IT202000023647A1 - Sirna nel trattamento della sindrome ectrodattilia-displasia ectodermica-palatoschisi (eec) - Google Patents
Sirna nel trattamento della sindrome ectrodattilia-displasia ectodermica-palatoschisi (eec) Download PDFInfo
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Description
siRNA nel trattamento della Sindrome
Ectrodattilia-displasia Ectodermica-palatoschisi (EEC)
DESCRIZIONE
CAMPO DELL?INVENZIONE
L?invenzione concerne il campo farmacologico, ed in particolare il trattamento delle patologie collegate alla Sindrome Ectrodattilia-displasia Ectodermica-palatoschisi. Viene descritto un siRNA (small interfering RNA) ed il suo uso come medicamento. Viene altres? descritta una composizione farmaceutica comprendente tale siRNA, specifico per la mutazione R279H del gene p63.
STATO DELLA TECNICA
La sindrome Ectrodattilia-displasia Ectodermica-palatoschisi (EEC) ? una rara patologia ereditaria caratterizzata da disfunzioni multiorgano quali ectrodattilia, displasia ectodermica, palatoschisi e labiopalatoschisi. Frequenti sono le anomalie del dotto naso-lacrimale e del sistema genito-urinario. La parte ectodermica di questa sindrome coinvolge i capelli, i denti e le unghie.
I pazienti affetti da sindrome EEC spesso mostrano alterazioni della superficie oculare, ricorrenti blefariti e congiuntiviti, microlesioni superficiali, perforazioni e ulcerazioni spontanee della cornea, disfunzioni dell?epitelio corneale e una scarsa riepitelizzazione in seguito a traumi o a cheratoplastica perforante. La cheratopatia progressiva induce la formazione di un pannus corneale vascolarizzato che porta ad una progressiva diminuzione della capacit? visiva fino alla completa perdita della vista. Attualmente non sono disponibili cure definitive, ma solo palliativi per alleviare la sintomatologia. La sindrome EEC ? causata da mutazioni puntiformi nel gene p63, un importante fattore di trascrizione durante l?embriogenesi e responsabile del differenziamento delle cellule staminali negli epiteli stratificati.
La sindrome EEC ? una patologia genetica autosomica dominante, causata soprattutto da mutazioni puntiformi missenso in eterozigosi, vale a dire quindi che il gene p63 ? normalmente espresso (trascritto e tradotto), ma solo il 50% delle proteine p63 sono normali mentre nel restante 50% presentano un cambio amminoacidico in punti ben precisi, ma tutti localizzati nello stesso dominio della proteina, chiamato ?DNA binding domain?. Per la mutazione R279H: il cambio amminoacidico consiste nella sostituzione dell?amminoacido R (arginina) con H (istidina), mentre per la R304Q l?arginina ? sostituita con la glutammina (Q). Queste semplici sostituzioni amminoacidiche sono purtroppo sufficienti per alterare la corretta formazione dei complessi proteici di p63 e quindi la sua funzione di fattore di trascrizione.
Le metodiche standard di trasferimento genico volte a consentire l?espressione de novo della proteina (terapia genica additiva) non sono consigliabili/ottimali per il gene p63, dal momento che non utilizzando dei promotori ?originali-tessuto-specifici?, in grado quindi di garantire il corretto dosaggio e localizzazione del transgene, comporterebbero una over-espressione del transgene, la quale purtroppo risulta essere associata a diversi eventi negativi tra cui il carcinoma. Queste strategie di terapia genica additiva sono maggiormente indicate per le patologie recessive, caratterizzate solitamente dalla completa assenza di espressione di un determinato gene e quindi occorre inserirne una de novo. Pertanto, gli approcci di terapia genica per patologie di tipo dominante rappresentano una sfida impegnativa, dal momento che spesso richiedono il silenziamento selettivo dell?allele mutato, senza che ci? interferisca con l?espressione dell?allele wild-type.
Scopo della presente invenzione ? pertanto quello di fornire un nuovo farmaco per il trattamento della EEC, per la quale ad oggi non esistono terapie efficaci e non-invasive.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
L?invenzione pertanto concerne un siRNA (small interfering RNA) di SEQ ID NO:29 (anche chiamata ?siRNAa?). Gli inventori hanno sorprendentemente sviluppato una molecola di siRNA specifica per la mutazione R279H del gene p63. Tale siRNA ? stato visto attivo nel recupero funzionale delle cellule staminali epiteliali.
Sotto un altro aspetto viene descritto un siRNA avente la sequenza descritta in SEQ ID NO:29, per l?uso come medicamento.
Sotto ancora un altro aspetto la presente invenzione descrive siRNA di SEQ ID NO:29 per l?uso nel trattamento della Sindrome Ectrodattilia-displasia Ectodermica-palatoschisi e delle patologie epiteliali collegate alla Sindrome Ectrodattilia-displasia Ectodermicapalatoschisi.
In una forma di realizzazione l?invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente il siRNA di SEQ ID NO:29 ed eccipienti farmacologicamente accettabili. Le rivendicazioni dipendenti descrivono forme di realizzazione particolari dell?invenzione.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
L?invenzione verr? ora descritta in dettaglio e facendo riferimento alle Figure allegate. Figura 1: cellule epiteliali di mucosa orale R279H-p63 (B-C) e R304Q-p63 (D-E) e cellule di controllo per p63 (A) piastrate su scaffold di lenticoli corneali umani (HKLs). Figura 2: analisi dell?espressione della p63/b-actina mediante la real-time PCR. Il riquadro (A) riporta i dati nei campioni sani mentre il riquadro (B) riporta i dati di soggetti affetti. Le curve di amplificazione dei geni b-actina housekeeping (?) mostrano un CT pi? basso rispetto a quelli di p63. Il saggio ? stato effettuato su colture con espressione comparabile di p63: Il delta del CT di p63/b-actina sono simili sia per i mutati che per i campioni wild-type (C).
Figura 3: espressione di ?Np63? durante il lifespan di colture di limbus/cornea (H-LESCs), mucosa orale (H-OMESCs) e colture ottenute paziente EEC (OMESC R279H), in quest?ultime si evidenzia un?iniziale over-espressione (accumulo) e poi un rapido declino rispetto alle cellule normali.
Figura 4: (A) qPCR relativa che mostra i risultati dopo trattamento con i diversi siRNA (a-s) elencati in Tabella 1. Si osserva una forte down-regolazione di mRNA ?Np63? con la mutazione R279H, a seguito del trattamento con il siRNAa, corrispondente ad una variante del siRNA 10 della Tabella 1, indicato con SEQ ID NO:29. U indica il campione non trattato, S indica il controllo e le lettere corrispondono ai siRNA di tabella 1. (B) L?analisi di imaging in fluorescenza delle due linee cellulari trattate con dosi di siRNAa con range compreso tra 0 e 10 nM mostra che rispetto ad un siRNA di controllo (siNCT) il siRNAa era in grado di (i) ridurre l?espressione della proteina R279H-?Np63?-EGFP con efficienza dipendente dalla concentrazione. (C) Grafico che mostra la quantificazione della fluorescenza espressa come intensit? pixel. (D) La titolazione di siRNA ha downregolato l'mRNA di R279H, mostrando un gradiente di valori correlato alla concentrazione utilizzata, con un IC50 di 7,20 /- 0,04 nM.
Figura 5: colture organotipiche e distribuzione tissutale di siRNA marcati con fluorescenza. Colture organotipiche allestite mediante l?utilizzo di un dispositivo in grado di creare due differenti compartimenti a livello di un lenticolo corneale umano (stroma corneale (A) e (B) in presenza del siRNAa ed in presenza del placebo (C). Analisi al microscopio confocale hanno dimostrato la presenza di un epitelio ben organizzato e stratificato, di 4-5 strati, nell?area trattata, mentre la regione adiacente mostrava il tipico fenotipo delle cellule mutate per p63 (D).
Figura 6: fotografie di cellule epiteliali basali ancorate alla membrana basale ed esprimenti diversi marcatori cellulari (laminina ?3, Ck3, Ck12, DNp63alfa, 14-3-3 ?. Figura 7: Modello di approccio terapeutico basato sui siRNA per il trattamento con LSCD in pazienti con displasia ectodermica-ectrodattilia-schisi (EEC). Le cellule staminali limbari (LESC) con p63 difettose hanno una ridotta capacit? di ripopolare l'epitelio corneale, che porta a un progressivo deterioramento della vista culminante in una completa cecit? bilaterale, associata alla congiuntivalizzazione. Gli approcci di silenziamento genico mediante siRNA allele-specifici ? potenzialmente un nuovo modo per ripristinare i difetti epiteliali e, infine, la grave perdita della vista osservata nei pazienti EEC giovani e adulti. In particolare, nei giovani pazienti, che hanno ancora cellule staminali (LESC) nel limbus residue, i colliri contenenti siRNA mutanti specifici potrebbero controbilanciare la perdita di cellule staminali. Nei pazienti adulti EEC, che hanno un LSCD pi? grave e perso definitivamente il limbus, la correzione genica mediata dalla fornitura continua di siRNA specifici pu? migliorare gli esiti clinici dell'innesto di OMESC autologhi. Abbreviazioni: LESC, cellule staminali epiteliali limbari; LSCD: deficit di cellule staminali limbari; OMESC, cellule staminali epiteliali della mucosa orale; siRNA, piccolo RNA interferente.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
L?inibizione dell?espressione di un gene viene detta silenziamento genico o knock down. ? possibile silenziare uno specifico gene all?interno del genoma grazie alla tecnologia dell?interferenza a RNA (RNA interference, RNAi).
L?RNAi ? un processo naturale usato dalle cellule per regolare l?espressione genica, fenomeno osservato in differenti organismi (da protozoi a mammiferi), conservatosi durante l?evoluzione come meccanismo di difesa contro i virus.
Il meccanismo del RNAi ? reso possibile in quanto la cellula pu? esprime RNA che non servono a codificare proteine, ma che sono processati da una serie di enzimi per generare dei corti RNA (20-30 nt) detti siRNA (small interfering RNA, piccoli RNA interferenti).
Ciascun siRNA ? complementare alla sequenza di uno specifico mRNA. Il suo appaiamento porta alla degradazione specifica dell?mRNA prima che venga tradotto. Pertanto Il silenziamento genico che ne consegue ? un processo post-trascrizionale di controllo dell?espressione genica che sfrutta la capacit? di una sequenza oligonucleotidica ?antisenso? di ibridizzarsi con uno specifico mRNA target (?senso?), rendendolo non pi? accessibile per la traduzione nella proteina corrispondente e determinando la sua degradazione da parte di specifiche nucleasi. Attualmente esistono due strategie di silenziamento genico che sono state sviluppate a fini farmacologici: gli oligonucleotidi antisenso (ASO) e gli small interfering RNA (siRNA)
Quest?ultimo meccanismo avviene fisiologicamente attraverso un complesso processo che coinvolge pi? componenti. Inizialmente una lunga molecola di RNA a doppio filamento viene tagliata in un RNA a doppio filamento pi? corto contenente 20-25 nucleotidi (siRNA) che viene incorporato in un complesso enzimatico (RNA-induced silencing complex, RISC) e ridotto a singolo filamento: il - filamento antisenso (quello attivo) rimane legato al complesso, mentre il filamento senso viene degradato. In presenza di un mRNA complementare, avviene l?ibridizzazione al filamento antisenso, seguita dall?attivazione di un enzima presente nel complesso RISC che opera un taglio sull?mRNA e dalla degradazione dei due frammenti cos? generati. Il risultato finale ? l?inibizione dell?espressione di uno specifico gene. Il filamento antisenso di RNA rimane protetto dal complesso RISC a lungo, creando una condizione per cui pu? silenziare l?espressione genica anche in un momento successivo. La scoperta di questo meccanismo ha permesso a C. Mello e A. Fire di vincere il premio Nobel per la Medicina nel 2006. Questo processo fisiologico ? subito diventato oggetto di intensi studi per sviluppare approcci farmacologici in grado di bersagliare geni specifici.
Recentemente ? stato inoltre dimostrato che l?RNAi pu? essere anche allele specifico, ovvero mutazione specifico.
Il silenziamento allele-specifico tramite RNAi consiste nell?inibire in modo specifico l'espressione dell?allele dominante responsabile della malattia, che differisce da quello normale anche per un solo nucleotide. La specificit? ? cruciale per ridurre al minimo gli effetti eventuali anche sull?allele normale. Per questo approccio ? necessario identificare la variazione nucleotidica, ossia la mutazione puntiforme del singolo nucleotide, che caratterizza l?allele mutato. L?efficacia di questo metodo ? stata dimostrata in una linea di fibroblasti di un paziente affetto da ?Atassia Spinocerebellare di tipo 1 (SCA1) provando la sua possibile applicazione terapeutica in questa patologia (Fiszer et al.
2012). Questo tipo di metodica permette di conservare intatta la sintesi della proteina sana, fondamentale nel mantenimento delle normali funzioni cellulari.
Come indicato nel sommario dell?invenzione, la presente invenzione riguarda un siRNA (small interfering RNA) di SEQ ID NO:29 in grado di silenziare l?allele mutato del gene p63 e specifico per la mutazione p63-R279H.
Tale silenziamento viene modulato attraverso l?introduzione nella cellula di piccole molecole sintetiche RNA a doppio filamento siRNA in grado di riconoscere e legare la specifica sequenza di RNA messaggero p63R279H causandone l?immediata degradazione.
Allo scopo di aumentare la stabilit? degli siRNA e conferire una loro efficiente e duratura distribuzione nei diversi strati dell?epitelio corneale, la struttura degli ologonucleotidi ? stata sottoposta a varie modificazioni chimiche, note come locked nucleic acids (LNA). Tale modifica ? basata sull?introduzione a carico del ribosio di legami extra in grado di connettere gli atomi di carbonio in posizione 2? e 4? (ponte 2?-0,4?C-metilene). La presenza di tale legame blocca il ribosio nella conformazione strutturale C3? endo che ? frequentemente presente nella forma strutturale A del DNA o dell?RNA. Pertanto gli acidi nucleici bloccati (LNA) sono una classe di analoghi dell'RNA ad alta affinit? in cui l'anello ribosio ? "bloccato" nella conformazione ideale per il legame di Watson-Crick. Di conseguenza, gli oligonucleotidi LNA mostrano una stabilit? termica senza precedenti quando ibridati in un filamento complementare di DNA o RNA. Per ciascun monomero con LNA incorporato, la temperatura di fusione (Tm) del duplex aumenta di 2-8 ?C. Inoltre, gli oligonucleotidi LNA possono essere pi? piccoli rispetto agli oligonucleotidi DNA o RNA tradizionali e mantengono comunque un alto Tm. Ci? ? importante quando l'oligonucleotide ? di ridotte dimensione e viene utilizzato per rilevare target piccoli o molto simili.
L'incorporazione di LNA negli oligonucleotidi ha dimostrato di migliorare la sensibilit? e la specificit? per molte tecnologie basate sull'ibridazione tra cui PCR, microarray e ibridazione in situ.
Un oligonucleotide LNA, rispetto agli oligonucleotidi di DNA o RNA tradizionali, offre un'affinit? sostanzialmente maggiore per l?appaiamento al corrispettivo filamento complementare. Ci? si traduce in sensibilit?, specificit? e ridotta se non completamente assente citotossicit? senza precedenti e rende gli oligonucleotidi LNA ideali per la rilevazione di target di DNA o RNA piccoli o molto simili.
I vantaggi e le potenziali applicazione degli LNA includono:
? sensibilit? significativamente maggiore rispetto agli oligo / sonde di DNA e RNA ? rilevamento affidabile di tutte le sequenze di microRNA, indipendentemente dal contenuto del GC
? Rilevazione superiore da campioni clinici difficili come biofluidi e FFPE
? maggiore specificit? target rispetto alle sonde DNA e RNA
? rilevamento di discrepanze a singolo nucleotide
? discriminazione superiore delle famiglie di microRNA
? elevata stabilit? in vivo e in vitro
? associazione ad alta potenza a RNA e DNA
? inibizione antisenso superiore di piccoli bersagli di RNA in vivo.
Un vantaggio importante della strategia di terapia genica basata sui siRNA ? che non modifica direttamente il DNA genomico, e quindi pone meno problemi sia dal punto di vista della sicurezza che dal punto di vista etico, evitando l?utiizzo di vettori di natura virale, in grado di integrarsi nel DNA per poter esprimere gli siRNA in maniera costitutiva. Sotto un altro aspetto viene descritto un siRNA di SEQ ID NO:29, per l?uso come medicamento.
Gli inventori hanno sorprendentemente trovato che in base alla severit? del deficit di cellule staminali da cui sono affetti i pazienti EEC, il siRNA di SEQ ID NO:29 potrebbe avere applicazioni cliniche sia per pazienti giovani che adulti.
Sotto ancora un altro aspetto la presente invenzione descrive siRNA di SEQ ID NO:29 per l?uso nel trattamento della Sindrome Ectrodattilia-displasia Ectodermica-palatoschisi e delle patologie e condizioni collegate alla Sindrome Ectrodattilia-displasia Ectodermica-palatoschisi.
Dette patologie e condizioni collegate alla Sindrome Ectrodattilia-displasia Ectodermicapalatoschisi sono scelte dal gruppo consistente in cheratopatie progressive, blefariti, congiuntiviti, microlesioni superficiali, perforazioni e ulcerazioni spontanee della cornea e disfunzioni dell?epitelio corneale e delle mucose.
In una forma di realizzazione preferita, l?uso del siRNA di SEQ ID NO:29 ? nel trattamento delle patologie che coinvolgono la cornea. Nei pazienti EEC tali patologie si manifestano verso la seconda-terza decade di vita, portando poi alla cecit?. Tale decorso fornisce una finestra terapeutica per correggere il difetto genetico usando il siRNA di SEQ ID NO:29 nel trattamento preventive. Il trattamento con siRNA di SEQ ID NO:29 permette di mantenere la trasparenza corneale, prevenire la perdita della vista ed alleviare il dolore e la fotofobia.
Sotto un altro aspetto l?invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente il siRNA di SEQ ID NO:29 (indicato anche come siRNAa) ed eccipienti farmacologicamente accettabili.
Preferibilmente la composizione farmaceutica secondo l?invenzione viene somministrata per via topica, enterale o parenterale.
In una forma di realizzazione preferita, detta composizione ? somministrata per via topica, preferibilmente per via oftalmica, cutanea o orale.
In una ulteriore forma di realizzazione detta composizione ? in forma liquida sotto forma di sospensione, emulsione, soluzione, collirio o spray orale, in forma solida: una crema o gel, polvere, granuli, compressa, capsula o pillola.
? preferita la forma liquida per l?uso come collirio e la forma solida in crema o gel per il trattamento delle mucose.
Infatti i pazienti affetti da EEC soffrono spesso di calvizie precoce e di pelle secca (molto simile alla psoriasi) ed il trattamento con una pomata o gel comprendente il siRNA di SEQ ID NO:29 potrebbe migliorare la condizione del paziente.
Nelle cornee affette di individui giovani, con cellule staminali ancora presenti nel limbus, l?uso di colliri contenenti la specifica molecola di siRNA di SEQ ID NO:29 diretta contro l?allele mutato (collirio molecolare) potrebbero rappresentare una pratica opzione terapeutica. Nei pazienti adulti, con deficit di cellule staminali ormai conclamato e assenza di cellule limbari, i risultati clinici potrebbero essere migliorati con la continua somministrazione di collirio molecolare, contenente la molecola di siRNA di SEQ ID NO:29 terapeutica, abbinato al trapianto di un graft di cellule staminali della mucosa orale.
Come verr? descritto negli esempi, gli obiettivi del presente progetto erano: (i) reclutamento e caratterizzazione genetica e clinica di una coorte di pazienti affetti da sindrome EEC in Europa; (ii) caratterizzazione cellulare, molecolare e biochimica di cellule staminali corneali ottenuti da pazienti EEC e determinazione della loro capacit? rigenerativa; (iii) sviluppo di tecniche di silenziamento genico per la correzione del difetto genetico delle cellule corneali EEC, mediante utilizzo di specifiche sequenze di RNA (siRNAs) in grado di inattivare l?allele mutato di p63 e (iv) richiesta di un trial clinico di terapia genica di fase I/II per il trapianto di cellule staminali corneali EEC geneticamente modificate.
In conclusione, in base alla severit? del deficit di cellule staminali da cui sono affetti i pazienti EEC, si potrebbero avere applicazioni cliniche sia per pazienti giovani che adulti. Infatti, la patologia corneale di tali pazienti si manifesta verso la seconda-terza decade di vita, portando poi alla cecit?. Tale decorso fornisce una finestra terapeutica per correggere il difetto genetico usando delle strategie preventive, che potrebbero mantenere la trasparenza corneale, prevenire la perdita della vista ed alleviare il dolore e la fotofobia. Nelle cornee affette di individui giovani, con cellule staminali ancora presenti nel limbus, l?uso di colliri contenenti la specifica molecola di siRNA a diretta contro l?allele mutato (collirio molecolare) potrebbero rappresentare una pratica opzione terapeutica. Nei pazienti adulti, con deficit di cellule staminali ormai conclamato e assenza di cellule limbari, i risultati clinici potrebbero essere migliorati la continua somministrazione di collirio molecolare, contenente la molecola di siRNA a terapeutica, abbinato al trapianto di un graft di cellule staminali della mucosa orale (Figura 7).
Sotto ancora un altro aspetto viene descritto un metodo di trattamento della Sindrome Ectrodattilia-displasia Ectodermica-palatoschisi e delle patologie e condizioni ad essa collegate, mediante il passaggio di somministrare il siRNA di SEQ ID NO:29.
ESEMPI
Si riportano di seguito alcuni risultati riguardanti la realizzazione della presente invenzione forniti a titolo illustrativo.
1. Reclutamento e caratterizzazione clinica e genetica di pazienti affetti da sindrome EEC
Per ciascun paziente ? stata effettuata la diagnosi clinica della patologia, mediante approfonditi esami oftalmologici (valutazione della superficie oculare mediante lampada a fessura, test di Snellen per la misurazione della capacit? visiva, analisi della capacit? di lacrimazione mediante test di Schirmer, test TBUT e valutazione della presenza e funzionamento delle ghiandole di Meibomio, colorazione con fluoresceina per la valutazione dell?integrit? dell?epitelio corneale), ed un accurata diagnosi molecolare allo scopo di identificare le mutazioni a carico del gene p63 responsabili della sindrome. Lo studio ? stato approvato dal Comitato Etico per la Sperimentazione Clinica della Provincia di Venezia e IRCCS San Camillo -prot.cat.05.08 e dal Comitato Etico per la Sperimentazione Clinica della Provincia di Padova-4503/AO/18).
2. Allestimento di colture organotipiche: le cellule mutanti per p63 mostrano difetti nella stratificazione e nel differenziamento
Le colture organotipiche in vitro rappresentano un modello ideale per valutare la capacit? dei cheratinociti difettivi per p63 di stratificare e differenziarsi regolarmente in presenza di una matrice corneale.
Al fine di ottenere informazioni (i) sulla funzione delle cellule staminali EEC, recanti le suddette mutazioni e (ii) sulla loro capacit? clonogenica residua, il loro potenziale proliferativo e capacit? di differenziamento, sono state analizzate le staminali epiteliali isolate dalla mucosa orale, rispettivamente di due pazienti affetti da Sindrome EEC. Il motivo della scelta della mucosa orale e non limbo-corneale si basa sul fatto che recenti studi clinici (Sotozono et al.2013) suggeriscono che la mucosa orale pu? rappresentare una valida alternativa al trapianto di limbus, come dimostrato dai dati a lungo termine ottenuti su numerosi pazienti affetti da deficit limbare bilaterale, quindi privi di aree di limbus sane, trattati mediante graft autologhi di cellule staminali della mucosa orale. Quindi, poich? la Sindrome EEC comporta un deficit limbare bilaterale e pazienti adulti (tipicamente dopo i 30 anni di et?) non hanno pi? il limbus, la mucosa orale rappresenta una sicura e, ad oggi, unica fonte terapeutica alternativa per risolvere i gravi problemi oculari in tali pazienti. Per questo motivo i nostri studi sono stati effettuati isolando e caratterizzando le cellule staminali della mucosa orale di 2 pazienti EEC, affetti dalle due pi? severe e comuni mutazioni. Gli esperimenti sono stati effettuati usando una biopsia di mucosa orale ottenuta da un soggetto sano e 2 biopsie ottenute da pazienti EEC. Le cellule sono state isolate dalle biopsie di mucosa orale (3x3 mm), coltivate in vitro e propagate serialmente fino al termine della loro capacit? replicativa. Sono stati poi comparati i profili di crescita della linea epiteliale di mucosa orale di controllo (wild type) e le linee cellulari mutate per p63 (R279H e R304Q).
Sono state realizzate colture organotipiche usando cellule epiteliali primarie di mucosa orale mutate per p63 -R304Q (Figura 1): cellule epiteliali di mucosa orale di controllo, R279H-p63 e R304Q-p63 sono state piastrate su lenticoli corneali umani (HKLs) e cresciute per 21 giorni consecutivi. Come mostrato in Figura 1, gli epiteli generati dalle cellule, R279H-p63 (B-C) e R304Q-p63 (D-E), confrontati con quello ottenuto da cellule di controllo per p63 (A) appaiono pi? sottili, costituiti solo da 1-2 strati, alcuni privi di cellule o con cellule irregolari e terminalmente differenziate. Lo spessore dell?epitelio differisce notevolmente tra quelli ottenuti con cellule R279H-p63 (12,1 ? 7 ?m; massimo 21,3 ?m) o cellule R304Q-p63 (9,1 ? 3 ?m; massimo 14,5 ?m) e quello ottenuto con cellule di controllo (56,4 ? 18 ?m; massimo 82, 3 ?m). il numero di strati cellulari era maggiore nell?emicornea ottenuta da cellule di controllo (3,9 ? 1,2 strati, massimo 5,8 strati) confrontato con quelli ottenuti dalle cellule R279H-p63 (1,2 ? 1,2 strati, massimo 2,2 strati) o cellule R304Q-p63 (1,1 ? 1,0 strati, massimo 1,2 strati).
Analisi al microscopio confocale a scansione laser hanno mostrato un diverso comportamento, relativamente ai processi di differenziamento cellulare, delle tre emicornee. L?epitelio ottenuto dalle cellule di controllo era costituito da cellule basali che esprimono il marcatore p63 e la sua isoforma ?Np63?, cellule soprabasali esprimenti 14-3-3-? (un marcatore del differenziamento precoce per gli epiteli stratificati) e cellule superficiali terminalmente differenziate esprimenti la citocheratina 3, un marcatore della superficie oculare.
I tessuti generati dalle cellule difettive per p63, invece, hanno mostrato difetti sia nella stratificazione che nel differenziamento, risultando in una severa ipoplasia e perdita della polarit?. Sono state inoltre osservati dei cluster anomali di cellule terminalmente differenziate che esprimevano fortemente la citocheratina 3 e l?involucrina, ma non p63 e 14-3-3-?, indicando pertanto un prematuro fenotipo di differenziamento terminale. Questi risultati suggeriscono che p63 ? essenziale per la formazione di un epitelio corneale correttamente stratificato; in assenza di tale proteina, il tessuto assume le caratteristiche di un epitelio semplice, costituito da 1-2 strati e caratterizzato da cellule irregolari squamose.
3. Approcci di terapia genica per la correzione del difetto genetico nella sindrome EEC: sviluppo di siRNAs allele specifici
Come indicato precedentemente, gli approcci di terapia genica per patologie di tipo dominante rappresentano una sfida impegnativa, dal momento che esse spesso richiedono il silenziamento selettivo dell?allele mutato, senza che ci? interferisca con l?espressione dell?allele wild-type.
Una possibile strategia ? rappresentata dall?utilizzo dei ?small-interfering RNA? (siRNA), piccole molecole di RNA in grado di legarsi e silenziare l?RNA messaggero prodotto dall?allele mutato, ma non quello originato dall?allele sano.
Allo scopo di sviluppare una strategia per la progettazione di siRNAs nucleotide-specifici contro i mutanti p63-R279H e R304Q, ? stata analizzata la capacita delle molecole di siRNA di discriminare tra due RNA target che differiscono solo per una singola base. Tutti i possibili siRNAs (21+1) sono stati disegnati e sintetizzati per analizzare tutte le possibili sequenze target contenenti la mutazione di un singolo nucleotide, G953A che causa la mutazione p63-R279H.
Tabella 1: sequenze dei siRNA disegnati
4. Sviluppo di una Real Time PCR allele specifica per la discriminazione e la quantificazione della mutazione p63-R279H allo scopo di monitorare l?efficienza dei siRNA
Allo scopo di testare se i siRNA fossero in grado di silenziare selettivamente l?espressione del mutante p63-R279H senza interferire con l?espressione dell?RNA wildtype, ? stata messa a punto una Real-Time PCR specifica per la mutazione R279H, per consentire la quantificazione relative deli RNA messaggeri wild-type e mutato.
Il primo step ? stato il disegno di due sonde Taqman capaci di ibridarsi specificamente sia all?allele wild-type che a quello mutato, consentendo un?analisi competitiva. Queste sonde sono state marcate con due diversi fluorofori, 6-FAM per l?allele wild-type ed HEX per il mutato. Il nostro saggio si ? avvalso dell?utilizzo di un singolo set di primers, cosicch? la discriminazione della mutazione ? stata ottenuta mediante l?uso di sonde che differiscono solo alla posizione della mutazione R279H.
Tabella 2: sonde Taqman
Questo approccio ha il vantaggio che la rilevazione della mutazione p63 ? indipendente dall?efficienza di amplificazione. La presenza di una sonda contro la sequenza wild-type agisce da controllo interno per determinare la qualit? dell?RNA ed inoltre consente la quantificazione del tasso di mutazione mediante il calcolo del rapporto tra allele mutato e wild-type. Le intensit? dei segnali di fluorescenza sono state registrate ed analizzate durante la PCR grazie allo strumento ABI Prism 7900 sequence detector, usando il software SDS (versione 2.4) della Applied Biosystems. Il saggio ? stato validato per la sua accuratezza mediante la costruzione di curve standard sia per le sonde wild-type che mutate. La sensibilit? del saggio ? stata determinata effettuando delle diluizioni seriali del 50% dell?RNA mutato estratto da pazienti eterozigoti, unito al 100% di RNA wild-type, allo scopo di ottenere campioni dell?allele mutante p63-R279H presente in percentuale di 50, 37.5, 25, 12.5, 10, 7.5, 5. 2.5 e 0. Il test si ? dimostrato sensibile abbastanza da rilevare fino all?1% di p63 mutato.
? stato inoltre rilevato un basso segnale aspecifico originato dall?appaiamento della sonda mutata con sequenze wild-type. Ci? ? dovuto al fenomeno della crossibridazione, che si verifica comunemente quando le sequenze differiscono solo per una singola base ed ? facilmente distinguibile dai reali segnali positivi.
Per analizzare l?espressione di p63 in rapporto alla beta-actina, abbiamo sviluppato un nuovo test capace di analizzare, in un?unica sessione analitica le espressioni geniche relative. In Figura 2 ? riportato un esempio di Real time PCR ottenuta da campioni sani e affetti. Le curve ottenute dall?amplificazione della beta-actina (curva pi? bassa) mostrano un Ct (Cycle Threshold) pi? basso, paragonato a quello di p63 (curva pi? alta). I delta Ct p63/beta-actina ottenuti sono totalmente simili tra campioni mutati e wild-type, indicando che l?espressione di p63 non ? influenzata dalla mutazione. Questo saggio ? stato messo a punto allo scopo di determinare l?efficienza di silenziamento genico dei siRNA e identificare cos? la migliore sequenza siRNA per la successiva costruzione dei vettori lentivirali.
5. Analisi dell?efficienza dei siRNA nel silenziamento dell?allele R279H-p63
I primi screening sono stati effettuati utilizzando due batterie di siRNA (Dharmacon da 19 nucleotidi e Invitrogen Stealth da 25 nucleotidi).
Ciascun siRNA ? stato utilizzato per la trasfezione di cellule primarie di mucosa orale R279H-p63, con un range di concentrazione compreso tra 10 e 100 nM.48 ore dopo la trasfezione, l?RNA totale ? stato isolato dalle cellule e analizzato mediante il saggio della Real ?Time PCR allele-specifica, per la discriminazione e la quantificazione degli RNA messaggeri wild-type e mutati. L?analisi dell?espressione totale di p63 ? stata effettuata mediante Real-Time PCR quantitativa (qPCR), confrontando la quantit? di trascritti betaactina/p63. L?analisi del set di siRNA ha dimostrato che alcuni di essi mostravano un pi? alto tasso di silenziamento totale di p63.
I risultati di questi primi screening hanno dimostrato una maggior efficienza e specificit? dei siRNA da 19 bp, dovute probabilmente alle minori dimensioni rispetto ai siRNA da 25 bp. In particolare sono stati individuati 3 siRNA (n.1, 4 e 11) efficaci nel silenziare l?allele mutato R279H-p63 (efficienza pari a ? 80% per siRNA 1), dimostrando cos? di essere in grado di determinare una discriminazione allelica tra allele wild-type e mutato. La fase successiva di svolgimento del progetto ? stata quella di ottimizzare gli esiti degli screening con l?obiettivo di identificare molecole con la pi? alta specificit? e stabilit?. Da qui la scelta focalizzata sui LNA-siRNA di 19 nucleotidi (Locked Nucleic Acid, Eqixon) diretti contro l?allele mutato R279H-p63. Gli LNA-siRNA sono molecole di siRNA chimicamente modificate, allo scopo di conferire opportunamente una maggiore stabilit? e specificit? di legame alle sequenze target.
6.Creazione di due modelli cellulari che esprimono stabilmente WT-?Np63? e R279H ?Np63?
Al fine di testarne l?efficacia dei siRNA, lo screening ? stato eseguito non direttamente sulle cellule staminali dei pazienti EEC, in quanto co-esprimenti entrambe le forme di p63 (mutata e sana), ma si ? provveduto alla creazione in vitro di due linee cellulari stabili, in grado di esprimere separatamente o la forma normale della proteina (WT-?Np63?-RFP) e/o la forma mutata (R279H-?Np63?-EGFP). Al fine di ottenere linee capaci di esprimere in maniera costitutiva i due alleli di p63, sono stati pertanto sviluppati vettori lentivirali di terza generazione ed effettuate delle trasduzioni delle cellule HEK293T. A tal scopo sono state utilizzate le cellule HEK293T, una linea cellulare epiteliale che non esprime p63 a livello endogeno. Tali cellule sono state trasdotte con lentivirus di terza generazione contenenti gli alleli WT- o R279H- ?Np63? fusi con sequenze di RFP o EGFP, rispettivamente. Dopo l?isolamento di cloni stabili (n= 14 per entrambi i costrutti) abbiamo osservato che le linee cellulari contenenti l?allele R279H-?Np63? mostravano livelli di espressione di ?Np63? pi? alti rispetto ai cloni di controllo. Si evince pertanto che il nostro modello cellulare rispecchia fedelmente l?aumentato livello di R279H- ?Np63?, precedentemente riscontrato nelle R279H- OMESC in vivo. Successivamente ? stata effettuata la trasfezione di tali linee utilizzando i 19 LNA-siRNA disegnati in modo tale da avere come target la regione dell?mRNA dell?allele R279H-p63 contenente il cambio nucleotidico G-A in posizione 953.
7. Screening di LNA-siRNA diretti contro l?allele p63-R279H
Le linee cellulari stabili omozigoti sono state usate separatamente per effettuare la trasfezione di 19 LNA-siRNA, diretti contro l?allele R279H-p63. 48 ore dopo la trasfezione, la down-regolazione allele specifica ? stata rilevata mediante la qPCR ?Np63? relativa. Il siRNA denominato a (SEQ ID NO:29) si ? dimostrato il pi? efficace nel ridurre l?espressione dell?mRNA mutato di circa il 90% (Figura 4A). Al siRNA a sono state apportate alcune modifiche chimiche al fine di ottenere un siRNA che abbia la massima efficienza in termini di specificit? e stabilit?. Tale siRNA ? il siRNA di SEQ ID NO:29, oggetto della presente invenzione. Le analisi di Western-blot hanno dimostrato una significativa e specifica riduzione della proteina mutata quando ? stato utilizzato il siRNA a (45 ? 4%), mentre la down-regolazione con i siRNA b e c non ha avuto effetti consistenti e riproducibili.
L?analisi di immagine delle due linee cellulari trattate con dosi di siRNAa con range compreso tra 0 e 10 nM, ha mostrato che rispetto ad un siRNA di controllo (siNCT) il siRNA a era in grado in vitro di (i) ridurre l?espressione della proteina R279H-?Np63?-EGFP con efficienza dipendente dalla concentrazione, e (ii) mantenere la fluorescenza della proteina WT-?Np63?-RFP (Figura 4 B, C, D). Allo scopo di valutare la specificit? del siRNA a nell?inibire la neo-sintesi di R279H-?Np63? e di diminuire la sua espressione nel tempo, abbiamo utilizzato la linea cellulare HEK293T trasfettata in maniera transiente, in modo da ottenere un modello in vitro della patologia EEC. La linea cellulare HEK293T ? stata co-trasfettata, in un rapporto di 1:1, con entrambi i plasmidi WT-?Np63?-RFP e ?Np63?-EGFP mutante, in presenza del siRNA a. L?analisi di immagine ha mostrato una specifica e significativa inibizione della neo-sintesi di R279H -?Np63? ?EGFP in circa l?80% delle cellule totali 48 ore dopo la trasfezione, comparate alle cellule trattate con un controllo negativo siNCT. In esperimenti successivi, il siRNA a ? stato successivamente aggiunto alle cellule eterozigoti in transiente, 18 ore dopo la trasfezione, insieme al siRNA marcato con fluoresceina (FITC-siRNA), in modo da seguire la distribuzione dei siRNA. L?analisi di Z-stack ha mostrato uno specifico silenziamento di R279H -?Np63? ?EGFP. 48 ore dopo la trasfezione ? stato osservato l?effetto massimo nelle cellule trattate con siRNA a FITC-siRNA. Lo step successivo ? stato quello di validare il potenziale inibitorio ed allelespecifico dei siRNA ex vivo. Le cellule R279H-OMESC sono state trasfettate usando concentrazioni di FITC-siRNA in un range compreso tra 10 e 100 nM. 48 ore dopo la trasfezione, l?efficienza di trasfezione ottimale ? stata dell?88 ? 2% a 100 nM. Successivamente, abbiamo trasfettato i siRNA a, b e c nelle cellule R279H-OMESC a 100 nM, e i livelli di espressione di p63 wild-type e mutato sono stati misurati mediante AS-qPCR. Si ? ottenuta una significativa soppressione dell?mRNA mutato con il siRNA a, ma anche con i siRNA b e c, con una percentuale di soppressione dell?mRNA mutato pari a 80%, 72% and 65%, rispettivamente. Allo scopo di determinare la concentrazione minima di siRNA a sufficiente ad inibire l?mRNa mutato di p63, ? stata effettuata un?analisi dose-risposta, alle concentrazioni di siRNA pari a 0,1, 10 e 100 nM. La titolazione del siRNA a ha abolito l?mRNA R279H, mostrando un gradiente di valori correlati alla concentrazione usata.
La sequenza 5?-3? anti-senso (AS) del siRNAa ? la seguente: /5Phos/rArUrUrGrGrArCrGrG T+ GrGrUrUrCrArUrCrC+T+T (SEQ ID NO:29), dove: - le basi ad RNA sono indicate come rA, rC, rG, rU;
- le basi ad LNA sono indicate come T;
- le basi a DNA sono indicate come T.
Per ciascun siRNA, ? stato sintetizzato anche il filamento senso (S), che per il siRNA a ? il seguente: rGrGrArUrGrArArCrCrArCrCrGrUrCrCrArArUTT (SEQ ID NO:30).
8.Quantificazione dell?espressione di ?Np63? in cellule ottenute da donatori sani e pazienti EEC: le fasi sperimentali successive sono state effettuate direttamente sulle cellule staminali dei pazienti EEC trattate e non con il SEQ ID NO:29.
Dal momento che nei tessuti dei pazienti EEC ? stata precedentemente osservato un accumulo di p63, dovuto probabilmente alla maggiore stabilit? dell?isoforma mutata, l?espressione di ?Np63? ? stata quantificata nelle OMESC R279H, utilizzando una PCR quantitativa assoluta (Ab-qPCR), a diversi passaggi in coltura (I, III; V, VII e XI) ed ? stata poi comparata con cellule OMESC di controllo e cellule staminali epiteliali limbari. Come mostrato in Figura 3, ?Np63? diminuisce durante la coltivazione seriale. Il tasso di riduzione ? risultato pi? rapido nelle OMESC R279H. L?espressione di ?Np63? al primo passaggio ? di tre volte superiore rispetto alle OMESC di controllo. La maggior capacit? di self-renewal delle OMESC spiega perch? esse vengano usate con successo come fonte di cellule staminali, consentendo la rigenerazione epiteliale per molto tempo. Allo scopo di approfondire il rapporto tra espressione di ?Np63? e la patologia EEC, ? stata valutata la percentuale di espressione degli mRNA wild-type e mutati di p63 attraverso la PCR quantitativa allele-specifica (AS-qPCR). Tale saggio ha rivelato che il profilo di espressione dei due trascritti ? diverso nei tre passaggi analizzati (I, III e V), con una diminuzione dell?mRNA p63 mutato (Figura 3). Al primo passaggio, le percentuali degli mRNA p63 mutante (R279H) e wild type sono risultate 60 ? 7% and 40 ? 5%, rispettivamente, mentre durante l?invecchiamento i rapporti sono cambiati, diventando 12 ? 1,7% and 23 ? 0,9%. Questi risultati confermano che la presenza elevata di mRNA mutato influenza il normale programma di differenziamento e pu? indurre l?attivazione di un pathway di regolazione alternativo e tuttora sconosciuto, portando alla prematura perdita delle cellule staminali.
Per verificare questa ipotesi ed analizzare la capacit? dei siRNA di bloccare l?espressione dell?allele mutato R279H, sono stati scelti 2 cloni che mostravano la tipica localizzazione nucleare di ?Np63? ed esprimevano livelli di mRNA e proteina di ?Np63? comparabili al livello endogeno trovato nelle OMESC-EEC.
9. Ripristino del prematuro arresto proliferativo nelle cellule p63-R279H attraverso il trattamento con siRNA a
Allo scopo di capire se il siRNA a fosse in grado di ripristinare il fenotipo funzionale nelle cellule R279H - OMESC, abbiamo effettuato il saggio di migrazione e proliferazione cellulare con le OMESC trattate sia con il controllo negativo siNCT che con il siRNA a (100 nM). I risultati mostrano che la chiusura del setto a 4 e 7 ore era ridotta nelle cellule mutate trattate con il siRNA a, ma non in quelle trattate con il controllo. Inoltre, le cellule mutate trattate con siRNA a esibivano un life-span pi? lungo pari a 7 passaggi in coltura, rispetto ai 5-6 delle cellule wild-type. Infine, il trattamento con siRNA a era in grado di attenuare la perdita progressiva delle cellule clonogeniche nelle R279H ? OMESC. Alla concentrazione di siRNA usata, non sono state osservate alterazioni significative sia a livello morfologico che dell?espressione dei marcatori quali p63, ?Np63?, MUC1, K3, K4 e K13 nelle cellule trattate con siRNA a. Presi insieme, questi risultati supportano la nostra ipotesi che attraverso un silenziamento specifico dell?allele R279H-p63, la strategia dei siRNA pu? contrastare l?arresto prematuro delle cellule mutate ed estenderne il ciclo vitale.
10. Ripristino dei processi di stratificazione e differenziamento nelle cellule R279H OMESC dopo infusione con siRNA a (SEQ ID NO:29):
Per verificare l?eventuale ripristino dei processi di differenziamento e stratificazione nelle cellule mutate, sono state allestite colture organotipiche mediante l?utilizzo di un dispositivo in grado di creare due differenti compartimenti a livello di un lenticolo corneale umano (stroma corneale, HKL, Figura 5A), in modo tale da poter allestire contemporaneamente due colture organotipiche con cellule R279H-p63, (i) in presenza del SEQ ID NO:29 a e (ii) in presenza di siRNA placebo (Figura 5C). Per poter visualizzare la localizzazione dei siRNA a livello cellulare, le trasfezioni nei due compartimenti sono state eseguite aggiungendo dei siRNA fluorescenti. Al termine della coltura, sono state ottenute sezioni istologiche dell?intero tessuto per testare l?abilit? delle cellule mutate trattate con siRNA a di stratificare correttamente. Analisi al microscopio confocale hanno dimostrato la presenza di un epitelio ben organizzato e stratificato, di 4-5 strati, nell?area trattata, mentre la regione adiacente mostrava il tipico fenotipo delle cellule mutate per p63 (Figura 5D). L?epitelio ottenuto era caratterizzato dall?espressione basale di p63 e ?Np63?, mentre l?espressione della citocheratina 3 e di 14-3-3 ? era presente solo nelle cellule dello strato superiore. Le cellule epiteliali basali erano ancorate alla membrana basale ed esprimevano la laminina ?3 (Figura 6). Dalla descrizione dettagliata e dai risultati sopra riportati, emergono evidenti vantaggi conseguiti mediante l?impiego dei siRNA della presente invenzione. In particolare, tale siRNA si ? mostrato sorprendentemente e vantaggiosamente adatto al trattamento della EEC in pazienti aventi la mutazione R279H del gene p63.
Claims (8)
1. Un siRNA di SEQ ID NO:29.
2. Un siRNA di SEQ ID NO:29, per l?uso come medicamento.
3. Un siRNA di SEQ ID NO:29 per l?uso nel trattamento della Sindrome Ectrodattiliadisplasia Ectodermica-palatoschisi e delle patologie e condizioni collegate alla Sindrome Ectrodattilia-displasia Ectodermica-palatoschisi.
4. L?uso del siRNA secondo la rivendicazione 3, in cui dette patologie e condizioni sono scelte dal gruppo consistente in cheratopatie progressive, blefariti, congiuntiviti, microlesioni superficiali, perforazioni e ulcerazioni spontanee della cornea e disfunzioni dell?epitelio corneale e delle mucose, scarsa riepitelizzazione in seguito a traumi o interventi di cheratoplastica perforante.
5. Una composizione farmaceutica comprendente il siRNA di SEQ ID NO:29 ed eccipienti farmacologicamente accettabili.
6. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 5, in cui detta composizione ? somministrata per via topica, enterale o parenterale.
7. La composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 o 6, in cui detta composizione ? somministrata per via topica, preferibilmente per via oftalmica, cutanea o orale.
8. La composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 7, in cui detta composizione ? in forma liquida di sospensione, emulsione, soluzione, collirio o spray orale, in forma solida di una crema o gel, polvere, granuli, compressa, capsula o pillola.
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