JPS5993098A - オリゴヌクレオチド誘導体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、一般に、オリゴヌクレオチド誘導体に四する
。さらに具体的には、本発明は、ヌクレオチドの５′−
末喘延長上に適当な長さのスペーザー促介して保穫さハ
、たアミノ基を導入してなるオリゴヌクレオチド誘導体
に１周する。本発明は、また、このようなオリゴヌクレ
オチド誘導体の製造方法にも関する。

先行技術 近年、核酸の化学合成は新しい保蝕基の導入あるいはト
リエステル法、ホスファイト法等の新しい縮合法の開発
により飛躍的に発展している。また、遺伝子工学の急速
な進歩とあいまって、核酸の化学合成がこの分野でも重
要な意義ケもつようになってきた。例えば１人工遺伝子
を合成し、遺伝子１１ｉ１１換え操作馨利用して有用物
質の生産か行なわれている（ヒト成長ホルモノ：　Ｎａ
ｔｕｒｅ、　２８］　。

５４４（１９７９）、白血球由来イ／ターフェロノ：Ｎ
ａｔｕｒｅ、２８７，４１１（１９８０））。また、ハ
イブリッド法のためのプローブ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、、　９　、８７９（１９８１））とじでや
、ｍＲＮＡあるいは一本鎖ＤＮＡから逆転写酵素あるい
はＤＮＡ　ｄ？　１．１メラーゼによって二本鎖ＤＮＡ
　ｙ合成する際に必要な鋳型ＤＮＡに相補的なりＮＡ断
片（ゾライマー）として利用する例（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１
ｄｓ　ｎｅｓ、、８，４０５７（１９８０）　）　もあ
る。

さらには、Ｐ；酸な結合さぜた４１３体を用いろアフイ
ニテイクロマトグラフィーｆ１１．１６４脂として、オ
リゴ（ｄＴ）−セルロースまたは７１？１月Ｕ）−アガ
ロースカラムを使って３′−末グＩＡに４？す（Ａｌを
含むＲＮＡを単１ｉｉｉａ　ｉ’−るとイ’）　ｌ、を
層１１例（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　８１　、９４１
　（１９７７）　）もある。

このように、核酸の有機化学的合成手段は、遺伝子工学
、分子生物学等の分野の研死に多大な寄与をもたらすも
ので））る。

本発明者らは、現在まで、メリゴヌクレオチドの有機化
学的合成分野で同相法ケ有力な合成手段として挿々のオ
リゴヌクレオチドの合成ケ行なってその１５用を検８・
Ｊシてきたが、特にアフィニティクロマトグラフィー用
）ｆｆｊ脂あるいは非放射性アフイニデイプローブ等を
開発すべく鋭意努カヲｉＦねた結果、これらの製造の際
に有用な中間となるオリゴヌクレオチドな見出した。

現在まで開発あるいは市販されているアフィニテイクロ
マトグラフィー用樹脂（Ａｒｄｔ、　Ｂｌｏｃｌ＋ｅｍ
。

Ｂｉｏｐｌ＋ｙｓ、、１６８，５６１（１９７４八Ｊ、
ＢＩｏｃｈｅ＋ｎ、、８３゜７８３（１９７８）、剃開
昭５２−２５７９５号、（司５３−１０１３９６叶、同
５；う一１３３２８３号および同５５−３６２７７号各
公報）や非放射性用アフィニティプローブ（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８　、６（ｉ３
３−６６３７（１９８１））に用いられているオリゴヌ
クレオチド誘導体の製造法は、一般に合成にわたりめん
どうであるという共通の稚魚をかかえていてＬト用範囲
が限定されているのが現状である。

発明の側４店゛ 要旨 イぐ発明は、上記の点に解決を与えること？目的と（−
１特定のオリゴデオキ７ヌクレオチドの塩基以夕（の特
定部位に適度の長さのス梨−ツー一を介してアミノ基を
導入してなるオリゴヌクレオチド誘導体によってこの［
］的を達成しようというものである。

従って、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、下
式Ｑ＋］で示されろものであること、ｆＸ：１時機と′
１−ろものでル）る。

また、＊発明によるオリゴヌクレオヂｌｙ　Ｍ’８導体
の製、置去は、Ｔ代（イ）〕で示さう１４化合物と下式
ｒＩ〕で示される化合物とゲ両化合ｌ吻の水酸基におい
てリン酸基を介して結合させて、下式口■］で示される
オリゴデオギノリづＳヌクレオチドを得ること、を特を
改ど″するものでｋ）ろ。

さらに、また、本発明による第１ノザヌクレオチド誘導
体の製蹟去は、Ｆ式■〕で示される化合物と化合′吻〔
■′〕のＲ３ヶ除去したものとを結合させることによっ
て下式ＱＱで示さ第１るオリゴデオキノリゼヌクレオチ
ドを得ること、を特徴とするものである。なお、この製
造法は、後記したところから明らかなように、上記の製
造法の一実施態ｊＭｙｃ係るものである。

Ｂ′０ ＨＯＪ−０−品−０→−Ｒ”　　　（＋））１−１ ムＲ０ Ｒ−Ｎｕ−１え’　−０１１Ｑ） １％　−ＮＩＩ−Ｒ−０−Ｐ−ＯＲ３［１’］論 〔ただし、ｍは仔７析の自然数であり、］（０はリン酸
）Ｉ（の）呆護基であり、ＩＮｌ　は２価の直釦または
分岐鎖の炭化水素残基であり、Ｒ２はアミノ基の１呆＾
に基であり、Ｊζ３はリン酸基の保護基であり、Ｂ′ら
ｋよ同一でも異なってもよい）。〕 旦−坐 本発明の方法Ｖこよって製、青さ牙またオリゴデオキゾ
リゼヌクレオチドは、前記のイｈＩ脂およびゾａ　−ブ
等を製造する際の繁雑さ馨回継するものであって、下記
のような長所をもつものである。

（イ）合成が非常に簡単であって、大破合成が”Ｊ　ｈ
ｆ宅である。

（σ）オリゴヌクレオチド中に存在する他の官能基（水
酸基、す／ｒ浚基、塩基部分のアミノ基）よりも反応性
が高い一級アミノ基をイｊ１−ろので、このＦｉｉ１分
で選択的に他の化合物と反し芯さ＋！：ることができろ
。

本発明によるオリゴヌクレオチドｄう４体は、前記の式
［１１］で示されるものである。

Ｂ′ 式中、記号十は、２′−デオギヅリゼヌクレオノドの３
′−および５′−水酸基を除いたデオキ／リゼヌクレオ
ゾｒ残基を示すのに慣用されているものであって、具体
的には下記の棉゛造のものである。

Ｒ′ 置換基Ｂ′は、ヌクレオチド゛を梧′成する塩基であっ
て必彼に応じて１呆護さハ、たもの、馨示す。本発明で
「必要に応じて沫ａＮｔされた」というときの「必要に
応じて」ということは、当該デオキ／す最ヌクレオチド
誘導体ケ合成しあるいに上これを他の反（らに供゛する
場合にこの塩基をこれらの反〔トスの際に他の試薬から
の攻撃から保護￥る必要があ４）場合には、ということ
ケシＣｕ未する。どのような」動台にそのような保護が
必要であるか／ｉ；］るいはどのような保ｉ／４基が使
用されるかに１φ１しては、核酸合成に関する文献また
し」、成宵たとえば後記したものを◎照′１′ることか
できろ。Ｂ′の具体例は、通常しよそλ１ぞ牙１．ア／
ル化されたアデニノ（通常（よＮ６−べ／シイルアｆ二
〕）、／ト７ノ（通常（よＮ６−ペ／ゾイル７トンノ）
およびグアエン０山常はＮ１−イソブチリルグアニノ）
、あるいはチミ／（１呆護不９）である。化合物ＩＪυ
中にＢ′が複数個存在−イるときは、それらは同一でも
異なってもよい。

ｍＧｉ自然斂ヲ示し、化合物０００重合度を示すも０）
である。そσ〕場合の１０は実用的には１〜６、特にｊ
〜４、である。

基Ｒ０はり／酸基の保護基であって１通常オルトクロロ
フェニル基マたハノξラクロロフェニル基が用いられる
。複数個のＲ０＆ま同一でなくてもよ〜・。

基Ｒ１は、化合物ｎ＋〕の核酸１１１（分と作画された
アミノ基部分とを連結１−不二価の面！１〜または分岐
鎖の炭化水素残端である。これは、債に炭素斂２〜２０
　ｑ＋、；度の直鎖または分岐鎖のアルキレノ基である
。

好ましいｌζ１は、炭素イタ２〜６のアルキレフ基でｋ
・ろ。

基Ｒ２はアミン基の保護基であって、通常トリフルオロ
アセデル基またはオルトニトロスルフエール部が用いり
１．る。本化合′吻の応用の而からＲ２はＲ３脱離の際
安定であり、かつオリゴヌクレオチド部分が安定なまま
で脱離できるものが好ｆ、１〜い。

）よＲ３はリン酸、ｌｃ−の１呆護基であって、ｊ市常
シアンエチル基が用いられる。また、本化合′吻の応用
の面から他のすべての保護基が安定な灸件で容易に脱離
されて、す／酸ジエステルを与えることができるＵ′を
換基が好ましい。

なお、これらの保護基Ｒ０、Ｒ２およびＲ３の詳細につ
いても、後記の文献または成書を参照することができる
。

化合物１〕０の合成 一般的説明 化合物Ｑ＋）、すなわち本発明によるヌクレオチド誘導
体は、合目的的な任意の方法によって合成することがで
きる。

一つの好ましい方法は、前記式０〕の化合物の５′−来
臨水酸基と前記式Ｑ）の化合′吻の水ｒ竣基と乞）ノン
酸基を介して結合させることからなるも０）である。

両水酸茫は結合層１．もの際にはいずＪｌか一力がリン
酸化されていることが望ましく、従って結合層１６に先
立っていずれか一力の化合物の水酸基、たとえば化合物
〔田の５′−末尋水酸基、を二価のυ）？１η化試薬で
リン酸化する予備工程が必要な場合がある（第１図）。

固化合物の一方、たとえば化合物〔２〕、が既にり／酸
化されている場合はこのような予備工程は年間であるが
、このリン酸化された化合物ＣＩ）がそのυノ酸基が作
詩基ＲＫよって保護されたもの（化合物し目角ある場合
には凡　の除去を予じめ行なうことが必要であろう（第
２図）。

化合物リヱと剣越□ 式１’ｆ１）の化合物は、通常のオリゴヌクレオチドの
合成法によって合成１−ることかできる。

一般に、オリゴヌクレオチド合成法としては、トリニス
デル法、ホスファイト法およびそれそ牙１の固相７７１
．：および液相法があって、その詳細は後記の文献や成
占に示されている。本発りＪでもこれらの公知方法に従
って反１．ムを進めろことができる。

化合物〔１〕セ；よび〔Ｉ′３の合成 化合物〔Ｉ）（まアミノ基が保へされたアミノアルキレ
ノアルコール（ＮＨ２−Ｒ’−０Ｈ）であり、このフ′
ルコール化合物のアミノ基７Ｒで保護することにより得
ることができる。なお、アミノアルキルアルコールにつ
いては、ＲがＣ２＼Ｃ１２のものが市販されている。

化合物〔ｆ′〕は、化合物Ｑｌの水酸基ナリノ酸化しか
つこのリン酸基を保護基ｎ　　−ｃＨＨｔ、ｑしたもの
でｋ）る。

化合物００の合成 オリゴデオキプリゼヌクレオヂｒ〔化合′吻θＩＪ）は
、上記化合物の〕と化合物〔Ｉ〕とを内作合物の水酸基
においてリン酸基を介して結合させることりこまって製
＠１−ることかできる。

両者の結合は、両化合物ヲリノ酸基を介して結合させる
任意の方法によって行なうことができる。

たとえば、その−実流暢様（第１図）は、内作合物の一
方、たとえば化合物の〕の５′−水酸基ケニ価のす／酸
化試薬でリン酸化し、続いて他方の化合物−［なわち化
合物〔Ｉ〕と縮合条件下（たとえば１−メチル−イミダ
ゾール存在下）で反旧させることよりなるものである。

適当な二価のリノ酸化試薬としては、ホスホジトリアゾ
リド、ホスホノクロリドまたはホスホベノゾトリアゾリ
Ｆ等がある。

化合′南中いずれかがａにその水酸基にリン酸基ケ有す
るものである場合は、縮合剤を用いて結合さぜることに
よりこの反【ラヲ行なうことができる。

その場合の実流暢様は第２図に示した７１１９であイ）
が、化合物〔■′〕のリン酸基保饅基Ｒ３はシアノエチ
ル基であることがふつうであって、その除去はたとえば
化合物［１’：］　’ｒビリノ／−水−トソートリエチ
ルアミノＩ：１）に溶解することによって行なうことが
できる。

上記いずＪｌの方法においても、縮合剤としては種ノ？
知られているが、１・／ルクロリド、メンチレノスルホ
ニルクロリド、メンチレノスルホニルテトラゾリドおよ
びメンチレノスルホニルニトロトリアゾリドが好マしい
。

な松、デオキノリゼヌクレオヂドの合成法は既に各種の
ものが公知であって、保細基の種類およびその導入ない
し除去ならびに縮合その他について上記以外の肝託Ｉは
核酸の作字合成に関１−る蔵書や総説たとえば「ヌクレ
オチド・ヌクレオチドの合成」（丸善１９７７卯）、「
核酸有機化学」（化学同人１９７９年）、「核酸」（朝
食書店１９７９年）、’ｌ’ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、　
３４　、３１４３　（１９７８）、有合化、丑。

７２３　（１９７３）および化学の領域、η、　５６６
　（１９７９）等を参照することができる。

第１図のフローチャートに従って、本発明の化合物（回
申の化合物卯）を製造した。

第１図で、記号は下記の屁味をもつ。

Ｂ’　　　ペノゾイル化アデニノ ＣＥ　　シアンエチル ２ Ｒオルトクロロフェニル １ ｘ−ｐ−ｘ　　二価のリン酸基（Ｘはハロゲノを示０Ｒ
０−３−） 化合物０υの合成 実施例１ ６−アミノヘキサノール１．１７ｇ　（１（１ｍ　ｍｏ
ｌ　）　ｆ、６ノメギサノ（１５，ｍｌ　）に溶解し、
トリフルオロアセチル］、８０ｒｎｌ　（１４，４ｍ　
ｍｏｌ）を加え、室部で一夜反りを行なう。反Ｌｂ後、
この溶液を濃縮し、残渣をエーテルに１容１Ｎ（Ｌ　、
水で３回抽出を行なう。エーテル層を無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥後、４縮を行なう。残直にエーテルを加えて溶
解した後、４ノタノを加えて結晶化させることにより、
粉末状の化合物〔１）（）リフルオロアセチル−６−ア
ミンヘキサノール〕を得る。

一方、既知の方法で合成した５′−ヒドロキノ−２ヌク
レオヂド（０）８００ｍｇ（０，７１ｍｍｏｌ）　ｆｍ
ｌ）　ジノ共イ弗により無水にし、これにオルトクロロ
フェニルホスホノトリアゾリド（］、　、　（Ｊｌｒｎ
　ｒｎｏｌ　）のジオキャｙ　（５，Ｑ　ｍｌ　）６液
を加えて２時間反＋５、させろ。

これに先に合成した化合物（１：］　３００　ｍｇ　（
１−４ｍ　ｍｏｌ　）およびＩ−メチルーイミグゾール
１］５ｎ１ｇ（１，４ｍ１↑１０１）を加えてさらに２
時間反Ｌｉ′；きぜる。反応の終了を確望後、ビリジ／
−水を加えて過剰のトリアゾリドを分解し、俗媒を留去
する。残ａをクロロホルムに溶解した後、水、０．５Ｍ
！Ｊノ酸二水素ナトリウム水浴液、飽和炭酸水素ナトリ
ウムおよび５％塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水（
Ｎｆｆｆ酸ナトリウムで乾燥する。クロロホルム層な濃
縮後、ノリ力ゲルノヨートカラムで’４’ｒｊ　’ＪＪ
　（ｉ？￥ｌ’Ｊ　敲とじて０〜４％のメタノール含有
クロロポルムを使用）し、目的物を含む溶出液を８縮し
、これをペンタ／中に滴下して粉末状の化合物ｆｕ、］
を得る。

以下同様にして化合物ｎｏにａ当する化合物（実施例２
〜６）を合成した。実施例の置換基、塩基。

ｍす・マよび収率を表１に示す。

第　　　１　　　表 上表中、各記号は下記を廐味する Ｔｆａトリフルオロアセチル Ｎｐｓ　　：Ａ−ルトニトロスルフェニルＣＥ　　ノア
ノエチル Ａｌ（ｚ　　Ｎ６−ペノゾイルアデニン］゛　チミン ＧＩ　Ｔｌｕ　　Ｎ　ｌ−イソグチリルグアニノ

【図面の簡単な説明】

ｈ１１〜２１小よ、い１れも本発明の化合′吻ケ合成−
′ｆろ力θ、の−例ケ小社フローチーヤードでｋ）る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下式（ｊＱで示されるものであることを特徴とする
   。オリゴヌクレオチド誘導体。 ［ただし、ｍ＆ま任意の自然数であり、Ｒｏはリン酸基
   の保酔基であり、Ｒ１は２価の直鎖または分岐鎖の炭化
   水素残基であり、Ｒ２はアミノ基の保護基であり、Ｒ３
   はリン酸基の保護基で数個存在するときは、それらは同
   一でも異なってもよい）。〕 ２塩基Ｂ′がそれぞれアシル化されたアデニン、ノド７
   ノおよびグアニン、なラヒーチミノ（保護不要）からな
   る群より選ばれたもσ）である、特許請求の範囲第１項
   記載のオリゴヌクレオチド誘導体。 ３　Ｒｏがオルトクロロフェニル基または繋うクロロフ
   ェニル基である、特許請求の範囲第１項または？Ａ′ｆ
   ｊ２項記戦のオリゴヌクレオチド誘導体。 ４　■（１が炭素数２〜ｍの１σ鎖または分岐鎖リアル
   キレ７基で手・る、特許請求の範囲第１〜３項のい−ｆ
   　；ｈ、力司項て記載のオリゴヌクレオチド誘導体。 ５、　Ｉｔ２がトリフロロアセチル基またはメルトニト
   ロスルフェニルノー二である、特許請求の範囲第１〜４
   項のいずれか１項に記載σ）オリゴヌクレオチド誘導体
   。 ６　Ｒ３がノアノエチル基で３）７：Ｉ、特、ｉｆ請求
   のＮ　９１第１〜５項のいずれか１項に記載のオリゴヌ
   クレオチド誘導体。 ７下式ｒＯ〕で示される化合物と下式Ｃ１〕で示される
   化合物とを固化合物の水酸基においてリン酸基を介して
   結合させて、下式ＯＯで示されるオリゴヌクレオチドを
   得ることを特徴とする、オリゴヌクレオチド誘導体の製
   造法。 Ｒ−ＮＨ−１也−〇Ｈ１（Ｉ、１ しただし、ｍは任、ｉ；？の自然数であり、Ｒはυ）酸
   基の保ｔφ基であり、Ｒ１は２価の直鎖または分岐鎖の
   炭化水素残基であり、ｉｔ　　はアミン基の１呆護基で
   あり、Ｒ３はリン酸基の１呆護井で数個存ｔＥするとき
   は、それらは同一でも異なつ８、化合物「０〕と化合物
   １］■〕との結合を、いずれか一方の化合物の水酸基が
   リン１イタ化さ１１．た状態で、縮合条件下に行なう、
   Ｉ特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９化合物１０〕の５′−来臨水酸基な、二価のり７１１
   ９化試薬でリン酸化しＣから縮合反応ケ実施する、Ｉ特
   許請求のか１〕囲第８１百記載の方法。 １０す／酸化試薬がホスホノトリアゾリド、ホスホノト
   リアゾリドまたはホスホジクロリドである、ｌ侍ｄ「請
   」〈の範ｒｊｆｌ＋第９項記載の方法。 １１化合物ｆ’Ｉ’ｌの水酸基がリン酸化された状態に
   あろ、ノｔをＷ［請求の範囲′４８項記・ｉあの方法。 １２縮合剤がトシルクロリド、メンチレノスルホニルク
   ロリド、メゾ千レノスルホニルテトラゾ’Ｊ　ｒ巧ｃ；
   よびメノチレノスルホニルニトロトリアゾリドの贋ずれ
   かである、ｌ侍約゛藷求の帥囲第８〜１１項のいずれか
   １項に記載の方法。