JPH03504015A - アルファ‐オリゴリボヌクレオチドの合成方法およびこの方法に用いられる化合物 - Google Patents
アルファ‐オリゴリボヌクレオチドの合成方法およびこの方法に用いられる化合物Info
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- JPH03504015A JPH03504015A JP50701289A JP50701289A JPH03504015A JP H03504015 A JPH03504015 A JP H03504015A JP 50701289 A JP50701289 A JP 50701289A JP 50701289 A JP50701289 A JP 50701289A JP H03504015 A JPH03504015 A JP H03504015A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
アルファーオリゴリボヌクレオチドの合成方法およびこの方法に用いられる化合
物
この発・明はアルファ(1)−オリゴリボヌクレオチド化合物の新規な合成方法
とこの合成方法によって得られる化合物とに関する。このような化合物に関して
は先行技術である特許出願FR87104,339およ:び国際公開第8870
4,301号において本願出願人の名によって開示されている。しかし、それら
に開示されているところのホスホトリエステル方法にもとづく合成方法はウラシ
ル塩基とシトシン塩基とをもっばら含む化合物にのみ適応できるものであった。
それらのa−オリゴリボヌクレオチド化合物は自然なβ型立体異性体に対して、
不自然なα型のアノマーな異性体となる。
それらの化合物はエフェクター剤を付加的に結合させることができる。特に、こ
の結合は共有結合によって得ることが゛できる。それらのエフェクター剤は核酸
に関した分野で既知となっている。それらは主に挿入されたラジカル、ヌクレオ
チド鎖と直接的または間接的に反応する機能を有するケミカルラジカル、または
検知を容易にし、かつ挿入されたラジカルを構成することが可能なケミカルラジ
カルとなる標識物からなる。
より特異的には、本発明の目的はホスホラミダイト(phosphoramid
ite)方法による固体支持体上でのσ−オリゴリボヌクレオチド化合物の合成
過程に関するものである。
固体支持体上でのホスホラミダイトによる合成はすでにσ−オリゴリボヌクレオ
チド化合物の合成について示されており、特に特許出願FR87104,339
に開示されている。対象的に、先行技術において、特に自動合成装置を用いてa
−オリゴリボヌクレオチド化合物は固体支持体上で合成されていない。
α−オリゴリボヌクレオチド(sic)化合物の合成は先行技術において、特に
特許出願PR87104,339においていわゆるホスホトリエステル方法にも
とづいて開示されている。
本発明は、固体支持上における合成において、リボースの2゛−位に!位置する
ヒドロキシル基を保護するという問題をTBDMS (tert−ブチルジメチ
ルシリル)およびCcmp (1−(2−クロロ−4−メチルフェニルシリル)
−4−メトオキシ−4−ピペリジル)をもちいることによって解決することを目
的としている。
Ctmp基はリボースの5°−位のヒドロオキシ基の保護のためのDmtr(ジ
メトオキシトリチル)基の利用に適合するという利点がある。なぜなら、例えば
4−メトオキシテトラヒドロビラン−4−イル(Mthp)基とは異なり、固体
支持体の脱保護(deprotection )状態であってもインタクトな状
態を維持するからである。
本発明において提起される他の保護基はTBDMSであって、反応性を有するモ
ノマーの合成に関与し、またフン素イオン、特に無水THF中におけるテトラブ
チルアンモニウムフルオライドによる除去が容易であるという利点がある。
本発明に用いられるホスホルアミダイト方法にもとづく固体支持体(solid
−phase process)プロセスは以下の合成過程によって概略なされ
る。すなわち、
一保護すれたa−リボヌクレオシド誘導体は固体支持体上において2・−または
3・−位のヒドロキシルファンクション(hydoroxylfunction
s)のひとつを介して固定化される。
−保護されたa−オリゴリボヌクレオチド鎖は手動または自動合成装置のりアク
タ−内の固体支持体上で集合(issemble)される。この集合は3°−位
のホスホルアミダイト基を置換された保護a−リボヌクレオシドからなるモノマ
ーの綜合によってなされ、リボースの2’−位のヒドロキシルファンクシ1ンは
CtmpまたはTBDMS基によって保護されている。
−aミーオリゴリボヌクレオチド支持体から得られたオリゴマーの分離および保
護基の除去によって得られる。好ましくは、a−オリゴヌクレオチドの集合は活
性剤(activating agent)存在した、第1のモノマーに関して
固定化されたa−リボヌクレオシド化合物の3°−および5°−ヒドロキシルフ
ァンクション間における前記七ツマ−の縮合によってなされるか、もしくは第1
の七ツマ−につづいて集合する七ツマ−に関して固定化されたa−リボヌクレオ
シド化合物に保護されたa−ボロリボヌクレオチドのの3゛−および5°−ヒド
ロキシルファンクション間における前記七ツマ−の縮合によってなされる。
特に、前記モノマーの縮合に用いられる活性剤はテトラゾールおよびその誘導体
からなる群から選択されるもので、例えばバラ−ニトロフェニルテトラゾールで
ある。
好適には前記モノマーの3°−位置のホスホルアミダイト基は化学式0)で表さ
れるN、N−ジアルキルアミノホスホルアミダイト基である。
R1は付加的に置換かれた同一のあるいは異なるC1ないしC7アルキル基、例
えば、α8、 (CH,)、CH,R,はイJ加的に置換されたC1ないしC7
アルキル基、例えば、aち、CM2CH,CN。
好ましくは、前記モノマーのホスホルアミダイト基は(sic)メチルジイソプ
ロピルアミノホスホルアミダイト (R,= (CH,) 2CHおよびR,=
CH,) または2−シアノエチルジイソプロピルアミノホスホルアミダイト
(R,= (CI−1,) 、CHおよびR2=CH,CH,CN)である。
前記千ツマ−のヒドロキシル基および前記固定化されたσ−リボヌクレオシド化
合物のヒドロキシル基はDm「基によって5゛−位を保護されている。
固定化されたa−リボヌクレオシド化合物はサクシニル型2価基を介して2°−
または3−位置のO)L基のひとつと支持体のアミノ基とがエステル化によって
結合して前記化合物の固定体支持体への結合がなされることが可能である。
固体支持体はポリマー、シリカゲルまたは多孔性ガラスピーズに結合した長鎖ア
ルキルアミンからなることが可能である。
エフェクターラジカルに結合したα−オリゴリボヌクレオチドを合成しようとす
るとき、固体支持体上に結合した保護a−オリゴリボヌクレオチドの5゛−末端
ヒドロキシルファンクシ1ンは挿入基、化学的に活性な基又は光活性可能な基に
よって置換されるモノマーにカップリング可能な固体支持体に結合する。
本発明によれば、従来から知られている技術によって、特にアルキル鎖を介して
ラジカルエフェクターによって分離または除去後に合成されたa−オロゴリボヌ
クレオチドの3°−または5′−末端のヒドロキシルファンクションに結合可能
である。
よって、本発明にもとづいて下記の一般式によって表される化合物の合成が可能
でありはラジカルを示す。この式中に表されたラジカルBは同一または異なるも
ので、それぞれ付加的に修飾されたリボ核酸を示し、人為的なアルファアロマ−
立体配座(alphaar+omeric configuration)にも
とづいてグリコシド環に結合している。
Xもまたラジカルを示す。この式中に表されたラジカルXは同一またはこと案る
もので、それぞれオクソアニオン0−、チオアニオンS−、アルキル基、アルコ
シル又はアリロキシル基、アミノアルキル基、チオアルキル基またはY−Zから
なるものである。
RおよびR“は同一または異なるもので、水素原子または基−Y−Zを示してい
る。
Yは直鎖状または分枝状のアルキレンラジカル−アルク(alk)−またはラジ
カルで合によって示されるものである。[1= O,NまたはSoまたは二者択
一的にラジカル−Y”−0−Y”で、Y”またはYoはYによって与えられる意
味を持つ;EはXと同様の意味を持つが、Y−Zが異なる。
Zはエフェクター試薬に該当するラジカルである。
nは0(sic)を含む挿入である。
Lは酸素原子、イオウ原子または−NH−基を表す。
この一般式では、下記の概略措造式で示したヌクレオシドを用いた。
この式は構造式:
に該当する。ここで(3′)および(5゛)末端を書き示した。
この一般式は同一または異なるヌクレオチドの結合を示すためのものである。n
はただ単に分子内のヌクレオチドの番号を示すもので、このましくは1から10
0まであり、より好ましくは1から50までである。
エフェクター試薬に該当するエフェクターラジカルは核酸に関する技術分野にお
いては既知のことであり、例えば、DNAまたはRNAに挿入可能な多環状化合
物である。
これらの挿入可能な試薬は一般に、アクリジン、フエナンチリジニウム、フロコ
ラマリン、ダウノマイシン、t、io−フェナンスロリン、プロフィリン(si
c) 、ジビリド−[1,2−i:3“、2°−dlイミダゾール誘導体、エリ
ブチシンまたはエリブチジニウムおよびそれらの誘導体からなる。
また、これらのエフェクター試薬は化学開裂(chemioil cleava
ge)ラジカルのような反応性を有するケミカルラジカルで、直接または間接的
にヌクレオチド鎖を開裂する。好ましくは、これらの反応性を有するケミカルラ
ジカルは、例えば化学的にまたは光化学的に活性化可能なものである。活性可能
な反応性を有する開裂基は、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸、ジエチレント
リアミンペンタ酢酸、ポルフィリン、1.10−7エナンスロリン、プソラレン
および近紫外または可視領域の放射を吸収可能な他のアロマティック基の誘導体
である。
金属イオン、酸素または還元剤存在下で、化学的活性化可能なこれらの基は、核
酸配列のそれらの基に近い部分に亀裂を生じさせる。
ラジカルBはa−アノマー立体配座を介してヌクレオチドの糖部分に結合するリ
ボ核酸塩基からなる。それはアデニン、シトシン、グアニンまたはウラシルであ
る。しかし、修飾されたリボ核酸塩基、特にハロゲン化またはアジド化されたも
のを用いることも可能である。例えば、5−ブロモウラシル、8−アジドアデニ
ン、または2−アミノアデニンのようなアミン化誘導体などが挙げられる。さら
にそれらの誘導体で、例えばアミノアルキレン基またはアイドフェニルアルキレ
ン基によってN6を置換、06をグアニンで置換したものがある。例えば、また
はNH2を9−(、−アルキレン)アクリジン基、または8−
【(ω−アミノア
ルキル)アミノ1アデニンおよびその誘導体で置換したもの、およびω−位をア
クリジン基で置換したものがある。
本発明にもとづいて、誘導された修飾塩基の可能性と同様に一般塩基が考慮され
ることが可能である。相補的β−鎖に共有結合することが可能な”エフェクター
塩基2が誘導されることができよう。よって、4位におけるアジリジン基による
Cの機能化(functiona1iza6on)はG上において2つの相補的
な銀量に共有結合的な(oovalent) CH。
−CH,ブリッジを形成させる。
よって、より特徴的なことはラジカルBはアデニン、シトシン、グアニン、本ア
ジドシトシンおよび8−アジドアデニン、ウラシルおよび5−ブロモウラシルか
ら選択される。
ラジカル−アルク−は好ましくは直鎖状または分岐状アルキレンラジカルであっ
て、1ないし10の炭素原子を有する。
特に、a−オリゴマーの3−または5°、末端アルコールファンクションを用い
て、オリゴメーのグリコシド部分における機能化l°に結合した(CH2)、を
介してエフェクターが誘導される。
下記の式によって、かつZlの意味によって3′
or −0−Z、−(CH,)Il−Z5′
・ホスフェートまたはメチルホスホネートが得られる。
U=O,N、またはSo
・エーテルが得られる。
or−o−+CH2H−CHr+1−Z5′
・エステルが得られる。
−0−(Co−)−+cHd、、−Z
・または二者択一的にカーボネートが得られる。
−Q−4CONH−)−+CH,+a、−Z本発明はまた、塩基又は酸を有する
塩のかたちの前記化合物の合成に関与するものであり、またラセミ型またはRま
たはS光学異性体の型にある前記化合物、精製又は混合された前記式によって表
される化合物に関与する。
また、本発明の目的は、発明にもとづいて合成された化合物、特に排他的にUお
よびCを含まない化合物を得ることである。
さらに、本発明の目的は本発明にもとづく合成方法に利用される化合物そのもの
である。
それらの化合物は3゛−位がホスホルアミダイト基と置換したa−リボヌクレオ
シドモノマーであって、該七ツマ−のリボースにおいて2°−位のヒドロキシル
ファンクションがCtmp又はTBDMS基によって保護されている。
より特徴的には、それらの化合物は下記の式によって表される七ツマ−である。
Bはα−アノマーの立体配置によってグリコシド環に結合した塩基であって、U
、A。
C,Gおよび前記塩基の修飾塩基および(または)保護塩基からなる群から選択
された塩基である。
Plはヒドロキシルファンクションを保護された基であって、例えばCtmp、
TBDMS。
R2はHまたはヒドロキシルファンクションを保護された基であって、この基は
例えばDmtr、
R3は化学式(1)によって表されるN、N−ジアルキルアミノホスホルアミダ
イト基のようなホスホルアミダイト基、
R1は付加的に置換された同一のあるいは異なるC1ないしC,アルキル基、例
えば、α3、(CH,) 、CH。
R2は付加的に置換されたC1ないしC,アルキル基、例えば、CH,、CH2
O(、CNである。
さらに本発明の目的は2゛−または3゛2位のヒドロキシルファンクションを介
して固体支持体上に固定化されたα−リボヌクレオシドを含むことを特徴とする
a−オリゴリボヌクレオチド化合物を提供することである、。この化合物は化学
式(nt)によって表される化合物である。
Bはa−アノマーの立体配置によってグリコシド環に結合した塩基でありて、U
、A。
C,Gおよび前記塩基の修飾塩基および(または)保護塩基からなる群から選択
された塩基であることを特徴あう、
R2はHまたはヒドロキシルファンクションを保護された基であって、この基は
例えばDmtr、
R3およびR゛、のどちらか一方はHまたはヒドロキシルファンクションを保護
する基であって、この基は例えばベンゾイル基であり、他方は末端ファンクシ式
ンを介して固体支持体に結合することが可能なファンクシコン基または固体支持
体に結合した前記ファンクション基である。
さらに、R1またはR1,は化学式(IV)によって表される基であることが可
能である。
Pは数字工ないし5であり、
R4はOHを表し、OHはC,G、のような活性基、または固体支持体に結合し
た一冊ラジカルであって、例えば前記固体支持体はポリマー、シルカゲルまたは
多孔性ガラスピーズに結合したアルカリアミン鎖の−NHラジカルである。
第1図および第2図に図示した合成経路は3゛−位がホスホルアミダイト基によ
って置換され、2°−位のヒドロキシルファンクションがCtmpまたはTBD
MS基のような保護基によって保護されているa−リボヌクレオシドモノマーの
合成に関するものである。これらの図において、Bは(ツ加的に修飾および(ま
たは)保WLカれたリボ核酸塩基を示す。
よって、a−グアニン、−シトシンおよび−アデニンは2−14−および6−位
においてベンゾイル保護として用いられている。
11に
論
宵2囚
1、七ツマ−(5a)の合成(第1図参照)(1=Ctm文献に記載された方法
にもとづいて得たa−リボヌクレオシドから合成を行なった。酸に対して不安定
な保護基Crmpの選択的導入(selective 1ntroductio
n)は以下の方法によってなされた。
化合物(la)をジメチルフォルムアミド/ピリジン混合物中において1,1,
3.3−テトライソプロピル−1,3,−ジクロロジシロキサン処理し、得られ
た誘導体(2a)をトリフルオロ酢酸存在下において1−(2−クロロ−4−メ
チルフェニル)−4−メトキシ−1,2,5,6−テトラヒドロビリジン処理し
た。その結果、無水ジオキサン中において化合物(3鳳)を得ることができた。
精製後、この化合物をEt4NBrおよびKFを含むCH、CN溶液によって5
0°C,1時間処理した。その結果、1,1,3.3−テトライソプロビルジシ
リル保護基(protectton)が選択的に取り除かれて化合物(4a)
を得ることができた。
この化合物(4a)を4,4°−ツメlキシトリチルクロライド含むピリ1ジン
溶液によってトリチローション(tritylation)することによってヌ
クレオシド誘導体(5a)を得ることができた。
ヌクレオシド誘導体(2b)を保護処理(protection)後に得ること
ができた。例えば、該当する誘導体(ib)をピリジン溶液中において4.4゛
−ジメトオキシトリチルクロライドによってトリチローションすることによって
得ることができた。
したがって、3゛−位を置換された誘導体(3a) は無水ピリジン中において
イミダゾール存在下、tert−ブチルジメチルシリルクロライドと反応させる
ことによって得ることができた。
誘導体(5a)はメタノール中においてトリエチルアミン存在下TBDMSJi
の分子間移動(intramolecular migration)によって
誘導1体(3a)から得ることができた。
3、a−リボヌクレオシドホスホルアミダイト(6a−b) (第1図および
第2図参照)
N−保護a−リボヌクレオシドホスホルアミダイト(N−protecired
alpha−ribonucleoside phosphoramidite
s) (6a−b)を該当するN−保護5’−0−ジメトキシトリチルーヶー
リボヌクレオシド(5a−b)から得ることができた。
R,=CH3である誘導体(6a)を得るために、不活性気体下、がっジクロロ
メタン中においてN、N、N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)存在下
、ヌクレオシド誘導体(5&)をクロロ−N、N−ジイソプロピルアミノメトキ
シホスフィリン処理した。
また、R,=CH2−CH,−CNである誘導体(6b)を得るために、無水ジ
クロロメタン中においてジイソプロピルアンモニウムテトラゾライド(0,5モ
ル当量)存在した、ヌクレオシド誘導体(5a)を2−シアノエチルN、N、N
−テトライソプロビルホスホロジアミダイト (1,1モル当量)処理した。
4、固体支持体に結合したオリゴリボヌクレオシドの2°末端または3°末端か
らなるヌクレオシド化合物7の合成(第2図参照)オリゴリボヌクレオシドの2
°末端または3°末端からなるヌクレオシド化合物7は誘導体lから2つのステ
ップをもって合成された。その2つのステップとは、まず誘導体lの5′、ヒド
ロキシル基を4,4°−ジメトキシトリチルクロライドによって選択的トリチロ
ーションを行ない、誘導体(2b)を得る第1のステップと、つぎにこの誘導体
(2a)の2−又は3゛−位のヒドロキシルをベンゾイルクロライドによってベ
ンゾイルする第2のステップとからなる。
5、固体支持体への化合物7し4廊」(」jra工■11−(第3図参照)移植
(g−rafting)は第3図に示した。2゛(又は3゛)−モノベンゾイル
異性化混合物(7)の溶液をサクシニックアンハイドライドとジメチルアミノピ
リジン(DMAP) とを含むピリジン溶液と反応させた。
その結果、2゛−または3°−位にサクシニル基を有し、かつ他の隣接したハイ
ドロキシル(vicinal hydroxyl)がベンゾイル基によって保護
された化合物(8)を得ることができた。そして、この化合物(8)を3°−ま
たは2゛、(ペンタクロロフェニルスクシネート)誘導体に変換し、つづいてこ
の誘導体を固体支持体、例えば多孔性(porous)ガラスピーズ(LCA−
CPO)に結合した長鎖アルキルアミンと反応させることによって、固体支持体
に結合したかごうぶつ(io) を得ることがゼきた。
第3図
LCA−CPG支持体にノ(有結合した化合物(1o)は小さなリアクターに導
入された。σ−オリゴリボヌクレオチド(sic)の伸張反応(elongat
ion)は合成サイクルの継続によってなされた。
洗浄は別として、各サイクルはジトリチローション、濃縮、アセチローションお
よび酸化の各段階からなる。必要な回数だけサイクルを循環したあと、支持体を
チオフェノール/トリエチルアミン/ジオキサン(1: 2 : 3. v/
v/v)混合物によって1時間処理し、ホスフェートからメチル又はシアンエチ
ル基を除去した。その後、支持体を濃縮アンモニア溶液処理し、これによってヘ
テロサイクリックアミンを保護している基(sic)を除去し、かつ支持体から
ムクレオチド産物を遊離させた。この段階では、求めるオリゴリボヌクレオチド
は5°末端゛にジメトオキシトリチル基を有しており、高速液体クロマトグラフ
ィによって精製された。酢酸処理することによって、5゛末端にあるジメトオキ
シトリチル基を除去することができた。
このような合成サイクルはオリゴヌクレオチド合成に関してはすでに既知のこと
である。
以下、実施例にもとづいて本発明をより詳細に説明する。
実施例1:α−ウリジンの完全保護されたホスホルアミダイト化合物(phos
phoramidite 5ynrhon)の合成(a) a 二’y ’)
’) > (1)451M (rotection)(a、I) Piに対して
不安定な4,4°−ジメトオキシトリチル(Dmtr)基によるリボースの5°
−OHの保護a、2) Eftの2’−OHの保護
2つの保護基を用いることを試みた。すなわち、!−(2−クロロ−4−メチル
−フェニル)−4−メトキシ−4−ピペリジル(またはCtmp)基(C,B、
Reese、 Nucleosides、 No、6.121.1987)
と3MLフチルジメ2291、1986) とである。
Ct m pはDm trとともに用いるとよい。なぜなら、CtmpはDmt
rの脱保護状態下であっても4−メトオキシテトラヒドロビラン−4−イル(M
thp)基と異なりインタクトな状態が保たれるからである。しかし、Ctmp
の合成には生産量が少ないにもかかわらず数多くの反応段階を経なければならな
いので、他の保護基が開発された。それがTBDMSである。これはフッ素イオ
ン、すなわち無水THF中においてテトラブチルアンモニウムフルオライド(T
BAF)によって除去される(K、K。
(b、r、)糖の2’−OHに対するCLmp保護基の利用α−ウリジン(1,
831g、 7.5mmol)含有無水ピリジン溶液(15ml)に対して、1
,3−ジクロロ−1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサン(2,5m
l、 7.9mmol)を添加した。この溶液を2時間、室温で攪拌し、さらに
真空エバポレータで蒸発させることによって約1/2に濃縮した。残滓は飽和炭
酸水素ナトリウム(20ml)に注し1で混合溶液とし、この混合溶液をジクロ
ロメタン(40mlおよび2 X、 20m1)で抽出した。硫酸ナトリウムに
よって結合有機相(combtned organicphases)を乾燥さ
せて濾過した。ろ液は減圧でエバボレート(減圧蒸留)し、さらにトルエン(3
x 20m1)にともにエバボレートした。
よびジクロロメタンの混合液によって溶離(elute)を実施した。求める産
物を含むフラクシコン(分画)は結合しくcombined) 、減圧蒸留され
た。残滓はベンゼンで溶解した後、凍結乾燥させた。その結果、3.3gの白色
粉末を得ることができた。90%の回収(yield)率であった。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:CHl、1ffsI?rTIP
S−t+二g71゜’ −D、H,5hannahoff and R,A、
5anchez、 J、 Org。
Chem、 3B、 59:] (1973)。
” −W、’r、 Markiewicz、 J、 Chem、 Res、、
5ynop、、 24−(1979); 、J、 Chem、 Res、、 1
81 (1979゜無水ジオキサン(8ml)に1−(2−クロロ4−メチルフ
ェニル)4−メトキシ−1,2,5,6−テトラヒドロピリジン(3,46g、
14.54mmoりおよび3′、5°−0−(1,1,3,3−テトライソプ
ロピルジシロキサン−1,3−ジイル)−a−ウリジン(0,782g、 1.
615mmol)を溶解させた溶液を事前に加えた丸底フラスコに0.55m1
のトリフルオロ酢酸を加えた。この混合溶液を室温で5時間攪拌した後、トリエ
チルアミン(1,5m1)を加えて中和した。中和後ただちに、減圧蒸留によっ
て乾燥させて油性残滓を得、この油性残滓をシリカゲルカラムクロマトグラフィ
にかけた。ジクロロメタンに含有されたアセトン(Oかも10%)の濃度を増加
させるにしたがって溶離がなされた。目的とする精製産物が含まれる分画が結合
され、かつ減圧下で蒸発乾燥され、ベールイエローの粉末(Ig、 85.5%
)が得られた。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:the Ctmp gro
up); 6.26 (d、 LH,Hl、、 J□、−、、3,63
Hz); 5.フジレファレンス:
’−C,B、 Reese、 H,T、 Serafinowsk
a and G+Zappia、 Tet、 Lett、、 27.2
291 (1986)。
前記の方法によって得られた化合物(Ig、 1.3111mmol)をアセト
ニトリル(41jml) と水(0,41m1)とからなる溶液に加えて溶解
し、さらにテトラエチルアンモニウムブロマイド(1,74g、 8.28mm
ol)およびボタジウムフルオライド(0,481g、 128mmol)を加
えた。
この混合溶液を50°C11時間の条件で激しく攪拌した後、濾過した。濾過液
は陰圧で蒸発乾燥され、得られた残滓を再びジクロロメタン(50ml)に溶解
した。この有機溶液、を水で洗った(3 X 3m1)。その後、硫酸ナトリウ
ム上かつ減圧蒸留によって蒸発乾燥魚せた。
得られた残滓はシリカゲルカラムクロマトグラフィにかけた。溶離はメタノール
(0,5む分画が結合され、蒸発乾燥された。 無色の残滓(0,51g、77
%)が得られた。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:IHNMR(CDCI、)
6 8.85 (g、 LH,N1(); 7.フ5 (dy IHF
Hat Js−s8.18 Hz); 6.88−7.15 (m、
3H,aromatic Hof the Ctmpgroup); 6.
4B (d、 11ミ、 Hl、、 Jl、−、、6,82Hz);
5+71 (d、 IH。
N3); 4.86 (pseudo−t、 1B、 N2.)74.40 (
m、 IH,H,、)74.24 (m。
LH,H,、); 3.6−3.9 (m、 2H,N3. and H,に
3.27 (s、 3H,0CH3)23.03 (m、 LH,OH,、);
2.75−3.1 (m、 4H,2CH,of the Ctmpgrou
p); 2.33 (m、 IH,OH,、)22.26 (s、 3H,to
lyl CH,)21.75−2.15 (m、 4H,2CH,of the
Ctmp group)。
レファレンス:
and ’J’、 Hata、 J、 Aaier、 Chem、 Soc、、
山。
4552 (1984)。
σ町
1論αベニ)
上記方法によって得られた化合物(0,51g、 1.06mmol)を無水ピ
リジン(5ml)に溶解させ、さらにジメトキシトリチルクロライド(0,43
0g、 1.27mmol)を加えた。この混合溶液を室温で1時間30分攪拌
した後、メタノール(2ml>を加えた。さも番こ、5分間攪拌させで反応させ
、この反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液(30ml) &こ注v1だ。
結合有機相(ωmbined organic phase)は硫酸ナトリウム
上で乾燥させ、濾過しj:。濾過液は減圧蒸留によって蒸発乾燥させた。得られ
た残滓はベトロリュウムエーテJし中(こ共沈させた。乾燥後、無色の粉末(o
、645g、 78%)が得られた。
核磁気共m (NMR)によって得られたデータ:groupl。
上記の方法によって得られた化合物(I Jf53g、 2.36mmo+)を
無水ジクロロメタン(7ml)は無水ジクロロメタン(7,ml)に溶解し、さ
らにこの溶解液にN、N、N−ジイソプロピルエチルアミン(1,65m1.9
.44mmol)とクロロ−N、N−ジイソプロピルエチルアミン(1,15m
1゜5.9mmol)を加えた。アルゴン雰囲気中において室温、30分攪拌し
た後、エチルアセテート(80ml) を含む分離ファネルに注いだ。得られ
た溶液は塩水(4x 50mol)で洗った。有機相は硫酸ナトリウム上で乾燥
させ、濾過および減圧蒸留によって乾燥させた。残滓はシリカゲルカラムクロマ
トグラフィにかけた。溶離はシクロヘキサン、ジクロロメタンおよびトリエチル
アミンの混合溶液(それぞれの比は99:O: lから0:99:L、VNN)
によって行なった。精製産物を含む分画が結合し、蒸留によって乾燥された。得
られた残滓は再びベンゼンに溶解して凍結乾燥された。これによって無色の粉末
(2,056g。
92%)が得られた。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:”P NMR(CD、CN)
6158.52 and 155.7L5’−0−Dm+r−3’−Ctmp−
a−ウリジン(sic) (0,644g、 0.821mmol)およびジ
イソプロピルアンモニウムテトラゾイリド(0,070g、 0.41mmo+
)の混合物に、2−シアノエチルN、N、N’、N”、テTライソプロビルホス
ホロジアミダイト (0,27g、 0.9mmol)含有無水ジクロロメタン
(1ml)を加え、さらに続けて無水ジクロロメタン(3,1m1)を加えた。
そして室温で4時間攪拌した後、さらにホスポルアミダイトを加えて18時間攪
拌し、つづいて50°Cに加熱して7時間攪拌した。攪拌された反応溶液は飽和
炭酸水素ナトリウム溶液(IOml)に注いだ。その後、この混合溶液に工升ル
アセテート(20ml)を加え、有機相を塩水(3X 10m1)で洗った。洗
浄後、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過した。溶媒を蒸発させた後、残滓?シ
リカゲルカラムクロマトグラフィにかけた。前記と同様の溶離を行なった。凍結
乾燥を行なって、求める化合物を無色の粉末(0,789g、 97%)として
得ることができた。
核磁気共鳴(NMR)によって(Mられたデータ。
”P NMR(CD、CH) 6152.35 and 1.49.68゜b2
糖の2°−OHに利用されるTIIDMS保護基)%OOフロ6
エ 1979 p 2フロ2
上記と同様の条件によって、σ−ウリジンにジメトキシトリチルクロライドを作
用させ、5−0−ジメトキシトリチル−6−ウリジン(sic)が73%産生さ
れた。この化合物(0,546g、 1mmoりを含む無水テトラヒドロフラン
(IOml)溶液に、ピリジン(0,3ml。
3.7mmol) 、硝酸銀(0,034g、 1.2mmol)およびter
t−ブチルジメチルシリルクロライド(TBDMS−CI、 0.196g、
I 、3mmol >を連続して加えた。この反応溶液は、室温で25時間攪拌
された後、泊過された。濾過液は飽和炭酸水素ナトリウム溶液(IOml)を含
む分離ファネルに注がれた。紹物はジクロロメタン(2x 20+T11によっ
て抽出した。有機相は結合され、減圧蒸留によってV′t、煙された。残滓はシ
リカゲルカラムクロマトグラフィにかけられ、メタノール(0から56%)とジ
クロロメタンとの混合溶液によって溶離した。78%の回収1.1で5°−0−
ジメトキシトリチル−3′−0−1en−ブチルメチルシリル−a−ウリジンが
得られた(0.514g)。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:後の化合物(0,435g、
0.66mmoりをトリエチルアミン(0,α)9ml)含むメタノール(44
ml)の溶液に溶解した。この混合溶液を室温で24時間攪拌した後、減圧蒸留
した。残滓は2つの異性体;2’−TBDMSおよび3’−TBDMSからなる
もので、この残滓を試料としてシリカゲルカラムクロマトグラフィを行なった。
溶離をメタノール(3ないし4%)とジクロロメタンとの混合物によって行ない
、2゛−位を置換された異性体を含む分画が結合され、そして蒸留乾燥された。
ベンゼンに溶解された残滓は凍結乾燥された。これによって無色の粉末が(0,
095g)が得られた。また、3−位を置換された異性体を含む分画も結合され
、そして蒸留乾燥された。そして残滓はトリエチレルアミン/メタノール溶液に
よって再び処理され、前記同様にしてクロマトグラフィによって精製された。よ
っつで、2回にわけて異性体(sic)5’−0−ジメトキシトリチル−2’−
0−tert−ブチルジメチルシリルσ−ウリジンが回収された(0.204g
、 47%)。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:1HNMR(CDCI、)
6 8.57 (1+、 IH,N)f); 7.59 (d、 I
H,Hll、J、−68,15Hz)2 6.83−7.41 (m、 1
3H,aromatic H); 6.49 (d、 Hl、。
J、、−、、5,94Hz); 5.69 (d、 11. H5); 4.8
5 (m、 LH,Hl、)、 4.35(m、 IH,H,、)、 4.
07 (m、 IH,H,、); 3.フ9 (s、 6H,(OC
R,)、);3.06−3.52 (m、 2H,H,、and H,に 2.
54 (d、 IH,OH3,); 0.85 (a。
9H,(CH,)2)50.06 and −0,13(2g、 6H,5L(
CH,)、)。
実施例2:3゛−末端a−ウリジン化合物(LCA−CPG支持体に結合)の合
成5−0−ジメトキシトリチル、α−ウリジン(0,796g、 i、46mm
ol> を無水ピリジン(7,3m1)に加えた溶液をアルゴン大気中、−45
°Cに冷却した。この冷却溶液に、無水ジクロロメタン(0,58m1)にベン
ゾイルクロライド(0,186m1.1.61mmol)を加えた溶液をシリン
ジを用いて滴下した。5分間後に滴下が終わり、反応溶液は30分間、−45°
Cに冷却した後、さらに温度を変えて一20°Cに3時装置いた。反応溶液に水
(0,2m1)を加えて、飽和炭酸水素ナトリウム(35ml)含む分離ファネ
ルに注いだ。産物はジクロロメタン(30而および2X 15m1)で抽出した
。有機相が結合し、水(20ml)で洗浄し、蒸留乾燥した。残滓はシリカゲル
カラムクロマトグラフィにがけられた。溶離はアセトン(0から15%)含有ジ
クロロメタンによって行なった。5°−0−ジメトキシトリチル−2゛(または
3゛)−αベンゾイル−α−ウリジンが結合し、蒸留乾燥かれた。残滓はペトリ
ウムエーテルと共沈し、無色の粉末(otys2g、 70%)として得られた
。
レファレンス:
’ 、T、 Kempe、 F、 Chow、 W、1.5undquist、
T、J。
Nardi、 B、 Poulson and S、M、 Peterson、
Nucl。
Ac1d Re+、、 10.6695 (1982)。
5°−O−ジメトキシトリチル−2寅または3゛)0ベンゾイル−3°(または
2゛)0サクシニル−a、ウリジンをTJナカらの方法(T、 Tanakx
et IIl、 Nucl、 Ac1d、 Res、、 14.6265198
6jと同様
にして上記化合物から得た。
上記したサクシネートに対応するペンタクロロフェニルエスレルはゴウフらの方
法と同様の方法によって、ジシクロへキシルカルボジイミド存在下における濃縮
によって得ることができた。回収量71%。
レファレンス:
” 、G、R,Gough、 M、J、 Brunderer and
p−’r。
Gilham、 Tetrahedron Lett、、 2jl、
4177(1981) 。
「長鎖アルキルアミンによってコントロールされたボアグラス(Long−ch
ainalkylamine−controlled pore glass)
J支持体(ピアス(Pierce)) をトリエチルアミン(0,O3m1)
を加えた無水ピリジン(1,5mυ溶液によって活性化させた。溶媒を蒸発させ
た後、残滓は前記活性エステル(0,152g、O,15mmol)を加えた無
水ピリジン(t、5m1)に懸濁した。
この混合溶液を室温で72時間攪拌させた後、ガラスピーズを乾燥させ、ピリジ
ン(2ml)およびジクロロメタン(3x 2m1)で洗浄した。洗浄後、真空
乾燥させた。つぎに、ガラスピーズを下記組成の溶液(2,4m1)に懸濁した
。この溶液の組成は、4− (N、N−ジメチルアミノ)ピリジン(+somg
)を無水テトラヒドロフラン(2ml)に加えた溶液、無水酢酸(0,ON17
ml、0.198mmo+) 、ルチジン(0,019gm1.0.171mm
ol)およびテトラヒドロフラン(1ml)である。ガラスピーズ懸濁液を10
分攪拌して、不溶性物質を吸引除去した。そしてテトラヒドロフラン(2X2m
l>およびジクロロメタン(4x 2m1)によって洗浄し、真空乾燥した。ガ
ラスピーズ試料の処理(アセトニトリル中における一一トルエンスルホン酸のデ
シモル溶液を用いて)によって遊離したジメトキシトリチルカチオンの分光光度
計によるアッセイによって26umol/gのファンクショナリゼーションであ
る3:とが示された。
(IN−(2°、3’、5’−tri−0−アセチル−a−D−リボフラノシル
)ウラシルの合成a−ウリジン(14,77g、 60.48mmol)を含む
無水ピリジン(10,5m1)からなる溶液に、無水酢酸(1()4 m l
)を加えて2時間30分攪拌した。過剰のツー水酢酸をメタノール(200ml
)とともに注!I7朶く加えて加水分解した後、混合物を減圧蒸留によって乾燥
させた。油性で、かつオレンジ色の残滓が得られた。この残滓を水(200ml
)に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液によって中和した。混合物はジクロロ
メタン(4X 200m1)によって抽出した。結合有機相は硫酸ナトリウム上
で乾燥させ、濾過された。濾過液は減圧蒸留された後、トルエンと共に蒸発した
。その結果、白い粉末が得られた(z+、3j。
■
57.5mmol) o回収量は95%。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:2.05−2 (3g、 9H
,3CH3of tba acetyl groupss)。
レファレンス:
” D、H,5hannahoff and R,A、 5anchez、
J、 Org。
Chew、、 ユ旦、 593 (19)3)。
(2) 4 (1,2,4−)リアゾル−1−イル)手(2°、3’、5°−u
i−0−ア七チルーa−D−リボフラノシル)−2−ピリミジノン
前記化合物(24,3g、 57.5mmo1)を無水ピリジン(86ml)に
溶解した溶液に、1,2.4− )リアゾール(11,9g、 172.5mm
ol) と2−クロロヘニルジクロロホスフエート (14,2ml。
86.3mmol)をアルゴン雰囲気中で添加した。溶液を遮光して、36時間
攪拌した。攪拌後、反応溶液を減圧蒸留して茶色の残滓を得た。この残滓を再び
ジクロロメタン(500ml)に溶解した。この有機溶液を水(3x 250m
1)で洗浄し、つづいて飽和炭酸水素ナトリウム (2X 250m1)および
最後に水(300m1)で洗浄した。これらの洗浄処理した後に、アニマルチャ
ーコール(加温したジクロロメタン)処理し、濾過した。濾過液は減圧蒸留し、
そしてトルエンととりに3回蒸留した。オレンジ色の粉末(20,62g。
48.8+m+nol)が得られた。
回収量85%。
(3)1−σ−D−リボフラノシルシトシンの合成土記化合物(20.62g,
48.81mmol>をジオキサンと32%アンモニア溶液との混合溶液(3
: l , V/V) (580ml)に溶解した。反応溶液を室温で3時
間攪拌した後、減圧蒸留した。これによってオレンジ色の残滓が得れてた。残滓
多よアンモニアメタノール(1.51)に溶解して室温で24時間攪拌した。溶
媒の蒸発とトルエンとの蒸発後、求める産町が結晶化して白い結晶(7g, 2
8.7mmol)が得られた。
回収量60%
融解点(M.p.) 2 1 5°C(エタノール)。
紫外線吸収(UV) (水): λ− w 272 nm and X−ll
IIm 249 rm.核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:’H
NMR (DM50−dll) 5 7.54 (d,IH,H,,J
,,− 7.5 Hz)5 6.02(d, LH, H. (sic)
, Ji,,. 3.84 Hz)7 5.68 (d, AH, H,);
5.26(d, LH, OH,. or OH3.); 4.97 (d,
IH, OH,. or OH,.)7 4.75 (m,LH, OH,.)
; 4.05 (m, 2H, H,., and H,.), 3.96 (
m, LH, H,.);3.61−3.43 (m, 2H, H,. an
d H,J.N4−ペンゾイルーa−シチジンの合成α−シチジン(7g, 2
8.7mmol)を無水ビリミシン(+20+nl)に懸濁した。トリメチルシ
リルクロライド(34ml, 261mol) をアルゴン大気中で添加し、室
温で1時間30分攪拌した。つづいて、ペンゾイルクロライド(4.4ml,
37.7mmol)を添加して3時間攪拌した。
水とジクロ口メタン(55ml : 55ml, V/V (sic))とを事
前に冷却したペンゾイルクロライド添加溶液に加えて1時間攪拌した。有機相を
減圧蒸留した後、トルエンとともに蒸発させ、つづいてエタノールとともに蒸発
させた。得られた残滓は水/エタノール混合溶液に溶解して室温に一晩置いた。
求める産物は90%の回収量でもって結晶化して得られた(9g,25.9mm
ol)。
M.p.207′″c (methanol).UV (ethanol)
x.,, 30B and 261, xlI,I, 287 a
nd 229 nra−核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:区
, 111 (19B2).
b.1. 糖の2゜−OHに対するCtmp保護基の利用3゛−5゜−0−(
1,1,3,3,−tetra−イソブロビルジソロキサン−1.3−ジイル)
−a−ウリジン(sic)の生産に関して前記方法と同様の方法を用いることに
よって3’−5’−0−(1,1,3,3,−tew−イソブロビルジソロキサ
ン−1.3−ジイル)一N4−ペンゾイルーα−シチジン(sic)を凍結乾燥
後において無色の粉末として得た。回収量は94%であった。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:(m, 213H, CM a
nd CM, of the ’r工PS group).σ−ウリジン類似化
合物の生産に関する前記方法と同様の方法をもちいることによって、3゛,5゜
−0−(1,1,3.3−テトライソブ口ビルジシロキサン−1.3−ジイル0
−2゜−0−Ctmp−N’−ベンゾイルーσ−シチジンをベールイエローの粉
末として回収量15%で得た。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:’H N)Gt (DMSO−
d,) 5 11.21 (s, IH, NH), 6.91−8.08 (
m, IOH,H,, H, and aromatic H); 6.29
(d, H1., J,. −2. 3.4 Hz); 4.59(m, I
H, H,,)2 4.48 (m, IH, H,.); 4.
24 (m, IH, H,、); R.8フー
4.07 (m, 2H, H,. and Hs−); 3.10 (s,
3H, OCR,)2 2.93 and2.63 (2m, 4H, 2C
}[2of the (Ctmp) group)7 2.15 (s, 3H
, CI,of the Ctmp group); 1.70−1+94 (
m, 4H, 2CH2of the Ctmpgroup) 2 0.94−
1.08 (m, 28H, CM and CH3of the TIPS
group).α−ウリジン類似化合物の生産に関する前記方法と同様の方法を
もちいることによって、5−0−ジメトキシトリチル−2゜−0−Qmp−N’
−ベンゾイルー。−シチジンをペトロリウムエーテルとの共沈後、無色の粉末と
して回収!89%で得た。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:’H NKR (DMSO−d
,) 8 11.15 (s, IH, NH); 6.90−8.45 (m
, IOH,H,, H, and aromatic Ml; 6.43 (
d, 11{, +{’、., J1.−2. 6.8 HZ);5.46 (
d, 11, 014,.); 4.97 (m, IH, OH,.)7 4
.70 (m, LH, H2.);4.18 (nl, 2H, H,. a
nd Ha,); 3.49 (m, 2H, H,. and H,−1;
3.19(By 3H, OCR3); 2.67−2.83 (m, 4M,
2CH, of the Ctmp group);2.15 (s, 3
H, CH, of the Ctmp group); 1.66−1.El
5 (m, 4H,2CH, of the Ctmp group).a−ウ
リジン類似化合物の生産に関する前記方法と同様の方法をもちν)ること番こよ
って、5′−0−ジメトキシトリチル−2’−0−Ctmp−N’−ベンゾイル
ーσ−シチジンをペトロ1ノウムエーテル中における沈殿の後、無色の粉末とし
て回収量73%で得た。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:。−ウリジン類似化合物の生産
に関する前記方法と同様の方法をもち17%ること各こよって、5゛−0−ジメ
トキシトリチル−2’−0−Cwp−N ’−ベンゾイノレーa−シチジン3゛
−ホスホノレアミダイトを無色の粉末として回収量91%で得た。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ二31P NKR (CD3CN
) 6 154.06 and 151.15.b、2 TBDMS保護基の
利用
別λZム1し世匝ヱ酉杢全q那土2シタαJさ1乙≧シμ倉底前記方法によって
得られたN4−ベンゾイル−a−シチジン(9g、 25.9mmol)を無水
ピリジン(50ml)に加えてなる溶液にジメトキシトリシルクロライド(10
,1g、 29.8mmoりを添加した。この混合物を2時間室温で攪拌した後
、メタノール(4ml)を加えた。その後、再び5分間攪拌し、反応溶液を飽和
炭酸水素ナトリウム溶液(350ml)に注いだ。
その結果、産物はジクロロメタン(3X 200m1)によって抽出された。結
合有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過した。養液は減圧蒸留し、トルエン
とともに蒸発させた。
残滓はシリカゲルカラムクロマトグラフィにかけた。溶離はメタン(0から10
%)含有ジクロロメタン溶液によって行なった。求める産物を含む分画は結合し
、蒸留乾燥した。
残滓はベトロリウムエーテルとともに沈殿した。乾燥後、白色粉末(14,5g
、22.3mmol)を得ることができた。回収量は86%であった。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:前記化合物(2,2g、 3.
4mmol)を無水ピリジン(33ml)に加えてなる溶液に、ten−ブチジ
ル油−ノチルシリルクロライド(TBDMS−CI、 663.1mg、 4.
4mmo+)とイミダゾール(601,9mg、 L84mmol)とを加えた
。反応溶液は室温で23時間攪拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(40m
l)を含む分離フrネルに注いだ。産物はジクロロメタン(2x80ml)によ
って抽出した。有機相は結合し、減圧蒸留によって乾燥された。残滓はシリの混
合溶液によって溶離した。求める産物を含む分画は結合し、減圧蒸留された。残
滓は再びジオキサンに溶解し、凍結乾燥された。その結果、1.2gの白色粉末
(1,57mmol)を得ることができた。回収量は46%であった。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:’HNKR(CDCI、) 5
8.67 (broad s 、 LH,冊); 8.01−6.83 (m。
gtoup); 0.15−0 (2g、 6H,SL (C)!、)、 of
the TBDMS group)。
前記反応によって得られた化合物(244mg、 0.36mmol)を無水ジ
クロロメタン(1,2m1)に溶解してなる溶液に、N、N、N−ジイソプロピ
ルエチルアミン(223ul、 1.28mmol)とクロロ−N、N、N−ジ
イソプロピルアミノメトキシホスフィリン(+56ul、 0.8m1)とをア
ルゴン大気中で添加した。この混合物をアルゴン大気中室温で20分間攪拌した
後、エチルアセテート(l 1m1)を含有した分離ファネルに注いだ。それに
よって得られた溶液を塩水(3x 7m1)で洗浄した。有機相は硫酸ナトリウ
ム上で乾燥させて濾過し、減圧蒸留した。
残滓はシリカゲルカラムクロマトグラフィにかけて、シクロヘキサン、ジクロロ
メタンおよびトリエチルアミン(90・9:1から30・69 : 1. V/
V/V)の混合溶液によって溶離を行なった。求める産物を含む分画は結合され
、蒸留によって乾燥された。この残滓をアルミナを通したジオキサンに溶解し、
凍結乾燥した。これによって白色粉末(240mg。
0.259mmo+)が得られた。回収量は81%であった。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ””P NMR(CD、CNI
s 152.40 and 151.26゜’HNMR(CDCI、) 68
.60 (broad complex、 IH,NH); 8.141Ht
Hl−IJl・−z−4・6 H2) ; 44−11(、LHt Hz4t
4−44 and 44−38(2,IH,H,,1; 4.33−4.24
(m、 IH,H,,1; 3.77 (s、 6Hf 20CI(3of
the Dmtr group)23.62−3.47 (m、 2H,2CM
of the igopro−pyl qrotJp
2.3.5−tri−0−ベンゾイル−1−0−アセチル−きりボフラノース(
2,73g、 5.4mmoりとを用いてり、パイチェノドによる融合方法によ
って得た。この融合(fusioin)はpara−)ルエンスルホン酸(10
0mg)の存在下、真空(8mmHg> 、1808C120分間の条件で行な
った。得られた残滓はエタノールに溶解した後、アニマルチャーコール(ani
mal charωj)処理した。
脱色された溶液は蒸留され、かつトルエンとともに減圧蒸留された。反応産物は
シリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製した。溶離は溶離液のジクロロ
メタンに対するアセトン含有比の増加(0から5%)によって行なった。2津の
アノマー、σおよびβを含む分画が結合し、減圧蒸留された。残滓はピリジンと
エタノールとからなる溶液(45ml : 27.5ml、 V/V(sic)
)に溶解し、氷を入れたバスに浸して冷却しbそして、この溶液に水とエタノー
ル(35ml : 35m1. V/V(sic))の混合物に2規定の水酸化
ナトリウムを溶Hさせた溶液を加えた。この反応溶液はピリジニウム型におい1
ηWEX 50Wによって中和した後、濾過した。養液は蒸留し、かつエタノー
ルとともに2回蒸留を繰り返した。
エタノール中に最初に見いだされた結晶はベータアノメーを最大限取り除くこと
を可能とした。結晶化されていない溶液のほうにはアルファアノマーが濃縮され
ており、エタノール中に求める産物を結晶化することができた。
’ NKR(Dに5o−d、) 611.15 (broad s、 IH,
hn(); 8.73 and8.64 (2s、 2H,H,and H,l
; 8.06−7.53 (m、 5H,aromaticHofセhe be
nzoyl group); 6.46 (d、 LH,H,、); 5.59
(d。
LH,OH,、); 5.44 (d、 IH,OH,、); 4.9
L (pseudo−し、 IH。
OH,、)7 4.45 (m、 LH,H,、)2 4.20−4.13
(m、 2H,H,、andH,、); 3.63−3.39 (m、
2H,H,、and H,−) 。
MaSli Spectrum (FAB > o; qlycerol ma
trix) : (M→−H)+ 8レファレンス:372゜
’ L、 PLchat、、 P、 Dufay and Y、 La
morre。
C,R,Acad、 Sc、 Paris、 259. 2453N6−
ベンゾイル−α−アデノシン(960mg、 2.585mmol)を無水ピリ
ジン(13ml) kこjJOえてなる溶液に、ジメトキシトリシルクロライド
(1,14g、 3.335mmol>を加えた。この混合物を室温で3時間攪
拌した後、メタノール(8ml)を加えた。15分間の攪拌の後、反応溶液を飽
和炭酸水素ナトリウム溶液(100ml)に注し1だ。そして産物をジクロロメ
タン(2X 100m1)によって抽出した。結合した有機相は硫酸ナト1功ム
上で乾燥させ、濾過した。濾過液は減圧蒸留され、かつトルエンとともに3回蒸
留された。残滓はシリカゲルカラムクロマトグラフィにかけられた。溶離は溶離
液のジクロロメタンに対するメタノール含有比の増加(0から3%)によって行
なった。求める産物を含む分画は結合し、かつ蒸留によって乾燥された。
残滓はベトロリウムエーテル中に沈殿された。乾燥後、白色粉末(1,322g
、 1.96mmo+)を得ることができた。回収量は76%であった。
核磁気共鳴(NM、R)によって得られたデータ:Hof the dimet
hoxytrityl and benzoyl groups)76.43(
d、 IH,H,、、J、、−、、5,99Hz); 5.52 (broad
s、 lH,0H1−);5.27 (broad s、 1N、 OH,,
1; 4.91 [tn、 LHI M、、1; 4.53 (mTIH,Ha
−); 4.37 (m、 18. H,、); 3.16 (8,6
M、 20CR3ofthe Dmtr group)53.45−3.16
(m、 21(、H3,and o、−)。
Mass spectrum (FAE > O; giyc@rol mat
rLx)= (M + H)” m674゜
前記反応によって得られた化合物(1,815g、 2.69mmol)を無水
ピリジン(z7ml)に加えてなる溶液に、1)ブチル−ジメチルシリルクロラ
イド(TBDMS−CI、 576mg、 3.82mmol)とイミダゾール
(478mg、 7.02mmol) とを加えた。反応溶液を室温で3日問、
攪拌した。攪拌後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(100ml)を含む分離ファ
ネルに反応溶液を注いだ。産物はジクロロメタン(3X 50m1)によって抽
出した。有機相は結合し、水(200ml)で洗浄した。
そして硫酸ナトリウム上で乾燥して、濾過した。濾過液は減圧蒸留され、かつト
ルエンと共に3回蒸留された。残滓はシリカゲルカラムクロマトグラフィにかけ
られ、ジクロメタンとメタノール(0から10%)との混合溶液によって溶離が
行なわれた。求める産物(2−TBDMS)を含む分画は結合し、蒸留乾燥され
た。その結果、フオーム((oam )が得られた。他の異性体(3“、rBD
MS)を含む分画は結合し、蒸留乾燥された。
残滓(3°−TBDMS、 950mg)をトリエチルアミン(0,030m1
)/メタノール(nml)溶液に溶解した。この混合物歯24時間呈室温攪拌さ
れ、溶媒は減圧下で蒸発された。2つの異性体、3’−TBDMSおよび2°−
TBDMS、の混合物はシリカゲルカラムクロマトグラフィにかけられた。メタ
ノール(0から10%)とジクロロメタンとの混合溶液による溶離後、2゛−位
を置換した異性体を含む分画は結合し、かつ蒸留乾燥された。一方、3’−TB
DMS異性体を含む分画はトリエチルアミン/メタノール溶液によって再度処理
さト、前記したようにシリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製された。
よって、2°−T[IDMS異性体は3回回収された。回収後、ジオキサンに溶
解して凍結乾燥した。その結果、白色粉末(1,17g、 1.48mmol)
が得られた。回収量は55%であった。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:’HNMR(CDCI、) &
9j4 (s、 IH,Ml(); 8.E19 and 8.83 (2g
。
2H,H,and !(、) ; 8.3B−6,84(m、 18H,aro
matic Hof thedimethoxytrityl and b
enzoyl groupgl; 6.6) (4LHtH,、、J、、−
、、6,54Hz); 5.07 (t、 IH,Hl、)24.53 (!1
1. IH。
H,、); 4.17 (m、 IH,H,、); 3.80 (a、 6H,
20CH3of theDmtr group); 3.67 (d、、 IH
,OR,、)23.58−3.11 (m、 2H,H,。
and H3−); 0.60 (s、 9H,。
(d)5°−0−ジメトキシトリチル−3゛樽−ジイソプロピル−アミノメトキ
シホスフィニル−2“−0−tert−ブチル−ジメチルシリル−H6−ベンゾ
イル、σ−アデノシン(立体配座異性体混合物)の合成
前記方法によって得られた化合物(996,2mg、 1.264mmol)を
無水ジクロロメタン(4,111mIOに加えてなる溶液に、N、N、N−ジイ
ソプロピルエチルアミン(879ul、 5.05mmol)とクロロ−N、N
−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィン(616ul、 3.16mmol
)をアルゴン大気中において添加した。添加後、エチルアセテート(44ml)
を注いだ。得られた溶液を塩水(3x 10m1)で洗浄した。有機相を硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、濾過し、そして減圧蒸留した。残滓はシリカゲルカラムク
ロマトグラフィにかけ、シクロヘキサン、ジクロロメタンおよびトリエチルアミ
ンの混合溶液(99:O:1から40:59:1.VNN)によって溶離させた
。求める産物を含む分画は結合し、蒸留乾燥され、さらにベンゼンとともに蒸留
された。残滓はベンゼン中において凍結乾燥された。その結果、白色粉末(1,
049g、 1.1mmo+)を得ることができた。産量は88%であった。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:”P NKR(CD、C町61
52.43 and 151.66゜’HNMR(CDCI3) 69.16
and 9.11 (2s、 LH,NH)28.87−6.81 (m、 2
0H,aromatic Hof the dhnethoxytrityl
andbenzoyL group8. H,and H,of the ad
enine base); 6+68(pseudo−t、 IH,H,、、J
、、−、、7Hz); 5.(18−4,99(Ell、 LHtH2,)24
.43−4.26 (m、 2M、 H4,and H,、); 3.7B (
s、 6H,20CH,of the Dmtr)73.63−3.04 (m
、 4H,H,、and H,−); 2(Jf of t、ho 1s
opropyl groupl; 3.3B and 3.17 (
2d、 IH。
P−OCH,、J、−、1145Hz)21.28−0.97 (m、 12H
,2CH,of七he 1sopropyl group)70.66 (s、
9H,(CH山Cof theTBDMS group)2 0.04
and −0,22(2d、 6H,Si、(CH3)、of theT
BDKS group)。
Masa spectrum (PAJ > 0; n1trobenz
yl alcohol matrlx)t(M + Hどツ949゜
実施例5:N2−アセチル−a−グアノシンを用いた保護ホスホルアミダイト化
合物の合成
(1)5′−〇−アセチルー2゛13°−0−イソプロピリデン−N2−アセチ
ル−60ジt\ニルカルバモイル−σ−グアノシンの合成
N2−アセチル−6−0−ジ−ニルカルバモイルグアノシン(7,35g、 1
8.92mmoりを無水ジクロロエタン(150ml)に加えてなる溶液に、N
、O−ビス (トリメチルシリル)アセトアミド(8,85m1.36.19m
mol)を添加した。この混合溶液を80’C’t’15分間加熱した。溶媒は
減圧(8mmHg>によって蒸発させた。これによって得られた油性残滓に5°
−di−0−アセチル−2’、3 ’−0−イソプロピリデンー■リボフラノー
ス(6,21g、 22.66mmol) / )ルエン(150ml)溶液を
加えて80°Cで1時間加熱および攪拌を行なった。そしてエチルアセテート(
200ml)で希釈した後、水(200ml) )こ注いだ。有機相は水で一回
洗浄し、ざらに飽和炭酸水素ナトリウム溶液(200ml)で洗った。洗浄後、
有機相を硫酸六トリウム上で乾燥させ、濾過した。濾過液は減圧蒸留した。残滓
はシリカゲルカラムクロマトグラフィにかけて、アセトン(0から50%)とジ
クロロメタンとの混合溶液によって溶離を行なった。求める産物を含む分画を結
合し、蒸留乾燥させた。これによって、白色粉末(1,4g、 2.32mmo
l)を得ることができた。回収量は12.3%であった。
核磁気共l’tft (NMR)によって得られたデータ:’HNにR(CDC
I、l 6 8.20 (s、 IH,H,); フ、95 (s
、 LH,1m);7.42−7.21 (m、 IOH,aromatic
Hof tbe dlphenylcarbamoylgroup)26.4
2 (d、 LH,H,、z J、、 −2,3,8Hz)34.89−4.8
3 (m、 2H。
H2−and H,,1; 4.ss (m、 LHI ’a’); 4.31
−4.19 (me 2Ht H5−and”s弔 2.52 (s、3H,
Cfち of the acetyl group on the rib
ose);2、 i4 (s、 3H,CI、 of the acetyl
group on the guanine bas@) 11.48 and
1.49 (2g、 6H,2CM3of the igopropylld
ene group onthe sugar) 。
レファレンス=lR,Zou and M、J、 Robinss、 Can、
J、 Chew、 65゜1436(1987)。
P、A、 Levane and E+T、 5tiller、 J、 Bio
l。
Cham、 102.197 (1933)。
(2) 2’−,3“、0−イソプロビルイデンーN2−アセチル−α−グアノ
シンの合成前記方法で得た化合物(1,5g、 2.4mmo+)を無水テトラ
ヒドロフラン(12ml)に加えてなる溶液に、1Mテトラブチルアンモニウム
フルオライド含有テトラヒドロフラン(121711、12mmol)を添加し
て室温で20時間攪拌して反応させた。その後、溶媒を減圧蒸留によって気化さ
せた。これによって得られた残滓をエチルアセテート(50ml)に溶解した後
、水(50ml)に注いだ。有機相は1回につき水50m1を用いて2回洗った
。この有機相には求める産物が含まれており、減圧蒸留によってこの産物からな
る残滓を得た。
残滓はRP2グラフテッドシリカゲル(メルク社製No、7719)を用いたク
ロマトグラフィによって精製宅れた。溶離液は水とメタノール(too:Oから
50 :50. V/V)の混合物?用いて行なった。その結果、求める産物を
含む分画を採取することができ、蒸留乾燥および凍結乾燥によって白色の粉末(
581mg、 1.6mmo!>を得ることができた。なお、回収率は66%で
あっt二。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:’HNMR(DMSO−d、)
61l−95(broad s、 2H,2NH); 7.89 (L LH
t(3)N”−アセチル−a−グアノシンの合成前記方法によって得られた産物
(5,81mg、 1.6mmol)をギ酸と水(50:50. V/V)
(8ml)の混合溶液によって酸処理した。反応溶液は室温で4日間攪拌した。
攪拌後、溶媒を減圧蒸留によって気化させ、残滓を水とともに蒸留(10回繰り
返した)することによって得た。求める産物は水中に結晶化して存在し、白色結
晶(330mg、 1.o16mmol)を得ることができた。なお、回収率は
73%であった。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:5□−0−ジメトキシトリチル
−N2−アセチル−σ−グアノシンの合成N2−アセチル−σ−グアノシン(3
30mg、 1.016mmo+>を無水ピリジン(6,5m1)に加えてなる
溶液に、ジメトオキシトリチルクロライド(489mg、 1.445mmol
)を加えた。混合物は3時間室温で攪拌した後、メタノール(1ml)を加えた
。5分間の攪拌後、反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム(25m+)に注いだ。
産物はジクロロタン(3x 25m1)によって抽出された。求める産物を含む
有機相は水(50m+)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、濾過した
。濾過液を減圧蒸留し、つづいてトルエンとともに蒸留を3回行なった。これに
よって、求める産物はジクロロメタン中に結晶化し、白色結晶(535mg、
0.848mmol ) と17で得ることができた。回収率は83.5%であ
った。
(s、LH,H,)27.41−6.83 (m、13H,aromatic
Hof the dimeth−oxyCrityl groupl; 6.
1B (d、LH,Hl、、J、、−、,5,18Hz)5 5.63(br
oad s、LH,OH2,1; 5.42 (broad s、IH,OH,
、); 4.40 (m、IH。
H,、); 4.2フ (m、 LH,H,、)2 4.14 (m、
LH,N3.); 3.74 (s、 6H,2α:H,of the
Dmtr groupl; 3.32−3.00 (m、 2H,N3
. and I(、−1;2 、18 (ss、 31. CH,of the
acetyl group on the guanine bass)。
Mass spectrum (F’AB < O; thioglycero
l matrix)s (M−H)−m&2&。
5′−〇−ジメトキシトリチルー2°−0−tert−ブチルジメチルシリル−
N2−アセチル−σ−グアノシンの旭
前記方法によって得られた化合物(51111mg、 0.011126mmo
l)を無水ピリジン(13m+)に加えてなる溶液に、−一ブチルジメチルシリ
ルクロライド(TBDMS−CI、 162mg。
1.074mmol)を加え、続いてイミダシル(125mg、 2.147m
mol)を加えた。この反応混合物は室温で4日間攪拌した。攪拌後、飽和炭酸
水素ナトリウム溶液(25m+)に注いだ。
ジクロロメタン(3X 25m1)によって産物を抽出した。有機相を水(50
m+)洗いした後、硫酸ナトリウムを乾燥させて濾過した。濾過液を減圧蒸留し
た後、トルエンとともに蒸留を3回した。残滓はシリカゲルによるクロマトグラ
フィにかけた。溶離はメタノール(0から20%)とジクロロメタンとの混合溶
液を用いて行なった。2つの異性体(2’−TBDMSおよび3’−TBDMS
)を含む分画を得て蒸留によって乾燥させた。乾燥によって得られた残滓は2.
5τn1のエタノールに溶解した。このエタノール溶液を室温で20時間攪拌し
、続いて減圧蒸留によってエタノール分を気化させた。これによって得られた残
滓はシルカゲルを用いたクロマトグラフィにかけられた。溶離はメタノール(0
からw%)とジクロロメタンとの混合溶液を用いて行なった。これによって2°
−TBDMS異性体を含む分画を得ることができた。この分画を蒸留乾燥した。
一方、3°−TBDMS異性体を含む分画は再びエタノールによる異性化反応に
供した。そして異性化したものをシリカゲルクロマトグラフィによって精製した
。その結果、2°−TBDMS異性体を3回回収することができた。得られた異
性体をジオキサンに溶解して凍結乾燥した。白色の粉末(250mg、 0.3
42mmo+ )が得られ、回収率は42%であった。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:’HNMR(CDCI、)
J LL、8フ (broad s、 LH,NH); 8.36
(broad s。
LH,NH); a、00 (B、 1M、 Ha); フ、42−
6.83 (m、 138.aromaセic Hof the Dmtr
group)26.25 (d、 LH,H,、、J、、 −、、6,59H
z); 4.93(t、 IH,H,、); 4.42 (m、 IH,H,、
)74.16 (m、 LH,H,、); 3.79(s、 6H,20CH,
of the Dmtr group); 3.52−1.12 (a+、 2
H,H,。
and H,); :1.!2 (d、 LH,OH3,); 2.2B (!
l、 3H,CH,of theacetyl group on the g
uanine base)20.69 (s、 9f(、(CH,)3Coft
he TBD14S group); 0.04 and −0,19(2g、
6H,2CH1of theTBDM5 groupl 。
マススペクトラム(FAJI < o;チオグリセロールマトリックス) :
(M−H) −=740、N、N、N−ヂイソプロビルアミノメトキシホス
フィン(130p+、 0.647mmol)を無水ジクロロメタン(200)
I+)に加えてなる溶液に、前記化合物[51(200mg、0.269mmo
+) /無水ジクロロメタン(goopl)溶液をアルゴン大気中において攪拌
しながら滴下した。室温で1時間15分間攪拌した後、エチルアセテート(3m
1)に注いだ。得られた溶液を塩水(3x 7m1)を用いて洗浄した。有機相
から硫酸ナトリウムを乾燥させた後、濾過および減圧蒸留した。得られた残滓を
シリカゲルカラムクロマトグラフィにかけた。溶離はアセトニトリル、ジクロロ
メタンおよびトリエチルアミン(0:99:1から50 + 50 : 1.
VNN)からなる溶液によって行なった。求める産物を含む分画を採取し、蒸留
乾燥させてベンゼンとともに蒸留した。残滓はベンゼン中において、凍結乾燥さ
れた。これによって79%の回収率でもって白色粉末(192mg、、 0.2
12mmol)を得ることができた。
核磁気共鳴(NMR)によって得られたデータ:”P NMR(CD、CN)
5152.47 and 151.37゜’HNMR(CDCI、) 511.
82 (broad s、 LH,NH)28.39 and 8.32(2s
、 IH,H,l; 8.32 (broad s、 LH,NH);
フ、45−6.83 (m、 13H。
aromatic Hof the Dmtr gtoupl; 6.12 (
pseudo−t、 LH,Hl、。
J、、−、、6,8Hz)74.93 (m、 LH,H,、)54.34 (
01,2H,H,、andH&、); 3.80 (s、 6H,20CH,o
f the Dmtr group)53.61J、51(m、 2H,2C
M of the 1sopropyl group)73.49−3.10
(m、 2H。
H,、and H,、、)7 3.40 and 3.18 (2d、 3
H,OCH,on the phos−phorus、 J、−、= 13
j Hz)7 2.28 and 2.27 (2g、 3H,CI、o
f theacetyl group on the guanine ba
se)21.25−0.99 (m、 12H,4CH。
of the 1sopropyl group); o、フ2 (2g
、 9H,(CH)、Cof the TBDMSgroup); 0−
05 and −0,15(2g、 6H,2CH,of the T
BDMS group)。
Mass spectrum (FAR< O; polyethyl
ene glycol matrLx)t(に−H)−−901゜
チド合成(スケール1 umol)
(a)合成条件
* a −[’Up) 7 Ul (sic)の合成に用ν)られるa−rUホ
スホJレアミダイト化合物(a −rUphosphoramidite 5y
nthon)用いられた濃度=0.2M(20e)
*コンデンス(綜合)に用1.)た活性試薬(剤) : 0.2M(40c)
p−ニトロへニルテトラゾール(加熱状態で溶解、約45°C)
(b) 合成サイクルおよび濃縮産物
使沙艷聾1」伸コ鯛4憂回】」西虞!
番号 手順 溶媒または試薬 時隔(秒)+1先浄・バ
ージCHiCNr 7 ルコン522 ン) ’If シーツyン3!
TCA/(II@CIJl 003洗i%・ハy (Hfi(N、
フルフン2254 ift 合0.2M 7 、= Y イ) (20c+
+)/CHyCN + 0.2M pNOa−フェニルテトラゾール 9
31
(40e) /CH,CN
5 バージ(sic) フルフン 1゜6
キャッピング 6.sx DMAP/THF +^c、o:itソーシ:
THF(1:l:8) 1 437 バージ(sic)
アルゴン 2゜8 酸化 0.1N I
s/T旺:Pyr、’H20(40:10:I) 509 in
CHaCN 110濃縮産物はジト
リチレーション段階におけるジメトキシトリチルカチオンの遊離を分光光度計に
よってアッセイすることによって測定した(λ=498nm)。
全段階を経ての回収率ニア0%
平均回収率/段階=95%
(c)α−[’Up)ttJ]の脱保護および精製a−[’UP)7U]の脱保
護(deprotecuon)および精製を下記の・32%NH,OH処理3回
(3紛間/回)による支持体からの分離。
・32%NH4OH処理(1時間、55°C)による支持体に結合した第1のヌ
クレオシド結合上に存在するベンゾイル基の除j0
−0.01M HCI (PH2)処Jl(24時間、室温)にょるCtmpの
除去。
・DEAE−セファデックスカラムによる精製、260nmにおいて吸光度(a
bso市antz unit)I9であった。
・HPLC分析による精製、精製度(purity> 82%であった。
2、ホスホルアミダイト方法による固体支持体上でのα−U合成(a)合成条件
* a−rUホスホルアミダイトシンソン(a −rU phosplollf
fIidite 5yncht−をa −[(LJP)sυP
合成に用いた。
濃度: 0.2M
*コンデンス(縮合、codensation)に用いた活性剤(activa
ting agent) : 0.2M(40e)p−ニg
ロへニルテトラゾール(加熱娃で溶解、約45°C)(b)合成サイクルおよび
濃縮産物
侠1堕2上±独騨箪蛮牛L(ゆ碧!
番号 手!11i 溶媒または試薬 時隔(秒)l
洗浄・バージ CH3CN、 7/I、フン522 ジトリチレー
ション 31 TCA/CH*CIi J 003 洗n・バ
ージCH3CN、 フルj’) 2314 縮合
0.2M 7 ミ9 () (20cq)/CH3CN + 0.2MρNO
3−フェニルテトラゾール 937
(40e) /CHsCN
5 バージ(sic) アルゴン 106
*+ッヒンク6.5XDMAP/111F+ACeO:露チシーン:THF(1
:l:8) 1 437 バージ(sic) アルゴ
ン 2゜8 酸化 0.1M IIl/T
HF:Pyr:HeO<40: 10: l) 559 洗浄
C)lscN 110全段階を経てのa
−[(Up)sU]回収率:85%平均回収率/段階;97%
(c) a−[(IJp)5Ulの脱保護(sic)および精製a−[(Up)
5Ulの脱保護(depr眞直1on) (sic)および精製を下記のステ
ップを実施することによって実行した。
・チオフェノール/Ex、N/ジオキサン溶液(1:1:2. v/v/v)処
理(3紛、室温)によるリン酸(ホスフェート)の脱保護。
・32%NT(40H処理(1時間、55°C)および32%NH、OH処理(
3回、毀、室温)による支持体からのオリゴリボヌクレオチドの分離。得られた
α−[(Up)5U)オリゴリボヌクレオチドの量は260nmにおける吸光度
は42で示された。
・DEAF、セファデックスカラムによる精製。得られたa−オリゴヌクレオチ
ドの260nmにおける吸光度は!9であった。
・HPLC分析によってa−rU 6の精製度を調べた結果、精製度は74%で
あった。
(a)合成条件
*a−rUホスホルアミダイトシンソン(a −rU phosphorami
dite 5ynthon)をa −[r(Up) I IU1合成に用いた。
濃度:0.15M (20明、)
(b)合成サイクルおよび濃縮産物
伸張サイクル(clona6orICIC)を含む段階番号 手順
溶媒または試薬 時間(秒)1 洗θ・バージ co、c
N、 アルゴン 522 ジトリチL、−’、taン3!TC
A/CH3Cl、 1003 洗浄・バージ CH3
CN、 アルゴン 2254 縮合 0.2Mア
ミダイト(20eq )/CH,CN + 0.2HpNO,−フェニルテトラ
ゾール 920
(40e) /CHsCN
5 バージ(sic) アルゴン 106
キャッピング 6.5X DMAP/THF +AC,0:ルデシーン:
THF(1:l:8) 937 バージ(sic)
アルゴン 208 酸化 0.1M I
t/THF :Pyr’、H2O(40: 10: l) 659
洗浄 CH,CN 100濃縮産物
はジトリチレーション段階におけるジメトキシトリチルカチオンの遊離を分光光
度計によってアッセイすることによって測定した(λ=49gnm)。
全段階を経ての回収率=78%
平均回収率/段階=97J%
表中*はN−メチルイミダゾールである。
(c) α−[(L’P)++Ulの脱保護および精製α−r(Up) l
l Ulの脱保護および精製を下記のステップを実施することによって実行した
。
・チオフェノール/トリエチルアミン/ジオキサン溶液(1:1:2. v/v
/v)処理(39号、室温)。
・32%アンモニア溶液/エタノール(3: 1. v/v)処理(3回、30
分)およびその上清(supemaunt)を32%アンモニア溶液/エタノー
ル(3: 1. v/v)処理(3時間、55°C)処理することによる支持体
に結合した第1のヌクレオシド結合上のベンゾイル基の除去。
・減圧蒸留および蒸留によって得られた残滓の0.1M)リブチルアンモニウム
(Iacuna)/テトラヒドロフラン溶液処理(18時間)。
・DEAE−セファデックスカラムによる精製。260nmにおける吸光度は菊
であった。
・HPLC分析によって精製度を調べた結果、精製度は匍%であった。
実施例7:生物物理学的特性
1、オリゴヌクレオチドa −[(Llp) l l Ulとポリ(A)との交
差結合(ハイブリダイゼーション)について
交差結合実験はに一コンバーチプルIBMマイクロコンピュータに接続されたエ
ビコン810スペクトロホトメータ(コントロン(Kontron)社製)を用
いて実施された。温度条件のコントロールはフバーPD415温度設定装置をセ
ットしたサーキュレーシコンウォーターバス(ツバ−(Huber)社製)を用
いて実施された。セルの光透適長(opticalpath−1ength)は
1cmであって、コンパートメントには実験中は窒素ガスが吹きこまれた。
あらかじめ、2本のオリゴヌクレオチド鎖を混合して3紛間、80°Cに加熱し
た。加熱過程における吸光度および温度の値の変化は測定されてコンピュータに
記録された。典型的な実験では、温度が0.75°C/分ごと変化させ、がっ3
o秒ごとに吸光度を測定してコンピュータに記録した。このようにして5°Cに
から80°Cの温度範囲における魚ポイントについて測定が実施された。この実
験では吸光度測定は260nmの波長を用いて実施されたが、ハイブリッドの形
成または変性は吸光度の急激な変化をもたらした。温度変化が前記温度範囲の中
間(変曲点)に達したときの吸光度の値をTm値として以下示す。
オリゴヌクレオチドa −[(LJp) l I Ulとポリ(A)とを緩衝液
(lomM NaC1およびlomMNa−力コジレート(sodiumcac
odyla+e) 、 pH7,0>に溶解してそれぞれの濃度が240pM(
塩として計算)となるようにした。
この条件でTm値は、Tm=I6°Cとなった。
結論:α−RNAsはβ−RNAsと安定度の高い対形成を行なった。
このような交差結合は多くの生物学的適応が可能であり、特に核酸プローブとし
て、または治療用製剤としての適応が可能である。
2、オリゴヌクレオチドα−[(Up)5Ulとオリゴヌクレオチドβ−F(U
p)sU]とのヌクレアーゼ感受性に関する比較検討
HPLC分析の条件
HPLC分析はRCM400モジュール(ウォーターズ(wa把rS)社製)に
ラジアル−パック(Radial−Pak) C,、(iopm)カラムを設置
して行なった。装置はU6にインジェクター(ウォーターズ) 、6000Aポ
ンプ(ウォーターズ)2台、M720グラジェントプログラマ−(ウォーターズ
)、パイユニカム(Pye Unicm) PU 4021マルチチヤンネルデ
イテクターおよびバイユニカムPU 4850コントロールコンソールからなる
。溶離は0.1M酢酸アンモニアjam液(pH(sic) 5.9)中のアセ
トニトリルの濃度を0から12,5%と直線的に変化させて行ない、溶出速度は
3ml/分であった。なお、検出は254面で行なった。
1 、 crotaJus durissus terrificus由来生物
毒であるホスホジェステラーゼ(3°−エクソヌクレアーゼ)による分解
オリゴヌクレオチド溶液(20)11.260nmにおける吸光度2)を0.0
1MMgCl、含有0.1 M Tris−HCI緩衝液(100pl、 pH
9)によって希釈した。この希釈溶液に商業的に入手したホスホジェステラーゼ
(2ul、 3ユニット/ml)溶液を添加し、37°Cでインキュベートした
。ある特定時間において、一部(101131)を採取し、それを2分間、10
0°Cでもって加熱した後、分析に供した。
インキュベーション時間(分)
2、牛膵臓由来ホスホジェステラーゼ(5°−エクソヌクレアーゼ)による分解
オリゴヌクレオチド溶液(20J11.260面における吸光度2)を0.12
5M酢酸アンモニア(pH7,0) 、2.5mM EDTAおよび0.062
5%Tween 80からなる緩衝液(80ul)によって希釈した。商業的に
入手したホスホジェステラーゼ(2u11最終濃度0.013ユニット/m1)
を加えて、37°Cでインキュベートした。ある特定時間において、一部(10
pl)を採取し、それを2分間、1000Cでもって加熱した後、分析に供した
。
3、〜2咀曲生qπae由来sIヌクレアーゼ(−重鎖特異的エンドヌクレアー
ゼ)による酵素的分解
オリゴヌクレオチド溶液(20p+、260nmにおける吸光度2)を0.3M
NaG、0.01 MTris(pH7,0)および0.005M EDTA
からなる緩衝液(120pl)によって希釈した。商業的に入手したSlヌクレ
アーゼ(21,1,4xlO°2ユニット/m+>溶液を添加し、37°Cでイ
ンキュベートした。ある特定時間において、一部(5oIJl)を採取し、それ
を2分間、100°Cでもって加熱した後、分析に供した。
インキュベーション時間(分)
β−rU6 0.3 0−り舒−
1竺−1(連−−
結論:σ−オリゴリボヌクレオチドはβ−オリゴリボヌクレオチドよりもヌクレ
アーゼ消化に対する抵抗性(安定性)が高いことが示された。
国際調査報告
+1*mmm*ml#1Me1mMkwPCT/F只89100303−2−国
際調査報告
Claims (18)
- 1.a−オリゴリボヌクレオチドの合成方法であって、固体支持体上でホスホル アミダイト型合成を実施することを特徴とするa−オリゴリボヌクレオチドの合 成方法。
- 2.請求の範囲第1項記載の合成方法であって、3′−位がホスホルアミダイト 基と置換した保護a−リボヌクレオシドモノマーは、該モノマーのリボースにお いて2′−位のヒドロキシルファンクションがCtmp又はTBDMS基によっ て保護されており、かつ前記モノマーが集合したことを特徴とするa−オリゴリ ボヌクレオチドの合成方法。
- 3.請求の範囲第1項または第2項記載の合成方法であって、保護a−リボヌク レオシド化合物は2′−または3′−位のヒドロキシルファンクションによって 支持体に固定化されることを特徴とするa−オリゴリボヌクレオチド化合物の合 成法。
- 4.請求の範囲第3項記載の合成方法であって、前記固定化されたa−リボヌク レオシド化合物は、ベンゾイル基のような保護基によって3′−または2′−位 のヒドロキシルファンクションが保護されていることを特徴とするa−オリゴリ ボヌクレオチド化合物の合成法。
- 5.請求の範囲第2項ないし第4項のいずれか一項に記載の合成方法であって、 a−リボヌクレオシドの集合は活性剤存在下におけるモノマー間の縮合によって なされるもので、最初のモノマーでは固定化されたa−リボヌクレオシド化合物 の5′−位ファンクションと3′−位ファンクションとの間で起こり、あるいは それにつづくモノマーでは保護されたa−ポリリボヌクレオチド中間体化合物は 前記固定化されたa−リボヌクレオシド化合物と結合することを特徴とするオリ ゴリボヌクレオチド化合物の合成方法。
- 6.請求の範囲第2項ないし第5項のいずれか一項に記載の合成方法であって、 前記モノマーの3′−位量のホスホルアミダイト基は化学式(I)で表されるN ,N−ジアルキルアミノホスホルアミダイト基であることを特徴とするa−オリ ゴリボヌクレオチド化合物の合成方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ R1は付加的に置換された同一のあるいは異なるC1ないしC7アルキル基、例 えば、CH3、(CH3)2CH、 R2は付加的に置換されたC1ないしC7アルキル基、例えば、CH3、CH2 CH2CN。
- 7.請求の範囲第6項記載の合成方法であって、前記モノマーのホスホルアミダ イト基は(sic)メチルジイソプロピルアミノホスホルアミダイト(R1=( CH3)2CHおよびR2=CH3)または2−シアノエチルジイソプロピルア ミノホスホルアミダイト(R1=(CH3)2CHおよびR2=CH2CH2C N)であることを特徴とするa−オリゴリボヌクレオチド化合物の合成方法。
- 8.請求の範囲第3項ないし第8項記載のいずれか一項にの合成方法であって、 前記モノマーのヒドロキシル基および前記固定化されたa−リボヌクレオシド化 合物のヒドロキシル基はDmtr基によって5′−位を保護されていることを特 徴とするa−オリゴリボヌクレオシド化合物の合成方法。
- 9.請求の範囲第4項ないし第8項のいずれか一項に記載の合成方法であって、 前記モノマーの縮合に用いられる活性剤はテトラゾールおよびその誘導体からな る群から選択されるもので、例えばパラ−ニトロフェニルテトラゾールであるこ とを特徴とするa−オリゴリボヌクレオチド化合物の合成方法。
- 10.請求の範囲第3項ないし第9項のいずれか一項に記載の合成方法であって 、固定化されたa−リボヌクレオシド化合物はサクシニル型2価基を介して2′ −または3′−位置のOH基のひとつと支持体のアミノ基とがエステル化によっ て結合して前記化合物の固定体支持体への結合がなされることを特徴とするa− オリゴリボヌクレオチド化合物の合成方法。
- 11.請求の範囲第1項ないし第10項のいずれか一項に記載の合成方法であっ て、固体支持体はポリマー、シリカゲルまたは多孔性ガラスビーズに結合した長 鎖アルキルアミンからなることを特徴とするa−オリゴリボヌクレオチド化合物 の合成方法。
- 12.請求の範囲第1項なし第11項のいずれか一項に記載の合成方法に用いら れる化合物であって、3′−位がホスホルアミダイト基によって置換され、2′ −位のヒドロキシルファンクションがCtmpまたはTBDMS基のような保護 基によって保護されているa−リボヌクレオシドモノマーからなることを特徴と するa−オリゴヌクレオチド化合物の合成方法に用いられる化合物。
- 13.請求の範囲第1項ないし第11項のいずれか一項に記載の合成方法に用い られる化合物であって、該化合物は化学式(II)からなることを特徴とするa −オリゴヌクレオチド化合物の合成方法に用いられる化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ Bはa−アノマーの立体配置によってグリコシド環に結合した塩基であって、U ,A,C,Gおよび前記塩基の修飾塩基および(または)保護塩基からなる群か ら選択された塩基であることを特徴とする、 P1はヒドロキシルファンクションを保護された基であって、例えばCtmp, TBDMS、P2はHまたはヒドロキシルファンクションを保護された基であっ て、この基は例えばDmtr、 P3は化学式(I)によって表されるN,N−ジアルキルアミノホスホルアミダ イト基のようなホスホルアミダイト基、 ▲数式、化学式、表等があります▼(I)R1は付加的に置換された同一のある いは異なるC1ないしC7アルキル基、例えば、CH3、(CH3)2CH、 R2は付加的に置換されたC1ないしC7アルキル基、例えば、CH3、CH2 CH2CN。
- 14.請求の範囲第1項ないし第11項のいずれか一項に記載の合成方法に用い られる化合物であって、該化合物は2′−または3′−位のヒドロキシルファン クションを介して固体支持体上に固定化されたa−リボヌクレオシドを含むこと を特徴とするa−オリゴリボヌクレオチド化合物の合成方法に用いられる化合物 。
- 15.請求の範囲第1項ないし第11項のいずれか一項に記載の合成方法によっ て用いられる化合物であって、該化合物は化学式(III)によって表される化 合物であることを特徴とするa−オリゴリボヌクレオチド化合物の合成方法によ って利用される化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼(III)Bはa−アノマーの立体配置によ ってグリコシド環に結合した塩基であって、U,A,C,Gおよび前記塩基の修 飾塩基および(または)保護塩基からなる群から選択された塩基であることを特 徴とする、 P2はHまたはヒドロキシルファンクションを保護された基であって、この基は 例えばDmtr、 R3およびR′3のどちらか一方はHまたはヒドロキシルファンクションを保護 する基であって、この基は例えばベンゾイル基であり、他方は末端ファンクショ ンを介して固体支持体に結合することが可能なファンクション基または固体支持 体に結合した前記ファンクション基である。
- 16.請求の範囲第14項記載の化合物であって、R3またはR′3は化学式( IV)によって表される基であることを特徴とするa−オリゴリボヌクレオチド 化合物の合成方法に用いられる化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼(IV)Pは数字1ないし5であり、 R4はOHを表し、OHはC6Cl5のような活性基、または固体支持体に結合 した−NHラジカルであって、例えば前記固体支持体はポリマー、シルカゲルま たは多孔性ガラスビーズに結合したアルカリアミン鎖の−NHラジカルである。
- 17.請求の範囲第1項ないし第11項のいずれか一項に記載の合成方法によっ て得られたことを特徴とするa−オリゴリボヌクレオチド化合物。
- 18.請求の範囲第17項記載の化合物であって、該化合物は排他的に塩基Uお よびCを含まないことを特徴とするa−オリゴリボヌクレオチド化合物。
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JP2008504840A (ja) * | 2004-06-30 | 2008-02-21 | アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | 非リン酸骨格結合を含むオリゴヌクレオチド |
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