CZ299612B6 - Polypeptid a polynukleotid Neisseria meningitidis, vektor, hostitelská bunka, vakcinacní prostredek, protilátka a zpusob výroby - Google Patents
Polypeptid a polynukleotid Neisseria meningitidis, vektor, hostitelská bunka, vakcinacní prostredek, protilátka a zpusob výroby Download PDFInfo
- Publication number
- CZ299612B6 CZ299612B6 CZ20004202A CZ20004202A CZ299612B6 CZ 299612 B6 CZ299612 B6 CZ 299612B6 CZ 20004202 A CZ20004202 A CZ 20004202A CZ 20004202 A CZ20004202 A CZ 20004202A CZ 299612 B6 CZ299612 B6 CZ 299612B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- polypeptide
- polynucleotide
- sequence
- amino acid
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 287
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 271
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 264
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 218
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 218
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 217
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 31
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 title claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 78
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 96
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 66
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 53
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 52
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 48
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 48
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 40
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 28
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 26
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 26
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 23
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 20
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 19
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 9
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 claims description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 7
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 6
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 claims description 5
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 claims description 5
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 208000034762 Meningococcal Infections Diseases 0.000 claims description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 claims description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 claims description 4
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 claims description 4
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 claims description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 3
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 claims description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 2
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical class O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 claims description 2
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 claims 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 abstract description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 62
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 32
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 24
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 14
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 14
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 11
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 208000037941 meningococcal disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 2
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- KPZGRMZPZLOPBS-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloro-2,2-bis(chloromethyl)propane Chemical group ClCC(CCl)(CCl)CCl KPZGRMZPZLOPBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 101100124874 Caenorhabditis elegans hsf-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 235000017274 Diospyros sandwicensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102100034049 Heat shock factor protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 244000084296 Hernandia moerenhoutiana Species 0.000 description 1
- 235000010044 Hernandia moerenhoutiana Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101001016883 Homo sapiens Heat shock factor protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- 244000062730 Melissa officinalis Species 0.000 description 1
- 235000010654 Melissa officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000588621 Moraxella Species 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 206010062212 Neisseria infection Diseases 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229940122985 Peptide agonist Drugs 0.000 description 1
- 229940083963 Peptide antagonist Drugs 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 101100525628 Picea mariana SB62 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 description 1
- 238000010357 RNA editing Methods 0.000 description 1
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 241000287219 Serinus canaria Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108010031127 Transferrin-Binding Protein B Proteins 0.000 description 1
- 206010046306 Upper respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000004836 empirical method Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150082581 lytA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N n-Triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000001799 protein solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007925 protein solubilization Effects 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 150000003248 quinolines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 229940032094 squalane Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940093609 tricaprylin Drugs 0.000 description 1
- VLPFTAMPNXLGLX-UHFFFAOYSA-N trioctanoin Chemical compound CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC VLPFTAMPNXLGLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
Abstract
Polypeptidy BASB029 a polynukleotidy kódující tyto polypeptidy BASB029 a zpusoby výroby techto polypeptidu rekombinantními technikami. Poskytují se také diagnostická, profylaktická a terapeutická použití.
Description
(57) Anotace
Polypeptidy BASB029 a póly nukleotidy kódující tyto polypeptidy BASB029 a způsoby výroby těchto polypeptidu rekombinantními technikami. Poskytují sc také diagnostická, profy lakliekťi a terapeutická použili.
Polypeptid a polynukleotid Neisseria meningitidis, vektor, hostitelská buňka, vakcinační prostředek, protilátka a způsob výroby
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká polynukleotidu (dále zde označovaných jako „polynukleotid (polynuklcotidy) BASB029 nebo „BASB029“, polypeptidů kódovaných těmito nukleotidy (dále zde označovaných jako ,,BASB029kb nebo „polypeptid (polypeptidy) BASB029). rekombinantních to materiálů a způsobů jejich výroby. Další provedení se týká způsobů použití těchto polypeptidů a polynukleotidů včetně vakcín proti bakteriálním infekcím. V dalším provedení se vynález týká diagnostických testů pro detekci infekce některými patogeny.
Dosavadní stav techniky
Neisseria meningitidix (meningokok) je gramnegativní bakterie, která se často izoluje z lidského horního respiračního traktu. Příležitostně způsobuje invazivní bakteriální onemocnění jako je bakteremie a meningitida. Výskyt meningokokového onemocnění vykazuje geografické sezónní
2o a meziroční rozdíly (Schwartz, B„ Moorc, P. S.. Broome, C. V.; Clin, Microbiol. Rev. 2 (dodatek), SIS — S24, 1989), Většina onemocnění v zemích mírného pásma jc způsobena kmeny sérotypu B a četnost jejich výskytu v celkové populaci kolísá v rozmezí l až 10/100 000 obyvatel/rok (Kaczniarski. E.B. (1997), Cornmun. Dis, Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Seholten, R. J.P. M, Bijlmer, H. A. Poolman. J.T. a další, Clin. Infect. Dis. 16; 237 -- 246. 1993; Cruz. C„ Pavez. G.„
2? Aguilar, E„ a další, Epidemiol. Infect., 105: 119-126, 1990).
Většinou v centrální Africe se vyskytují epidemie s převažující séroskupinou A meningokoků. přičemž někdy je četnost výskytu až 1000/100 000 obyvatel/rok (Schwartz, B„ Moore. P.S.. Broome. C.V., Clin. Microbiol. Rev. 2 (dodatek), SIS — S24, 1989). Téměř všechny případy
3tí meningokokového onemocnění jsou způsobeny meningokoky séroskupiny A. B, C. W-135 a Y a v současnosti je dostupná tetravalentní polysacharidová vakcína A, C. W-135, Y (Armand. J„ Arminjon. E„ Mynard. M.C. Laíaix, C„ J. Biol. Stand. 10: 335 -339. 1982).
Polysacharidová vakcíny se v současnosti stále zlepšují jejich chemickou konjugací s nosnými proteiny (Lieberman. J. M, Chiu, S.S., Wong, V.K., a další, JAMA 275: 1499 -Ί 503. 1996). *
Vakcína pro séroskupinu B není dostupná, protože bylo zjištěno, že kapsu lamí polysacharid typu B je neimunogenní, pravděpodobně proto, že má strukturní podobnost se složkami hostitelského organismu (Wyle, E. A„ Artenstein, M. S„ Brat, M. L. a další, J. Infect. Dis. 126: 514 - 522,
1 972; Finne, J. M„ Leinoncn, M., Makela, P. M. Eancet i i.: 355 - 357, 1983).
Již mnoho let byla prováděna řada výzkumů s cílem vyvinout vakcíny založené na vnější membráně meningokoků (de Moraes, J. C., Perkins. B., Cainargo, M. C. a další, Eancet 340: 1074 1078, 1992; Bjune, G.. I íoiby, E. A., Gromiesby, J. K. a další; 338: 1093 - 1096, 1991), Některé vakcíny prokázaly účinnost u starších dětí (> 4 roky) a u dospívajících od 57 do 85 %.
V těchto vakcínách je přítomno mnoho složek vnější membrány bakterií, jako je PorA, PorB, Rmp, Ope, Opa. FrpB a příspěvek těchto jednotlivých složek k pozorovaně ochraně stále vyžaduje další definice. Použitím zvířecích nebo lidských protilátek se ukázalo, žc některé složky vnější membrány bakterií jsou potenciálně vhodné pro indukci ochranné imunity, jako je TbpB a NspA (Martin, D., Cadieux. N., Hamel, J. Brodeux, B. R, J. Exp. Med. 185: 1173 - 1183. 1997; Lissolo, L, Maitre-Wilmotte, C., Dumas, P., a další, Inf. Imniun. 63: 884-890, 1995). Mechanismy ochranné imunity zahrnují bakteriální aktivitu a opsonofagocytózu vyvolané protilátkou.
- 1 CZ 299612 B6
Pro kombinaci všech mechanismů zprostředkovaných protilátkami byl použit model zvířecí bakteremie (Saukkonen. K„ Leinonen, M„ Abdillahi, H.. Poolman. J. T.. Vaccine 7; 325 - 328. 1989). Obecně přijímaná domněnka je. že baktericidní mechanismus zprostředkovaný pozdní složkou komplementu je klíčový pro vyvolání imunity proti onemocnění meningokoky (Ross.
S. C„ Rosenthal P. J., Berberic. Η. M., Densen, P. J.. Inícct. Dis. 155: 1266 1275, 1987),
Četnost infekcí Neisseria meningitidis v posledních několika desetiletích dramaticky vzrostla. Tento vzrůst byl připisován vzniku kmenů s vícečetnou rezistencí na antibiotika a rostoucím počtem lidí s oslabeným imunitním systémem. Není již neobvyklé izolovat kmeny Neisseria meiiinio gilidis, které jsou rezistentní na některá nebo všechna standardní antibiotika. Tento jev vyvolal naléhavou potřebu nových antimikrobiálních prostředků, vakcín, způsobu pro systematické prozkoumávání léčiv a diagnostických testů na tento organismu.
is Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká BASB029, zvláště polypeptidů BASB029 a polynukleotidů BASB029, rekombinantních materiálů a způsobů jejich výroby. V dalším provedení se vynález týká způsobů použití těchto polypeptidů a polynuklcolidů, včetně mj. prevence a léčení mikro20 biálních onemocnění. V dalším provedení se vynález týká diagnostických testů pro detekci onemocnění spojených s mikrobiálními infekcemi a stavy souvisejícími s těmito infekcemi, jako jsou testy pro detekci exprese nebo aktivity polynukleotidň nebo polypeptidů BASB029.
Ze znění následujícího popisu a jiných částí předkládané přihlášky budou odborníkovi v oboru zřejmé i různé změny a modifikace spadající do podstaty a rozsahu předkládaného vynálezu.
Podrobný popis vynálezu
Předkládaný vynález se týká polypeptidů a polynukleotidň BASR029, které se popisují podrobněji dále. Vynález se zvláště týká polypeptidů a polynukleotidů BASB029 bakterie Neisseria meningitidis, která je příbuzná homologií aminokyselinové sekvence s proteinem povrchových fibril (IISF) Haemophdus influenzae. Předkládaný vynález se zvláště týká BASB029 $ nukleotidovými a aminokyselinovými sekvencemi uvedenými v SPQ ID No: 3 a SEQ ID No.: 2,4.
3? Je zřejmé, že sekvence uváděné ve výpisech sekvencí níže jako „DNA“, znamenají příklad jednoho provedení vynálezu, protože odborníkovi s běžnou znalostí oboru bude jasné, že tyto sekvence mohou být použity v polynukleotidech obecné, včetně ribopolynukleotidů.
Polypeptidy
V jednom provedení předkládaného vynálezu se poskytuji polypeptidy Neisseria meningitidis označované zde jako „BASB029 a „polypeptidy BASB029“ stejně jako jejich biologicky, diagnosticky. profylaktický, klinicky nebo terapeuticky použitelné varianty a prostředky s obsahem těchto látek.
Předkládaný vynález dále poskytuje:
(a) izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 85% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95 % identitu, nejvýhodněji přibližně 97 až 99% nebo přesnou identitu, se sekvencí SEQ ID No.: 2. 4;
(b) polypeptid kódovaný izolovaným polynukleotidem obsahujícím polynuklcotidovou sekvenci, který má alespoň 85% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95%
CZ 299612 Bó identitu, nej výhodněji přibližně 97 až 99% nebo přesnou identitu, se sekvencí SEQ ID No.; 3 v průběhu celé délky SEQ ID No.: 3; nebo (c) polypeptid kódovaný izolovaným polynukleotidem obsahujícím póly nukleotidovou sekvenci, 5 která kóduje polypeptid, který má alespoň 85% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu, nej výhodněji přibližně 97 až 99% nebo přesnou identitu, se sekvencí aminokyselin SEQ ID No.: 2. 4.
Polypeptidy BASB029 poskytované v SEQ ID No.: 2, 4 jsou polypeptidy BASB029 z Neisseria ío meningitidis, kmenů ATCC 13090 a 1144/76.
Vynález také poskytuje imunogenní fragment polypeptidu BASB029, tj. sousedící části polypcptidu BASB029, který' má stejnou nebo v podstatě stejnou imunogenní aktivitu jako polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No.: 2, 4. I zn., že fragment (v případě potřeby navázaný na nosič) je schopen zvýšit imunitní odezvu, která rozpozná polypeptid BASB029.
Takový imunogenní fragment může například zahrnovat polypeptid BASB029 s chybějící Nkoncovou úvodní sekvencí a/nebo transmembránovou doménou a/nebo C-koncovou ukotvovaeí doménou. Ve výhodném provedení obsahuje imunogenní fragment BASB029 podle vynálezu v podstatě veškerou extracelulámí doménu polypeptidu. který má alespoň 85 % identitu, výhod2o něj i alespoň 90 % identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu, nejvýhodněji přibližně alespoň až 99% identitu, vzhledem k SEQ ID No,: 2, 4 po celé délce SEQ ID No.: 2.
Fragment je polypeptid s aminokyselinovou sekvencí, která je zcela stejná jako část, ale ne veškerá jakákoli aminokyselinová sekvence nebo jakýkoli polypeptid podle vynálezu. Stejně jako u polypeptidů BASB029, fragmenty mohou být „samostatné, nebo mohou být obsaženy uvnitř většího polypeptidu, ze kterého tvoří část nebo oblast, nej výhodněji jedinou spojitou oblast v jediném větším polypeptidu.
Mezi výhodné fragmenty patří například zkrácené polypeptidy obsahující ěást aminokyselinové sekvence SEQ ID No.: 2, 4 nebo jejích variant, jako je spojitá řada zbytků, které obsahují aminoa/nebo karboxykoncové sekvence aminokyselin. Výhodné jsou také degradační formy polypeptidů podle vynálezu, které jsou produkovány hostitelskou buňkou nebo v hostitelské buňce. Výhodné jsou dále fragmenty charakterizované strukturními nebo funkčními znaky, jako fragmenty obsahující alfa-helix a oblasti vytvářející alfa-helix, bela-lisl a oblasti vytvářející beta-list.
otáčení a oblasti vytváření otočení, svinutí a oblasti vytvářející svinutí, hydrofilní oblasti, hydrofobní oblasti, alfa-amfipatické oblasti, beta-amfípatické oblasti, pružné oblasti, oblasti tvořící povrch, oblasti vázající se na substrát a oblasti s vysokým indexem antigenicity.
Další výhodné fragmenty zahrnují izolovaný polypeptit zahrnující aminokyselinovou sekvenci obsahující alespoň 15. 20, 30, 40, 50 nebo 100 sousedících aminokyselin z aminokyselinové sekvence SEQ ID No,: 2, 4, nebo izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci zahrnující alespoň 15, 20, 30, 40, 50 nebo 100 sousedících aminokyselin zkrácených nebo vypuštěných z aminokyselinové sekvence SEQ ID No.: 2, 4.
Fragmenty nebo polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro výrobu odpovídajícího polypeptidu s plnou délkou metodou peptidové syntézy; proto mohou být tyto fragmenty použity jako meziprodukty pro výrobu úplných polypeptidů podle předkládaného vynálezu.
Zvláště výhodné jsou varianty, ve kterých je v jakékoli kombinaci provedeno několik, 5-10, 1-5, 1-3. 1-2 nebo 1 substitucí, delecí adicí aminokyselin.
Polypeptidy nebo imunogenní fragmenty podle vynálezu mohou být ve formě „zralého (maturního) proteinu nebo mohou být částí většího proteinu, jako je prekurzor nebo fúzní protein. Často ss je výhodné zahrnout navíc sekvenci aminokyselin, která obsahuje sekvence se sekreční funkcí
- .> CZ 299612 Bó nebo úvodní sekvence, prosekvence. sekvence napomáhající čištění jako jc několik histidinových zbytků nebo dodatečná sekvence pro dosažení stability při výrobě rekombinantního proteinu. Navíc je také možné uvážit přidání exogenního polypeptidu nebo lipidového zakončení nebo póly nukleotidových sekvencí pro zvýšení irnunogenního potenciálu hotové molekuly.
V jednom provedení se vynález týká rozpustných fúzních proteinů získaných metodou genetického inženýrství, které obsahují polypeptid podle předkládaného vynálezu nebo jeho fragment a různé části konstantních oblastí nebo lehkých nebo těžkých řetězců imunoglobulinů různých podtříd (IgG, IgM, IgA, IgE). Jako IgG, zejména IgGl. přičemž fúze probíhá v oblasti ohybu io (hinge region). V konkrétním provedení může být část Ec jednoduše odstraněna přidáním štěpící sekvence, která může být rozštěpena faktorem srážlivosti krve Xa.
Vynález se dále týká způsobů výroby těchto fúzních proteinů metodami genetického inženýrství ajejich použití pro sereening léčiv, diagnózu a terapii. Další provedení vynálezu se také týká polynukleotidu kódujících tyto fúzní proteiny. Příklady technologie fúzních proteinů je možno nalézt v mezinárodních patentových přihláškách WO 94/29458 a WO 94/22914.
Proteiny mohou byl chemicky konjugovány nebo exprimovány jako rekombinantní fúzní proteiny umožňující produkci vyšších koncentrací v expresním systému v porovnání s nefúzovaným proteinem. Fúzní partner může napomáhal při poskytování T hel peřový cli epitopů (imunologický fúzní partner), s výhodou T-helperových epitopů rozpoznávaných u člověka, nebo napomáhat při expresi proteinu (zvyšování exprese) při vyšších výtěžcích, nebo je tomu u nativního rekombinantního proteinu. S výhodou bude fúzním partnerem jak imunologický fúzní partner, tak i partner zvyšující expresi.
Mezi látky s funkcí fúzního partnera patří protein D z Haeniophilus influenzae a nestrukturní protein z viru chřipky, NS 1 (hemaglutinin). Dalším fúzním partnerem je protein známý jako LytA. S výhodu se používá C-koncová část molekuly. Protein LytA je odvozen ze Streptococcus pneutnoniac, která syntetizuje N-acetyl-alaninamidázu. amidázu LytA, (kódovanou genem lytA gen {Gene, 43 (1986), str. 265 - 272}) tedy autolysin, který specificky degraduje některé vazby v peptidoglykanové kostře. C-koncová doména proteinu LytA je odpovědná za afinitu k cholinu nebo některým cholinovým analogům jako je DEAE. Tato vlastnost byla použita pro vyvinutí expresních plazmidů £. coli C-LytA použitelných pro expresi fúzních protein. Purifikace hybridních proteinů obsahujících fragment C-LytA na svých aminových koncích byla již popsána {Biotechnology: 1tí. (1992) str. 795-798}. Je možné používat opakující část molekuly LytA, která se nalézá na C-konci a začíná na zbytku 178, například zbytku 188-305.
Do předkládaného vynálezu také patří varianty výše uvedených polypeptidů, tj. polypeptidy, které se liší od referenčních polypeptidů konzervativními substitucemi aminokyselin, přičemž zbytek je substituován jiným zbytkem s podobnými vlastnostmi. Mezi takové typické substituce patří substituce mezi Ala, Val, Leu a Ile: mezi Ser a Thr; mezi kyselými zbytky Asp a Glu; mezi Asn a Gin; a mezi bazickými zbytky Lys a Arg; nebo aromatickými zbytky The a Tyr,
Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny jakýmkoli vhodným způso45 bem. Mezi tyto polypeptidy patří izolované, v případě se vyskytující polypeptidy , polypeptidy vyrobené rekombinantními technikami, synteticky vyrobené polypeptidy, nebo polypeptidy vyrobené kombinací těchto metod. Prostředky pro výrobu těchto polypeptidů jsou v oboru dobře známy.
Nejvýhodnější je, jestliže je polypeptid podle vynálezu odvozen zNeisscria Meningitidis, ale s výhodou může být získán z jiných organismů stejného taxonomického rodu. Polypeptid podle vynálezu může být také například získán z organismů stejné taxonomické třídy nebo řádu.
-4CZ 299612 B6
Polynukleotidy
Předmětem vynálezu je poskytnutí polynukleotidů, které kódují polypeptidy BASB029. zvláště polynukleotidy, které kódují polypeptid označovaný zde jako BASB029.
Ve zvláště výhodném provedení vynálezu zahrnuje polynukleotid oblast kódující polypeptidy BASB029 obsahující sekvenci uvedenou v SEQ ID No.: 3, která zahrnuje gen s úplnou délkou nebo jeho variantu.
ío Polynukleotidy BASB029 uvedené jako SEQ ID No.: 3 jsou polynukleotidy BASB029 pocházející z kmenů Neisseria metiingilidis H44/76.
V dalším provedení vynálezu se poskytují izolované molekuly nukleotidových kyselin kódujících a/nebo exprimující polypeptidy BASB029 a polynukleotidy, zvláště polypeptidy a poíynukleo15 tidy Neisserid meningitidis BASB029, včetně například neprocesováných RNA, ribozym o vých RNA, mRNA, cDNA, genomových DNA, B- a Z-DNA. Další provedení vynálezu zahrnují biologicky, diagnosticky, profylakticky, klinicky nebo terapeuticky použitelné polynukleotidy a polypeptidy a jejich varianty a prostředky s jejich obsahem.
Další předmět vynálezu se týká izolovaných polynukleotidů včetně alespoň jednoho genu s úplnou délkou, který kóduje polypeptid BASB029 s dedukovanou sekvencí aminokyselin SEQ ID No.: 2, 4, a polynukleotidy s nimi úzce příbuzné a jejích varianty.
V dalším zvláště výhodném provedení vynálezu se poskytuje polypeptid BASB029 z Neisseria meningitidis zahrnující nebo sestávající zc sekvence aminokyselin SEQ ID NO: 2. 4, nebo její varianty.
S použitím zde poskytovaných informací, jako je polynukleotidová sekvence uvedená v SEQ ID No.: 3 může být získán standardními metodami klonování a screeningu, jako jsou metody klono50 vání a sek ve no vání fragmentů chromozomální DNA z bakterie použitím buněk Neisserid tneningifidis jako výchozího materiálu a s následným získáním klonu s úplnou délkou, polynukleotid podle vynálezu kódující polypeptid BASB029. Například pro získání polynukleotidové sekvence podle vynálezu jako jc polynukleotidová sekvence uvedená jako SEQ ID No.: 3, sc typicky testuje knihovna klonů c h ro m o zo m á I n í DNA Ne isseria meningit idis \ E. voli nebo j i ném vhodném hostiteli pomocí radioaktivně značeného oligonukleotidu, s výhodou 17-meru nebo delšího, odvozeného z částečné sekvence. Klony nesoucí DNA identickou s DNA sondy mohou být potom odlišeny použitím podmínek stringentní hybridizace. Sekvenováním jednotlivých klonů, které byly takto pomocí hybridizace identifikovány, sekvenačními primery odvozenými z původní polypeplidové nebo polynukleotidové sekvence, je potom možné prodlužovat polynukleotido4<> vou sekvenci v obou směrech pro zjištění sekvence úplného genu. l oto seke citování se pohodlně provádí například použitím denaturované dvojřetčzcové DNA vyrobené z plazmidového klonu. Vhodné techniky se popisují v publikaci Maniatis, T., Fritsch, E. F., a Sambrook a další, MOLECH UR CLONING, A LABORATORY MANUAL 2. vydání; Cold Spring Harbor Laboratoře Press. Cold Spring Harbor, New York (1989) (viz zvláště část Screening By Hybridization 1,90 a Scquencing Denatured DoublcStraed DNA Tcmplates 13,70). Pro získání genu s úplnou délkou může být také provedeno přímo sekvencování genomické DNA. Pro ilustraci je možno uvést, že každý polynukleotid uvedený v SEQ ID No.: 1, 3 byl objeven v knihovně DNA odvozené z Neisserid meningitidis.
5o Každá sekvence DNA uvedená v SEQ ID No.: 3 navíc obsahuje otevřený čtecí rámec kódující protein s přibližně stejným počtem aminokyselinových zbytků, jako se uvádí v SEQ ID No.: 2, 4 s dedukovanou molekulovou hmotností aminokyselinových zbytků, které jsou dobře známé odborníkům v oboru.
- 5 CZ 299612 B6
Polynuklcotid sekvence SEQ ID No.: 1 kóduje mezi startem kodonem na nukleotidu číslo 1 a stop kodonem, který’ začíná na nukleotidu číslo 1782 SEQ ID No.: 1, polypeptid SEQ ID No.: 2.
Polynukleptid SEQ ID No.: 3 mezi startem kodonem na nukleotidu číslo 1 a stop kodonem. který začíná na nukleotidu 1774 SEQ ID No.: 3. kóduje polypeptid SEQ ID No.: 4.
V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález izolovaný polynuklcotid. který obsahuje nebo který7 se skládá z:
1« (a) polynukleotidové sekvence, která má alespoň 85% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu, nejvýhodněji alespoň 97 až 99% nebo přesnou identitu, se SEQ ID No.: 3 podél cele délky SEQ ID No.: 3; nebo (b) polynukleotidové sekvence kódující polypeptid. který má alespoň 85% identitu, výhodněji alespoň 90% identitu, ještě výhodněji alespoň 95% identitu, ještě výhodněji alespoň 97 až 99% nebo 100% přesnou identitu, se sekvencí aminokyselin SEQ ID No.: 2, 4 podél celé délky SEQ lDNo.:2, 4.
Polynukleotid kódující polypeptid podle předkládaného vynálezu včetně homologů a orthologů z druhů jiných než je Nedušena meningitidis. mohou být získány způsobem zahrnujícím kroky screeningu vhodné knihovny za podmínek stringentní hybridizace (například s použitím teploty v rozmezí 45 až 65 °C a při koncentraci SDS od 0,1 do 1%) se značenou nebo detekovatelnou sondou, která je složená nebo která obsahuje sekvenci SEQ ID No.: 3 nebo její část; a izolací úplného genu a/nebo genomických klonů obsahujících uvedenou polynukleotidovou sekvenci.
Vynález poskytuje polynukleotidovou sekvenci, která je identická po celé své délce s kódující sekvencí (otevřený čtecí rámec) v SEQ ID No.: 3. Vynález také poskytuje kódující sekvenci pro zralý polypeptid nebo jeho fragment samu o sobě stejně jako kódující sekvenci pro zralý polv30 peptid nebo fragment uvnitř čtecího rámce s jinou kódující sekvencí, jako je sekvence kódující úvodní nebo sekreční sekvenci, pre- nebo pro- nebo preproproteinovou sekvenci. Póly nukleotid podle vynálezu mříže také obsahovat alespoň jednu nekódující sekvenci, včetně například bez omezení alespoň jedné nekódující sekvence na 5’ a 3’ konci, jako jsou přepisované, ale nepřekládané sekvence, terminační signály (jako jsou rho-independentní a rho-independcnlní terminační signály), vazebná místa ribozomů. Kozákovy sekvence, sekvence stabilizující mRNA, introny a polyadenylační signály.
Polynukleotidová sekvence může také obsahovat další kódující sekvenci, která kóduje další aminokyseliny. Například může být zakódována markerová sekvence, která umožňuje purifikaeí fúzovaného polypeptidu. V některých provedeních vynálezu je markerovou sekvencí hexahistidinový peptid. jak jej poskytuje vektor pQE (Qiagen, lne.), a který se popisuje v publikaci Gentz a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 86: 821-824 (1989), nebo značku (tag) Ha peptidu (Wilson a další, Cell 37: 767 (1984), které mohou být oba použily při čištění s nimi fúzované polypeptidové sekvence. Polypeptidy podle vynálezu také bez omezení zahrnují polynukleotidy obsahující strukturní gen a s ním přirozeně asociované sekvence, které řídí genovou expresi.
Nukleotidová sekvence kódující polypeptid BASB029 SEQ ID No,; 2, 4 může být identická s polypeptidovou kódující sekvencí obsaženou v nukleotidech 1 až 1782 SEQ ID No.: 1, nebo sekvencí kódující polypeptid obsaženou v nukleotidech 1 až 1773 SEQ ID No.: 3. Alternativně může jít o sekvenci, která je důsledkem redundance (degenerace) genetického kódu, a která také kóduje polypeptid SEQ ID No.; 2,4.
Termín „polynukleotid kódující polypeptid , jak sc zde používá, zahrnuje polynukleotidy, které obsahují sekvenci kódující polypeptid podle vynálezu, zvláště bakteriální polypeptid a konkrét55 něj i polypeptid Ne is sen a meningtiidis BASB029 s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ
-6CZ 299612 B6
ID No.: 2, 4. Tento termín také zahrnuje polynukleotidy. které obsahují jedinou spojitou oblast nebo nespojité oblasti kódující polypeptid (například polynukleotidy přerušené integrovaným fágem. integrovanou vloženou sekvencí, integrovanou vektorovou sekvencí, integrovanou transpozonovou sekvencí, nebo nespojitou v důsledku editace RNA nebo reorganizace genomové
DNA) spolu s dalšími oblastmi, které mohou rovněž obsahovat kódující a/nebo nekódující sekvence.
Vynález se dále týká variant polynukleotidů popisovaných v přihlášce, které kódují varianty polypeptidů s dedukovanou aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No: 2.4, ío
Fragmenty polynukleotidů podle vynálezu mohou být například použity pro syntézu úplných (Tull-length) polynukleotidů podle vynálezu.
Další zvláště výhodná provedení jsou polynukleotidy kódující varianty BASB029, které mají i? aminokyselinovou sekvenci polypeptidů BASB029 SEQ ID No.: 2,4, ve které jsou několik, málo počet, 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3. 2, 1 nebo žádný zbytek aminokyseliny nahrazeny, modifikovány, vypuštěny a/nebo přidány, přičemž možná je jakákoli kombinace. Mezi těmito případy jsou zvláště výhodné tzv. mlčící (silent) substituce, adice nebo delece, které nemění vlastnosti a účinky polypeptidů BASB029.
Další výhodná provedení podle vynálezu jsou polynukleotidy, které mají alespoň 85% identitu po celé jejich délce s polynukleotidem kódujícím polypeptid BASB029 s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID No.: 2,4 a polypeptidy. které jsou s těmito uvedenými polynukleotidy komplementární. V této souvislosti jsou zvláště výhodné polynukleotidy s alespoň 90% identitou po celé jejich délce se stejným výše uvedeným polynukleotidem. a mezi nimi jsou zvláště výhodné polynukleotidy, které mají identitu alespoň 95 %. Navíc jsou v této skupině polynukleotidů s identitou 95% vysoce výhodné polynukleotidy s identitou alespoň 97% a mezi těmito jsou zvláště vysoce výhodné polynukleotidy s identitou alespoň 98 % a alespoň 99 %, přičemž ještě výhodnější je identita 99 %.
Mezi výhodná provedení patří polynukleotidy kódující polypeptidy, které si zachovávají v podstatě stejnou biologickou funkci nebo aktivitu jako zralý polypeptid kódovaný DNA SEQ ID No.: 3.
Podle jednoho z výhodných provedení se poskytují polynukleotidy, které hybridizují, zvláště za stringentních podmínek, s polynukleotidovými sekvencemi BASB029, jako jsou polynukleotidy v SEQ ID No.: 3.
Vynález se dále týká polynukleotidů, které hybridizují se zde poskytovanými polynukleotidový40 mi sekvencemi, V tomto ohledu se vynález týká zvláště polynukleotidů, které hybridizují s popisovanými polynukleotidy za stringentních podmínek. Jak se zde používá, termíny „stringentní podmínky a „stringentní podmínky hybridizace zaznamenají hybridizací* ke které dojde pouze v případě, jestliže je mezi sekvencemi shora alespoň 95 % a s výhodou alespoň 97 %. Konkrétním příkladem podmínek stringentní hybridizace je inkubace přes noc při teplotě 42 °C v roztoku obsahujícím 50% formamid, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM citran trqjsodný), 50mM fosforečnan sodný (pH 7,6), 5 x Denhardtův roztok, 10% sulfát dextranu a 20 pg/ml denaturované DNA lososího spermatu upravené působením střižných sil, a s následným promýváním hybridizačního nosiče v pufru 0,1 x SSC při přibližně 65 °C. Podmínky hybridizace a praní jsou dobře známé a jejich příklady se uvádějí v publikaci Sambrook, a další. Molecular Cloning: A Laboratory'
Manual. druhé vydání, Cold Spring Harbor. N. Y. (1989), zvláště v kapitole 11. U polynukleotidových sekvencí podle předkládaného vynálezu může být také použita hybridizace v roztoku.
Vynález také poskytuje polynukleotid složený z nebo obsahující polynukleotidovou sekvenci získanou sereeningem vhodné knihovny obsahující úplný gen pro polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID No.: 3 za stringentních podmínek hybridizace pomocí sondy, která má
- 7 CZ 299612 Bó sekvenci léto polynukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID No.; 3 nebo její fragment; a izolací této polynukleotidové sekvence. Mezi fragmenty použitelné pro získání takového polynukleotidu patří například sondy a primery', které se zde popisují na jiných místech.
? Jak bude diskutováno na jiných místech například ve vztahu k testování polynukleotidů podle vynálezu, tylo polynukleotidy mohou být použity jako hybridizační sonda pro RNA, cDNA a genomovou DNA pro izolací cDNA s úplnými délkami a genomickýeh klonů kódujících BASB029 a pro izolaci cDNA a genomickýeh klonů jiných genů, které mají vysokou identitu, zvláště vysokou sekvenční identitu, s genem BASB029. Tyto sondy budou obecně obsahovat alespoň 15 nukleotidových zbytků nebo párů bází. S výhodou budou mít tyto sondy alespoň 30 nukleotidových zbytků nebo páru bází a mohou obsahovat alespoň 50 nukleotidových zbytků nebo párů bází. Zvláště výhodné sondy budou obsahovat alespoň 20 nukleotidových zbytků nebo párů bází a budou zároveň obsahovat méně než 30 nukleotidových zbytku nebo párů bází.
Kódující oblast genu BASB029 může být izolovaná screeningem použitím sekvence DNA poskytované v SEQ ID No.: 3 pro syntézu oligonukleotidové sondy. Značný oligonukleotid se sekvencí komplementární k sekvenci genu podle vynálezu a potom použije pro screenmg knihovny cDNA, genomické DNA nebo mRNA pro zjištění, které molekuly z knihovny s touto sondo hybridizují.
2(1
V současnosti je k dispozici několik způsobů pro získání molekul DNA s plnou délkou nebo pro prodlužování krátkých úseků DNA, které jsou známé odborníkům v oboru, například způsoby založené na metodě Rapid Amplification of cDNA ends (R ACE) (viz například Frohman, a další. PNAS USA 85: 8998 - 9002, 1988). Nedávné modifikace této techniky, které se například nazý25 vají Marathon,M technology (Clontech Laboratories lne.), podstatně zjednodušily hledání delších molekul cDNA, V technologii MarathonIM byly připraveny cDNA z mRNA extrahované ze zvolené tkáně a „ad a pt ořové“ sekvence navázané na oba konce. Potom se provádí amplifikace nukleové kyseliny (PCR) pro namnožení „chybějícího“ 5’- konce DNA s použití kombinace oligonukleotidových primerů specifických pro gen a pro adaptor. Reakce PCR se potom opakuje s použitím „nested“ primerů, tj. primerů navržených tak, aby teplotně hybridizovaly s amplifikovaným produktem (typicky primer specifický pro adaptor, který teplotně hybridizuje dále od 3konce adaptorové sekvence a primer specifický pro gen. který teplotně hybridizuje od 5'-konce zvolené genové sekvence). Produkty této reakce mohou být potom analyzovány sekvenováním DNA a úplná DNA může být zkonstruována buď navázáním produktu přímo na existující DNA
3? za získání úplné sekvence, nebo provedením oddělené PCR s plnou délkou s použitím nové informace o sekvenci pro návrh primerů 5'.
Polynukleotidy a polypeptidy podle vynálezu mohou být použity například jako reakění činidla pro výzkum a materiály pro výzkum léčení a diagnózy onemocnění, zvláště onemocnění člověka.
jak bude dále diskutováno v souvislosti s analýzami polynukleotidů.
Polynukleotidy podle vynálezu, které jsou oligonukleotidy odvozené se sekvence SEQ ID No.: 2 - 4, mohou být použity u zde popisovaných způsobu, ale s výhodou pro PCR, pro zjištění, zda jsou nebo nejsou zde identifikované polynukleotidy v bakterii nebo infikované tkání zcela nebo zčásti transkribovány. Tyto sekvence budou také použity při diagnóze stadia infekce a typu infekce vyvolané patogenem.
Vynález také poskytuje polynukleotidy, které kódují polypeptid, který je zralým proteinem, plus další amino- nebo karboxykoncové aminokyseliny, nebo aminokyseliny uvnitř zralého póly pept i50 du (jestliže například zralá forma obsahuje více než jeden polypeptidový řetězec). Tyto sekvence mohou mít mj. úlohu při úpravě (procesování) proteinu z formy prekurzorů do formy zralého proteinu, mohou umožňovat transport proteinu, mohou prodlužovat nebo zkracovat poločas proteinu nebo mohou umožňovat manipulaci s proteinem pro testování nebo výrobu. Jak je tomu obecně in vivo, další aminokyseliny mohou být procesovány mimo zralý protein celu lamím i enzymy.
-8CZ 299612 B6
Pro každý polynukleotid podle vynálezu se poskytuje polynukleotid, který je s ním komplementární. Je výhodné, jestliže jsou tyto komplementární polynukleotidy úplně komplementární ke každému polynukleotidu, se kterým jsou komplementární.
Prekurzorový protein, který obsahuje zralou formu polypeptidu fúzovanou k jedné nebo více prosekvencím může být inaktivní forma polypeptidu. Když se prosek vence odstraní, tyto inaktivní prekurzory se obecně aktivují. Některé nebo všechny prosekvence mohou být před aktivací odstraněny. Obecně se takové prekurzory nazývají proproteiny.
Navíc kc standardním označením nukleotidů A. G, C. T/U může být pro popis určitých polynukleotidů podle vynálezu použito označení „N”. ,.N znamená, že na takto označené poloze v sekvenci DNA nebo RNA se může objevit jakýkoli ze čtyř nukleotidů DNA nebo RNA, avšak je výhodné, jestliže N není nukleové kyselina, která by poskytla, pokud se provádí čtení ve správném čtecím rámci a pokud se N bere v kombinaci se sousedícími kombinacemi nukleotidů, kodon předčasné terminace takového čtecího rámce.
Je tedy možné shrnout, že polypeptid podle vynálezu může kódovat zralý protein, zralý protein plus úvodní sekvenci {který může být označovaný jako preprotein), prekurzor zralého proteinu obsahující jednu nebo více prosekvcncí. které nejsou úvodními sekvencemi preproteinu. nebo preprotein. který'je prekurzor proproteinu, a který' obsahuje úvodní sekvenci a jednu nebo více prosekveneí, které se obecně v průběhu kroku procesování odstraní za vytvoření aktivní a zralé formy polypeptidu.
Podle jednoho provedení vynálezu se poskytuje použití polypeptidu podle vynálezu pro terapeutické nebo profylaktícké použití, zvláště genetickou imunizaci.
Použití polynukleotidu podle předkládaného vynálezu při genetické imunizaci bude obvykle využívat vhodné metody dodávání, jako je přímá injekce plaz.midové DNA do svalů (Wolff a dal30 ší, Hum. Mol. Genet. (1992) 1:363. Manthorpe a další. Huni. Gene Ther. (1983) 4; 419). dodání DNA v komplexu sc specifickými proteinovými nosiči (Wu a další, 7. Biol. Chem. (1989) 264: 16985). koprecipitace DNA s fosforečnanem vápenatým (Benvenisty & Reshef. PNAS USA. (1986) 85: 9551), zapouzdre η í DNA v různých forrnáeh liposomů (Kaneda a další, Science (1989) 243: 375), bombardování částicemi (Tang a další. Nátuře (1992) 356: 152, Eiscnbraun a další, DNA Cell. Biol. (1993) 12: 791) a infekce in vivo s využitím klonovaných retrovirálních vektorů (Seeger a další, PNAS USA (1984)81: 5849).
Vektory; hostitelské buňky, expresní systémy ío Vynález se také týká vektoru obsahujících polynukleotid nebo polynukleotidy podle vynálezu, hostitelských buněk, které jsou vytvořeny metodou genetického inženýrství vektory podle vynálezu a výroba polypeptidů podle vynálezu rekombinantními technikami. Pro výrobu lakových proteinů mohou být také použity bezbuněčné translační systémy použitím kyselin RNA odvozených z konstruktů DNA podle vynálezu.
Rekombinantní polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být vyrobeny způsoby dobře známými odborníkům v oboru z hostitelských buněk připravených genetickým inženýrstvím a obsahujících expresní systémy. V dalším provedení se tedy předkládaný vynález týká expresních systémů, které obsahují polynukleotid nebo polynukleotidy podle předkládaného vynálezu.
hostitelských buněk, které byly získány metodami genetického inženýrství s použitím těchto expresních systémů a výroby polypeptidů podle vynálezu rekombinantními technikami.
Pro rekombinantní výrobu polypeptidů podle vynálezu mohou být hostitelské buňky upraveny metodami genetického inženýrství tak, aby obsahovaly expresní systémy nebo jejich části nebo
-9CZ 299612 B6 polynukleotidy podle vynálezu. Zavedení polynukleotidu do hostitelské buňky může být uskutečněno způsoby popsanými v mnoha standardních laboratorních manuálech, jako je Davis. a další, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) a Sambrook, a další MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor N.Y. (1989). jako je například transfekce použitím fosforečnanu vápenatého, transfekce zprostředkovaná DEAE dextranem. transvekce, mikroinjekce, transfekce zprostředkovaná kationtovým lipidem, elektroporace. transdukce. vnášení škrábání, balistické vnášení a infekce.
io Reprezentativními příklady vhodných hostitelů jsou například bakteriální buňky, jako jsou buňky streptokoků, stafylokoků, enterokoků. E, coli. streptomyeet. kyanobakterií, Bacillus subti/is, Moraxella calarrhalis, Haemophilus influenzae a Neisseria meningitidis; buňky hub, jako jsou kvasinkové buňky. Kluveromyces, Saccharomyces, a basidiomycety, Candida albicans a Aspergillus; hmyzí buňky jako jsou buňky Drosophila S2 a Spodoptera SEE živočišné buňky jako jsou buňky CHO. COS, HeLa. Cl 27, 3T3, BHK, 293, CV-I a buňky Bowesova melanomu; rostlinné buňky, jako jsou buňky gymnospermu nebo angiospermu.
Pro výrobu polypeptidů podle vynálezu může být použita celá řada expresních systémů. Mezi takové vektory patří mj. vektory odvozené z chromozomů, epizomů a vírů, například vektory odvozené z bakteriálních plazmidů, bakteriofágů, transpozonň. kvasinkových epizomů. inzerčních elementů, kvasinkových chromozomálních elementů, virů jako jsou bakuloviry, papovavirv. jako je SV40, vakcinie, adenoviry; viry drůbežích neštovic, viry' pseudorabies, pikornaviry, retroviry a alfaviry a vektory' odvozené zjcjicb kombinací, jako jsou vektory odvozené zpiazmidových a bakteriofágových genetických elementů, jako jsou kosmidy a fágmidy. Konstrukty expresních systémů mohou obsahovat řídicí oblasti, které regulují a připravují expresi. V tomto smyslu může být pro expresi obecně použit jakýkoli systém nebo vektor vhodný pro udržování, propagaci nebo expresi polynukleotidů a/nebo pro expresi polypeptidu v hostiteli. Do expresního systému může být vložena příslušná sekvence DNA jakoukoli zrady známých a rutinních technik, jako jsou například postupy uváděné v knize Sambrook a další. MOLECULAR CLONING.
A LABORATORY MANUAL (výše).
U rekombinantních expresních systémů v eukaryotických organismech mohou být zavedeny do exprimovaného polypeptidu vhodné sekreční signály pro umožnění sekrece předkládaného proteinu do lumcn endoplazmatického retíkula, do periplazmatického prostoru nebo do extraxclulár35 ního prostředí. Tyto signály mohou být ve vztahu k polypeptidu endogenní nebo může jít o heterologní signály.
Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány a čištěny z rekombinantních buněčných kultur známými způsoby, včetně srážení síranem amonným nebo ethanolem, extrakce to kyselinami, aniontovou nebo kationtovou iontoměničovou chromatografií, fosfocelulózovou chromatografií, chromatografií využívající hydrofobní interakce, afinitní chromatografií, hydroxyiapatitovou chromatografií a lecitinovou chromatografií. Nejvýhodněji se pro čištění používá afinitní chromatografíe s ionty kovů (ion metal afinity cliromatography, 1MAC). Pro regeneraci aktivní konformace proteinů v případě denaturace polypeptidu během intracelulámí syntézy, izo45 láce a/nebo purifikace mohou být použity dobře známé techniky refoldingu.
Jako expresní systém může být také použit rekombinantní živý organismus, jako je virus nebo bakterie. Příslušný gen může být vložen do genomu živé rekombinantní bakterie nebo viru. Inokulace a infekce in vivo tímto živým vektorem povede k expresi antigenů in vivo a indukci imu50 nitních odpovědí. Viry a bakterie používané k tomuto účelu jsou například viry neštovic (např. vakcinia. drůbeží neštovice, kanárci neštovice), alfaviry (Sindbis virus. Semliki Forest Virus, Venezuelian Eqtiin Encephalitis Virus), adenoviry; viry spojené s adenoviry, pikornaviry (poliovirus, rhinovirus), hepesviry (varicella zoster virus, atd), Listeria, Sahnonella. Shigella, Neisseria, BCG. Tyto viry a bakterie mohou být virulentní nebo oslabené různými způsoby pro získání živých vakcín. Tyto živé vakcíny tvoří také část vynálezu.
- 10CZ 299612 B6
Diagnostické, prognostické, sérotypové a mutační testy
Tento vynález je také zaměřen na použití polynukleotidů a polypeptidu BASB029 podle vynálezu pro použití jako diagnostických reagencií. Detekce polynukleotidů a/nebo polypeptidů BASB029 v eukaryotech, zvláště savcích a zvláště u člověka poskytuje diagnostickou metodu pro diagnózu onemocnění, stadia onemocnění nebo odpovědi infekčního organismu na léčiva. Eukaryoty. zvláště savci a zvláště člověk, zvláště jedinci infikovaní nebo s podezřením na infekci organismem obsahujícím gen nebo protein BASB029, mohou být detekovány na úrovni nukleových ío kyselin nebo aminokyselin řadou dobře známých způsobů stejně jako použitím zde popisovaných metod.
Polypeptidy a polynukleotidy pro prognózu, diagnózu nebo jiné analýzy mohou být získány z domněle infikovaných a/nebo infikovaných tělesných materiálů jednotlivců. Polynukleotidy i? z jakýchkoli těchto zdrojů, zvláště DNA nebo RNA, mohou být použity přímo pro detekci nebo mohou být enzymaticky amplífíkovány použitím PCR nebo jiné techniky amplífikace před analýzou. Stejnými způsoby také mohou být použity RNA, zvláště mRNA, cDNA a genomová DNA.
Použitím amplífikace může být provedena analýzou genotypu zvoleného polynukleotidu organismu charakterizace druhů a kmenů infekčního organismu nebo organismu přítomného v jednotliv20 ci. Delece nebo inzerce mohou být detekovány změnou velikosti amplifikovaného produktu v porovnání s genotypem referenční sekvence zvolené z příbuzného organismu, s výhodou rozdílných druhů stejného rodu nebo rozdílných kmenů stejného druhu. Bodové mutace je možno identifikoval hybrid izací ampl i fi kované DNA se značenými polynukleotidovýini sekvencemi BASB029. Úplně nebo významným způsobem souhlasí sekvence mohou být odlišen z nedosta25 tečně nebo podstatněji odlišných duplexů štěpením DNázou nebo RNázou pro DNA. popřípadě RNA, nebo detekcí rozdílů v teplotách tání nebo renaturačních kinet i kách. Rozdíly v póly nukleotidové sekvenci mohou být také detekovány přímým sekvenováním DNA nebo RNA, viz například Myers a další, Science. 230: 1242 (1985). Změny sekvence v určitých specifických polohách mohou být také odhaleny testy s nukleázovým chráněním, jako jsou testy s RNázovou. VI a Sl ochranou nebo metody chemického štěpení, viz například Cotlon a další. Proč. Natí Acad. Sci.. IJSA, 85:4397-4401 (1985).
V dalším provedení je možno vytvořit soubor oligonuklcotidových sond obsahující nukleotidovou sekvenci BASB029 nebo její fragmenty, pro provádění účinného screeningu například gene35 tických mutací, sérotypu. taxonomické klasifikace nebo identifikace. Metody technologie souborů (arrav technology) jsou dobře známé a jsou obecně použitelné a mohou být použity vyřešení řady otázek v molekulární genetice včetně genové exprese, genetického propojování a genetické variability (viz například Chee a další. Science, 274: 610 (1996)).
to V dalším provedení se tedy předkládaný vynález týká diagnostického kitu. který zahrnuje:
(a) polynukleotid podle předkládaného vynálezu, s výhodou s nukleotidovou sekvencí SEQ ID No. 3, nebo její fragment;
(b) nukleotidovou sekvenci komplementární sc sekvencí podle odstavce (a);
(c) polypeptid podle předkládaného vynálezu, s výhodou polypeptid SEQ ID No.: 2. 4 nebo jeho fragment; nebo (d) protilátku proti polypeptidu podle předkládaného vynálezu, s výhodou proti polypeptidu SEQ
ID No.: 14.
Bude zřejmé, že každý takový kit (a), (b), (c) nebo (d) může obsahovat podstatnou složku. Kit tohoto typu bude mj. použitelný pří diagnostice onemocnění nebo vnímavosti na onemocnění.
Předkládaný vynález se týká také použití polynukleotidů podle předkládaného vynálezu jako diagnostických činidel. Detekce mutované formy polynukleotidů podle vynálezu, s výhodou SEQ ID No.: 3, která je asociovaná s onemocněním nebo patogenitou. nebo poskytovat diagnostický ? nástroj, který může přispět k vyřešení nebo definovat diagnózu onemocnění, prognózu průběhu onemocnění, určení stadia onemocnění, nebo zjištění vnímavosti na onemocnění, které je důsledkem nedostatečné exprese, nadměrné exprese nebo změněné exprese polynukleotidů. Organismy, zvláště infekční organismy nesoucí mutace v takovém polynukleotidů mohou být detekovány na polynukleotidové úrovni řadou způsobů, jako jsou způsoby popisované v předkládané přihlášce na j i ných místech.
Buňky z organismu nesoucí mutace nebo polymorfismy (alelické variace) v polynukleotidů a/nebo polypeptidu podle vynálezu mohou být detekovány na úrovni polynukleotidů nebo polypeptidů řadou způsobu, což například umožní zařazení podle sérotypů. Pro detekci mutací v RNA je is například možno použít RT-PCR. Zvláště výhodné je použití metody RT-PCR spolu s automatickými detekčními systémy, jako je například GeneScan. Pro stejný účel PCR mohou být také použity RNA, cDNA nebo genomické DNA. Jako příklad je možno uvést použití primerů PCR komplementárních k polynukleotidů kódujícímu polypeptid BASB029 pro identifikace a analýzu mutací.
Vynález dále poskytuje primery; u nichž byly odstraněny 1, 2. 3 nebo 4 nukleotidy z 5' a/nebo 3' konce. Tyto primery mohou být použity mj. pro amplifikaci BASB029 DNA a/nebo RNA izolovaných ze vzorku odvozeného z jednotlivce, jako například tělesného materiálu. Tyto primery mohou být použity pro amplifikaci polynukleotidů izolovaného z infikovaného jednotlivce tak, že tento polynukleotid může být potom testován různými způsoby s cílem zjistit sekvenci polynukleotidu. Tímto způsobem je možno detekovat mutace v sekvenci polynukleotidů a výsledky použít pro diagnózu a/nebo prognózu infekce nebo jejího stadia nebo průběhu, nebo pro zjištění sérotypů a/nebo klasifikaci infekčního činidla.
Předkládaný vynález dále zahrnuje způsob diagnostiky onemocnění, s výhodou bakteriálních infekcí, ještě výhodněji infekcí způsobených Neisseria meningitidis, který zahrnuje zjištění zvýšené míry' exprese polynukleotidů se sekvencí SEQ ID No,; 3 ve vzorku odebraného z jednotlivce, jako je tělesný materiál. Zvýšenou nebo sníženou expresi polynukleotidů BASB029 je možno měřit použitím jakékoli z metod známých v oboru zaměřených na kvantitativní stanovení polynukleotidů, jako je například amplifikace, PCR, RT-PCR, RNázová ochrana, northernový přenos, spektrometria a jiné metody hybridizace.
Navíc je možno použít diagnostického testu podle vynálezu pro detekci nadměrné exprese polypeptidu BASB029 v porovnání se vzorky normální kontrolní tkáně například pro detekci přítom40 nosti infekce. Metody testu budou způsoby používané pro stanoveni hladin polypeptidu BASB029 ve vzorku odebraném hostiteli, jako je tělesný materiál, přičemž tyto způsoby jsou v oboru dobře známé, Mezi tyto testovací metody patří radioímunologické analýzy, testy využívající kompetitivní vazby, analýza Westernovým přenosem, sendvičové proti látkové analýzy, detekce protilátek a metody ELISA.
Polynukleotidy podle vynálezu mohou být použity jako složky polynukleotídových polí, s výhodou polí nebo mříži s vysokou hustotou. Tato pole s vysokou hustotou jsou zvláště použitelná pro diagnostické a prognostické účely. Například pro zjištění přítomnosti určité polynukleotidové sekvence nebo příbuzné sekvence u jednotlivce je možné použít souboru bodově nanesených
5o materiálů (spots), přičemž každý člen souboru obsahuje různý gen, a dále obsahuje polynukleotid nebo polynukleotidy podle vynálezu, a testování pomocí sondy, například získané hybridizaci nebo amplifikaci nukleové kyseliny získané z tělesného vzorku. Taková přítomnost může indikovat přítomnost patogenů, zvláště Neisseria meningitidis, a může být použitelná při diagnóze a/nebo prognóze onemocnění nebo průběhu onemocnění. Výhodné jsou mříže obsahující řadu variant póly nukleotidové sekvence SEQ ID No.: 3. Výhodná je také mříž obsahující řadu variant polynukleotidové sekvence kódující polypcptidovou sekvenci SEQ ID No.: 2.4.
Protilátky
Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu nebo jejich varianty nebo buňky exprimující tyto látky mohou být použity jako imunogeny pro vytvoření protilátek, které jsou imunospecifické pro tyto polypeptid. popřípadě polynukleotidy.
ίο V některých výhodných provedeních podle vynálezu se poskytují protilátky proti polypeptidům nebo polynukleotidům BASB029.
Protilátky vytvořené proti polypeptidům nebo polynukleotidům podle vynálezu mohou být získány podáváním polypeptidů a/nebo polynukleotidů podle vynálezu, nebo fragmentů nesoucích epi15 topy jedné nebo obou těchto skupin, analogů jedné nebo obou těchto skupin nebo buněk exprimujícíeli zástupce jedné nebo obou skupin zvířeti, s výhodou zvířeti odlišnému od člověka, použitím rutinních protokolů. Pro výrobu monoklonálních protilátek je možno použít jakékoli techniky známé v oboru, která poskytuje protilátky produkované kontinuálními buněčnými kulturami. Mezi příklady patří různé techniky, například popisované v Koliler, (i. a Milslein. C„
Nátuře 256: 495 - 497 (1975); Kozbor a další, Imunology Podav 4: 72 (1983); Col a další. sir. 77 - 96 v MONOCLONAL ANTIBODIES A CANCER EHERAPY. Alan R. Eiss, lne. (1985).
Způsoby produkce jednořetězcových protilátek (patent US 4 946 778) mohou být upraveny pro produkci jednořetězcových protilátek proti polypeptidům nebo polynukleotidům podle předkláda25 ného vynálezu. Pro expresi humanizovaných protilátek imunospeciflckých vůči polypeptidům nebo polynukleotidům podle vynálezu mohou být také použity transgenní mvši nebo jiné organismy nebo Živočichové, jako jsou jiní savci.
Pro volbu genu pro protilátky s vazebnými aktivitami vzhledem k polypeptidu podle vynálezu může být také použita technologie typu phage display, bud' ze skupiny v-genů nebo lymfocytů amplifikovaných PCR z lidí. u kterých byl proveden sereening na aktivitu anti—BASB029. nebo z knihoven (McCafťcrty, a další (1990). Nátuře, 348, 552 - 554; Marks, a další (1992), Biotechnofogv, 10, 779 - 783). Afinita těchto protilátek může být také zlepšena například mícháním řetězců (Clackson, a další (1991), Nátuře, 352:628).
Výše popisované protilátky mohou být použity pro izolaci nebo pro identifikaci klonů exprimujících polypeptidy nebo polynukleotidy podle vynálezu pro čištění polypeptidů nebo polynukleotidů například afinitní chromatografií.
l ak například protilátky proti polypeptidu BASB029 nebo polynukleotidů BASB029 mohou být použity pro léčení infekcí, zvláště bakteriálních infekcí.
Mezi varianty polypeptidů patří antigenně, epitopově nebo imunologicky ekvivalentní varianty; tyto varianty tvoří další zvláštní provedení předkládaného vynálezu.
Protilátka nebo její varianta je s výhodou modifikována, aby bylo dosaženo její menší imunogenicity u jednotlivce. Jestliže jc například tímto jedincem člověk, protilátka může být nej výhod něj i „humanizována, kde oblast nebo oblasti protilátky odvozené zhybridomu určují komplementaritu, jsou transplantovány do lidské monoklonální protilátky, například jak se popisuje v Joncs a další (1986), Nátuře, 321, 522 - 525 nebo Tempest. a další (1991), Bioteehudo^v, 9, 266 273.
CZ 299612 Bó
Látky s antagonistickým a agonistickým účinkem, testy a molekuly
Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu mohou být také použity pro testování vazby sub5 strátů a ligandů s malou velikostí molekuly, například v buňkách, bezbuněčných preparátech, chemických knihovnách a směsích přírodních produktů. Tyto substráty a ligandy mohou být přírodní substráty a ligandy, nebo mohou napodobovat struktur nebo funkci těchto látek, viz např. Coligan, a další, Current Protocoh in 1 mimo logy (2): kapitola 5 (1991).
Metody screeningu mohou jednoduše měřit vazbu sloučeniny připadající v úvahu na polypeptid nebo polynukleotid, nebo na buňky nebo membrány nesoucí polypeptid nebo poly nukleotid. nebo fúzní protein polypeptidu prostřednictvím značky, která je přímo nebo nepřímo spojená se sloučeninou připadající v úvahu. Alternativně může metoda screeningu zahrnovat kompetitivní reakci se značeným kompetitorem. Navíc mohou tyto metody screeningu testovat, zda sloučenina připa15 dající v úvahu poskytuje signál vytvořený aktivací nebo inhibici polypeptidu nebo polynukleotidu, s použitím detekčních systémů vhodných pro buňky obsahující polypeptid nebo polynukleotid. Inhibitory' aktivace se obecně testují v přítomnosti známého agonisty a pozoruje sc vliv na aktivaci agononisty přítomností sloučeniny připadající v úvahu. Při metodách screeningu na inverzní agonisty nebo inhibitory mohou být použity konstitutivně aktivní polypeptidy a/nebo konstitutivně exprimované polypeptidy a polynukleotidy, v nepřítomnosti agonisty nebo inhibitory, testováním, zda sloučenina přicházející v úvahu poskytne inhibici nebo aktivaci polypeptidu nebo polynukleotidu. Metody screeningu mohou dále jednoduše zahrnovat kroky míchání sloučeniny připadající v úvahu s roztokem obsahujícím polypeptid nebo polynukleotid podle předkládaného vynálezu za vytvoření směsi, měření aktivity polypeptidu a/nebo polynukleotidu
BASB029 ve směsi a porovnání aktivity polypeptidu a/nebo polynukleotidu BASB029 ve směsi se standardem. Pro vysoce výkonné metody screeningu pro identifikaci antagonistů polypeptidu podle předkládaného vynálezu stejně jako fylogeneticky a/nebo funkčně příbuzných peptidů je možno také použít fúzních proteinů, jako jsou proteiny vyrobené z části Lc a polypeptidu BASB029, jak bylo popsáno výše (viz D. Bcnnctt, a další,./ Mol Recognifion, 8: 52 58 (1995);
a K. Johanson. a další../ Biol. Chem., 270 (16): 9459 - 9471 (1995)).
Polynukleotidy, polypeptidy a protilátky, které se vážou a/nebo interagují s polypeptidem podle předkládaného vynálezu, mohou být také použity pro konfiguraci metod screeningu pro detekci vlivu přidaných sloučenin na produkci mRNA a/nebo polypeptidu v buňkách. Například metoda
ELISA může být upravena pro měření sek ren ováných hladin polypeptidu nebo s buňkami asociovaných hladin polypeptidu použitím monoklonálních a polyklonálních protilátek standardními metodami známými v oboru. Tak je možno zjistit látky, které mohou inhibovat nebo zvyšovat produkci polypeptidu (nazývané také látky s antagonistickým, popřípadě agonistickým účinkem) z vhodně manipulovaných buněk nebo tkání.
Vynález také poskytuje způsob screeningu sloučenin pro identifikaci těchto látek, které zvyšují (agonizují) nebo blokují (antagonizují) působení polypeptidů nebo polynukleotidu BASB029, zvláště těch sloučenin, které mají bakteristatické a/nebo baktericidní účinky. Mezi způsoby screcningu mohou patřit techniky s vysokou průchodností. Například pro sereening látek s agouistic45 kými nebo antagonistickými účinky se inkubuje syntetická reakční směs. buněčný kompartment jako je membrána, buněčný obal nebo buněčná stěna, nebo preparát vytvořený z těchto prvků s obsahem polypeptidu BASB029 spolu se značeným substrátem a/nebo ligandem takového polypeptidu v nepřítomnosti nebo v přítomnosti molekuly přicházející v úvahu, která může mít vzhledem k BASB029 agonistické nebo antagonistické účinky. Schopnost molekuly přicházejí v úvahu agonizovat nebo antagonizovat polypeptid BASB029 se odráží ve snížené vazbě značeného ligandu nebo snížené tvorbě produktu z takového substrátu. Molekuly, které se vážou bez následků, tj. bez indukce účinků polypeptidu BASB029, jsou nejpravděpodobněji dobrými antagonisty. Molekuly, které se dobře vážou a v závislosti na jednotlivých případech zvyšují míru tvorby produktu ze substrátu, zvyšují přenos signálu nebo zvyšují aktivitu chemického kanálu, inají agonis- 14CZ 299612 B6 tické účinky. Detekce míry' nebo koncentrace v závislosti na jednotlivých případech, vytváření produktu ze substrátu, převodu signálů nebo aktivity chemického kanálu muže být zesílena použitím reporterového systému. Reportérové systémy, které mohou být v této souvislosti užitečné. zahrnují, bez omezení na kolorimetrické metody, značeny substrát převedený na produkt, reporterový gen odpovědný za změny v aktivitě polynukleotidů nebo polypeptidů BASB029 a metody testování vazby známé v oboru.
Dalším příkladem testu na látky s agonistiekým účinkem na BASB029 je kompetitivní test, který kombinuje BASB029 a látku s potenciálním agonistiekým účinkem s molekulami, které se vážou ío na BASB029, molekulami, které se vážou na rekombinantní BASB029, přirozenými substráty nebo ligandy nebo látkami napodobujícími substrát nebo ligand, za vhodných podmínek pro test kompetitivní inhibice. BASB029 může být značený, například radioaktivitou nebo sloučeninou umožňující kolorimetrické stanovení, takže lze určit počet molekul BASB029 navázaných na vazebnou molekulu nebo přeměněných na produkt a tak přesné stanovit účinnost látky s poten15 ciálním antagonistickým účinkem.
Mezi látky s potenciálním antagonistickým účinkem patří mj. malé organické molekuly, peptidy, polypeptidy a antibiotika, která se vážou na polynukleotid a/nebo polypeptid podle vynálezu a tím inhibují nebo oslabují jeho aktivitu nebo expresi. l átkami s potenciálním antagonistickým
2o účinkem mohou být také malé organické molekuly, peptid, polypeptid jako je úzce příbuzný protein nebo protilátka, která se váže na stejná místa na vazebné molekule, jako je vazebná molekula, aniž by indukovala účinky vyvolávané BASB029, čímž zabrání působení nebo expresi polypeptidů a/nebo polynukleotidů BASB029 tím, že se znemožní vazba těchto polypeptidů a/nebo polynukleotidů BASB029.
Mezi látky s potenciálním antagonistickým účinkem patří malá molekula, která se váže na vazebné místo pro polypeptid a obsadí je, čímž se zamezí vazbě celulárních vazebných molekul, takže se zabráni normální biologické aktivitě. Příklady malých molekul zahrnují bez omezení malé organické molekuly, peptidy nebo molekuly podobné peptidům. Mezi další látky s polenso ciálním antagonistickým účinkem patří antisense molekuly (viz Okano, J. Newochem., 56: 560 (1991): OIJOODEOXYNUKLEOTIDES AS A NTf SENSEINI/IBITORS OF (JENE EXRRESS/ON,
CRC Press. Boča Raton, FL (1988), kde je uveden popis těchto molekul). Mezi výhodné potenciálně antagonistické sloučeniny patří látky, které jsou příbuzné s BASB029 nebo jsou jeho varianty.
V dalším provedení se předkládaný vynález týká rozpustných fúzníeh proteinů získaných genetickým inženýrstvím, které obsahují polypeptid podle předkládaného vynálezu nebo jeho fragment a různé části konstantních oblastí těžkých nebo lehkých řetězců imunoglobulinů různých podtříd (IgG, IgM. IgA. IgL). Jako imunoglobulin je výhodná konstantní část těžkého řetězce lidského IgG, zvláště IgGl, kde fúze probíhá oblasti ohybu. V konkrétním provedení může být část Pe odstraněna jednoduše inkorporaci štěpící sekvence, která může být rozštěpena faktorem krevní srážlivosti Xa. Předkládaný vynález se dále týká způsobů výroby těchto fúzníeh proteinů metodami genetického inženýrství a jeho použití pro sereening léčiv, diagnózu a terapii. Další provedení vynálezu se také týká polynukleotidů kódujících tyto fúzní proteiny. Příklady techno45 logie fúzníeh proteinů je možno nalézt v mezinárodních patentových přihláškách WO 94/29458 a WO 94/22914.
Každá z polynukleotidových sekvencí poskytovaná v předkládaném vynálezu může být použita pro výzkum a vývoj antibakteriálníeh sloučenin. Kódovaný protein může být pro expresi použit jako cíl pro sereening antibakteriálníeh léčiv. Navíc mohou být polynukleotidové sekvence kódující aminokoncové oblasti kódovaného proteinu nebo Shine-Delgarnovu sekvenci nebo jiné sekvence umožňující translaci příslušné mRNA použity pro zkonstruování antisense sekvencí pro řízení exprese kódující sekvence, o kterou se zajímáme.
- 15 CZ 299612 B6
Vynález také poskytuje použití polypeptidu. pólynukleotidu, agonisty nebo antagonisty podle vynálezu pro zasahování do počáteční fyzikální interakce mezi patogenem nebo patogeny a eukaryotickým, s výhodou savčím hostitelem, odpovědnými za následnou infekci. Konkrétně mohou být použity' molekuly podle vynálezu: při prevenci adheze bakterií, zvláště gram požit i vílích s a/nebo gramnegativních bakterií, na eukaryotícké, s výhodou savčí proteiny extracelulámí matríx nebo zařízení zasahujících do organismu nebo na proteiny extracelulámí mairix v poraněních: pro blokování bakteriální adheze mezi proteiny eukaryotícké, s výhodou savčí extracelulámí matrix a bakteriálními proteiny BASB029, které zprostředkují poškození tkáně a/nebo pro blokování normálního postupu patogeneze pro infekci iniciované jinak než implantací zařízení do organ i χιό mu nebo jinými chirurgickými technikami.
Podle dalšího provedení vynálezu se poskytují látky s agonistickým a antagonistickým účinkem na BASB029, s výhodou látky s agonistickým a antagonistickým účinkem s bakteristatickýni nebo baktericidním působením.
Látky s antagonistickými a agonistickým i účinky podle vynálezu mohou být použity například pro prevenci, inhibici a/nebo léčení onemocněn i.
V dalším provedení se předkládaný vynález týká mimotopů polypeptidu podle vynálezu. Mimo20 top je peptidová sekvence, která je dostatečně podobná nativnímu peptidu (sekvencí nebo strukturou), takže je schopná rozpoznávat, protilátkami, které rozpoznávají nativní peptid: neboje schopné vyvolat tvorbu protilátek, které rozpoznávají nativní peptid při navázání na vhodný nosič.
Peptidové mimotopy mohou být navrženy pro konkrétní účel adicí, deleci nebo substitucí zvolených aminokyselin. Peptidy mohou být tedy modifikovány pro účely usnadnění konjugace na proteinový nosič. Například u některých metod chemické konjugace může být žádoucí vložení koncového cysteinu. V případě peptidů konjugovaných k proteinovému nosiči může být vhodné zavést hydrofobní zakončení na vzdáleném konci od konjugovaného zakončení peptidu, takže nckonjugovaný konec peptidu zůstává spojen s povrchem nosného proteinu, l im je umožněno prezentování peptidu v konformaci. která nejblíže napodobuje konformaci peptidu, která se vyskytuje v případě úplné nativní molekuly. Například peptidy mohou být pozměněny tak, aby obsahovaly N-koncový cystein a C-koncové hydrofobní amidované zakončení (tail). Alternativně je možno provést adici nebo substituci D-stereoizomerní formy jedné nebo více aminokyselin za vytvoření výhodného derivátu, například umožňujícího dosažení zvýšení stability peptidu.
Alternativně mohou být peptidové mimotopy identifikovány použitím protilátek, které jsou samy schopny vázat sc na polypeptidy podle předkládaného vynálezu, s použitím technik jako je technologie typu prezentace fágy (phage display technology) (EP 0 552 267 Bl). Tato technika to vytvoří velký počet polypeptidových sekvencí, které napodobují strukturu nativních peptidů a jsou proto schopny vázat se na anti-nativní peptidové protilátky, ale nemusí nutně samy sdílet významnou sekvenční homologii s nativním polypeptidem.
Vakcíny
Další provedení předkládaného vynálezu se týká způsobu indukce imunologické odpovědi u jednotlivce. zvláště savce, s výhodou člověka, který’ zahrnuje očkování jedince polynukleotidem a/nebo polypeptidem BASB029, nebo jeho fragmentem nebo variantou dostatečným způsobem pro vyvolání tvorby protilátek a/nebo T buněčné odpovědi pro ochranu tohoto jedince před infekcí, zvláště bakteriální infekcí a nejlépe infekcí Neisseria meningitidis. Poskytují se také způsoby, při kterých tato imunologická od poved1 zpomaluje replikaci bakterií. Ještě další provedení vynálezu se týká způsobu indukce imunologické odpovědi u jedince, který zahrnuje dodáni vektoru nukleové kyseliny, sekvence nebo ribozymu uvedenému jedinci pro přímou expresi polynukleotidu a/nebo polypeptidu BASB029. nebo jeho fragmentu nebo varianty, pro dosažení
- 16CZ 299612 R6 exprese polypeptidu a/nebo polypeptidu BASB029. nebo jeho fragmentu nebo varianty in vivo s cílem indukovat imunologickou odpověď, jako je produkce protilátky a/nebo vyvolání Tbuněčné odpovědi, včetně například T-bunék produkujících cytokiny nebo cytotoxických Tbuněk, pro ochranu uvedeného jednotlivec, svýhodou člověka, před onemocněním, ať už jc nemoc u tohoto jedince vyvinutá nebo ne. Jedním příkladem podávání genu je jeho vpravení do požadovaných buněk ve formě povlaku na částicích nebo jinak. Takový vektor nukleové kyseliny může obsahovat DNA, RNA. a ribozym, modifikovanou nukleovou kyselinu, hybrid DNA/RNA, komplex DNA/protein nebo komplex RNA/protein.
ío Další provedení vynálezu se týká imunologického prostředku, který je schopný po zavedení do jednotlivce, s výhodou do člověka schopného vyvolání imunologické odpovědí, vyvolat imunologickou odpověď na polynuklcotid BASB029 a/nebo jím kódovaný polypeptid, přičemž prostředek obsahuje rekombinantní polynukleotid BASB029 a/nebo její kódovaný polypeptid a/nebo obsahuje DAN a/nebo RNA kódující a exprimující antigen uvedeného polypeptidu BASB029, jím kódovaného polypeptidu nebo jiného polypeptidu podle vynálezu. Imunologická odpověd1 může být použita terapeuticky nebo profylakticky a může mít formu protilátkové imunity a/nebo buněčné imunity, jako je buněčná imunita vyvolaná buňkami CTL nebo CD4+ T.
Polypeptid BASB029 nebo jeho fragment mohou být fúzovány s pomocným proteinem (kopro2U teinem) nebo chemickou skupinou, kterc mohou nebo nemusí samy o sobě produkovat protilátky, ale které jsou schopny stabilizovat první protein a produkovat fúzovaný nebo modifikovaný protein, který' bude mít antigenní a/nebo imunogenní vlastnosti, a s výhodou ochranné vlastnosti. Fúzovaný rekombinantní protein tedy s výhodou dále obsahuje antigenní pomocný protein jako je lipoprotein D z Haemophihts influenzae, glutathion S-transferázu (GST) nebo belagalakto25 sidázu, nebo jiný relativně velký pomocný protein, který umožňuje solubilizaci proteinu a jeho výrobu a čištění. Navíc může pomocný protein působit jako adjuvans vc smyslu poskytnutí generalisované stimulace imunitního systému organismu, kterému byl protein podán. Pomocný protein může být navázán buď na aminový, nebo karboxylový konec prvního proteinu.
3o Předkládaný vynález poskytuje prostředky, zvláště vakcíny. a způsoby zahrnují polypeptidy a/nebo polynukleotidy podle vynálezu a iinunostinuilační sekvence DNA. jaké se poskytují v Sáto, Y. a další. Science 273: 352 (1996).
Vynález také poskytuje způsob použití popisovaného polypeptidu nebo jeho konkrétních frag35 mentu, u kterých bylo zjištěno, že kóduji ncvariabilní oblasti povrchových proteinů bakteriálních buněk, v polynukleotidových konstruktech použitých v experimentech s genetickou imunizací na zvířecích modelech týkajících se infekce Neisseria meningitidis. Tyto experimenty budou zvláště užitečně pro identifikaci proteinových epitopů schopných provokovat profylaktickou nebo terapeutickou imunitní odpověď. Předkládá se, že tento přístup umožní následnou přípravu zvláště
4d cenných monoklonálních protilátek odvozených z požadovaného orgánu živočicha úspěšně odolávajícího nebo potlačujícího infekci, pro vývoj preventivních prostředků nebo způsobů léčení bakteriální infekce, zvláště infekce Neisseria meningi/idis u savců, zvláště lidí.
Vynález také zahrnuje vakcínu obsahující imunogenní rekombinantní polypeptid a/nebo poly45 nukleotid podle vynálezu spolu s vhodným nosičem, jako je farmaceuticky přijatelný nosič. Protože polypeptid a polynukleotidy se mohou v žaludku rozkládat, podávají se s výhodou parenterálně, včetně například subkutánního, intramuskulárního. intravenózního nebo intradermálního podávání. Mezi formulace vhodné pro parenterální podávání patří vodné a nevodné sterilní infekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakter i statické sloučeniny a rozto50 ky, které umožňují dosažení isoloniekého stavu s tělesnou tekutinou, zvláště krv í jednotlivce; a vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou obsahovat suspendující nebo zahušťující činidla. formulace mohou být upraveny ve formě jednotkových dávek nebo zásobníků obsahujících větší počet dávek, například uzavřených ampulích a lahvičkách a mohou být uchovávány v lyofilizovaném stavu, přičemž bezprostředně před použitím je nutné pouze přidat sterilní kapalný nosič.
- 17CZ 299612 B6
Vakeína podle vynálezu může obsahovat adjuvantní systémy pro zvýšení imunogenieity prostředku. Adjuvantní systém s výhodou vyvolává preferenčně typ buněčné odpovědi Tlil.
Imunitní odpověď může být rozlišena na dvě extrémní kategorie, a to humorální nebo buněčná imunitní odpověď (tradičně charakterizovaná proti látkovým, popřípadě buněčně-efektorovým mechanismem ochrany). Tyto kategorie odpovědí se označují jako odpovědi typu THl (odpověď zprostředkovaná buňkami) a odpověď typu TH2 (humorální odpověď).
ío Extrémní imunitní odpovědi typu Tlil mohou být charakterizovány tvorbou antigenně specifických, ha ploty po vě omezených cy to toxických T-lymfocytů a odpovědí přirozených buněk - žabíjcěů. U myší jsou odpovědi typu ΤΗ 1 často charakterizovány vytvářením protilátek subtypu IgG2a, zatímco u lidí tyto odpovědi vytvářejí protilátky typu IgGE Buněčné odpovědi typu TI 12 jsou charakterizovány tvorbou širokého spektra imunoglobulinových tsotypů věetně u myší IgGE
IgA, a IgM.
Je třeba vzít v úvahu, že hnací silou stojící za vytvářením těchto dvou typů imunitních odpovědí jsou cytokiny. Vysoké hladiny cytokinů typu TI11 upřednostňují indukci imunitních odpovědí na daný antigen zprostředkovaných buňkami, zatímco vysoké hladiny cytokinů typu TH2 mají sklon
2o upřednostňovat indukci hu morálních imunitních odpovědí na antigen.
Dělení imunitních odpovědí na typu TI 11 a TH2 však není absolutní. Ve skutečnosti bude jedinec podporovat imunitní odpověď, která se popisuje jako převážně TH1 nebo převážně ΓΗ2. Je však často vhodné uvažovat třídy cytokinů z hlediska skupin popsaných v myších klonech CD4+ ve T buněk autory Mosmannem a Coffmanem (Mostnann, T.R. a Coffman, R,L. (1989) Tííl a TH2 cells: different patterns of lytnphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of ítnmunology, 7, str. 45 - 173).
Tradičně jsou odpovědi typu ΤΗ 1 spojeny s produkcí cytokinů INF—γ a IL—2 T-lymfocyty. Další to cytokiny. často přímo spojené s indukcí imunitních odpovědí typu THE nejsou produkovány 1buňkami (například 1L-12), Naopak odpovědi typu TH2 jsou spojeny se sekrecí IL 4, IL-5, IL—6 alL-13.
Je známo, že některá vakcinační adjuvans jsou zvláště vhodná pro stimulaci cytokinových odpo35 vědí buď THE nebo TH2. Tradičně rovněž mezi nejlepší indikátory rovnováhy THl : TI 12 u imunitní odpovědi po vakcinaci nebo infekci přímé měření produkce cytokinů THl nebo TH2 T-lymfocyty in vitro po restimulaei antigenem. a/nebo měření poměru IgGl ; lgG2 odpovědí protilátek specifických pro určitý antigen.
ío Adjuvans typu THl je tedy adjuvans. které přednostně stimuluje izolované populace T-bunék k produkci vysokých hladin cytokinů typu THl při restimulaei antigenem in vitro, a podporuje vytváření jak CD8+ cytotoxických l-lymfocylů, tak i imunoglobulinových odpovědí specifických pro antigen spojených s isotypem typu ΤΗ I.
Adjuvans, která jsou schopná přednostní stimulace buněčné odpovědi THl, se popisují v mezinárodních patentových přihláškách WO 94/00153 a WO 95/17209.
Jedním takovým adjuvans, je 3-De O-acylovaný monofosíoiy llipid A (3D-MPE). Ten je znám z GB 2220211 (Ribi). Chemicky jde o směs 3-De-O acylovaného monofosforyllipidu A s 4, 5 nebo 6 acylovanými řetězci, která jsou vyráběna firmou Ribi Imrnunochem, Montana. Výhodná forma 3-De-O-acylovaného monofosfory llipidu A se popisuje v evropském patentu EP 0 689 454 Bl (SmithKline Beecham Biologicals SA).
S výhodou jsou částice 3D MPE dostatečně malé, aby je bylo možno sterilizovat filtrací mem55 bránou 0,22 μπι (evropský patent no. 0 689 454).
- 18CZ 299612 B6
3D-MPL bude přítomen v množství 10 až 100 pg, s výhodou 25 až 50 pg na dávku, přičemž antigen bude typicky přítomen v rozmezí 2 až 50 pg na dávku.
? Další výhodné adjuvans zahrnuje QS21, netoxická frakce vyčištěná HPLC z kůry Quillaja Saponaria Molina. Tato látka . může být popřípadě smíchána s 3-De -O-acylo váným monofosfory i lipidem A (3D-MPI,), popřípadě spolu s nosičem.
Způsob výroby QS21 se popisuje v patentu U5 5 057 540. in
Ncreaktogenní adjuvantní směsi obsahují QS21 byly popsány již dříve (WO 96/33739). Tyto formulace obsahují QS2I a cholesterol se ukázaly při společné formulaci s antigenem jako úspěšná ΤΗ 1-stimuluj ící adjuvans.
iš Další adjuvans, které jsou preferenčními stimulátory buněčné odpovědi TIH, zahrnují imunomodulační oligonukleotidy, například nemetli)lované sekvence CpG popisované ve WO 96/02555.
Jako vhodné adjuvantní látky preferenčně stimulující buněčnou odpověď THI je také možno uvažovat kombinace různých THI-stimulujících adjuvans. jako jsou směsi uvedené výše. Napří20 klad QS21 může být formulován spolu s 3D-MPL. Poměr QS21 : 3D-MPL bude typicky řádově I : 10 až 10 : 1; s výhodou 1 : 5 až 5 : I a často v podstatě 1:1. Výhodné rozmezí pro dosažení optimální synergie jc 2,5 : 1 až I : 1 3D-MPL : QS21.
Ve vakcíně podle předkládaného vynálezu je také s výhodou přítomen nosič. Nosičem může být emulze typu olej ve vodě nebo hlinitá sůl, jako jc fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý.
Výhodná emulze typu voda v oleji obsahuje melabolizovatclný olej. jako jc skvalen. alfa-tokoferol a Tween 80. Ve zvláště výhodném provedení se antigeny ve vakcíně podle vynálezu kombinují v takovéto emulzi s QS2I a 3D-MPL Navíc může emulze typu olej ve vodě obsahovat spán
85 a/nebo lecitin a/nebo trikapryIin.
Pro podávání člověku budou QS21 a 3D-MPL typicky přítomny vc vakcíně v rozmezí 1 pg až 200 pg. jako 10 až 100 pg. s výhodou 10 pg až 50 pg na dávku. Emulze typu olej vc vodě bude typicky obsahovat od 2 do 10 % skvalenu, od 2 do 10 % alfatokoferolu a od 0.3 do 3 % Tweenu
80. Poměr skvalen : alfatokoferol je s výhodou rovný nebo menší než 1, protože takto vznikají stabilnější emulze. Spán 85 může být také přítomen v množství 1 %. V některých případech může být výhodné, aby vakcíny podle předkládaného vynálezu navíc obsahovaly stabilizátor.
Netoxické emulze typu olej ve vodě s výhodou obsahují netoxický olej, například skvalan nebo skvalen a emulgátor, například Tween 80. ve vodném nosiči. Vodný nosič může být například fyziologický roztok s fosfátovým pufrem.
Zvláště účinná adjuvantní formulace obsahuje QS21,3D-MPL a tokoferol v emulzi typu olej ve vodě, jak se popisuje ve WO 95/17210.
Předkládaný vynález také poskytuje polyvalentní vakcínu obsahující vakcinační formulaci podle vynálezu v kombinaci s jinými antigeny, zvláště antigeny použitelnými pro léčení rakoviny, autoimunitních onemocnění a s nimi souvisejících stavů. Taková polyvalentní vakcína může obsahovat adjuvans indukující ΤΗ 1 odpověď, jak bylo popsáno výše.
5(1
I když byl vynález popsán na určitých polypcptidech a polynukleotidech BASB029, je zřejmé, že pokrývá také fragmenty v přírodě se vyskytujících polypeptidů a polynukleotidů, a podobné polypeptidy a polynukleotidy obsahující adice, delccc nebo substituce, které podstatným způsobem neovlivní imunologické vlastnosti rekombinantních polypeptidů nebo polynukleotidů.
- 19C'Z 299612 B6
Antigen může být také podáván ve formě celé bakterie (živé nebo usmrcené) nebo jako subcelulární frakce, přičemž tyto možnosti zahrnují také samotnou Λ’ meningitidis.
Prostředky, kity a podávání
V dalším provedení vynálezu se poskytují prostředky obsahující polynukleotid BASB029 a/nebo polypeptid BASB029 pro podávání do buňky nebo do víccbunečného organismu.
Vynález se také týká prostředků obsahujících polynukleotid a/nebo a polypeptid diskutovaný ío výše. nebo na ně působí agonistické nebo antagonistické látky. Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu mohou být použity v kombinaci snestcrilním nosičem nebo nosiči pro použití v buňkách, tkáních nebo organismech, jako je farmaceutický nosič pro podávání jednotlivci. Tyto prostředky obsahují například aditivum do média nebo terapeuticky účinné množství polypeptidu a/nebo polynukleotidu podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič nebo pomocnou látku.
Mezi tyto nosiče mohou bez omezení patřit fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, dextróza. voda. glycerol, ethanol ajejich kombinace. Formulace by měla být přizpůsobena způsobu podávání. Předkládaný vynález se dále týká diagnostických a farmaceutických balení a kitů obsahujících jednu nebo více nádobek naplněných jednou nebo více složkami výše uvedených prostředků podle vynálezu.
Polypeptidy, polynukleotidy a jiné sloučeniny podle vynálezu mohou být používány samostatné nebo spolu s jinými látkami, jako jsou terapeutické látky.
Farmaceutické prostředky mohou být podávány jakýmkoli účinným a pohodlným způsobem, včetně například topického, orálního, análního, vaginálního, intravenózního, intrapcritoncálního, intramuskulámího, subkutánního, intranazálního nebo intradermálního podání.
Při léčení nebo prevenci může být účinná látka podávána jednotlivci jako prostředek ve formě injekce, například jako sterilní vodná disperze, s výhodou isotonická.
V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství polypeptidu a/nebo polynukleotidu. jako je rozpustná forma polypeptidu a/nebo polynukleotidu podle předkládaného vynálezu, peptid $ agonistickýni nebo antagonistickým účinkem nebo sloučenina s malou molekulou, a kombinace s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo pomocnou látkou. Mezi tyto nosiče patří bez omezení fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, dextróza, voda, glycerol. ethanol ajejich kombinace. Předkládaný vynález sc dále týká farmaceutických balení a kitů obsahujících jednu nebo více násobek naplněných jednou nebo více složkami výše uváděných prostředků podle vynálezu. Polypeptidy, polynukleotidy a jíně látky podle předkládaného vynálezu mohou být používány samostatně nebo spolu s dalšími sloučeninami, jako jsou terapeutické sloučeniny.
Prostředek bude přizpůsoben způsobu podávání, například systémovému podávání nebo orálnímu podávání. Mezi výhodné formy systémového podávání patří injekce, typicky intravenózní injekce. Mohou být také použity jiné typy injekcí, jako jsou subkutánní. intramuskulámí nebo intra45 per itoneá lni. Mezi alternativní prostředky pro systémové podávání patří transinukosální a transdermální podávání s použitím látek napomáhajících penetraci jako jsou žlučové kyseliny nebo fusidové kyseliny nebo další delergenty. Navíc mohou být polypeptid nebo jiné sloučeniny podle předkládaného vynálezu formulovány v enlerosolventním nebo zapouzdřeném prostředku a je také možné orální podávání. Tyto sloučeniny mohou být také podávány místně a/nebo lokal izo50 vaně, ve formě balzámů, past, gelů. roztoků, prášků atd.
Pro podávání savcům a zvláště člověku bude očekávaná denní dávka účinné látky od 0,01 do 10 mg/kg, typicky kolem 1 mg/kg. Lékař určí v každém případě skutečnou dávku, která bude pro jednotlivce nej vhodnější, a která se bude lišit podle věku. hmotnosti a reakce konkrétního jednot- 70 CZ 299612 B6 livce. Výše uvedené dávky jsou pouze příklady pro průměrného pacienta. Mohou samozřejmě existovat jednotlivé případy, kdy jsou oprávněny vyšší nebo nižší rozsahy dávek, které spadají rovněž do rozsahu vynálezu.
Požadované rozmezí dávek závisí na výběru peptidu, cestě podávání, povaze formulace, povaze nemocí a stavu jednotlivce a úsudku ošetřujícího lékaře. Vhodné dávky jsou však v rozmezí OJ až 100 gg/kg tělesné hmotnosti pacienta.
Vakcíny jsou vhodně v injekční formě. Pro zvýšení imunitní odpovědi jc možno použít běžných ío adjuvans. Vhodná jednotková dávka pro vakcínaci je 0,5 až 5 gg/kg antigenu, přičemž tato dávka se s výhodou podává 1 až 3 x a v intervalu jednoho až tří týdnů. S uvedeným rozmezím dávek se u sloučenin podle vynálezu nepozorují nepříznivé toxikologické účinky, které by vyloučily jejich podávání vhodným jedincům,
Jc možno očekávat široké variace v potřebných dávkách / hlediska různých dostupných sloučenin a rozdílných účinností různých způsobů podávání. Například sc předpokládá, že u orálního podávání bude nutné podávat vyšší dávky než v případě podávání intravenózní injekcí. Variace těchto dávek mohou být upraveny podle standardních empirických metod pro optimalizaci, jak se to v oboru běžně provádí.
Databáze sekvencí, sekvence v reálném prostředí a algoritmy
Sekvence polynukleotidů a polypeptidů tvoří cenný zdroj informací, pomocí kterého lze určit dvou a třírozměrné struktury stejně jako identifikovat další sekvence s podobnou homologii. T yto přístupy jsou nejsnadněji uskutečňovány uchováváním sekvence na počítačově čitelném médiu a potom použitím uchovaných dat ve známém programu pro výpočet makromolekulami struktury nebo pro hledání databáze sekvencí pomocí známých prohledávacích nástrojů, jako je programový balík GCG.
Vynález také poskytuje způsob analýzy charakteristických sekvencí nebo řetězců, zvláště genetických sekvencí nebo kódovaných proteinových sekvencí. Mezi výhodné způsoby analýzy sekvencí patří například způsoby analýzy sekvenční homologie, jako je analýza identity a podobnosti. analýza struktury DNA, RNA a proteinů, uspořádání sekvence, analýza chránění, analýza sekvenčních motivů, stanovení otevřeného čtecího rámce, použití bází nukleovou kyselinou, ana35 lýza využití kodonu, snížení počtu bází nukleové kyseliny a analýza vrcholů sekvenčního chromatogramu.
Pro provádění identifikace homologie se poskytuje počítačová metoda. Tato metoda zahrnuje kroky poskytnutí první nukleotidové sekvence obsahující sekvenci polynukleotidu podle vynále40 zu na počítačově čitelném médiu: a porovnání uvedené první nukleotidové sekvence s alespoň jednou druhou polynukleotidovou nebo polypcptídovou sekvencí pro identifikaci homologie. Počítačová metoda se také poskytuje pro provádění identifikace homologie. přičemž tato metoda zahrnuje kroky poskytnutí první polypeptidové sekvence obsahující sekvenci polypeptidu podle vynálezu na počítačově citelném médiu; a porovnání uvedené první polypeptidové sekvence s alespoň jednou druhou polynukleotidovou nebo polypeptidovou sekvenci pro identifikaci homologie.
Všechny publikace a odkazy, včetně bez omezení patentů a patentových přihlášek, citované v předkládané přihlášce, jsou zde zařazeny ve své úplnosti odkazem, tak jako by každá jednotlivá publikace nebo každý odkaz byly uvedeny ve svém cyklu. Stejným způsobem jsou zde také zařazeny jakékoli uváděné přihlášky, jejíchž prioritu předkládaná přihláška nárokuje.
Definice „Identita“, tak jak je známa v oboru, je vztah mezi dvěma nebo více polypeptidovými sekvencemi. nebo mezi dvěma nebo více póly nukleotidovými sekvencemi podle konkrétního případu, tak, jakje určena pozorováním sekvencí. V oboru také „identita znamená stupeň příbuznosti sekvencí mezi sekvencemi polypeptidu nebo polynukleotidů podle konkrétního případu, který je určen shodou mezi řetězci těchto sekvencí. „Identita může být snadno vypočtena známými způsoby, včetně bez omezení způsobů popsaných v Computational Molecular Biology, Lesk A. M. ed. Oxford University Press. New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, io Smith. D. W„ ed„ Academie Press. New York. 1993; Gomputer Analysis of Sequence Data. Část I, Griffin, A. M. a Griffin, H. G. ed„ Humana Press. New Jersey. 1994: Sequence Analysis in Molecular Biology’, von Hcine, G. Academie Press, 1987; a Sequence Analysis Primer. Gribskov, M. a Devereux., J„ ed„ M. Stockton Press. New York. 1991; a Carriilo. 11.. a Lipman. D.. SIAM d. Applied Math., 48; 1073 (1988). Metody pro určování identity jsou navrženy tak.
aby poskytly co nejvyšší shodu mezi testovanými sekvencemi. Navíc jsou metody pro určení identity zakódovány ve veřejně dostupných počítačových programech. Jako počítačové programy pro určení identity mezi dvěma sekvencemi je možno uvést program GAP, který je součástí programového balíku GCG (Devereux, J„ a další. Nueleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP. BLASTN (Altschul, S. P. a další, J. Molec. Biol. 215: 403 - 410 (1990), a PASTA (Pearson a Lipman Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988). Skupina programů BLAST je dostupná veřejnosti u NCBI i z jiných zdrojů (BLAST Manuaí Altschul, S„ a další, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S„'a další,./. Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990). Pro stanovení identity může být také použit dobře známý Smith Watermanův algoritmus.
Mezi parametry' zadávané pro porovnání polypeptidové sekvence patří následující:
Algoritmus: Needleman a Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) Comparison matrix: BLOSSUM62 from Henikoťťa Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 89: 10915 10919(1992)
Gap Penalty; 8
Gap Length Penalty: 2
Program použitelný s těmito parametry je dostupný jako program „gap“ u firmy Gcnetics Com35 puter Group, Madison WL Výše uvedené parametry jsou parametry jsou parametry, které jsou nastaveny jako výchozí (spolu s parametrem „no penalty pro koncové mezery).
Parametry pro porovnání polynukleotidů jsou například následující:
Algoritmus: Needleman a Wunsch, J, Mol, Biol.. 48: 443 - 453 (1970) Comparison matrix: matchcs = +10, mismatch = 0
Gap Penalty: 50 t5 Gap Length Penalty: 3
Dostupný jako: program „gap Firmy Genetics Computer Group, Madison Wl: Uváděné parametry jsou nastaveny pro srovnávání nukleových kyselin jako výchozí.
so Výhodný význam výrazu „identita“ pro polynukleotidy na polypeptidy podle konkrétního případu se poskytuje v následujících částech (I) a (2) níže.
(1) Provedení polypeptidů dále zahrnují izolované polynukleotid obsahující polynuklcotidovou sekvenci, která má alespoň 50. 60, 70, 80. 85, 90. 95, 97 nebo 100% identitu s referenční sekven- 22 CZ 299612 B6 cí SEQ ID No,: 1, přičemž uvedená polynukleotidová sekvence muže být s referenční sekvencí SEQ ID No.: I identická, nebo může obsahovat až do určitého celého čísla změny nukleotidů ve srovnání s referenční sekvencí, přičemž tyto změny (alterace) jsou zvoleny ze skupiny zahrnující alespoň jednu deleci. substituci, včetně tranzicc a transvcrze nebo inzerci nukleotidu, a kde uvedené změny se mohou vyskytovat v 5' nebo 3’ koncových polohách referenční nukleotidovc sekvence, nebo na kterémkoli místě mezi těmito terminálními polohami, a mohou být rozprostřeny buď jednotlivě mezi nukleotidy referenční sekvence, nebo v jedné nebo více sousedících skupin uvnitř referenční sekvence a kde uvedené změny se mohou vyskytovat v 5' nebo 3' koncových polohách referenční nukleotidové sekvence, nebo na kterémkoli místě mezi těmito terminálio nimi polohami, a mohou být rozprostřeny bud'jednotlivě mezi terminálními polohami, a mohou být rozprostřeny buď jednotlivě mezi nukleotidy referenční sekvence, nebo v jedné nebo více sousedících skupin uvnitř referenční sekvence a kde uvedený počet nukleotidových změn stanovený vynásobením celkového množství nukleotidů v SEQ ID No.: 1 celým číslem definujícím procento identity, vydělením 100 a odečtením výsledného celkového počtu nukleotidů v SEQ ID i? No.: 1, nebo nn < Xn-íx,, · y), kde nn je počet nukleotidových změn. x„ je celkový počet nukleotidů v SEQ ID No.: 1, Y je 0,50 pro 50%, 0,60 pro 60 %, 050 pro 70 %’ 0,80 pro 80 %, 0.85 pro 85 %. 0.90 pro 90 %, 055 pro 95 %. 0.97 pro 97 % nebo 1,00 pro 100 %, a · je sy mbol operátoru násobení, a kde jakýkoli neceločíselný výsledek pro xn a y je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před odečtením od xfl. Alterace polynukleotidová sekvence kódující polypeptid SEQ ID No.: 2 mohou vytvářet v této kódující sekvenci mutace typu nonsense, missense nebo frameshift a tím měnit polypeptid kodo25 váný polynukleotidem po těchto změnách.
Například polynukleotidová sekvence podle předkládaného vynálezu může být identická s referenční sekvencí SEQ ID No.: I, tj. může mít 100 % identitu, nebo může obsahovat až do určitého celočíselného počtu změn nukleových kyselin ve srovnání s referenční sekvencí, takže procentní identita je menší než 100 %. Tyto změny se volí ze skupiny delece substituce, včetně tranzice a transvcrze. nebo inzerce alespoň jedné nukleové kyseliny, přičemž uvedené změny se mohou vyskytovat v 5' nebo 3’ koncových polohách referenční póly nukleotidové sekvence nebo kdekoli mezi těmito koncovými polohami, rozprostřené buď jednotlivě mezi nukleovými kyselinami v referenční sekvenci, nebo v jedné nebo více sousedících skupinách uvnitř referenční sekvence.
Počet změn nukleových kyselin pro danou identitu v procentech je určen vynásobením celkového počtu nukleových kyselin v SEQ ID No.: 1 celým číslem definujícím procentní identitu dělenou 100 a odečtením výsledku od celkového počtu nukleových kyselin v SEQ ID No.: I, neboli:
nn < x,H% · y), kde nn je počet změn nukleových kyselin, xn je celkový počet nukleových kyselin v SEQ ID No.: 1, y je například 0.70 pro 70 %. 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 % atd.. · je symbol operátoru násobení, a jakýkoli neceločíselný výsledek pro xn a y se zaokrouhlí dolů na nejbližší celé číslo před odečtením od x„.
(2) Provedení polypeptidů dále zahrnují izolovaný polypeptid obsahující polypeptid s alespoň 50. 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 nebo 100% identitou vzhledem k referenční polypeptidové sekvenci SEQ ID No.: 2, kde polypeptidové sekvence může být identická s referenční sekvencí SEQ ID No.: 2 nebo může obsahovat až do určitého celočíselného počtu změn aminokyselin v porovnání
5() s referenční sekvencí, přičemž uvedené změny jsou zvoleny ze skupiny delece, substituce, včetně konzervativní a nekonzervativní substituce nebo inzerce alespoň jedné aminokyseliny, a kde uvedené změny se mohou vyskytoval na amino nebo karboxy koncových polohách referenční polypeptidové sekvence nebo kdekoli mezi těmito koncovými polohami, rozprostřené buď jednotlivě mezi aminokyselinami referenční sekvence, nebo v jedné nebo více sousedících skupinách uv nitř referenční sekvence, a kde uvedený počet změn nukleových kyselin se určí vynásobením celko-23 CZ 299612 B6 vého počtu aminokyselin v SEQ ID No.: 2 celým číslem definujícím procentní identitu dělenou 100 a odečtením výsledku od uvedeného celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No.: 2. neboli:
na < xa (xa · v), kde n;, je počet změn aminokyselin. xa je celkový počet aminokyselin v SEQ ID No,: 2, y je 0.50 pro 50%, 0,60 pro 60 %. 0.70 pro 70 0.80 pro 80 %. 0,85 pro 85 %. 0,90 pro 90 %, 0.95 pro
%. 0.97 pro 97 % nebo 1,00 pro 100 %, a · je symbol operátoru násobení, a kde jakýkoli neceločíselný produkt xa a v je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před odečtením od x;i.
Polypeptidová sekvence podle předkládaného vynálezu může být identická s referenční sekvencí SEQ ID No,: 2. takže může být stoprocentně identická, nebo může obsahovat až do určitého celočíselného počtu změn aminokyselin v porovnání s referenční sekvencí, takže procentní identita je menší než 100 %, Tyto změny jsou zvoleny ze skupiny delece, substituce, včetně konzer15 vativní a nekonzervativní substituce nebo inzerce alespoň jedné aminokyseliny, a kde uvedené změny se mohou vyskytovat v amino nebo karboxykoncových polohách referenčních polypeptidové sekvence nebo kdekoli mezi těmito koncovými polohami, rozprostřeny bud' jednotlivě mezi aminokyselinami referenční sekvence, nebo v jedné nebo více sousedících skupinách uvnitř referenční sekvence. Počet změn aminokyselin pro danou procentní identitu se určí vynásobením celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No.: 2 celým číslem definujícím procentní identitu vyděleným 100 a odečtením výsledku od uvedeného celkového počtu aminokyselin v SEQ ID No.: 2, neboli;
na < \H\i · y), kde na je počet změn aminokyselin, je celkový počet aminokyselin v SEQ ID No.: 2, y je například 70 pro 70 %. 0,80 pro 80 %, 0,85 pro 85 % atd., a · jc symbol operátoru násobení, a kde neceločíselný výsledek xn a y je zaokrouhlen dolů na nejbližší celé číslo před odečtením x;i.
„Jednotlivec“ nebo „jednotlivci“ označují organismus, tzn. vícebuněčny organismus včetně savce. ptáka, opice, primáta a člověka, „Izolovaný“ znamená změněný „rukou člověka proti přirozenému stavu. tj. pokud se objekt vyskytuje v přírodě, byl změněn nebo vyjmut z původního prostředí nebo obojí. Například poly35 nukleotid nebo polypeptid přítomný přirozeně v živém organismu není „izolovaný“, ale stejný polynukleotid nebo polypeptid oddělený od koexistujících materiálů přírodního stavu je „izolovaný ve smyslu použití tohoto termínu v předkládané přihlášce. Navíc je polynukleotid nebo polypeptid, který je zavedený do organismu transformací, genovou manipulací nebo jakoukoli jinou rekombinantní metodou je „izolovaný“, i když je ještě přítomen v uvedeném organismu, přičemž tento organismus může být živý nebo neživý.
„Polynukleotid nebo „polynukleotidy obecně označují jakýkoli polyribonukleotid nebo polydeoxyribonukleotid, kterými mohou být nemodifikovaná RNA nebo DNA nebo modifikovaná RNA nebo DNA včetně jednořetězcových a dvouřetězcových oblastí.
Termín „varianta“ označuje polynukleotid nebo polypeptid, který se liší od referenčního polynuklcotidu nebo polypeptidu, ale zachovává si nezbytné vlastnosti. Typická varianta póly nukleotidu má odlišnou nukleotidovou sekvenci od dalšího, referenčního polynukleotidů. Změny v nukleolidové sekvenci varianty mohou nebo nemusí změnit aminokyselinovou sekvenci polypeptidu kódovaného referenčním polynukleotidem. Změny nukleotidů mohou vést k substitucím, adicím, delecím, fúzím aminokyselina a zkrácením polypeptidu kódovaného referenční sekvencí, jak je diskutováno níže. Typická varianta polypeptidu se liší v aminokyselinové sekvenci od jiného, referenčního polypeptidu. Obecně jsou rozdíly omezeny na rozdíly sekvencí varianty vzhledem k referenčnímu polypeptidu, které poskytují celkově úzce podobné sekvence a v mnoha oblastech identické. Varianta a referenční polypeptid se mohou odlišovat v aminokyselinové sekvenci
-24Q7. 299612 Bó jednou nebo více substitucemi, adicemi nebo delecemi v jakékoli kombinaci. Substituované nebo vložené aminokyselinové zbytky buď mohou být. nebo nemusí být kódovány genetickým kódem. Varianta polynukleotidů nebo polypeptidu se může vyskytovat v přírodě, jako například alelieká varianta, nebo může jít o variantu, o které není známo, že by se v přírodě vyskytovala. Varianty polynukleotidů a polypeptidů, které se v přírodě nevyskytují, mohou být vyrobeny technikami mutageneze nebo přímou syntézou.
„Onemocnění“ znamená jakoukoli nemoc nebo nemoci způsobené nebo související s infekcí způsobenou bakterií, včetně například infekce horního dýchacího traktu a invazivních bakteriálních io onemocnění jako je bakteremie a meningitida.
Příklady provedení vynálezu
Příklady uváděné dále se provádějí standardními technikami, které jsou v oboru dobře známé kromě výjimek, které se podrobně popisují. Příklady jsou ilustrativní a neomezují vynálezu,
Příklady 1: Sek véno ván i DNA genu BASB029 ze dvou kmenů V. tneningitidis pro účely výzkumu a potvrzení sekvence
A: BASB029 v N. tneningitidis séroskupina B kmen ATCC 13090
Gen BASB029 se sekvencí SEQ ID No.: I byl poprvé objeven v databázi Incyte PathoScq, obsahující neukončené genomové sekvence DNA Λ'. tneningitidis, kmen ATCC 13090. Translace polynukleotidové sekvence BASB029 ukázané v SEQ ID No.: 2, měla významnou podobnost (52% identita v 582 překrývajících se aminokyselinách) s povrchovým fíbrilárním (11SE) proteinem Haemophilus influenzae.
Sekvence genu BASB029 byla dále experimentálně potvrzena, K tomu účelu byla extrahována genomická DNA z IO10 buněk N. tneningitidis (kmen ATCC 13090) s použitím extrakčního kitu pro genomickou DNA QIAGEN firmy Qiagen GmbH, a 1 pg tohoto materiálu byl ampliflkován polymerázou řetězovou reakcí použitím primem llsfl (5-GGG GCA TAT GAA CAA AAT ATA CCG CAT CAT TTG GAA-3') |SE2Q ID No.: 5] obsahujícího vnitřní místo Ndel (podtrženo) a primem HSF2 (5' GGG GCT CGA GCC ACT GA P AAC CGA CAG ATG CGG
A-3) (SEQ ID No.: 6] obsahujícího vnitřní místo Xhol (podtrženo). Tento produkt PCR byl čištěn na gelu a bylo provedeno sek véno ván i DNA použitím sek venač ního kitu Big Dye Cycle Sequencing kit (Pcrkin-Elmer) a sekvenátoru DNA AB1 373A/PR1SM. Sekvenování DNA bylo prováděno na dvou řetězcích s dvojnásobnou redundancí a úplná sekvence byla uspořádána použitím programu SeqMan ze softwarového balíku DNASTAR Easergene. Získaná sekvence
4« DNA ukázala 100% identitu se SEQ ID No.: I.
B. BASB029 v N. tneningitidis séroskupiny B kmen 1144/76
Sekvence kmenu BASB029 byla také zjišťována v další bakterii A tneningitidis séroskupiny B.
kmen 1144/76. Pro tento účel byla extrahována genomická DNA z N. tneningitidis, kmen H44/76 použitím stejných experimentálních podmínek, jako v příkladu 1. Tento materiál (1 pg) byl potom ampliflkován PCR s použitím primerů Hsfl a Hsf2 specifických pro en BASB029. Byl získán fragment DNA o délce 4389bp, který byl štěpen restrikčním i endonukleázami Ndeí'Xho\ a vložen do odpovídajících míst klonovaeího/expresního vektoru pET-24b (Novagen) použitím standardních technik molekulární biologie (Molecular Cloning. a Laboratoř)' Manual. druhé vydání, ed.: Sambrook, Eritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989). Rekombinantní vektor pET-24b/BASB029 byl potom sekvenován pomocí kitu Big Dyes (Applied Biosystems) a analyzován na sekvenátoru DNA ABI 373/A za podmínek předepsaných dodavatelem. Takto
- 25 CZ 299612 Bó byl získán polynukleotid a dedukovaná polypeptidové sekvence označené jako SEQ ID No.: 3, popř. SEQ ID No.: 4. Použitím programu PILELJP z balíku GCG bylo provedeno porovnání polynukleotidových sekvencí SEQ ID No.: 1 a 3. přičemž výsledky jsou uvedeny na obr. k míra identity zjištěná programem GAP byla 96.8 %. Použitím stejného programu PIEEUP bylo ? provedeno srovnání polypeptidových sekvencí SEQ ID No.: 2 a 4, které je uvedeno na obr. 2; stupeň identity zjištěný programem GAP byl 94.2 %. Souhrnně je možno říci, že tyto údaje ukazují na silnou konzervaci sekvence genu BASB029 mezi dvěma kmeny /V. meníngitidis séroskupiny B.
Příklad 2: Exprese a purifikace rekombinantního proteinu BASB029 v Escherichia coli
Konstrukce klonovacího/expresního vektoru pET-24b/BASB029 byla popsána v příkladu 1B. Tento vektor nese gen BASB029 izolovaný z kmene 1144/76 fúzovaný s řadou šesti hislidinových zbytků, a je umístěn pod řízením silného promotoru genu 10 bakteriofága T7. Pro studium exprese byl tento vektor zaveden do kmene Escherichia coli Novablue (DES) (Novagen), ve kterém byl gen pro T7 polymerázu umístěn pod kontrolu regulovatelného lac promotoru isopropyl-beta-D-thiogalaktosidázy (IPTG). Kapalné kultury (100 ml) rekombinantního kmene Novablue (DES) (pET24b/BASB029| E. coli byly ponechány růst při 37 °C za míchání až do dosažení optické density při 600 nm (OD600) 0,6. V tomto místě byl přidán IPTG na konečnou koncentrací I mM a kultura byla ponechána růst 4 další hodiny. Kultura byla potom centrifugována při 10 000 ot/min a biomasa byla zmrazená při -20 °C na alespoň 10 h. Po roztáni byla biomasa resuspendována v průběhu 30 min při teplotě 25 °C v pufru A (6M guanidinhydrochlorid, 01M NatEPCg, 0,001M Tris, pil 8,0), 3 x protlačena jehlou a zcentrifugována (20 000 ot/min, 15 min). Vzorek byl potom nanesen při plném průtoku 1 ml/min na kolonu llitrap s naneseným Ni2f (Pharmacia Biotech). Po nanesení byla kolona postupně promyta 40 ml pufru Β (8M močovina, 0.1M NaH^POj. 0,lM Tris. pH 8,0). 40 ml pufru C (8M močovina, 0,lM NatEPCfi, 0,01 M Tris, pH 6,3). Rekombinantní protein BASB029/His6 byl potom z kolony eluován 30 ml pufru D (8M močovina. 01M Nal TPOj. 0,01 M I ris, pl I 6.3) s obsahem 500 mM imidazolu, přičemž byly jímány frakce 3 ml. Jakje ukázáno v obr. 3 (dráha 1). z kolony byl eluován vysoce obohacený (čistota při barvení eoomassie byla odhadována na více než 90%) protein BA$B029/EIis6, který se pohyboval při molekulové hmotnosti 66 kDa (66 000) (odhadována relativní molekulová hmotnost). Tento polypeptid byl reaktivní proti myší monoklonální protilátce zaměřené proti 5-histidinovému motivu (viz obr. 3, dráha 2). l ato data společně ukazují, že gen BASB029 je možno exprimovat a purifikovat v rekombinantní formě (BASB029/His6) v E. coli.
Příklad 3: Imunizace myši rekombinantním BASB029
Částečně purifi kovaný rekombinantní protein BASB029 exprimovaný v E. coli byl třikrát v stříknut myším Balb/C ve dnech 0, 14 a 29 (8 zvířat/skupina). Zvířatům byly podány subkutánní injekce obsahující přibližně 5 gg antigenu ve dvou různých formulacích. Buď adsorbovaný na 100 gg AIPO.1, nebo formulovaný v emulzi SBAS2 (emulze SB62 obsahující 5 gg MPL a 5 gg
QS21 na dávku). Negativní kontrolou byly myši imunizované pouze emulzí SBAS2. Vzorky krve byly odebrány ve dnech 29 (15 dnů po II) a 35 (6 dnů po III) pro detekci specifických anti— BASB029 protilátek. Specifické antiBASB029 protilátky byly měřeny v odděleném séru (z 10 myší/skupina) metodou westernového přenosu na šestí různých kmenech NmB (obr. 4 a 5).
Rozpoznání epotipu BASB029 v různých kmenech NmB westernovým přenosem
V tomto testu byla vyšetřena séra imunizovaných myší (spojená) westernovým přenosem na rozpoznávání epitopů BASB029 šesti různých kmenů Neisseria meningitidis Β: H44/76 (B: 15:P1.7,
16. linie A4). BZ198 (B:NT*: -. linie 3), EG 328 (B:NT*. linie ST-18). a ATCC 13090 Men B, stejně jako částečně purifi kovaného rekombinantního proteinu BASB029 (*; NT: nety pováno).
-26CZ 299612 B6
Vc stručnosti je možno uvést, že 10 μΐ (>10* buněk/dráha) každého vzorku po smísení se vzorkovým pufrem (10 min při 95 °C) se nanese na gradientový gel SDS-PAGE (Tris-glyein 4 až 20%. Novex. kód No. EC60252). Elektroforetická migrace probíhala při 125 V 90 min,.
Potom se proteiny převádějí na nitrocelulózovou membránu (45 μηι, Bio-rad kód No. 170-3930). Filtr byl blokován pufrem PBS 0.05% Tween 20 přes noc při teplotě laboratoře, před inkubací s myším sérem obsahujícím protilátky anti-BSB029 pocházející jak z formulace AiPO4, tak i SBAS2. Tato séra se 100 x ředí pufrem PBS - 0.05% Tween 20, a inkubují se na nitrocelulózové membráně 2 h při teplotě laboratoře za mírného třepání na systému mini-blottcr systém ío (Miniprotean. Bio-rad kód No. 170 - 4017). Po třech opakovaných prornývacích krocích v pufru PBS - 0,05% Tween 20 po dobu 5 min, se nitrocelulóžová membrána inkubuje při teplotě laboratoře 1 h za mírného třepání s příslušným konjugátem (biotinylované ovčí protilátky proti myšímu Ig. Amersham kód No. RPN1001) při ředění 1/500 ve stejném promývacím pufru. Membrána se promyje třikrát jako předtím a inkubuje sc 30 min za míchání s komplexem streptavidin-peroxidáza (Amersham kód No. 1051) při ředění t/1000 v promývacím pufru. Po posledních třech opakovačích krocích promývání probíhá vyvíjení při době inkubace 20 min v 50 ml roztoku obsahujícího 30 mg 4-chlor-M-naftolu (Sigma). 10 ml methanolu, 40 ml PBS a 30 μΐ H2O2. Barvení se zastaví několikanásobným promytím membrány destilovanou vodou.
Výsledky na obr. 4 a 5 ukazují, že ve všech testovaných kmenech je přítomen očekávaný pruh a okolí 65 až 70 kDa (65 ()()() až 70 000), a dva hlavní pruhy v okolí 55 a 90 kD (55 000 a 90 000), které jasně souvisejí s tímto proteinem BASB029 (polymery, degradaění produkty). To znamená, že protein BASB029 se pravděpodobně exprimuje u všech, pokud ne u všech kmenů NmB. V obr. 4 se rekombinantní protein BASB029 objevuje ve formě čtyř rozdílných pruhů.
dvou při očekávaných molekulových hmotnostech 5 až 70 kDa (65 000 až 70 000). a dvou dalších při velmi vysokých molekulových hmotnostech (>200 kDa, 200 000), které jsou pravděpodobné agregáty rekombinantního proteinu BASB029.
Příklad 4: Přítomnost protilátek anti-BASB029 v sérech zotavených pacientů
Při tomto testu byla vyšetřována séra dostavených pacientů westernovým přenosem na rozpoznávání čištěného rekombinantního proteinu BASB029.
Ve stručnosti, 5 gg částečně purifikovaného proteinu BASB029 NmB se nanese na gradientový gel SDS-PAGE (4 až 20%. Novex, kód No. EC'60252) a provede sc elektroforetická migrace. Proteiny se převedou na nitrocelulózovou membránu (0,45 μηι, Bio-rad kód No. 162-0114) při napětí 100 V po dobu I h na blotovacím systému Bio-rad Trans blot systém (kód No. 1703930). Potom se filtr blokuje pufrem PBS-0,05% Tween 20 přes noc při teplotě laboratoře, před inkubací s lidským sérem, I ato séra se ředí stokrát pufrem PBS-0,05 Tween 20, a inkubují se na nitrocelu lóžové membráně 2 h při teplotě laboratoře za mírného třepání na systému mini-blotter systém (Miniprotean, Bio-rad kód 170-4017). Po třech opakovaných krocích promývání v pufru PBS-0,05% Tween 20 5 min. se nítrocelulózová membrána inkubuje při teplotě laboratoře 1 h za mírného třepání s vhodným konjugátem (biotinylované ovčí protilátky proti lidskému IgG, Amer15 shain kód No. RPNI003) při ředění 1/500 ve stejném promývacím pufru. Membrána se třikrát promyje jako předtím a inkubuje se 30 min za míchání s použitím komplexu streptavidin-peroxidáza (Amersham kód No. 1051) při ředění 1/1000 v promývacím pufru. Po posledních třech promývacích krocích sc provede vyvíjení po dobu 20 min v 50 ml roztoku obsahujícího 3 mg 4— chlor—I- naftolu (Sigma), 10 ml methanolu. 40 ml ultračisté vody a 30 μί H2O2. Barvení se zastaví několikanásobným promytím membrány destilovanou vodou.
Výsledky jsou ilustrovány na obr. 6 a 7, které ukazují, že u všech sedmi sér rekonvalescentů došlo k reakci s rekombinantním proteinem BASB029 v okolí molekulových hmotností 65 až 70 kDa (65 000 až 70 000). přičemž u většiny se také objevují dva horní pruhy (>200 kDa.
-27 CZ 299612 Bó
200 000), přičemž u několika z nich se objevuje pouze slabá reakce. Reakce proti proteinům s vysokou molekulovou hmotností potvrzuje, že tyto dva pruhy jasně souvisejí s proteinem BASB029, a že zde pravděpodobně o jejich agregované formy. V části A obr. 6 a 7 jsou vidět stejné reakce proti těmto čtyřem pruhům u imunizovaného myšího séra. To jasně potvrzuje, že všechny tyto čtyři pruhy souvisejí s rekombinantním proteinem BASBQ29. V obr. 7 jsou také ukázány negativní myší séra, která s rekombinantním proteinem nereagují.
Uložené materiály ío Kmen Netiseria meningitidis séroskupina B byla uložena ve sbírce American Typu Cul ture Collection (dále „ATCC) 22. června 1997 pod depozitním číslem 13090. Uložený mikroorganismus byl popsán jako Netiseria meningitidti (Albrecht a Ghon) a je lyofilizovaný a zahrnuje knihovnu insertu 1,5 až 2,9 kb zkonstruovanou z izolátu N. meiiingitidti. foto uložení se popisuje v Int, Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 8: 1-15 (1958).
Uložený kmen Netiseria memngiddti se zde označuje jako ..uložený kmen! nebo jako ..DNA uloženého kmenu.
Uložený kmen obsahuje úplný gen BASB029, Sekvence polynukleotidů obsažená v uloženém kmenu stejně jako jakákoli sekvence aminokyselin jakéhokoli polypeptidů kódovaného tímto nukleotidem je v případe jakéhokoli konfliktu týkajícího se popisu sekvenci rozhodující.
Uložení kmene bylo provedeno v souladu s Budapešťskou dohodou o mezinárodním uznávání ukládání mikroorganismů pro účely udělování patentů. Tento kmen bude neodvolatelně a bez omezení nebo podmínek zpřístupněn po udělení patentu veřejnosti. Uložený kmen se poskytuje pouze pro pohodlí odborníků v oboru a uložení neznamená, že by bylo považováno za nezbytné pro jasnost a úplnost popisu nebo jeho uskutečnění.
Claims (20)
- PATENTOVÉ NÁROKY35 1. Polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 97% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 po eclé délce sekvence SEQ ID No. 2, nebo je SEQ ID No. 4.
- 2. Polypeptid podle nároku 1, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 2.
- 3?27. Vakcinační prostředek podle některého z nároků 24 až 26, vyznačující se tím, že nosič obsahuje emulzi typu olej vc vodě obsahující metabolizovatelný olej.28. Vakcína podle nároku 27, vyznačující se tím, že metabolizovatelný olej obsahuje skvalen, alfa tokoferol a Tween 80.29. Vakcinační prostředek podle některého z nároků 21 až 28, vyznačující se tím. že obsahuje alespoň jeden další antigen Neisseria meningitidis.30. Způsob diagnostikování infekce Neisseria meningitidis, vyznačující se tím, že 45 zahrnuje identifikaci polypeptidu podle nároku 1 nebo 2, přítomného v biologickém vzorku z živočicha s podezřením na takovou infekci.31. Vakcinační prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje proteinový epitop schopný poskytnou prolylaktickou nebo terapeutickou imunitní odpověď vůči Neisseria meningi5(i tidis. přičemž proteinový epitop je identifikovatelný způsob zahrnujícím (i) podání imunogenního fragmentu podle kteréhokoliv z nároků 4 až 6. nebo polynukleotidu kódujícího tento fragment jedinci; a55 (ii) zjištění profylaktieké nebo terapeutické imunitní odpovědi jedince na Neisseria meningitidis.~ 30 Cl 299612 Bó32. Způsob čištění rekombinantního polypeptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 85% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4 nebo jeho fragmentu schopného, v případě potřeby při navázání na nosič, vyvolat imunitní odpověď3. Polypeptid složený z aminokyselinově sekvence SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4,
- 4. Imunogenní fragment polypeptidů obsahujícího aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 85% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4. kde uvedený45 fragment je schopný, případně potřeby navázaný na nosič, vyvolat imunitní odpověď rozpoznávající polypeptid SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4, a dále kde uvedený fragment postrádá Ckoncovou doménu kotvy.
- 5 rozpoznávající polypeptid SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4, vy z n a č uj í c í se tím, že uvedený způsob je zvolený ze skupiny složené ze srážení síranem amonným, srážení ethanolem. extrakce kyselinou, chromatografie na fosfocelulóze, chromatografie s hydrofobními interakcemi. chromatografie na hydroxylapatitu a lektinové ehromatografíe.ío33. Použití prostředku obsahujícího imunologicky účinné množství polypeptidu podle nároku 1 nebo 2, nebo imunogenního fragmentu podle kteréhokoli z nároků 4 až 6. při přípravě léčiva pro použití při vytváření imunitní odpovědi u živočicha.34. Použití prostředku obsahujícího imunologicky účinné množství polynukleotidu podle nekte15 rého z nároků 7 až 9, při přípravě léčiva pro použití při vytváření imunitní odpovědi u živočicha.35. Protilátka vytvořená proti imunogennímu fragmentu definovanému v kterémkoli z nároku 4 až 6.5 nebo nukleotidovou sekvenci úplně komplementární s uvedeným izolovaným polynukleotidem.5. Imunogenní fragment podle nároku 4, kde uvedený fragment dále postrádá N koncovou50 vedoucí sekvenci.
- 6. Imunogenní fragment polypeptidů obsahujícího aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4, kde uvedený fragment je nevariabilní oblast polypeptidu SEQ ID No. 2 při porovnání se SEQ ID No. 4 nebo polypeptidů SEQ ID No. 4 při porovnání se SEQ ID No. 2. a je- 78 CZ 299612 Bó schopný, v případe potřeby navázaný na nosič, vyvolal imunitní odpověď rozpoznávající polypeptid SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4.
- 7. Izolovaný polynukleotid. který' obsahuje nukleotidovou sekvenci, kterou jc SEQ ID No. 3;
- 8. Izolovaný polynukleotid složený z nukleotidové sekvence, kterou je SEQ ID No. 3.
- 9. Izolovaný polynukleotid kódující imunogen ní fragment podle kteréhokoli z nároků 4 až 6. to
- 10. Expresní vektor obsahující polynukleotid podle kteréhokoli z nároků 7 až 9.
- 11. Hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 10.is
- 12. Živý mikroorganismus obsahující expresní vektor podle nároku lí).
- 13. Hostitelská buňka N. meningitidis obsahující expresní vektor, kde uvedený expresní vektor obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 85% identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4,20 nebo jeho fragment schopný, v případě potřeby navázaný na nosič, vyvolat imunitní odpověď, která rozpoznává polypeptid SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4.
- 14. Hostitelská buňka podle nároku 13, kde uvedená nukleotidová sekvence má alespoň 85% identitu se sekvencí SEQ ID No. 3.
- 15. Membránová nebo subcelulární frakce hostitelské buňky exprimující polypeptid podle nároku 1 nebo 2, nebo imunogenní fragment polypeptidu podle některého z nároků 4 až 6,
- 16. Způsob výroby polypeptidu definovaného v nároku 1 nebo 2, nebo imunogenního fragmentu ta definovaného v kterémkoli z nároků 4 až 6, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 11. za podmínek dostačujících pro produkci uvedeného polypeptidu a izolaci polypeptidu z kultivačního média.
- 17. Způsob výroby polypeptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 85%35 identitu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4 nebo jeho fragmentu schopného, v případě potřeby při navázání na nosič, vyvolal imunitní odpověď rozpoznávající polypeptid SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4, vyznačující sc tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 13 nebo 14 za podmínek dostačujících pro produkci uvedeného polypeptidu a izolaci polypeptidu z kultivačního média.
- 18. Způsob exprese polynukleotidu podle některého z nároků 7 až 9, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 11 za podmínek dostačujících pro expresi kteréhokoli z uvedených polynukleotidů.45
- 19. Způsob exprese polynukleotidu, který má alespoň 85% identitu s polynukleotidem SEQ IDNo. 3, vy znač u j íc í se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 13 nebo 14 za podmínek dostačujících pro expresi kteréhokoli z uvedených polynukleotidů.20. Způsob produkce membrány definované v nároku 15. vyznačující se tím, že50 zahrnuje transformaci hostitelské buňky expresním vektorem obsahujícím polynukleotid kódující polypeptid podle nároku 1 nebo 2 nebo imunogenní fragment definovaný v některém z nároků 4 až 6. a kultivaci hostitelské buňky za podmínek dostačujících pro produkci uvedeného polypeptidu, a izolaci uvedené membrány z kultivačního média.-29CZ 299612 Bó21. Vakcinační prostředek, vyznačující sc tím, že obsahuje účinné množství polypeptidu podle nároku 1 nebo 2, nebo imunogenní fragment podle některého z nároků 4 až 6. a farmaceuticky přijatelný nosič.522. Vakcinační prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství polynukleotidu podle některého z nároků 7 až 9 a farmaceuticky přijatelný nosič.23. Vakcinační prostředek, vyznačující se tím. že obsahuje účinné množství membrány nebo subcelulámí frakce podle nároku 15. a farmaceuticky přijatelný nosič.Kl24. Vakcinační prostředek, v y z n a č u j í e í se tím. že obsahuje:(i) účinné množství polypeptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 85% identitu s aminokyselinou sekvencí SEQ ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4, nebo jeho fragmentu i? schopného, v případě potřeby při navázání na nosič, vyvolat imunitní odpověď rozpoznávající polypeptid SED ID No. 2 nebo SEQ ID No. 4;(ii) farmaceuticky přijatelný nosič; a20 (iii) adjuvans zvolené ze skupiny složené z DE-O-acylovaného monofosforyllipidu A. QS21, QS21 a cholesterolu, imunomodulačního oligonukleotidů ajejich kombinací.25. Vakcinační prostředek, v y z n a c uj í c í se tím. že obsahuje:25 (i) účinné množství polynukleotidu s alespoň 85% identitou s polynukleolidem SEQ ID No. 3;(ii) farmaceuticky přijatelný nosič; a (iii) adjuvans zvolené ze skupiny složené z. De-0 acylovaného monofosfory llipidu A, QS21, 30 QS21 a cholesterolu, imunomodulačního oligonukleotidů ajejich kombinací.26. Vakcína podle nároku 24 nebo 25. vyznačující se tím, že imunomodulační oligonukleotid je ncmethylovaný CpG.
- 20 36. Terapeutický prostředek použitelný při léčení člověka s onemocněním vyvolaným Neisseria meningilidi.st vyznačující se tím. že obsahuje alespoň jednu protilátku proti fragmentu definovanému v některém z nároků 4 až 6. a vhodný farmaceutický nosič.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9810276.7A GB9810276D0 (en) | 1998-05-13 | 1998-05-13 | Novel compounds |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ20004202A3 CZ20004202A3 (en) | 2001-05-16 |
CZ299612B6 true CZ299612B6 (cs) | 2008-09-17 |
Family
ID=10831992
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20004202A CZ299612B6 (cs) | 1998-05-13 | 1999-05-07 | Polypeptid a polynukleotid Neisseria meningitidis, vektor, hostitelská bunka, vakcinacní prostredek, protilátka a zpusob výroby |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6780419B1 (cs) |
EP (2) | EP1621623A3 (cs) |
JP (2) | JP4707832B2 (cs) |
KR (4) | KR100673674B1 (cs) |
CN (1) | CN1322127C (cs) |
AT (1) | ATE311457T1 (cs) |
AU (1) | AU750032B2 (cs) |
BR (1) | BR9910396A (cs) |
CA (1) | CA2328403C (cs) |
CY (1) | CY1105676T1 (cs) |
CZ (1) | CZ299612B6 (cs) |
DE (1) | DE69928658T2 (cs) |
DK (1) | DK1078063T3 (cs) |
ES (1) | ES2252946T3 (cs) |
GB (1) | GB9810276D0 (cs) |
HK (1) | HK1036300A1 (cs) |
HU (1) | HUP0102479A3 (cs) |
IL (2) | IL139613A0 (cs) |
NO (2) | NO326994B1 (cs) |
NZ (1) | NZ508323A (cs) |
PL (1) | PL197449B1 (cs) |
TR (1) | TR200003347T2 (cs) |
WO (1) | WO1999058683A2 (cs) |
ZA (1) | ZA200006523B (cs) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9726398D0 (en) * | 1997-12-12 | 1998-02-11 | Isis Innovation | Polypeptide and coding sequences |
CA2317815A1 (en) † | 1998-01-14 | 1999-07-22 | Chiron S.P.A. | Neisseria meningitidis antigens |
GB9810276D0 (en) * | 1998-05-13 | 1998-07-15 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
DE60015084T2 (de) * | 1999-02-26 | 2006-02-16 | Chiron S.R.L. | Verbesserung der bakterizidaktivität von neisseria antigenen mit cg enthaltende oligonukleotiden |
GB9916529D0 (en) * | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
ES2543736T3 (es) | 1999-10-29 | 2015-08-21 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Péptidos antigénicos de Neisseria |
GB9928196D0 (en) | 1999-11-29 | 2000-01-26 | Chiron Spa | Combinations of B, C and other antigens |
DK2289545T3 (en) | 2000-01-17 | 2016-09-05 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Supplemented OMV vaccine against meningococcus |
NZ520445A (en) | 2000-01-25 | 2004-02-27 | Univ Queensland | Proteins comprising conserved regions of neisseria meningitidis surface antigen NhhA |
PT2270030E (pt) | 2000-02-28 | 2012-07-24 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Expressão heteróloga de proteínas de neisseria |
EP2248822B1 (en) | 2001-07-27 | 2016-11-23 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Meningococcus adhesins |
KR101239242B1 (ko) | 2002-08-02 | 2013-03-11 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 항원 조합물을 포함하는 나이세리아 백신 조성물 |
AU2003274511B2 (en) | 2002-10-11 | 2009-06-04 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Polypeptide-vaccines for broad protection against hypervirulent meningococcal lineages |
BRPI0415025A (pt) | 2003-10-02 | 2006-12-12 | Chiron Srl | vacinas lìquidas para sorogrupos meningocócicos múltiplos |
US7459930B2 (en) * | 2006-11-14 | 2008-12-02 | Micron Technology, Inc. | Digital calibration circuits, devices and systems including same, and methods of operation |
GB0700562D0 (en) | 2007-01-11 | 2007-02-21 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Modified Saccharides |
GB0916570D0 (en) | 2009-09-21 | 2009-10-28 | Royal Holloway & Bedford New C | Method |
JP2013522177A (ja) | 2010-03-11 | 2013-06-13 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | グラム陰性細菌性、例えば髄膜炎菌性の感染または疾患に対する免疫原性組成物またはワクチン |
SG11201403877PA (en) * | 2012-01-05 | 2014-09-26 | Deutsches Krebsforsch | Means and methods for treating or diagnosing idh1 r132h mutant-positive cancers |
WO2018022031A1 (en) | 2016-07-27 | 2018-02-01 | Prysmian S.P.A. | Flexible optical-fiber ribbon |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0301992A2 (en) * | 1987-07-30 | 1989-02-01 | Centro Nacional De Biopreparados | Vaccine against group B Neisseria meningitidis, gammaglobulin and transfer factor |
WO1993006861A1 (fr) * | 1991-10-03 | 1993-04-15 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins S.A. | VACCIN CONTRE LES INFECTIONS A $i(NEISSERIA MENINGITIDIS) |
WO1999031132A1 (en) * | 1997-12-12 | 1999-06-24 | The University Of Queensland | NOVEL SURFACE PROTEIN OF $i(NEISSERIA MENINGITIDIS) |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4769240A (en) * | 1980-09-15 | 1988-09-06 | Bactex, Inc. | Pili of neisseria and vaccine compositions containing same |
US4702911A (en) * | 1985-09-27 | 1987-10-27 | Immunomed Corporation | Preparation of bacterium pili subunits and vaccines containing pili subunits |
US6245337B1 (en) * | 1994-08-25 | 2001-06-12 | Washington University | Haemophilus adherence and penetration proteins |
US6121037A (en) * | 1994-10-18 | 2000-09-19 | Stojiljkovic; Igor | Bacterial hemoglobin receptor genes |
US5646259A (en) * | 1995-03-24 | 1997-07-08 | St. Louis University | DNA encoding haemophilus adhesion proteins |
US6265567B1 (en) * | 1995-04-07 | 2001-07-24 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Isolated FrpB nucleic acid molecule |
CU22559A1 (es) * | 1996-01-17 | 1999-05-03 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Sistema de expresión de antígenos heterologos en e. coli como proteínas de fusión |
CA2317815A1 (en) * | 1998-01-14 | 1999-07-22 | Chiron S.P.A. | Neisseria meningitidis antigens |
GB9810276D0 (en) * | 1998-05-13 | 1998-07-15 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
DK1228217T3 (da) * | 1999-04-30 | 2013-02-25 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Konserverede neisseria-antigener |
-
1998
- 1998-05-13 GB GBGB9810276.7A patent/GB9810276D0/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-05-07 BR BR9910396-6A patent/BR9910396A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-05-07 CN CNB998086061A patent/CN1322127C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-07 PL PL345281A patent/PL197449B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-05-07 EP EP20050077297 patent/EP1621623A3/en not_active Withdrawn
- 1999-05-07 CZ CZ20004202A patent/CZ299612B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-05-07 DE DE69928658T patent/DE69928658T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-07 US US09/700,293 patent/US6780419B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-07 KR KR1020007012700A patent/KR100673674B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-05-07 NZ NZ508323A patent/NZ508323A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-05-07 AU AU41420/99A patent/AU750032B2/en not_active Ceased
- 1999-05-07 DK DK99924946T patent/DK1078063T3/da active
- 1999-05-07 KR KR1020087014761A patent/KR20080070073A/ko active Application Filing
- 1999-05-07 WO PCT/EP1999/003255 patent/WO1999058683A2/en active IP Right Grant
- 1999-05-07 JP JP2000548474A patent/JP4707832B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-07 EP EP99924946A patent/EP1078063B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-07 TR TR2000/03347T patent/TR200003347T2/xx unknown
- 1999-05-07 IL IL13961399A patent/IL139613A0/xx unknown
- 1999-05-07 KR KR1020097024661A patent/KR20100019461A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-05-07 CA CA2328403A patent/CA2328403C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-07 AT AT99924946T patent/ATE311457T1/de active
- 1999-05-07 HU HU0102479A patent/HUP0102479A3/hu unknown
- 1999-05-07 KR KR1020067009829A patent/KR100897951B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-05-07 ES ES99924946T patent/ES2252946T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-11-10 NO NO20005696A patent/NO326994B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-11-10 IL IL139613A patent/IL139613A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-11-10 ZA ZA200006523A patent/ZA200006523B/xx unknown
-
2001
- 2001-08-13 HK HK01105651A patent/HK1036300A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-07-22 US US10/896,778 patent/US20040265332A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-01-17 CY CY20061100057T patent/CY1105676T1/el unknown
-
2007
- 2007-12-07 US US11/999,978 patent/US20090093622A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-03-02 NO NO20090955A patent/NO20090955L/no not_active Application Discontinuation
-
2010
- 2010-03-01 JP JP2010044336A patent/JP2010166921A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0301992A2 (en) * | 1987-07-30 | 1989-02-01 | Centro Nacional De Biopreparados | Vaccine against group B Neisseria meningitidis, gammaglobulin and transfer factor |
WO1993006861A1 (fr) * | 1991-10-03 | 1993-04-15 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins S.A. | VACCIN CONTRE LES INFECTIONS A $i(NEISSERIA MENINGITIDIS) |
WO1999031132A1 (en) * | 1997-12-12 | 1999-06-24 | The University Of Queensland | NOVEL SURFACE PROTEIN OF $i(NEISSERIA MENINGITIDIS) |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
St. Geme , J.W. 3rd et al.: "Characterization of the genetic locus encoding Haemophilus influenzae type b surface fibrils", J. Bacteriol. Vol 178, No. 21, 6281-6287, 1996 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20090093622A1 (en) | BASB029 polynucleotide(s) and polypeptides from Neisseria meningitidis | |
US20100196409A1 (en) | Basb006 polypeptides from neisseria meningitidis and immunogenic compositions thereof | |
US20060189792A1 (en) | Neisseria meningitidis antigenic polypeptides, corresponding polynucleotides and protective antibodies | |
EP1702986A1 (en) | BASB013 DNA and proteins from Neisseria meningitidis | |
US20080219986A1 (en) | Polynucleotides and polypeptides BASB033 from neisseria meningitidis and their uses | |
CA2341079A1 (en) | Basb024 outer membrane protein of neisseria meningitidis | |
CZ20004395A3 (cs) | Antigenní polypeptidy Neisseria meningitidis, příslušné polynukleotidy a protektivní protilátky |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20140507 |