또한, 본 발명은, 올리고뉴클레오티드의 혼성화시 원핵생물 세포의 증식에 필수적인 기능성 단백질의 발현을 저해하는 항생제 조성물을 제공한다. 다양한 측면에서, 항생제 조성물은, 올리고뉴클레오티드의 혼성화시 원핵생물 세포 증식에 필수적인 기능성 단백질의 발현을 저해하며, 상기 기능성 단백질은 원핵생물 세포 증식에 필수적이며, 그람 음성 유전자 생성물, 그람 양성 유전자 생성물, 세포 주기 유전자 생성물, DNA 복제에 참여하는 유전자 생성물, 세포 분열 유전자 생성물, 단백질 합성에 참여하는 유전자 생성물, 박테리아 자이레이제 및 아실 캐리어 유전자 생성물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 상기 항생제 조성물에서, 원핵생물 유전자는 항생제에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩한다.
일부 구현예들에서, 항생제 조성물은 항생제를 더 포함한다. 다양한 측면에서, 항생제 조성물에서, 항생제는 페니실린 G, 메티실린(Methicillin), 나프실린(Nafcillin), 옥사실린(Oxacillin), 클록사실린(Cloxacillin), 디클록사실린(Dicloxacillin), 암피실린(Ampicillin), 아목시실린(Amoxicillin), 티카르실린(Ticarcillin), 카르베니실린(Carbenicillin), 메즐로실린(Mezlocillin), 아즐로실린(Azlocillin), 피페라실린(Piperacillin), 이미페넴(Imipenem), 아즈트레오남(Aztreonam), 세팔로틴(Cephalothin), 세팍클로르(Cefaclor), 세폭시틴(Cefoxitin), 세푸록심(Cefuroxime), 세포니시드(Cefonicid), 세프메타졸(Cefmetazole), 세포테탄(Cefotetan), 세프프로질(Cefprozil), 로라카르베프(Loracarbef), 세페타메트(Cefetamet), 세포페라존(Cefoperazone), 세포탁심(Cefotaxime), 세프티족심(Ceftizoxime), 세프트리아손(Ceftriaxone), 세프타지딤(Ceftazidime), 세페핌(Cefepime), 세픽심(Cefixime), 세프포독심(Cefpodoxime), 세프설로딘(Cefsulodin), 플레록삭신(Fleroxacin), 날리딕스산(Nalidixic acid), 노르플록삭신(Norfloxacin), 시프로플록산신(Ciprofloxacin), 오플록삭신(Ofloxacin), 에녹삭신(Enoxacin), 로메플록삭신(Lomefloxacin), 시녹삭신(Cinoxacin), 독시사이클린(Doxycycline), 미노사이클린(Minocycline), 테트라사이클린(Tetracycline), 아미카신(Amikacin), 젠타미신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycin), 네틸미신(Netilmicin), 토브라마이신(Tobramycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 아지트로마이신(Azithromycin), 클라리트로마이신(Clarithromycin), 에리트로마이신(Erythromycin), 에리트로마이신 에스톨레이트(Erythromycin estolate), 에리트로마이신 에틸 숙시네이트(Erythromycin ethyl succinate), 에리트로마이신 글루코헵토네이트(Erythromycin glucoheptonate), 에리트로마이신 락토비오네이트(Erythromycin lactobionate), 에리트로마이신 스테아레이트(Erythromycin stearate), 반코마이신(Vancomycin), 테이코플라닌(Teicoplanin), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 클린다마이신(Clindamycin), 트리메토프림(Trimethoprim), 설파메톡사졸(Sulfamethoxazole), 니트로푸란토인(Nitrofurantoin), 리팜핀(Rifampin), 무피록신(Mupirocin), 메트로니다졸(Metronidazole), 세팔렉신(Cephalexin), 록시트로마이신(Roxithromycin), 코-아목시클라브우아네이트(Co-amoxiclavuanate), 피페라실린과 타조박탐(Tazobactam)의 조합, 및 이들의 다양한 염, 산, 염기 및 그외 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예로, 상기 항생제 조성물에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 원핵생물 유전자의 비-코딩 가닥에 있는 서열에 충분히 상보적이다. 다른 구현예로, 상기 항생제 조성물에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 원핵생물 유전자의 비-코딩 서열에 있는 서열에 충분히 상보적이어서, 3중 가닥 구조를 형성한다. 일부 측면들로, 상기 항생제 조성물에서, 혼성화로 상기 올리고뉴클레오티드, 상기 비코딩 서열 및 상기 비코딩 서열에 상보적인 코딩 서열 간에 3중 가닥 구조가 형성된다. 다른 측면으로, 상기 항생제 조성물에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 원핵생물 유전자의 비코딩 서열에 있는 서열과 충분히 상보적이어서, 상기 올리고뉴클레오티드와 상기 비코딩 서열 간에 2중 가닥 구조를 형성한다. 일부 측면에서, 상기 비코딩 서열은 프로모터 서열이다.
일부 구현예로, 상기 항생제 조성물에서, 올리고뉴클레오티드는 3' 비코딩 서열과 혼성화된다. 다른 구현예로, 상기 항생제 조성물에서, 올리고뉴클레오티드는 5' 비코딩 서열과 혼성화된다.
또한, 본 발명은 시험관내에서 타겟 서열과 혼성화하는 항생제 조성물을 제공한다. 일부 구현예들에서, 생체내에서 타겟 서열과 혼성화하는 항생제 조성물을 제공한다.
본원에서는, 세포에, 본 발명의 항생제 조성물을, 혼성화시 타겟 유전자에 의해 코딩되는 기능성 단백질의 생산 저해를 유발하는 조건 하에, 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 기능성 타겟 유전자 생성물의 생산을 저해하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 세포에, 본원에 기술된 나노입자를 포함하는 항생제 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 원핵생물의 감염을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본원의 나노입자 및 항생제를 포함하는 키트를 제공한다.
도 1은 프로모터 복합체의 결합을 차단하는 올리고뉴클레오티드 금 나노입자 접합체(A)와 전장 mRNA 전사 형태의 형성을 차단하는 올리고뉴클레오티드 금 나노입자 접합체(B)의 개략도를 나타낸 것이다.
도 2는 접합체를 처리한 후, E. coli의 전자현미경 사진이다.
도 3은 나노입자를 이용한 박테리아 루시퍼레이즈 발현 저해 결과를 요약한 것이다. 넌센스(nosense)는 E. coli 게놈 또는 형질전환된 플라스미드와 상보적인 영역이 없는 서열이다. 안티센스는 루시퍼레이즈를 타겟팅하는 서열이다. 상대적인 루시퍼레이즈 활성은 renilla 발현으로 정규화한 막대 안에 퍼센트로 표시한다.
도 4는 듀플렉스 침투 계획을 나타낸 것이다. a) 나노입자에 의한 듀플렉스(플루오레세인 및 듀플렉스의 말단의 인접한 답실)의 침투와 이로 인한 형광 신호 방출을 나타냄. b) 짧은(20 bp) 듀플렉스와 긴(40 bp) 듀플렉스 2가지의 경우, 듀플렉스 침투에 따른 형광 증가를 나타낸 결과(회색 박스는 넌센스 서열이고, 블랙 박스는 안티센스 서열임).
본 발명은 항생제 조성물과 이의 이용 방법을 제공한다. 일 측면에서, 항생제 조성물은, 혼성화를 허용하는 조건 하에서 원핵생물 유전자의 비-코딩 타겟 서열과 혼성화될 정도로 상기 타겟 서열에 대해 충분히 상보적인, 올리고뉴클레오티드를 포함하도록 변형된 나노입자를 포함한다. 이러한 혼성화를 통해, 상기 항생제 조성물은 타겟 원핵생물 세포의 증식을 저해한다. 특정 측면에서, 타겟 세포내에서의 혼성화는 상기 타겟 서열에 의해 코딩되는 기능성 단백질의 발현을 저해한다. 다양한 측면에서, 상기 타겟 서열에 의해 코딩되는 원핵생물 단백질의 전사, 번역 또는 2가지 모두가 저해된다. 또한, 본 발명은, 세포에 상기 항생제 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서의 타겟 원핵생물의 유전자 생성물의 생산을 저해하는 방법을 제공하며, 이때, 상기 조성물의 나노입자와 조합되어 있는 상기 올리고뉴클레오티드는, 혼성화를 허용하는 조건에서 박테리아 유전자의 비코딩 타겟 서열에 대해 충분히 상보적이며, 혼성화로 인해 상기 타겟 유전자에 의해 코딩되는 원핵생물의 기능성 유전자 생성물의 저해가 이루어진다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 타겟 원핵생물 서열의 전사, 번역 또는 이 2가지 모두의 저해로 인해, 타겟 원핵생물 서열에 의해 코딩되는 기능성 단백질의 생산이 저해된다는 것을 이해할 것이다.
올리고뉴클레오티드-관능화된 나노입자와 타겟 원핵생물 서열의 혼성화를 통해, 본원에서 정의되는 "복합체"가 형성된다. 본원에서, "복합체"는 이중 가닥(또는 듀플렉스) 복합체 또는 삼중 가닥(또는 트리플렉스) 복합체이다. 본원에서, 트리플렉스 복합체와 듀플렉스 복합체는 타겟 박테리아 원핵생물의 번역 또는 전사를 저해하는 것으로 간주된다.
본원에서, "비코딩 서열"은 당해 기술 분야에서 용인되는 의미를 가진다. 일반적으로 비코딩 서열은 유전자에 의해 코딩되는 단백질 번역용 코돈을 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 측면에서, 비코딩 서열은 염색체의 서열이다. 일부 측면에서, 비코딩 서열은 염색체 외 서열이다. 일 측면에서, 비코딩 서열은 유전자의 코딩 서열 전체 또는 일부와 상보적이다. 비코딩 서열은 프로모터, 인핸서 및 발현 침묵자와 같은 조절 요소를 포함한다. 비코딩 서열의 예로는, 5' 비코딩 서열과 3' 비코딩 서열이 있다. "5' 비코딩 서열"은 코딩 서열에서 5'(상류)에 위치하고 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 5' 비코딩 서열은 개시 코돈의 상류에 있는 프로세싱되는 전체 mRNA에 존재할 수 있으며, 일차 전사체는 mRNA로의 프로세싱, mRNA 안정성 또는 번역 효율에 영향을 미칠 수 있다. "3' 비코딩 서열"은 코딩 서열에 3'(하류)에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 폴리아데닐화 신호 서열과, 그외 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 신호를 코딩하는 서열을 포함한다. 상기 폴리아데닐화 신호는 통상적으로 mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 서열의 부가력으로 특정된다.
일 구현예에서, 비코딩 서열은 프로모터를 포함한다. "프로모터"는 구조 유전자의 전사를 지시하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 개시 부위 근처, 유전자의 5' 비코딩 서열에 위치되어 있다. 전사 개시에 작용하는 프로모터내 서열 인자들은 대게 컨센서스 뉴클레오티드 서열에 의해 특정된다. 이들 프로모터 인자들은 RNA 중합효소 결합부, TATA 서열, CAAT 서열, 차별화-특이적인 요소[DSEs; McGehee et al ., Mol . Endocrinol . 7: 551 (1993)], 사이클릭 AMP 반응 인자(CRE), 혈청 반응 인자[SRE; Treisman, Seminars in Cancer Biol . 1: 47 (1990)], 글루코코르티코이드 반응 인자(GRE), 및 CRE/ATF 등의, 그외 전사 인자의 결합부[O'Reilly et al., J. Biol . Chem . 267:19938 (1992)], AP2 [Ye et al ., J. Biol . Chem . 269:25728 (1994)], SP1, cAMP 반응 인자 결합 단백질 [CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)] 및 옥타머 인자들[일반적으로, Watson et al ., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), 및 Lemaigre and Rousseau, Biochem . J. 303:1 (1994) 참조]을 포함한다. 프로모터가 유도성 프로모터라면, 전사 속도는 유도제에 반응하여 증가한다. 반면에, 프로모터가 구성적 프로모터(constitutive promoter)라면, 전사 속도는 유도제에 의해 조절되지 않는다. 또한, 억제성 프로모터들도 공지되어 있다. "코어 프로모터"는 TATA 박스 및 전사 개시를 비롯하여, 프로모터 기능에 필수적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 정의에 따라, 코어 프로모터는, 활성을 강화하거나 조직 특이적인 활성을 부여할 수 있는 특이적인 서열이 없는 조건에서도, 검출가능한 활성을 가지거나 또는 가지지 않을 수 있다.
다른 구현예에서, 비코딩 서열은 조절 인자를 포함한다. "조절 인자"는 코어 프로모터의 활성을 조절하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 예컨대, 조절 인자는 특정 원핵생물에서 주로 또는 선호적으로 전사를 실행할 수 있는 세포성 인자와 결합하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 비코딩 서열은 인핸서를 포함한다. "인핸서"는 전사 개시 부위에서의 상대적인 인핸서의 거리나 오리엔테이션에 상관없이, 전사 효율을 증가시킬 수 있는 조절 인자의 일종이다.
본원에서, 본 명세서와 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형 "정관사(a, an)" 및 "부정관사(the)"는 문맥에서 명확하게 지시된 경우를 제외하고는 복수의 참조도 포함함에 유념한다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 당해 기술 분야에서 용인되는 의미를 갖는다는 것에 유념한다.
또한, 용어 "접촉된", "접합된" 및 "관능화된" 역시 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 올리고뉴클레오티드와 나노입자의 조합(association)을 의미함에 유념한다.
"혼성화"는 왓슨-크릭 DNA 상보성, 호그스타인(Hoogstein) 결합 또는 그외 당업계에 공지된 서열-특이적인 결합 규칙에 따른, 수소 결합에 의한 핵산 2 또는 3 가닥 간의 상호작용을 의미한다. 혼성화는 당업계에 공지된 여러가지 엄격 조건 하에서 수행할 수 있다.
항생제 조성물
일부 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자 및 담체를 포함하는 항생제 조성물로서, 상기 올리고뉴클레오티드가 혼성화를 허용하는 조건 하에서 타겟 서열에 혼성화되게 될 원핵생물 유전자의 타겟 비-코딩 서열에 충분히 상보적인, 항생제 조성물을 제공한다. 다양한 구현예들에서, 항생제 조성물은, 원핵생물 세포 감염의 치료를 위해 치료가 필요한 포유류에게 치료학적 유효량으로 투여되도록 제형화된다.
다양한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 원핵생물 유전자의 혼성화가, 원핵생물 세포의 증식을 저해(또는 저지)할 것으로 생각된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 원핵생물 유전자의 혼성화로, 일 측면에서, 원핵생물이 박테리아인 경우에, 제균 작용 또는 살세균 작용이 이루어질 것으로 생각된다. 혼성화가 생체내에서 이루어지는 경우, 원핵생물 세포의 증식은 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 비접촉된 원핵생물 세포의 증식과 비교하여 약 5% 까지 저해된다. 다양한 측면에서, 원핵생물 세포의 증식은, 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 비접촉시된 원핵생물 세포의 증식과 비교하여, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배, 약 50배 또는 그 이상으로 저해된다.
혼성화가 시험관내에서 이루어지는 경우, 원핵생물 세포의 증식은, 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 비접촉시된 원핵생물 세포의 증식과 비교하여, 약 5% 까지 저해된다. 다양한 측면에서, 원핵 세포의 증식은, 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 비접촉시된 원핵생물 세포의 증식과 비교하여, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배, 약 50배 또는 그 이상으로 저해된다.
당해 기술 분야의 당업자는, 생체내 저해든 또는 시험관내 저해든 간에, 일상적인 기법을 이용하여 원핵 세포의 증식 저해 수준을 결정할 수 있다. 예컨대, 원핵 세포의 직접 수 정량은, 일정 기간 동안 채집한 샘플 세트를 수득하고(예, 생체내 저해인 경우, 체액; 또는 시험관내 저해의 경우, 액상 배양 샘플), 상기 샘플을 고상 증식-허용 배지 상에서 배양한 다음, 증식가능한 재생된 원핵 세포의 수를 측정하여, 수행한다. 최후 시간대의 원핵 세포의 수 대 최초 시간대의 원핵 세포수로 원핵 세포증식의 저해율을 구한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 원핵 생물의 유전자와의 혼성화는, 원핵생물 유전자에 의해 코딩되는 원핵생물의 기능성 단백질의 발현을 저해한다. 본원에서, "원핵생물의 기능성 단백질"은 원핵생물 유전자에 의해 코딩되는 전장의 야생형 단백질을 지칭한다. 일 측면에서, 원핵생물의 기능성 단백질의 발현은 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 비접촉된 세포의 경우와 비교하여 약 5% 저해된다. 다양한 측면에서, 기능성 원핵생물 단백질의 발현은 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 비접촉된 세포의 경우와 비교하여 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배, 약 50배 또는 그 이상 저해된다.
관련 측면으로, 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 원핵생물 유전자 간의 혼성화는, 원핵 세포 증식에 필수적인 기능성 단백질의 발현을 저해한다. 일 측면에서, 원핵 세포 증식에 필수적인 기능성 원핵생물 단백질의 발현은 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 비접촉된 세포의 경우와 비교하여 약 5% 저해된다. 다양한 측면에서, 원핵 세포 증식에 필수적인 기능성 원핵생물 단백질의 발현은 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 비접촉된 세포의 경우와 비교하여 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배, 약 50배 또는 그 이상 저해된다.
증식에 필수적인 원핵생물 단백질로는, 그람 음성 유전자 생성물, 그람 양성 유전자 생성물, 세포 주기 유전자 생성물, DNA 복제에 참여하는 유전자 생성물, 세포 분역 유전자 생성물, 단백질 합성에 참여하는 유전자 생성물, 박테리아 자이레이즈 및 아실 캐리아 유전자 생성물을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이러한 종류들은 이하 본원에서 상세하게 논의된다.
또한, 본 발명은, 원핵 생물 유전자의 비코딩 타겟 서열과의 혼성화시, 원핵생물 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 변형된 활성으로 발현되는, 항생제 조성물을 포함한다. 일 측면에서, 원핵생물 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현은 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 접촉되지 않은 세포에서의 단백질 발현과 비교하여 약 5% 감소된다. 다양한 측면에서, 원핵생물 단백질의 활성은 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 접촉되지 않은 세포에서의 단백질 발현과 비교하여 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 감소된다. 다양한 측면에서, 원핵생물 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성은 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 접촉되지 않은 세포에서의 단백질 활성과 비교하여 약 5% 증가된다. 다양한 측면에서, 원핵생물 단백질의 발현은 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 접촉되지 않은 세포에서의 단백질의 활성과 비교하여 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배, 약 50배 또는 그 이상 증가된다.
원핵 세포에서의 단백질의 활성은, 나노입자에 부착된 올리고뉴클레오티드의 서열, 타겟이 되는 원핵생물의 유전자(즉, 그 유전자에 의해 코딩되는 단백질) 및 나노입자의 크기 등 몇 가지 파라미터에 따라 증가 또는 감소된다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 항생제 조성물의 원핵생물 유전자의 전사 저해를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 항생제 조성물의 원핵생물 유전자의 번역 저해를 포함한다.
일부 구현예에서, 항생제 조성물은 항생제에 대한 내성을 부여하는 원핵생물 유전자의 비코딩 타겟 서열과 혼성화된다. 이러한 유전자들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있으며, 예컨대 Liu et al ., Nucleic Acids Research 37: D443-447, 2009 (그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 논의되어 있다. 일부 측면에서, 항생제에 대해 내성을 부여하는 원핵생물 유전자의 비코딩 타겟 서열에 대한, 항생제 조성물의 혼성화는, 항생제에 대한 원핵생물 감수성을 증가시키게 된다. 일 측면에서, 원핵생물의 항생제 감수성은 항생제 조성물과 접촉되지 않은 원핵생물의 감수성과 비교하여 약 5% 증가된다. 다양한 측면에서, 원핵생물의 항생제 감수성은 항생제 조성물과 접촉되지 않은 원핵생물의 감수성과 비교하여 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 20배, 약 50배 또는 그 이상 증가된다. 항생제에 대한 상대적인 감수성은 본원에 기술된 일반적인 기법을 이용하여 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정할 수 있다.
항생제와의 병용 치료( Combination Therapy)
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자 접합체를 포함하는 항생제 조성물은 항생제와 병용하여 각각 치료학적 유효량으로 투여하기 위해 제형화된다.
본원에서, 용어 "항생제"는, 감염성 질병의 치료에 주로 사용되는, 박테리아 및 그외 미생물의, 증식 저해 또는 사멸 능력을 가지고 있는 일군의 화학물질들 중 임의의 것을 의미한다. 예로, 미국 특허 7,638,557이 있다(그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 항생제의 예로는, 페니실린 G, 메티실린(Methicillin), 나프실린(Nafcillin), 옥사실린(Oxacillin), 클록사실린(Cloxacillin), 디클록사실린(Dicloxacillin), 암피실린(Ampicillin), 아목시실린(Amoxicillin), 티카르실린(Ticarcillin), 카르베니실린(Carbenicillin), 메즐로실린(Mezlocillin), 아즐로실린(Azlocillin), 피페라실린(Piperacillin), 이미페넴(Imipenem), 아즈트레오남(Aztreonam), 세팔로틴(Cephalothin), 세팍클로르(Cefaclor), 세폭시틴(Cefoxitin), 세푸록심(Cefuroxime), 세포니시드(Cefonicid), 세프메타졸(Cefmetazole), 세포테탄(Cefotetan), 세프프로질(Cefprozil), 로라카르베프(Loracarbef), 세페타메트(Cefetamet), 세포페라존(Cefoperazone), 세포탁심(Cefotaxime), 세프티족심(Ceftizoxime), 세프트리아손(Ceftriaxone), 세프타지딤(Ceftazidime), 세페핌(Cefepime), 세픽심(Cefixime), 세프포독심(Cefpodoxime), 세프설로딘(Cefsulodin), 플레록삭신(Fleroxacin), 날리딕스산(Nalidixic acid), 노르플록삭신(Norfloxacin), 시프로플록산신(Ciprofloxacin), 오플록삭신(Ofloxacin), 에녹삭신(Enoxacin), 로메플록삭신(Lomefloxacin), 시녹삭신(Cinoxacin), 독시사이클린(Doxycycline), 미노사이클린(Minocycline), 테트라사이클린(Tetracycline), 아미카신(Amikacin), 젠타미신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycin), 네틸미신(Netilmicin), 토브라마이신(Tobramycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 아지트로마이신(Azithromycin), 클라리트로마이신(Clarithromycin), 에리트로마이신(Erythromycin), 에리트로마이신 에스톨레이트(Erythromycin estolate), 에리트로마이신 에틸 숙시네이트(Erythromycin ethyl succinate), 에리트로마이신 글루코헵토네이트(Erythromycin glucoheptonate), 에리트로마이신 락토비오네이트(Erythromycin lactobionate), 에리트로마이신 스테아레이트(Erythromycin stearate), 반코마이신(Vancomycin), 테이코플라닌(Teicoplanin), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 클린다마이신(Clindamycin), 트리메토프림(Trimethoprim), 설파메톡사졸(Sulfamethoxazole), 니트로푸란토인(Nitrofurantoin), 리팜핀(Rifampin), 무피록신(Mupirocin), 메트로니다졸(Metronidazole), 세팔렉신(Cephalexin), 록시트로마이신(Roxithromycin), 코-아목시클라브우아네이트(Co-amoxiclavuanate), 피페라실린과 타조박탐(Tazobactam)의 조합, 및 이들의 다양한 염, 산, 염기 및 그외 유도체가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 항-박테리아성 항생제로는, 페니실린, 세팔로스포린, 카르바세펨, 세파마이신, 카르바페넴, 모노박탐, 아미노글리코시드, 글리코펩타이드, 퀴놀론, 테트라사이클린, 마크롤라이드 및 플루오로퀴놀론이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
투약 및 약학 조성물
본원에서, 용어 "치료학적 유효량" 은 확정된 질병이나 증상을 치료, 완화 또는 방지하거나, 검출가능한 치료 효과, 예방 효과 또는 저해 효과를 나타내는데 충분한 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 효과는 예컨대 임상적인 상태 개선, 증상 경감에 의해, 또는 본원에 기술된 분석에 의해 검출할 수 있다. 개체에 대한 정확한 유효량은 개체의 체중, 신장 및 건강; 증상의 특성과 수준; 및 투여용으로 선택된 항생제 조성물 또는 조성물의 조합에 따라 결정될 것이다. 주어진 상황에 대한 치료학적 유효량은 당업자의 일상적인 실험과 임상 전문가의 판단으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 항생제 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제와 함께 약학 조성물 형태로 제형화될 수 있다. 화합물 또는 항생제 조성물을 포함하는 조성물은 원핵생물의 감염 또는 증상의 치료를 허용하는 임의 경로에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 경구 투여이다. 부가적으로, 화합물 또는 항생제 조성물을 포함하는 조성물은, 정맥내, 복막내, 폐내, 피하 또는 근육내와 같은 비경구, 강내(intrathecal), 진피내, 직장내, 경구, 코내 또는 주입에 의해서 등의, 임의의 표준적인 투여 경로를 이용하여 환자에게 전달할 수 있다. 또한, 위장관 안에서 체액과 접촉시 활성 성분의 조절성 방출을 달성하고, 혈장내 활성 제제의 실질적으로 일정하고 유효한 수준을 제공하기 위해, 본원에 기술된 물질들로 서방형 제형을 제조할 수도 있다. 상기한 목적을 위해, 생물학적 생분해성 폴리머, 수용성 폴리머 또는 이 둘의 혼합물, 및 선택적으로 적합한 계면활성제로 구성된 폴리머 매트릭스 내에, 결정 형태가 임베딩(embedding)되어질 수 있다. 임베딩은 폴리머 매트릭스 안으로의 미세입자의 혼입을 의미할 수 있다. 또한, 조절성 방출 제형도 공지된 분산 또는 에멀젼 코팅 기법을 통해, 분산된 미세입자 또는 에멀젼화된 미세-액적의 캡슐화를 통해, 수득한다.
투여는, 단회 투약 투여의 형태를 취할 수 있거나, 구현예의 화합물은 분할 투여 또는 지속-방출 제형 또는 투여 방법(예, 펌프)으로 일정 기간 동안 투여될 수 있다. 그러나, 구현예의 화합물은 개체에게 투여되며, 투여되는 화합물의 양과 투여 경로는 질병 상태의 효과적인 치료를 허용하도록 선택되어야 한다.
일 구현예에서, 약학 조성물은 특정 투여 방식과 투약 형태에 따라, 담체, 용매, 안정화제, 보강제, 희석제 등의 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 제형화될 수 있다. 약학 조성물은 생리학적으로 적합한 pH를 달성하도록 일반적으로 제형화되어야 하며, 제형 및 투여 경로에 따라, pH 약 3 내지 약 11, 바람직하게는 약 pH 3 - 약 7의 범위일 수 있다. 다른 구현예에서, pH는 약 pH 5.0 - 약 pH 8의 범위로 조정하는 것이 바람직할 수 있다. 보다 구체적으로, 약학 조성물은, 다양한 측면에서, 치료학적 또는 예방학적 유효량의 본원에 기술된 하나 이상의 조성물을 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 약학 조성물은 본원에 기술된 화합물의 조합을 선택적으로 포함할 수 있다.
용어, "약학적으로 허용가능한 부형제"는 본원에 기술된 화합물과 같이 약학 제제의 투여를 위한 부형제를 지칭한다. 이 용어는 과도한 독성없이 투여할 수 있는 모든 약학적 부형제를 의미한다.
약학적으로 허용가능한 부형제는, 부분적으로, 투여 중인 특정 조성물에 의해, 뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 즉, 약학 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다(참조, 예, Remington's Pharmaceutical Sciences).
적합한 부형제는, 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 아미노산 폴리머, 아미노산 코폴리머 및 무활성의 바이러스 입자 등의, 크고, 느리게 대사되는 마크로분자를 포함하는, 담체 분자일 수 있다. 다른 예시적인 부형제로는, 항산화제(예, 아스코르브산), 킬레이팅제(예, EDTA), 탄수화물(예, 덱스트린, 하이드록시알킬 셀룰로스 및/또는 하이드록시알킬메틸셀룰로스), 스테아르산, 액체(예, 오일, 물, 염수, 글리세롤 및/또는 에탄올), 습윤제 또는 유화제, pH 완충화제 등이 있다. 또한, 리포좀도 약학적으로 허용가능한 부형제의 범위에 포함된다.
부가적으로, 약학 조성물은, 멸균 주사용 수계 에멀젼 또는 오일성 현탁액과 같은 무균성 주사용 조제물의 형태일 수 있다. 이 에멀젼 또는 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 이용하여 당해 기술 분야의 당업자에 의해 제형화될 수 있다. 이 무균성 주사용 조제물은, 1,2-프로판-디올 중의 용액과 같이, 무독성의 비경구 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 무균성 주사용 용액 또는 현탁액일 수 있다.
또한, 무균성 주사용 조제물은 동결건조된 분말로서 조제될 수 있다. 이용될 수 있는 비히클 및 용매는 물, 링거액 및 등장성 소듐 클로라이드 용액이다. 또한, 무균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 이를 위해, 합성 모노- 또는 디글리세라이드 등의 임의의 블랜드 고정 오일을 사용할 수 있다. 또한, 지방산(예, 올레산)을 주사제 제조에 마찬가지로 사용할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 서열 및 원핵생물의 단백질 저해
일부 측면에서, 본 발명은 특정 핵산을 타겟팅하는 방법을 제공한다. 임의 타입의 원핵생물의 핵산을 타겟팅할 수 있으며, 상기 방법은, 예컨대 기능적인 원핵생물 유전자 생성물의 생산을 저해하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 타겟팅 될 수 있는 핵산의 예로는 유전자 및 원핵생물의 RNA 또는 DNA가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
원핵생물의 타겟 핵산의 경우, 다양한 측면에서, 핵산은 게놈 DNA로부터 전사되는 RNA이다.
제공되는 세포에서 타겟 원핵생물 단백질의 생산을 저해하는 방법은, 타겟 유전자 생성물의 발현을, 올리고뉴클레오티드-관능화된 나노입자의 부재시의 유전자 생성물 발현과 비교하여, 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 100% 저해하는 것을 포함한다. 즉, 제공되는 방법은 타겟 유전자 생성물의 발현에 대한 임의의 저해 수준 형성을 포함한다.
저해 정도는, 예컨대 타겟 원핵생물이 발견되며 원핵생물 단백질의 저해가 바람직한 개체의 체액 샘플로부터, 또는 타겟 원핵생물이 발견되며 원핵생물 단백질의 저해가 바람직한 개체에서 당해 기술 분야에 공지된 이미지화 기법에 의해, 생체내에서 결정한다. 다른 예로, 저해 정도는, 세포 배양물내 잔류하는 원핵생물 또는 유기체의 양을, 보다 앞선 시간대에 세포 배양물에 존재하였던 원핵생물이나 유기체의 양과 비교하여, 정량화함으로써, 생체내에서 결정한다.
트리플렉스 복합체가 형성되는 구현예에서, 원핵생물 게놈내 돌연변이의 도입도 고려된다. 이러한 구현예에서, 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자 접합체는 돌연변이를 포함하며, 트리플렉스 복합체의 형성은 나노입자에 부착된 올리고뉴클레오티드와 원핵생물 게놈의 가닥 간의 재조합이 이루어지게 한다.
항-원핵생물 올리고뉴클레오티드
본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 타겟 올리고뉴클레오티드 서열과의 혼성화시, Tm이 더 높을 수 있지만, 예컨대 65℃일 수 있지만, 적어도 약 45℃, 전형적으로 약 50℃ - 60℃의, Tm을 가진다. 원핵생물의 타겟 폴리뉴클레오티드 서열 및 원핵생물 mRNA 타겟 폴리뉴클레오티드 서열의 선택에 대해서는 이하 하기에서 논의된다.
일 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 생리적 조건 하에서 타겟 원핵생물 서열과 혼성화 되도록 설계되며, Tm은 실질적으로 37℃ 보다 높으며, 예컨대 적어도 45℃, 바람직하게는 60℃ - 80℃이다. 올리고뉴클레오티드는, 핵산과 높은 결합 친화성을 가지도록 설계되며, 일 측면에서, 타겟 원핵생물 서열과 100% 상보성이거나 또는 미스매치를 포함할 수도 있다. 본 방법에서, 올리고뉴클레오티드는, 타겟 원핵생물 서열에 대해 95% 보다 높은 상보성, 타겟 원핵생물 서열에 대해 90% 보다 높은 상보성, 타겟 원핵생물 서열에 대해 80% 보다 높은 상보성, 타겟 원핵생물 서열에 대해 75% 보다 높은 상보성, 타겟 원핵생물 서열에 대해 70% 보다 높은 상보성, 타겟 원핵생물 서열에 대해 65% 보다 높은 상보성, 타겟 원핵생물 서열에 대해 60% 보다 높은 상보성, 타겟 원핵생물 서열에 대해 55% 보다 높은 상보성, 타겟 원핵생물 서열에 대해 50% 보다 높은 상보성을 가진다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 올리고뉴클레오티드 변형된 나노입자 접합체에 대한 적합한 타겟을 쉽게 결정할 수 있으며, 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 설계 및 합성할 수 있을 것으로 이해된다. 타겟은, 예컨대 대상 타겟 핵산의 서열을 (예, 유전자은행으로부터) 입수하고, 이를 예컨대 MacVector 6.0 프로그램, ClustalW 알고리즘, BLOSUM 30 매트릭스, 및 디폴트 파라미터(핵산 정렬에서, 오픈 갭 패널티 10, 연장된 갭 패널피 5.0)를 이용하여 다른 핵산 서열과 정렬함으로써, 동정할 수 있다.
임의의 필수적인 원핵생물 유전자가 본 발명의 방법을 이용하는 타겟 유전자로서 고려된다. 전술한 바와 같이, 임의의 원핵생물 종에 필수적인 원핵생물 유전자는, E. coli에 대해 Gerdes [Gerdes et al ., J Bacteriol . 185(19): 5673-84, 2003]가 기술한 방법 등의 다양한 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 많은 필수 유전자들이 박테리아계에 전반적으로 보존되어 있어, 타겟 선택에 대한 추가적인 본보기로 제공된다. 타겟 유전자 서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 보유한 리소스 등의 쉽게 이용가능한 생물정보 리소스를 이용하여 동정할 수 있다. 동정된 필수 박테리아 유전자에 대해, 매우 많은 수의 미생물 종에 대한 전체 참조 게놈 서열을 입수하여, 서열 분석할 수 있다. 또한, 일 측면에서, 박테리아 균주는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 수득한다. 임의의 주어진 종들에 대한 적절한 배양 배지 및 조건을 이용하여, 간단한 세포 배양 방법을 확립함으로써, 올리고뉴클레오티드 변형된 나노입자 접합체의 항-박테리아 활성을 측정할 수 있다.
그런 다음 최적의 활성을 보이는 올리고뉴클레오티드 변형된 나노입자 접합체를 동물 모델 또는 수의 동물에서 인간 감염 치료용으로 사용하기 전에 테스트한다.
세포-분열 및 세포 주기 타겟 단백질에 대한 타겟 서열
본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 필수 원핵생물 유전자를 코딩하는 원핵생물의 핵산의 서열과 혼성화 되도록 설계된다. 예시적인 유전자로는, 세포 분열에 필요한 유전자, 세포 주기 단백질 또는 지질 생합성이나 핵산 복제에 필요한 유전자가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 임의의 필수 박테리아 유전자가, 유전자의 불가결성이 확인되면, 타겟이 된다. 유기체의 유전자가 필수적인지를 결정하는 한가지 방법은, 기술된 유전자 풋프린팅 기법을 이용하는 것이다[Gerdes et al ., J Bacteriol. 185(19): 5673-84, 2003, 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨]. 이 보고서에서, 620개의 E. coli 유전자들이 필수적인 것으로 동정되었고, 3,126개의 유전자가 편성 호기성(robust aerobic) 증식용 배양 조건 하에서 증식하는데 중요하지 않은 것으로 동정되었다. 진화 관계 분석에서, 상당수의 E. coli 필수 유전자, 특히 DNA 복제, 세포 분열 및 단백질 합성과 같은 중요한 세포성 과정에 관여하는 유전자 세트가, 박테리아계 전체에 보존되어 있는 것으로 확인되었다.
다양한 측면에서, 본 발명은, 다음과 같은, 박테리아의 필수 단백질을 코딩하는 타겟 서열에, 안정적이고 특이적으로 결합하는데 유효한 핵산 서열인, 올리고뉴클레오티드를 제공한다: (1) 식중독과 관련있는 E. coli 균주, 예컨대 O157:H7과 같은 주어진 박테리아 종들 중 특정 균주에 특이적인 서열(미국 특허 출원번호 20080194463의 표 1 참조, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨); (2) 2종 이상의 박테리아 종에 공통된 서열; (3) 2종의 관련 박테리아 속에 공통된 서열(즉, 비슷한 계통 발생적 오리진의 박테리아 속); (4) 그람 음성 박테리아들에서 일반적으로 보존된 서열; (5) 그람 양성 박테리아들에서 일반적으로 보존된 서열; 또는 (6) 일반적으로 필수 박테리아 단백질-코딩 핵산 서열에 대한 컨센서스 서열.
일반적으로, 본 발명의 방법을 이용하여 유전자 발현을 조절하기 위한, 타겟은, 비제한적으로, zipA, sulA, secA, dicA, dicB, dicC, dicF, ftsA, ftsI, ftsN, ftsK, ftsL, ftsQ, ftsW, ftsZ, murC, murD, murE, murF, murg, minC, minD, minE, mraY, mraW, mraZ, seqA 및 ddlB 등의, 세포 분열 및 세포벽 합성(세포벽 분역 또는 dcw) 유전자 클러스터의 유전자로부터 전사되는 mRNA 서열 등의, 활발한 원핵생물 증식 또는 복제 기간 동안에 발현되는, 원핵생물의 핵산을 포함한다. 박테리아 세포 분열과 E. coli의 세포 주기 각각에 대한 일반적인 리뷰로서, [Bramhill, Annu Rev Cell Dev Biol . 13: 395-424, 1997], 및 [Donachie, Annu Rev Microbiol . 47: 199-230, 1993]을 참조하며, 2가지 문헌 모두 본원에 원용에 의해 명확하게 포함된다. 추가적인 타겟으로는 지질 생합성(예, acpP) 및 복제(예, gyrA)에 관여하는 유전자를 포함한다.
E. coli의 세포 분열에는 세포 외막 3층(세포질막, 고정된 펩티도글리칸 층 및 외막) 전체의 조화된 함입이 수반된다. 격막의 압착으로 세포는 2개의 구획으로 분할되고, 복제된 DNA가 분리된다. 9개 이상의 필수 유전자 생성물이 이 과정에 참여된다: ftsZ, ftsA, ftsQ, ftsL, ftsI, ftsN, ftsK, ftsW 및 zipA [Hale et al ., J Bacteriol . 181(1): 167-76, 1999]. 고려되는 단백질 타겟은 하기에서 논의되는 3종이며, 특히 하기에 기술된 GyrA와 AcpP 타겟이다.
FtsZ는, E. coli에서 최초기의 필수 세포 분열 유전자들 중 한가지이며, 박테리아 세포의 분열 부위에서 막-조합된 고리를 형성하는, 가용성의 투불린-유사 GTPase이다. 이 고리는 세포 압착을 유도하는 것으로 생각되며, 세포벽 함입에 작용하는 것으로 보인다. FtsZ는, E. coli에서 세포 분열을 매개하는 격막 고리 구조의 필수 성분인, zipA라고 하는 E. coli의 신규한 내재 내부 막 단백질(integral inner membrane protein)에 바로 결합한다[Lutkenhaus et al ., Annu Rev Biochem . 66: 93-116, 1997].
GyrA는 박테리아 자이레이즈 효소의 서브유닛 A와 이의 유전자를 지칭한다. 박테리아 자이레이즈는 세포에서 DNA의 슈퍼코일링 수준을 조절하는 박테리아 DNA 토포이소퍼레이즈들 중 하나이며, DNA 복제에 필요하다.
AcpP는, 지질 생합성의 필수 조인자인 아실 캐리아 단백질을 코딩한다. 지방산 합성 경로에서, 열 안정적인 조인자인 아실 캐리어 단백질의 경로에서 중간산물과의 결합이, 필수적이다.
이러한 3종의 단백질들 각각에 대해, 미국 출원번호 20080194463의 표 1에 다수의 중요한 병인성 박테리아 각각에 대한 타겟 서열을 포함하는 예시적인 박테리아 서열이 제공되어 있다. 유전자 서열은 각 박테리아 균주에 대한 유전자은행 레퍼런스 전체 게놈 서열로부터 유래된다.
원핵생물의 16S 리보좀 RNA에 대한 타겟 서열
일 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 박테리아 16S rRNA 핵산 서열을 코딩하는 서열과 생리학적 조건에서 혼성화되고, Tm이 실질적으로 37℃ 보다 높게, 예컨대 45℃ 이상, 바람직하게는 60℃ - 80℃가 되도록, 설계된다.
보다 구체적으로, 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 특징들 중 한가지 이상의 특징을 가진 타겟 16S rRNA 유전자 서열에 안정적이고 특이적으로 결합하는데 유효한 서열을 가진다: (1) 16s RNA의 이중 가닥 서열에서 발견되는 서열, 예컨대, 16S rRNA 서열의 펩티딜 전이효소 센터, 알파-사르신(sarcin) 루프 및 mRNA 결합 서열; (2) 박테리아 16s rRNA의 단일 가닥 서열에서 발견되는 서열; (3) 해당 박테리아 종의 특정 균주, 즉, 식중독과 관련된 E. coli의 균주에 특이적인 서열; (4) 박테리아 특정 종에 특이적인 서열; (5) 하나 이상의 박테리아 종에 공통된 서열; (6) 2종의 밀접한 2종의 박테리아(즉, 비슷한 계통발생적 오리진의 박테리아 속)에 공통된 서열; 또는 (7) 일반적으로 박테리아 16S rRNA 서열의 컨센서스 서열.
16S rRNA 서열에 대한 예시적인 박테리아 및 관련 유전자은해 등재 번호는 미국특허 6,677,153의 표 1에 제공되어 있으며, 상기 문헌은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
대장균(E. coli)은 위장관의 정상 세포총의 일부인 그람 음성 박테리아이다. E. coli 균주는 수백 종이 있으며, 대부분은 유해하며, 건강한 인간과 동물의 위장관에서 살아간다. 현재, 인간에게서 위장염을 유발하는 장병독성 E. coli의 인지된 클래스("EEC 그룹")는 4종이다. 그 중, 장병원성(EPEC) 균주들이 있으며, 이의 병독 기전은 전형적인 E. coli 장독소의 배출과 관련있다. 이러한 E. coli 균주들은, 위장관 및 비뇨관의 감염과 관련된 질환, 패혈증, 폐렴 및 수막염 등의 다양한 질환을 야기할 수 있다. 항생제는 일부 균주에서는 효과가 없으며, 반드시 감염 재발을 예방하는 것은 아니다.
예컨대, 미국에서 E. coli 균주 0157:H7은 해마다 10,000 내지 20,000건의 감염을 야기하는 것으로 추정되고 있다(연방 질병통제 및 예방 센터). 출혈성 대장염은 E. coli O157:H7에 의해 유발되는 급성 질환명이다. 취학 전 아동과 노년층에서 심각한 합병증 발생 위험성이 가장 높다. E. coli 균주인 0157:H7은 최근 태평양 북서부 지방에서 패스트-식품을 파는 레스토랑에서 설익은 햄버거를 먹고 사망한 4건의 어린이 사망의 원인으로 보고되었다[참조, 예컨대, Jackson et al ., Epidemiol. Infect. 120(1):17-20, 1998].
장병독성 E. coli 균주에 대한 예시적인 서열은 유전자은행 등재 번호 X97542, AF074613, Y11275 및 AJ007716을 포함한다.
살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)은, 국소 위장 감염, 위장염(설사, 복부 경련 및 열)에서 중증 전신 질환인 장 열(장티푸스 포함)에 이르는 임상 범위의 다양한 증상을 야기하는 그람 음성 박테리아이다. 살모넬라 감염은 또한 가축의 막대한 손실을 유발한다.
전형적인 그람 음성 바실러스인 살모넬라 spp.의 세포벽에는 세포의 라이시스(lysis)시 유리되는 컴플렉스 리포폴리사카라이드(LPS) 구조를 포함하고 있으며, 유기체의 병독성에 작용하는 내독소로서 작용할 수 있다.
살모넬라는 충분하게 익히지 않은 육류와 육가공품에서 생육하기 때문에, 오염된 식품이 비-장티푸스성 살모넬라 감염의 주된 전파 방식이다. 대부분의 공통된 동물원은 닭, 칠면조, 돼지 및 소이며, 또한 수많은 기타 가금 및 야생 동물이 포함된다. 살모넬라 spp.에 의해 유발되는 장티푸스 및 다른 장 열의 역학은 인간의 변으로 오염된 물과 관련있다.
장티푸스에 대한 백신을 사용할 수 있으며, 백신은 부분적으로 효과적이지만, 비-장티푸스성 살모넬라 감염에는 유효하지 않다. 비-장티푸스성 살모넬라증은 위생 도축 실무와 철저한 조리 및 식품의 냉장 보관을 통해 방제한다. 항생제는 전신 질환용으로 처방되고 있으며, 일부에서는 암피실린이 성공적으로 사용되고 있다. 그러나, 과량의 항생제 치료를 받는 환자, 위 수술한 후 면역억제제 치료를 받는 환자, 그리고 용혈성 빈혈, 백혈병, 림프종 또는 AIDS 환자의 경우에는, 살모넬라 감염은 의학적인 문제로 남아있다.
슈도모나스 spp.는 대부분의 항생제에 내성이기 때문에 임상적으로 중요한, 운동성 그람 음성 간균으로, 병원 획득성(병원내) 감염의 주요 원인이다. 감염은 면역약화된(immunocompromised) 개체, 화상 환자, 호흡기 장착 환자, 유치 도뇨관을 꽂고 있는 환자, IV 마취제 사용자 및 만성 폐 질환자(예, 낭포성 섬유증)에서 가장 흔하다. 건강한 개체에서는 감염이 드물지만, 많은 부위에 침범하여, 비뇨관 감염, 패혈증, 폐렴, 인두염 및 그외 다수의 문제를 야기할 수 있으며, 치료에 실패하는 경우가 많아 사망율이 보다 높은 편이다.
슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)는 단극성 운동성을 가진 그람 음성의 호기성 간균 박테리아이다. 인간 기회감염성 인간 병원체인 슈도모나스 에어루지노사는 또한 식물의 기회감염성 병원체이다. 다른 슈도모나스 균주와 마찬가지로, 슈도모나스 에어루지노사는 다양한 피그먼트들을 분비한다. 슈도모나스 에어루지노사에 대한 최종적인 임상 동정에는, 피오시아닌 및 플루오레세인 2가지의 생산과 유기체의 42℃에서의 생육력 동정이 포함될 수 있다. 또한, 슈도모나스 에어루지노사는 디젤과 제트 연료에서 증식할 수 있어, 미생물 부식을 야기하는, 탄화수소 활용 미생물로서(또는 "HUM bug") 알려져 있다.
비브리오 콜레라(Vibrio cholera)는 인간에 감염하는 그람 음성의 간균으로, 위생 불량으로 전파되며 물 공급원을 오염시키는 질환인 콜레라를 야기한다. 비브리오 콜레라는 인간 소장에서 군락을 이룰 수 있으며, 여기에서 점막을 통한 이온 전달을 파괴하여, 설사와 수분 부족을 야기하는 독소를 생산한다. 비브리오 콜레라에 감염된 개체에는 전해질이 포함된 용액을 정맥내 또는 경구로 공급하여 수분을 보충시켜야 한다. 이러한 질환은 대게 자체-제어되지만, 탈수와 필수 전해질 감소로 인해 사망에 이를 수도 있다. 테트라사이클린과 같은 항생제가 이 질병의 진행을 단축시키는 것으로 입증되고 있으며, 현재 경구 백신이 개발 중에 있다.
나이세리아 고노리아(Neisseria gonorrhoea)는, 일반적인 성 접촉에 의해 전염되는 질환인 임질의 원인 물질인, 그람 음성 구균이다. 나이세리아 고노리아는 이의 표면 항원이 바뀔 수 있어 재감염에 대한 면역성 형성이 어렵다. 거의 750,000건의 임질 사례들이 미국에서만도 매해 보고되고 있으며, 매해 보고되지 않는 사례도 750,000건으로 예측되고 있으며, 대부분이 십대와 젊은 성인층이다. 임질 치료용으로는 암피실린, 아목시실린 또는 일부 타입의 페니실린들의 사용이 권고되고 있다. 그러나, 페니실린-내성 임질의 발생이 증가하고 있으며, 현재 대부분의 임질균 감염의 치료에는, 주사에 의해 제공되는 새로운 항생제, 예컨대 세프트리악손 또는 스펙티노마이신이 사용되고 있다.
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)는 인간 코에서 정상적으로 군락을 이루며, 때때로 피부에서도 발견되는, 그람 양성 구균이다. 스타필로코커스는 혈류 감염, 폐렴 및 병원내 감염을 유발할 수 있다. 스타필로코커스 아우레우스는 중증 식중독을 야기할 수 있으며, 많은 균주들이 식품에서 생육하여 외독소를 생산한다. 일반적인 항생제, 예컨대 반코마이신에 내성인 스타필로코커스가 미국에서 출현하여, 지역사회와 병원 환경 모두에서 주된 공중 보건 과제로 확산되고 있다. 현재, 반코마이신-내성인 스타필로코커스 아우레우스는 일본에서도 동정되었다.
미코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)는 때로는 불구를 만드는 치명적인 질환인, 결핵의 원인 물질인 그람 양성 박테리아이다. 결핵은 전 세계적으로 증가하는 추세에 있으며, 단일 감염 질환으로 인한 사망의 주된 요인이다(현재 사망율은 3백만건/년임). 결핵은 뇌, 신장 및 뼈를 비롯한 신체 장기 몇 곳에 침범할 수 있지만, 가장 흔히 발병하는 부위는 폐이다.
미국에서, 양성 피부 검사에 의한 결과에 따르면, 약 천만명이 미코박테리움 투베쿨로시스로 감염되어 있으며, 매해 약 26,000건이 활동성 질환으로 새롭게 발병되고 있다. 결핵(TB) 사례 증가는 HIV/AIDS, 노숙, 약물 남용 및 활동성 감염 환자의 이주와 관련되어 있다. 현재, 약물-감수성 TB에 대한 치료 프로그램은 6개월 내지 9개월 동안 2종 또는 4종의 약물(예, 이소니아지드, 리팜핀, 피라진아미드, 에탐부톨 또는 스트렙토마이신)을 복용하는 것인데, 그 이유는 TB 병균들은 모두 한가지 약물에 의해서는 파괴되지 않기 때문이다. 또한, 미코박테리움 투베쿨로시스의 약물-내성 및 다약제 내성 균주의 출현이 증가되고 있다.
헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori)(H. pylori)는 위의 내벽에 감염되는 나선형 또는 S형 형태를 띄는 미세-호기성, 그람 음성, 느리게 증식하는 편모를 가진 유기체이다. 헬리코박터 필로리는 만성적인 표재성 위염, 소화성 궤양 질환 및 만성적인 위축성 위염과 관련있는 인간 위 병원체로서, 위 선암을 유발한다. 헬리코박터 필로리는 인간에서 가장 흔한 만성적인 박테리아 감염증 중 하나이며, 활동성 위염을 앓고 있는 환자의 90% 이상에서 발견된다. 현재의 치료법은 대부분의 사례들에서 헬리코박터 필로리를 근절하는, 비스무스, 메트로니다졸 및 테트라사이클린 또는 아목시실린을 이용한 3중 약물 치료법이다. 3중 치료법의 문제점으로 환자의 순응성, 부작용과 메트로니다졸 내성이 있다. 가능성 있는 것으로 보이는 대안적인 이중 치료제 요법은 아목시실린 + 메트로니다졸 또는 오메프라졸 + 아목시실린을 이용하는 방법이다.
스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)는 그람 양성 구균으로서, 세균성 폐렴 뿐만 아니라 중이 감염증(중이염) 및 수막염의 가장 일반적인 요인이다. 미국에서, 매해 뉴모니아에 의한 질환들 중 균혈증은 약 50,000건에 달하며, 수막염은 3,000건, 입원 사례는 100,000-135,000, 중이염은 7백만건에 이른다. 뉴모니아 감염증은 미국에서만도 매해 약 40,000건의 사망을 초래한다. 2세 미만의 유아, 65세 이상의 성인, 예컨대 울혈성 심장 질환, 당뇨병, 폐기종, 간 질환, 겸상 세포, HIV 등의 기저가 되는 의학적 증상을 앓고 있는 모든 연령대층, 그리고 특수 환경, 예컨대 요양 시설과 장기 보호 시설에서 생활하는 모든 연령층이 감염 위험성이 가장 높다.
약물 내성의 스트렙토코커스 뉴모니아 균주는 미국에서 발견되기 시작하고 있으며, 많은 페니실린-내성 뉴모니아 균주들은 에리트로마이신 또는 트리메토프림-설파메톡사졸과 같은 다른 항균 약물에도 내성을 나타낸다.
트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum)은 매독을 유발하는 스피로헤타과 균주이다. 트레포네마 팔리듐은 주로 매독, 딸기종, 비-성병성 풍토병성 매독 또는 열대 백반성 피부병을 유발하는 병원체이다. 트레포네마 팔리듐은 시험관내에서는 생육할 수 없으며, 포유류 세포의 부재시 복제되지 않는다. 박테리아는 최초 감염시 감염 부위에 궤양을 유발하지만, 시간 경과에 따라 신체를 이동하여 다수 장기들을 손상시킨다. 말기에는, 전염성은 없지만, 치료받지 않는 경우 매독은 심각한 심장 이상, 정신 장애, 실명, 그외 신경적인 문제들과 사망을 유발할 수 있다.
매독은 일반적으로 주사 투여되는 페니실린으로 치료한다. 페니실린에 알레르기 반응을 보이는 환자 또는 통상적인 용량의 페니실린에 반응을 보이지 않는 환자에 대해서는 다른 항생제를 이용할 수 있다. 매독의 모든 단계는, 적절한 치료를 통해 질환을 치유할 수 있지만, 매독 말기에는 신체 장기에 이미 행해진 손상은 회복되지 않을 수 있다.
클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)는 미국에서 가장 흔한 성 접촉으로 감염되는 세균성 질환으로, 매해 새로운 발병 건수는 4백만 건으로 추정되고 있다. 가장 높은 감염율을 보이는 연령대는 15세에서 19세이다. 클라미디아는 비-임균성 요도염(NGU), 자궁관염, 세균성 질염 및 골반 염증 질환(PID)의 주된 요인이다. 클라미디아 감염은 매우 가벼운 증상을 동반하거나 또는 증상이 전혀 없을 수도 있지만, 클라미디아 감염을 치료하지 않고 방지하게 되면 특히 여성의 경우 생식 장기에 치명적인 손상을 야기할 수 있다. 아지트로마이신, 에리트로마이신, 오플록삭신, 아목시실린 또는 독시사이클린 등의 항생제가 일반적으로 클라미디아 감염 치료용으로 처방되고 있다.
바르토넬라 헨셀래(Bartonella henselae) 고양이 긁힘 열(Cat Scratch Fever)(CSF) 또는 고양이 긁힘병(cat scratch disease)(CSD)은, 처음에는 로칼리마이아 헨셀래(Rochalimaea henselae)로 명명되었으나, 현재에는 바르토넬라 헨센래라고 하는 그람 음성 간균에 의해 유발되는, 고양이 노출을 통해 획득되는 인간 질환이다. 증상으로는 열과 림프절 팽창이 있으며, CSF는 일반적으로 사람에게서 비교적 가볍고 자체-제어가능한 질환이지만, 바르토넬라 헨셀래에 감염되면, 면역약화된 개체의 경우, 균혈증을 수반한 급성 발열성 질환, 세균성 혈관종증, 간 자색반 질환(peliosis hepatis), 세균성 비장염(bacillary splenitis) 및 그외 AIDS 뇌질환과 같은 만성 질환 증상들을 비롯하여, 뚜렷한 임상 증상을 발생시킬 수 있다. 이 질환은 독시사이클린, 에리트로마이신, 리팜핀, 페니실린, 젠타마이신, 세프트리아손, 시프로플록삭신 및 아지트로마이신 등의 항생제로 치료한다.
헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae, H. influenza)는 그람 음성 박테리아 유형으로, 6가지 타입이 공지되어 있으며, B 형 또는 "HIB"에 의해 유발되는 헤모필러스 인플루엔자-관련 질환이 가장 일반적이다. HIB에 대한 백신이 개발되기 전까지, HIB는 중이염, 부비동 감염, 기관지염의 일반적인 요인이었으며, 특히 수막염의 주된 요인이었으며, 폐렴, 패혈성 관절염(관절 감염증), 소포염(연조직의 감염증) 및 심막염(심장 주변을 둘러싸고 있는 막의 감염증)의 흔한 요인이었다. 헤모필러스 인플루엔자 B 형 박테리아는 사람들에게 널리 퍼져 있으며, 일반적으로 질환을 야기하지 않으면서 인후와 코에서 생육한다. 5세 이하의 백신 접종받지 않은 유아가 HIB 질환 위험성이 있다. 헤모필러스 인플루엔자 감염에 의해 야기되는 수막염과 그외 중증 감염증들은 뇌 손상이나 사망을 유발할 수 있다.
시겔라 디센테리아(Shigella dysenteriae, Shigella dys.)는, 이질을 유발하는 그람 음성 간균이다. 이 박테리아는 대장에서 점막 세포로 들어가 점막 세포 안에서 분열하여, 광범위한 염증 반응을 발생시킨다. 시겔라 감염은 탈수로 이어질 수 있는 심각한 설사를 야기할 수 있으며, 매우 어리거나, 매우 연세가 높은 사람에게 위험하거나 또는 장기간 아플 수 있다. 시겔라 디센테리아는 세포독성이며, 장독성이며, 신경독성인 강력한 독소를 만드는데, 이것은 단백질 합성의 저해자로서 작용한다. 암피실린 및 TMP-SMX와 같은 항생제에 대한 내성은 나타났지만, 시프로플록삭신, 노르플록삭신 및 에녹삭신과 같이 신규한 비싼 항생제는 여전히 유효한 편이다.
리스테리아(Listeria)는 인간과 동물의 변에서 발견되는 그람 양성의 운동성 박테리아 속이다. 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)는 리스테리아증, 수막뇌염, 수막염과 같은 질환을 유발시킨다. 이 유기체는 특히 임신한 여성, 신생아, 노년층 및 면역약화된 개체에서의 식중독 병균으로 인한 사망의 주된 요인들 중 하나이다. 이 균주는 부식토(decaying vegetable matter), 오수, 물 및 흙과 같은 환경에서 발견되며, 온도와 염 농도 두 가지가 극단적인 경우에도 생존할 수 있어, 특히 재가열하지 않는 식품에서 매우 위험한 식중독 병원체가 된다. 이 박테리아는 장내 감염 부위로부터 중추 신경계와 태아-태반 유닛까지 전파될 수 있다. 감염으로 인해 수막염, 위장염 및 패혈증이 초래될 수 있다. 소와 양의 경우, 리스테리아 감염은 뇌염과 자연 유산을 야기한다.
프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)는 E. coli와는 거리가 먼 그람 음성의 공생적인 장 유기체이다. 이것은 인간 요도에서 군락을 형성하지만, 도관 삽입 개체에서의 요도관 감염증의 주된 요인인, 기회 감염균(opportunistic pathogen)이다. 프로테우스 미라빌리스는 2가지 예외적인 특징을 가지고 있다: 1) 매우 빠른 이동성을 가지고 있어, 배양 플레이트 상에 주유 현상(swarming phenomenon)을 나타내며; 2) 우레아 분해력을 제공하는 유레아제를 생산하며, 비뇨 생식기관 안에서 생존함.
예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)는 전세계적으로 수백만명의 생명을 앗아간 무서운 질환인, 역병(선 페스트 및 폐렴형 페스트)의 원인 물질이다. 이 유기체는 감염된 벼룩에 물려 쥐에서 사람에게로 또는 대유행기 동안에 공기를 통해 사람에서 사람에게로 전파될 수 있다. 예르시니아 페스티스는 아주 적은 수만으로도 질병을 야기할 수 있는 고병원성 유기체이며, 치료하지 않고 방치하면 대게 사망하게 된다. 이 유기체는 장 침습성이며, 숙주의 신체 전체로 퍼지기 전에 대식세포에서 생존하며 증식할 수 있다.
바실러스 안트락시스(Bacillus anthracis)는 탄저균이라고도 한다. 인간은 오염된 동물과 접촉하였을 때 감염된다. 탄저균은 사람-사람 접촉으로는 전이되지 않는다. 이 질환의 3가지 형태는 피부(스킨), 폐(폐) 및 장을 포함하는 감염 부위를 나타낸다. 폐 감염과 장 감염은 치료하지 않고 방치하면 종종 치명적이다. 포자가 대식세포에 의해 흡수되고, 발아가 개시되는 포식 리소좀(phagolysozome)(막 구획) 안에 내재화된다. 빠르게 증식되는 감염된 대식세포가 용해되면, 박테리아는 혈류로 방출되어, 순환계와 림프계를 따라 전파되며, 패혈증 쇼크, 호흡 곤란 및 장기 부전을 일으킨다. 이 병원체의 포자는 테러 무기로도 사용되고 있다.
버크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei)는 말, 노새 및 당나귀에서 주로 발병하는 감염성 질환인, 비저병을 야기하는, 그람 음성의 호기성 박테리아이다. 인간 감염으로 이어지는 경우는 드물며, 가축 동물에서 보다 흔히 볼 수 있다. 이 유기체는 버크홀데리아 슈도말레이(B. pseudomallei)와 유사하며, 운동 능력이 없는 것으로 구분된다. 이 병원체는 숙주-획득성(host-adapted)이며, 숙주의 외부 환경에서는 발견되지 않는다. 비저병은 항생제로 치료하지 않는 경우에는 대게 치명적이며, 공기를 통해 전파될 수 있거나, 또는 감염된 동물 접촉으로 더 쉽게 감염된다. 빨리 시작되는 폐렴, 균혈증(혈액을 통해 유기체 전파), 농포 및 사망이 감염기에 공통적으로 나타난다. 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)에서와 비슷한 III형 분비 시스템이 필수적이지만, 병독성 기전은 아직 충분히 파악되지 않았다. 생물 테러제로서 가능성있는 것으로 간주되는 이러한 잠재적으로 위험한 유기체에 대한 백신은 없다. 이러한 유기체의 게놈은 비슷한 (하기) 버크홀데리아 슈도말레이와 비교하여 많은 수의 삽입 서열을 가지고 있는데, 매우 많은 수의 단순한 서열 반복체는 세포 표면 단백질의 항원성 변형에 작용할 수 있다.
버크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei)는 인간과 동물에서 유비저를 야기하는 그람 음성 박테리아이다. 유비저는 아시아 태국 및 호주의 일부 지역에서 발견되는 질환이다. 버크홀데리아 슈도말레이는 전형적인 토양 유기체이며, 논(rice paddies)과 습한 열대 토양으로부터 취해지며, 기회 감염균으로서 당뇨병을 앓고 있는 환자 등의 감수성 개체에서 질환을 야기할 수 있다. 이 유기체는 세포 안에 존재할 수 있으며, 폐렴과 균혈증(혈류를 통해 박테리아 전파)을 유발할 수 있다. 잠복기는 매우 길 수 있어, 감염이 병으로 진행되는데 수십년이 걸릴 수 있으며, 치료로 항생제의 몇 달간의 복용을 행할 수 있는데, 대게 재발한다. 세포내 전파는 세포의 한쪽 극에서 세포질을 통해 세포에서 세포로의 이동을 가능하게 하는, 액틴 중합을 유도함으로써 이루어질 수 있다. 이 유기체는 보크홀데리아 말레이 게놈에서 발견되는 것과 비슷한, 항원 변형을 조장할 수 있는 다수개의 소형 서열 반복체를 가지고 있다.
보크홀데리아 세팍시아(Burkholderia cepacia)는 보크홀데리아 물티보란스(Burkholderia multivorans), 보크홀데리아 베트나미엔시스(Burkholderia vietnamiensis), 보크홀데리아 스타빌리스(Burkholderia stabilis), 보크홀데리아 세노세팍시아(Burkholderia cenocepacia) 및 보크홀데리아 암비파리아(Burkholderia ambifaria)를 비롯한, 7종 이상의 다른 서브-종들로 이루어진, 그람 음성 박테리아이다. 보크홀데리아 세팍시아는 기본적인 폐 질환(낭포성 섬유증 또는 면역 문제(예, 만성적인 육아종 질환))을 가지고 있는 인간에게서 대부분 폐렴을 야기하는 중요한 인간 병원체이다. 보크홀데리아 세팍시아는 보통 물과 흙에서 발견되며, 습한 환경에서 장기간 생존할 수 있다. 사람에서 사람에게로의 전파가 입증되었으며, 그 결과, 낭포성 섬유증 환자에 대한 병원, 진료소 및 캠프는 보크홀데리아 세팍시아에 대한 예방 조치로서 엄격한 격리가 법으로 규정되어 있다. 이 박테리아를 가지고 있는 개체는 대게 확산을 제한하지 않는 곳 보다는 분리된 구역에서 치료받는다. 그 이유는 보크홀데리아에 감염되면 폐 기능이 급속하게 저하되어 사망에 이를 수 있기 때문이다. 보크홀데리아의 진단은 타액 배양물로부터 박테리아의 동정을 통해 이루어진다. 보크홀데리아 카팍시아는 아미노글리코시드(예, 토브라마이신) 및 폴리믹신 B 등의 다수의 일반적인 항생제에 본래 내성을 가지고 있어, 치료가 어렵다. 치료제로는 통상적으로 복수 항생제가 사용되는데, 세프타지딤, 독시사이클린, 피페라실린, 클로람페니콜 및 코-트리목사졸을 포함할 수 있다.
프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)는 에드워드 프란시스에 의해 20세기 초반 캘리포니아 툴레어 카운티에서 다람쥐에서 발병된 전염병 같은 병의 원인 물질로 최초로 언급되었다. 현재에는 이 유기체는 그 사람의 이름을 따서 명명되었다. 이 질환은 야토병이라고 하는데, 기록된 역사의 도처에 언급되어 있다. 이 유기체는 감염된 고기를 통해 또는 에어로졸을 통해 감염된 진드기 또는 대모등에붙이에서 인간에게 전염될 수 있어, 잠재적인 생물테러제이다. 이는 수생 유기체이며, 레지오넬라와 함께 관찰되는 유사한 원생생물 내부에서 사는 것으로 발견될 수 있다. 이는 감염력 등급이 높고, 식세포와 비-식세포에 침입하여 빠르게 증식할 수 있다. 이 유기체가 대식세포 안에 있는 경우, 파고좀으로 탈출하여 시토졸에서 살 수 있다.
수의학적 적용
가축의 위장관내 건강한 미소 식물상(microflora)은 건강과 이의 관련 식품의 제조에 매우 중요하다. 인간에서와 같이, 건강한 동물의 위장관에는 많은 유형의 박테리아들(즉, E. coli, 슈도모나스 에어루지노사 및 살모넬라 속 )이 있으며, 서로 생태학적 균형을 이루며 살아가고 있다. 이 균형은 식이 변화, 스트레스 또는 항생제나 그외 치료학적 치료제에 의해 파괴되어, 살모넬라, 캄필로박터, 엔테로콕시, 툴레어미아 및 E. coli와 같은 박테리아에 의해 일반적으로 야기되는 세균성 질환이 동물이 발생할 수 있다. 이들 동물에서의 세균 감염은 대게 치료 비용이 들고 빈번하게 생산성 감소와 연계되는, 치료학적 개입을 필요로 한다.
그 결과, 가축의 위장관내 식물상의 균형을 유지하기 위해, 가축에게 일상적으로 항생제를 처리하고 있다. 이러한 방식의 문제점은 항생제 내성 박테리아가 발생되며, 이러한 항생제와 내성 박테리아가 인간이 섭취하게 되는 제조되는 식품으로 이동된다는 것이다.
나노입자
폴리뉴클레오티드가 부착된 관능화된 나노입자를 제공한다. 나노입자의 크기, 형태 및 화학적 구성은 제조되는 폴리뉴클레오티드-관능화된 나노입자의 특성에 기여한다. 이러한 특성은, 예를 들어, 광학 특성, 광전자 특성, 전기화학적 특성, 전자 특성, 다양한 용액에서의 안정성, 자기 특성 및 포어와 채널 크기의 편차를 포함한다. 여러가지 크기, 형태 및/또는 화학적 구성을 가지는 나노입자들의 혼합물, 그리고 동일한 크기, 형태 및 화학적 조성을 가지는 나노입자의 용도, 및 따라서 특징들의 혼합이 고려된다. 적합한 입자의 예로는, 미국 특허 7,238,472 및 국제 특허 WO 2003/08539에 언급된 바와 같은, 입자 응집체, 등방성 입자(예, 구형 입자), 이방성 입자(예, 비-구형 로드, 사변체 및/또는 프리즘) 및 코어-셀 입자가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 구현예에서, 나노입자는 금속이며, 다양 측면에서 나노입자는 콜로이드 금속이다. 즉, 다양한 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 금속(예컨대, 비제한적으로, 은, 금, 백금, 알루미늄, 팔라듐, 구리, 코발트, 인듐, 니켈 또는 나노입자를 형성할 수 있는 그외 모든 금속), 반도체(예컨대, 비제한적으로, CdSe, CdS, 및 ZnS로 코팅된 CdS 또는 CdSe), 및 자기(예, 강자성체) 콜로이드 물질을 포함한다.
또한, 미국 특허 공개번호 2003/0147966에 언급된 바와 같이, 본 발명의 나노입자는 상업적으로 이용가능한 것, 뿐만 아니라 합성, 예컨대 용액에서의 점진적인 핵형성(progressive nucleation)(예, 콜로이드 반응에 의해)으로 제조되거나 또는 스퍼터링 증착(sputter deposition)과 같은 다양한 물리적 및 화학적 증기 증착 과정에 의해 합성되는 것을 포함한다. 예로, HaVashi, Vac. Sci. Technol. A5(4) :1375-84 (1987); Hayashi, Physics Today, 44-60 (1987); MRS Bulletin, January 1990, 16-47을 참조한다. 미국 출원 공개번호 2003/0147966에서 추가로 언급된 바와 같이, 다른 방법으로 당해 기술 분야의 공지된 방법을 이용하여, HAuCl4 및 사이트레이트-환원제를 이용하여 나노입자를 생산하는 것도 포함한다. 예로, Marinakos et al ., Adv. Mater. 11:34-37(1999); Marinakos et al ., Chem. Mater. 10: 1214-19(1998); Enustun & Turkevich, J. Am. Chem. Soc. 85: 3317(1963)을 참조한다.
나노입자의 크기 범위는 평균 직경(mean diameter) 약 1 nm - 약 250 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 240 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 230 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 220 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 210 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 200 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 190 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 180 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 170 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 160 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 150 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 140 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 130 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 120 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 110 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 100 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 90 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 80 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 70 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 60 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 50 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 40 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 30 nm, 평균 직경 약 1 nm - 약 20 nm, 또는 평균 직경 약 1 nm - 약 10 nm일 수 있다. 다른 측면에서, 나노입자의 크기는 약 5 nm - 약 150 nm (평균 직경), 약 5 - 약 50 nm, 약 10 - 약 30 nm, 약 10 - 150 nm, 약 10 - 약 100 nm, 또는 약 10 - 약 50 nm이다. 나노입자의 크기는 약 5 nm - 약 150 nm (평균 직경), 약 30 - 약 100 nm, 약 40 - 약 80 nm이다. 본 발명에 사용되는 나노입자의 크기는 이 입자의 용도 또는 적용에 따라 변경된다. 크기 변경은 나노입자의 특정한 물리적 특징, 예컨대 광학 특징 또는 본원에 기술된 바와 같이 관능화될 수 있는 표면적의 크기를 최적화하는데 유용하게 이용된다.
올리고뉴클레오티드
본원에서 용어 "뉴클레오티드" 또는 이의 복수형은 본원에서 논의되거나 당해 기술 분야에 공지된 변형된 형태와 상호 호환된다. 특정 예로, 당해 기술 분야에서는, 천연 뉴클레오티드, 및 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 비천염 뉴클레오티드를 포함하는 용어 "뉴클레오베이스"를 사용한다. 즉, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오베이스는 천연 뉴클레오베이스 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)을 의미한다. 비천연 뉴클레오베이스는, 예컨대, 크산틴, 디아미노퓨린, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자크산틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에타노사이토신, N',N'-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸사이토신(mC), 5-(C3-C6)-알키닐-사이토신, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소사이토신, 2-하이드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소사이토신, 이소구아닌, 이노신 및 Benner et al ., 미국 특허. 5,432,272와 Susan M. Freier & Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol. 25: pp 4429-4443에 기재된 "비천연" 뉴클레오베이스를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 용어 "뉴클레오베이스"는 또한 공지된 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클 뿐만 아니라 이의 헤테로사이클릭 유사체와 호변이성체를 포함한다. 나아가, 천연 및 비천연 뉴클레오베이스로는, 미국 특허 3,687,808 (Merigan, et al .), Chapter 15 by Sanghvi, in Antisense Research and Application, Ed. S. T. Crooke and B. Lebleu, CRC Press, 1993, in Englisch et al ., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613-722(특히 페이지 622 및 623 참조, Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed., John Wiley & Sons, 1990, pages 858-859, Cook, Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585-607, 상기 문헌들은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨)에 언급된 것을 포함한다. 다양한 측면에서, 폴리뉴클레오티드는, 가장 고전적인 의미로는 뉴클레오시딕 염기(nucleosidic)는 아니지만 뉴클레오시딕 염기로서 제공되는 특정 "보편적인 염기(universal bases)"를 비롯하여, 유사 뉴클레오베이스를 제공할 수 있는 헤테로사이클릭 화합물과 같은 화합물을 포함하는, 비천연 뉴클레오티드의 카테고리인, "뉴클레오시딕 염기" 또는 "염기 유닛(base unit)" 하나 이상을 포함한다. 보편적인 염기로, 3-니트로피롤, 선택적으로 치환된 인돌(예, 5-니트로인돌) 및 선택적으로 치환된 하이폭산틴을 포함한다. 그외 바람직한 보편적인 염기로는, 당업계에 공지된 보편적인 염기를 비롯하여, 피롤, 디아졸 또는 트리아졸 유도체가 있다.
변형된 염기의 예는 EP 1 072 679 및 WO 97/12896에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 변형된 염기로는, 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 크산틴, 하이폭산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 그외 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 그외 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐 우라실 및 사이토신, 및 피리미딘 염기의 그외 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 그외 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 그외 5-치환된 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 변형된 염기로는, 3환식 피리미딘, 예컨대 페녹사진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), 치환된 페녹사진 시티딘(예, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온)과 같은 G-clamp, 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함한다. 변형된 염기는, 또한, 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예컨대 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 치환된 염기를 포함할 수 있다. 추가적인 뉴클레오베이스로는 미국 특허 3,687,808에 언급된 염기, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990에 언급된 것, Englisch et al., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613에 언급된 것, 및 Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993에 언급된 것을 포함한다. 이들 염기 중 일부는 결합 친화력을 증가시키는데 유용하며, 그 예로는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예컨대 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신이 있다. 5-메틸사이토신 치환은 핵산 듀플렉스의 안정성을 0.6-1.2℃ 증가시키는 것으로 입증되어 있으며, 특정 측면에서, 이는 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합된다. 미국 특허 3,687,808, 미국 특허 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,750,692 및 5,681,941을 참조하며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
미리 정해진 서열의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법은 잘 공지되어 있다. 예로, Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989) and F. Eckstein (ed.) Oligonucleotides and Analogues, 1st Ed. (Oxford University Press, New York, 1991)을 참조한다. 폴리리보뉴클레오티드와 폴리데옥시리보뉴클레오티드 둘다 고상 합성 방법이 바람직하다(잘 알려져 있는 DNA 합성 방법들은 RNA 합성에도 사용가능함). 또한, 폴리리보뉴클레오티드는 효소반응에 의해 제조할 수 있다. 비천연 뉴클레오베이스를 폴리뉴클레오티드에 병합할 수 있다. 예로, 미국 특허 7,223,833; Katz, J. Am. Chem. Soc., 74:2238 (1951); Yamane, et al ., J. Am. Chem. Soc., 83:2599 (1961); Kosturko, et al ., Biochemistry, 13:3949 (1974); Thomas, J. Am. Chem. Soc., 76:6032 (1954); Zhang, et al ., J. Am. Chem. Soc., 127:74-75 (2005); 및 Zimmermann, et al ., J. Am. Chem. Soc., 124:13684-13685 (2002)를 참조한다.
폴리뉴클레오티드, 또는 이의 변형된 형태, 및 본원에 정의된 도메인으로 관능화되어 제공되는 나노입자는, 일반적으로, 약 5 - 약 100개의 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 보다 구체적으로, 나노입자는, 약 5 - 약 90개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 80개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 70개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 60개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 50개의 뉴클레오티드 길이 약 5 - 약 45개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 40개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 35개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 30개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 25개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 20개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 15개의 뉴클레오티드 길이, 약 5 - 약 10개의 뉴클레오티드 길이의 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드가 바람직한 결과를 달성할 수 있는 범위로 특정하게 언급된 크기의 길이의 모든 폴리뉴클레오티드 중간체로 관능화된다. 즉, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 그 보다 많은 수의 뉴클레오티드 길이로 구성된 폴리뉴클레오티드가 고려된다.
나노입자로의 부착이 고려되는 폴리뉴클레오티드는, 타겟 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 유전자 생성물의 발현을 조절하는 것을 포함한다. 본 발명에 고려되는 폴리뉴클레오티드는 본원의 아래에서 언급되는 DNA, RNA 및 이의 변형된 형태를 포함한다. 이에, 다양한 측면에서, 비제한적으로, 타겟 폴리뉴클레오티드에 혼성화하여 타겟 폴리뉴클레오티드의 전사 또는 번역을 개시하는 폴리뉴클레오티드, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 혼성하여 전사를 저해하는 삼중 나선을 형성하는 폴리뉴클레오티드, 및 타겟 폴리뉴클레오티드에 혼성하여 번역을 저해하는 리보자임이 고려된다.
다양한 측면에서, 특정 mRNA를 타겟으로 한다면, 단일의 관능화된 올리고뉴클레오티드-나노입자 조성물은 동일한 전사체의 복수 카피에 대한 결합력을 가진다. 일 측면에서, 나노입자는 동일한 폴리뉴클레오티드, 즉 각각의 폴리뉴클레오티드가 동일한 길이와 동일한 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로 관능화된 상태로 제공된다. 다른 측면에서, 나노입자는 동일하지 않은, 즉 부착된 하나의 폴리뉴클레오티드가 부착된 하나 이상의 다른 폴리뉴클레오티드와 길이 및/또는 서열 차이로 인해 동일하지 않은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드로 관능화된 상태로 제공된다. 상이한 폴리뉴클레오티드가 나노입자에 부착된 경우, 이들 여러가지 폴리뉴클레오티드는 동일한 단일 타겟 폴리뉴클레오티드의 다른 부위에 결합하거나, 또는 상이한 유전자 생성물 코딩하는 여러가지 타겟 폴리뉴클레오티드에 결합한다.
변형된 올리고뉴클레오티드
전술한 바와 같이, 나노입자 관능화에 변형된 올리고뉴클레오티드가 고려된다. 다양한 측면에서, 나노입자 상에 관능화된 올리고뉴클레오티드는 전체가 변형되거나 부분적으로 변형된 것이다. 즉, 다양한 측면에서, 폴리뉴클레오티드내 뉴클레오티드 유닛들의 뉴클레오티드 간의 연결 하나 이상 또는 전체, 및/또는 하나 이상 또는 전체 당은 "비천연" 기로 치환된다.
일 측면에서, 이러한 구현예는 펩타이드 핵산(PNA)을 포함한다. PNA 화합물에서, 폴리뉴클레오티드의 당-벡본은 아미드를 포함하는 벡본으로 치환된다. 예로, 미국 특허 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262와, Nielsen et al ., Science, 1991, 254, 1497-1500을 참조하며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본원의 폴리뉴클레오티드에서 고려되는, 뉴클레오티드와 비천연 뉴클레오티드 사이의 다른 연결로는, 미국 특허 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 및 5,700,920; 미국 출원 공개번호 20040219565; 국제 출원 공개 번호 98/39352 및 WO 99/14226; Mesmaeker et. al., Current Opinion in Structural Biology 5:343-355 (1995) 및 Susan M. Freier and Karl-Heinz Altmann, Nucleic Acids Research, 25:4429-4443 (1997)에 언급된 것을 포함하며, 상기 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
폴리뉴클레오티드에 대한 구체적인 예는 변형된 벡본 또는 뉴클레오시드간 비천연 연결을 포함하고 있는 것을 포함한다. 변형된 벡본을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드는, 벡본에 인 원자를 가지고 있는 것과 벡본에 인 원자를 가지고 있지 않은 것을 포함한다. 뉴클레오시드간 벡본에 인 원자가 없는 변형된 폴리뉴클레오티드도 "올리고뉴클레오티드" 의미에 포함되는 것으로 간주된다.
인 원자를 함유하고 있는 변형된 폴리뉴클레오티드 벡본으로는, 예컨대 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 그외 알킬 포스포네이트, 예컨대 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 예컨대 3'-아미노포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 정상적인 3'-5' 연결을 가진 셀레노포스페이트 및 보라노포스페이트, 이의 2'-5' 연결된 유사체, 및 하나 이상의 뉴클레오티드 간 연결이 3' -> 3', 5' -> 5' 또는 2' -> 2' 연결인, 역위된 극성(inverted polarity)의 물질을 포함한다. 또한, 3'-최말단 뉴클레오티드간 연결에 하나의 3' -> 3' 연결, 즉 어베이직(abasic)일 수 있는 하나의 역위된 뉴클레오시드 잔기(뉴클레오티드가 생략되거나 또는 그 위치에 하이드록시기를 가짐)를 포함하는 역위된 극성의 올리고뉴클레오티드도 고려된다. 또한, 염, 혼성 염 및 유리 산 형태도 고려된다.
상기 인-함유성 연결의 제조 방법을 기술한 대표적인 미국 특허로는, 미국 특허 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 및 5,625,050이 있으며, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 벡본은, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼성된 이종원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 이종원자의 뉴클레오시드 연결 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성된 벡본을 가진다. 이것은, 모르폴리노 연결을 가진 벡본; 실록산 벡본; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 벡본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 벡본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 벡본; 리보아세틸 벡본; 알켄 함유성 벡본; 설파메이트 벡본; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 벡본; 설포네이트 및 설폰아미드 벡본; 아미드 벡본; 및 그외 혼성된 N, O, S 및 CH2 구성 파트를 가진 벡본을 포함한다. 또다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드에는 포스포로티오에이트 벡본이 구비되며, 올리고뉴클레오티드에는 헤테로원자 벡본이 구비되며, 예로 미국 특허 5,489,677 및 5,602,240에 언급되어 있는 -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-, -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- 및 -O-N(CH3)-CH2-CH2-이 구비된다. 예로, 미국 특허 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 및 5,677,439를 참조하며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
다양한 형태로, 올리고에서 2개의 연속적인 단량체 사이의 연결은 -CH2-, -O-, -S-, -NRH-, >C=O, >C=NRH, >C=S, -Si(R")2-, -SO-, -S(O)2-, -P(O)2-, -PO(BH3) -, -P(O,S)-, -P(S)2-, -PO(R")-, -PO(OCH3) -, 및 -PO(NHRH)-로부터 선택되는 2-4개, 바람직하게는 3개의 기/원자로 구성되며, 상기에서 RH는 수소 및 C1-4-알킬 중에서 선택되고, R"은 C1-6-알킬 및 페닐 중에서 선택된다. 이러한 연결에 대한 예시적인 예는, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CO-CH2-, -CH2-CHOH-CH2-, -O-CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -O-CH2-CH=(다음 차례 단량체에 대한 연결로서 사용되는 경우에는 R5를 포함함), -CH2-CH2-O-, -NRH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NRH-, -CH2-NRH-CH2- -, -O-CH2-CH2-NRH-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, -NRH-CS-NRH-, -NRH-C(=NRH)-NRH-, -NRH-CO-CH2-NRH-O-CO-O-, -O-CO-CH2-O-, -O-CH2-CO-O-, -CH2-CO-NRH-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2 -, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CH=N-O-, -CH2-NRH-O-, -CH2-O-N=(다음 차례 단량체에 대한 연결로서 사용되는 경우에는 R5를 포함함), -CH2-O-NRH-, -CO-NRH- CH2-, - CH2-NRH-O-, - CH2-NRH-CO-, -O-NRH- CH2-, -O-NRH, -O- CH2-S-, -S- CH2-O-, - CH2- CH2-S-, -O- CH2- CH2-S-, -S- CH2-CH=(다음 차례 단량체에 대한 연결로서 사용되는 경우에는 R5를 포함함), -S- CH2- CH2-, -S- CH2- CH2- O-, -S- CH2- CH2-S-, - CH2-S- CH2-, - CH2-SO- CH2-, - CH2-SO2- CH2-, -O-SO-O-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2- CH2-, -O-S(O)2-NRH-, -NRH-S(O)2- CH2-; -O-S(O)2- CH2-, -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)2-S-, -S-P(O)2-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)2-S-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(O CH2CH3)-O-, -O-PO(O CH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRN)-O-, -O-P(O)2-NRH H-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, - CH2-P(O)2-O-, -O-P(O)2- CH2-, 및 -O-Si(R")2-O-; 특히 -CH2-CO-NRH-, -CH2-NRH-O-, -S-CH2-O-, -O-P(O)2-O-O-P(-O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -NRHP(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(CH3)-O-, 및 -O-PO(NHRN)-O-가 있으며, 이때 RH는 수소 및 C1-4-알킬 중에서 선택되고, R"은 C1-6-알킬 및 페닐 중에서 선택된다. 추가적인 예시적인 예는 Mesmaeker et. al., 1995, Current Opinion in Structural Biology, 5: 343-355 및 Susan M. Freier and Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol 25: pp 4429-4443에 기술되어 있다.
폴리뉴클레오티드의 또다른 변형된 형태들은 미국 출원번호 20040219565에 상세하게 기술되어 있으며, 이 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
또한, 변형된 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 2' 위치에 하기 중 하나를 포함한다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬(여기에서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 비치환된 C1 - C10 알킬 또는 C2 - C10 알케닐 및 알키닐일 수 있음). 다른 구현예로, O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2가 있으며, 이때 n과 m은 약 1 - 약 10이다. 그외 폴리뉴클레오티드는 2' 위치에 하기 들 중 하나를 포함한다: C1 - C10의 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단성 그룹, 리포터 그룹, 인터칼레이터, 폴리뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선시키는 그룹, 또는 폴리뉴클레오티드의 약력학적 특성을 개선시키는 그룹, 및 비슷한 특성을 지닌 그외 치환기. 일 측면에서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O-CH2CH2OCH3, 또한, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE라 함)(Martin et al ., 1995, Helv. Chim. Acta, 78: 486-504), 즉, 알콕시알콕시기를 포함한다. 그외 변형으로, 2'-디메틸아미녹시에톡시, 즉, 2'-DMAOE로 알려진 O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(또한, 당해 기술 분야에서는 2'-O-디메틸-아미노-에톡시-에틸 또는 2'-DMAEOE라 함), 즉, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2이 있다.
또다른 변형으로는, 2'-메톡시(2'-O-CH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-알릴(2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-알릴(2'-O-CH2-CH=CH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 상기 2'-변형은 아라비노(위) 위치 또는 리보(아래) 위치에 있을 수 있다. 일 측면에서, 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 또한, 폴리뉴클레오티드 상의 다른 위치, 예컨대 3'말단 뉴클레오티드나 2'-5' 연결된 폴리뉴클레오티드에서 당의 3'번 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5'번 위치에서, 유사한 변형이 이루어질 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 펜토푸라노실 당 대신 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 가질 수도 있다. 예로, 미국 특허 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 및 5,700,920을 참조하며, 그 내용은 그 전체가 본원에 원용에 의해 포함된다.
일 측면에 있어서, 당의 변형은 2'-하이드록시기가 당 고리의 3' 또는 4' 탄소 원자에 연결되어, 이환식 당 모이어티를 형성하는, LNA(Locked Nucleic Acid)를 포함한다. 특정 측면에서, 연결은 메틸렌(-CH2-)n 기가 2' 산소 원자와 4' 탄소 원자를 연결하는 연결이며, 여기에서 n은 1 또는 2이다. LNA 및 이의 제조 방법은 WO 98/39352 및 WO 99/14226에 기술되어 있으며, 이의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
나노입자에 올리고뉴클레오티드 부착
본 방법에 이용되는 것으로 고려되는 올리고뉴클레오티드는 임의의 수단을 통해 나노입자에 결합되는 것을 포함한다. 올리고뉴클레오티드를 나노입자에 부착하는 방식과 상관없이, 다양한 측면에서, 5' 연결, 3' 연결, 일부 내부 연결(internal linkage) 또는 이들의 임의 조합을 통해 부착이 이루어진다.
부착 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있으며, 미국 공개번호 2009/0209629에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. RNA를 나노입자에 부착하는 방법은 일반적으로 PCT/US2009/65822에 기술되어 있으며, 이 문헌은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 즉, 일부 구현예들에서, 기술 내용에서, 나노입자에 부착된 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것을 포함한다.
일부 측면에서, 도메인을 추가로 포함하는 올리고뉴클레오티드가 나노입자에 조합된, 나노입자에 부착된 올리고뉴클레오티드가 구비된 나노입자를 제공한다. 일부 측면에서, 상기 도메인은 폴리티미딘 서열이다. 다른 측면에서, 상기 도메인은 포스페이트 폴리머(C3 잔기)이다.
일부 구현예들에서, 나노입자에 부착된 올리고뉴클레오티드는 DNA이다. DNA가 나노입자에 부착되었을 때, 나노입자에 부착된 DNA 올리고뉴클레오티드와 타겟 폴리뉴클레오티드 간에 혼성화가 이루어져, 상기 타겟 폴리뉴클레오티드가 상기 나노입자에 조합되도록, 폴리뉴클레오티드가 타겟 서열에 충분히 상보적인 서열로, DNA는 구성된다. 다양한 측면들에서, DNA는 단일가닥이거나, 또는 이중 가닥 분자가 타겟 폴리뉴클레오티드의 단일 가닥 서열에 혼성화하는 단일 가닥 서열을 포함하는 경우라면 이중 가닥이다. 일부 측면들에서, 나노입자 상에 관능화된 올리고뉴클레오티드의 혼성화가 되면, 이중 가닥 타겟 폴리뉴클레오티드와 함께 트리플렉스 구조를 형성할 수 있다. 다른 측면에서, 트리플렉스 구조는 나노입자 상에 관능화된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥의 타겟 폴리뉴클레오티드와의 혼성화에 의해서 이루어질 수 있다.
스페이서
특정 측면에서, 관능화된 나노입자는, 올리고뉴클레오티드 및 도메인이 스페이서를 통해 나노입자에 부착된 것을 포함한다. 본원에서 "스페이서"는 그 자체로는 유전자의 발현 조절에 참여하지 않지만, 나노입자와 관능기 올리고뉴클레오티드 사이의 거리를 넓히거나 또는 나노입자에 복수의 카피 수로 부착되었을 경우 각각의 올리고뉴클레오티드 간의 간격을 넓히기 위해 제공되는 모이어티를 의미한다. 따라서, 스페이서는, 올리고뉴클레오티드들이 동일한 서열이거나 또는 다른 서열을 가지던 간에, 각각의 올리고뉴클레오티드에 직렬식으로 위치되는 것으로 본다. 본 발명의 일 측면에서, 도메인이 나노입자에 직접 부착된 경우, 상기 도메인은 스페이서를 통해 나노입자에 선택적으로 관능화된다. 일 측면에서, 도메인들이 세로로 정렬되어 나노입자에 관능화된 경우, 스페이서는 세로 정렬 구조인 도메인 단위들 사이에 일부 또는 전체적으로 선택적으로 존재한다. 일 측면에서, 스페이서는 존재하는 경우 유기 모이어티이다. 다른 측면에서, 스페이서는 폴리머이며, 예컨대 수용성 폴리머, 핵산, 폴리펩타이드, 올리고당, 탄수화물, 지질, 에틸글리콜 또는 이의 조합을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 스페이서를 가지며, 스페이서를 통해 나노입자에 공유 결합된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같이 동일한 폴리뉴클레오티드이다. 나노입자에 스페이서가 결합됨으로써, 폴리뉴클레오티드는 나노입자의 표면과 떨어지게 배치되어, 이에 대한 표적과의 혼성화를 위한 접근성이 더 좋아진다. 스페이서가 폴리뉴클레오티드인 경우, 다양한 구현예에서, 스페이서의 길이는 적어도 약 10개의 뉴클레오티드, 10-30개의 뉴클레오티드, 또는 심지어 30개 보다 많은 수의 뉴클레오티드 길이이다. 스페이서는 나노입자 또는 타겟 폴리뉴클레오티드에 결합되게 되는 폴리뉴클레오티드의 결합력을 간섭하지 않는, 임의의 서열을 가질 수 있다. 스페이서는 서로 또는 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열을 가지지 않아야 하지만, 타겟 폴리뉴클레오티드에 일부분이 또는 전체가 상보적일 수도 있다. 특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드 스페이서의 염기는 모두 아데닌, 모두 티민, 모두 시티딘, 모두 구아닌, 모두 우라실이거나 또는 모두 일부 변형된 다른 염기이다.
표면 밀도
본원에서 제공되는 나노입자는, 다양한 측면에서, 나노입자들 간의 협력적 행태와 하나의 나노입자에서 폴리뉴클레오티드 가닥들 간의 협력적 행태를 이루는데 충분한 충진 밀도(packing density)로 폴리뉴클레오티드를 나노입자 표면 상에 포함한다. 다른 측면에서, 나노입자들 간의 협력적 행태는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레이즈 분해 내성을 증가시킨다. 또다른 측면에서, 세포에 의한 나노입자의 흡수는 나노입자에 조합된 폴리뉴클레오티드의 밀도에 의해 영향을 받는다. PCT/US2008/65366에 기술된 바와 같이, 나노입자의 표면 상의, 고밀도의 폴리뉴클레오티드는 세포의 나노입자 흡수 증가와 연관된다.
나노입자 및 폴리뉴클레오티드의 바람직한 조합을 위해, 나노입자를 안정시키는데 적합한 표면 밀도와 이를 달성하기 위한 필수 조건은 실험을 통해 정할 수 있다. 일반적으로, 안정적인 나노입자-올리고뉴클레오티드 구조체를 제공하는데에는, 표면 밀도 2 pmoles/cm2 이상이 적합할 것이다. 일부 측면에서, 상기 표면 밀도는 적어도 15 pmoles/cm2이다. 또한, 폴리뉴클레오티드를 나노입자에 표면 밀도 적어도 2 pmol/cm2, 적어도 3 pmol/cm2, 적어도 4 pmol/cm2, 적어도 5 pmol/cm2, 적어도 6 pmol/cm2, 적어도 7 pmol/cm2, 적어도 8 pmol/cm2, 적어도 9 pmol/cm2, 적어도 10 pmol/cm2, 적어도 약 15 pmol/cm2, 적어도 약 20 pmol/cm2, 적어도 약 25 pmol/cm2, 적어도 약 30 pmol/cm2, 적어도 약 35 pmol/cm2, 적어도 약 40 pmol/cm2, 적어도 약 45 pmol/cm2, 적어도 약 50 pmol/cm2, 적어도 약 55 pmol/cm2, 적어도 약 60 pmol/cm2, 적어도 약 65 pmol/cm2, 적어도 약 70 pmol/cm2, 적어도 약 75 pmol/cm2, 적어도 약 80 pmol/cm2, 적어도 약 85 pmol/cm2, 적어도 약 90 pmol/cm2, 적어도 약 95 pmol/cm2, 적어도 약 100 pmol/cm2, 적어도 약 125 pmol/cm2, 적어도 약 150 pmol/cm2, 적어도 약 175 pmol/cm2, 적어도 약 200 pmol/cm2, 적어도 약 250 pmol/cm2, 적어도 약 300 pmol/cm2, 적어도 약 350 pmol/cm2, 적어도 약 400 pmol/cm2, 적어도 약 450 pmol/cm2, 적어도 약 500 pmol/cm2, 적어도 약 550 pmol/cm2, 적어도 약 600 pmol/cm2, 적어도 약 650 pmol/cm2, 적어도 약 700 pmol/cm2, 적어도 약 750 pmol/cm2, 적어도 약 800 pmol/cm2, 적어도 약 850 pmol/cm2, 적어도 약 900 pmol/cm2, 적어도 약 950 pmol/cm2, 적어도 약 1000 pmol/cm2 또는 그 이상으로 결합시키는 방법을 제공한다.
실시예
실시예 1
나노입자의 제조
사이트레이트-안정화된 금 나노입자(1-250 nm)를 공개된 공정을 이용하여 제조한다[G. Frens, Nature Physical Science. 1973, 241, 20]. 본 실시예에서는, 13 및 5 nm 크기를 사용하지만, 다른 실시예들에서는 1 nm - 500 nm의 크기의 나노입자를 사용한다. 간략하게, 하이드로겐 테트라클로로아우레이트를, 환류 수 중의 사이트레이트로 처리하여 환원한다. 입자의 크기와 분산성을 전자 투과 현미경과 uv/vis 분광광도계로 확인할 수 있다. 티올화된 올리고뉴클레오티드를 표준 고상 포스포르아미디트 방법을 이용하여 합성한다[Pon, R. T. Solid-phase supports for oligonucleotide synthesis. Methods in Molecular Biology (Totowa, NJ, United States) (1993), 20 (Protocols for Oligonucleotides and Analogs), 465-496]. 이 티올-변형된 올리고뉴클레오티드를 13 ± 1 및 5 nm 금 콜로이드에 10 nM 콜로이드 1 mL 당 올리고뉴클레오티드 3 nmol 농도로 첨가하여, 밤새 흔든다. 12시간 후, 소듐 도데실설페이트(SDS) 용액(10%)을 이 혼합물에 첨가하여, 0.1% SDS 농도로 만들고, 포스페이트 완충액(0.1 M; pH = 7.4)을 혼합물에 첨가하여, 0.01 M 포스페이트 농도로 만들고, 소듐 클로라이드 용액(2.0 M)을 혼합물에 첨가하여, 0.1 M 소듐 클로라이드 농도로 만든다. 그런 다음, 소듐 클로라이드 용액(2.0 M) 분액 6개를 8시간에 거쳐 상기 혼합물에 첨가하여, 최종 소듐 클로라이드 농도를 0.3 M로 만들고, 밤새 흔들어 관능화 공정을 완료한다. 이 용액은 원심분리(13,000 rpm, 20 min)한 다음, 멸균 포스페이트 완충화된 염수에 재현탁하는 과정을 3번 실시하여, 정제된 접합체를 제조한다.
실시예 2
올리고뉴클레오티드 변형된 나노입자 접합체의 제조 방법
본 실시예에서의 올리고뉴클레오티드 디자인은 2가지 가능성 있는 작용 기전을 포함한다. 첫번째로, 암피실린 내성(AmpR) 유전자 β-락타메이즈에 대한 프로모터 부위의 센스 가닥에 선호적으로 혼성화하는 공개된 플라스미드 서열을 이용하여 서열을 설계하였다. 이것은 박테리아 게놈에서 AmpR의 프로모터 서열에 대한 접합체의 선호적인 혼성화(입자의 보다 우호적인 결합 상수 및/또는 세포내 농도에 의해 부여됨)를 이용함으로써, 박테리아를 암피실린에 민감해지게 한다. 이것은 프로모터 복합체가 이의 타겟 부위에 결합하지 못하게 하며, mRNA 전사체(Amp 내성 유전자)의 전사를 방지함으로써, 박테리아가 암피실린에 민감해지게 한다. 사용되는 서열은 5'-AT TGT CTC ATG AGC GGA TAC ATA TTT GAA AAA AAA AAA A-SH-3' (서열번호 1)과 5'-AT TGT CTC ATG AGC GGA TAC AAA AAA AAA A-SH-3' (서열번호 2)이다.
2번째 전략은, AmpR 유전자의 내부 영역에 혼성화하도록 설계된 서열을 이용하는 방법이다. 이로써, 전장 mRNA 전사 완료가 방지된다. 이의 다음 작용은 기능성 mRNA 전사체(Amp 내성 유전자)의 완전한 전사를 방지하여, 박테리아가 암피실린에 민감해지게 하는 것이다. 이러한 전략을 위해, 타겟 듀플렉스 DNA에 혼성화하는 센스 가닥을 선택하였다. 이의 서열은 5'-ACT TTT AAA GTT CTG CTA TAA AAA AAA AA-SH-3' (서열번호 3)이다. 2가지 전략 계획은 도 1로 제시한다. 다른 예로, 전통적인 안티센스 전략을 이용하여 mRNA에 결합하고 단백질 생산을 방지함으로써, 박테리아를 항생제에 민감해지게 하는 방법을 이용할 수 있다.
JM109 E. coli 컴피턴트(competent) 세포를, 공개된 공정(Promega 및 Invitrogen)에 따라, 암피실린 함유 플라스미드(psiCHECK 2, Promega 또는 pScreen-iT, Invitrogen)를 이용하여 형질전환시키고, 항생제 함유(Amp) 플레이트에서 배양하였다. 단일 클론을 선택하여, 암피실린이 첨가된 액체 배지에서 12시간 배양하였다. 이 배양물을 사용하여, 이후 실험에 사용하기 위한 동결 스톡(10% 글리세롤)을 만들었다.
E. coli 스톡을 해동한 후, 아래와 같이, 암피실린이 첨가 또는 무첨가된 액체 배지에서 적은 부피로 배양하고, 해당 LB 플레이트에 도말하였다. 일 예로, 동결시킨 박테리아 브로스 5 ㎕를 30 nM 입자가 첨가된 LB 배지 1 mL에서 5.5시간 배양하였다. 이 1 mL 중 100 ㎕를 취하여 도말한 다음 밤새 배양하였다. 전자 투과 현미경을 이용하여, 박테리아 도입을 확인하였다(도 2).
나노입자 처리 수시간 후, 적은 부피의 박테리아를 암피실린 양성 또는 암피실린 음성 플레이트에 도말하였다. 이 박테리아를 다시 12시간 동안 그 플레이트에서 배양하고, 각 조건에서 배양된 콜로니의 수를 세었다. 그 결과는 아래 표 1에 요약 개시한다. 이러한 전략에서 66%의 박테리아 증식 저해가 달성되었다. 일반적인 조건 최적화로, 박테리아 민감화 성공율 100%를 달성할 것으로 예상된다.
배양 조건 실험 증식 예상
1 2 3
E. coli (-)
Amp (-)
나노입자 (-)		 NA NA NA (-)
E. coli (-)
Amp (+)
나노입자 (-)		 (-) (-) (-) (-)
E. coli (+)
Amp (-)
넌센스 NP (+)		 NA NA NA (+)
E. coli (+)
Amp (+)
넌센스 NP (+)		 NA NA NA (+)
E. coli (+)
Amp (-)
프로모터 NP (+)		 (+) (+) (-) (+)
E. coli (+)
Amp (+)
프로모터 NP (+)		 (-) (-) (-) (-)
E. coli (+)
Amp (-)
내부 NP (+)		 (+) (+) (-) (+)
E. coli (+)
Amp (+)
내부 NP (+)		 (-) (-) (-) (-)
프로토콜: 30 nM 입자가 첨가된 브로스 1 mL에서 박테리아 브로스 5 ㎕ 3.5시간 배양. 100 ㎕를 도말하여, 밤새 배양함.
배양 조건 실험 증식 예상
1 2 3
E. coli (-)
Amp (-)
나노입자 (-)		 (-) (-) (-) (-)
E. coli (-)
Amp (+)
나노입자 (-)		 (-) (-) (-) (-)
E. coli (+)
Amp (-)
넌센스 NP (+)		 (+) (+) (+) (+)
E. coli (+)
Amp (+)
넌센스 NP (+)		 (+) (+) (+) (+)
E. coli (+)
Amp (-)
프로모터 NP (+)		 (+) (+) (+) (+)
E. coli (+)
Amp (+)
프로모터 NP (+)		 (-) (-) (+) (-)
E. coli (+)
Amp (-)
내부 NP (+)		 (+) (+) (+) (+)
E. coli (+)
Amp (+)
내부 lNP (+)		 (+) (+) (+) (-)
프로토콜: 30 nM 입자가 첨가된 브로스 1 mL에서 박테리아 브로스 5 ㎕ 5.5시간 배양. 100 ㎕를 도말하여, 밤새 배양함.
실시예 3
올리고뉴클레오티드 변형된 나노입자는 전사 넉다운을 달성한다
다른 전략을 이용하여 플라스미드 유래 루시퍼레이즈 유전자에서 전사 넉다운을 조사하였다. 이 모델을 사용하여, 루시퍼레이즈 넉다운을 Renilla 발현을 코딩하는 플라스미드 상의 별개 영역과 구별함으로써, 부위-선택적인 유전자 넉다운을 입증하였다. 이러한 효과를 분석하기 위해, 듀얼-루시퍼레이즈 리포터 분석 시스템(Promega)을 사용하였다. 이 모델에 사용된 전략은 루시퍼레이즈 유전자의 전장 mRNA 전사체의 형성을 차단하는 것이었다. 그 결과, Renilla에 비해 루시퍼레이즈 신호가 감소된다. 이 분석에 사용되는 서열은 5'-CCC GAG CAA CGC AAA CGC AAA AAA AAA AA-SH-3' (서열번호 4)이다. 다른 예로, 프로모터 컴플렉스를 타겟 부위에 결합하지 않게 차단하기 위해, 상기에서 사용되는 방법과 비슷한 전략을 사용할 수 있다. 예로, 5 nm 입자를 사용하였다. 12시간 후 넉다운 결과는 입자를 300 nM 농도로 이용하였을 때 59%였다(p 값 = 0.0004). 이러한 결과는 전사 수준에서 유전자의 조절을 달성하는 다른 방법을 보여준다. 데이타 요약 결과는 도 3에 나타낸다.
실시예 4
올리고뉴클레오티드 변형된 나노입자 접합체의 전사 차단
접합체의, 전사 차단력과 이후의 이중가닥 게놈 DNA와의 혼성화에 의한 단백질 생산 차단력에 대한 증거로서, 시험관내 전사 분석을 수행하였다. 올리고뉴클레오티드로 관능화된 금 나노입자를, 루시퍼레이즈 유전자를 코딩하는 이중 가닥 플라스미드 DNA가 포함된 시험관내 전사 반응(Promega)에 넣었다. 이 올리고뉴클레오티드 서열은 루시퍼레이즈 유전자의 센스 가닥을 타겟팅하기 때문에, 전사만 차단할 뿐 번역은 차단하지 않는다. 대조군으로서, 비-상보적인 서열로 관능화된 나노입자 접합체를 동일한 방식으로 사용하였다. 전사 반응은 진행되었으며, 루시퍼레이즈 활성을 시판 키트(Promega)로 측정하였다. 루시퍼레이즈 유전자를 타겟팅하는 나노입자 접합체가 함유된 샘플의 경우, 비-상보적인 서열과 나노입자 접합체가 포함된 대조군 반응과 비교하여, 현저한 루시퍼레이즈 활성 감소(>75%)가 관찰되었다.
또한, 넉다운 기본 원리를 도출하기 위해, 미리 형성된 듀플렉스의 올리고뉴클레오티드 골드 나노입자 접합체 침입을 조사하기 위해 완충액 중에서 실험을 수행하였다. 개략도와 결과 데이타는 도 4(A 및 B)에 나타낸다. 입자는 미리 형성된 듀플렉스에 결합할 수도 있다(트리플렉스 형성). 또는 다른 예로, 입자를 타겟 서열에 대한 보다 높은 결합 상수로 미리 형성된 듀플렉스로 치환할 수 있다. 그 후, 입자를 13,000 rpm으로 원심분리하고, PBS 중에 3회 헹군 다음 KCN으로 산화한다. 결합된 가닥의 형광을 측정한다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 이는 플루오레세인-캡핑된 올리고뉴클레오티드(안티센스 가닥)의 방출과 형광 신호 증가를 형성시킬 것으로 가정된다. 나노입자 첨가하기 전에, 퀀처(답실, 센스 가닥) 및 발색단(플루오레세인, 안티센스 가닥)이 포함된 듀플렉스를 형성한다. 넓은 농도 범위에서, 이러한 전략의 서열 특이성을 볼 수 있다.
본 발명은 다양한 구현예와 실시예를 들어 설명되어 있지만, 당해 기술의 당업자라면 변형 및 개선을 가할 수 있을 것으로 생각된다. 이에, 청구항에 기술되는 그러한 제한은 오직 본 발명을 토대로 이루어져야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Mirkin, et al. <120> INHIBITION OF BACTERIAL PROTEIN PRODUCTION BY POLYVALENT OLIGONUCLEOTIDE MODIFIED NANOPARTICLE CONJUGATES <130> 30938/29005 <150> 61/143,293 <151> 2009-01-08 <150> 61/169,384 <151> 2009-04-15 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (39)..(39) <223> Thiol <400> 1 attgtctcat gagcggatac atatttgaaa aaaaaaaaa 39 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> Thiol <400> 2 attgtctcat gagcggatac aaaaaaaaaa 30 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (29)..(29) <223> Thiol <400> 3 acttttaaag ttctgctata aaaaaaaaa 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (29)..(29) <223> Thiol <400> 4 cccgagcaac gcaaacgcaa aaaaaaaaa 29

Claims (25)

  1. 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자(oligonucleotide-modified nanoparticle)를 포함하는 항생제 조성물로서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 혼성화를 허용하는 조건 하에 비코딩 타겟 서열에 혼성화될 정도로 원핵생물 유전자의 비코딩 타겟 서열에 대해 충분히 상보적인 것을 특징으로 하는, 항생제 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 원핵생물의 유전자와의 혼성화시 원핵생물 세포의 증식을 저해하는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 혼성화시 상기 원핵생물의 유전자에 의해 코딩되는 기능성 원핵생물 단백질의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 기능성 원핵생물 단백질의 발현이 상기 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 비접촉된 세포와 비교하여 약 75% 저해되는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 혼성화시 상기 원핵생물 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 변화된 활성을 가진 채 발현되는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 활성이 상기 올리고뉴클레오티드-변형된 나노입자와 비접촉된 세포와 비교하여 약 10% 저해되는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 혼성화시 상기 원핵생물의 유전자의 전사를 저해하는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 혼성화시 상기 원행생물의 유전자에 의해 코딩되는 기능성 단백질의 번역을 저해하는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 혼성화시 원핵생물 세포 증식에 필수적인 기능적인 단백질의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드의 혼성화가 이루어지면 상기 원핵생물 세포 증식에 필수적인 기능적인 단백질의 발현을 저해하고,
    상기 원핵생물 세포 증식에 필수적인 기능적인 단백질은 그람 음성 유전자 생성물, 그람 양성 유전자 생성물, 세포주기 유전자 생성물, DNA 복제에 관여하는 유전자 생성물, 세포 분열 유전자 생성물, 단백질 합성에 관여하는 유전자 생성물, 박테리아 자이레이즈 및 아실 캐리어 유전자 생성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서, 상기 원핵생물의 유전자는 항생제에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 항생제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항생제는 페니실린 G, 메티실린(Methicillin), 나프실린(Nafcillin), 옥사실린(Oxacillin), 클록사실린(Cloxacillin), 디클록사실린(Dicloxacillin), 암피실린(Ampicillin), 아목시실린(Amoxicillin), 티카르실린(Ticarcillin), 카르베니실린(Carbenicillin), 메즐로실린(Mezlocillin), 아즐로실린(Azlocillin), 피페라실린(Piperacillin), 이미페넴(Imipenem), 아즈트레오남(Aztreonam), 세팔로틴(Cephalothin), 세팍클로르(Cefaclor), 세폭시틴(Cefoxitin), 세푸록심(Cefuroxime), 세포니시드(Cefonicid), 세프메타졸(Cefmetazole), 세포테탄(Cefotetan), 세프프로질(Cefprozil), 로라카르베프(Loracarbef), 세페타메트(Cefetamet), 세포페라존(Cefoperazone), 세포탁심(Cefotaxime), 세프티족심(Ceftizoxime), 세프트리아손(Ceftriaxone), 세프타지딤(Ceftazidime), 세페핌(Cefepime), 세픽심(Cefixime), 세프포독심(Cefpodoxime), 세프설로딘(Cefsulodin), 플레록삭신(Fleroxacin), 날리딕스산(Nalidixic acid), 노르플록삭신(Norfloxacin), 시프로플록산신(Ciprofloxacin), 오플록삭신(Ofloxacin), 에녹삭신(Enoxacin), 로메플록삭신(Lomefloxacin), 시녹삭신(Cinoxacin), 독시사이클린(Doxycycline), 미노사이클린(Minocycline), 테트라사이클린(Tetracycline), 아미카신(Amikacin), 젠타미신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycin), 네틸미신(Netilmicin), 토브라마이신(Tobramycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 아지트로마이신(Azithromycin), 클라리트로마이신(Clarithromycin), 에리트로마이신(Erythromycin), 에리트로마이신 에스톨레이트(Erythromycin estolate), 에리트로마이신 에틸 숙시네이트(Erythromycin ethyl succinate), 에리트로마이신 글루코헵토네이트(Erythromycin glucoheptonate), 에리트로마이신 락토비오네이트(Erythromycin lactobionate), 에리트로마이신 스테아레이트(Erythromycin stearate), 반코마이신(Vancomycin), 테이코플라닌(Teicoplanin), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 클린다마이신(Clindamycin), 트리메토프림(Trimethoprim), 설파메톡사졸(Sulfamethoxazole), 니트로푸란토인(Nitrofurantoin), 리팜핀(Rifampin), 무피록신(Mupirocin), 메트로니다졸(Metronidazole), 세팔렉신(Cephalexin), 록시트로마이신(Roxithromycin), 코-아목시클라브우아네이트(Co-amoxiclavuanate), 피페라실린과 타조박탐(Tazobactam)의 조합, 및 이들의 다양한 염, 산, 염기 및 그외 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 원핵생물의 유전자의 비코딩 가닥내 서열에 충분히 상보적인 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 원핵생물의 유전자의 비코딩 서열내 서열에 충분히 상보적이므로, 삼중 가닥 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  16. 제항 내지 제15항 중 어느 한항에 있어서, 혼성화시 상기 올리고뉴클레오티드, 상기 비코딩 서열 및 상기 비코딩 서열에 상보적인 코딩 서열 간의 3중 가닥 구조가 형성되는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 원핵생물의 유전자의 비코딩 서열내 서열과 충분히 상보적이므로, 상기 올리고뉴클레오티드와 상기 비코딩 서열 간에 이중 가닥 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한항에 있어서, 상기 비코딩 서열은 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 3' 비코딩 서열과 혼성화하는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 5' 비코딩 서열과 혼성화하는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한항에 있어서, 시험관내에서 상기 타겟 서열과 혼성화되는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한항에 있어서, 생체내에서 상기 타겟 서열과 혼성화되는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
  23. 세포를, 제1항 내지 제22항 중 어느 한항에 따른 항생제 조성물과, 혼성화시 타겟 유전자에 의해 코딩되는 기능성 단백질의 생산이 저해되는 조건 하에, 접촉시키는 단계를 포함하는,
    세포에서 타겟 유전자 생성물의 생산을 저해하는 방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한항에 따른 나노입자를 포함하는 조성물을 유효량으로 세포에게 투여하는 단계를 포함하는, 원핵생물의 감염을 치료하는 방법.
  25. 항생제; 및 제1항 내지 제22항 중 어느 한항에 따른 나노입자를 포함하는, 키트.
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