CZ398197A3 - Cytoplazmatické modulátory regulace a signalizace integrinu - Google Patents

Description

Cytoplazmatické modulátory regulace a signalizace integrinu

Oblast techniky

Vynález se obecně týká proteinů, zahrnutých v integrinových signalizačních drahách. Vynález se konkrétněji týká rodiny proteinů, zde označených jako proteiny integrinové regulace (IRP), které reguluji účinnost integrinu, a dvou členů této proteinové rodiny, označených jako IRP-1 a IRP-2.

Dosavadní stav techniky

Integriny jsou heterodimerové povrchové molekuly, tvořené a a β podjednotkami spojenými nekovalentni vazbou.

Všechny integriny jsou transmembránovými proteiny s protireceptorovou vazebnou účinnosti, umístěné v extracelulární doméně. Integriny rovněž vykazují relativně krátké cytoplazmatické oblasti, transmembránových signalizačních které jevech.

participuji při

Integriny jsou schopny vzájemně reagovat s dalšími protireceptory navázanými v buňce, složkami extracelulární matrice a stejně tak s rozpustnými faktory. Navázání extracelulárnich ligandů vede k zesiťováni a lokálnímu shlukováni integrinu [Miyamoto a kol., Science, 267: 833 (1995)] a vytvořeni fokálních adhezi, ve kterých jsou cytoplazmatické domény integrinových shluků spojeny s cytoskeletni složkou, zahrnující například aktinová vlákna [Pavalko a Otey, Proč,

Soc. Exp. Biol. Med., 205: 32767 (1994) a Gumbiner, Neuron,

11: 551 (1993)]. I když se většina výzkumů, zabývajících se fyziologickou aktivitou integrinu, zaměřuje na identifikaci • · · · specifických extracelulárních receptoru, o interakcích integrinů s cytoplazmatickými složkami se ví pouze málo. Nicméně studie mutací ukázaly, že pro to, aby se integriny spojily s fokálními kontakty, jsou zapotřebí cytoplazmatické sekvence [LaFlamme a kol., J. Cell. Biol., 117: 437 (1992)] .

I když byla identifikována celá řada integrinů, ukázalo se, že pro leukocyty jsou unikátní určité podsoubory, přičemž každý člen podsouboru má charakteristickou buněčně specifickou expresi a vazebné vlastnosti protireceptoru. Z integrinů, specifických pro leukocyty, jsou známy alespoň tři β₂ integriny, z nichž každý sestává z unikátní a podjednotky ve spojení s β₂ podjednotkou (označenou jako CD18) [Kishimoto a kol.,

Cell,

48: 681-690 (1987)].

Přehled dosavadního stavu techniky pro β₂ integriny lze nalézt například ve

Springerově publikaci Cell,

Ί6; 301 až 314 (1994).

CDlla/CD18, rovněž známý jako αιβ₂ nebo LFA-1,

exprimován ve všech leukocytech a ukázalo se, že se váže na

ICAM-1, ICAM-2 a ICAM-3. CDllb/CD18, rovněž známý jako α_Μβ₂ nebo MAC-1, je exprimován v polymorfonukleárních neutrofilech, monocytech a eosinofilech a ukázalo se, že se váže na ICAM-1, komplementární faktor iC3b, faktor X a fibrinogen. CDllc/CD18, rovněž známý jako α_χβ₂ nebo pl50/95, je exprimován v monocytech, polymorfonukleárními neutrifily a eosinofily, a ukázalo se, že se váže na komplementární faktor iC3b a fibrinogen. Kromě toho byl nedávno identifikován čtvrtý lidský β₂ integrin, označený jako oic$₂ [Van der Vieren a kol., Immunity, 3: 683-690 (1995)] .

• · · · β₇ integrinová podjednotka je ve

spojeni s a₄ podjednotkou exprimována převážně na

Heterodimer buněčného povrchu rozpoznává leukocytech.

protireceptor nacházející se ve střevě označený jako molekula s adhezi k mukosoadresinové buňce (MadCAM) a zdá se, že hraje klíčovou roli při vázáni lymfocytu na intestinálni tkáň [Berlin a kol., Cell 74:185-195 (1993)]. Ukázalo se, že α₄β₇ se váže na VCAM [Chán a kol., J. Biol. Chem. 267:8366-8370 (1992)]. Způsobem obdobným s účinkem dříve spojovaným pouze se selektinovými povrchovými molekulami se ukázalo, že α₄β₇ participuji v selektinově nezávislém připojeni lymfocytu k zaníceným venulám za průtokovém podmínek [Berlin a kol., Cell 80:413-422 (1995)]. Zvířecí modely, používající protilátky imunospecifické pro a₄ podjednotku, naznačuji, že α₄β₇ nebo cc₄ ve spojeni s βχ integrinovou podjednotkou mohou hrát roli v celé řadě chorobných stavů, včetně experimentální alergické encefalomyelitidy [Yednock a kol., Nátuře 356:63-66 (1992); Baron a kol., Exp. Med. 177:57-68 (1993)]; kontaktní hypersensitivity [Ferguson a Kupper, J. Immunol. 150:1172-1182 (1993); Chisholm a kol., Eur. J. Immunol. 23:682-688 (1993)]; a neobézni cukrovky [Yang a kol., Proč. Nati. Acad. Sci (USA) 90:10494-10498 (1993); Burkly a kol., Diabetes 43:529-534 (1994); Baron a kol., J. Clin. Invest. 93:1700-1708 (1994)].

Ukázalo se, že integriny jsou jedním z hlavních typů proteinů, podílejících se na dopravě leukocytů tělem. Leukocyty konstantně recirkuluji mezi lymfoidními orgány a ostatními tkáněmi tím, že prochází z mízy a krve skrze endotelovou buněčnou vrstvu vaskulatury a pronikají tkáni, ležící pod ní. Jedním aspektem složkou zánétlivých a autoimunitnich chorob je přítok leukocytů do zanícených míst. Proti zánětu v těchto místech lze bojovat pomoci • · • · · ···· · β·· · · · · ··· ···· ·· ·» ·· · · ·® monoklonálních protilátek imunospecifických pro integriny, které blokují nebo inhibuji funkci leukocytů. Pro přehled viz například Lobb a Hemler, J. Clin. Invest. 94:1722-1728 (1994) . Modulace integrinové funkce je jedním způsobem, jak lze provést rozpuštěni zánětu, nicméně zatím se ví příliš málo o specifických cytoplazmatických složkách regulace a signalizace integrinů.

Liu a Pohajdak, Biochimica et Biophysica Acta, 1132: 75-78 (1992) popisuje lidský cDNA klon, označený jako B2-1, který kóduje domény, mající protein homologický s kvasinkovým SEC7 proteinem, olihňový kinesin, pleckstrin a dynamin. Zmíněný článek uvádí, že protože B2-1 je homologem pouze malé části kvasinkového SEC7 proteinu, není jednoznačně prokázáno, že B2-1 je lidským homologem kvasinkového proteinu, který není pravděpodobně dán rozdíly vně motivu SEC7. Tento článek dále tvrdí, že B2-1 se může podílet na reorientaci golgiho/sekrečnich granuli NK buněk k cílovým buňkám během cytolýzy. Schiller a Kolanus [,,A dominant negative effect of the human Sec7 PH domain on β₂ integrin mediated binding to ICAM-1, 3rd Adhezion Meeting of the German Immunology Association, Regensburg, Germany,

14. až 15. březen 1995] popisují lidský protein, mající podobné motivy, které vzájemně reagují s cytoplazmatickou doménou β₂ integrinů a uvádějí, že přeexprimování PH domény proteinu má za následek silně dominantní negativní účinek na aktivačně závislou aviditu β₂ integrinů v Jurkatových buňkách. Nicméně, Schiller a Kolanus neukazují: (i) na existenci proteinů integrinové regulace (IRP), které výhodně vzájemně reagují s integriny a/nebo modulují integrinovou účinnost, (ii) IRP které, pokud se kontransfekovaly s DNA kódující integrin v COS buňkách, regulují de novo expresi kotransfekovaného integrinů, nebo • · • · «· ··· ···· • · · · « ·« <··· · ··· · · · · · · · ···· ·· · · ·· · · ·· (iii) IRP, které moduluji navázání a otáčení JY buněk za proudových podmínek.

Z výše uvedeného vyplývá, že v dané oblasti existuje potřeba identifikovat molekuly, které se váží na integriny a/nebo modulovat vazby, a/nebo signalizační aktivity integrinů a vyvinout metody, které by mohly tyto molekuly identifikovat. Tyto metody, a molekuly identifikované pomocí těchto metod, poskytnou praktický prostředek pro terapeutický zákrok v případě integrinem zprostředkované imunitní a zánětlivé odezvy.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje nové proteiny integrinové regulace (IRP), které představují cytoplazmatické složky β₂ a/nebo β₇ integrinovou regulaci, a/nebo signalizační cesty.

Jedním předmětem vynálezu je poskytnutí čistých a izolovaných polynukleotidů (např. DNA a RNA, jak jejich kóduj ících, tak nekódujících řetězců) kódujících IRP-1 a

IRP-2. Uvažované polynukleotidy zahrnuji genomové DNA, RNA, cDNA kyseliny a zcela nebo částečně chemicky syntetizované DNA kyseliny. Mezi výhodné polynukleotidy podle vynálezu lze zařadit IRP-1 DNA sekvenci, zde uvedenou jako SEQ ID č.: 1, IRP-2 DNA, zde uvedenou jako SEQ ID č.: 2, a DNA sekvence, které hybridizují na jejich nekódující řetězce za velmi přísných podmínek, nebo které by hybridizovaly, ale z důvodu nadbytečnosti genetického kódu. Příkladné, velmi přísné hybridizační podmínky jsou následující: hybridizace při 42°C v 5X SSPE, 45% formamidu a promývání při 65°C ve 0,2X SSC, nebo při 50°C v IX SSC.

Je zřejmé, že lze použít varianty těchto podmínek, které • · · · • ·

	6	• · • · • · · • · · · · ·	• · 9 · · · « • · · ·· ···· • · · · · · « · · · · · ·«
budou odpovídat	dané délce	sekvencí	a obsahu GC
nukleotidové	báze	v těchto	sekvencích,	určených pro
hybridizací.	Pro	stanovení velmi přísných	hybridizačních

podmínek existují v daném oboru standardní vzorce, viz například Sambrook a kol., 9.47-9.51 v Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) .

Informace o DNA sekvenci podle vynálezu umožňují identifikovat a izolovat DNA kódující odpovídající molekuly dobře známými technikami, například výše popsanou DNA/DNA hybridizací, a polymerázovým reakčním klonováním řetězce (PCR). Znalost sekvence cDNA, kódujících IRP proteiny, například umožňuje pomocí DNA/DNA hybridizace izolovat genové DNA sekvence, kódující IRP proteiny, a exprimovat řídící sekvence regulátorů, například promotorů, operátorů apod.. Dá se očekávat, že DNA/DNA hybridizační procesy se provádí za použití DNA sekvencí podle vynálezu za přesně vymezených podmínek, které umožní izolaci DNA kódujících alelové varianty IRP proteinů; nehumálních druhů proteinových strukturně homologů těchto příbuzných proteinů,

IRP proteinů; a dalších sdílejících alespoň jednu schopnost vzájemně reagovat s členy nebo regulátory β2 a/nebo β₇ integrinových regulačních drah, ve kterých IRP participuj i.

proteiny vynálezu detekovatelně hybridizačních testech, syntetizování IRP rovněž

Pokud se označí, jsou stanovuj ících proteinů.

Informace umožňuj e strategie vyvinout „knockout polynukleotidy podle rovněž použitelné při kapacitu buněk pro o DNA sekvenci podle pomocí rekombinace [viz například,

Science, 244: 1288-1292 (1989)] hlodavce, kteří nebo vynálezu homologů

Capecchi, nejsou schopny exprimovat funkční IRP proteiny, nebo kteří exprimuji varianty IRP proteinů. Tyto hlodavce lze použít • · • · · · • · · · · ···· • »φ· · ·· ···· · ··· · · · · · · · ···· · · ·· ·· · · ·· jako modely pro studium aktivit IRP proteinů a IRP modulátorů in vivo. Polynukleotidy podle vynálezu mohou rovněž představovat základ diagnostických metod, používaných pro identifikaci genetických změn v místě IRP proteinu, které podléhá chorobnému stavu nebo stavům. Vynález rovněž poskytuje antimediátorové nukleotidy důležité pro regulaci exprese IRP proteinů pomocí těch buněk, které původně exprimovaly totéž.

Vynález rovněž poskytuje autonomní replikační rekombinantní konstrukce, například plazmid a virové DNA vektory, zabudovávající polynukleotidy podle vynálezu, zejména vektory, ve kterých jsou polynukleotidy navázány na endogenní nebo heterologní expresní kontrolní DNA sekvenci a transkripční terminátor.

Předmětem vynálezu je rovněž stabilní transformace nebo transfekce hostitelských buněk, zejména jednobuněčných hostitelských buněk, například prokaryotických a eukarytických buněk, DNA kyselinami podle vynálezu, způsobem umožňujícím expresi IRP proteinů v těchto buňkách. Hostitelské buňky podle vynálezu jsou zvláště použitelné u způsobů, produkujících IRP proteiny ve větším měřítku, ve kterém buňky rostou ve vhodném kulturním médiu a požadované proteiny se izoluji z buněk nebo z média, ve kterém tyto buňky rostou.

Do rozsahu vynálezu spadají IRP polypeptidové produkty, obsahující část aminokyselinové sekvence nebo celou sekvenci, označenou jako SEQ ID č.: 2 (IRP-1) a

SEQ ID č. : 4 (IRP-2). Očekává se, že použití savčích hostitelských buněk poskytne takové posttranslačni modifikace (například merystoylaci, glykosylaci a zkrácení a tyrosinovou, serinovou nebo threoninovou fosforylaci), • · · • · • · které mohou být potřebné pro udělení optimální biologické účinnosti rekombinantním expresním produktům podle vynálezu. Předmětem vynálezu jsou rovněž fúzní polypeptidy, ve kterých jsou IRP aminokyselinové sekvence exprimovány těsně vedle aminokyselinových sekvencí, odvozených z dalších polypeptidu. Fúzní polypeptidy podle vynálezu zahrnují polypeptidy s modifikovanými biologickými, biochemickými a/nebo imunologickými vlastnostmi, v porovnání s přirozeně se vyskytujícím polypeptidem. Součástí vynálezu jsou rovněž multimerové formy IRP proteinů. Polypeptidové produkty podle vynálezu mohou mít délce nebo mohou obsahovat jejich fragmenty, varianty.

Varianty zahrnují IRP proteiny, přirozeně nebo do je alespoň polypeptidy po celé případně ve kterých kódovaná) aminokyselina kterých je alespoň jedna specifikovaná (tj .

vynechána nebo nahrazena, jedna nespecifikovaná aminokyselina přidána: (1) bez ztráty schopnosti vzájemně reagovat se členy nebo regulátory β₂ a/nebo β₇ signalizační dráhy, nebo (2) neschopností vzájemně reagovat se členy nebo regulátory β₂ a/nebo β₇ signalizační dráhy. Proteiny, které vzájemně reagují s IRP proteiny lze identifikovat pomocí celé řady testů.

Prvním testem podle vynálezu je test „two-hybrid screen. Dvouhybridní systém se vyvinul v kvasinkách [Chien a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA), 88: 9578-9582 (1991)] a je založen na funkční in vivo rekonstituci transkripčního faktoru, který aktivuje reporterový gen. Konkrétně polynukleotid, kódující protein, který vzájemně reaguje s IRP proteiny, se izoluje transformací nebo transfekcí vhodných hostitelských buněk pomocí DNA konstruktu, obsahujícího reporterový gen pod kontrolou promotoru, regulovaného transkripčnim faktorem, majícím DNA vazebnou • · • · doménu a aktivační doménu; exprimovánim první hybridní DNA sekvence, kódující první fúzi části nebo celého IRP proteinu a DNA vazebné domény, nebo aktivační domény transkripčního faktoru v hostitelských buňkách; exprimovánim knihovny druhých hybridních DNA sekvencí, kódujících druhé fúze části nebo celých předpokládaných IRP vazebných proteinů a DNA vazebné domény, nebo aktivační domény transkripčního faktoru, která není zabudována v první fúzi, v hostitelských buňkách; detekováním vazeb IRP

interakčního	proteinu na IRP proteiny v příslušné
hostitelské	buňce vytvořením reporterového genového
produktu v	hostitelské buňce; a izolováním druhých

hybridních DNA sekvencí, kódujících interakční protein z příslušné hostitelské buňky. Pro tento test jsou výhodné pro řízenou expresi lacZ reporterového genu GAL4 aktivační sekvence proti směru exprese genu, transkripční faktor, obsahující GAL4 DNA vazebná doména a GAL4 transaktivační doména a kvasinkové hostitelské buňky.

Další testy, používané pro identifikaci vzájemně reagujících s IRP proteiny, mohou proteinů, zahrnovat imobilizaci IRP proteinů nebo testovaného proteinu, detekovatelné označení neimobilizovaného vazebného partnera, vzájemnou inkubaci vazebných partnerů stanovení množství označených vazeb.

Označená vazba naznačuje, že testovaný protein vzájemně reaguje s IRP proteiny.

Další typ testu, používaný pro identifikaci IRP interakčních proteinů, zahrnuje imobilizaci IRP proteinů nebo jejich fragmentů na pevném nosiči, potaženém (nebo napuštěném) fluorescenčním činidlem; označení testovaného proteinu sloučeninou, schopnou excitovat fluorescenční činidla; uvedení imobilizovaných IRP proteinů do kontaktu s označeným testovaným proteinem; detekování světelné emise • · • · · · 9 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 99 9 9

9999 99 99 99 ···· fluorescenčním činidlem; a identifikování interakcí proteinů jako testovaných proteinů, které jsou výsledkem emise světla fluorescenčním činidlem. Alternativně lze imobilizovat předpokládaný interakční protein a IRP proteiny označit.

Předmětem vynálezu jsou rovněž protilátky a další vazebné proteiny (například proteiny identifikované ve výše zmíněných testech), které jsou specifické pro IRP proteiny podle vynálezu. Protilátky podle vynálezu zahrnují monoklonální, polyklonální, antiidiotypické a rekombinantní (tj . humanizované, chimérické atd.) protilátky a jejich fragmenty. Do rozsahu vynálezu spadají rovněž buněčné linie (například hybridomové buněčné linie), které produkují protilátky podle vynálezu. Vazebné proteiny lze vyvinout za použití izolovaných přírodních nebo rekombinovaných IRP polypeptidových produktů. Tyto vazebné proteiny lze zase použít pro čištění rekombinantních a přirozeně se vyskytujicích IRP polypeptidových produktů a pro identifikaci buněk, produkujících tyto produkty. Testy, detekující a kvantifikující proteiny v buňkách a tekutinách, mohou zahrnovat jedinou protilátku nebo množinu protilátek v „sendvičovém formátu. Tyto vazebné proteiny jsou rovněž výhodně použitelné při modulaci (tj. blokování, inhibování nebo stimulaci) IRP interakcí se složkami β₂ a/nebo β₇ integrinové signalizační dráhy.

Specifickými příklady monoklonálních protilátek podle vynálezu jsou monoklonální protilátky, produkované hybridomovými buněčnými liniemi 200A, 200B a 233G. Tyto buněčné linie jsou uloženy ve sbírce Američan Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD.

20852, 2. dubna 1997. Depozitním číslem pro linii 200A je • · · «

HB-12331, pro linii 200B HB-12332 a pro linii 233G

HB-12333.

Testy, používané pro identifikaci sloučenin, které moduluji interakci IRP proteinů s dalšími proteiny nebo lipidy, mohou zahrnovat transformováni nebo transfekce vhodných hostitelských buněk DNA konstruktem, obsahujícím reporterový gen pod kontrolou promotoru, regulovaného transkripčním faktorem, majícím DNA vazebnou doménu a aktivační doménu; expresi první hybridní DNA sekvence, kódující první fúzi části nebo celého IRP proteinu a DNA vazebné domény, nebo aktivační domény transkripčního faktoru, v hostitelských buňkách; expresi druhé hybridní DNA sekvence, kódující druhou fúzi části nebo celého IRP proteinu a DNA vazebné domény, nebo aktivační domény transkripčního faktoru, v hostitelských buňkách, která není zabudována v první fúzi; vyhodnocení vlivu testované sloučeniny na interakci mezi IRP proteinem a interakčním proteinem detekováním vazby interakčního proteinu na IRP proteiny v příslušné hostitelské buňce měřením produkce reporterového genového produktu v hostitelské buňce v přítomnosti testované sloučeniny nebo za její absence; a identifikování modulačních sloučenin jako těch testovacích sloučenin, které způsobují změnu produkce reporterového genového produktu, v porovnání s produkcí reporterového genového produktu v nepřítomnosti modulační sloučeniny. V tomto testu lze výhodně použít pro řízenou expresi lacZ reporterového genu GAL4 aktivační sekvence proti směru exprese genu, transkripční faktor, obsahující GAL4 DNA vazebnou doménu a GAL4 transaktivační doménu a kvasinkové hostitelské buňky.

Další typ testu, používaný pro identifikaci sloučenin, které modulují interakci mezi IRP proteiny a interakčním • ·

proteinem nebo lipidem, zahrnuje imobilizaci IRP proteinů nebo přirozeného IRP interakčního proteinu, detekovatelné označení neimobilizovaného vazebného partnera, vzájemné inkubováni vazebných partnerů a určeni vlivu testované sloučeniny na množství označených vazeb, přičemž snížení počtu označených vazeb v přítomnosti testované sloučeniny oproti počtu označených vazeb v nepřítomnosti testované sloučeniny naznačuje, že testované činidlo je inhibitorem IRP interakce s daným proteinem. Naopak zvýšení počtu označených vazeb v přítomnosti testované sloučeniny oproti počtu označených vazeb v nepřítomnosti testované sloučeniny naznačuje, že předpokládaný modulátor je aktivátorem IRP interakce s daným proteinem.

Další způsob podle vynálezu pro identifikaci sloučenin, které modulují vazby mezi IRP proteiny a interakčním proteinem nebo lipidem, zahrnuje imobilizaci IRP proteinů nebo jejich fragmentů na pevném nosiči, potaženém (nebo napuštěném) fluorescenčním činidlem;

označení interakčního proteinu sloučeninou, schopnou excitovat fluorescenční činidla;

uvedení imobilizovaných

IRP proteinů do kontaktu s označeným interakčním proteinem;

detekování světelné emise fluorescenčním činidlem; a identifikování modulujících sloučenin jako těch testovaných sloučenin, které ovlivňuji emisi světla fluorescenčním činidlem, v porovnání s emisí světla fluorescenčním činidlem v nepřítomnosti testované sloučeniny. Alternativně lze imobilizovat předpokládaný IRP interakční protein a IRP proteiny označit.

Modulátory IRP proteinů mohou ovlivňovat ARF, PI, βι, β₂, β₃ a/nebo β₇ integrinovou regulační a signalizační aktivitu, IRP lokalizaci v buňce, a/nebo IRP interakci se • · · · • · • ··· · ·· ···· · • · · · · · · ··· ···· ·· ·· ·· ·· ·· 13 členy ARF, PI, βι, β2, βί a/nebo β₇ integrinových signalizačních drah. U kombinatorických knihoven peptidů a peptidových mimetik, definovaných chemických entit, oligonukleotidů a knihoven přirozených produktů, lze pomocí testů (například výše uvedených testů) určit, zda-li jsou aktivní jako modulátory. Selektivní modulátory mohou například zahrnovat polypeptidy nebo peptidy, které se specificky váží na IRP proteiny nebo IRP nukleovou kyselinu, oligonukleotidy, které se specificky váží na IRP nukleovou kyselinu a/nebo další nepeptidové sloučeniny (například izolované nebo syntetické organické molekuly), které specificky reagují s IRP proteiny nebo IRP nukleovou kyselinou. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají mutantní formy IRP proteinů, které ovlivňují vazebnou aktivitu nebo buněčnou lokalizaci standardních IRP proteinů. Modulátory ARF, PI, βι, β₂, ββ a/nebo βν/IRP interakce, identifikované způsoby podle vynálezu, se použiji in vitro nebo in vivo pro ovlivnění zánětlivých procesů, jejichž součástí jsou leukocyty. Kromě toho lze modulační sloučeniny, které s váží na ARF, PI, βι, β2, β3 a/nebo β₇ integriny nebo IRP proteiny použít při monitorování hladin ARF, PI, βι, β₂, β3 a/nebo β₇ v biologických vzorcích, zahrnujících tělní tekutiny nebo bioptickou tkáň.

IRP modulátory mohou být formulovány v kompozicích, obsahujících farmaceuticky přijatelné nosiče. Dávková množství těchto modulátorů by měla být dostatečná pro dosažení modulace IRP/βι, β₂, β3 nebo β₇ integrinové signalizace nebo regulace in vivo.

Další cíle a výhody vynálezu se stanou zřejmějšími po prostudování následujícího podrobného popisu.

• · · ·

Stručný popis obrázků

Obr. 1 znázorňuje graf ukazující schopnost JY buněk, exprimujících označené polypeptidy, vázat VCAM-1;

obr. 2 znázorňuje graf ukazující schopnost JY buněk, exprimujících označené polypeptidy, vázat ICAM-1;

obr. 3 znázorňuje seřazení aminokyselinových sekvencí IRP-1, IRP-2, B2-1 a C. Elegans homologu B2-1.

Příklady provedení vynálezu

Vynález je ilustrován pomocí následujících příkladů, přičemž příklad 1 popisuje izolaci cDNA kyselin, kódujících IRP-1 a IRP-2, a příklad 2 popisuje analýzu doménové struktury IRP-1 a IRP-2 proteinů, kódovaných pomocí cDNA kyselin. Rekombinantní expresní konstrukty, obsahující celou délku IRP cDNA kyselin a cDNA kyselin, kódujících IRP domény a IRP mutace jsou popsány v příkladu 3. Příklad 4 obsahuje výsledky testů, které analyzují vlivy rekombinované exprese IRP proteinů na adhezi hostitelských buněk, a které hodnotí roli IRP proteinů v buněčné adhezi na ICAM-1 a VCAM-1, roli IRP proteinů v povrchové expresi integrinů a subcelulární lokalizaci IRP proteinů. Příklad 5 popisuje přípravu stabilně transformované JY buněčné linie (JY-8), která stabilně exprimuje IL-8 receptor, a jeho použití při určování role IRP proteinů v IL-8-závislé PMA-stimulované buněčné adhezi na ICAM-1 a VCAM-1. Příklad 5 rovněž popisuje přípravu expresních vektorů, kódujících IRP fúzní proteiny zeleného fluorescenčního proteinu (GFP). Příklad 6 popisuje adhezi JY buněk, transfekovaných IRP proteiny za proudových podmínek. Příprava a charakterizace • ·· ·

9 9 99 9

9

monoklonních protilátek IRP proteinů je popsána v přikladu 7. Role IRP proteinů při chemotaxi charakterizuje přiklad 8. Příklad 9 popisuje experimenty ukazující distribuci IRP proteinů v různých lidských tkáních. Testy, jejichž úkolem je identifikovat proteiny, které vzájemně reagují s IRP proteiny, jsou popsány v příkladu 10, zatímco testy, jejichž úkolem je identifikovat modulátory IRP interakcí, jsou popsány v příkladech 11 a 12.

Přiklad 1

Pomocí polymerázové řetězcové reakce (PCR) a DNA/DNA hybridizace se izolovaly dva lidské IRP cDNA klony.

Výzkum BLAST identifikoval různé parciální cDNA kyseliny, vykazující podobnost s B2-1 proteinem. Konvenční sekvenční oligonukleotidové primery, odpovídající 5' a 3' konci oblastí reprezentujících pleckstrinové homologové domény, které jsou označeny na základě EST jako H02055, R82669, R43994, H39073, R45477, T07442 a T32215. Sekvence primerů na 5' konci (TS3.5) a 3' konci (TS3.3) byly:

TS3.5 ATATACGCGTACCTTCTTCAACCCGGACC (SEQ ID č.: 5) ;

TS3.3 ATATGTCGACTCAGGGCTGCTCCTGCTTC (SEQ ID č.: 6).

Tyto primery se použily ve ΙΟΟμΙ PCR reakci za použití cDNA lidské sleziny jako matrice 2mg plazmatické cDNA v pcDNA-1 Amp (Invitrogen, San Diego). Vzorky se udržovaly 5 minut při 94°C a následně se nechaly projít třiceti cykly, které zahrnovaly 1 minutu při 94°C, 1 minutu při

50°C a 2 minuty při 72°C. Výsledný PCR produkt přibližně 450 bp se digeroval pomocí Mlul a Sáli. Vyčištěný, digerovaný fragment se nakloňoval na vektor pCl-neo ·· ···· • · · · · · (Promega, Madison, WI), který měl sekvence, kódující hemagglutininový konec na 5' konci, v místě inzerce digerovaného PCR fragmentu. Sekvence výsledného inzertu se ověřila a vektor se označil jako 5'HA TS53/pCl#3.

Mlul/Sáli digerovaný PCR produkt se označil a použil pro sondování velikosti cDNA knihovny lidské sleziny, zvolené pro inzerty větší, než 3 kb inzerty. Knihovna sleziny se připravila klonováním oligo-dT prvotní cDNA knihovny na pcDNA-1 Amp a velikostně selekční vektor/inzertovou DNA větší přibližně než 7,8 kb. Vektory knihovny se transformovaly do XL1 Blue Ultracompetent buněk (Stratagene, La Jolla, CA) a umístily na 15 základních ploten o velikosti 150 mm², opatřených filtry Hybond N⁺, v hustotě přibližně 20 000 kolonií na plotnu. Z každé základní plotny se připravily dvě repliky, které se použily při hybridizaci. Digerovaný PCR fragment (400 ng) se označil 120 μCi³²P dCTP a dTTP pomocí označovací sady Boehringer Mannheim Random Primed Labeling Kit, podle výrobcem přiloženého návodu. Nezabudované nukleotidy se odstranily přes Centri-sep kolony (Princeton Separations, Adelphia, NJ). Tato sonda se hybridizovala v roztoku obsahujícím 5X SSPE, 45% formamidu, 5X Denhardts, 1% SDS přes noc při 42°C. Filtry se promyly na 0,2X SSC při 65°C a exponovaly na film. Pozitivy na duplikátových filtrech se vyjmuly, naředily, a opět umístily na filtry Hybond N⁺ na LBM plotny. Z každé této původní plotny se vytvořily dva duplikáty, které se rehybridizovaly hybridizačním roztokem získaným z primárního síta. Sekundární pozitivy se vyjmuly, nechaly růst, a plazmidy se izolovaly, a oba konce inzertu se sekvencovaly.

·· ··«· · · · · · • · · · ♦ • · · · · · • · · · · · · ·«·· «· ·· ·· ·· * · • · « · • · ·· • 4· · ·· • ·9

99*»·

Jeden identifikovaný klon, tvořený celodélkovým genem, který byl označen jako klon S3, kódoval protein, který je zde označen jako IRP-1. Nukleotid a odvozené aminokyselinové sekvence klonu jsou uvedeny pod

SEQ ID č.:

a 2. Tento klon má optimální

Kozákovu konvenční sekvenci, obklopující tento klon, která má počátek v methiononu a terminační kodon v rámci

5' methioninu.

Délka klonu je přibližně 1,6 kb a klon má otevřený čtecí rámec

399 aminokyselin.

Klon S3 je nejpodobnější EST R82724 a vykazuje vyšší než

93% homologii na 469 nukleotidech.

Další izolovaný klon měl délku přibližně 3,4 kb. Tento klon, označený jako S12, který kóduje protein, zde označený jako IRP-2, vykazuje homologii k IRP-1, ale je zřejmě novým genem. Tento IRP-2 klon není celodélkový, protože seřazení jeho 5' konce s IRP-1 sekvencí umístilo přibližně 50 aminokyselin do kódovací oblasti IRP-1 klonu.

Pro získání celodélkového (kompletního) IRP-2 klonu se stejná knihovna cDNA sleziny (výše popsaná) opakovaně zkoumala pomocí dvou IRP-2 sond, a to následujícím způsobem. Zarovnaný (tupý) IRP-2 klon se digeroval odděleně pomocí Xbal a Xhol. 2 kb Xbal fragment a Xhol fragment se následně označily výše popsaným způsobem, pomocí označovací sady Boehringer Mannheim Random Primed Labeling Kit, podle výrobcem přiloženého návodu. Nezabudované nukleotidy se odstranily přes Centri-sep kolony a sonda se přidala do filtru ve výše popsaném hybridizačním roztoku a hybridizovala přes noc při 42°C. Filtry se vymyly při 50°C na IX SSC/0,1% SDS. Primární pozitivy se vyjmuly, naředily, a opět umístily na filtry Hybond N⁺ na LBM plotny. Z každého z těchto základních vzorků se připravily dva duplikáty, které se rehybridizovaly výše popsaným • · · · • ·

hybridizačním pufrem. Pozitivy na duplikátových filtrech se vyjmuly, nechaly růst, a jejich plazmidy se izolovaly a inzerty sekvencovaly. Dva klony, S12-41 a S12-47, rozšířily IRP-2 kódující oblast o 50 aminokyselin, ve směru 5'. Na 5' konci klonů, který zachovává přibližně stejnou organizaci aminokyselin jako IRP klon, se nachází methionin a dobře se hodí ke Kozákově konvenční sekvenci, obklopující tento methionin. S12-47 klon byl sekvencován zcela, a IRP-2 DNA a odvozené aminokyselinové sekvence jsou uvedeny pod SEQ ID č.: 3 až 4.

Příklad 2

Porovnáním IRP-1, IRP-2, B2-1 (Liu a kol., supra) genů a odvozených aminokyselinových sekvencí se identifikovaly tři společné domény: amino terminální kinesinová a myosinová doména, SEC7 doména a karboxylová terminální pleckstrinová homologová (PH) doména. Kinesin a myosin jsou transportní proteiny, související s mikrotubuly [Navole a kol., J. Biol. Chem. II7;1263-1275 (1992)]. Kvasinkový protein SEC7, popsaný v publikaci, jejímiž autory jsou Alschul a kol., Mol. Biol., 215: 403-410 (1990), je protein, obsahující 2 008 aminokyselin, který, jak se ukazuje, reguluje glykoproteinovou sekreci z Golgiho aparátu. I když přesnější funkce proteinu SEC7 v kvasinkách nebyla určena, je známo, že SEC7 genová mutace v Arabidopsisu způsobuje modulaci vývojového buněčného dělení a buněčné adheze [Shevell a kol., Cell, 77: 1051-1062

PH domény se nacházejí ve velkém množství proteinů, které jsou součástí signálního přenosu. V některých proteinech tato doména umožňuje navázání na

G protein βγ podjednotek, inositoltrifosfát (IP3) nebo *a«a • ·

fosfatidylinositoldifosfát (PIP₂), viz Ingley a Hemmings, J. Cell. Biochem., 56: 436-443 (1994). V aminokyselinových sekvencích IRP-1 a IRP-2 dosahuje kinesinová a myosinová doména přibližně od zbytku 9 do zbytku 60, SEC7 doména přibližně od zbytku 71 do zbytku 245 a PH doména přibližně od zbytku 260 do karboxy konce. V B2-1 jsou kinesinová a myosinová, SEC7 a PH doména definovány přibližně od zbytku 10 do zbytku 61, přibližně od zbytku 72 do zbytku 245, resp. přibližně od zbytku 246 do karboxy zakončení. Aminokyselinová identita mezi různými doménami v IRP a B2-1 je znázorněna v níže uvedené tabulce 1.

Tabulka 1

B2-1

	kinesin/myosin	SEC7 doména	PH doména
IRP-1	59 %	88 %	90 %
IRP-2	34 %	79 %	72 %

Konzervace kinesinové a myosinové, SEC7 a PH domény v těchto třech proteinech ukazuje, že IRP-1 a IRP-2 proteiny představují členy rodiny lidských proteinů, vztahujících se k B2-1. Obrázek 3 ukazuje seřazení IRP-1, IRP-2 a B2-1 klonů se zdánlivým homologem C. Elegans [Wilson a kol., Nátuře, 368: 32-38 (1994)]. Přestože procentická identita C. Elegans proteinu s dalšími třemi lidskými proteiny není příliš vysoká je zřejmé, že celá doménová struktura je konzervována mezi čtyřmi proteiny.

Většina zbytků, konzervovaných mezi třemi lidskými proteiny a proteinem C. Elegans, je rovněž konzervována v proteinu Arabidopsis [Shevell a kol., supra], který φ φ · · · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ·* obsahuje homologovou SEC7 oblast, a dále jsou konzervovány v kvasinkovém SEC7 proteinu. To ukazuje na důležitost těchto zbytků, pokud jde o funkci SEC7 domény. Ve skutečnosti Shevell a kol., supra uvádí, že v klonu Arabidopsis (EMB30) ovlivňuje mutační změna jednoho z těchto zbytků (odpovídajícího poloze 157 v řazení na obrázku 3) buněčné dělení, prodloužení a adhezi.

Konzervované zbytky v IRP PH doménách mohou být rovněž funkčně důležité. Tsukada a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA), 91: 11256-11260 (1994) uvádí, že mutace argeninu (odpovídacího poloze 289 na obrázku 3) konzervovaného v mnoha PH doménách na cystein, pokud je přítomen v PH doméně btk tyrozinové kinázy v myši, povede ke vzniku X-navázaného imunodeficienčního fenotypu, přestože si enzym udrží úplnou btk kinázovou aktivitu. Toto tvrzení autorů je spekulací, protože se předpokládá, že se zmíněný zbytek nachází na povrchu molekuly, a je tedy nepravděpodobné, aby tato substituce měla strukturní dopad; spíše je pravděpodobné přerušení specifické interakce s dalším proteinem. Tento zbytek je rovněž konzervován mezi lidskými IRP proteiny a proteinem C. Elegans.

Konečně všechny tři lidské proteiny, stejně jako protein C. Elegans, mají ve svých PH doménách mezi subdoménami 5 a 6 dalších šestnáct až osmnáct zbytků, pokud se porovnají s dalšími PH doménami. Při zhodnocení z pohledu navržení třírozměrné struktury PH domény, popsané v publikaci, jejímiž autory jsou Macias a kol., Nátuře, 369: 675 (1994), měla by tato doména vytvořit smyčku, vybíhající z jádra domény, a mohla by být tedy důležitá pro vzájemnou reakci s dalším proteinem nebo proteiny. Těchto šestnáct až osmnáct zbytků vykazuje 73% identitu mezi čtyřmi proteiny.

Přiklad 3

Pro účely studie role IRP proteinů ve funkci integrinu se v COS a JY buňkách exprimovaly IRP-1, IRP-2 a B2-1 proteiny nebo jejich PH domény společně s β₂ integrinovými podjednotkami CDlla a CD18. IRP a B2-1 expresní vektory se zkonstruovaly následujícím způsobem. Exprese proteinů, používající tyto vektory je popsaná v příkladu 4.

Komplementární DNA kódující lidský B2-1 protein se klonovala PCR amlifikací velikostně zvolené 2,5 až 4 kb Ramosovy knihovny. Primery na koncích 5' a 3', kódující oblasti, se označily na základě již publikované sekvence (Liu a kol., supra). Primerové páry se označily za účelem usnadnění inzerce zesílených sekvencí do příslušných vektorů. B2-1 cDNA se nejprve amplifikovala a klonovala do vektoru pET 15b (Novagen, Madison, WI) za použití 5' Sc7.Nde a 3' Sc7.Xho primerů:

Sc7.Nde ATATCATATGGAGGAGGACGACAGCTAC (SEQ ID č.: 7); Sc7.Xho ATATCTCGAGTCAGTGTCGCTTCGTGGAG (SEQ ID č.: 8).

Primery se použily ve 10μ1 PCR reakci. Vzorky se udržovaly 5 minut při 94°C a následně se nechalo proběhnout 30 cyklů: 30 sekund při 94°C, 30 sekund při 55°C a 1 minutu při 72°C. Výsledný PCR produkt se gelově čistil, digeroval pomoci Ndel a Xhol a klonoval na pET 15b. Klony se sekvencovaly a klony Sc7/pET #5 a Sc7/pET #6 obsahovaly inzert, mající sekvenci identickou s publikovanou B2-1 sekvencí.

HA zakončení se přidalo na konec 5' B2-1 cDNA pomocí

PCR a takto zakončený gen se následně nakloňoval do • · · · • * • ·

pCl-neo. Výše popsaný 3' Sc7.Xho primer se použil spolu s 5' Sc7.HAS primerem:

S c 7.HAS ATATGCTAGCCACCATGGGGTACCCATACGATGTTCCTGACTATGCG

ACGCGTATGGAGGAGGACGACAGC (SEQ ID č.: 9).

Podtržené nukleotidy v tomto primeru kódují HA zakončení. Tyto primery se použily ve 10μ1 PCR reakci s Sc7/pET #6 DNA jako matrice za následujících podmínek. Vzorky se udržovaly 5 minut při 94 °C a následně se nechalo proběhnout 30 cyklů:

minuta při 94°C, 1 minuta při 55°C a 2 minuty při 72°C.

Výsledný PCR produkt se gelově čistil, digeroval pomocí Ndel a Xhol a klonoval na pCl-neo vektor, digerovaný pomocí Ndel/XhoT. Výsledný klon se označil jako 5' HASc7/pCl #29. Jeho inzert kódoval HA fúzní protein, zde označený jako 5'HA B2-1.

HA zakončení se přidalo na konec 3' B2-1 cDNA pomocí PCR a takto zakončená cDNA se následně nakloňovala do pCl-neo. Použitými primery byly Sc7.HA3 a T7:

Sc7.HA3 ATATGTCGACTCACGCATAGTACAGGAACATCGTATGGGTACATACG

CGTGTGTCGCTTCGTGGAGGA (SEQ ID č.: 10);

T7 TAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID č.: 11).

Tyto primery se použily ve 10μ1 PCR reakci s SEC7/pCl #9 DNA jako matrice za následujících podmínek. Vzorky se udržovaly 5 minut při 94°C a následně se nechalo proběhnout 30 cyklů: 1 minuta při 94°C, 1 minuta při 55°C a minuty při 72°C. Výsledný PCR produkt se gelově čistil, digeroval pomocí Xhol a Sall a ligoval do pCl-neo, předem rozpojil pomocí Xhol a Sall. Konstrukt se označil jako 3'HA B2-l/pCl #29 a jím kódovaný protein se označil jako 3'HA B2-1.

β ·

Β2-1 PH doména se subklonovala pomoci PCR a za použití 5' Tsc7.S a 3' Sc7.Xba primerů:

Tcs7.5 ATATACGCGTACTTTCTTCAATCCAGACCG (SEQ ID č. : 12); Sc7.Xba ATATTCTAGATCAGTGTCGCTTCGTGGAG (SEQ ID č.: 13).

Primery se použily 100λ PCR reakce s SEC7/pET #5 DNA jako matricí za následujících podmínek. Vzorky se udržovaly 5 minut při 94 °C a následně se nechalo proběhnout 30 cyklů: 1 minuta při 94°C, 1 minuta při 50°C a 2 minuty při 72°C. Výsledný PCR produkt se gelově čistil, digeroval pomocí Mlul a Xbal a klonoval do 5'HA pCl-neo, který se předem rozpojil pomocí Mlul/Xbal (připravený rozříznutím 5ΉΑ B2-l/pCl #29 klonu, pomocí Mlul/Xbal). Inzert výsledného klonu kódoval HA fúzní protein, zde označený jako 5ΉΑ B2-1 PH.

IRP-1 cDNA se subklonovalo do 5'HA pCl vektoru, nejprve použitím PCR pro přidání Mlu místa na 5' konec cDNA a Sall místa na 3' konec klonu. Použitými primery byly:

S3.5'HA ATATACGCGTATGGAGGACGGCGTCTATG (SEQ ID č.: 14);

TS3.3 (SEQ ID č.: 6).

Primery se použily ΙΟΟμΙ PCR reakce s S3.3 DNA jako matricí za následujících podmínek. Vzorky se udržovaly 5 minut při 94 °C a následně se nechalo proběhnout 30 cyklů: 45 sekund při 94°C, 45 sekund při 50°C a 1 minutu při 72°C. Výsledný PCR produkt se gelově čistil, digeroval pomocí Mlu a Sall a ligoval do 5'HA pCl, který se předem rozpojil pomocí Mlu a Sall. Výsledný klon se označil jako 5ΉΑ IRP-1/pCl #15 a protein, kódovaný tímto klonem, se označil jako 5'HA IRP-1.

Klon 5'HA TS3/pCl #3 (příklad 1) se použil pro exprimování IRP-1 PH domény.

• · · · • · · · • · ·· · · · ···· • · · · · ·· ···· · ··· ···· · · · «··· ·· · · ·· · · · ·

IRP-2 se nejprve klonoval na pCl-neo, používající PCR bez HA zakončeni. Použitými primery byly:

S12/SR1 ATATGAATTCCACCATGGACCTGTGCCACCCAG (SEQ ID č.: 15); TS12.3 ATATGTCGACTCACTGCTTGCTGGCAATC (SEQ ID č.: 16).

Tyto primery se použily ve ΙΟΟμΙ PCR ve 30 cyklech s klonem 5'HAS12/pCl jako membránou za následujících podmínek: 1 minutu při 94°C, 1 minutu při 50°C a 1 minutu při 72°C.

Výsledný amplifikovaný produkt se čistil, digeroval pomocí EcoRI a Sáli a ligoval na pCl-neo vektor, předem digerovaný stejnými dvěma enzymy. Výsledný klon #11 se zcela sekvencoval a ukázalo se, že je identický s původním klonem.

Kromě toho se IRP-2 a IRP-2 PH doména klonovaly samostatně na pCl-neo s 5'HA zakončením za použití PCR a primerů TS12.5 (SEQ ID č.: 17), TS12.3 (SEQ ID č.: 18),

S12.5 (SEQ ID č.: 19).

TS12.5 ATATACGCGTACCTTCTTCAATCCAGAC (SEQ ID č.: 17); ST12.3 ATATGTCGACTCACTGCTTGCTGGCAATC (SEQ ID č.: 18);

S12.5 ATATACGCGTATGGACCTGTGCCACCCAG (SEQ ID č. : 19).

DNA matricí pro amplifikační reakce byl klon S12. Vzorky se držely 4 minuty při 94 °C a následně se podrobily t30 cyklům: 94 °C po dobu jedné minuty, 52 °C po dobu dvou minut a 72°C po dobu dvou minut. Každý ze dvou výsledných amplifikačních produktů se digeroval pomocí Mlul a Sáli, čistil a samostatně ligoval do pCl-neo HA vektoru, předem digerovaného pomocí Mlul a Sáli. Klony pCl-neo HA IRP-2 #8 a pCl-neo IRP-2 PH #5 se sekvencovaly a ukázaly, že jsou identické s odpovídajícími sekvencemi v matricovém klonu.

Přiklad 4

V tomto příkladu se určily účinky přeexprimovaných IRP proteinů na β2 dependentní buněčnou adhezi (měřeno navázáním transfekovaných COS nebo JY buněk na ICAM-1) a na β₇ dependentní buněčnou adhezi (měřeno navázáním transfekovaných JY buněk na VCAM-l).

COS buňky se kotransfekovaly pomocí vektorů, kódujících CDlla/CD18 a vektorů (příklad

3), maj ících inzerty kódující 5'HA

B2-1, 3ΉΑ B2-1,

5' HA

B2-1 PH,

5' HA

IRP-1,

5'HA IRP-1

PH,

5ΉΑ IRP-2,

5'HA

IRP-2 PH nebo pCl-neo vektorové kontroly. COS buňky se rozdělily tak, že 24 hodin před transfekcí představovaly 1,2 x 10⁶ buněk na 10 cm² plotnu. Následující den se pro každou plotnu připravila transfekční směs, obsahující 5 ml DMEM, μΐ chlorochinu (0,25 M) , 30 μΐ DEAE Dextranu (50 mg/ml v

CMF-PBS) a 10 μς každého vektoru DNA, který se transfekuje do buněk. Růstové médium se odstranilo z přibližně 80 % slitých ploten COS buněk a přidala se transfekční směs.

Plotny se inkubovaly 2,5 hodiny při 37°C. Transfekční směs se odstranila odsáváním a během jedné minuty se přidal 10% roztok DMSO v DMEM (při pokojové teplotě) . Po uplynutí jedné minuty se DMSO odstranil odsáváním a přidalo se 10 ml kompletního média.

Exprese LFA-1 a IRP proteinů transfekovanými COS buňkami se potvrdila použitím různých protilátek. Všechny transfekanty se zbarvily pozitivně na CD18. IRP transfekanty se zbarvily pozitivně na HA epitop za použití

HA zakončené specifické monoklonální protilátky

150B OR 12CA5.

Transfekované buňky se testovaly za účelem zjištěni jejich schopnosti vázat ICAM-1 při 48 a 72 hodinách po transfekci. Za účelem přípravy buněk pro adhezní test se růstové médium odstranilo odsáváním a na plotnu se během tří minut přidalo 5 ml komplevonu II a následně se buňky izolovaly. Přidalo se 5 ml kompletního DMEM a buněčná suspenze se míchala při rychlosti 1 000 ot/min po dobu 5 minut. Buňky se resuspendovaly v kompletním DMEM a spočetly. Adhezní testy s různě transfekovanými buňkami se prováděly níže popsaným způsobem.

Jednotlivé 96jamkové plotny (Corning, Cambridge, MA) se nejprve potáhly buď ICAM-l/Fc nebo VCAM-l/Fc v uhličitanovém pufru, pH 9,6, při 50 μΙ/jamku 5 μς/ιηΐ proteinů a inkubovaly přes noc při 4°C. Tyto plotny se promyly 2 x 150 μΙ/jamku PBS a blokovaly 150 μΙ/jamku 1% BSA v PBS po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě. Po blokačním činidle se do každé jamky přidalo při pokojové teplotě 100 μΐ adhezního pufru (RPMI médium s 10% plodovým bovinním sérem) spolu se 100 μΐ transfekovaných JY buněk, suspendovaných v adhezním pufru. Transfekované buňky se připravily následujícím způsobem.

Den před testem se transfekované buňky naředily na hustotu 3 x 10⁵ buněk/ml v RPMI médiu doplněném penicilinem/streptomycinem, L-glutaminem, pyruvátem sodným a 10% plodovým lýtkovým sérem. Buňky se nechaly zdvojit, přičemž k tomuto zdvojení došlo přibližně 24 hodin po inkubaci. Po zdvojení se buňky sklidily a resuspendovaly na hustotu 1 x 10⁶ buněk/ml v adhezním pufru. Přibližně 1 x 10⁵ buněk ve 100 μΐ se přidalo do každé jamky a plotny se inkubovaly 30 minut při pokojové teplotě v zakrytém stavu.

• · · · • ·

Po inkubaci se buňky fixovaly přidáním 50 μΙ/jamku 14% glutaraldehydu v CMF-PBS a inkubovaly 30 minut při pokojové teplotě. Po inkubaci se jamky třikrát promyly deionizovanou vodou. Po posledním proplachu se voda odstranila odsáváním, 50 μΐ skvrna obsahující přibližně 0,125% Krystalovou Violeť (připravenou jako zásobní roztok 1% v 10% ethanolu a 90% deionizované vody, naředěný na 0,125 % deionizovanou vodou a přefiltrovaný přes 0,22 mikrometrový filtr) a plotny se inkubovaly po dobu dvou minut. Po ukončení inkubace se plotny třikrát promyly deionizovanou vodou výše popsaným způsobem a přidalo se 200 μΙ/jamku ethanolového roztoku (dva díly 95% ethanolu a jeden díl deionizované vody). Po jednohodinové inkubaci se plotny přečetly na čtecím přístroji ELISA, při rozsahu vlnových délek 570 až 590 nm.

hodin po přetnutí B2-1 PH doménová transfekační činidla demonstrovala mírné snížení LFA-1 dependentní adheze, v porovnání s vektorovými kontrolními transfekačními činidly. Bylo zde zaznamenáno snížení vaznosti IRP-2 PH doménových trasfekačních činidel, zatímco plnodélkové IRP klony nevykazovaly podstatnější změnu adheze vzhledem k pCl-neo vektorové kontrole. 72 hodin po přetnutí čtyři transfekční činidla (3ΉΑ B2-1, 5' HA B2-1, B2-1 PH a IRP-1 PH) demonstrovala 50% snížení ICAM-1 adheze, v porovnání s vektorovou kontrolou.

JY buňky, které exprimují endogenovou α₄β₇ a LFA-1, se jednotlivě transfekovaly vektory kódujícími buď IRP-1,

IRP-2, B2-1, IRP-1 PH, IRP-2 PH nebo B2-1 PH. Buňky se transfekovaly elektroporací za použití standardního postupu. Pro každou informaci se odstředilo 10⁷ JY buněk a uchovávalo na ledu. Buňky se promyly za použití DPBS a opět ·· ····

9 9

9

9 9 9 9 9 999

9 9 9 9 99 99999

9 9 9 9 9 9 9 99

999 9 9 9 99 9 9 999 9 odstředily. Buňky se resuspendovaly v 0,5 ml DPBS a transfekovaly na elektroporační směsi se přidalo třicet transformační kyvetu. Do každé mikrogramů DNA (1 mg/ml DPBS).

Transformační směs se mírně míchala inkubovala 10 minut na ledu. Buňky se za použití parametrů:

elektroporovaly a následujících pulzéru BioRad Gene Pulser kapacitanční nástavec spuštěn, napětí 250 V kapacitance na

960 μί. Po provedení elektroporace se transfekční směs inkubovala deset minut na ledě. Buňky se umístily do

T25 baňky obsahující 5 ml média. Tři dny po přetnutí se do média koncentraci 0,5 mg/ml. Adhezní testy se přetnutí.

kompletního RPMI přidal hygromycin v prováděly dní po

JY buňky transfekované IRP proteiny rovněž demonstrovaly snížení LFA-1 dependentní adheze k ICAM-1 a α₄β₇ adheze k VCAM-1, LFA-1 a mezi transfekčními činidly nebyl podstatnější rozdíly pokud jde o a₄ hladiny, takže to

nevysvětluje snížení adheze.
Takže se zdá, že IRP proteiny demonstrují určitou specifičnost při modulaci β2 nebo β7 integrinové dependentní adheze. Zdá se, že IRP-1 exprimované v JY buňkách preferenčně snižují β2 dependentní adhezi, zatímco

IRP-2 regulují směrem dolů β₇ dependentní adhezi. B2-1 transfekční činidla demonstrují jak snížení β ₂ tak snížení β₇ adheze. Zdá se, že exprese zkrácení obsahujících PH doménu IRP-1, IRP-2 nebo B2-1 obecně snižuje jak β₂ tak β₇ dependentní adhezi. Viz níže uvedená tabulka 2, ve které „+ reprezentuje zvýšení adheze, označuje snížení adheze a „NS označuje případ, kdy nedošlo k podstatnější změně adheze.

·· ···« • r ····

Tabulka 2

Hostitelská buňka

JY

COS

Exprimovaný protein

5'HA	IRP-1		-	NS/ +	-
5' HA	IRP-2		NS	-	NS
5' HA	B2-1		-	NS/ +	-
5' HA	IRP-1	PH	-	NS/-	-
5'HA	IRP-1	PH	-	NS/~	NS

Tyto výsledky by odpovídaly aminové terminální části IRP proteinů vzájemně reagujících, přímo nebo nepřímo, s β₂ nebo β₇ integriny s různými afinitami rezultujičími v preferenční regulaci jednoho nebo druhého typu integrinů. Funkce a interakce PH domén, může být na druhé straně společným signálním elementem v drahách regulujících různé integriny. Tímto prvkem může být heterotrimerový GTP vážící proteiny (např. G_ap_Y) PIP_n, proteinkináza C(PKC) nebo nějaká ještě nedefinovaný ligand PH domén. Předpokládá se, že antagonizujici činidlo, které přeruší IRP PH doménu vážící se na tento společný signalizační prvek, by měla široce regulovala adhezi β₂,β₇ a pravděpodobně dalších integrinů, například βι a β₃ integrinů. Na druhé straně lze předpokládat, že antagonizující činidlo, které přeruší aminovou terminační interakci IRP proteinů s integrinem, reguluje integrinovou dependentní adhezi konkrétnějším způsobem.

• ·· · v

• · ····

Leukocyty a leukocytové buněčné linie, které nejsou maximálně aktivovány pro integrinovou dependentni buněčnou adhezi lze aktivovat PKC agonizujicimi činidly, například forbolester PMA. Mechanizmus, kterým PKC aktivita indukuje buněčnou adhezi není dobře definována; PKC může mít určitý vliv na afinitu nebo zvýšení avidity a stejně tak na cytoskeletovou reorganizaci potřebnou pro buněčné rozšíření. Nicméně, pokud PKC působí po směru nebo proti směru exprese IRP, potom se může indikovat vliv PKC aktivity na IRP snížení integrinové dependentni adheze. Forbolová stimulace výše popsaných JY trasnfekačních činidel často neobnovuje LFA-1 nebo α₄β₇ dependentni adhezi k vektorovým kontrolním hladinám. Takže buď regulační PKC substrát může působit proti směru dráhy regulované IRP proteiny nebo PKC reguluje diferenční dráhu nebo aspekt integrinové dependentni adheze. Alternativně IRP proteiny mohou regulovat více aspektů integrinové dependentni adheze a PKC stimulace může ovlivnit pouze jeden z těchto aspektů. IRP proteiny mohou regulovat integrinovou dependentni adhezi ovlivněním integrinové afinity, avidity (shlukování) (příklad 4) nebo membránovou recyklizaci. Předpokládá se, že úkolem integrinové recyklizace je snížení LFA-1 hladin na COS buňkách exprimujících IRP proteiny, ale nikoliv na COS buňkách exprimujících IRP PH domény.

Aby se určilo, zda IRP proteiny vyvíjejí vliv na buněčnou povrchovou expresi integrinů, se COS buňky kotransfekovaly s DNA kyselinami kódujícími buď kompletní

IRP-1, IRP-2 nebo B2-1 (nebo s kontrolním DNA vektorem pClneo nebo DNA kódující 14-3-30) spolu s DNA kódující buď

Ούβ2, α₄β₇ nebo ICAM-2. Buňky se zbarvily pro povrchovou expresi (fluorescenční intenzitu a procento pozitivních

	31	«· ···· ·· • · · · · • · · ♦ • · · · · • · · · · ···· ·· ··	···· ·· ·· • · · · · * · · · · • · · · · · · • · · · · • · · · · ·
buněk)	pomocí	monoklonálních	protilátek	ICA4,1
(imunospecifické	pro a4),TSl/22 (imunospecifické	pro αχ) ,

3S3 (imunospecifické pro βχ) nebo 92C12F (imunospecifické pro ICAM-2). βχ je endogenně exprimována v COS buňkách a pro transfekci není potřeba žádná βι kódující DNA.

Výsledky shrnuté v níže uvedené tabulce 3 naznačují, že IRP-1 snižuje buněčnou povrchovou expresy αιβ2 integrinu pravděpodobně snižováním de novo biosyntézy nebo recyklačního procesu, který odstraňuje a nahrazuje integrin na celém buněčném povrchu.

Tabulka 3

IRP vliv na buněčnou povrchovou integrinovou expresi

	cíl	βι	α4	βχ	ICAM-2	βι
pCI-neo	760Ť	396	317	309	509	363
	59%*	62%	30%	74%	59%	72%
IRP-1	533	364	266	405	469	361
	51%	66%	32%	74%	59%	77%
IRP-2	711	367	294	384	522	359
	60%	69%	38%	75%	55%	7 6%
B2-1	666	375	304	418	489	329
	59%	70%	36%	72%	54%	73%
14-3-30	690	361	336	368	543	386
	60%	72%	43%	74%	60%	75%

t Střední fluorescenční intenzita ★ procento pozitivní • · · · ··» · · · · ·· ···· ·· ·· «· ·· ··

Jak již bylo diskutováno výše, různé rodinné členy mohou mít opačné účinky na integrinovou dependentni adhezi. Tyto opačné účinky odpovídají IRP proteinům vzájemně reagujícím s různými efektory nebo signalizačními drahami, které regulují navázání integrinu (níže diskutováno). Redundance v těchto drahách může z části vysvětlovat, proč nadexprese IRP proteinů vede pouze k částečné blokaci IL-8 indukovatelné adheze. Kromě toho snížení adheze pomoci IRP1 nadexprese může být způsobeno IRP-1 antagonizujiciho proadhezivní účinnost dalšího IRP. Proadhezivni účinnost B2-1 (cytohesin-1) není směrována pouze na JY-8 (přiklad 5) a byla rovněž pozorován v souvislosti s nadexpresi v Jurkatových T-lymfoidnich buňkách [Kolanus a kol., Cell, 86:233-242 (1996)]. Nicméně na rozdíl od JY-8 buněk, exprese v Jurkatových buňkách indukovala α_χβ₂ navázaní. Takže B2-1 může indukovat pro buněčný typ specifickým způsobem navázání α₄β₇ nebo αιβ₂. Není překvapením, že vazebné vlastnosti specifického integrinu se mohou s typem buňky měnit [Chán a kol., J. Cell. Biol., 120:537-543 (1993), Kassner a kol., J. Exp. Med., 178:649-660 (1993)].

Potom se v JY-8 (příklad 5) transfekčních činidlech schopných adheze k ICAM-1 určila subcelulární oblast IRP/GFP fúzních proteinů. Skleněná podložní sklíčka se 18 hodin při 4°C potáhla ICAM-l/Fc (1 gg/ml) v 50 mM hydrogenuhličitanovém pufru, pH 9,6 a následně se opláchla RPMI médiem obsahujícím 10% FBS. JY-8 transfekanty exprimující GFP/IRP fúzní proteiny se nechaly přilnout ke skleněným podložním sklíčkům potaženým ICAM-1.

Za účelem stanovení subcelulární distribuce IRP/GFP fúzních proteinů a identifikování oblastí IRP-1, které se mohou nacházet v intracelulární oblasti se zkoumala pomocí • · • · · · • · • · · ···* ·· «··· · · · · ·« ·· ·· fluorescenční konfokální mikroskopie JY-8 transfekanty. IRP-1, IRP-2 a B2-1 nacházející se převážně na vodící hraně kortikální oblasti buněčné kostry kraulujících na ICAM-1 (viz příklad 8). PH doména IRP-1, se nacházela se v oblasti plazmové membrány, zatímco Sec7 doména demonstrovala větší difúzi cytoplazmatické oblasti. Transfekanty, exprimující GFP, demonstrovala difúzi cytoplazmatické fluorescence. Tyto výsledky naznačovaly, že PH doména, která nese oblast plazmatické membrány, způsobuje s dalšími doménami lokalizaci standardního typu IRP proteinů na vodící hraně.

Za účelem stanovení distribuce IRP proteinů během tvorby lamel se analyzovaly časově odstupňované obrazy JY-8 IRP-2/GFP transfekantů kraulujících na ICAM-1. JY-8 buňky nadexprimující IRP-2 se zvolil tak, aby určil lokalizaci v buňkách schopných migrovat v odezvě na IL-8, protože IRP-2 fúzní transfekanty demonstrují vyšší úrovně chemotaktické migrace vzhledem k IRP-1 nebo B2-1 trasfekačním činidlům. IRP-2 se nachází koncentrovaný podél jedné hrany JY-8 buněk na místě lamelové formace a před touto formací. Časově odstupňované obrazy ukazují, že konkomise současně se svým vývojem IRP-2 relokalizoval do lamely. Takže IRP-2 je přítomen velmi brzy a v celém rozsahu extenze lamelipodia.

IRP proteiny pravděpodobně hrají roli při nesení integrinové funkce ve vodící hraně migrujících buněk. Zdá se, že tato lokalizace je závislá jak na Sec7 tak na PH doménových interakcích, protože Sec7 doména se lokalizuje difúzně a PH doména se rovnoměrně rozmístí na membráně, pokud jsou exprimovány nezávisle. Interakce PH domén mohou podepřít funkční membránovou lokalizaci komplexu obsahujícího IRP a ADP ribosylační faktor (ARF) . V tomto • · • · · · • · · · · >

místě se mohou ARF stát aktivní, protože aktivita

ARNO (protein popsaný po prioritním datu této přihlášky)

GTP změnového faktoru (GEF) je stimulována fosfatidylinositolovým navázáním na PH doménu [Chardin a kol.,

Nátuře, 384:481-484 (1996)].

Role

ARF faktorů při membránovém transportu naznačuje, že by mohly zprostředkovávat lokalizaci integrinu na vodící hranu migrujících buněk a z této hrany, což poznámce, že polarizovaná exocytóza na by mohlo odpovídat vodící hraně může hrát rozhodující roli při buněčném pohybu [Bretscher, Cell,

Kromě toho inhibitor ARF GTP změny, Brefeldin A, inhibuje lamelipodiovou formaci a migraci fibroblastů u modelu hojení rány [Bershadsky a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA, 91 :5686-5689 (1994)]. Bylo uvedeno, že B2-1 se váže přímo na cytoplazmatickou doménu β2 [Kolanus a kol., Cell, 86:233-242 (1996)]. IRP proteiny mohou tedy přímo na sebe vázat integriny a aktivovat členy RAS nadrodiny, která může působit v jednom nebo několika krocích chemotaxe.

Role při integrinové aviditě je rovněž navržena. ARF a další člen ras nadrodiny, RhoA, působí synergisticky na aktivaci fosfolipázy Délka (PLD) [Kuribara a kol., J. Biol. Chem., 270:25667-25671 (1995)]. PLD je v různých buněčných typech aktivována různými agonizujícími činidly a štěpí fosfatidylcholin za vzniku cholinu a kyseliny fosfatidové kyseliny [Boman a kol., Trends Bio. Chem. Sci., 29147-150 (1995). Fosfatidová kyselina a žádné další negativně změněné lipidy demonstrují zvýšení vazebnosti vyčištěného integrinu Gpllbllla na fibrinogen [Smyth a kol., J. Biol. Chem., 267:15568-15577 (1992)]. IRP proteiny mohou působit jako regulátory v signalizačních drahách, • · • · · · • · • ·· · · · · ··· «· · · · · · · ·« ·» ·» které mění umístěni integrinové membrány nebo aviditu. V nedávné době bylo publikováno, že ARNO indukuje GDP/GTP záměnu a tak aktivuje člen ras nadrodiny, ARF-1 [Chadrin a kol., Nátuře, 384:481-484 (1996)]. Je známo šest ARF faktorů a další čtyři ARF podobné proteiny, které sdílejí 45 až 60% aminokyselinové identity [Boman a kol., Trends in Bio. Chem. Sci., 20:147-150 (1995)]. ARF faktory se nachází na golgi, vezikulách a plazmové membráně a podílí se na membránovém transportu, endocytose a exocytose [D'SouzaCchorey a kol., Science, 267:1175-1178 (1995), Peters a kol., J. Cell Biol., 128:1003-1017 (1995), Boman a kol.,

Trends in Biol. Sci., 20:147-150 (1995)]. IRP proteiny mohou tedy regulovat lokalizované zvýšení fosfatidové kyseliny, které bude zase zvyšovat integrinové navázání, přímé nebo nepřímé, přes konverzi na PKC agonizující diacylglycerol (DAG).

Příklad 5
Byla	vyvinuta JY	buněčná	linie,	která stabilně
exprimuj e	funkční	receptor	pro	IL-8 vykazující

N-terminální mAb epitopový konec. Tato buněčná linie je zde označena jako „JY-8. Ke stanovení role při αιβ2 dependentní adhezi, se v JY-8 buněčné linii nadexprimovaly IRP proteiny. JY-8 buňky zpravidla exprimuj! jeden β₂ integrin, α_χβ₂, a jeden a₄ integrin, α₄β₇ [Chán a kol., J. Biol. Chem., 267:8366-8370 (1992)]. IRP expresní konstrukty se generovaly za použiti zeleného fluorescenčního proteinu (GFP) fúzovaného na aminový konec IRP-1, IRP-2 a B2-1 standardních sekvencí, které jsou popsány v následujícím odstavci.

«4 ··· ···· • · · · · · · · · · · · • · · 9 4 9 4 ··· • ··· « 4 4 4 4 9 4 4 4 4

Exprese konstruktů pro zelený fluorescenční protein (GFP) IRP fúzních proteinů se připravily následujícím způsobem. Expresní vektor pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA) se digeroval pomocí Nhel a BamHI. Nhel a BamHI digerovaný DNA fragment kódující GFP z pEGFP (Clontech, Palo Alto, CA) se ligoval na NHel/Bam HI digerovaný pCEP4. Výsledný plazmid, pCEP4/GFP, se použil pro přípravu IRP fúzních konstruktů.

K subklonován! IRP DNA fragmenty do pCEP4/GFP se použily PCR reakce, které dodaly na konce zmíněných fragmentu Xho I a Hind III restrikční místa potřebná pro následnou rámcovou ligaci.

Pro PCR se použily následující příměrové páry:

S3.GFPXho.5, ATATCTCGAGCTATGGAGGACGGCGTCTAT (SEQ ID č.: 20) a S3.GFP.H3.3, ATATAAGCTTGCGGCCGCTCAGGGCTGCTC CTGCTTC (SEQ ID č. : 21) pro fúzi IRP-1 GFP; S7.GFP.Xho.5, ATATCTCGAGCTATGGAGGAGGACGACAGCTAC (SEQ ID č.: 22) a

S7.GFP.H3.3, ATATAAGCTTGCGGCCGCTCAGTGTCGCTT CGTGGAGG (SEQ ID č. : 23) pro fúzi B2-1 GFP; S12.GFP.Xho.5, ATATCTCGAGCTATGGACCTGTGCCACCCAG (SEQ ID č.: 24) a

S12.GFP.H3.3, ATATAAGCTTGCGGCCGCTCACTGCTTGCT GGCAATCTTC (SEQ ID č. : 25) pro fúzi IRP-2 GFP; S3.GFP.5.X, ATATCTCGAGCTATGAGCGAGGTGGAGGGGCTG, (SEQ ID Č.: 26)

S3.GFP.5.H3, ATATAAGCTTGCGGCCGCTCAGAAGGTGTG GGTCAGGTC (SEQ ID č.: 27) pro fúzi IRP-1 doménu GFP; S3GFP.P.X. ATATCTCGAGCTATGACCTTCTTCAACCCGG (SEQ ID č.: 28) a

S3.GFP.H3.3 pro fúzi IRP-1 PH doménu GFP.

Kromě toho aminokyselinové substituční mutanty se generovaly pomocí insert vitro mutagenezní sady Muta-Gene Phagemid (Verze 2, BioRad, Hercules, CA) s oligonukleotidy: S3.E156A, GTCAATTTTCTGGGCCGCTCCGGGTAGGCGAAA (SEQ ID č.: 29) pro přípravu

Ε156Α • · 4 Φ 4 4 4 Φ 4444 44 44

4 Φ Φ 4 4444

4 · · ·*444 φ Φ · φ 4 44 44444

44 4 4 4 φΦΦΦ • ΦΦΦ 44 4 4 ·· 44*· a S3.R279A,

TGTGAGGATAAACCAGGCCCGCTTCCACGTCTTC (SEQ ID č.: 30) pro přípravu R279A. Pro přípravu vhodných restrikčních míst pro

GFP fúzi se použila PCR amplifikace mutantní cDNA využívající primery S3.GFP.Xho5 S3.GFP.H3.3.

Výsledné PCR produkty se ligovaly na Xho I a Hind III místa PCEP4/GFP. Klony izolované z E. coli XLI modrých transformačních činidel se potvrdily sekvencováním. Všechny expresní vektory byly navrženy tak, aby kódovaly IRP/GFP fúzní proteiny s GFP v místě aminového zakončení fúzního proteinu. JY-8 buňky se transfekovaly elektroporací s expresními konstrukty a transfekční činidla se zvolily za použití hygromycinu B (0,5 mg/ml, Calbiochem, San Diego, CA) .

Kromě toho, se připravily IRP-1 GFP fúzní proteiny mající v Sec7 nebo PH doménách aminokyselinové substituce. Substituce alaninu za glutaman v poloze 156, E156/A se zvolila na základě účinků této mutace na buněčnou adhezi v Sec7 doméně proteinu Arabidopsisu, EMB30 [Shevell a kol., Cell, 77>1051-1062 }1994]]. Podobně substituce v PH doméně, R279/A, se zvolila na základě mutace identifikované v PH doméně BTK, která má za následek X-vázanou agemaglobulinemii (XLA) [Yao a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 97:9175-9179 (1994)] a může být důležitá v PKC (Yao a kol., Proč. Nat. Acad. Sci USA, 91:9115-9119 (1994) a navázání inositol 1,3, 4,5-tetrakisfosfátu (IP₄) [Fukuda a kol., J. Biol. Chem., 271:30303-30306 (1996)]. Rovněž se generovala zkrácení obsahující buď Sec7 doménu nebo PH doménu IRP-1 fúzovanou na GFP.

Imunologický přenos na membránu ukázalo, že se IRP/GFP fúzní proteiny exprimovaly ve všech JY-8 • · • 4

4 4 4 4 4 44 4 φ 4 4 4 4 4 4 · · · ·4 • * 4 4444444

4444 44 44 ·· 444» transfekantů v podobných koncentracích. Pro potvrzení exprese fúzních proteinů, se detergenční lysáty JY-8 transfekantů imunologicky zabarvily pomocí protilátek specifických pro IRP-1, B2-1, IRP PH domén a GFP. Migrace všech GFP fúzních proteinů, v SDS-PAGE, odpovídala jejich předpokládaným velikostem. Kromě toho, fúzní proteiny vázaly příslušnou mAb specifickou pro IRP-1, B2-1 nebo PH doménu a stejně tak GFP protilátky. Endogenní IRP-1 a B2-1 se rovněž detekovaly v JY lysátech. Odhady z několika skvrn naznačily, že se sedm fúzních proteinů exprimovalo v úrovních alespoň desetkrát vyšších než endogenní IRP-1 a B2-1.

Integrinově dependentní buněčná adheze je indukovatelná různými stimuly [Diamond a Springer, Curr. Opin. Biol. 4:506-517, (1994)]. Známé stimuly pro indukování adheze zahrnují agonizující činidla pro G-protein spojené chemokinovými receptory, například IL-8 nebo agonizující činidla pro PKC, například PMA. Tyto stimuly aktivují signalizační dráhy, které mohou regulovat organizaci buněčné kostry a shlukování způsobem, který zvyšuje nebo stabilizuje integrinovou depepndentni adhezi. Chemokiny a agonizující činidla, například PMA se používají běžně pro zvýšení adheze nebo určení maximálních úrovni adheze při insert vitro testech.

Adhezní testy měřící navázání IRP/GFP fúzních proteinů na ICAM-1 nebo VCAM-1 se prováděly v 96jamkových plotnách Easy Wash (Corning) za použití modifikovaného postupu Morla a kol., Nátuře, 367:193-196 (1994). Každá jamka se potáhla 50 μΐ ICAM-l/Fc (5 μς/ιηΐ) nebo VCAM-l/Fc (2 μς/ιηΐ) v 50 mM hydrogenuhličitanovém pufru (pH 9,6). Některé jamky se potáhly CD18 mAb (22F12C, ICOS • · 4 · • · • 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 99 44

Corporation) za účelem kvantifikováni 100% vaznosti zavedených buněk nebo BSA blokem za účelem stanovení vaznosti pozadí. Plotny se blokovaly 1% BSA v PBS po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě. Jamky se následně propláchly a přidalo se 200 μΐ adhezního pufru (5% FBS, 5 mM KC1, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 20 mM HEPES, 10 mM D-glukózy) s nebo bez PMA (20 ng/ml) nebo IL-8 (25 ng/ml). Do každé jamky se následně přidaly JY-8 buňky (100 μΐ 5xl0⁶/ml) a plotny se inkubovaly při 37°C v 5% CO₂ po dobu pěti nebo třiceti minut. Buňky schopné adheze se fixovaly přidáním 50 μΐ 10% glutaraldehydového roztoku a zabarvily 0,5% roztokem krystalové violeti (SIGMA). Po promytí a přidání 70% ethanolu se buňky schopné adheze kvantifikovaly na základě stanovení absorbance při 570 nm za použití spektrofotometrického systému Spectramax 250 Microplate (Molecular Devices). Procentu buněk schopných adheze se určilo pomocí následujícího vzorce:

A570 (vaznost naICAM-1 nebo VCAM-1) - A₅₇₀ (vaznost na BSA) ---------------------------------------------------_{x 100}

A570 (vaznost na CD18 mAb)

Adheze JY-8 transfekantů na imobilizované ICAM-1 nebo VCAM-1 se určila za statických podmínek bez stimulace (základní úroveň vazebnosti) a stejně tak za stimulace IL-8 nebo PMA. V porovnání s základní úrovní vazebnosti, JY-8 buňky exprimující pouze GFP ukázaly tří až čtyřnásobné zvýšení vazebnosti na ICAM-1 a dvojnásobné zvýšení vazebnosti na VCAM-1 v přítomnosti IL-8. IL-8 indukovatelná adheze na VCAM-1 byla zřejmá po pěti minutách, nicméně zvýšení základní úrovně vaznosti mezi pěti a třiceti minutami snižuje rozdíl mezi stimulovanou a nestimulovanou • · • · · · · β» · ··» ···· ·· ·» ·· ·· ·· vazebnosti. Následné testy se prováděly třicet minut. PMA ošetření vedlo k čtyřnásobnému nebo vyššímu zvýšení adheze k ICAM-1 a VCAM-1. JY-8 transfekanty nadexprimující IRP-1 vykazovaly 40 až 50% snížení vazebnosti na ICAM-1 vzhledem ke kontrolním transfekantům činidlům exprimujícim ekvivalentní nebo vyšší úrovně GFP. Toto snížení bylo zřejmé pro základní a IL-8 stimulovanou adhezi, ale nikoliv pro PMA indukovanou adhezi. Vazebnost IRP-1 nadexprimující JY-8 transfekanty k VCAM-1 se rovněž snížila přibližně o 40% za podmínek IL-8 stimulace, ale nikoliv za základních nebo PMA stimulovaných podmínek. Tyto výsledky ukazují, že IRP-1 výhodně ovlivňuje chemokinem, ale nikoliv PMA stimulovanou adhezi a že IRP-1 nadexprimování obecně neudili buňkám adhezní nedostatečnost.

Za účelem určeni příspěvku různých IRP-1 domén k inhibování adheze, se testovaly JY-8 buňky exprimující aminokyselinovou substituci a deleci mutantů. Substituce aminokyselin v odstraněných Sec7 s PH doménách ovlivňuji IRP-1 nadexpresi na adhezi. Transfekanty exprimující IRP1 Sec7 doménovou mutaci E156/A a PH doménovou mutaci R279/A, vykazují úrovně vazebnosti k ICAM-1 a VCAM-1 shodné s vazebností GFP exprimujícího JY-8. Kromě toho nezávislá exprese IRP-1 Sec7 nebo PH domén nezvyšuje vazebnost na ICAM-1 nebo VCAM-1 tak účinně jako standardní typ IRP-

1. Takže jak Sec7, tak PH domény působí společně tak, že regulují IL-8 stimulovanou adhezi na ICAM-1 a VCAM-1.

Dále se stanovily účinky IRP-2 a B2-1 nadexprese na JY-8 adhezi. JY-8 transfekční činidla nadexprimující IRP-2 vykazují slabší snížení, přibližně o 20%, v základní úrovni vaznosti k ICAM-1 nebo IL-8 indukované vaznosti k ICAM-1 a VCAM-1 v porovnání s GFP transfekanty. Na druhou stranu • · • · • · · » · · · · • *·· · · · · · · · · • · · · · · · ··· «·»· «· · · · · · · · · transfekanty nadexprimující B2-1 vykazuji kontrolní úrovně IL-8 stimulované vaznosti k ICAM-1, ale odpovídající zvýšení vazebnosti k VCAM-, přibližně o 50%. Takže vliv na B2-1 nadexpresi v IL-8 stimulovanou adhezi k VCAM-l jsou opačné v porovnání s IRP-1 a IRP-2 a selektivní pro a₄p₇/VCAM-l interakci.

Modulace	JY-8	adheze	k ICAM-1 a	VCAM-l s
nadexprimováním	IRP	proteinů	nemůže přispívat	ke změnám
úrovní αιβ2 nebo	α4β7	buněčného	povrchu. V míře	exprese αιβ2

nebo α₄β₇ na různých JY-8 transfekantech nadexprimujících IRP proteiny je relativně malý rozdíl v porovnání s transfekanty nadexprimujícím GFP proteiny. JY-8 buňky nadexprimující IRP-1 Sec7 vykazují mírné snížení exprese α₄β₇, nicméně tyto buňky nevykazují snížení adheze k VCAM-

1.

Přiklad 6

Integrin α₄β₇ může zprostředkovat přichycení a narolování lymfocytů k endotelovým buněčným ligandům VCAM-l a MadCAM-1 za proudových podmínek [Berlin a kol., supra (1995)]. Za účelem stanovení toho, zda IRP exprese ovlivňuje α₄β₇ zprostředkované buněčné navázání a narolování, se kvantifikovala vaznost JY transfekantů za neklidových podmínek [Berlin a kol., supra (1995)]. Kromě toho, po stanovení buněčné vaznosti za proudových podmínek se zjišťovala statická adheze s cílem stanovit možné změny v α₄β₇ aviditě, k nimž by mohlo dojít v důsledku IRP exprese.

• · • · · ·

JY buňky, které exprimují endogenní α₄β₇, se nebo B2-1 kontrolní kompletními kóduj ícími

DNA (JYvek) a do imobilizovaný obsahuj ící

1/Ig) chimérický protein

Biol. 125:215-222 (1994)].

dyny/cm², se udržoval

IRP l(JY_IRP_i), IRP-2 (JYiRP-2) sekvencemi nebo vektorovou proudové systémové

VCAM-1/imunoglobulinový [Vonderheide a kol., J.

Počáteční průtok, který

Po následujících pět minut, dynů/cm², JYvek transfekanty kdy smyčky (VCAMCell.

byl 3 dobu jedné minuty. Po se průtok snížil na 1,5 a menší měrou i JYb2-i transfekanty vykazovaly schopnost navázat se a narolovat se (obrázek 2) . Buňky transfekované buď IRP-1 nebo IRP-2, JYiRp-i a JYirp-2 se nenavázaly nebo se navázaly pouze velmi zřídka.

V následující minutě se transfekované buňky inkubovaly v přítomnosti imobilizovaného ligandů v klidovém stavu a tato doba byla nedostatečná pro vytvoření vazeb JYirp-i/VCAM-1 nebo JY_IRP-₂/VCAM-l. Po této periodě statického navázání se průtok v průběhu následujících čtyř a půl minut přírůstkově zvyšoval z 1,5 na 9 dynů/cm². Vazebnost JY_B2-i a JYvek se snižovala až do okamžiku, kdy průtok dosáhl 3 dyny/cm² (obrázek 2) . Podobné snižování četností vazeb pro tyto dva proteiny naznačuje podobnou vazebnou aviditu pro IRP-3 a VEK.

Výsledky testu naznačily, že IRP-1 a IRP-2 exprese ruší schopnost α₄β₇ navázat se na VCAM-1 jak za proudových, tak za krátkodobých statických podmínek. Nicméně se ukazuje, že exprese B2-1 snižuje pouze schopnost navázat se a narolovat se.

• · • · · · • · • · · · ♦ · · · · • · · · · ·· · · · · · ·«· · · · · · · · ···· · · ·· ·· ·· ··

Za účelem stanoveni vlivu IRP-1 a IRP-2 exprese na vazebnost endogenní LFA-1 na ICAM-1 se JY buňky trasfekované výše popsaným způsobem použily při podobném testu, který se lišil v tom, že imobilizovaným protireceptorem byl ICAM-1. Všechny transfekované JY buňky, c výjimkou JYb2-i buněk, se navázaly a narolovaly na ICAM-1 při průtoku 1,5 dynů/cm². Schopnost navázat byla však v porovnání s ctíPv/VCAM-l vazností snížená (obrázek 3). Adheze na ICAM-1 po jedné minutě statického navazování podstatně vzrostla v případě všech transfekantů s výjimkou JYirp-1 buněk, u kterých vaznost sice vzrostla, ale k nižšímu maximu. Po zvýšení průtoku následovalo statické navazování, při kterém se ICAM-1 vážící JYi_RP-i, JYb2-i a JYvek buňky zredukuje. Nicméně se zdá, že JY_IRP_₂ vaznost je nejodolnější vůči zvýšení průtoku, protože vaznost byla detekována dokonce při průtoku 7,5 dynů/cm². Tyto výsledky naznačují, že B2-1 exprese ruší LFA-1 připojení na ICAM-1 za proudových podmínek; IRP-1 exprese snižuje LFA-l/ICAM-1 vazebnost za statických podmínek; a IRP-2 exprese podporuje vyšší aviditu vazebnosti mezi LFA-1 a ICAM-1.

Přiklad 7

Za účelem generování IRP-1 a B2-1 specifických monoklonálních protilátek, se myši imunizovaly pomocí Hiszakončenými IRP-1 a B2-1 exprimovanými a čištěnými z E. coli. Kódující oblasti IRP-1 a B2-1 byly ligovány v rámci pET15b (Novagen, Madison, WI) C-terminálu do sekvencí kódujících histinové zakončení tak, že se IRP-1 a B2-1 proteiny exprimovaly jako N-terminálním histidinem zakončené proteiny v kmeni E.coli BL211ysS. Rekombinantní ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · ·· · · · · · • · · · · ···· • · · · · ·· · · · · · • ·· · · · · · · · *··· ·· ·· ·· ·· ·· proteiny se čistily standardními postupy (Qiagen, Chatsworth, CA).

Hybridomy se generovaly způsobem obecně popsaným v publikaci, jejímiž autory jsou Tjoelker a kol., J. Biol. Chem., 270:25481-25487 (1995). Pro hybridomové série 200, se každé z pěti šesti- až dvanáctitýdenních myší Balb/c odebrala krev v den 0 a myši se následně imunizovaly subkutánně 67 pg E. coli produkovaným HÍSB2-1, emulgovaným v kompletním Freundsově adjuvantu. Po 21 dnech se každá myš injektovala 25 pg HisB2-l v kompletním Freundsově adjuvantu. Zkušební odběry se provedly 34 den a testovaly Westernovým přenosem. 100 ng HisB2-l proteinu z 10% redukujícího SDS-PAGE se transferovalo na PVDF, který se následně nastříhal na proužky. Přenos se blokoval jednu hodinu při pokojové teplotě 3% BSA, 0,2% Tweenem 20 v CMFPBS. Předimunní a imunní séra se naředila v poměru 1:500 v blokovacím pufru a inkubovala zmíněnými proužky při pokojové teplotě. Proužky se třikrát promyly 2% Tweenem 20 v CMF-PBS a následně jednu hodinu inkubovaly kozím antimyším (Fc)-HRP. Po čtyřnásobném promytí se proužky vyvolávaly pomocí chemiluminescenčních rentgenů Renaissance (NEN) . Myš #2413 se podala poslední intraperitoneální injekce 25 pg HisB2-l proteinu v CMF-PBS 45 den a o čtyři dny později se jí odebrala slezina.

Pro hybridomové série 233, se každé z pěti šesti- až dvanáctitýdenní myší Balb/c v den nula provedl odběr krve a všechny se imunizovaly subkutánně 30 pg HisIRP-1 produkovaného E. coli. a emulgovaného v kompletním

Freundsově adjuvantu. Dvacátý druhý den se každé myši injektovalo 10 pg HisIRP-1 a čtyřicátý pátý den 5 pg

HisIRP-1 v kompletním Freundsově adjuvantu. Padesátý pátý • · · · den se provedly zkušební odběry

Westernovým přenosem proti HisIRP-1 a ty se a HisIRP-2.

testovaly

Myš #2520 se injektovala intraperitoneálně 50

133. a 134. den a 137. den se μς HisIRP-1 odebrala slezina.

Fúze se provedly níže popsaným způsobem. Jednobuněčná suspenze se provedla drcením sleziny mezi zmrazenými konci dvou mikroskopických podložních sklíček ponořenými v seru prostém RPMI 1640, doplněném 2 mM L-glutaminu, 1 mM purivátu sodného, 100 jednotkami/ml penicilínu a 100 μς/πιΐ streptomycinu (RPMI) (Gibco, Canada). Buněčná suspenze se filtrovala přes sterilní 70-meshový buněčný filtr Nitex (Becton Dickinson, Parsippany, New Yersey) a dvakrát promyl pětiminutovým odstřeďováním při 200 g a resuspendováním pelet ve 20 ml seru prostém RPMI. Thymocyty odebrané ze tří myší Balb/c, na kterých dosud nebyly prováděny žádné pokusy, se připravily podobným způsobem.

NS-1 myelomové buňky udržované v log fázi v RPMI pomocí 11% sera FetalClone (FBS)) (Hyclone Laboratories, lne., Logan, Utah) se tři dny před fúzí odstřeďovaly pět minut při 200 g a pelety se dvakrát promyly způsobem popsaným v předcházejícím odstavci. Po promytí se každá buněčná suspenze převedla na konečných 10 ml v seru prostém RPMI a spočetla.

Slezinové buňky se kombinovaly s NS-1 buňkami v poměru

5:1 odstřeďovaly a supernatant se odsál. Vytlačila se buněčná peleta z stálého míchání se v průběhu jedné minuty přidaly 2 ml 37°C PEG 1500 (50% v 75 mM Hepes, pH 8,0) (Boehringer Mannheim) a posléze následovalo přidání 14 ml séra prostého RPMI, které se provedlo v průběhu sedmi • · * · • · · ·· · • · · · · · · ·· • 9 · · · · · · · · · · • ·· ···· · · ·

		· · ♦ · 46	··	• ·
minut. Potom se	přidalo	dalších 16 ml RPMI a	buňky	se
odstřeďovaly	při 200	g deset minut. Po	odčerpání
supernatantu se	peleta	resuspendovala ve 200	ml RPMI
obsahujícím 15%	FBS, 100	μΜ hypoxanthinu sodného, 0,4	μΜ

aminopterinu, 16 μΜ thymidinu (HAT) (Gibco), 25 jednotek/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 10⁶ thymocytů/ml. Suspenze se nalila do 96jamkových plat tkáňové kultury s jamkami s plochým dnem (Corning United Kingdom), přičemž do každé jamky se nalilo 200 μΐ. Buňky na plotnách se živily třikrát až pětkrát před screenovánim odsátím přibližně 100 μΐ z každé jamky pomocí jehly 18 G (Becton Dickinson) a přidáním 100 μΐ/jamku výše popsaného média s tou obměnou, že obsahovalo 10 jednotek/ml IL-β a postrádalo thymocyty.

Supernatanty z fúze 200 se screenovaly nejprve pomocí testu ELISA na imunogen a detekovaly pomocí kozího protimyšího IgG(Fc) koňského ředkvičkového peroxidázového konjugátu. Supernatanty z třiceti jamek , které poskytly nejvyšší signál se opakovaně testovaly pomocí Westernový analýzy na imunogenu. Na základě výsledků testu se pro další klonování zvolilo devět fúzních jamek. Těchto devět jamek se označilo jako 200A až 2001.

Supernatanty z fúze 233 se nejprve testovaly pomocí testu ELISA na HisIRP-1 a HisB2-l potaženými plotnami. Fúze z jamek reagující s HisIRP-1 a nikoliv s HisB2-l se zvolily pro další klonování.

Tyto fúzní buňky se subklonovaly postupně pomocí RPMI, 15% FBS, 100 μΜ hypoxanthinu sodného, 16 μΜ thymidinu a 10 jednotek/ml IL-β. Subklonování se provádělo buď dvojitým naředěnim nebo limitujícím naředěním a naočkováním 96 jamkových ploten při koncentraci 0,5 až 1,0 buněk/jamku.

• · ··· ···· • ··· · · · · · · · · • ·· ···· · · · ···· ·· ·· ·· ·· ··

Jamky subklonálních ploten se hodnotily vizuálně a členy kolonií v nejméně hustých jamkách se zaznamenaly. U zvolených jamek každého klonování se testovaly pomocí testu ELISA nebo popsaného Westernová přenosu reaktivita pozorovaná v původní fúzní jamce. Klonování bylo dokončeno pro buněčné linie 200A, 200B, 200F, 200H, 200G, 233E, 233G a 233K. Westernový přenosy se prováděly pomocí reakčních protilátek z osmi hybridomových linií pomocí IRP-1, IRP-2 a B2-1. Pro monoklonální protilátky z osmi hybridomových buněčných linií se za použití sady Isostrip (Boehringer Mannheim) nebo produktu ELISA a za použití isotypových specifických reakčních činidel (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) stanovily isotopy. Všemi protilátkami jsou IgGl s výjimkou 200G, kterou je izotop IgG2a.

Hybridomové buněčné linie 200A, 200B a 233G byly uloženy ve sbírce Američan Type Culture Collection.

233 série mAbs se dále testovaly za použiti hybridomových supernatantů a screenovaly ve Westernových přenosech. JY-8 buňky se transfekovaly bud’ GFP/IRP-1 nebo GFP/IRP-2 nebo GFP/B2-1 (viz přiklad 5) se lyžovaly v 1% pufru CHAPS. Buňky se lyžovaly 30 minut na ledu a následně odstřeďovaly deset minut rychlosti 12 000 ot./min. Do supernatantů se přidal vzorkový pufr a vzorky se čtyři hodiny vařily. Vzorky prošly přes 8% gel Novex a tranfekovaly na PVDF membránu. Tato membrány se blokovala jednu hodinu v TST (25 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,2%

Tween-20) obsahujícím 3% BSA. Blokovací roztok se odstranil a nahradil 1:20 naředěním hybridomového supernatantů v vazebném pufru (3% BSA v TST) a inkuboval jednu hodinu při pokojové teplotě. Membrána se extenzívně promyla TST a následně třicet minut inkubovala pomocí HRP konjugovaným ···· ·· · · · · ·· *· ·· · · · · · · · · ·· · · · · · ·· · · · · · · ···· * • ·· ·«·· · · · »··· ·· ·· ·· ·· · kozím protimyším IgG Fc fragmentem (Jackson ImmunoResearch) při pokojové teplotě. Po promytí pomocí TST se pro ECL detekování použila sada Renaissance (NEN) a membrána se exponovala na Hyperfilm (Kodak). Supernatanty z 233A, 233D, 233G, 233K a 233L všechny specificky označené příslušně velikým 77 kDa pásem v GFP-IRP-1 lyzátů a nikoliv v GFPIRP-2 nebo GFB-B2-1 lyzátech. Signál používající 233G byl nej silněj ší.

Zopakováním výše popsaného postupu se rovněž zkoumala schopnost detekovat GFP-IRP fúzní proteiny z lyzátů JY-8 transfekantů pomocí Westernová přenosu u vyčištěné 200A a 200B mAbs. Obě mAbs se při Westernově přenosu použily v koncentraci 1 μς/πιΐ. mAb 200A označily GFP-Irp-1, GFP-IRP-2 a GFP-B2-1 stejně dobře, zatímco 200B preferenčně označila GFP-B2-1 a vykazovala slabé rozpoznání (menší než 10% úrovně patrné s B2-1) GFP-Irp-1. Na dalším Western obsahujícím lyzátů JY-8 transfekantů exprimujícího GFP zakončenou PH doménu IRP-1 zkrácení, 200A detekovala pás vhodné velikosti pro GFP-IRP-1 PH doménové zkrácení naznačující, že 200A rozpoznává společný epitop v homologových PH doménách IRP-1, IRP-2 a B2-1.

U hybridomových supernatantů se screenovala specifická reaktivita k rekombinantním proteinům pomocí ELISY. Kromě toho, se specifičnost určila pomocí reaktivity na Westernové přenosy obsahující IRP-1, IRP-2 a B2-1 E. coli exprimované proteiny. mAb 200A ((reagující s IRP-1, IRP-2 a B2-1 PH doménami) , 233G (reagující s IRP-1) a 200B (reagující s B2-1) se použily pro stanovení expresních úrovní a velikostí GFP-IRP fúzních proteinů v JY-8 IRP transfekantů.

·· ·· ···· • »· • « · · · • 9 · ·· ··

Pro stanoveni integrinových expresních úrovní na JY-8 transfekantech činidlech, se buňky zabarvily mAb specifickou pro αχβ₂, TS1/22 (ATCC) a a₄, IC/A4.1 (ICOS Corporation) standardní nepřímou imunofluorescencí. Fluorescence byla kvantitativně stanovena proudovou cytofluorometrií za použití skenu FACS.

Přiklad 8

Chemotaxe nevyžaduje pouze počáteční adhezi na substrát a cyklizací integrinu fázemi vázání a uvolňování v polarizovaných buňkách, ale rovněž vyžaduje recyklizaci integrinu odtokové na vodící hranu. Pro stanovení vlivu IRP proteinů na další integrinové funkce, kromě statické adheze, se pomocí migračního testu chemotaktických buněk stanovila úloha IRP na chemotaxi. V tomto testu JY-8 buňky migrovaly směrem ke zdroji IL-8 integrinovým a CAM dependentním způsobem.

Tento test použil modifikaci postupu pro buněčnou migraci pod agarózou, který popsal Schreiner a kol., Immunol., 88:89-96 (1980). Stručně uvedeno, šestijamkové plotny (Falcon) se potáhly bud’ ICAM-l/Fc (25 μg/ml) nebo VCAM-l/Fc (10 μg/ml) (ICOS Corporation) v hydrogenuhličitanovém pufru (pH 9,6). Po překrytí 1% agarózou v RPMI, obsahujícím 0,5% BSA (Intergen), se plotny inkubovaly 30 minut při 4°C. Buňky se promyly RPMI a resuspendovaly při koncentraci 5 x 10⁷/ml v RPMI 0,5% BSA. Buňky se tvořily v agaróze použitím 2,5mm gelové raznice (Pharmacia) a bezprostředně potom se plnily 10 μΐ IL-8 (2,5 μg/ml) (PeproTech) nebo buněčnou suspenzí. Plotny se ·· ···· ·· »··· ·· ·· ·· · ·· · ···· ·· ··· ···· • · · · * ♦ · ··« · · ······· ··· ···· *· ·· ·· ·* ·· inkubovaly 8 hodin při 37°C v 5% CO₂. Buňky se následně fixovaly přidáním 2% glutaraldehydového roztoku. Po odstranění agarózy se jamky propláchly dH₂O a vysušily. Kvantifikování buněčné migrace se provedlo za použití videomikroskopické pracovní stanice, sestávající z mikroskopu Diaphot (Nikon, Tokio, Japan), CCD-72 videokamery a DSP2000 digitálního procesoru (Dage, Michigan City, IN), a za použití Macintosh NIH Image zobrazovacího programu (vyvinutého při národním institutu zdraví USA a dostupného z internetu anonymními FTP z zippy.nimh.nih.gov nebo na floppy disku společnosti National Technical Information Service, Springfield, Virginia, číslo PB95500195GEI).

Chemotaxe JY-8 buněk, exprimujících GFP/IRP fúzní proteiny, se stanovila výše popsaným způsobem. IRP-1, IRP-2 a B2-1 nadexprese v JY-8 buňkách snižuje chemotaxi na ICAM1 nebo VCAM-1, v porovnání s GFP exprimujícími tranfekační činidla. Exprese IRP-1 PH doménového substitučního mutantu R279/A rovněž snižuje chemotaxi. Nicméně exprese R279/A snižuje chemotaxi mnohem méně účinněji než exprese standardní IRP-1. Exprese IRP-1 PH domény rovněž snižuje chemotaxi na ICAM-1 a VCAM-1. Tyto výsledky naznačují, že IRP-1 PH doména hraje hlavní roli při IRP-1 mediovaném snížení chemotaxe. Substituce E156/A v IRP-1 Sec7 doméně rovněž rezultuje ve snížení chemotaxe, ale v menším snížení než v případě standardní IRP-1 nadexprese. Nadexprese IRP1 Sec7 domény rezultuje ve zvýšené chemotaxi na ICAM-1, ale v chemotaxi na VCAM-1 nebyly pozorovány žádné změny. Tyto výsledky naznačují, že Sec7 doména může rovněž přispívat k chemotaxi. Takže jak IRP-1 Sec7 doména, tak PH doména způsobují α₄β₇ a αιβ₂ dependentní chemotaktickou migraci.

• · · ·

			• · · * · • · · · · ·	• · • · · · ·
			• · · · · · · ···· ·· · · ··	• · • ·
			51
Jak	bylo	uvedeno	výše, inhibiční účinek	IRP-1
nadexprese	na	chemotaxi	se snížil substitucemi v	Sec7

(E156/A) a PH (R279/A) doménách, což naznačuje, že obě domény přispívají společně s adhezí rovněž k IRP-1 regulaci chemotaxe. Zvýšená chemotaktická migrace JY-8 transfekantů, exprimujících IRP-1 R279/A, v porovnání se standardem a téměř kompletní blokací s expresí IRP-1 PH domény naznačuje, že PH domény hrají hlavní roli v chemotaxi. Takže se zdá, že interakce mezi IRP-1 PH doménou a fosfatidylinositoly [Harlan a kol., Biochemistry, 34:98599864 (1995), Pitcher a kol., J. Biol. Chem., 270:1170711710 (1995)] nebo heterotrimerovými G proteinovými βγ podjednotkami [Mahadeven a kol., Biochemistry, 34:9111-9117 (1995), Touhara a kol., J. Biol. Chem., 269:10217-10220 (1994), Pitcher a kol., J. Biol. Chem., 270:11707-11710 (1995)] jsou rozhodující pro roli IRP proteinů v chemotaxi.

Přiklad 9

Distribuce IRP proteinů ve tkání se stanovila pomocí monoklonálních protilátek 200B a 233G. Protilátka 200B preferenčně rozpoznává B2-1 a protilátka 233G specificky rozpoznává IRP-1.

Obě klonální protilátky se použily v koncentraci 10 pg/ml pro imunocytochemickou analýzu zmražených lidských mandlí, sleziny a částí lymfatických uzlin. Díly o síle 6 mikrometrů se položily na podložní sklíčka Superfrost Plus Slides (VWR) a uložily při -70°C. Před použitím se podložní sklíčka vyjmula a umístila po dobu pěti minut při teplotě 55°C. Díly se následně fixovaly dvě minuty ve studeném 4% paraformaldehydu a následně 5 minut ve studeném • · acetonu a vysušily. Části se blokovaly 30 minut při pokojové teplotě v roztoku obsahujícím 1% BSA, 30% normálního lidského séra a 5% normálního krysího séra. Protilátky 200B nebo 233G se aplikovaly na jednotlivé díly jednu hodinu při pokojové teplotě. Nenavázaná protilátka se odstranila třínásobným omytím podložních sklíček v TBS pufru, přičemž jedno omytí trvalo pět minut. Následně se na každou část aplikovala krysím-protimyším-biotinem konjugovaná protilátka ve stejném TBS pufru a díly se inkubovaly třicet minut při pokojové teplotě. Pro detekování sady ABC-elite (Vector Labs) se použila druhá protilátka a aplikovala se 30 minut při pokojové teplotě na každý díl. Aplikoval se DAB substrát (Vector Labs) a barevný vývoj se zastavil ponořením do vody. Barva se zesílila přibližně pěti až desetisekundovou aplikaci 1% kyseliny osmiové. Zesilování se zastavilo umístěním podložních sklíček do vody. Díly se opačně dobarvily před dehydratací v Hematoxylinu Gill's č. 2 a opláchly ve vodě, okyseleném alkoholu, uhličitanu lithném a spojily s Permountem (VWR). 200B a 233G zabarvení se detekovala v mandlích, slezině a lymfatických uzlinách, ale nikoliv s kontrolní IgGl protilátkou.

Obě protilátky vykazovaly velmi silné označení na mukosálním epitelu na mandlích. Zdá se, že obě látky označují podsoubor zvrstveného šupinatého epitelu. Rozdílem mezi 200B a 233G vazebností v mandlích je označení patrné v případě 233G uvnitř sekundárních váčků. Toto označení není patrné v případě 200B. Ve slezině se jeví obě protilátky podobně, pokud jde o jejich vaznost, a označují jednotlivé buňky v oblastech červené dřeně. V lymfatické uzlině byla vaznost pozorována na jednotlivých buňkách v hluboké kůře v případě 200B a v hluboké kůře a dřeňové kůře v případě • · · · • · ·· · · · · · • · · · · ·· · · · · · ··· · · · · ··· «··· · * ·· ·· ·· ··

233G. Vzor označeni, viditelný v případě 200B, byl značně tečkovaný. Tento vzor byl rovněž patrný v případě 233G, ale mnohem jemnější.

Přiklad 10

PH domény jsou přítomny ve více než sedmdesáti funkčně diverzních proteinech, zahrnujících kinázy a spojkové proteiny. Jak již bylo uvedeno, PH domény poskytují schopnost vázat se na G proteinové ρ_γ podjednotky, PIP2 a PKC. SEC7 motiv v IRP proteinech se rovněž vyskytuje v dalších proteinech, nesdílejících homologii mimo tento motiv, a je pravděpodobně nositelem intramolekulárních interakcí.

Kromě toho kinesinová/myosinová aminová homologie IRP proteinů předpokládat, přinášet interakci Proteiny, které vzájemně reagují identifikovat různými testy, mezi terminální by mohla, jak se dá dalšími proteiny.

lze

IRP proteiny které spadají i níže popsané testy.

Prvním testem, použitým v rámci vynálezu, je dvouhybridní screenovací test „two-hybrid screen.

Dvouhybridní systém byl vyvinut v droždí [Chien a kol.,

Proč. Nati.

Acad. Sci.

(USA), 88:9578-9582 (1991)] zakládá se na funkční in vivo rekonstituci transkripčního faktoru, který aktivuje reporterový gen. Konkrétně se polynukleotid, kódující protein, který vzájemně reaguje s IRP proteiny izoluje: transformací nebo transfekací příslušných hostitelských buněk pomocí DNA konstruktu obsahujícího reporterový gen za kontroly promotoru regulovaného transkripčním faktorem, majícím DNA vazebnou doménu a aktivační doménu; exprimování první hybridní ·· · · · · · · · • ··· · ·· ···· * • ·· · · · · · · · ···· · · · · · · ·c ·· sekvence, kódující první fúzi části nebo všech IRP proteinů, a DNA, kódující domény nebo aktivační domény transkripčního faktoru v hostitelských buňkách; exprimování knihovny druhých hybridních sekvenci kódujících druhé fúze části nebo všech pravděpodobných IRP proteinů vážících proteiny a DNA vazebné domény nebo aktivační domény transkripčního faktoru, které se nezabudovaly při první fúzi, v hostitelských buňkách; detekování navázanosti IRP interakčního proteinu na IRP proteiny v příslušné hostitelské buňce detekováním produkce reporterového genového produktu v hostitelské buňce; a izolování druhých hybridních DNA sekvencí, kódujících interakční protein, z příslušné hostitelské buňky. V současné době je výhodné v tomto testu použít lexA promotor pro řízenou expresi reporterového genu, lacZ reportérovy gen, transkripční faktor obsahující lexA DNA vazebnou doménu a GAL4 transkripční doménu a kvasnicové hostitelské buňky.

Další testy navržené pro identifikaci proteinů, které vzájemně reagují s IRP proteiny, mohou zahrnovat imobilizaci IRP proteinů nebo testované domény, detekovatelné označení neimobilizovaného vazebného partnera, vzájemné inkubování vazebných partnerů a určení množství označených vazeb. Označené vazby naznačují, že testovaný protein vzájemně reaguje s IRP proteiny.

Další typ testu pro identifikaci IRP interakčních proteinů zahrnuje imobilizaci IRP proteinů nebo jejich fragmentu na pevném nosiči, potaženém (nebo napuštěném) fluorescenčním činidlem; označení testovaného proteinu sloučeninou schopnou excitovat fluorescenční činidlo; uvedeni imobilizovaných IRP proteinů do kontaktu s označeným testovaným proteinem; detekování světelné emise • · · · • · fluorescenčním činidlem; a identifikování interakci proteinů jako testovaných proteinů, která má za následek emisi světla fluorescenčním činidlem. Alternativně lze imobilizovat předpokládaný interakční protein a IRP proteiny pro tento test označit.

Příklad 11 používají v rámci snižování integrinové,

Modulátory IRP interakcí, které se vynálezu, jsou použitelné při zejména β₂ a/nebo β₇ integrinové, adheze k celulárním nebo extracelulárním matričním ligandům, což má za následek zejména lokalizace v snížení funkcí spojených se začleněním integrinů, snížení buněčného růstu, stimulace a zánětlivých procesech. Konkrétně lze očekávat, že modulátory zánětlivých mají terapeutickou hodnotu nebo autoimunních chorob tím, při léčení že sníží vtok lymfocytů, zánětlivého místa a rovněž sníží buněk, například neutrifilů, eosinofilů, monocytů nebo NK buněk, do cytotoxické aktivity buněk, místě. Modulátory mohou dependentní adhezi, ko-stimulační které být se již nacházejí v tomto schopné jak snižovat integrinovou stimulační a mohou mít

IRP proteinů které interferují s extracelulární ligandy tak mohou antagonizovat aktivity integrinů. Modulátory určitou výhodu proti sloučeninám, integrinem (tj .

extracelulárním ligandovým protože začlenění integrinů může být prozánětlivé. Modulátory IRP vázajícím se na blokačním protilátkám nebo antagonizujícím činidlům), může mít aktivační účinky a vaznosti mohou přímo nebo nepřímo přerušit integrinové signalizační dráhy.

Vzhledem k tomu, že se nezdá, že by nadexprese karboxylové terminální PH domény IRP proteinů vedla ke specifickému • · · ·

sníženi buněčné adheze integrinu, může být specifičností funkce aminových terminálních sekvencí, které poskytují kinesinové nebo SEC7 homologie. Takže modulátory, které se naváží na tyto aminové terminální sekvence mohou ovlivnit celulární adhezi integrinově specifickým způsobem. Příklady testů navržených pro identifikaci sloučenin, které modulují interakci IRP proteinů s dalšími proteiny, jsou popsány níže.

První test zahrnuje transformování nebo transfekce vhodných hostitelských buněk DNA konstruktem, obsahujícím reporterový gen pod kontrolou promotoru, regulovaného transkripčním faktorem, majícím DNA vazebnou doménu a aktivační doménu; expresi první hybridní DNA sekvence, kódující první fúzi části nebo celého IRP proteinu a DNA vazebné domény, nebo aktivační domény transkripčního faktoru, v hostitelských buňkách; expresi druhé hybridní DNA sekvence, kódující druhou fúzi části nebo celého IRP proteinu a DNA vazebné domény, nebo aktivační domény transkripčního faktoru, v hostitelských buňkách, která není zabudována v první fúzi; vyhodnocení vlivu testované sloučeniny na interakci mezi IRP proteinem a interakčním proteinem detekováním vazby interakčního proteinu na IRP proteiny v příslušné hostitelské buňce měřením produkce reporterového genového produktu v hostitelské buňce v přítomnosti testované sloučeniny nebo za její absence; a identifikování modulačních sloučenin jako těch testovacích sloučenin, které způsobují změnu produkce reporterového genového produktu, v porovnání s produkcí reporterového genového produktu v nepřítomnosti modulační sloučeniny.

tomto testu lze výhodně použít lexA promotor pro pohánění exprese reporterového genu, lacZ reporterový gen, • · • « · • · transkripční faktor, obsahující lexA DNA vazebnou doménu a GAL4 transaktivační doménu a kvasinkové hostitelské buňky.

Další typ testu, používaný pro identifikaci sloučenin, které modulují interakci mezi IRP proteiny a interakčním proteinem, zahrnuje imobilizaci IRP proteinů nebo přirozeného IRP interakčního proteinu, detekovatelné označení neimobilizovaného vazebného partnera, společné inkubování vazebných partnerů a určení vlivu testované sloučeniny na množství označených vazeb, přičemž snížení počtu označených vazeb v přítomnosti testované sloučeniny oproti počtu označených vazeb v nepřítomnosti testované sloučeniny naznačuje, že testované činidlo je inhibitorem IRP interakce s daným proteinem. Naopak zvýšení počtu označených vazeb v přítomnosti testované sloučeniny oproti počtu označených vazeb v nepřítomnosti testované sloučeniny naznačuje, že předpokládaný modulátor je aktivátorem IRP interakce s daným proteinem.

Konkrétně se IRP proteiny exprimovaly jako Hiszakončené nebo His-kemptide-zkončené rekombinantní proteiny a čistily přes kov chelatující chromatografické pryskyřice z pETI15b-transformovaných E. coli lyzátů.

Dobře známým prostředkem pro radiooznačení rekombinantních proteinů je zakončit peptid keptidovým zakončením. Keptidovým zakončením je polypeptidový fragment sedmi aminokyselin, který obsahuje proteinkinázové A (PKA) fosforylační místo. Keptidově zakončený rekombinantní protein může být radioaktivně označen na keptidovém konci působením PKA [Mohanraj a kol., Protein Expr Purif. 8(2):175-182 (1996)].

• ♦ · • ·

IRP proteiny (bez keptidového zakončeni) se radioaktivně označily pomocí volného ¹²⁵I buď metodou „Iodobead (Pierce) nebo použitím modifikované laktoperoxidázo/peroxidvodíkové metody popsané v Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lané, Editors, kapitola 9, str. 319-358 (1988). Radioaktivně označené proteiny se odsolily a skladovaly ve vazebném testovaném pufru, kterým byl buď 20 mM HEPES nebo 20 mM fosfát sodný pH 7,5 pufr se 150 mM nebo 300 mM NaCl, případně s 0,05% detergentem (NP-40 nebo Tritonem-X-100) a 2 mM azidu jako konzervačního činidla. Konečná specifická radioaktivita se pohybovala mezi 3 až 10 [¹²⁵I]/nmol IRP.

β₂ integrinové cytoplasmidové koncové proteiny (Ckonec) se exprimovaly a čistily jako rekombinantní His3E9zakončené proteiny z pETI15b-transformovaných E. coli nebo z transformovaného Saccharomyces sp., nebo se získaly jako nezakončené, syntetické peptidové preparáty (Anaspec, lne. San Jose, CA, Macromolecular Resources, Fořt Collins, CO).

Integrinové C-konce se imobilizovaly na 96jamkových mikrotitračních plotnách Scintistrip (Wallac) při koncentracích 1 až 100 μς/πιΐ v objemech 50 až 100 μΐ uhlovodíku (pH 9,6) na jamku a inkubovaly při 4°C přes noc. Plotny se sušily a blokovaly ve 350 μΐ/jamku sterilně filtrovaného 1-2% albuminu bovinního séra (BSA), rozpuštěného ve vazebném testovacím pufru a inkubovaly se 1 až 2 hodiny při pokojové teplotě. Jamky se třikrát promyly ve vazebné testovacím pufru a sušily bezprostředně před přidáním IRP proteinů.

• · · · testovacím formátem byl bud’ konkurenčně nebo saturační vazebný test. U

Vazebným inhibiční vazebný test konkurenčního vazebného testu se radioaktivně označené IRP proteiny naředily j edním na 25 až 100 nM ve vazebném testovacím pufru (neoznačeného IRP potenciálním modulátorem vaznosti proteiny, C-konce kontrolní polypeptidy, například BSA) .

nebo

Test nespecifické se inicioval přidáním 100 μΐ roztoku označených

IRP proteinů a modulátoru do blokovaných

000 cpm/jamku), které se následně inkubovaly jednu hodinu při pokojové teplotě (22 až 24°C) a test se následně zastavil rychlým trojím až pětinásobným promytím potenciálního (50 000 až 200 jamek Scintistrip ve vazebném testovacím pufru. Saturační provedly podobně s tou výjimkou, že se

1:20 poměr radioaktivně označených ku vazebné testy se použil konstantní neoznačeným IRP proteinům v celkovém koncentračním rozmezí 0,01 až 30 μΜ. Plotny se vysušily a scintilace se po kalibrování detektorů změřila na kapalném scintilačním čítači Wallac Model 1450. „Interjamkový crosstalk byl korigován za použití testovací plotny Scintistrip obsahující v Gll 100 μΐ 25 až 100 nM radiačně značeného IRP imobilizovaného anti-IRP monoklonální protilátkou 200A, nanesenou v jamce ve 20 μς/πιΐ hydrogenuhličitanového pufru. Inkubační časy a podmínky pro testované plotny se identifikovaly pomocí výše popsaného vazebného testu.

Vazebnost se měřila jako počet, radioaktivně označených IRP nacházejících se v C-koncem-potažených jamkách, přesahující počet, nacházející se v BSA potažených jamkách. Specifická vaznost se stanovila jako počet nacházející se v C-koncem potažených jamkách, který se

4 4 4

4 4 4 4 4 44 4

4 4 4 4 44 44444

44 4 444444 • 444 44 44 44 44·· snížil přidanými neoznačenými IRP proteiny nebo rozpuštěnými C-konci.

Konkurenční vazebný test, používající jodovaný IRP-1, ukázal, že potenciální modulátory IRP-1, IRP-1 Sec7 domény, B2-1, inhibovaly navázání mezi jodovaným IRP-1 a imobilizovanými His3E9-zakončené β2 C-konci. IRP-1, IRP-1 Sec7 doména, B2-1, pokud jsou přítomny v koncentracích 0,001 až 4 μΜ, snižují vaznost jodovaného IRP-1 na β₂ C-konec přibližně o 75 %. Přidání kontrolního peptidu (BSA) nesnižuje IRP-1 vaznost k imobilizovanému β₂ C-konci. Takže druhá kontrola, ve které se na BSA blokované mikrotitrové plotně neimobilizoval žádný β₂ C-konec, vykazovala pouze úrovně vaznosti radioaktivně označeného IRP-1 odpovídající pozadí.

Vazebné testy lze modifikovat použitím IRP proteinů a C-konců dalších integrinů, například včetně βι, β3 a β7. IRP proteiny nebo C-paty lze označit pomocí [³H]-borohydridu sodného, [¹²⁵I]-Bolton-Hunterova reakčního činidla, [³⁵SJ — metabolického označení, proteinkinázového [³²P]-označení nebo další vhodnou radioaktivně značící síťující metodou. Proteiny a peptidy lze imobilizovat na mikrotitračních plotnách (Nunc Covalink, Pierce Reactibind, Costar Labcoat, atd...) nebo na tělíscích (SPA nebo jiných). Vazebné testy lze odborníkem v daném oboru modifikovat nastavením inkubačních časů a modifikací pufrovacích podmínek. Kromě toho mohou polypeptidy, použité v tomto testu, zahrnovat diferentní syntetické peptidové fragmenty a lze je připravit různými v dané oblasti známými způsoby, včetně exprese cDNA konstruktů, izolace z přirozených zdrojů a chemické syntézy. Stanovení toho, zda je testovaná sloučenina modulátorem se provádí přidáním testované ··· ·

4> · • · ·· • · * • · · · • · «· ·· sloučeniny do vazebného testu. Jak již bylo diskutováno výše, zvýšení nebo snížení vaznosti naznačuje, že testovaná sloučenina je modulátorem IRP proteinů.

Další vazebné testy, které se zaměřují na identifikaci modulátorů IRP aktivity, zahrnují testy, které určují vazebnost IRP proteinů k vazebnému partnerovi (ARF faktory, fosfatidylinositoly nebo další příbuzné sloučeniny). U těchto testů se IRP nebo jeho vazebný partner imobilizuje na mikrotitračních plotnách nebo tělíscích. Množství vazeb, detekovatelně označených IRP nebo vazebného partnera, se určí za vhodných podmínek v přítomnosti a v nepřítomnosti testované sloučeniny. Modulátor IRP aktivity je sloučenina, která snižuje nebo zvyšuje vazebnost IRP k vazebnému partnerovi.

Pro stanovení vazebnosti IRP k fosfatidylinositolu, se His-zakončená IRP-1 PH doména (5'HA IRP-1 PH) imobilizovala na mikrotitrační plotně přibližně šestnáctihodinovou inkubací 100 μΐ 20 μς/ιηΐ 5' HA IRP-1 PH v uhlovodíkovém pufru (pH 9,6) při teplotě 41C. Mikrotitrační plotna se následně dekantovala a přibližně jednu hodinu blokovala 1 až 2% lidským IgG přibližně při 22°C. Tyto plotny se třikrát promyly v testovacím pufru (25 mM Tris pH 7,4, 100 μΜ NaCl, 0,25% NP-40, 0,1% deoxycholátu sodného, 1 mM MgCl₂, 0,5% DTT) . Deset nanomolů ³H-inositolfosfátů (IPn) (Du Pont, NEN) se přidalo v průběhu dvou hodin při teplotě 22°C v 100 μΐ testovacím pufru s 0 až 100 μιηοΐγ studeného IPn. Mikrotitrační plotny se čtyřikrát promyly a přidala se scintilační látka. Vaznost se stanovila měřením navázané radioaktivity v scintilačním počítači. Výsledky naznačily, že navázanost His-zakončené IRP-1 PH domény na inositol (1,3,4,5)P₄ a IP₆ byla desetkrát vyšší než u kontrolních ♦ · · • · příkladů. Modulátor vazebnosti mezi IRP s inosilfosfáty lze stanovit přidáním testované sloučeniny do tohoto testu a určením rozdílů vaznosti v přítomnosti a nepřítomnosti testované sloučeniny.

Ještě další způsob podle vynálezu pro identifikaci sloučenin, které modulují vazby mezi IRP proteiny a interakčním proteinem, zahrnuje imobilizaci IRP proteinů nebo jejich fragmentů na pevném nosiči, potaženém (nebo napuštěném) fluorescenčním činidlem; označení interakčního proteinu sloučeninou, schopnou excitovat fluorescenční činidla; uvedení imobilizovaných IRP proteinů do kontaktu s označeným interakčním proteinem; detekování světelné emise fluorescenčním činidlem; a identifikování modulujících sloučenin jako těch testovaných sloučenin, které ovlivňují emisi světla fluorescenčním činidlem, v porovnání s emisí světla fluorescenčním činidlem v nepřítomnosti testované sloučeniny. Alternativně lze imobilizovat předpokládaný IRP interakční protein a IRP proteiny označit.

U kombinatorických knihoven, peptidů a peptidových mimetik, definovaných chemických entit, oligonukleotidů a knihoven přirozeně se vyskytujících produktů lze zkoumat jejich účinnost jako modulátorů v takových testech, které byly popsány výše.

Příklad 12

Identifikace modulátorů IRP interakcí se usnadní jasným definování částí proteinů, které jsou nezbytné pro vaznost. Pro identifikaci vazebných oblastí proteinů se může použít aminokyselinová substituce prováděná • · · · • 9 standardních mutagenezových technik, generují zkrácené formy může rovněž použít pro při které se prostřednictvím

Analýza delecí, proteinů, například PCR, se identifikaci vazebných oblasti, pokud deletace neroztrhne terciálni nebo kvarterní strukturu proteinu do té míry, že již není rozpoznána svým specifickým receptorem.

Identifikace pro vazebnost významných proteinových oblastí umožní přesnější a účinnější prozkoumání vazebné aktivity předpokládaných modulátorů. Vynález rovněž zahrnuje vysoce výkonný screenovací test pro analyzování schopnosti modulovat interakce β₂, β₇, βι a/nebo β₃ integrinů s IRP proteiny a rovněž schopnosti modulovat interakce IRP proteinů s dalšími interakčními proteiny u velkých knihoven malých molekul nebo peptidů a rovněž protilátek imunospecifických pro jeden nebo oba dva vazebné partnery. Ačkoliv nejsou dva zde popsané screenovací, scintilační proximitni testy (SPA) a imunosorpčni testy (ELISA) samy o sobě HTS metodami, umožňují určovat schopnost modulovat vazebnost u celé řady zmíněných sloučenin. SPA a ELISA jsou zvláště vhodné pro tento identifikační proces a lze je modifikovat tak, aby umožňovaly vysoce výkonně screenovat popsané testované sloučeniny.

V závěru je třeba uvést, že výše uvedená příkladná provedeni mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, jenž je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

• ·· ·

(1) Informace pro SEQ ID č.: 1:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 1700 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (ix) Znaky:

(A) Název/klič: CDS (B) Oblast: 283..1482 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 1:

TCCTAGATGA TCTCGAGAGG CGCAGTGTGC GCCCACTGTG GATTGGACAG TGTCAAAAAG GCGACGAAGG GAAGAGTCTT TTCAGCGCTG CCCGGGGCGT TTGAGCGGGC TCACCCGAGC GGCGGGACCG CCCCGGATTC CCCGCGGGCC

TCTAAAGGCG AGGGCGGTGA GGACGACAGC60

AGGGGCGGTC CCTACTGAAG GGGCGGTTGG120

AGGACTGGCG CTGAGGAGGC GGCGGTGGCT180

CCGCGGGCCA ACGCGGATCC AGGCCCGACT240

TTCCTAGCCG CC ATG GAG GAC GGC294

Met Glu Asp Gly

GTC Val 5

TAT GAA CCC CCA Tyr Glu Pro Pro

GAC CTG ACT CCG GAG GAG CGG ATG GAG CTG GAG

342

Asp Leu 10

Thr

Pro Glu

Glu 15

Arg Met

Glu Leu Glu 20

AAC

ATC

CGG

CGG

CGG

AAG

CAG

GAG

CTG

CTG

GTG

GAG

ATT

CAG

CGC

CTG

390

Asn

Ile

Arg Arg Arg

Lys

Gin

Glu

Leu

Leu

Val

Glu

Ile

Gin

Arg

Leu

25

30

35

CGG

GAG

GAG

CTC

AGT

GAA

GCC

ATG

AGC

GAG

GTG

GAG

GGG

CTG

GAG

GCC

438

Arg

Glu

Glu

Leu

Ser

Glu

Ala

Met

Ser

Glu

Val

Glu

Gly

Leu

Glu

Ala

40

45

50

AAT

GAG

GGC

AGT

AAG

ACC

TTG

CAA

CGG

AAC

CGG

AAG

ATG

GCA

ATG

GGC

486

Asn

Glu

Gly

Ser

Lys

Thr

Leu

Gin

Arg

Asn

Arg

Lys

Met

Ala

Met

Gly

55

60

65

AGG

AAG

AAG

TTC

AAC

ATG

GAC

CCC

AAG

AAG

GGG

ATC

CAG

TTC

TTG

GTG

534

Arg

Lys

Lys

Phe

Asn

Met

Asp

Pro

Lys

Lys

Gly

Ile

Gin

Phe

Leu

Val

70

75

80

• · · · • ·

	GAG AAT GAA CTG CTG Glu Asn Glu Leu Leu 85	CAG AAC ACA CCC
Gin 90	Asn Thr Pro
	TAC	AAG	GGC	GAG	GGG	CTG	AAC	AAG	ACA
	Tyr	Lys	Gly	Glu	Gly 105	Leu	Asn	Lys	Thr
	GAG	AGG	GAA	GAA	CTG	AAC	CTG	GCA	GTG
	Glu	Arg	Glu	Glu 120	Leu	Asn	Leu	Ala	Val 125
	CAT	GAG	TTC	ACC	GAC	CTC	AAT	CTG	GTG
	His	Glu	Phe 135	Thr	Asp	Leu	Asn	Leu 140	Val
	TGG	AGC	TTT	CGC	CTA	CCC	GGA	GAG	GCC
	Trp	Ser 150	Phe	Arg	Leu	Pro	Gly 155	Glu	Ala
	GAG	GCC	TTC	GCC	CAG	CGA	TAC	TGC	CTG
	Glu 165	Ala	Phe	Ala	Gin	Arg 170	Tyr	Cys	Leu
	TCC	ACA	GAC	ACG	TGC	TAT	GTG	CTG	TCC
	Ser	Thr	Asp	Thr	Cys 185	Tyr	Val	Leu	Ser
	ACC	AGT	CTC	CAC	AAT	CCC	AAT	GTC	CGG
	Thr	Ser	Leu	His 200	Asn	Pro	Asn	Val	Arg 205
	TTT	GTG	GCC	ATG	AAC	CGG	GGC	ATC	AAC
	Phe	Val	Ala 215	Met	Asn	Arg	Gly	Ile 220	Asn
«	GAG	CTG	CTC	AGG	AAC	CTG	TAC	GAC	AGC
	Glu	Leu 230	Leu	Arg	Asn	Leu	Tyr Asp 235	Ser
	ATT	CCT	GAG	GAT	GAC	GGG	AAT	GAC	CTG
	Ile 245	Pro	Glu	Asp Asp	Gly 250	Asn	Asp	Leu
	GAC	CGG	GAG	GGC	TGG	CTC	CTG	AAG	CTG
	Asp Arg	Glu	Gly	Trp 265	Leu	Leu	Lys	Leu

65	• < • • ·'	• • · • ·· ♦·	• · • • · · • ·	• · • · • · · • · · • · · ·	• · · · • · · · • · · · · • · · ·· ··
GAG	GAG	ATC	GCC	CGC	TTC	CTG	582
Glu	Glu 95	Ile	Ala	Arg	Phe	Leu 100
GCC	ATC	GGG	GAC	TAC	CTG	GGG	630
Ala 110	Ile	Gly Asp	Tyr	Leu 115	Gly
CTC	CAT	GCT	TTT	GTG	GAT	CTG	678
Leu	His	Ala	Phe	Val 130	Asp	Leu
CAG	GCC	CTC	AGG	CAG	TTT	CTA	726
Gin	Ala	Leu	Arg 145	Gin	Phe	Leu
CAG	AAA	ATT	GAC	CGG	ATG	ATG	774
Gin	Lys	Ile 160	Asp Arg	Met	Met
TGC	AAC	CCT	GGG	GTT	TTC	CAG	822
Cys	Asn 175	Pro	Gly	Val	Phe	Gin 180
TTC	GCC	GTC	ATC	ATG	CTC	AAC	870
Phe 190	Ala	Val	Ile	Met	Leu 195	Asn
GAC	AAG	CCG	GGC	CTG	GAG	CGC	918
Asp	Lys	Pro	Gly	Leu 210	Glu	Arg
GAG	GGC	GGG	GAC	CTG	CCT	GAG	966
Glu	Gly Gly Asp 225	Leu	Pro	Glu
ATC	CGA	AAT	GAG	CCC	TTC	AAG	1014
Ile	Arg	Asn 240	Glu	Pro	Phe	Lys
ACC	CAC	ACC	TTC	TTC	AAC	CCG	1062
Thr	His 255	Thr	Phe	Phe	Asn	Pro 260
GGG	GGC	CGG	GTG	AAG	ACG	TGG	1110
Gly Gly Arg 270	Val	Lys	Thr 275	Trp

• ·· · • · · · · ·

AAG CGG CGC TGG

TTT ATC

CTC ACA GAC AAC TGC CTC TAC TAC TTT GAG

1158

Lys

Arg Arg

Trp 280

Phe

Ile

Leu Thr Asp 285

Asn

Cys

Leu Tyr

Tyr Phe Glu 290

TAC

ACC

ACG

GAC

AAG

GAG

CCC

CGA

GGA

ATC

ATC

CCC

CTG

GAG

AAT

CTG

1206

Tyr

Thr

Thr

Asp Lys

Glu

Pro

Arg

Gly

Ile

Ile

Pro

Leu

Glu

Asn

Leu

295

300

305

AGC

ATC

CGA

GAG

GTG

GAC

GAC

CCC

CGG

AAA

CCG

AAC

TGC

TTT

GAA

CTT

1254

Ser

Ile

Arg

Glu

Val

Asp Asp

Pro

Arg

Lys

Pro

Asn

Cys

Phe

Glu

Leu

310

315

320

TAC

ATC

CCC

AAC

AAC

AAG

GGG

CAG

CTC

ATC

AAA

GCC

TGC

AAA

ACT

GAG

1302

Tyr

Ile

Pro

Asn

Asn

Lys

Gly

Gin

Leu

Ile

Lys

Ala

Cys

Lys

Thr

Glu

325

330

335

340

GCG

GAC

GGC

CGA

GTG

GTG

GAG

GGA

AAC

CAC

ATG

GTG

TAC

CGG

ATC

TCG

1350

Ala

Asp Gly Arg

Val

Val

Glu

Gly

Asn

His

Met

Val

Tyr Arg

Ile

Ser

345

350

355

GCC

CCC

ACG

CAG

GAG

GAG

AAG

GAC

GAG

TGG

ATC

AAG

TCC

ATC

CAG

GCG

1398

Ala

Pro

Thr

Gin

Glu

Glu

Lys Asp

Glu

Trp

Ile

Lys

Ser

Ile

Gin

Ala

360

365

370

GCT

GTG

AGT

GTG

GAC

CCC

TTC

TAT

GAG

ATG

CTG

GCA

GCG

AGA

AAG

AAG

1446

Ala

Val

Ser

Val

Asp

Pro

Phe

Tyr

Glu

Met

Leu

Ala

Ala

Arg Lys

Lys

375

380

385

CGG

ATT

TCA

GTC

AAG

AAG

AAG

CAG

GAG

CAG

CCC

TGA

CCCCCTGCCC

1492

Arg

Ile

Ser

Val

Lys

Lys

Lys

Gin

Glu

Gin

Pro

390

395

CCAACTCCAT TATTTATTAC GGAGCTGCCC CGCCTGGGTG GCCGGACCCC	TGGGCCTTGG	1552
GGCTGTGGAT CCTGGTTCCC TGTTTGGAAA ATTCACCACC TCTAGCTCCT	CACTGTTCTT	1612
TGTAATTAAC ACGCTGTTGG TAACTTTAGA GCACACTGGC GCCCGTTACT	AGTGGATCCG	1672
AGCTCGGTAC CAAGCGTGGT CTCCCTAT		1700

(1) Informace pro SEQ ID č.: 2:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 399 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein • · ···· • · · · · · • · (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 2:

Met Glu Asp Gly Val

Tyr Glu Pro Pro

Asp Leu Thr Pro Glu Glu Arg

1

5

10

15

Met

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Arg Arg Arg Lys

Gin

Glu

Leu

Leu

Val

Glu

20

25

30

Ile

Gin

Arg

Leu

Arg

Glu

Glu

Leu

Ser

Glu

Ala

Met

Ser

Glu

Val

Glu

35

40

45

Gly

Leu

Glu

Ala

Asn

Glu

Gly

Ser

Lys

Thr

Leu

Gin

Arg

Asn

Arg Lys

50

55

60

Met

Ala

Met

Gly Arg

Lys

Lys

Phe

Asn

Met

Asp

Pro

Lys

Lys

Gly

Ile

65

70

75

80

Gin

Phe

Leu

Val

Glu

Asn

Glu

Leu

Leu

Gin

Asn

Thr

Pro

Glu

Glu

Ile

85

90

95

Ala

Arg

Phe

Leu

Tyr

Lys

Gly

Glu

Gly

Leu

Asn

Lys

Thr

Ala

Ile

Gly

100

105

110

Asp

Tyr

Leu

Gly

Glu

Arg

Glu

Glu

Leu

Asn

Leu

Ala

Val

Leu

His

Ala

115

120

125

Phe

Val

Asp

Leu

His

Glu

Phe

Thr

Asp

Leu

Asn

Leu

Val

Gin

Ala

Leu

130

135

140

Arg

Gin

Phe

Leu

Trp

Ser

Phe

Arg

Leu

Pro

Gly

Glu

Ala

Gin

Lys

Ile

145

150

155

160

Asp Arg

Met

Met

Glu

Ala

Phe

Ala

Gin

Arg Tyr Cys

Leu

Cys

Asn

Pro

165

170

175

Gly

Val

Phe

Gin

Ser

Thr

Asp

Thr

Cys

Tyr Val

Leu

Ser

Phe

Ala

Val

180

185

190

Ile

Met

Leu

Asn

Thr

Ser

Leu

His

Asn

Pro

Asn

Val

Arg Asp Lys

Pro

195

200

205

Gly

Leu

Glu

Arg

Phe

Val

Ala

Met

Asn

Arg Gly

Ile

Asn

Glu

Gly Gly

210

215

220

Asp

Leu

Pro

Glu

Glu

Leu

Leu

Arg

Asn

Leu Tyr Asp

Ser

Ile

Arg Asn

225

230

235

240

···· ·· ··· · • ·

Glu Pro Phe Lys Ile Pro Glu Asp Asp Gly Asn Asp Leu Thr His Thr
	245	250	255
Phe Phe Asn	Pro Asp 260	Arg Glu Gly Trp Leu Leu 265	Lys Leu Gly Gly Arg 270
Val Lys Thr 275	Trp Lys	Arg Arg Trp Phe Ile Leu 280	Thr Asp Asn Cys Leu 285
Tyr Tyr Phe 290	Glu Tyr	Thr Thr Asp Lys Glu Pro 295	Arg Gly Ile Ile Pro 300
Leu Glu Asn 305	Leu Ser	Ile Arg Glu Val Asp Asp 310 315	Pro Arg Lys Pro Asn 320
Cys Phe Glu	Leu Tyr 325	Ile Pro Asn Asn Lys Gly 330	Gin Leu Ile Lys Ala 335
Cys Lys Thr	Glu Tkla 340	Asp Gly Arg Val Val Glu 345	Gly Asn His Met Val 350
Tyr Arg Ile 355	Ser Ala	Pro Thr Gin Glu Glu Lys 360	Asp Glu Trp Ile Lys 365
Ser Ile Gin 370	Ala Ala	Val Ser Val Asp Pro Phe 375	Tyr Glu Met Leu Ala 380
Ala Arg Lys	Lys Arg	Ile Ser Val Lys Lys Lys	Gin Glu Gin Pro

385 390 395 (1) Informace pro SEQ ID č.: 3:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 1260 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (ix) Znaky:

(A) Název/klíč: CDS (B) Oblast: 70..1254 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 3:

···· ·· ···* ··

CGGCCGCCAG TGTGCTCTAA AGCAGCAAGC GACAGGAGCA CGGGTCATCT TTTCCCCAGA 60

GGCGTCGGA ATG GAC CTG TGC CAC CCA GAG CCC GCG GAG CTG AGC AGC 108

Met Asp Leu Cys His Pro Glu Pro Ala Glu Leu Ser Ser

405 410

GGG Gly

GAG Glu 415

ACG GAA GAG TTA CAG AGG ATC AAG TGG CAC CGA AAG CAG CTC

156

Thr

Glu Glu Leu Gin 420

Arg

Ile

Lys

Trp His Arg 425

Lys

Gin

Leu

CTG

GAG

GAC

ATC

CAG

AAG

CTG

AAG

GAT

GAG

ATT

GCA

GAT

GTG

TTT

GCC

204

Leu

Glu

Asp

Ile

Gin

Lys

Leu

Lys Asp

Glu

Ile

Ala

Asp

Val

Phe

Tkla

430

435

440

445

CAA

ATC

GAC

TGC

TTC

GAG

AGT

GCG

GAG

GAG

AGC

CGG

ATG

GCC

CAG

AAG

252

Gin

Ile

Asp Cys

Phe

Glu

Ser

Ala

Glu

Glu

Ser

Arg

Met

Ala

Gin

Lys

450

455

460

GAG

AAG

GAG

CTG

TGT

ATT

GGG

CGC

AAG

AAG

TTC

AAC

ATG

GAC

CCC

GCC

300

Glu

Lys

Glu

Leu

Cys

Ile

Gly Arg Lys

Lys

Phe

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

465

470

475

AAG

GGT

ATC

CAG

TAT

TTC

ATT

GAG

CAC

AAG

CTG

CTG

TCC

CCT

GAC

GTC

348

Lys

Gly

Ile

Gin

Tyr

Phe

Ile

Glu

His

Lys

Leu

Leu

Ser

Pro

Asp

Val

480

485

490

CAG

GAC

ATT

GCA

CGG

TTC

CTG

TAT

AAA

GGC

GAG

GGC

CTC

AAC

AAG

ACA

396

Gin

Asp

Ile

Ala

Arg

Phe

Leu

Tyr

Lys

Gly

Glu

Gly

Leu

Asn

Lys

Thr

495

500

505

GCC

ATT

GGT

ACC

TAC

CTG

GGG

GAG

AGG

GAT

CCC

ATC

AAC

CTG

CAG

GTC

444

Ala

Ile

Gly

Thr

Tyr

Leu

Gly

Glu

Arg Asp

Pro

Ile

Asn

Leu

Gin

Val

510

515

520

525

CTC

CAG

GCC

TTC

GTG

GAC

TGC

CAC

GAG

TTC

GCC

AAC

CTC

AAC

CTC

GTC

492

Leu

Gin

Ala

Phe

Val

Asp

Cys

His

Glu

Phe

Ala

Asn

Leu

Asn

Leu

Val

530

535

540

CAG

GCC

CTC

AGG

CAG

TTC

CTG

TGG

AGC

TTC

CGG

CTG

CCG

GGC

GAG

GCC

540

Gin

Ala

Leu

Arg

Gin

Phe

Leu

Trp

Ser

Phe

Arg

Leu

Pro

Gly

Glu

Ala

545

550

555

CAG

AAG

ATA

GAC

CGG

ATG

ATG

GAG

GCC

TTT

GCC

ACT

CGA

TAC

TGC

CTC

588

Gin

Lys

Ile

Asp Arg

Met

Met

Glu

Ala

Phe

Ala

Thr

Arg

Tyr

Cys

Leu

560

565

570

TGC

AAC

CCA

GGC

GTC

TTC

CAG

TCC

ACA

GAC

ACC

TGC

TAC

GTG

TTG

TCC

636

Cys

Asn

Pro

Gly Val

Phe

Gin

Ser

Thr

Asp

Thr

Cys

Tyr

Val

Leu

Ser

575

580

585

• · • · · ·

TTC TCC ATC ATC

ATG CTC

AAC ACC Asn Thr

AGC CTC CAC AAT

CCC AAC GTC CGG

684

Phe 590

Ser

Ile

Ile

Met

Leu 595

Ser

Leu His 600

Asn

Pro Asn Val

Arg 605

GAC

AGG

CCG

CCT

TTT

GAG

CGC

TTT

GTG

TCC

ATG

AAC

CGC

GGC

ATC

AAC

732

Asp

Arg

Pro

Pro

Phe

Glu

Arg

Phe

Val

Ser

Met

Asn

Arg

Gly

Ile

Asn

610

615

620

AAT

GGT

AGC

GAC

CTG

CCC

GAG

GAC

CAG

CTG

CGG

AAC

CTC

TTC

GAC

AGC

780

Asn

Gly

Ser

Asp

Leu

Pro

Glu

Asp

Gin

Leu

Arg

Asn

Leu

Phe

Asp

Ser

625

630

635

ATC

AAG

AGT

GAG

CCA

TTC

TCC

ATC

CCT

GAG

GAC

GAC

GGC

AAT

GAC

CTC

828

Ile

Lys

Ser

Glu

Pro

Phe

Ser

Ile

Pro

Glu

Asp Asp Gly

Asn

Asp

Leu

640

645

650

ACT

CAC

ACC

TTC

TTC

AAT

CCA

GAC

CGG

GAG

GGT

TGG

CTG

CTC

AAG

CTA

876

Thr

His

Thr

Phe

Phe

Asn

Pro

Asp Arg

Glu

Gly Trp

Leu

Leu

Lys

Leu

655

660

665

GGG

GGC

CGC

GTG

AAG

ACG

TGG

AAA

CGG

CGC

TGG

TTC

ATC

CTG

ACC

GAC

924

Gly Gly Arg

Val

Lys

Thr

Trp

Lys Arg Arg

Trp

Phe

Ile

Leu

Thr

Asp

670

675

680

685

AAC

TGC

CTC

TAC

TAC

TTC

GAG

TTC

ACC

ACT

GAC

AAG

GAG

CCA

CGG

GGA

972

Asn

Cys

Leu

Tyr Tyr

Phe

Glu

Phe

Thr

Thr

Asp

Lys

Glu

Pro

Arg

Gly

690

695

700

ATT

ATA

CCT

CTT

GAG

AAC

CTC

TCG

GTG

CAG

AAG

GTG

GAT

GAC

CCC

AAG

1020

Ile

Ile

Pro

Leu

Glu

Asn

Leu

Ser

Val

Gin

Lys

Val

Asp Asp

Pro

Lys

705

710

715

AAG

CCA

TTC

TGC

CTG

GAG

CTC

TAC

AAC

CCT

AGC

TGC

CGA

GGC

CAG

AAA

1068

Lys

Pro

Phe

Cys

Leu

Glu

Leu

Tyr

Asn

Pro

Ser

Cys

Arg

Gly

Gin

Lys

720

725

730

ATC

AAG

GCC

TGC

AAG

ACC

GAT

GGC

GAC

GGC

AGG

GTG

GTG

GAG

GGC

AAG

1116

Ile

Lys

Ala

Cys

Lys

Thr

Asp

Gly Asp

Gly Arg

Val

Val

Glu

Gly Lys

735

740

745

CAC

GAA

TCG

TAC

CGC

ATC

TCA

GCC

ACC

AGT

GCC

GAG

GAA

CGT

GAC

CAG

1164

His

Glu

Ser

Tyr Arg

Ile

Ser

Ala

Thr

Ser

Ala

Glu

Glu

Arg Asp

Gin

750

755

760

765

TGG

ATC

GAG

TCC

ATC

CGA

GCC

AGC

ATC

ACC

CGT

GTC

CCC

TTC

TAC

GAC

1212

Trp

Ile

Glu

Ser

Ile

Arg

Ala

Ser

Ile

Thr

Arg

Val

Pro

Phe Tyr Asp

770 775 780

CTG GTC TCT ACT CGG AAG AAG AAG ATT GCC AGC AAG CAG TGA

Leu Val Ser Thr Arg Lys Lys Lys Ile Ala Ser Lys Gin

785 790

1254

GATTCC

1260 (1) Informace pro SEQ ID č.: 4:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 394 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 4:

Met Asp 1

Leu Cys

His Pro Glu Pro Ala Glu Leu Ser Ser Gly Glu Thr

5

10

15

Glu

Glu

Leu

Gin

Arg

Ile

Lys

Trp

His

Arg Lys

Gin

Leu

Leu

Glu

Asp

20

25

30

Ile

Gin

Lys

Leu

Lys

Asp

Glu

Ile

Ala

Asp

Val

Phe

Ala

Gin

Ile

Asp

35

40

45

Cys

Phe

Glu

Ser

Ala

Glu

Glu

Ser

Arg

Met

Ala

Gin

Lys

Glu

Lys

Glu

50

55

60

Leu

Cys

Ile

Gly Arg

Lys

Lys

Phe

Asn

Met

Asp

Pro

Ala

Lys

Gly

Ile

65

70

75

80

Gin

Tyr

Phe

Ile

Glu

His

Lys

Leu

Leu

Ser

Pro

Asp

Val

Gin

Asp

Ile

85

90

95

Ala

Arg

Phe

Leu

Tyr

Lys

Gly

Glu

Gly

Leu

Asn

Lys

Thr

Ala

Ile

Gly

100

105

110

Thr

Tyr

Leu

Gly

Glu

Arg Asp

Pro

Ile

Asn

Leu

Gin

Val

Leu

Gin

Ala

115

120

125

Phe

Val

Asp Cys

His

Glu

Phe

Ala

Asn

Leu

Asn

Leu

Val

Gin

Ala

Leu

130

135

140

Arg

Gin

Phe

Leu

Trp

Ser

Phe

Arg

Leu

Pro

Gly

Glu

Ala

Gin

Lys

Ile

145

150

155

160

• ·· ·

Asp Arg Met Met Glu Ala Phe Ala	Thr Arg Tyr Cys Leu Cys Asn Pro
	165	170	175
Gly Val Phe	Gin Ser Thr Asp Thr	Cys Tyr Val Leu	Ser Phe Ser Ile
	180	185	190
Ile Met Leu	Asn Thr Ser Leu His	Asn Pro Asn Val	Arg Asp Arg Pro
195	200		205
Pro Phe Glu	Arg Phe Val Ser Met	Asn Arg Gly Ile	Asn Asn Gly Ser
210	215	220
Asp Leu Pro	Glu Asp Gin Leu Arg	Asn Leu Phe Asp	Ser Ile Lys Ser
225	230	235	240
Glu Pro Phe	Ser Ile Pro Glu Asp	Asp Gly Asn Asp	Leu Thr His Thr
	245	250	255
Phe Phe Asn	Pro Asp Arg Glu Gly	Trp Leu Leu Lys	Leu Gly Gly Arg
	260	265	270
Val Lys Thr	Trp Lys Arg Arg Trp	Phe Ile Leu Thr	Asp Asn Cys Leu
275	280		285
Tyr Tyr Phe	Glu Phe Thr Thr Asp	Lys Glu Pro Arg	Gly Ile Ile Pro
290	295	300
Leu Glu Asn	Leu Ser Val Gin Lys	Val Asp Asp Pro	Lys Lys Pro Phe
305	310	315	320
Cys Leu Glu	Leu Tyr Asn Pro Ser	Cys Arg Gly Gin	Lys Ile Lys Ala
	325	330	335
Cys Lys Thr	Asp Gly Asp Gly Arg	Val Val Glu Gly	Lys His Glu Ser
	340	345	350
Tyr Arg Ile	Ser Tkla Thr Ser Ala	Glu Glu Arg Asp	Gin Trp Ile Glu
355	360		365
Ser Ile Arg	Ala Ser Ile Thr Arg	Val Pro Phe Tyr	Asp Leu Val Ser
370	375	380
Thr Arg Lys	Lys Lys Ile Ala Ser	Lys Gin

385 390 (1) Informace pro SEQ ID č.: 5:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka : 29 bazických párů

· « (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 5:

ATATACGCGT ACCTTCTTCA ACCCGGACC (1) Informace pro SEQ ID č.: 6:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 29 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 6:

ATATGTCGAC TCAGGGCTGC TCCTGCTTC (1) Informace pro SEQ ID č.: 7:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 28 base pairs (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 7:

ATATCATATG GAGGAGGACG ACAGCTAC (1) Informace pro SEQ ID č.: 8:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 29 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 8:

• · · ·

ATATCTCGAG TCAGTGTCGC TTCGTGGAG 29 (1) Informace pro SEQ ID č.: 9:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 71 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 9:

ATATGCTAGC CACCATGGGG TACCCATACG ATGTTCCTGA CTATGCGACG CGTATGGAGG 60

AGGACGACAG C 71 (1) Informace pro SEQ ID č.: 10:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 68 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 10:

ATATGTCGAC TCACGCATAG TACAGGAACA TCGTATGGGT ACATACGCGT GTGTCGCTTC 60

GTGGAGGA 68 (1) Informace pro SEQ ID č.: 11:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 20 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 11:

TAATACGACT CACTATAGGG • · · ·

(1) Informace pro SEQ ID č.: 12:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 30 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 12:

ATATACGCGT ACTTTCTTCA ATCCAGACCG (1) Informace pro SEQ ID č.: 13:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 29 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 13:

ATATTCTAGA TCAGTGTCGC TTCGTGGAG (1) Informace pro SEQ ID č.: 14:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 29 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 14:

ATATACGCGT ATGGAGGACG GCGTCTATG (1) Informace pro SEQ ID č.: 15:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 33 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 15:

ATATGAATTC CACCATGGAC CTGTGCCACC CAG (1) Informace pro SEQ ID č.: 16:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 29 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 16:

ATATGTCGAC TCACTGCTTG CTGGCAATC (1) Informace pro SEQ ID č.: 17:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 28 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly : DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 17:

ATATACGCGT ACCTTCTTCA ATCCAGAC (1) Informace pro SEQ ID č.: 18:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka : 29 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 18:

ATATGTCGAC TCACTGCTTG CTGGCAATC (1) Informace pro SEQ ID č.: 19:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 29 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.: 19:

ATATACGCGT ATGGACCTGT GCCACCCAG (1) Informace pro SEQ ID č.: 20:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 30 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: single (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: další nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 20:

ATATCTCGAG CTATGGAGGA CGGCGTCTAT (1) Informace pro SEQ ID č.: 21:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka : 37 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců : jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: další nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primer (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.: 21:

ATATAAGCTT GCGGCCGCTC AGGGCTGCTC CTGCTTC • · • · · · • · · · (1) Informace pro SEQ ID č.: 22:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 33 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: další nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primer (xi) Popis sekvence : SEQ ID č.: 22:

ATATCTCGAG CTATGGAGGA GGACGACAGC TAC (1) Informace pro SEQ ID č.: 23:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 38 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: další nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 23:

ATATAAGCTT GCGGCCGCTC AGTGTCGCTT CGTGGAGG (1) Informace pro SEQ ID č.: 24:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 31 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: další nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primer • ♦ · · (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 24:

ATATCTCGAG CTATGGACCT GTGCCACCCA G (1) Informace pro SEQ ID č.: 25:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 40 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: další nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 25:

ATATAAGCTT GCGGCCGCTC ACTGCTTGCT GGCAATCTTC 40 (1) Informace pro SEQ ID č.: 26:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 33 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: další nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 26: ATATCTCGAG CTATGAGCGA GGTGGAGGGG CTG (1) Informace pro SEQ ID č.: 27:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 39 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární • · (ii) Typ molekuly: další (A) Popis: /pop. = nukleová kyselina primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 27:

ATATAAGCTT GCGGCCGCTC AGAAGGTGTG GGTCAGGTC (1) Informace pro SEQ ID č.: 28:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 31 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: další nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 28:

ATATCTCGAG CTATGACCTT CTTCAACCCG G 31 (1) Informace pro SEQ ID č.: 29:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 33 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: další nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 29:

GTCAATTTTC TGGGCCGCTC CGGGTAGGCG AAA (1) Informace pro SEQ ID č.: 30:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 34 bazických párů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: další nukleová kyselina (A) Popis: /pop. = primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 30:

Claims (19)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Vyčištěný a izolovaný polynukleotid kódující lidskou IRP-1 aminokyselinovou sekvenci, která je uvedena pod SEQ ID č.: 2.
2. 2. Vyčištěný a izolovaný polynukleotid kódující lidskou IRP-2 aminokyselinovou sekvenci, která je uvedena pod SEQ ID č.: 4.
3. 3. Polynukleotid podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že je molekulou DNA.
4. 4. DNA podle nároku 3, vyznačená tím, že se zvolí ze skupin zahrnujících cDNA, genomovou DNA, částečně syntetizovanou DNA a zcela syntetizovanou DNA.
5. 5. DNA molekula obsahující lidským IRP-1 polypeptidem kódující oblastní sekvenci, která je uvedena pod SEQ ID č.: 1.

   • · · · 4 ·
6. 6. DNA molekula obsahující lidským IRP-2 polypeptidem kódující oblastní sekvenci, která je uvedena pod SEQ ID č.: 3.
7. 7. DNA molekula kódující IRP polypeptid zvolený ze skupiny zahrnující:

   a) lidskou IRP-1 DNA uvedenou pod SEQ ID č.: 1;

   b) lidskou IRP-2 DNA uvedenou pod SEQ ID č.: 3;

   c) DNA molekulu, která hybridizuje za velmi přísných podmínek na nekódující řetězec proteinové kódující části lidské IRP-1 DNA, uvedené pod SEQ ID č.: 1; a

   d) DNA molekulu, která hybridizuje za velmi přísných podmínek na nekódující řetězec proteinové kódující části lidské IRP-2 DNA, uvedené pod SEQ ID č.: 3.
8. 8. DNA expresní konstrukt obsahující DNA podle nároku

   1, 2 nebo 7.
9. 9. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekované DNA podle nároku 1, 2 nebo 7.
10. 10. Způsob přípravy IRP polypeptidu, vyznačený tím, že zahrnuje růst hostitelské buňky podle nároku 9 ve vhodném prostředí a izolaci IRP polypeptidu z hostitelské buňky nebo z jejího růstového prostředí.
11. 11. Vyčištěný a izolovaný polypeptid obsahující IRP-1 aminokyselinovou sekvenci uvedenou pod SEQ ID č.: 2.
12. 12. Vyčištěný a izolovaný polypeptid obsahující IRP-2 aminokyselinovou sekvenci uvedenou pod SEQ ID č.: 4.
13. 13. Protilátka, která specificky váže IRP-1.
14. 14. Protilátka, která specificky váže IRP-2.
15. 15. Protilátka podle nároku 13 nebo 14, vyznačená tím, že je monoklonální protilátkou.
16. 16. Antiidiotypická protilátka, která specificky váže monoklonální protilátku podle nároku 13 nebo 14.
17. 17. Hybridomová buněčná linie produkující monoklonální protilátku podle nároku 13 nebo 14.
18. 18. Hybridomová buněčná linie 200A (ATCC HB-12331).
19. 19. Monoklonální protilátka produkovaná hybridomovou buněčnou linií podle nároku 18.

    • · · · • · · ·

    20. Hybridomová buněčná linie 200B (ATCC HB-12332). 21. Monoklonální protilátka produkovaná hybridomovou buněčnou linií podle nároku 20. 22. Hybridomová buněčná linie 233G (ATCC HB-12333). 23. Monoklonální protilátka produkovaná hybridomovou buněčnou linií podle nároku 22.

    24 .

    Způsob identifikace sloučeniny, která moduluje vazebnost mezi

    IRP-1 a β integrinovou podjednotkou, v y značen t i m , že zahrnuje:

    a) ý

    uvedeni IRP-1 nebo jeho fragmentu do kontaktu β integrinovou podjednotkou nebo jej ím fragmentem;

    b) měření vazebnosti mezi

    IRP-1 nebo j eho fragmentem a β integrinovou podj ednotkou nebo jejím fragmentem;

    c) měření vazebnosti mezi

    IRP-1 nebo jeho nebo podj ednotkou jejím fragmentem v přítomnosti testované sloučeniny; a fragmentem a β integrinovou

    d) srovnání měření v kroku (b) a měření v kroku (c) , přičemž snížení vaznosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná sloučenina je inhibitorem • · · · • · · · • · vazebnosti a zvýšeni vazebnosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná sloučenina je aktivátorem vazebnosti.

    25. Způsob vazebnost mezi identifikace sloučeniny, která moduluje

    IRP-2 a β integrinovou podjednotkou, v y značen t i m , že zahrnuje:

    a)

    Ý uvedení IRP-2 nebo jeho fragmentu do kontaktu β integrinovou podjednotkou nebo jej im fragmentem;

    b) měření vazebnosti mezi

    IRP-2 nebo jeho fragmentem a β integrinovou podjednotkou nebo jejím fragmentem;

    c) měření vazebnosti mezi

    IRP-2 nebo j eho fragmentem a β integrinovou podj ednotkou nebo jejím fragmentem v přítomnosti testované sloučeniny; a

    d) srovnání měření v kroku (b) a měření v kroku

    (c) , přičemž snížení vaznosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná sloučenina je inhibitorem vazebnosti a zvýšení vazebnosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná sloučenina je aktivátorem

    vazebnosti.

    26. Způsob identifikace sloučeniny, která modifikuje vazebnost mezi IRP-1 a ADP ribosylačním faktorem (ARF), vyznačený tím, že zahrnuje:

    a) uvedení IRP-1 nebo jeho fragmentu do kontaktu s ARF nebo jeho fragmentem;

    • ·· · • · · ·

    b) měření vazebnosti mezi IRP-1 nebo jeho fragmentem a ARF nebo jeho fragmentem; c) měření vazebnosti mezi IRP -1 nebo jeho fragmentem a ARF nebo jeho fragmentem v přítomnosti testované sloučeniny; a d) srovnáni měření v kroku (b) a měření v kroku (c) , přičemž snížení vaznosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná sloučenina je inhibitorem vazebnosti a zvýšení vazebnosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná sloučenina je aktivátorem vazebnosti.

    27. Způsob identifikace sloučeniny, která modifikuje vazebnost mezi IRP-2 a ADP ribosylačním faktorem (ARF), vyznačený tím, že zahrnuje:

    a) uvedení IRP-2 nebo jeho fragmentu do kontaktu s ARF nebo jeho fragmentem;

    b) měření vazebnosti mezi IRP-2 nebo jeho fragmentem a ARF nebo jeho fragmentem;

    c) měření vazebnosti mezi IRP-2 nebo jeho fragmentem a ARF nebo jeho fragmentem v přítomnosti testované sloučeniny; a

    d) srovnání měření v kroku (b) a měření v kroku

    (c) , přičemž snížení vaznosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná sloučenina je inhibitorem vazebnosti a zvýšení vazebnosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná sloučenina je aktivátorem

    vazebnosti.

    • 4 · ·· ·

    28. Způsob identifikace sloučeniny, která modifikuje vazebnost mezi IRP-1 a fosfatidylinosilem (PI), vyznačený tím, že zahrnuje:

    a) uvedení IRP-1 nebo jeho fragmentu do kontaktu s PI;

    b) měření vazebnosti mezi IRP-1 nebo jeho fragmentem a PI; c) měření vazebnosti mezi IRP -1 nebo jeho fragmentem a PI v přítomnosti testované sloučeniny; a d) srovnání . měření v kroku (b) a měření v kroku (c) , přičemž snížení vaznosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná sloučenina je inhibitorem vazebnosti a zvýšení vazebnosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná sloučenina je aktivátorem vazebnosti.

    29. Způsob identifikace sloučeniny, která modifikuje vazebnost mezi IRP-2 a fosfatidylinosilem (PI), vyzná- č e n ý t i m , že zahrnuje: a) uvedení IRP-2 nebo jeho fragmentu do kontaktu s PI; b) měření vazebnosti mezi IRP-2 nebo jeho fragmentem a PI; c) měření vazebnosti mezi IRP-2 nebo jeho fragmentem a PI v přítomnosti testované

    sloučeniny; a

    d) srovnání měření v kroku (b) a měřeni v kroku

    (c) , přičemž snížení vaznosti v kroku (c) naznačuje, že testovaná sloučenina je inhibitorem vazebnosti a zvýšení vazebnosti v kroku (C)

    • · ··· · • · naznačuje, že testovaná sloučenina je aktivátorem vazebnosti.

    30. Způsob izolování polynukleotidu protein, který se váže na IRP-1, v že zahrnuje:

    kóduj iciho ý tím,

    a) transformaci nebo transfekaci vhodných hostitelských buněk

    DNA konstruktem, obsahuj ícím reporterový gen regulovaného transkripčním vazebnou doménu pod kontrolou faktorem, promotoru majícím DNA a aktivační doménu;

    b) exprimován!

    kóduj ící první první hybridní fúzi části nebo

    DNA sekvence celého IRP-1 proteinu domény a DNA kódující domény uvedeného transkripčního hostitelských buňkách;

    nebo aktivační faktoru v

    c) exprimován! knihovny sekvencí kódujících druhé fúze druhých části hybridních nebo celého pravděpodobného IRP-1 proteinu vážících proteiny a DNA vazebné domény nebo transkripčního faktoru, které se nezabudovaly při první fúzi, v hostitelských buňkách;

    aktivační domény

    d) detekování navázanosti IRP-1 vázajícího proteinu na IRP-1 v příslušné hostitelské buňce detekováním produkce reporterového genového produktu v hostitelské buňce; a

    e) izolování druhých hybridních DNA sekvencí kódujících IRP-1 vázající protein z příslušné hostitelské buňky.

    31. Způsob izolováni polynukleotidů kódujícího protein, který se váže na IRP-2, vyznačený tím, že zahrnuje:

    a) transformaci nebo transfekaci vhodných hostitelských buněk DNA konstruktem, obsahujícím reporterový gen pod kontrolou promotoru regulovaného transkripčním faktorem, majícím DNA vazebnou doménu a aktivační doménu;

    b) exprimování první hybridní DNA sekvence kódující první fúzi části nebo celého IRP-2 proteinu a DNA kódující domény nebo aktivační domény uvedeného transkripčního faktoru v hostitelských buňkách;

    c) exprimování knihovny druhých hybridních sekvencí kódujících druhé fúze části nebo celého pravděpodobného IRP-2 proteinu vážících proteiny a DNA vazebné domény nebo aktivační domény transkripčního faktoru, které se nezabudovaly při první fúzi, v hostitelských buňkách;

    d) detekování navázanosti IRP-2 vázajícího proteinu na IRP-2 v příslušné hostitelské buňce detekováním produkce reporterového genového produktu v hostitelské buňce; a

    e) izolování druhých hybridních DNA sekvencí kódujících IRP-2 vázající protein z příslušné hostitelské buňky.